MXPA02002800A - El gen prv-1 y su uso. - Google Patents

Abstract

Este documento describe una secuencia de nucleotidos que codifica para la proteina PRV-1, y comprende esencialmente la secuencias ID No. 1, y tambien un proceso para detectar este gen del ARNm codificado por este gen y el polipeptido codificado por este gen.

Description

EL GEN PRV-1 Y SU USO.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifican para el gen PRV-1, al ADN recombinante que contiene esta secuencia de nucleótidos, a los vectores que contienen el ADN recombinante y a las células que son transformadas con estos vectores, y también a un polipéptido PRV-1, a los anticuerpos contra este polipéptido, a un proceso para la detección del polipéptido PRV-1 y a los fármacos que comprenden el polipéptido PRV-1 o los anticuerpos que son dirigidos contra el polipéptido PRV-1. La policitemia rubra vera (eritremia), también denominada policitemia vera o p. vera, es una enfermedad hematológica maligna en la cual existe una formación incrementada de células eritroides, granulocíticas y megacariocíticas . La enfermedad es de origen clonal y surge como resultados de la mutación de una célula precursora hematopoyética única. En Alemania, la incidencia de p. vera es de 4 a 6 por un millón de habitantes. Si se deja sin tratar, la enfermedad conduce a la muerte dentro de 18 meses. El tratamiento por medio de sangría o quimioterapia extiende el tiempo promedio de supervivencia a más de 13 años . P. vera es diagnosticada por medio de criterios clínicos. El panorama clínico incluye dolores de cabeza, prurito, esplenomegalia en dos terceras partes de los pacientes, sangrado o trombosis, hipertensión en una tercera parte de los pacientes, gota, la cual es originada por un incremento de producción de ácido úrico, y, en algunos casos, úlceras sépticas. El hallazgo más importante de laboratorio es un incremento en los valores para el hemoglobina, hematocrito, la cuenta de eritrocitos y el volumen total de eritrocitos, y también una granulocitosis neutrofílica o trombocitosis en muchos casos. Ya que, por una parte, la mayoría de los criterios son más bien difusos y, por otra parte, no todos los pacientes cumplen estos criterios, es frecuentemente difícil distinguir p. vera de otras enfermedades mieloproliferativas , tales como la leucemia granulocítica crónica o la trombocitosis esencial, y con esto confirmar el diagnóstico. A la fecha, la causa molecular de p. vera es completamente desconocida. No obstante, ya que, p. vera toma un curso severo si ésta no es tratada, es importante el diagnóstico preciso.

Un objetivo de la invención fue por lo tanto encontrar la causa molecular de la policitemia rubra vera y crear la posibilidad de diagnosticarla. Este objetivo fue logrado mediante el aislamiento de un gen el cual es expresado específicamente en asociación con p. vera y no en individuos control saludables. Este gen es designado el gen PRV-1 (policitemia rubra vera) . Una secuencia nucleotídica similar es descrita en la solicitud Internacional WO 98/50552. Una parte de la materia de interés de la invención se refiere por lo tanto a un polinucleótido que codifica para el gen PRV-1 y comprende esencialmente la secuencia ID No. 1. Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser ADN o ARN de una sola hebra o de doble hebra. Si estos son ARN, es claro entonces para la persona experta en la técnica que los nucleótidos "U" están presentes en lugar de los nucleótidos "T" . Se entiende que "polinucleótido" significa los ácidos nucleicos que contienen 15 o más nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de acuerdo a la invención es descrita en la figura 1. La invención se refiere por lo tanto a un polinucleótido que corresponde a la secuencia mostrada en la figura 1, y también a un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos muestra diferencias menores. Dentro del significado de la presente solicitud, se entiende que diferencias menores significan aquellas secuencias en las cuales unos pocos, preferentemente no más de 50 y particularmente preferentemente no más de 25, nucleótidos pueden permanecer sin cambio con, no obstante, la función del gen codificado por la secuencia de nucleótidos que no se ve afectada. La persona experta en la técnica está familiarizada con el hecho de que un triplete de base se codifica para un aminoácido que puede ser remplazado con otro triplete que codifica para el mismo aminoácido. Además de esto, las regiones que son de menos importancia pueden ser suprimidas y/o mutadas a un grado menor. En una modalidad particular, el polinucleótido comprende los nucleótidos 36 a 1346 de la secuencia No. 1, que es la región de codificación del gen PRV-1. Otras modalidades comprenden los nucleótidos 36 a 1262 ó 36 a 1238 de la secuencia No. 1. Esta región codifica presumiblemente la región activa del polipéptido PRV-1. Finalmente, el polinucleótido de la invención puede también comprender los nucleótidos 39 a 1346, 39 a 1262 ó 39 a 1238 de la secuencia No. 1, tal que el codón que codifica para la metionina inicial no está presente. Una modalidad preferida es un polinucleótido que comprende los nucleótidos 99 s 1346, 99 a 1262 ó 99 a 1238 de la secuencia No. 1. Esto da como resultado los codones en el extremo 5' que codifican para el péptido de señal del polipéptido PRV-1 que no está presente. El polinucleótido de acuerdo a la invención puede también ser un fragmento del gen PRV-1. Como regla, el fragmento posee más de 100 nucleótidos, preferentemente, no obstante, más de 300 nucleótidos. Los fragmentos pueden también ser utilizados como cebadores o como sondas, en particular para PCR; en este caso, los fragmentos pueden ser truncados para ajustarse al propósito. Usualmente, los cebadores tiene una longitud entre 10 y 30 nucleótidos y las sondas tienen una longitud entre 15 y 50 nucleótidos. El PRV-1 es un gen endógeno cuya expresión en individuos saludables está, no obstante, restringida únicamente a unos pocos órganos. Normalmente, ésta es expresada principalmente en los órganos hematopoyéticos, por ejemplo en la médula ósea y en hígado fetal, y débilmente expresados en el bazo pero no expresados en el corazón, el músculo, el páncreas o el riñon. En pacientes quienes sufren de p. vera, este gen es muy fuertemente sobreexpresado en las células hematopoyéticas, en particular. El gen PRV-1 codifica para una proteína que muestra la secuencia de proteínas mostrada en la figura 2. El péptido de señal, el cual está presente en la secuencia de proteínas de todas las moléculas superficiales y normalmente removido cuando la proteína es procesada, está dividido por un guión. La proteína tiene la secuencia ID No. 2. Otro aspecto más de la invención es en consecuencia un polipéptido esencialmente puro que tiene la secuencia No. 2 o un polipéptido que tiene la secuencia No. 2 pero que carece del péptido de señal (por ejemplo los aminoácidos 22 a 437 de la secuencia No. 2) . Otras modalidades abarcan los aminoácidos 1 al 409, 22 al 409, 1 al 401 ó 22 al 401 de la secuencia No. 2 (que es probablemente la región activa de la protelna) . Con respecto a la actividad biológica, el polipéptido de acuerdo a la invención está preferentemente glucosilado; éste está más preferentemente N-glucosilado . Éste puede ser luego glucosilado al menos en uno de los aminoácidos Asn-46, Asn-189 y Asn-382 del polipéptido PRV-1 (los números de aminoácidos se refieren a la secuencia No. 2) . La invención también abarca los fragmentos de los polipéptidos de acuerdo a la invención que están N-glucosilados . Los fragmentos son al menos de 50 aminoácidos de longitud, preferentemente de al menos 100 aminoácidos y lo más preferentemente de al menos 150 aminoácidos. En otra modalidad más, un polipéptido puede ser O-glucosilado . Es claro para la persona experta en la técnica que los aminoácidos particulares pueden ser remplazados con otros aminoácidos sin deteriorar la actividad biológica de la proteína. Tales formas modificadas de los polipéptidos de acuerdo a la invención son también parte de la materia de interés de la invención (variantes) . Los reemplazos de aminoácidos son aquellos que no tienen efecto negativo sobre la actividad biológica de la proteína. La persona experta en la técnica puede hacer uso de las reglas bien conocidas para la selección de los reemplazos. Dependiendo del método de preparación, el polipéptido PRV-1 puede, por ejemplo, poseer una ancla de glucosil-fosfatidilinositol . Éste es luego unido a los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 407 a 409 en la secuencia ID No. 2. Una ancla GPI es utilizada para anclar una protelna por medio de un lípido sobre 1 parte exterior de la membrana celular. No obstante, por razones que no han sido todavía concluyentemente elucidadas, se observa frecuentemente que las proteínas ligadas a GPI son también liberadas hacia el medio. Esto es nominado como "derramamiento o difusión" . A la fecha, no se ha aclarado si éste es un proceso específico, por ejemplo tales proteínas son escindidas de la membrana por enzimas de una manera controlada, o si esto representa una pérdida no específica del ancla. Es muy probable en consecuencia que PRV-1 vaya a ser encontrado en la membrana celular y extracelularmente . La forma secretada, la cual no está enlazada a la membrana, es probablemente más importante para el efecto del polipéptido como un factor de crecimiento y el inhibidor de crecimiento, ya que, como un factor de crecimiento, esta forma es capaz de difundirse y alcanzar otras células . Es claro para la persona experta que él puede influenciar el acoplamiento de la proteína a la membrana celular mediante la manipulación de estos aminoácidos C-terminales. Esto concierne particularmente a la preparación de las construcciones de ADN definidas las cuales están encaminadas para la expresión del polipéptido PRV-1 o fragmentos de este polipéptido. Los codones que codifican para estos aminoácidos pueden ser mutados o suprimidos . El gen codifica para un receptor de superficie de la familia uPAR/Ly6. Esta familia de receptores puede transducir las señales mitogénicas, por ejemplo, las señales que estimulan la división celular. Se asume por lo tanto que la sobreexpresión del gen PRV-1, entre otras sobre las células de la médula ósea de los pacientes con p. vera, contribuye a la hiperproliferación de estas células . Se ha encontrado que PRV-1 no es expresado sobre granulocitos en individuos saludables o en pacientes que sufren de otras enfermedades mieloproliferativas , por ejemplo que sufren de leucemia granulocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, trombocitosis esencial o eritrocitosis secundaria. Con el fin de ser capaces de utilizar el polipéptido codificado por el gen PRV-1 para el análisis y los métodos de detección, éste es expeditamente generado a partir del ADN recombinante, con el ADN recombinante que comprende preferentemente la secuencia nucleotídica ID No. 1 o al menos la región de codificación del gen PRV-1, que es los nucleótidos 36 a 1346 de la secuencia ID No. 1, o incluso al menos los nucleótidos 39 a 1262 o 39 a 1238, funcionalmente enlazados a un promotor. No obstante, el ADN recombinante puede también comprender únicamente un fragmento de la secuencia No. 1. La invención se refiere además a un vector que contiene el ADN recombinante para el polipéptido PRV-1, o un fragmento del mismo, y a una célula huésped que es transfectada o transformada con este vector. Las células huésped pueden ser procarióticas, por ejemplo bacterias tales como E. Coli. No obstante, los polipéptidos que son expresados son entonces no glucosilados. Se da por lo tanto preferencia a las células huésped eucarióticas, las cuales son capaces de glucosilar la proteína expresada post-traduccionalmente y modificarla de otras maneras. Los ejemplo de células huésped eucarióticas son células de insecto, tales como las células Sf9, para la expresión después de la infección con baculovirus recombinantes, y células de mamífero, tales como las células 293, células COS, células CHO y células HeLa. Estos ejemplos no son exhaustivos. Es también posible utilizar células de levadura como células huésped. Es claro para la persona experta en la técnica que el patrón de glucosilación puede diferir dependiendo de la célula huésped. La actividad biológica del producto de expresión puede por lo tanto variar también. Se da preferencia particular a las células huésped que glucosilan el producto de expresión de una manera tal que es conservada la actividad biológica de la proteína. Otro aspecto más de la invención es un proceso para la preparación de un polipéptido de acuerdo a la invención. En este proceso, un ADN que codifica para el polipéptido de acuerdo a la invención se provoca que sea expresado en una célula huésped. El medio de cultivo o las células es/son empleados para el aislamiento subsecuente del polipéptido, dependiendo de si el polipéptido expresado es secretado por la célula huésped hacia el medio de cultivo o permanece en la célula. Después de eso, el polipéptido de acuerdo a la invención es concentrado y/o purificado utilizando métodos que son conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo métodos cromatográficos . Los métodos para purificar proteínas son descritos, por ejemplo, en Scopes, R., Protein Purification: Principies and Practice (3rd edition) , Springer Verlag (1994) . En una modalidad particular, el proceso de acuerdo a la invención abarca el paso en el cual el polipéptido glucosilado es concentrado y/o purificado. Este paso puede tener lugar ya sea antes de que el polipéptido de acuerdo a la invención haya sido esencialmente purificado, o después de que éste haya sido ya esencialmente purificado. En el último caso, la porción glucosilada del polipéptido purificado es luego separada y aislada. En la modalidad más preferida del proceso, el polipéptido N-glucosilado es específicamente aislado. En otra modalidad más del proceso, el polipéptido es aislado, el cual está glucosilado en al menos uno de los aminoácidos Asn-46, Asn-189 y Asn-382 de la secuencia No. 2.

El polipéptido PRV-1 que es aislado de los granulocitos o producido recombinantemente puede ser empleado para diagnosticar policitemia vera y para tratar la enfermedad. Una posibilidad terapéutica es aquella de la "terapia antisentido" . Este método emplea una molécula de ARN "antisentido" , que es un ARN que es complementario al ARN de PRV. Ya que el ARN del PRV-1 tiene la secuencia 5 ' -AAAAGCAGAAAGAGATTACCAGCC-3 ' (seq. ID No. 3) en su comienzo, el ARN antisentido requerido, dirigido contra esta secuencia podría poseer la siguiente secuencia de nucleótidos: 5 ' -GGCTGGTAATCTCTTTCTGCTT T-3 ' (seq. ID No. 4) . Este ARN antisentido es incorporado dentro de un vector e introducido dentro de las células de p. vera. Este ARN es introducido, por ejemplo, por medio de transfección, con el vector utilizado para la transfección que está preferentemente configurado tal que éste es introducido específicamente dentro de las células de p. vera. La expresión del ARN antisentido da como resultado que ya no sea posible que el ARNm de PRV-1 sea traducido en un polipéptido. Las células que han sido tratadas de esta manera no forman entonces ninguna protelna PRV-1. La invención se refiere también por lo tanto a un proceso para la detección de p. vera que está caracterizado porque el polipéptido PRV-1 o un epítope del mismo, es detectado y se determina el grado de extensión. La sobreexpresión de este receptor sobre células maduras fuera de la médula ósea, por ejemplo, sobre granulocitos, es una fuerte indicación de la presencia de la enfermedad p. vera. Esta sobreexpresión es expeditamente detectada por medio de un inmunoensayo que utiliza anticuerpos que están dirigidos contra el receptor de PRV-1. Los métodos de prueba adecuados son las variantes de inmunoensayo conocidas que hacen uso de los anticuerpos específicos del polipéptido PRV-1, junto con otros anticuerpos marcados que pueden ser inmovilizados o estar en solución. La marcación puede ser efectuada de una manera conocida per se, por ejemplo utilizando isótopos radioactivos, por medio de fluorescencia o luminiscencia, utilizando enzimas, por medio de reacciones formadoras de color utilizando otros grupos que son adecuados para la determinación. Estas variantes son conocidas para aquellos expertos en la técnica y no requieren ninguna explicación más detallada aquí. De acuerdo a la invención, las pruebas de ELISA son particularmente preferidas. Los anticuerpos que son requeridos para detectar específicamente el receptor de PRV-1 pueden de igual modo ser preparados de una manera que es conocida per se. Los anticuerpos monoclonales y policlonales son adecuados, dándose preferencia al uso de anticuerpos monoclonales. Los péptidos que son derivados de la proteína pueden también ser utilizados para preparar anticuerpos. Dentro del contexto de la presente invención, se logró éxito utilizando los péptidos que tienen las secuencias: a) KVSDLPRQWTPKN (aminoácidos 34 a 46) [seq. ID No. 5], y b) SAREKRDVQP ASQH (aminoácidos 391 a 405) [seq. ID. No. 6].

Los anticuerpos policlonales son normalmente producidos mediante la inmunización de un huésped adecuado (conejo) con el polipéptido PRV-1, donde se enlazan apropiadamente a un soporte inmunológico (adyuvante), y promoviendo una respuesta inmune. Los anticuerpos monoclonales pueden ser generados de una manera conocida per se utilizando la técnica de hibridoma. Los anticuerpos pueden ser purificados por medio de purificación por afinidad. La preparación y la purificación de los anticuerpos se describe, por ejemplo, en "Antibodies: A Laboratory Manual" by Harlow and Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Además, tales anticuerpos policlonales o monoclonales que están dirigidos contra PRV- 1 pueden también ser utilizados para el tratamiento de la enfermedad. En otra modalidad más, el receptor de PRV-1 puede ser detectado utilizando un método de RT-PCR. Para esto, el ARN es primero que todo aislado de las células que sobreexpresan PRV-1, que son como una regla los granulocitos . Una trascripción inversa es luego realizada de una manera conocida per se utilizando un cebador de RT . El cebador RT es preferentemente un cebador que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 7) : ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT .

De esta manera, el ARN específico de PRV-1 es transformado en ADN. Este ADN es luego amplificado en una reacción de PCR de una manera conocida per se. Los dos siguientes cebadores son preferentemente empleados para los ciclos de amplificación: Como el cebador en sentido (SEQ ID No. 8) GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG .

Como el cebador antisentido (SEQ ID No. 9 ) GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG .

La persona experta en la técnica es fácilmente capaz de utilizar la secuencia descrita para encontrar otros cebadores que son también adecuados . Ya que el ARN es utilizado como el material inicial para este método, la señal de PCR es únicamente positiva cuando el gen de PRV-1 es también expresado. Como se explicó anteriormente, este es únicamente el caso cuando el paciente está sufriendo de p. vera. PRV no es expresado en granulocitos de pacientes saludables. En consecuencia, la ausencia de cualquier señal de RT-PCR indica que no está presente p. vera. La cuantificación en el método de RT-PCR es preferentemente efectuada utilizando la tecnología TaqMan® . Esta cuantificación requiere una sonda además de los cebadores . La secuencia preferida de la sonda es 5'-TTCTTGTTGAACCACACCAGACAAATCGG-3' (SEQ ID No : 10). La RT-PCR cuantitativa para la detección del trascrito de PRV-1 es por lo tanto también parte de la materia de interés de esta invención. En otra alternativa más, es también posible el utilizar un método de manchado o transferencia, preferentemente un manchado o transferencia de Northern Blot, para diagnosticar p. vera. Para tal método, el ARN es aislado de los granulocitos y luego examinado para la expresión de PRV-1 utilizando un método de manchado o transferencia, por ejemplo la transferencia de Northern. La secuencia de ADNc de la SEQ ID No. 1, o un segmento de la secuencia, puede ser utilizado como la sonda. La hibridación ocurre entonces únicamente si los granulocitos son derivados de un paciente que sufre de p. vera ya que únicamente entonces existe alguna expresión sobre los granulocitos. La ausencia de hibridación indica que el individuo de quien son derivados los granulocitos no tiene p. vera. Es también posible utilizar un fragmento del gen para la hibridación por transferencia de Northern. Tal fragmento es normalmente mayor de 100 bases de longitud, preferentemente mayor de 300 bases de longitud. Alternativamente, diversos fragmentos diferentes del gen, los cuales pueden ser utilizados como sondas en la transferencia de Northern, pueden ser preparados mediante la digestión del gen con las endonucleasas de restricción. Si los fragmentos son derivados del ADNc, estos están entonces presentes como dobles hebras que tienen que ser separadas en las hebras simples para la hibridación. Los ejemplos adecuados son el fragmento Bam Hl-PstI del par de base 420 hasta el par de base 831, o el fragmento Pstl-Pstl desde el par de base 831 hasta el par de base 1900. El ARNm de PRV-1, y en consecuencia la expresión de PRV-1, puede también ser detectada primero que todo transcribiendo inversamente el AR?m en una reacción de RT-PCR y luego amplificando el AD?c ; el AD? amplificado es luego detectado con una sonda en un método de hibridación. En el caso de un diagnóstico positivo, la enfermedad tiene que ser tratada ya que ésta conduce de otro modo a la muerte dentro de un periodo de tiempo relativamente corto. Para este tratamiento, es posible utilizar anticuerpos específicos que están dirigidos contra PRV-1 y a los cuales pueden ser unidos los componentes citotóxicos, donde sea apropiado. La invención se refiere además por lo tanto a un fármaco el cual, además de los excipientes acostumbrados, comprende anticuerpos que están dirigidos contra el receptor de PRV-1. Ya que el receptor de PRV-1 es sobreexpresado en p. vera, muchos anticuerpos son enlazados sobre la superficie de los granulocitos afectados cuando éstos entran en contacto con el anticuerpo anti-PRV-1. El enlace de muchos anticuerpos a estas células estimula las células inmunológicas para destruir estos granulocitos . De esta manera, es posible eliminar la célula de p. vera específicamente . Sorprendentemente, se ha encontrado también que el polipéptido PRV-1 muestra actividad hematopoyética. El polipéptido PRV-1 es capaz de estimular ciertas células precursoras hematopoyéticas para formar colonias eritroides. Son particularmente los polipéptidos PRV-1 N-glucosilados los que muestran esta función. Los polipéptidos de acuerdo a la invención que son preferidos son por lo tanto los polipéptidos PRV-1 N-glucosilados, y los fragmentos de los mismos, los cuales muestran la actividad del factor de crecimiento. Otro aspecto más de la invención es por lo tanto un fármaco el cual, además de un excipiente farmacéuticamente tolerado, comprende el polipéptido PRV-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo. El polipéptido PRV-1 es preferentemente el polipéptido PRV-1 glucosilado y, aún más preferentemente, el polipéptido PRV-1 N-glucosilado o un fragmento biológicamente activo del mismo. La invención también se refiere a los fármacos que comprenden al menos un polinucleótido de acuerdo a la invención. La presente invención se refiere además al uso del polipéptido PRV-1, a un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo, como un factor de crecimiento in vivo y ex vivo. El polipéptido PRV-1 o un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo, puede ser utilizado para el tratamiento de todas las pancitopenias y pancitopatías en la médula ósea y en la circulación (cambio en los constituyentes celulares de la sangre periférica y la médula ósea) . Los polipéptidos de la presente invención pueden, por ejemplo, ser utilizados para el tratamiento de anemias en el caso de insuficiencia renal, quimioterapia o radiación al cuerpo completo, para el tratamiento de las neuropatías y las trombocitopenias durante la quimioterapia o la radiación al cuerpo completo, para el tratamiento ex vivo de las células pluripotenciales periféricas o de médula ósea para la expansión (multiplicación) y retransfusión hacia los pacientes, y para el tratamiento de la sepsis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y reacciones inflamatorias regionales. Los polipéptidos de la presente invención, o los fármacos que los comprenden, pueden ser administrados en una amplia variedad de formas. La formas de administración comprenden la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral, transdérmica y transmucosal.

Los polinucleótidos de acuerdo a la invención pueden también ser utilizados para el tratamiento de pancitopenias y pancitopatías. En este caso, el objetivo es expresar un polipéptido PRV-1, o un fragmento funcional del mismo, en células del paciente afectado. Los métodos de terapia génica son primeramente, y principalmente utilizados en este contexto. Las células pueden ser aisladas del paciente y transfectadas con un polinucleótido de acuerdo a la invención (manipulación ex vivo) , después de los cual éstas son luego devueltas al paciente. Es también posible concebir métodos en los cuales los polinucleótidos de acuerdo a la invención tengan acceso a las células objetivo por medio de transferencia viral . La expresión de los ácidos nucleicos insertados conduce luego a la actividad hematopoyética . Sorprendentemente, se encontró también que, a concentración más alta, el polipéptido PRV-1 tiene un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de las células. De este modo, se observó, por ejemplo, que la adición de una cantidad incrementada de la proteína PRV-1 virtualmente detiene de manera completa, la formación de las colonias heritróides y granulocíticas/monocíticas . Este efecto se asemeja a la acción de la Interferona-a, el cual es utilizado, entre otros, terapéuticamente en la leucemia mieloide crónica (CML) y en p. vera. Una sustancia inhibitoria endógena posee grandes ventajas en comparación con el agente citostático químico, tal como la hidroxiurea, que fue utilizada cuando la Interferona-a no estaba disponible y es en cierto grado todavía utilizado. Una desventaja de la Interferona-a es que este compuesto activo tiene efectos colaterales muy severos. Los pacientes se sientes como si estuvieran sufriendo de una influenza seria. La presente invención hace disponible una sustancia inhibidora de la hematopoyesis, con la actividad inhibidora que es dependiente de la concentración. Otro aspecto más de la invención es por lo tanto el uso de un polipéptido PRV-1, como se describe en esta solicitud, para inhibir el desarrollo de las células, en particular su uso como un agente citostático. Se da preferencia al polipéptido que es utilizado para inhibir el desarrollo de las células hematopoyéticas. La invención también se refiere al uso de un polipéptido de acuerdo a la invención para producir un fármaco para tratar enfermedades proliferativas . Estas enfermedades son, en particular, las enfermedades mieloproliferativas, p. vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis , CML y también todas las leucemias y linfornas, y también tumores sólidos.

Otro aspecto más de la invención es el uso de un polinucleótido, como se describe en esta solicitud, de un fragmento biológicamente activo y de una variante biológicamente activa del mismo, para inhibir el desarrollo de las células. El polinucleótido puede ser incorporado en un vector adecuado y transfectado en las células objetivo adecuadas. Después de que ha sido expresado en una concentración apropiada el polipéptido PRV-1, o un fragmento biológicamente activo del mismo, o una variante biológicamente activa del mismo, el efecto inhibidor del desarrollo entra en operación. De igual manera, el polinucleótído puede ser incorporado en un vector viral, después de lo cual las células objetivo apropiadas son infectadas viralmente, conduciendo a que PRV-1 sea expresado. La invención también se refiere al uso de un polinucleótido de esta solicitud para producir un fármaco para tratar las enfermedades proliferativas , tales como las enfermedades mieloproliferativas , p. vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis , CML y también todas las leucemias y linfomas y también los tumores sólidos . La invención también se refiere a los equipos para detectar ya sea la policitemia vera o perturbaciones del sistema hematopoyético. Estos equipos comprenden un polinucleótido de acuerdo a la invención y/o un polipéptido de acuerdo a la invención y/o uno o más anticuerpos de acuerdo a la invención. Además de esto, el equipo puede también comprender un recipiente o las composiciones que son adecuadas para implementar reacciones de detección. Los ejemplos de tales composiciones son soluciones amortiguadoras, reactivos para bloquear membranas, soluciones de hibridación, anticuerpos secundarios, soluciones substrato para reacciones de detección, etc. El equipo es preferentemente utilizado para implementar las reacciones de PCR, RT-PCR, transferencias de Northern, transferencias de Southern, transferencias Western y ELISA, RÍA o reacciones similares. Los siguientes ejemplos se dan a manera de explicación.

Ejemplo 1 Caracterización del gen PRV Se llevaron a cabo los siguientes experimentos con el fin de caracterizar el gen: Se utilizó el siguiente protocolo para aislar los granulocitos de sangre almacenada o de sangre obtenida mediante sangrado de pacientes con p. vera: Un volumen igual de solución de dextrano al 3% en 0.9% de Cloruro de Sodio se agregó a la sangre y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente por 20 minutos . - La mezcla se separó en dos fases. La fase colorida clara superior fue retirada y centrifugada por 10 minutos a 1800 g y a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó y el botón celular se resuspendió en el mismo volumen de Cloruro de Sodio al 0.9%. En cada caso, 35 ml de las células en Cloruro de Sodio se colocaron en capas sobre 15 ml de Ficoll-Hypaque . La.s células sobre el Ficoll-Hypaque fueron luego centrifugadas por 60 minutos a 1800 g y a temperatura ambiente sin utilizar el freno. Un botón celular y dos capas con una interfaz se formaron. Las capas y la interfaz fueron aspiradas y el botón celular se resuspendió por 30 segundos en 10 ml de Cloruro de Sodio en 0.2% enfriado con hielo, y 10 ml de Cloruro de Sodio al 1.6% enfriado con hielo se agregaron inmediatamente después de 30 segundos. Las células se centrifugaron por 10 minutos a 1800 g y a temperatura ambiente. Éstas se lavaron luego una vez en 10 ml de PBS y se centrifugaron. El botón celular contenía granulocitos 95-99% puros. El ARN se aisló de estas células utilizando métodos estándares. 10 mg de este ARN se examinaron para la expresión de PRV-1 en una transferencia de Northern. La secuencia completa de ADNc mostrada en la SEQ ID No. 1 fue utilizada como una sonda. Este experimento fue realizado sobre 39 pacientes con p. Vera y 29 muestras control de sangre almacenada. Se encontró que la sonda de PRV-1 se hibridaba fuertemente en el caso de los pacientes con p. vera. No se observó hibridación en las muestras control saludables .

Ejemplo 2 PRV-1 posee actividad del factor de crecimiento Se retiraron embriones de un ratón preñado en 13.5 días después de la fertilización. Los hígados fetales fueron removidos. Las células contenidas en éstos fueron teñidas utilizando anticuerpos y se enriquecieron para las células particulares, y se agotaron para los otros tipos celulares, por medio de cromatografía en columna. Esto da como resultado una mezcla celular que está enriquecida por ciertas células precursoras hematopoyéticas (unidades formadoras de colonias-eritroides , CFU-E) . De este modo, mientras que aproximadamente 2% del hígado fetal consiste de CFU-E, 30-40% de las células enriquecidas consisten de CFU-E. Estas CFU-Es fueron transfectadas utilizando un retrovirus. Para hacer esto, una línea celular de empaquetamiento, designada 293-T, fue ella misma transfectada 48 horas previamente. Las células 293-T son una línea de células de riñon embrionario humano, establecida. Las células 293 -T son establemente transfectadas con varios genes a partir de un retrovirus. Si estas células 293-T son ahora transfectadas con dos plásmidos, denominados pOS y pKAT, las células 293-T producen entonces un retrovirus que es capaz de infectar células de hígado fetal murinas. Si las células 293-T son transfectadas con un vector pOS vacío y pKAT, un retrovirus del tipo silvestre, el cual únicamente expresa las proteínas retrovirales, es entonces producido. Por otra parte, la clonación de un gen humano, por ejemplo PRV-1, en el vector pOS da como resultado la producción de un retrovirus que expresa esta proteína cuando ésta tiene células infectadas. Las células 293 -T secretan el retrovirus hacia el medio de cultivo celular. Después de dos días, el medio de cultivo celular proveniente de las células 293 -T transfectadas que contienen retrovirus es cosechado y filtrado una vez a través de un filtro de 0.45 µm. Con el fin de transfectar las células de hígado fetal, estas últimas células son mezcladas con el medio de cultivo celular filtrado, el cual contiene el retrovirus, y se centrífuga por 2 horas a 1800 rpm y a 20°C en presencia agregada de Polibreno. Las células transfectadas de hígado fetal fueron luego cultivadas en un medio (Methocult, de Cell Systems) que contiene, además de las sales y aminoácidos usuales, suero fetal de ternera, 0.0001-0.4 IU de eritropoyetina (EPO) /ml y metilcelulosa (0.8%) . Las CFU-Es requieren EPO con el fin de formar las colonias hematopoyéticas. La metilcelulosa solidifica el medio en la forma de una jalea, con lo cual se fija en las células individuales en esta jalea de modo que, en contraste a estar en un medio líquido, éstas no pueden moverse. Es por lo tanto posible observar si una colonia hematopoyética es o no formada a partir de una célula simple. Las CFU-Es forman colonias eritroides, es decir colonias que contienen células sanguíneas rojas (eritrocitos) y sus células precursoras.

Después de tres días, se realiza la cuenta del número de colonias hematopoyéticas que se han desarrollado. Son comparadas diversas mezclas. Las mezclas fueron luego examinadas en cada experimento; las mezclas 1-3 son controles muy similares y cada una de ellas puede ser comparada individualmente con la mezcla 4.

Mezcla 1 Células que no fueron transfectadas con un retrovirus; Mezcla 2 Células que fueron transfectadas con un vector pOS vacío; Mezcla 3 Células que fueron transfectadas con una "proteína fluorescente verde" (GFP) , una proteína que no es hematopoyéticamente activa . Mezcla 4 Células que fueron transfectadas con pOS- PRV-1 (vector + gen de acuerdo a la invención) .

Tabla 1: La tabla 1 lista los resultados obtenidos a partir de tres experimentos que fueron realizados como se describe. Las figuras en cada caso indican el número de colonias .

Los experimentos demuestran que las CFU-Es que fueron transfectadas con PRV-1 forman muchas más colonias (hasta tres veces más) que las diversas CFU-Es control. Este resultado indica que PRV-1 es un factor de crecimiento para CFU-E. - Ejemplo 3 Solubilidad del factor de crecimiento PRV-1 Se llevó a cabo un experimento adicional con el fin de investigar si PRV-1 es un factor de crecimiento soluble o si es requerido el contacto célula-célula. Este no es únicamente un retrovirus que es producido por la línea celular de empaquetamiento 293 -T después de que éste ha sido transfectado con los vectores pOS y pKAT. Además, las células 293-T también sintetizan la proteína que codificada por el gen clonado en pOS, por ejemplo PRV-1 en el presente caso. Si el producto génico es una proteína soluble, éste es secretado hacia el medio que rodea la línea celular de empaquetamiento 293-T. Si las células 293 -T son transfectadas únicamente con el vector pOS, sin pKAT, no son entonces formados retrovirus. El medio de cultivo celular contiene únicamente entonces la proteína soluble producida por las células. El medio que es derivado de las células transfectadas con pOS-PRV-1, y el cual no contiene ningún retrovirus, es mezclado con las CFU-Es y la totalidad es sembrada en placa en el medio de metilcelulosa, las colonias resultantes son luego contadas . Se obtuvieron los siguientes resultados: Tabla 2: Solubilidad de PRV-1. Las figuras en cada caso indican el número de colonias.

En este experimento, también, las CFU-Es que fueron tratadas con el medio que contiene PRV-1 formaron muchas más colonias hematopoyéticas que las células control. Se puede concluir a partir de este resultado que PRV-1 es un factor de crecimiento soluble.

Ejemplo 4 PRV-1 tiene también un efecto citostático, inhibitorio.

Los experimentos fueron llevados a cabo sobre células sanguíneas periféricas. Ya que un número pequeño de células precursoras están también circulando en la sangre periférica en individuos saludables, es posible cultivar las colonias hematopoyéticas a partir de células de sangre periférica en un medio adecuado (metilcelulosa) . 40 ml de sangre venosa periférica fueron retirados de un donador saludable (mientras que inicialmente se introducía heparina o EDTA como un anticoagulante) . 15 ml de Ficoll/Hypaque fueron agregados a la sangre y la mezcla fue centrifugada a 1 600 rpm por 40 minutos sin frenado. Esto da como resultado la producción de un gradiente de densidad que fracciona la sangre en sus constituyentes celulares . Después de la centrifugación, las que son denominadas las células mononucleares, las cuales también incluyen las células pluripotenciales, van a ser encontradas en la interfaz entre el suero y el Ficoll. Esta interfaz fue removida y lavada en PBS (solución salina isotónica) . Este produce células mononucleares purificadas, aproximadamente 0.1% de las cuales son células pluripotenciales hematopoyéticas .

Las células mononucleares fueron recogidas en un medio particularmente rico (IMDM) el cual contenía una concentración agregada de 3% de FCS (suero fetal de ternera) . Este 3% de FCS/IMDM subsecuentemente contenía las modificaciones, por ejemplo PRV-1 fue o no agregado a éste . Las células mononucleares en IMDM fueron agregadas, a una densidad de 7 x 105 células/ml, a un medio comercialmente disponible suministrado por Stem Cell Technologies (Methocult) , que contenía IMDM y 30% de FCS, 1% de BSA (albúmina sérica bovina), mercaptoetanol, L-glutamina 2 mM, 3 Ul de EPO (eritropoyetina) /ml y 1.0% de metilcelulosa. Las células se desarrollaron por 14 días en este medio. Las pocas células pluripotenciales que están presentes en esta mezcla son capaces de desarrollarse en colonias hematopoyéticas. Usualmente, entre 100 y 200 colonias hematopoyéticas se desarrollan por cada 7 x 105 células empleadas. Una línea celular que expresa una cantidad muy alta de PRV-1 fue también construida. El PRV-1 que es producido por estas células es alterado tal que éste ya no posee una ancla lipídica. El producto de expresión consiste de los aminoácidos 1-401 de la secuencia SEQ ID No: 2; los aminoácidos 402-437 están por lo tanto ausentes. Este PRV-1 alterado no es por lo tanto, como el PRV-1 de tipo silvestre, incorporado en la membrana celular por medio de un ancla lipídica, si no es más bien completamente secretado desde las células . Como en el ejemplo 3, la línea celular con que se consistió de células 293 que no producen ningún retrovirus, pero las cuales expresan la proteína PRV-1. Para los ensayos de colonia hematopoyética, las células de sangre mononuclear fueron ahora recogidas ya sea en el medio IMDM, las cuales habían sido encubadas por 48 horas con las células no transfectadas (293) , o en el medio que había sido encubado por 48 horas con células que estaban expresando el PRV-1 alterado (293 -GPI-menos-PRV-1) . La habilidad de estas células para formar colonias hematopoyéticas fue luego investigada. El número de colonias de células sanguíneas eritroides (rojas) y mieloides (blancas) fue determinado después de 14 días. El experimento se repitió tres veces y también se llevó a cabo en diferentes días y utilizando diferentes donadores de sangre. Fueron también evaluadas replicas dentro del experimento, Los siguientes resultados fueron obtenidos: Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Se puede concluir a partir de estos datos que una dosis más alta de PRV-1 que aquella utilizada en el ejemplo 3, posee un efecto citostático.

Ejemplo 5 El factor de crecimiento PRV-1 está N-glucosilado Se aislaron granulocitos de un paciente que sufría de p. vera, y se prepararon extractos de proteína a partir de estas células utilizando un protocolo estándar. Estos extractos proteicos fueron tratados de acuerdo con el protocolo para el equipo de "Desglucosilación de N-Glucosidasa F" suministrado por Boehringer Mannheim. Con detalle, esto significa que se agregó un "amortiguador de desnaturalización" a los extractos de proteína y las mezclas fueron calentadas a 95°C por 3 minutos, después de lo cual éstas fueron tratadas ya sea con el "amortiguador de reacción" o con el "amortiguador de reacción" más N-glucosidasa . Cada mezcla fue incubada toda la noche a 37°C y las proteínas fueron analizadas sobre una electroforesis en gel PAGE seguida por un manchado o transferencia de Western. La proteína PRV-1 fue detectada por un anticuerpo dirigido contra una proteína que tenía la secuencia de aminoácidos ID No. 5. Los resultados muestran que mientras que la proteína PRV-1 purificada a partir de los granulocitos es de tamaño de 60-65 kDa, ésta es únicamente de 40 kDa en tamaño después de haber sido digerida con la N-glucosidasa. Esto prueba claramente que PRV-1 está glucosilada sobre los residuos de asparagina (asparagina = N) .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Univers itá ts klini kum Freiburg <120> EL GEN PRV- 1 Y USO DEL MI SMO <130> E980930 <140> PCT/EP00/09594 < 141> 2000- 09-29 <150> DE 199 47 010 . 3 <151> 1999-09-30 <160> 10 <170> PADAT Sequenzmodul, Versión 1.0 <210> 1 <211> 1600 <212> ADN <213> homo sapiens <220> <223> <400> 1 aaaagcagaa agagattacc agccacagac gggtcatgag cgcggtatta ctgctggccc 60 tcctggggtt catcctccca ctgccaggag tgcaggcgct gctctgccag tttgggacag 120 ttcagcatgt gtggaaggtg tccgacctgc cccggcaatg gacccctaag aacaccagct 180 gcgacagcgg cttggggtgc caggacacgt tgatgctcat tgagagcgga ccccaagtga 240 gcctggtgct ctccaagggc tgcacggagg ccaaggacca ggagccccgc gtcactgagc 300 accggatggg ccccggcctc tccctgatct cctacacctt cgtgtgccgc caggaggact 360 tctgcaacaa cctcgttaac tccctcccgc tttgggcccc acagccccca gcagaccca^g 420 gatccttgag gtgcccagtc tgcttgtcta tggaaggctg tctggagggg acaacagaag 480 agatctgccc caaggggacc acacactgtt atgatggcct cctcaggctc aggggaggag 540 gcatcttctc caatctgaga gtccagggat gcatgcccca gccaggttgc aa ctgctca 600 atgggacaca ggaaattggg cccgtgggta tgactgagaa ctgcaatagg aaagatttt 660 tgacctgtca tcgggggacc accattatga cacacggaaa cttggctcaa gaacccactg 720 attggaccac atcgaatacc gagatgtgcg aggtggggca ggtgtgtcag gagacgctgr 7S0 tgctcataga tgtaggactc acatcaacrc tggtggggac aaaaggctgc agcactgttg 840 gggctcaaaa ttcccagaag accaccatcc actcagcccc tcctggggtg cttgtggcct 900 cctataccca cttctgctcc tcggacctgt gcaatagtgc cagcagcagc ag gttctg 960 tgaactccct ccctcctcaa gctgcccctg tcccaggaga ccggcagtgt cctacctgtg 1020 tgcagcccct tggaacctgt tcaagtggct ccccccgaat gacctgcccc aggggcgcca 1080 ctcattgtta tgatgggtac attcatctct caggaggtgg gctgtccacc aaaatgagca 1140 ttcagggctg cgtggcccaa ccttccagct tcttgttgaa ccacaccaga caaatcggga 1200 tcttctctgc gcgtgagaag cgtgatgtgc agcctcctgc ctctcagcat gagggaggtg 1260 gggctgaggg cctggagtct ctcacttggg gggtggggct ggcactggcc ccagcgctgt 1320 ggtggggagt ggtttgccct tcctgctaac tctattaccc ccacgattct tcaccgctgc 1380 tgaccaccca cactcaacct ccctctgacc tcataaccta atggccttgg acaccagatt 1440 ctttcccatt ctgtccatga atcatcttcc ccacacacaa tcattcatat ctactcacct 1500 aacagcaaca ctggggagag cctggagcat ccggacttgc cctatgggag aggggacgct 1560 ggaggagtgg ctgcatgtat ctgataatac agaccctgtc 1600 <210> 2 <211> 437 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Ser Ala Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Phe He Leu Pro Leu 1 5 10 15 Pro Gly Val Gln Ala Leu Leu Cys Gln Phe Gly Thr Val Gln His Val 20 25 30 Trp Lys Val Ser Asp Leu Pro Arg Gln Trp Thr Pro Lys Asn Thr Ser 35 40 45 Cys Asp Ser Gly Leu Gly Cys Gln Asp Thr Leu Met Leu He Glu Ser 50 55 60 Gly Pro Gln Val Ser Leu Val Leu Ser Lys Gly Cys Thr Glu Ala Lys 65 70 75 80 Asp Gln Glu Pro Arg Val Thr Glu His Arg Met Gly Pro Gly Leu Ser 85 90 95 Leu He Ser Tyr Thr Phe Val Cys Arg Gln Glu Asp Phe Cys Asn Asn 100 105 110 Leu Val Asn Ser Leu Pro Leu Trp Ala Pro Gln Pro Pro Ala Asp Pro 115 120 125 Gly Ser Leu Arg Cys Pro Val Cys Leu Ser Met Glu Gly Cys Leu Glu 130 135 140 Gly Thr Thr Glu Glu He Cys Pro Lys Gly Thr Thr His Cys Tyr Asp 145 150 155 160 Gly Leu Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly He Phe Ser Asn Leu Arg Val 165 170 1^5 Gln Gly Cys Met Pro Gln Pro Gl Cys Asn Leu Leu Asn Gly Thr Gln 180 185 190 Glu He Gly Pro Val Gly Met Thr Glu Asn Cys Asn Arg Lys Asp Phe 195 200 205 Leu Thr Cys His Arg Gly Thr Thr He Met Thr His Gly Asn Leu Ala 210 215 220 Gln Glu Pro Thr Asp Trp Thr Thr Ser Asn Thr Glu Met Cys Glu Val 225 230 235 240 Gly Gln Val Cys Gln Glu Thr Leu Leu Leu He Asp Val Gly Leu Thr 245 250 255 fc Ser Thr Leu Val Gly Thr L Gly Cys Ser Thr Val Gly Ala Gln Asn 260 265 270 Ser Gln Lys Thr Thr He His Ser Ala Pro Pro Gly Val Leu Val Ala 275 280 285 Ser Tyr Thr His Phe Cys Ser Ser Asp Leu Cys Asn Ser Ala Ser Ser / 290 295 300 Ser Ser Val Leu Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gln Ala Ala Pro Val Fro 305 310 315 320 Gly Asp Arg Gln Cys Pro Thr Cys Val Gln Pro Leu Gly Thr Cys Ser 325 330 335 Ser Gly Ser Pro Arg Met Thr Cys Pro Arg Gly Ala Thr His Cys Tyr 340 345 350 Asp Gly Tyr He His Leu Ser Gl Gly Gly Leu Ser Thr Lys Het Ser 355 360 365 ^ He Gln Gly Cys Val Ala Gln Pro Ser Ser Phe Leu Leu Asn His Thr 370 375 380 Arg Gln He Gly He Phe Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gln Pro 385 390 395 400 Pro Ala Ser Gln His Glu Gly Gly Gly Ala Glu Gly Leu Glu Ser Leu 405 410 415 Thr Trp Gly Val Gly Leu Ala Leu Ala Pro Ala Leu Trp Trp Gly Val 420 425 430 Val Cys Pro Ser Cys 435 > <210> 3 <211> 24 <212> ARN <213> Secuencia ?rtificial <220> <223> extremo 5' de la. secuencia de PRV-1 <400> 3 aaaagcagaa agagattacc agcc <210> 4 <211> 24 <212> ARN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Molécula Antisentido <400> 4 ggctggtaat ctctttctgc tttt 24 <210> 5 <211> 13 <212> PRT Secuencia Artificial^ <220> <223> aminoácidos 34_-46 de PRV-1 <400> 5 Lys Val Ser Asp Leu Pro Arg Gln Trp Thr Pro Lys Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> aminoácidos 391-405 de PRV-1 <400> 6 Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gln Pro Pro Ala Ser Gln His 1 5 10 15 <210> 7 <211> 27 <212> ÍDM <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador RT <400> 7 attaggttat gaggtcagag ggaggtt 27 <210> 8 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador en sentido <400> 8 gcagaaagag attaccagcc acagacgg 28 <210> 9 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador antisentido <400> 9 gaatcgtggg ggtaatagag ttagcagg <210> 10 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223>sonda <400> 10 ttcttgttga accacaccag acaaatcgg 29

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido N-glucosilado, que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-437 de la secuencia No. 2 ; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2; o un fragmento de los mismos que contiene al menos 50 aminoácidos.

2. Un polipéptido, que consiste esencialmente de una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2.

3. Un anticuerpo contra un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

4. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .

5. Un proceso para detectar policitemia vera, caracterizado porque el polipéptido PRV-1 se hace reaccionar, en un inmunoensayo, con uno o más anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4.

6. Un proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo empleado es un anticuerpo policlonal o monoclonal de conformidad con la reivindicación 3 o 4.

7. Un fármaco para tratar policitemia vera, caracterizado porque, además de los excipientes acostumbrados, éste comprende anticuerpos de conformidad con la reivindicación 3 o .

8. un fármaco que comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, o un polipéptido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2; y al menos un excipiente farmacéuticamente tolerado.

9. Un fármaco que comprende un polinucleótido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de nucleótidos: los nucleótidos 1-1600 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1262 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1238 de la secuencia No . 1 ; los nucleótidos 39-1346 de la secuencia No . 1 ; los nucleótidos 39-1262 de la secuencia No . 1 ; los nucleótidos 39-1238 de la secuencia No .1 ; los nucleótidos 99-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 99-1262 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 99-1238 de la secuencia No. 1; y al menos un excipiente farmacéuticamente tolerado.

10. El uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un polipéptido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-437 de la secuencia No. 2 ; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2; o de un fragmento biológicamente activo de los mismos, como un factor de crecimiento.

11. El uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un polipéptido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-437 de la secuencia No. 2 ; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2; o de un fragmento biológicamente activo de los mismos o una variante biológicamente activa de los mismos, para producir un fármaco para el tratamiento de pancitopenias y pancitopatías en la médula ósea y en la circulación.

12. El uso de un polinucleótido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de nucleótidos: los nucleótidos 1-1600 de la secuencia No. 1 ; los nucleótidos 36-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1262 de la secuencia No. 1 los nucleótidos 36-1238 de la secuencia No. 1 los nucleótidos 39-1346 de la secuencia No. 1 los nucleótidos 39-1262 de la secuencia No. 1 los nucleótidos 39-1238 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 99-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 99-1262 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 99-1238 de la secuencia No. 1; o de un fragmento de los mismos o una variante de los mismos, para producir un fármaco para el tratamiento de pancitopenias y pancitopatías en la médula ósea y en la circulación .

13. El uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un polipéptido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-437 de la secuencia No. 2 ; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2; o de un fragmento biológicamente activo de los mismos o una variante biológicamente activa de los mismos, para tratar y/o multiplicar las células endógenas y/o las líneas celulares establecidas ex vivo o in vitro.

14. El uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un polipéptido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2; o de un fragmento biológicamente activo de los mismos a una variante biológicamente activa de los mismos, para inhibir el desarrollo de las células.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido es utilizado como un agente citostático.

16. El uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un polipéptido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-401 de la secuencia No. 2; o de un fragmento biológicamente activo de los mismos o de una variante biológicamente activa de los mismos, para producir un fármaco para tratar enfermedades proliferativas .

17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la enfermedad proliferativa se selecciona del grupo que comprende enfermedades mieloproliferativas , p. vera, trombocitopenia esencial, mielofibrosis , CML, todas las leucemias y linfornas y también tumores sólidos.

18. El uso de un polinucleótido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de nucleótidos: los nucleótidos 1-1600 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1262 de la secuencia No los nucleótidos 36-1238 de la secuencia No. los nucleótidos 39-1346 de la secuencia No. los nucleótidos 39-1262 de la secuencia No los nucleótidos 39-1231 de la secuencia No. los nucleótidos 99-1346 de la secuencia No los nucleótidos 99-1262 de la secuencia No los nucleótidos 99-1238 de la secuencia No. 1; o de un fragmento de los mismos o una variante de los mismos, para inhibir el desarrollo de las células.

19. El uso de un polinucleótido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de nucleótidos: los nucleótidos 1-1600 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1262 de la secuencia No. los nucleótidos 36-1238 de la secuencia No. los nucleótidos 39-1346 de la secuencia No. los nucleótidos 39-1262 de la secuencia No. los nucleótidos 39-1238 de la secuencia No los nucleótidos 99-1346 de la secuencia No. los nucleótidos 99-1262 de la secuencia No. los nucleótidos 99-1238 de la secuencia No o de un fragmento del mismo o una variante del mismo, para producir un fármaco para el tratamiento de enfermedades proliferativas .

20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la enfermedad proliferativa se selecciona del grupo que comprende enfermedades mieloproliferativas , p. vera, trombocitopenia esencial, mielofibrosis , CML, todas las leucemias y linfomas y también tumores sólidos.

21. Un equipo para detectar policitemia vera o perturbaciones del sistema hematopoyético, que comprende al menos un polinucleótido que comprende esencialmente una de las siguientes secuencias de nucleótidos: los s*~$ nucleótidos 1-1600 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1262 de 5 la secuencia No. 1; los nucleótidos 36-1238 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 39-1346 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 39-1262 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 39-1238 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 99-1346 de la secuencia No. 1; los 10 nucleótidos 99-1262 de la secuencia No. 1; los nucleótidos 99-1238 de la secuencia No. 1; o un fragmento de los mismos o una variante de los mismos, y/o al menos un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o un polipéptido que comprende esencialmente una de las 15 siguientes secuencias de aminoácidos: los aminoácidos 1- 437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 1-401 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-437 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 22-409 de la secuencia No. 2; los aminoácidos 20 22-401 de la secuencia No. 2; o un fragmento biológicamente activo de los mismos o una variante biológicamente activa de los mismos y/o al menos un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3 o 4.

22. Un equipo para detectar la proteína PRV-1 de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque éste es un equipo de prueba de ELISA.

23. Un equipo de conformidad con la reivindicación 21, para detectar el ARNm de PRV-1, caracterizado porque éste es un equipo de análisis de RT-PCR semicuantitativo o cuantitativo.

24. Un equipo de conformidad con la reivindicación 21, para detectar el ARNm de PRV-1, caracterizado porque es un equipo de transferencia de Northern.