MXPA02001344A

MXPA02001344A - Peptidos que bloquean la infeccion viral y metodos para su uso.

Info

Publication number: MXPA02001344A
Application number: MXPA02001344A
Authority: MX
Inventors: Anders Vahlne
Original assignee: Tripep Ab
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2002-07-22
Also published as: EP1206273A2; HUP0202502A2; CA2378460A1; NO20020571D0; JP2003506410A; CN1377275A; KR20020025970A; US6258932B1; PL354090A1; CZ2002402A3; IS6262A; AU5700800A; WO2001010456A3; IL147969A0; NO20020571L; US20020091086A1; WO2001010456A2

Abstract

Se da a conocer el descubrimiento de los peptidos, en forma de amida, que inhiben la infeccion viral, que incluye el virus de la infeccion de la inmunodeficiencia humana (HIV). Tambien se describen metodos de uso de dichos peptidos, que incluyen el uso en medicamentos para el tratamiento y prevencion de las infecciones virales, tal como dicha infeccion del HIV.

Description

PÉPTIDOS QUE BLOQUEAN LA INFECCIÓN VIRAL Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al descubrimiento de péptidos que inhiben las infecciones virales, que incluyen la infección del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) . Más específicamente, los medicamentos que comprenden varios pequeños péptidos son descritos para el uso en el tratamiento y la prevención de las infecciones virales, tal como la infección de HIV.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Todos los virus se componen de una cubierta de proteína que rodea un núcleo que contiene un ácido nucleico. La cubierta de proteína rodea directamente el ácido nucleico viral y se nombra una cápsida, en tanto, el complejo completo de proteína y ácido nucleico, que tiene tanto la cápsida como el ácido nucleico, se nombra una nucleocápsida. Los arenavirus, rotavirus, orbivirus, retrovirus (que incluyen los lentivirus) , papilomavirus, adenovirus, herpesvirus, paramixovirus, mixovirus y hepadnavirus, todos exhiben estas características estructurales generales. (Virology, Fields. Ed. tercera edición, Lippencott-Raven editores, página 1513, 1645, 1778, 2047, 2113, 2221 y 2727 (1996) ) . La cápsida se compone de muchas subunidades (capsómeros) y los capsómeros se forman de varios homo- o hetero-polímeros de proteínas. Los enlaces no covalentes entre los capsómeros en un conjunto viral son de la misma clase que estabiliza un dominio de proteína doblado. La interfaz entre dos subunidades puede verse muy similar a un solo dominio, con las cadenas laterales de aminoácidos empacadas herméticamente entre sí. Una característica común a la mayoría de las estructuras de los virus analizadas es la manera en que una cadena de polipéptido de un capsómero puede extenderse bajo o sobre dominios de capsómeros vecinos. Estos brazos de polipéptidos extendidos se entrelazan con otros brazos de polipéptidos y ayudan a estabilizar la cápsida iniciando interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno y puentes de sal . Los contactos entre capsómeros individuales, y para algunos virus, también hacen contacto con las proteínas del núcleo, determinan la estructura general de la cápsida y si un número de capsómeros idénticos esta involucrado, se repiten los contactos que ocurren y la estructura resultante es simétrica. (Virology, Fields Ed. , tercera edición, Lippencott-Raven editores, p 62 (1996)).

Algunos virus sencillos se forman espontáneamente de sus componentes disociados, mientras otros requieren modificaciones catalizadas de enzimas de los capsómeros para el conjunto de inicio. El propio conjunto viral es impulsado por la estabilidad de las interacciones entre las subunidades de proteínas bajo condiciones que favorecen la asociación. Los virus más complejos son a menudo construidos de subconjuntos que se han sometido a procesos de auto-ensamblado. (Virology, Fields Ed. , tercera edición, Lippencott-Raven editores, páginas 62, 70, 1646 y 1888 (1996) ) . Aunque las cápsidas de muchos virus difieren en la composición de proteínas, se ha desarrollado un diseño estructural viral general, caracterizado por capsómeros polimerizados que, a su vez, se componen de varios homo- o hetero-polímeros de proteínas. El HIV es el nombre dado a un lentivirus que infecta a los humanos y causa el síndrome de inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) . Los aislados de lentivirus de humanos son agrupados en uno o dos tipos (HIV-1 y HIV-2) en la base de las propiedades serológicas y el análisis de secuencias de los genomas virales clonados molecularmente. Los lentivirus distintos genéticamente se han obtenido de varias especies de primates no humanos, que incluyen los monos verdes africanos, monos ennegrecidos, mandriles, chimpancés y sicones. Colectivamente, los aislados de lentivirus de primates no humanos se nombran SIV. El análisis de secuencia revela que los genomas de algunas cepas de SIV y las cepas de HIV-1 y HIV-2 exhiben un alto grado de homología. Además, la microscopía electrónica revela que la ultraestructura de las HIV y SIV son similares en que ambas tienen viriones de alrededor de 110 nm de diámetro, con una nucleocápsida en forma de cono rodeada por una membrana de dos capas de lípidos, que contiene púas de glicoproteína de envoltura. (Virology, Fields Ed., tercera edición, Lippencott-Raven editores, p 1882-1883 (1996)). El HIV es un retrovirus complejo que contiene al menos siete genes. Los genes estructurales virales, designados gag, pol y env, respectivamente, codifican para las proteínas del núcleo viral, la transcriptasa inversa y las glicoproteínas virales de la envoltura viral. Los genes de HIV restantes son genes auxiliares implicados en la réplica viral. Los genes gag y env codifican poliproteínas, es decir las proteínas sintetizadas de cada uno de estos genes son desdobladas post-traslacionalmente en varias proteínas más pequeñas. Aunque la configuración general de los viriones de HIV y SIV es esférica, la nucleocápsida es asimétrica y tiene una dimensión larga de alrededor de 200 nm y un extremo libre amplio de alrededor de 40-60 nm, y un extremo estrecho de alrededor de 20 nm de ancho. La nucleocápsida «vß dentro de cada virión maduro se compone de dos moléculas de un genoma viral del ARN de cordón sencillo, encapsulado por proteínas procesadas proteolíticamente del polipéptido precursor de Gag. El desdoblamiento de la poliproteína del gene gag Pr559ag por la proteasa codificada viral (PR) produce proteínas de cápsida maduras. Estos productos del gene gag son de la proteína matriz (pl7) que se piensa será ubicada entre la nucleocápsida y la envoltura del virión; la proteína de cápsida principal (p25) , que forma la cubierta de la cápsida; y la proteína déla nucleocápsida (p9) que se une al genoma de ARN viral, Este proceso proteolítico en células infectadas se enlaza a la morfogénesis del virión. (Virology, Fields Ed. , tercera edición, Lippencott-Raven editores, página 1886-1887 (1996) ) . La proteína de la cápsida principal p24 (también nombrada CA) contiene alrededor de 240 aminoácidos y exhibe un peso molecular de 24-27 kD. La proteína p24 se auto-asocia para formar complejos de dímeros y oligoméricos, tan grandes como los dodecámeros . Los estudios genéticos con mutaciones en la poliproteína de gag de HIV-1 tienen varios dominios funcionales identificados en la proteína p24, que incluye la mitad de la terminal C de la molécula y una región de homología principal (MHR) que se extiende por 20 aminoácidos, que se conservan en las proteínas p24 de diversos retrovirus. Estas mutaciones parecen afectar el conjunto de la nucleocápsida precursor. (Virology, Fields Ed., tercera edición, Lippencott-Raven editores, pp 1888- 1889 (1996) ) . Desde el descubrimiento del HIV-1 como un agente etiológico del SIDA, se han hecho progresos significantes en comprender los mecanismos por los cuales el virus causa enfermedades. Mientras muchas pruebas de diagnóstico se han desarrollado, el progreso en la terapia de la vacuna del HIV ha sido lenta, principalmente debido a la naturaleza heterogénea del virus y la carencia de modelos adecuados de animales (Véase, por ejemplo, Martin, Nature, 345:572- 573 (1990) ) . Una variedad de agentes farmacéuticos se han usado como intentos de tratar el SIDA. Muchas, si no todas, de estas drogas, sin embargo, crean serios efectos secundarios que limitan grandemente su utilidad como agentes terapéuticos. La transcriptasa inversa del HIV es una droga objetivo, debido a su papel crucial en la réplica viral. Varios derivados de nucleósidos se ha encontrado inhiben la transcriptasa inversa del HIV, que incluyen la azidotimidina (AZT, zidovidina) . La AZT causa serios efectos secundarios, y muchos pacientes no pueden tolerar su administración.

Otros análogos de nucleósidos que inhiben la transcriptasa inversa del HIV se ha encontrado causan mayores efectos i*, i * *. * * a a *.******** *. * *** * ** * * * **** * *- * * *í lat """^' secundarios que el AZT. Otra droga objetivo es la proteasa del HIV (PR) crucial para el desarrollo del virus. La PR es una proteasa aspártica y puede ser inhibida por compuestos sintéticos. (Richards, FEBS Lett . , 253;214-216 (1989)). 5 Estos inhibidores de la proteasa inhiben el crecimiento del HIV más efectivamente que los inhibidores de la transcriptasa inversa, pero la terapia prolongada se ha asociado con enfermedades metabólicas, tal como la lipodistrofia, hiperlipidemia y resistencia a la insulina. 10 Adicionalmente, el HIV desarrolla rápidamente resistencia a los inhibidores de la transcriptasa inversa, análogos de nucleósidos / nucleótidos e inhibidores de la proteasa. Esta resistencia puede también extenderse entre pacientes. Los estudios han mostrado, por ejemplo, que un 15 décimo de los individuos recientemente infectados por el HIV ya han desarrollado resistencia a la AZT, probablemente debido a que se infectaron por una persona que, en el momento de la transmisión, llevaba un virus que era resistente al AZT. 20 Sería útil en el tratamiento y prevención de las infecciones virales, incluyendo el HIV y el SIV; tener agentes terapéuticos específicos y selectivos, que causaran pocos, si los hay, efectos secundarios. 25 ***S*il *¿* ~*e***** ^ .^^j ialh . . *********** „„ . . . *** ** **** * .** „ * ** *, **** ** k í ' -^p^'p COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a pequeños péptidos (de dos a diez aminoácidos de longitud) que inhiben la infección viral . Una estructura de cápsida intacta es de 5 importancia vital para la infección de un virión. Una manera de interrumpir el conjunto de las macromoléculas de la proteína de la cápsida, para su infección, dependiente de la di-, tri-, tetra- o polimerización, es construir pequeñas moléculas que afectan tales interacciones de proteína-0 proteína. Se descubrió que péptidos pequeños con un grupo de hidroxilo en la terminal de carboxilo reemplazado con un grupo de amida, tienen tal efecto inhibidor en las interacciones de la proteína de la cápsida. Así, aspectos de la presente invención se refieren a péptidos pequeños 5 modificados que afectan al conjunto de la cápsida viral. En modalidades convenientes, los péptidos cortos se unen a una proteína que está involucrada en la organización de los capsómeros y el ensamblado de la cápsida de la HIV-1, HIV-2 y SIV, y así inhiben y/o previenen el ensamble apropiado de la cápsida y, así, la infección viral.

Los péptidos pequeños, Gly-Pro-Gly-NH2 (GPG-NH2) , Gly-Lys- Gly-NH2 (GKG-NH2) , Cys-Gln-Gly-NH2 (CQG-NH2) , Arg-Gln-Gly-NH2 (RQG-NH2) , Lys-Gln-Gly-NH2 (KOG-NH2) , Ala-Leu-Gly-NH2 (ALG- NH2) , Gly-Val-Gly-NH2 (GVG-NH2) , Val-Gly-Gly-NH2 (VGG-NH2) , Ala-Ser-Gly-NH2, (ASN-NH2) , Ser-Leu-Gly-NH2 (SLG-NH2) y Ser- i.l J- Í ¡i *»! * * **** ** * ** ' **# *, -**. ** , , ***** ***** * * .... a». ' ' *>*^*S?l»l *á**Íf*** Pro-Thr-NH2 (SPT-NH2) son especies preferidas. Estos péptidos pequeños son péptidos miméticos, que se asemejan en su estructura (colectivamente nombrados como "agentes de péptidos") se usan en una forma monomérica o multimérica. Los agentes de péptidos de la presente invención son adecuados para la aplicación terapéutica y profiláctica en mamíferos, que incluyen el hombre, que sufren de una infección viral . En una modalidad, una composición para inhibir la réplica viral en las células huésped infectadas con un virus, tiene una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida, que tiene la fórmula X?X2X3-NH2, donde Xi, X2 y X3 son cualquier aminoácido, y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2, y donde la composición inhibe la réplica viral interrumpiendo el ensamblado de la cápsida viral . Convenientemente, X3 de estos péptidos es la glicina. Adicionalmente, las composiciones descritas antes pueden incluir un péptido en forma de amida, seleccionado del grupo que consta de los péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2 En otra modalidad relacionada, la composición, descrita anteriormente, es un péptido en forma de amida y tiene la fórmula X4X5X?X2X3-NH2 , en que X4 y X5 son cualquier aminoácido y cualquiera de uno o dos aminoácidos pueden estar ausentes Esta modalidad puede ser un tripéptido que tenga la fórmula X?X2X3 en que la secuencia se encuentra en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida del virus . En algunas modalidades, las composiciones, antes descritas, se unen a un soporte y en otras modalidades, las composiciones descritas anteriormente se incorporan en un producto farmacéutico que tiene un portador aceptable farmacéuticamente. Por ejemplo, el péptido en la forma de amida puede tener la fórmula Gly-Lys-Gly-NH2 y se puede unir a un soporte . Además, el péptido en la forma de amida puede tener una fórmula, tal como Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2 o Ser-Leu-Gly-NH2. Estos péptidos pueden también estar unidos a un soporte. Los métodos para inhibir la réplica del HIV en un huésped, son también modalidades. Un acercamiento, por ejemplo, implica administrar a una célula una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida, que tiene la fórmula de X?X2X3-NH2, donde X1# X2 y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2. Por lo tanto, el péptido anterior puede ser seleccionado del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2 , Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2. El método, descrito antes, puede además incluir la etapa de administrar un tratamiento antiviral, seleccionado del grupo que consta de inhibidores de la transcriptasa inversa análoga de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa análogos del nucleótido, inhibidores de la transcriptasa inversa sin nucleósidos, e inhibidores de la proteasa. El péptido usado en el método anterior puede estar unido a un soporte o se puede administrar en una composición farmacéutica que comprende un portador aceptable farmacéuticamente . En otra modalidad, una composición para inhibir la réplica del HIV en células huésped incluye una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida, que tiene la fórmula XXX2X3-NH2, donde Xi, X2 y X3, son cualquier aminoácido y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2. En este método, el péptido puede ser seleccionado del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2 Este método puede también incluir la administración de un tratamiento antiviral, seleccionado del grupo que consta de inhibidores de la transcriptasa inversa análoga de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa análoga de nucleótidos, inhibidores de la transcriptasa inversa sin nucleósidos e inhibidores de la proteasa. Además, el péptido usado en este método puede estar unido a un soporte o se puede administrar en una composición farmacéutica que comprende un portador aceptable farmacéuticamente . En otro método, un acercamiento para interrumpir el ensamble de la cápsida viral se suministra. Este acercamiento implica el contacto de una célula con una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida, de la fórmula X?X2X3-NH2, donde Xi, X2 y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2. Convenientemente, el péptido usado en este método se selecciona de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2. En algunas modalidades, X3 es glicina en el péptido usado en este método. En otras modalidades, el método emplea un péptido en la forma de amida, que tiene la fórmula X4X5X?X2X3-NH2, donde X4 y X5 son aminoácidos y en que cualquiera de uno o dos aminoácidos está ausente. Aún más, el método puede involucrar usar un tripéptido X1X2X3, que se encuentra en la secuencia de aminoácidos de la proteína del virus.

Muchas veces, el péptido del método se une a un soporte o se incorpora en una composición farmacéutica. También se suministran métodos de identificación de los agentes de péptidos. Por un método, por ejemplo, un 5 agente de péptido para la incorporación en una composición farmacéutica anti-viral, se identifica por el contacto con una pluralidad de células infectadas con un virus, por una cantidad efectiva de un agente de péptido, en que dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2, analizando el virus para 0 la formación incompleta de la cápsida, y seleccionando el agente del péptido que induce la formación incompleta de la cápsida. Este método puede implicar un análisis de la formación de la cápsida que emplea la microscopía, y el virus puede ser seleccionado del grupo que consta del HIV-1, 5 HIV-2 y SIV. Asimismo, el agente del péptido identificado puede ser seleccionado del grupo que consta de un tripéptido, un oligopéptido y un péptido mimético. Por ejemplo, el agente del péptido anterior se puede seleccionar del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: 0 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln- Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2. En una modalidad preferida, el agente del péptido usado en el método anterior tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos p24. **** 1* ** *\ í i***. l íí** * * . I. a- a. , *.***, ***** *. ** * * , . J- • •> •> J$^ *l*S? En otra modalidad, se suministra un método para identificar un agente de péptido que se une a una proteína viral, el cual implica suministrar una proteína viral, el contacto de la proteína viral con una cantidad efectiva de un agente de péptido, donde dicho agente de péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2, y detectar la formación de un complejo, que comprende la proteína viral y el agente del péptido. Como antes, este método puede implicar el uso de una proteína viral que está en la forma de un virus, seleccionado del grupo que consta del HIV-1, HIV-2 y SIV. Además, en algunos aspectos, el agente del péptido se selecciona del grupo que consta de un tripéptido, un oligopéptido y un péptido mimético. Convenientemente, el método anterior emplea un agente de péptido seleccionado del grupo que consta de los péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2. Adicionalmente,, se suministra un método para obtener una composición farmacéutica, en la cual el agente del péptido, identificado por los métodos anteriores, se incorpora en una composición farmacéutica. También se suministra otro acercamiento para obtener una composición farmacéutica, que implica la administración a una célula de una cantidad efectiva de un péptido, en forma de amida, que tiene la fórmula X?X2X3-NH2, donde Xi, X2 y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2, detectar una inhibición de la réplica viral en la célula e incorporar el péptido que causa la inhibición de la réplica viral en la composición farmacéutica. Este método puede implicar el uso de un péptido, que se selecciona del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2. Además, el método anterior puede involucrar la etapa de incorporar un compuesto antiviral, seleccionado del grupo que consta de inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa análogos del nucleótido, inhibidores de la transcriptasa inversa sin nucleósidos, e inhibidores de la proteasa en la composición farmacéutica.

Adicionalmente, el método anterior puede implicar la etapa de incorporar un portador en dicha composición farmacéutica. En otra modalidad, se suministra una composición para inhibir la réplica viral en células huésped, infectadas con un virus, que incluye una cantidad efectiva de un péptido de la fórmula X?X2X3-R, donde Xi, X2 y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2. donde R es un grupo de modulación unido a la terminal de carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo de amida u otra parte que tenga una carga similar y volumen esférico, y donde dicha composición inhibe la réplica viral interrumpiendo el ensamblado de la cápsida viral . Esta composición puede ser un péptido seleccionado del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2 y Ser-Pro-Thr-NH2. Convenientemente, X3 es glicina en estas modalidades. Adicionalmente, la composición anterior puede incluir un péptido que tenga la fórmula 4X5X6X7X8X9X?oX?X2 3- , donde X4, X5, X6, X7, X8, Xg y Xio son cualquier aminoácido y donde cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoácidos están ausentes, donde R es un grupo de modulación unido a la terminal de carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo de amida u otra parte que tenga una carga y volumen esférico similares. Preferiblemente, la composición anterior incluye un péptido X?X2X3 que se encuentra en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida del virus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que representa los resultados de un estudio de infección del HIV, conducido en células HUT78.

La Figura 2 es una forma compuesta de micrografías electrónicas de partículas de HIV sin tratar. La Figura 3 es una forma compuesta de micrografías electrónicas de partículas de HIV que se han puesto en contacto con el inhibidor de proteasa Ritonavir. La Figura 4 es una forma compuesta de micrografías electrónicas de partículas de HIV que se han puesto en contacto con GPG-NH2. La Figura 5 ilustra un alineamiento de la secuencia de proteínas, que corresponde a la terminal de carboxilo de la proteína HIV-1 p24 (residuos 146-231) y las secuencias de la proteína HIV-2, SIV, virus del sarcoma de Rous (RSV) , virus tipo 1 de leucemia de células T humanas (HTLV-1) , virus de tumores mamarios del ratón (MMTV) , virus del mono Mason-Pfizer (MPMV) y virus de leucemia del murino Moloney (MMLV) . La barra representa la región de homología mayor (MHR) . La Figura 6 es una gráfica de la p24 (pg/ml) detectada en el sobrenadante de células infectadas con HIV, que fueron cultivadas en la presencia y ausencia de la GPG-NH2, Ritonavir (Rito), AZT o combinaciones de estos agentes. La Figura 7 ilustra un soporte de cromatografía de capa delgada, que tiene compuestos rotulados radioactivos unidos a no proteínas, separados, de la orina de la rata y el plasma de la rata (rp) muestreados después de la alimentación oral del 14C-GPG-NH2, al igual que el plasma humano (Hp) , incubado con 14C-GPG-NH2; los tiempos de muestreo tienen sufijos y R1-R3 sirve para indicar la posición de los compuestos radioactivos identificados. La Figura 8 es un soporte de cromatografía de capa delgada, que tiene separado la 14C-GPG-NH2, que se trató con 0. ÍN HCl y 50 mM KCl, y muestreado en un período de 24 horas; los números representan el tiempo de la exposición de ácido, y la R sirve para indicar la posición de la 14C-GPG-NH2 identificada. La Figura 9 es una gráfica de la división del 14C-GPG-NH2 y sus metabolitos en la sangre de la rata. La Figura 10 es una gráfica de la eliminación de la radioactividad de la fracción de plasma de ratas que se alimentaron oralmente con la 14 C-GPG-NH2. La Figura 11 muestra proteínas de la plasma de la rata, crudas y fraccionadas, que se separan en un SDS/PAGE al 10%; 8-f3 se refiere a la tercera fracción tomada de una muestra a las 8 horas en seguida de la administración de la 14 C-GPG. , 8-f1 se refiere a la primera fracción tomada de una muestra 8 horas después de la administración de la 14 C-GPG. , 4-f3 se refiere a la tercera fracción tomada de una muestra, 4 horas después de la administración de la 14 C-GPG. , 4-f1 se refiere a la primera fracción tomada de una muestra, 4 horas después de la administración de la 14 C-GPG. , 8h, 4h, 2h y 1 h, se refieren al tiempo de la muestra tomada después de la administración de la 14 C-GPG. , y B1-B4 sirve para indicar la posición de las proteínas identificadas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA El inventor ha descubierto que pequeños péptidos modificados, que tienen secuencias que corresponden a las proteínas de la cápsida viral, impiden y/o inhiben la infección viral interrumpiendo la formación apropiada de la nucleocápsida. Dichos péptidos son útil en el tratamiento de enfermedades virales, en particular en sujetos afectados con HIV/SIDA, y como agentes preventivos para los pacientes con riesgo de una infección viral, en particular la infección de HIV y para el uso con dispositivos médicos donde el riesgo de exposición al virus es significante. En la siguiente descripción, el inventor demuestra que los péptidos pequeños, en forma de amida, que tienen una secuencia que corresponde a proteínas virales, tal como la GPG-NH2. GKG-NH2, ROG-NH2, KOG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2, inhiben la réplica de virus, tal como el HIV-1, HIV-2 y SIV, según se mide por los ensayos de infección viral que vigilan la cantidad de la proteína de la cápsida o la actividad de la transcriptasa inversa, presente en el sobrenadante del cultivo. Asimismo, el inventor presenta evidencia que estos péptidos pequeños inhiben la infección viral por un mecanismo independiente del lazo de V3, en una etapa subsiguiente al ADN, ARN y las síntesis de proteínas . 5 Las imágenes microscópicas electrónicas de las partículas de HIV tratadas con pequeños péptidos revelan que esta novedosa clase de agentes antivirales, interrumpen el ensamblado apropiado de la cápsida, de una manera distinta de los inhibidores de la proteasa. Además, los ensayos de 10 unión in vivo revelan que los péptidos pequeños se unen a la proteína de la cápsida principal (p24) del HIV-1. Debido a que las secuencias de las varias proteínas de cápsida virales se conocen, tal como los miembros de las familias de arenavirus, rotavirus, orbivirus, retrovirus, papilomavirus, 15 adenovirus, herpesvirus, paramixovirus, mixovirus y hepadnavirus, varios péptidos pequeños que corresponden a estas secuencias, pueden ser seleccionados y clasificados rápidamente para identificar cuáles inhiben efectivamente y/o previenen la infección viral, usando los ensayos de 20 infección viral o las técnicas de microscopía de electrones o ambos, descritos aquí, o modificaciones de estos ensayos, como será evidente a los expertos en la materia, dada la presente descripción. ***?^it*^*»* **m^**s**^&-**.

Varios acercamientos para obtener herramientas biotecnológicas y composiciones farmacéuticas, que comprenden los péptidos pequeños y los péptidos miméticos (denominados colectivamente como los "agentes de péptidos") que corresponden a secuencias de las proteínas pequeñas de la cápsida, se dan abajo. Aunque los agentes de péptidos preferibles son los tripéptidos que tiene un grupo de amida en sus terminales de carboxi, tal como la GPG-NH . GKG-NH2, ROG-NH2, KOG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2, el inventor también suministra composiciones y métodos para inhibir la réplica viral en las células huésped, que incluyen la réplica en estas células huésped que comprenden un péptido en la forma de amida, que tiene la fórmula de X?X2X3-NH2 o la fórmula de X4X5X?X2X3-NH2, donde X1# X , X3, X4 y X5, son cualquier aminoácido y donde cualquiera de uno o dos aminoácidos pueden estar ausentes. Modalidades preferidas tienen un residuo de glicina como X3 En algunas modalidades son provistos los agentes de péptidos en forma monomérica, en otras, ellos son suministrados en forma multimérica o en forma muítimerizada. Los agentes de péptidos unidos a un soporte son también usados en varias modalidades. La composición farmacéutica que comprende los agentes de péptidos se administran como agentes terapéuticos o profilácticos, o ambos para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad viral preferiblemente, la infección de HIV.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes de péptidos son administradas en combinación con otros tratamientos antivirales, que incluyen los inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleótidos, inhibidores de la transcriptasa inversa sin nucleósidos y los inhibidores de la proteasa. El inventor también suministra evidencia que los péptidos pequeños son resistentes a la hidrólisis acida, que una cantidad significante del péptido pequeño se entrega efectivamente a la sangre, plasma y tejidos orgánicos, cuando se administran a los sujetos de prueba, y que la administración de grandes dosis de péptidos pequeños a los sujetos de prueba es relativamente no tóxica. Adicionalmente, el inventor describe varios métodos de identificar un agente de péptido que inhiba o prevenga la réplica viral o interrumpa el ensamblado de la cápsida viral o ambos. Por un acercamiento, una cantidad efectiva de un agente de péptido se pone en contacto con las células infectadas con un virus y estas células son analizadas en la réplica viral o la presencia de los productos virales. Además, usando la microscopía electrónica, la capacidad de un agente de péptido para interrumpir el ensamblado de la cápsida puede ser determinado fácilmente. Aún más, se describen métodos que identifican un agente de péptido que se une a una proteína de la cápsida (por ejemplo la p24) y así interrumpe el ensamblado de la cápsida y también la réplica viral. Por lo tanto, una proteína de la cápsida (por ejemplo la p24) se 5 pone en contacto con un agente de péptido, por ejemplo un péptido, en forma de amida, que tiene la fórmula X?X2X3-NH2, donde Xlf X2 y X3 son cualquier aminoácido, y un complejo que comprende la proteína de la cápsida (por ejemplo la p24) , unida con el agente del péptido, se identifica. Mezclas de 10 reacción que tienen una proteína viral (por ejemplo p24) y un agente de péptido y un complejo biomolecular, que tiene una proteína viral (por ejemplo p24) unidas a un agente de péptido, también se enseñan en la presente descripción. La forma de amida de los péptidos pequeños, 15 listados en la siguiente Tabla 1, se probaron. Muchos de estos péptidos pequeños se seleccionaron y sintetizaron debido a que ellos corresponden o completa o parcialmente a secuencias en las proteínas virales del HIV y/o SIV. Los péptidos pequeños de la Tabla 1 se sintetizaron de acuerdo 20 con el método descrito en la siguiente Ejemplo 1, pero, por supuesto, pueden ser sintetizados por cualquier método conocido en la técnica.

J|>I*^-^-J- Tabla 1 Secuencia de Aminoácidos de los Péptidos probados Leu-Lys-Ala (LKA) Arg-GIn-Gly (RQG) Iso-Leu-Lys (1LK) Lys-Gln-Gly (KQG) Gly-Pro-Glp (GPQ) Ala-Leu-Gly (ALG) Gly-His-Lys (GHK) Giy-Val-Gly (GVG) Gly-Lys-Gly (GKG) Val-Gly-Gly (VGG) Ala-Cys-Gln (ACQ) Ala-Ser-Gly (ASG) Cys-Gln-Gly (CQG) Ser-Leu-Gly (SLG) Ala-Arg-Val (ARV) Ser-Pro-Thr (SPT) Lys-Ala-Atg (KAR) Gly-Ala-Thr (GAT) His-Lys-Ala (HKA) Lys-Ala-Leu (KAL) 10 Gly-Pro-Gly (GPG) Abreviaturas usadas Leu-Leucme Lys-Lysine Gln-Gluta ine Ala-Aianine His-Histidine lleu-lsoleucine Cys-Cysteine Gly-Glycine Pro-Proline Arg-Argipipe 15 Val-Valine Thr-Threonme Ser-Serme Ej emplo 1 En este ejemplo, se describen los acercamientos 20 usados para obtener pequeños péptidos, listados anteriormente. Se sintetizaron químicamente varios tripéptidos con un sintetizador automático de péptidos (Syro, Multisyntech, Tubingen, Alemania) . La síntesis se realizó usando los aminoácidos protegidos de 9- M^UÜI , . , , ** ******,** fluorenilmetoxicarbonilo (fmoc) (Milligen, Bedfod, MA) , de acuerdo con los protocolos estándar. Todos los péptidos se liofilizaron y luego se disolvieron a la concentración apropiada en una solución salina regulada con fosfato (PBS) . Los péptidos se analizaron por la cromatografía líquida de alto desempeño, de fase inversa (RP-HPLC) , usando una columna PepS-15C18 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . En muchas modalidades, los péptidos que tienen un grupo de modulación unidos a la terminal de carboxi del péptido ("péptidos modificados") se usaron. En algunos casos, los péptidos modificados se crearon substituyendo un grupo amino para el residuo de hidroxilo normalmente presente en el grupo carboxilo de la terminal de un péptido. Esto es, en lugar de una terminal COOH, los péptidos se sintetizaron para tener un C0-NH2. Por ejemplo, los péptidos pequeños preferidos incluyen la glicidil-lisil-glicina-amida (GKG-NH2) , cistil-glutaminil-glicina (COG-NH2) , glicil-prolil-glicina-amida (GPG-NH2) , arginil-glutaminil-glicina-amida (R0G-NH2) , lisil-glutaminil -glicina-amida (K0G-NH2) , alanil-leucil-glicina-amida (ALG-NH2) , glicil-valil-glicina-amida (GVG-NH2) , valil-glicil -glicina-amida (VGG-NH2) , alanil-seril-glicina-amida (ASG-NH2) , seril-leucilglicina-amida (SLG-NH2) , y seril-prolil-treonina-amida (SPT-NH2) . Además de los sintetizados, muchos tripéptidos también se . . **********- ¡ * * compraron de Bachem AG, Suiza, que incluyen, pero no se limitan a, GKG-NH2, COG-NH2 y GPG-NH2. En los experimentos toxicológicos y los experimentos que evalúan los efectos del tratamiento de 5 péptidos pequeños en combinación con las terapias antivirales convencionales, los péptidos se obtuvieron como sigue. Para los experimentos iniciales, se realizó la síntesis de péptidos de fase sólida usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, 10 Foster City, CA) Cada síntesis usó una resina de soporte de fase sólida de p-metilbencilhidrilamina (Peptide International, Louisvile, KY) que suministra una amida de terminal carboxilo cuando los péptidos se desdoblan del soporte sólido por hidrólisis acida. Todos los aminoácidos 15 para el uso en la síntesis contenían grupos de t- butilcarbonilo que protegen el grupo de NH2 y se obtuvieron de Novabiochem AG, Suiza. Los grupos protectores se removieron de los péptidos sintetizados y se desdoblaron de la resina de soporte sólida por el tratamiento con el ácido 20 trifluorometan-sulfónico, dando péptidos con un grupo de modulación de amino (-NH2) en lugar de un grupo de hidroxilo (-OH) de la terminal de carboxilo. Antes de usar, los péptidos se purificaron por la cromatografía líquida de alto desempeño, de fase inversa, y formaron secuencias en el 25 secuenciador de péptidos de Applied Biosystems. Además, el *****,******t*^******.f¡. tripéptido GPG que tiene una terminal o una amida (CO-NH2; GPG-NH2) o carboxilo (COOH; GPG-OH) se compró de Bachem AG, Suiza . En la siguiente descripción, se usaron varios ensayos para identificar péptidos pequeños que inhiben la infección del HIV-1, HIV-2 y SIV. Ensayos de la infección del HIV y SIV Los péptidos, obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 1, se usaron en varios ensayos de infecciones del HIV-1, HIV-2 y SIV. La eficiencia de la infección del HIV-1, HIV-2 y SIV se vigiló por la actividad de la transcriptasa inversa, la concentración de la proteína p24 en el sobrenadante celular y por la evaluación microscópica de la formación de sincitial del HIV-1. En experimentos iniciales, se clasificaron varios tripéptidos en la habilidad de inhibir la infección del HIV- 1, HIV-2 y SIV en las células H9. Una vez que los tripéptidos de inhibición se identificaron, se realizaron más ensayos específicos para determinar el efecto de varias concentraciones de los tripéptidos seleccionados y tratamientos combinados (por ejemplo el uso de más de un tripéptido en combinación) . En el ejemplo siguiente, se describe un acercamiento que se usó para clasificar varios tripéptidos en su habilidad de inhibir la infección de HIV-1, HIV-2 y SIV. EJEMPLO 2 En este ejemplo, se usaron métodos para analizar la habilidad de varios tripéptidos para inhibir la réplica del HlV-a, HIV-2 y SIV, se describen. En los Experimentos 1 y 2, aproximadamente 200,000 células H9 se infectaron con el HIV-, HIV-2 o SIV a 25 TClD50, para probar el efecto inhibidor de los siguientes tripéptidos sintetizados: LKA-NH2, ILK-NH2, GHQ-NH2. GHQ-NH2, GKG-NH2, AC0-NH2, ARV-NH2, KAR-NH2, HKA-NH2, GAT-NH2, KAL-NH2 y GPG-NH2. Por lo tanto, las células H9 se resuspendieron con o sin los diferentes péptidos (aproximadamente 100 µM) en 1 ml del medio RPMI 1640, suplementado con 10% (vol . /vol . ) de suero de bovino fetal, inactivado por calor (FBS), penicilina (10 µ/ml) , y estreptomicina (10 µ/ml) , todos disponibles a través de GIBCO y Polybrene (µg/ml) , disponible de Sigma. En seguida, se agregaron virus a 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con virus a 37°C durante 1 hora, luego se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos. Las células luego se lavaron tres veces en el medio RPMI sin péptidos, a la temperatura ambiente, y se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos, como antes. Después del lavado final, las células se resuspendieron en el medio de cultivo de RPMI , que contiene los péptidos en una placa de 24 pozos (Costar Corporation) y se mantuvieron a 37 °C en 5% de C02, con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y analizaron cuando el medio se cambió a 4, 7, 10 y 14 días después de la infección. Para vigilar la réplica del virus, la actividad de la transcriptasa inversa (RT) en los sobrenadantes se ensayó usando un equipo de actividad de la Lenti-RT, disponible comercialmente. (Cavidi Tech. Uppsala, Suecia) . La cantidad de la RT se determinó con la ayuda de una línea de regresión de loe estándares. Los resultados se presentan como los valores de absorbencia y la absorbencia mayor india una concentración de proteína mayor y una infección viral más grande. La formación sincitial también se vigiló por el examen microscópico. Las Tablas 2 y 3 muestran los valores de la absorbencia de los sobrenadantes del cultivo celular de los Experimentos 1 y 2 respectivamente . En el Experimento 3 (Tabla 4) aproximadamente 200,000 células H9 se infectaron con el HIV-1, HIV-2 y SIV a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de las concentraciones diferentes de los péptidos GPG-NH2, GKG-NH2 y CQG-NH2 y combinaciones de estos péptidos (la concentración indicada corresponde a la concentración de cada tripéptido) . Como antes, las células H9 se resuspendieron con o sin los diferentes péptidos a varias concentraciones en 1 ml del medio RPMI 1640, suplementado con 10% (vol . /vol . ) de suero de bovino fetal (FBS9 inactivado por calor, penicilina (100 µ/ml) y estreptomicina (100 µ/ml) y Polybrene ( g/ml) . En seguida, se agregaron los virus a 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con los virus indicados a 37 °C durante 1 hora y se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos. Las células se lavaron luego tres veces en el medio RPMI sin péptidos a la temperatura ambiente y se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos, como antes Después del lavado final, las células se resuspendieron en el medio de cultivo RPMI que contiene los péptidos en una placa de 24 pozos (Costar Corporation) y se mantuvieron a 37°C en 5% de C02, con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron cuando el medio se cambió a los 4, 7 y 11 días después de la infección. Como antes, la réplica de cada virus se vigiló detectando la actividad de la transcriptasa inversa (RT) en los sobrenadantes usando el equipo de actividad Lenti-RT (Cavidi Tech) . La cantidad de la RT se determinó con la ayuda de una línea de regresión de los estándares. Los resultados se presentan como valores de absorbencia (OD) y la absorbencia mayor indica una mayor concentración de proteínas y mayor infección viral . La Tabla 4 muestra los valores de absorbencia de los sobrenadantes del cultivo celular del Experimento 3. . **.,* . i i^aaataaa En el Experimento 4 (Tabla 5) aproximadamente 200,000 células H9 se infectaron con el HIV-1 a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de los péptidos GPG-NH2 y CQG-NH2 y combinaciones de estos péptidos (la concentración indicada corresponde a la concentración de cada tripéptido) . Como antes, las células H9 se resuspendieron con o sin los diferentes péptidos a varias concentraciones en 1 ml del medio RPMI 1640, suplementado con 10% (vol . /vol . ) de suero de bovino fetal (FBS) inactivado por calor, penicilina (100 µ/ml) y estreptomicina (100 µ/ml) y Polybrene ( g/ml) . En seguida, se agregaron los virus a 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con los virus indicados a 37°C durante 1 hora y se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos. Las células se lavaron luego tres veces en el medio RPMI sin péptidos a la temperatura ambiente y se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos, como antes Después del lavado final, las células se resuspendieron en el medio de cultivo RPMI que contiene los péptidos en una placa de 24 pozos (Costar Corporation) y se mantuvieron a 37°C en 5% de C02, con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron cuando el medio se cambió a los 4, 7 y 11 días después de la infección. Como antes, la réplica de cada virus se vigiló detectando la actividad de la transcriptasa inversa (RT) en los sobrenadantes usando el equipo de actividad Lenti-RT (Cavidi Tech) . La cantidad de la RT se determinó con la ayuda de una línea de regresión de los estándares. Los resultados se presentan como valores de absorbencia (OD) y la absorbencia mayor indica una mayor concentración de proteínas y mayor infección viral. La Tabla 5 muestra los valores de absorbencia de los sobrenadantes del cultivo celular del Experimento 3. Los sobrenadantes se analizaron en el día 11 y se diluyeron 5 veces, así que la detección pudo ser determinada más exactamente. En el Experimento 5 (Tabla 6) aproximadamente 200,000 células H9 se infectaron con el HIV-1 a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de los péptidos GPG-NH2 y CKG-NH2 y CQG-NH2, y combinaciones de estos péptidos. Como antes, las células H9 se resuspendieron con o sin los diferentes péptidos a varias concentraciones en 1 ml del medio RPMI 1640, suplementado con 10% (vol . /vol . ) de suero de bovino fetal (FBS) inactivado por calor. penicilina (100 µ/ml) y estreptomicina (100 µ/ml) y Polybrene ( g/ml) . En seguida, se agregaron los virus a 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con los virus indicados a 37°C durante 1 hora y se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos. Las células se lavaron luego tres veces en el medio RPMI sin péptidos a la temperatura ambiente y se formaron esferitas a 170xg durante 7 minutos, como antes Después del lavado final, las células se resuspendieron en el medio de cultivo RPMI que contiene los péptidos en una placa de 24 pozos (Costar Corporation) y se mantuvieron a 37°C en 5% de C02, con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron cuando el medio se cambió a los 4, 7 y 14 días después de la infección. Como antes, la réplica de cada virus se vigiló detectando la presencia de p24 n los sobrenadantes. El antígeno de p24 del HIV se determinó usando un equipo de detección de antígeno p24 de HIV, disponible comercialmente (Abbott) . Los resultados se presentan como valores de absorbencia (OD) y la absorbencia mayor indica una mayor concentración de proteínas y mayor infección viral . En ambos casos, las diluciones en serie de los sobrenadantes se hicieron para así detectar más exactamente la concentración de p24. La Tabla 6 muestra los valores de absorbencia de los sobrenadantes del cultivo Celular del Experimento 5. Como se discute más detalladamente abajo, se descubrió que los tripéptidos GPG-NH2, GKG-NH2 y CQG-NH2 y combinaciones de estos péptidos, inhiben efectivamente la infección del HIV-1, HIV-2 y SIV. En el Experimento 6 (Tabla 7 y Figura 1) ) aproximadamente 200,000 células HUT78 9 se infectaron con el HIV-1 a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de los péptidos GPG-NH2, RQG-NH2, KOG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLH-NH2 y SPT-NH2. Las células HUT se resuspendieron en 1 ml del medio RPM 1640, suplementado con 10% (vol . /vol . ) de suero de bovino fetal (FBS, GIBCO) inactivado por calor, penicilina (100 µ/ml) y estreptomicina (100 µ/ml) y Polybrene (Sigma, 2µg/ml)con o sin la presencia de diferentes péptidos pequeños (100 µM) , mencionados antes. En seguida, se agregaron los virus de HIV-1 a 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con los virus a 37°C durante 1 hora y en seguida las células se formaron esferitas a 170xg durante siete minutos. Las células se lavaron luego tres veces en el medio RPMI sin péptidos a la temperatura ambiente por la sedimentación a 170xg durante 7 minutos, como antes. Después del lavado final, las células se resuspendieron en el medio de cultivo RPMI que contiene los péptidos en una placa de 24 pozos (Costar Corporation) y se mantuvieron a 37°C en 5% de C02, con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron cuando el medio se cambió al día 4, 7 y 11 después de la infección y la producción del p24 viral se vigiló usando el equipo ELISA de p24 de HIV-2 (Abbott Laboratories, North Chicago, EE.UU.). Como se discute abajo, se descubrió que los pequeños péptidos de RQG-NH2, K0G-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLH-NH2 y SPT-NH2, inhibieron efectivamente la infección del HIV-1.

TABLA 2 Experimento 1 - (péptidos obtenidos en el sitio) Día 7 RT Día lO RT *Los valores representan densidad óptica (OD) RT = transcriptasa inversa TABLA 3 Experimento 2 - (péptidos obtenidos en el sitio) Día 7 RT Día lO RT *Los valores representan densidad óptica (OD) 20 ^a*^******.^ .^*** £ .

TABLA 4 Experimento 3 - (péptidos obtenidos de Bachem) Día 7 RT Día lO RT "Los valores representan densidad óptica (OD) .^¿¡¡.«SMadM TABLA 5 Experimento 4 - (péptidos obtenidos de Bachem) Día 7 RT Día lO RT *Los valores representan densidad óptica (OD) TABLA 6 Experimento 4 - (péptidos obtenidos en el sitio) •100µ GPG-NH2+GKG-NH2 + CQG-NH2 *Los valores representan densidad óptica (OD) TABLA 7 Experimento 6 - (Péptidos obtenidos en el sitio) Los pequeños péptidos inhiben y/o previenen las infecciones de HIV-1 , HIV-2 y SIV De los pequeños péptidos, listados en la Tabla 1, Los GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, ROG-NH2, KOG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2 inhibieron y/o previnieron la infección de HIV-1, y los GKG-NH2, CQG-NH2 y GPG-NH2 también mostraron inhibir o prevenir la infección de HIV-2 y SIV. Se debe notar que los pequeños péptidos RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2 no se analizaron en su habilidad para prevenir o inhibir la infección de HIV-2 o SIV, pero, dado el hecho que el HIV-2 y SIV comparten una significante homología en la estructura de proteína de la cápsida en la región a la cual los péptidos pequeños GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2_ KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2 corresponden, se espera una inhibición o prevención de la infección del HIV-2 o SIV, o ambas. Los resultados de los Experimentos 1-6 (mostrados en las Tablas 2-7 y la Figura 1) , demuestran que los péptidos pequeños, en forma de amida, que corresponden a la secuencia de proteína de cápsida viral, que tienen una glicina como el aminoácido con terminal de carboxi, GPC-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2 y SLG-NH2, inhibieron o previnieron la infección de HIV. Los péptidos que contienen un residuo de alanina de terminal carboxi, Leu-Lys-Ala (LKA) y His-Lys-Ala (HKA) o un residuo de glutamina de terminal carboxi, Gly-Pro-Gln (GPQ) y Ala-Cys-Gln (ACQ) no impiden la infección de HIV. La glicina en la terminal amino no tiene un factor inhibidor, sin embargo, debido a que los péptidos con un residuo de glicina y terminal amino, Gly-Pro-Gln (GPQ) , Gly-His-Lys (GHK) y Gly-Ala-Thr (GAT) , fallaron en prevenir la infección y la formación sincitial del HIV-1. Además, los péptidos con otras cadenas laterales polares sin cargar, tal como el Gly-Pro-Gln (GPQ) , Ala-Cys-Gln (ACQ) y Gly-Ala-Thr (GAT) o cadenas laterales no polares en la terminal de carboxi, tal como Ala-Arg-Val (ARV) , His-Lys-Ala (HKA) y Lys-Ala-Leu (KAL) , y Leu-Lys-Ala (LKA) fallaron en prevenir la infección. Aunque un residuo de glicina en la terminal de carboxi parece estar asociado con la inhibición de la infección del HIV y SIV, otros residuos de aminoácidos o residuos de aminoácidos modificados en la terminal de carboxi de los pequeños péptidos pueden también inhibir la infección del HIV y SIV. Por ejemplo se mostró que el Ser-Pro-Thr (SPT) inhibió o previno la infección de HIV-1. En algunos experimentos parece que el efecto de los péptidos pequeños en las infecciones de HIV-l,HIV-2 y SIV fue dependiente de la concentración y el tiempo, concentraciones del GKG-NH2, CQG-NH2 y GPG-NH2, y sus combinaciones, tan bajas como de 5 µM y 20 µM se muestra son efectivas en reducir la infección de HlV-a, HIV-2 y SIV. A 100 µM o mayor, sin embargo, los tripéptidos GKG-NH2, CQG-NH2 y GPC-NH2, y sus combinaciones, inhibieron más eficientemente las infecciones de HIV- , HIV-2 y SIV. Como se muestra en la tabla 6, 300 µM de GKG-NH2 y CQG-NH2 redujeron la infección del HIV-1 por casi el 100%, según se detectó por la presencia del antígeno p24 en los sobrenadantes celulares. La reducción en por ciento tabulada en la Tabla 6 se calculó dividiendo la cantidad del antígeno p24 detectado en la muestra tratada con el péptido por la cantidad del antígeno p24 detectado en la muestra de control, multiplicando este dividendo por 100 para obtener un porcentaje y restando el porcentaje del dividendo por 100%.

Por ejemplo, el por ciento de reducción exhibido por la GPG-NH2 es: 5.6 X 102 x 100 = 3% y 100% - 3% = 97%. 2.0 x 10*4 En los primeros cinco experimentos (Tablas 2-6) se mostró que los tripéptidos GKG-NH2, CQG-NH2 y GPG-NH2, y sus combinaciones, inhiben las infecciones del HIV-1, HIV-2 y SIV a concentraciones iguales a o mayores de 5 µM. En el sexto experimento (Tabla 7 y Figura 1) se mostró que los péptidos pequeños RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2, inhiben y/o previenen efectivamente la infección del HGV-1 a 100 µM. Como se muestra en la Tabla 7, una reducción de así el 100% de virus, según se mide por la cantidad de la proteína de la cápsida p24 en el sobrenadante, se logró con los péptidos pequeños RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2 y SLG-NH2. La presente reducción del p24 mostrada en la Tabla 7, se calculó como se describió para la Tabla 6 anterior. Aunque la GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2 y SPT-NH2 fue menos efectiva en inhibir o prevenirla infección del HIV-1 a 100 µM, se cree que los tripéptidos son más efectivos a concentraciones mayores. Los datos presentados en los Experimentos 1-6, de las Tablas 2-7 y la Figura 1, demuestran que los péptidos pequeños que corresponden a las secuencias de una proteína de cápsida viral son agentes antivirales efectivos sobre un amplio intervalo de concentraciones . Con el fin de comprender mejor la inhibición viral mediada por los péptidos pequeños, se realizaron varios estudios en la síntesis del ADN, síntesis del ARN y la expresión de proteínas. Estos experimentos se discuten abajo. Los pequeños péptidos inhiben la infección viral en una etapa subsiguiente a la síntesis del ADN, síntesis del ARN y expresión de proteínas . Para estudiar las síntesis del ADN proviral y ARN viral, El ADN y ARN de las células H-9 infectadas con HIV-1, cultivadas en la presencia de un péptido pequeño se prepararon en varios puntos del tiempo (0-48 h) . El análisis de la mancha Southern reveló que el ADN de HIV-1 se sintetizó en la presencia del GPG-NH2 y la cantidad del ADN proviral fue casi igual a varias concentraciones (0-2,000 µM) del péptido pequeño, durante las primeras 24 horas.

Estos resultados probaron que los péptidos pequeños, tal como el GPG-NH2, no tienen efecto inhibidor en la entrada del HIV-1 y la síntesis del ADN y coinciden con el hallazgo que los péptidos pequeños no inhiben la actividad de la transcriptasa inversa al HIV-1.

Por el análisis de la mancha Northern, tres bandas del ARN (9.2, 4.3, 2.0 kb) se detectaron 24-48 hors después de la infección. El ARN de 9.2 kb actúa tanto como el ARN genómico como el mARN para los genes gag y pot . El ARN de un solo empalme de 4.3 kb, representa al menos el gene env, y el ARN de múltiples empalmes, de 2 kb, codifica los genes de regulación. La GPG-NH2 a 20 µM no tiene efecto inhibidor en la expresión de estos ARN hasta 48 horas después de la infección. A 200 µM y 2,000 µM, una reducción del ARN de HIV-1 se notó 48 horas después de la infección, que refleja probablemente la inhibición del segundo ciclo de réplica. Estos resultados establecieron que los péptidos pequeños no inhiben la réplica del HIV-1 en la etapa de transcripción, ni afectan el empalme de los transcriptores . En los experimentos diseñados para determinar si el HIV-1 expresa apropiadamente la proteína, en la presencia de pequeños péptidos, no se observó un efecto significante en la expresión o modificación de proteínas. Sin embargo, en un experimento, una migración aberrante de gpl60/gpl20 en la poliacrilamida se observó. En la presencia de la GPG-NH2 (20 µM o más) se observó la gp 160 y/o gp 120 en la electroforesis a una posición en el gel de poliacrilamida, representativo de un peso molecular levemente menor de 120,000 Da. Este resultado no fue reproducible y un cambio en la migración de las proteínas gag pl7 o p24 no se observó. Los estudios en analizar la glicosilación de la proteína del virus, en la presencia de la GPG-NH2, mostró que no afecta la glicosilación de enlace EN o de enlace O. Igualmente, la glicosilación en la gp producida recombinantemente (en virus de vacuna) no se afectó por la GPG-NH2. Asimismo, la GPG-NH2 se encontró no afecta la actividad de la proteasa específica del HIV-1. En los experimentos, presentados anteriormente, se demostró que los péptidos pequeños interfieren con la infección del HIV en una etapa posterior del ciclo replicativo del HIV. La GPG-NH2 fue incapaz de interrumpir la síntesis del ADN, la síntesis del ARN, la síntesis de la proteína y la glicosilación de la proteína. En la siguiente descripción, se describe mayor evidencia que los péptidos pequeños, tal como GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, CQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2 inhiben la infección viral en una etapa posterior en el ciclo de réplica y, en un sentido más amplio, otra técnica que se puede usar para clasificar otros pequeños péptidos y sus derivados para la capacidad de inhibir la infección viral, tal como las infecciones de HIV o SIV, es suministrada. Por lo tanto, se discuten abajo varios experimentos de microscopía electrónica, en donde las células infectadas de HIV-1 se incubaron en la presencia y ausencia de un pequeño péptido.

Los pequeños péptidos interfieren con el ensamblado de la nucleocápsida Una vez que se ha descubierto que los pequeños péptidos, GPC-.NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2 , VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2, inhibieron la infección del HIV, se usó la microscopía electrónica para analizar ulteriormente las células infectadas del HIV que se han incubado con un pequeño péptido. (Véanse las Figuras 2,3 y 4) . Como se muestra en la Figura 4, el análisis microscópico electrónico revelo que el contacto con la GPG-NH2 interrumpió la formación apropiada de la nucleocápsida viral . En este conjunto de experimentos, las células HUT78 se infectaron con el virus HIV-1 SF-2 a 300 TCID50 , durante 1 hora a 37°C. En seguida, las células se resuspendieron en un medio de cultivo de RPMI suplementado con 10% de FBS. antibióticos (200 u/ml) y Polybrene (3.2 µg/ml) . La GPG-NH2 luego se agregó en los cultivos celulares, 3, 5 ó 7 días después de la infección, a una concentración de 1 µM o 10 µM. Una muestra de control de Ritonavir, 0.5 µM (un inhibidor de la proteasa) se administró. Las células se cultivaron hasta el día 14, en dicho punto, las células se fijaron en glutaraldehído al 2.5% por medios convencionales. Las células fijas luego se fijaron posteriormente en 1% de 0s04 y se deshidrataron, se incrustaron con resinas epoxi, y los bloques se dejaron polimerizar. Las secciones epon de las células infectadas con virus se hicieron de aproximadamente 60 a 80 nm de espesor con el fin de acomodar el ancho de la nucleocápsida. Las secciones se montaron en rejillas teñidas con 1.=% de acetato de uranilo y se analizaron en un microscopio Zeiss CEM 902 a un voltaje de aceleración de 80 kV. El microscopio se equipó con un espectrómetro para mejorar la calidad de la imagen y se usó una trampa de enfriamiento de nitrógeno líquido para reducir el daño al haz. Las rejillas, que tienen secciones de control y la GPG-NH2 incubadas, se examinaron en varios estudios ciegos. La microscopía electrónica de las partículas de HIV sin tratar revelaron la nucleocápsida con la configuración cónica característica y el ARN encerrado, teñido uniformemente, que estira la longitud de la nucleocápsida. (Véase la Figura 2) . En contraste, la Figura 3 presenta dos micrografías electrónicas que muestran varias partículas de HIV-1 que se produjeron en la presencia del inhibidor de la proteasa viral, Ritonavir. Las células infectadas que se han tratado con el Ritonavir, exhibieron estructuras malformadas que no tienen una nucleocápsida discernible, como se esperaba. (Véase la Figura 3) . La Figura 4 presenta micrografías electrónicas que muestran ¿n^ partículas virales que se han producido en la presencia de la GPG-NH2. Las células, que tienen partículas de HIV-1 que se trataron con la GPG-NH2 exhibieron partículas del HIV-1 con estructuras de cápsida discernibles que son distintas de las partículas tratadas con Ritonavir. Más específicamente, en algunas partículas virales tratadas con tripéptidos, la estructura de la cápsida de forma cónica pareció estar relativamente intacta, pero el ARN se amasó en una configuración de tipo esfera, o externa a la cápsida o en la parte superior (extremo ancho) de la cápsida. Aún más, algunas cápsidas se observaron tener estructuras deformadas, con poca o nada de morfología, que se asemejan a una nucleocápsida normal y el ARN se ve o al exterior de la estructura o al interior de la misma, en un extremo. De estos estudios es claro que los péptidos pequeños interfieren con la formación apropiada de la nucleocápsida y que esta inhibición del desarrollo de la cápsida ocurrió en una etapa distinta de la acción del inhibidor de la proteasa, Ritonavir. Más evidencia que los tripéptidos, en forma de amida, tal como GPG-NH2, CKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2, interfieren con el ensamblado de la cápsida se reveló cuando un ensayo de unión con p24 como una biomolécula objetivo se * Á* 1 ^•¿MfraMfr realizó. Los detalles del ensayo de unión de p24 se suministran abajo.

Los pequeños péptidos se unen a la proteína principal de la cápsida (p24) Se realizaron experimentos para estudiar directamente si los péptidos pequeños tienen la habilidad de interactuar con la proteína de la cápsida (CA) madura o p24, y así interferir con la formación de la nucleocápsida. En este conjunto de experimentos, un ensayo de unión de la p24 se realizó, que evaluó la habilidad de la GPG-NH2 radio etiquetada para unirse a la p24. Se condujo un ensayo de unión basado en la diálisis usando una membrana de diálisis con un tamaño de poros menor de 20 kD (Slide-A-Lyzer, Pierce) . Cincuenta microlitros de una materia de lOµM de las proteínas recombinantes de p24 y gpl20 (donado del programa del SIDA, NCIB) y BAS (Sigma) se introdujeron en membranas de diálisis separadas y las proteínas se dializaron a 4°C durante 2 días, contra una solución de 500 ml compuesta de 150 mM de NaCl y 50 mM del regulador Tris-HCl, pH de 7.4 y 27.5 M de 14C-GPG-NH2 (Amersham Ltd. UK) . En seguida, partes alícuotas de diez o cinco microlitros de p24, gpl20 y BSA dializados se removieron y mezclaron con 3 ml de ReadySafe (Beckman) en un frasco de escintilación. El C14 fue luego detectado por el conteo de escintilaciones . En la Tabla 8, los resultados de un experimento de diálisis representativo son suministrados. Notablemente, una asociación de p24 con GPG-NH2 se observó el equilibrio de la diálisis. La cantidad del GPG-NH2 radioactivo asociada con p24, fue 7.5 veces mayor que la presente en el regulador. En contraste, ninguna cantidad apreciable de GPG-NH2 radioactivo en la cantidad presente en el regulador de diálisis, se asocia con cualquiera de la gpl20 o BSA. Estos resultados probaron que los pequeños péptidos, tal como GPG- NH2, se unen a p24 y a través de esta interacción interrumpen la formación apropiada de la nucleocápsida.

TABLA 8 En la siguiente descripción, se suministra evidencia adicional que los pequeños péptidos, tal como GPC- NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG ASG-NH2, SLG y SPT-NH2, inhiben las infecciones de HIV y SIV por un mecanismo que es diferente de la manera que el AZT o Ritonavir inhiben estos virus.

Los pequeños péptidos inhiben las cepas de HIV-1 gue son resistentes a AZT o Ri tonavir. La habilidad de los pequeños péptidos para inhibir las cepas de HIV-1 que son resistentes al AZT análogo del nucleósido o al Ritonavir, inhibidor de la proteasa. Se cultivaron aislados resistentes de HIV-1 en células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y los sobrenadantes se recogieron como materia de virus. La titulación del TC1D50 (50% de dosis infecciosas del cultivo de tejido) se realizaron en PBMC y los títulos se calcularon, de acuerdo con la fórmula de Reed y Muench. 400,000 PBMC se infectaron con 25 TC1D50 de esos virus (HIV-1, SF162 se usó como un control) por la adsorción a 37°C durante una hora y luego se lavaron tres veces. Las células se resuspendieron en el medio de cultivo que contiene GPG-NH2, sin droga (100 µM) , AZT (5µM9 O Ritonavir (0.1 µM) y se incubó a 37°C, con C02 y humedad. El medio de cultivo se cambió cada cuatro días y la proteína del antígeno de p224 de HIV-1 en los sobrenadantes se vigilaron por el análisis ELISA (Tabla 9) . Como se muestra en la Tabla 9, la GPG-NH2 tiene un efecto anti-viral potente en cualquiera de las cepas de HIV resistentes al AZT o al Ritonavir. Los resultados en este experimento afirman los datos presentados anteriormente y prueban que los pequeños péptidos inhiben la réplica del HIV de una diferente etapa de AZT o Ritonvir. Adicionalmente, el tratamiento de las "cepas de la calle" del HIV se logró con GPG-NH2, como se revela en la patente de EE.UU., No. 5,627,035, de Vahine et al, incorporada aquí como referencia en su totalidad. Dado que ellos también se derivan de la secuencia de la proteína viral del HIV, los péptidos GKG- NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, VGG ASG-NH2, SLG-NH2, 10 y SPT-NH2, son también útiles en el tratamiento de infecciones del HIV resistentes a AZT y Ritonavir, al igual que las cepas de la calle del HIV. TABLA 9 15 20 Los valores de HIV-1 , p13, se muestran en pg/ml y son promedios de experimentos duplicados tomados 14 días después de la infección. a no probado b Ritonavir 5 AZT bajo: aislado con baja resistencia a AZT AZT intermedio: aislado con resistencia intermedia a AZT AZT alto: aislado con alta resistencia a AZT Pl bajo: aislado con baja resistencia al inhibidor de proteasa Pl alto: aislado con alta resistencia al inhibidor de proteasa 10 En soporte adicional de los datos presentados anteriormente, se realizaron varios experimentos de la infección del HIV-1 en un mutante del HIV-1 que carecía de la variante de GPG en su lazo V3. Estos experimentos, 15 detallados abajo, establecieron que la inhibición del HIV-1 mediada por el GPG-NH2 ocurrió en una manera independiente del lazo V3. Este lazo V3 de la glicoproteína gpl20 de env de HIV-1 contiene una secuencia de GPG conservada en la punta del lazo que puede estar implicada en la réplica del 20 virus, para determinar si la infección del HIV-1 inhibida por GPG-NH2 por la perturbación de la interacción del lazo V3 , un provirus mutante de HIV-1 de lazo V3 se construyó. Este provirus mutante, que carecía del dominio GPC, se probó en su habilidad de infectar células en ensayos de infección 25 y se analizó por la inmunocitoquímica y la miscroscopía de electrones. El siguiente ejemplo describe la construcción del provirus mutante, el ensayo de la infección del HIV-1, la determinación de la estructura de las partículas virales mutantes por la inmunocitoquímica y la microscopía de electrones y el descubrimiento que el GPG-NH2 inhibe la infección por las partículas virales mutantes.

EJEMPLO 3 Se construyó un provirus con GPC suprimido, con base en la clona infecciosa pBRu-2. usando técnicas convencionales en biología molecular. Se usó la Escherichia coli DH5a y NM522 mutS para la subclonación, mutagénesis y amplificación de los ADN de plasmida. Se usó la plasmida pucld como un vector para la subclonación y la clona proviral de HIV-1, pBRu-2, que contiene una clona competente de réplica, de longitud completa, de HIV-l/Bru (también designada como LAV, LAI) se usó para generar el virus mutante. El fragmento Sa? a BamHl de 2.7 kb, que codifica el gene env, se subclonó en los sitios Sa? y BamHl del vector puc 18. La supresión del GPG se logró por la mutagénesis dirigida de sitio, usando el Equipo U.S:E. de Mutagénesis (Pharmacia). Se requirieron dos oligonucleótidos. El oligonucleótido mutagenético fue el CGT ATC GAG AGG AGA GCA TTT GTT ACÁ AT GG-3 ' , 5-fosforilado (obtenido de ^jgjg^ Scandinavian Gene Synthesis AB, Estocolmo, Suecia) . El oligonucleótido selectivo fue el GTG CCA CCT GTC GAC TAA GAA ACC AT-3' 5 ' fosforilado y se diseñó para remover un sitio de restricción único. AatlI en el vector puc 18. El ADN de tipo silvestre fue así eliminado selectivamente del grupo mixto de ADN de tipo silvestre y mutante por la digestión con la endonucleasa correspondiente AatlI. Los productos de reacción de mutagénesis se transformaron en E. coli amplificando los ADN de plasmida. La mutación se verificó por la secuencia de la Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR) del ADN usando un dispositivo de secuencia Automated Láser Fluorescente ALF™ DNA Sequencer. El fragmento de Sa? -BamHl suprimido del oligonucleótidos que codifica el GPG luego se clonó en pBru-2 para generar la plasmida proviral. Los ADN mutantes de las varias colonias bacteriales se amplificaron y purificaron por el equipó Qiagen Plasmid Kit. Dos de estos ADN, mp8 y mplO se introdujeron en células. El ADN de tipo silvestre y el ADN mutante, mpd y mplO se introdujeron en Heta, HUT78 o células MT-2 usando el método de dextrano de DEAR. (Palker et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 85 : 1943 -1938 (1988) ) . Brevemente, 10*8 células se prepararon 24 horas antes de la tranfección. Luego, el medio se removió y las células se lavaron una vez con una solución salina pre-calentada, regulada con fosfato (PBS) , y una vez que TBS-D (solución salina regulada con Tris - 0.1% de .. . . í ^ ^^f^^ dextrosa) . Aproximadamente 0.5 µg de ADN se mezclaron con TBS-D/DEAR-dextrano y se agregó a las células, seguido por una incubación de 30 minutos a 37°C. Luego la solución se removió y las células se lavaron una vez con TBS-D y una vez 5 con PBS. Las células se mezclaron con 5 ml de un medio precalentado suplementado con 10% de suero y 5 µg de difosfato de cloroquina y se incubó por 1 hora a 37°C, seguido por tres lavados con un medio exento de suero. Finalmente, las células se mantuvieron en un 10 ml de un medio de cultivo y 10 se incubaron a 37°C durante 4 días. Se recogieron los sobrenadantes que contienen virus, se filtraron a través de un filtro con tamaño de poros de 0.45 µ para remover cualquier célula, se formaron partes alícuotas y se mantuvieron a -70°C como el material 15 de virus. La titulación del virus se realizó por infectar las células MT-2 con diluciones aéreas de virus. Cien microlitros de cada dilución en serie por cinco veces de los sobrenadantes de virus, sirvieron como inoculo para 200,000 células MT 2. Después de 16 horas de adsorción, las células 20 se lavaron cinco veces y se resuspendieron en 1.5 ml del medio de cultivo en placas de 24 pozos o cavidades (Costar Corporation) . El medio se cambió a los 4, 7 y 11 días después de la infección y se probó la producción del p24 en los sobrenadantes en el día 14. Se calcularon dosis 25 infecciosas del cultivo de tejido al punto final del 50% (TCID50) de acuerdo con la fórmula de Reed-Muench (Reed y Muench, Am. J. Hygiene 27, 493-497 (1938)). CD4 + líneas de células T MT-2, C91 PL, C8166, CEM, HUT78 H9, Jurkat y Molt-3, líneas celulares monocíticas U937 y THP-1, se propagaron y mantuvieron en el medio RPMI1640 (GIBCO) , suplementado con 10% (vol/vol) de suero de bovino fetal, inactivado por calor (GIBCO) , penicilina (100 µ/ml) y estreptomicina (100 µ/ml) . Las células Hela crecieron en el medio 199 con sal de Hank suplementada con 2% de FBS, 0.8% de dextrosa y antibióticos. Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se purificaron por centrifugación del gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y se estimularon con fitohemaglutina (KEBO Lab) durante tres días en el medio RPMI 1640, suplementado como se describió anteriormente, antes de ser infectadas. Las células dendríticas (DC) se generaron de los monocitos de la sangre, que se purificaron de la fracción mononuclear por adherencia al plástico, como se describe por Rormani et al., J". Exp . Med. 180:83-93 (1994). En breve, las células mononucleares de la sangre se purificaron como se describió antes, y la adherencia se llevó a cabo sobre frascos de cultivo de tejido en el medio RPMI durante dos hors. Luego las células no adherentes se lavaron y separaron con PBS. Las células adherentes se cultivaron durante siete días en el medio con GM-CSF (25 µ/ml) y IL-4 (4.5 µ/ml) y luego se infectaron con virus. Las infecciones se realizaron en las líneas celulares MT-2 C9 a-PL, C8166, CEM, HUT78 H9, Jurkat, Molt-3, 5 U937, THP-1, PBMC y células dendríticas (DCs) . Para CD4 + líneas celulares, 200,000 células se incubaron a 37°C con virus de tipo silvestre o mutante a 100 TC1D50 durante 16 horas, luego se lavaron cinco veces, se resuspendieron en 1.5 ml del medio RPMI fresco, suplementado con 10% de FBS, 10 antibióticos y Polybrene (Sigma, 2 µg/ml) y se incubaron en una placa de 24 pozos a 37°C en 5% de C02 con humedad. Para los PBMC, 500,000 células se usaron y se cultivaron en el medio RPMI suplementado con proleucina (Eurocetus, 150 µ/ml) , hidrocortisona (Sigma, 5 µg/ml) y Polybrene (Sigma, 2 15 µg/ml) . Para las DC, 800,000 células se expusieron a virus durante 1, 16 y 48 horas, seguido respectivamente por 3 veces de lavado en PBS y el tratamiento moderado de tripsina al 0.05% a 37°C durante 5 minutos, para remover cualquier virus unido a la superficie, como se describe por Grannelli- 20 Piperno et al., J. Exp . Med. 184:2433-2438 (1996). Como un control, Los PBMC se expusieron al mp8 de la misma manera. Las células se lavaron, se recogieron y sometieron a lisis para aislar los ADN por la extracción de fenol/cloroformo y luego se realizó una secuencia de LTR que detecta la PCR, 25 semicuantitativa. Se hicieron diluciones en serie por diez dfe.ariaattiil^fti.^SHiria , .. * .* i . i * . . . . ¿***. .* 1 * x~6** *»¿ veces en los ADN y la LTR PCR se realizó en40 ciclos, usando una configuración "anidada" de tres aprestos, como se describió antes. (Hwang et al., Science 253: 71-74 (1991)). Para los experimentos del co-cultivo de DC-PBMC y el co-5 cultivo de DC-MT-2, 250,000 DC se expusieron a virus durante 16 gras, seguido por lavado por cinco veces hasta que no se pudo detectar el p24 (menos de 5 pg/ml) . Luego las células se trataron moderadamente con tripsina al 0.05%, que destruyó el epítope de unión del HIV-1 en CD4 y se removió 0 cualquier virus unido a la superficie. Después de lavar, las células se resuspendieron en el medio de cultivo de RPMI en mezcla con 200,000 células de PBMC o 100,000 células de MT- 2. Para los experimentos de infección, el medio de cultivo se cambió a los 4, 7, 11, 14 y 17 días después de la infección y se determinó el crecimiento viral por los niveles de p24, usando un equipo ELISA de p24 del HIV-1 (Abbott Laboratories, North Chicago, EE.UU.) La cuantificación del estudio ELISA del ensayo p24 se usó para cuantificar el nivel del p24 en cada muestra de virus y este ensayo tenía un intervalo de respuesta de dosis lineal de 200 pg a 640 pg de p24 por ml . Todas las muestras de virus se ensayaron en diluciones múltiples y la cantidad de p24 se determinó con la ayuda de una línea de regresión.. Los ADN se aislaron de las células cultivadas durante 17 días tapia, **. **%** después de la infección y la secuencia directa de la región V3 se realizó en estos ADN para verificar la mutación. La inmunocitoquimica también se ejecutó en células MT-2 infectadas y no infectadas por una técnica de emparedado de APAAP (inmunocomplejos de Fosfatasa Anti- Alcalina de Fosfatasa Alcalina) , como se describió previamente en Kowalski et al., Science, 237:1351-1355 (1987) . Las células se lavaron dos veces en PBS y se fijaron en portaobjetos por acetona durante 15 minuto. Luego las células se incubaron en sucesión con un p24 anti-HIV-1 del ratón de anticuerpo primario, las inmunoglobulinas antiratón del conejo del anticuerpo secundarias, y el anticuerpo monoclonal de APAAP del ratón (DAKO) durante 30 minutos a 37°C, respectivamente, en una cámara de humedad, seguido por el lavado en PBS durante 5 minutos. Después el substrato cromogénico se agregó e incubó durante 20 minutos a la temperatura ambiente, los portaobjetos se lavaron en H20, montados en glicerol y se vieron bajo el microscopio (amplificación x 100) . El p24 del anti-HIV-1 del ratón de anticuerpos monoclonales (Mabs) (DAKO, diluido 1:20), inmunogobulinas anti-ratón del conejo (diluidas 1:25) y los inmunocomplejos del ratón de Mab a la fosfatasa alcalina intestinal del ternero y se usó esta fosfatasa alcalina intestinal (APAAP, diluida 1:20 para el ensayo de inmunocitoquímica. * *** ** ?* i > Adicionalmente, la microscopía electrónica se realizó en células infectadas. Células recientemente infectadas se fijaron en el día 7 por glutaraldehído al 2.5% y se fijaron después en 1% de 0S04. Las células se deshidrataron, se incrustaron con resinas epoxi y se tiñeron con 1% de acetato de uranilo. Las secciones epon de las células infectadas de virus se obtuvieron con un espesor de 60-80 nm. Los especímenes se analizaron en un dispositivo Zeiss CEM 902 a un voltaje de aceleración de 80 kV, que se equipó con un espectrómetro para mejorar la calidad de la imagen. Una trampa de enfriamiento de nitrógeno líquido se usó para reducir el daño del haz. En otro conjunto de experimentos, se obtuvo mayor evidencia que el GPG-NH2 inhibe la infección del HIV-1 por un mecanismo además de la inhibición del lazo V3. Por lo tanto, la habilidad del GPG-NH2 para inhibir la infección de tipo silvestre los mutantes de supresión del lazo V3 (dominio de GOG) en las células MT-2 se determinó. En estos experimentos, aproximadamente 200,000 células MT-2 se infectaron con los mutantes de tipo silvestre de HIV-lBru y mutantes con GPG suprimido, mp8 y mplO a 25 TCID50, para probar el efecto inhibidor del GPG-NH2. Las células MT-2 se resuspendieron en 1 ml del medio RPMT 1640 suplementado con 10% (vol/vol) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS, GIBCO) , penicilina (100 µ/ml) estreptomicina (100 * « « * µ/ml) y Polybrene (Sigma 2 µg/ml) con o sin la presencia del GPG-NH2, a concentraciones de 20 y 100 µM. En seguida, los virus se agregaron a 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con virus a 37°C durante 16 horas, luego se formaron esferitas en forma suelta por centrifugación a 170xg durante 7 minutos. Las células luego se lavaron tres veces en el medio RPMI sin péptidos, a la temperatura ambiente por la sedimentación celular a 170xg durante 7 minutos, como antes. Después del lavado final, las células se resuspendieron en el medio de cultivo RPMI en placas de 24 pozos (Costar Corporation) que se mantenían a 37°C y 5% de C02 con humedad. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron cuando el medio se cambió al día 4, 7, 11 y 14 después de la infección. Para vigilar la réplica del virus, la proteína del antígeno p24 del HIV en los sobrenadante desde el día 7 y 14 se ensayaron por el equipo ELISA (Abbott Laboratories) que tiene un intervalo lineal de respuesta de dosis, de 20 hasta 640 pg del p24 por ml y la cantidad de p24 se puede determinar con la ayuda de la línea de regresión. Los resultados de los experimentos descritos en este ejemplo, discutidos en mayor detalle abajo, verifican que el GPG-NH2 inhibe la infección del HIV-1 en una manera independiente del lazo de V3.

Los pequeños péptidos inhiben la infección del HIV-1 en una manera independiente del lazo de V3 Para determinar si la supresión del GPC en el lazo de V3 afecta la producción del virus. Los ADN de plasmida proviral (tanto de tipo silvestre como de tipo mutante) se introdujeron en la línea celular negativa de CD4, Hela, al igual que las líneas celulares positivas de CD4 , MT-2 y HUT78. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron cada día y la producción de virus se vigiló midiendo los niveles de p2 . Un patrón de crecimiento similar se observó para los virus de tipo silvestre (WT) y mutantes, de las transfecciones Hela, dentro de un marco de tiempo de 6 días. Los niveles de p24 se mantenían creciendo hasta el día 4, luego fueron constantes. Así, los ADN provirales tanto mutantes como de tipo silvestre se expresaron igualmente bien en estas células. Resultados similares se obtuvieron de los transfectantes de HUT78 y se observaron los esincitiales en estas células HUT78 transfectadas. El patrón de la producción de p24 de las transfecciones de MT-2, sin embargo, fueron notablemente diferentes de aquéllas observadas en la células Hela y HUT78. El nivel del producto de p24 se mantuvo creciente más allá del día cuatro, aunque la producción de p24 de las células transfectadas con los ADN provirales de virus mutantes fueron menores de aquéllos transfectados con el ADN proviral de virus de tipo silvestre. En el día 6 después de la transfección, el tipo silvestre produjo 1.380 ng/ml de p24, mientras la producción de p24 de mp8 y mplO se produjeron y pudo infectar las células CD4+ ;T2 no transfectadas, no obstante aparentemente no tan eficiente como la progenie de tipo silvestre. Los ADN de estas células transfectadas formaron secuencias y la supresión del GPC se verificó para la progenie tanto de mp8 como mplO. En seguida, la habilidad de las clonas moleculares mutantes de generar partículas de virus capaces de establecer una infección se analizaron ulteriormente. Las células Hela y las células MT-2 se introdujeron con el ADN proviral y cuatro días después de la introducción se recogieron los sobrenadantes del cultivo, se filtraron, ensayaron para los niveles de p24 y partes alícuotas se congelaron a -70°C como materia viral. La titulación viral (TCID50) se realizó en las células MT-2. Los sobrenadantes de las transfectantes de MT-2 se ajustaron para contener la misma cantidad de p24, el virus de tipo silvestre suministro 83,300 TCID50/ml en tanto los mutantes, mp8 y mplO proporcionaron 16,700 y 25,000 TCID5o/ml, respectivamente -alrededor de cinco veces menos de la obtenida con el virus de tipo silvestre. De acuerdo con una producción de p24 menor de los sobrenadantes de transfección Hela, los títulos pueden suministrar también una cantidad mucho menos, 70 y 10 TCID5o/ml para las células WT y mutantes, respectivamente. Así, aunque el virus mutante fue aún infeccioso, la supresión de la variante GPG en V3 pudo tener reducida la virulencia viral de estas células. Esto se probó además por la infección de las células MT-2 y vigilado por la producción del virus progenie. La materia viral de las transfecciones tanto de Hela como MT-2, luego se usaron para infectar células de mT-2 (100 TCID50 de virus tipo silvestre o mutante de los sobrenadantes de transfección de MT-2 o cinco TCID50 de la materia transíectante Hela) . Las células se incubaron con virus durante 16 horas y luego se lavaron. En seguida, las células se resuspendieron e incubaron a 37°C. La réplica de virus se vigiló midiendo los niveles de p24 y los efectos citopáticos. Con el virus de los transfectantes de MT-2, los virus de tipo silvestre (WT) al igual que de tipo mutante (mp8 y mplO) todos mostraron réplicas virales por la producción de p24. Los niveles de p24 cresta de tipo silvestre alcanzaron 2,150 ng/ml en el día 11 después de la infección, mientras los virus mutantes exhibieron aproximadamente un retardo de 4 días, con los valores de p24 cresta de 1.580 ng/ml y 1.760 ng/ml para mpd y mplO, respectivamente, en el día 14 después de la infección. Las infecciones de las células MT-2 con virus de los transfectantes Hela (a 5 TCID50) también suministraron una producción de p24 en tanto tipo silvestre como mutantes, ** a . a.A « 4-1. con cinética de crecimiento similar como la obtenida con los virus producidos de las células MT-2. Los .ADN se aislaron de todas las células infectadas y la mutación se verificó por la secuencia de V3 , que indica que el recrecimiento de los virus mutantes no fue debido a la reversión o el pico de la secuencia de tipo silvestre. La formación del sincitio fue también observada en las células MT-2 infectadas con virus tanto de tipo silvestre como mutantes. Los cultivos celulares se fijaron en el día 7 después de la infección y se emplearon para la inmunocitoquímica usando la técnica del emparedado de APPP . Las células infectadas se inmuno-tiñeron y dieron un color rojo. Los sincitios se observaron en las células MT-2 infectadas con los virus tanto WT como mutantes, , aunque los virus WT indujeron sincitios más temprano (4 días después de la infección) que los mutantes (después de 6 días) . La microscopía electrónica (EM) además reveló que las células MT-2 de virus mutantes produjeron partículas de HIV-1. Estas partículas de HIV-1 que tienen un núcleo característico en forma de cono se observan. Los datos confirmaron que el virus mutante suprimido de GPG permanece infeccioso en las células MT-2. La evidencia conclusiva que el GPG-NH2 inhibe la infección viral por un mecanismo diferente que la interacción del lazo V3 se obtuvo cuando los experimentos se evaluaron en la habilidad del GPG-NH2 en inhibir la infección de tipo silvestre y los mutantes que suprimen el lazo V3 (dominio GPG) en las células MT-2 se realizaron. En tanto 7 días como en 14 días después de la infección, una reducción considerable de la infección viral de tipo silvestre y mutante se observó. Véase la tabla 10. A 20µM y 100 µM, el GPG-NH2 redujo la infección de tipo silvestre y la infección mediada por los constructores mp8 y mplO de supresión de GPC. De hecho a los 7 días después de la infección y 100 µM de GPG-NH , una reducción igualmente completa de la infección viral se observó para el tipo silvestre, mp8 y mplO. Estos resultados establecieron que el GPG-NH2 inhibió la infección de HIV-1 por un mecanismo independiente de una interacción con el dominio de GPG del lazo de V3.

TABLA 10 *. « *, * &. **$& * ***** .4,1.1» Los datos presentados aquí establecen que los péptidos pequeños que tienen una terminal de carboxi modificada, inhiben la infección viral (por ejemplo, HIV-1, HIV-2 y SIV) unido a p24 e interrumpe el ensamblado de la cápsida adecuada. Los ensayos detallados anteriormente pueden ser usados para identificar la habilidad de cualquier péptido pequeño, péptido pequeño modificado, oligopéptido o péptido mimético, a impedir o inhibir las infecciones de HIV o SIV. Técnicas similares pueden ser también usadas para identificar la habilidad de cualquier péptido pequeño, péptido pequeño modificado, oligopéptido o péptido mimético a prevenir o inhibir otras infecciones virales. Debido a que la secuencia de varias proteínas de cápsida viral son conocidas, el diseño, fabricación e identificación de los pequeños péptidos, en forma de amida, que impiden el ensamblado apropiado de diferentes cápsidas virales son directos. Varias proteínas virales de la cápsida, por ejemplo, contienen una región de homología de 20 aminoácidos de largo, nombrada la región de homología mayor (MHR) , que existe dentro del dominio de la terminal de **í -**--*-.lí..*-,4 [***.**?*íí***i**.s *, > ill * & * * iÚ carboxilo de muchos onco- y lenti-virus. (Véase la Figura 5) . Esta Figura 5 muestra el dominio de terminal carboxi de HIV-1 (residuos 146-231) y compara esta secuencia a las secuencias de la proteína de la cápsida de otros virus, algunos de los cuales infectan pájaros, ratones y monos. Notablemente, una homología considerable en las secuencias de estas proteínas de la cápsida viral se encuentra. Los investigadores han observado que el dominio de la terminal carboxilo se requiere para la dimerización de la cápsida y el ensamblado viral en el HIV-1. (Gamble et al. Science 278:849 (1997), aquí incorporado como referencia en su totalidad) . Mientras los péptidos pequeños que exhiben actividad antiviral en los ensayos descritos en esta especificación corresponden, completa o parcialmente, a regiones del dominio de la terminal de carboxilo de HIV-1, HIV-2 y SIV, las regiones del dominio de la terminal N de virus son importantes para el ensamblado de la cápsida y el diseño y síntesis de los péptidos pequeños que corresponde, completa o parcialmente a los aminoácidos de la región de la terminal N de las proteínas de la cápsida viral son modalidades convenientes de la presente invención. El uso de pequeños péptidos que corresponden, completa o parcialmente, a los aminoácidos dentro de la región MHR y el dominio de la terminal carboxilo de las proteínas de la cápsida viral, sin embargo, son modalidades preferidas de la presente invención. El inventor ha mostrado varios novedosos péptidos pequeños, en forma de amida, que corresponden, total o 5 parcialmente, a una secuencia de proteínas de la cápsida de tres diferentes virus que inhiben y/o previenen efectivamente la infección por estos virus. Las estrategias empleadas aquí se pueden usar en producir péptidos pequeños adicionales, en forma de amida, que corresponden, completa o 10 parcialmente, a las secuencias de proteínas de la cápsida de otros virus. Diseñando y fabricando pequeños péptidos, oligopéptidos y/o péptidos miméticos, que corresponden a las regiones de las secuencias descritas en la Figura 5, por ejemplo, nuevas moléculas que inhiben las infecciones del HIV, SIV, RSV, HTLV-1, MMTV, MPMV y MMLV, pueden ser 15 identificados rápidamente usando las técnicas de clasificación discutidas antes o modificaciones de estos ensayos, como será evidente a un experto en la materia. Además, muchas de las secuencias de otras proteínas de la cápsida viral son conocidas, tal como los miembros de las 20 familias de arenavirus, rotavirus, orbivirus, retrovirus, papilomavirus, adenovirus, herpesvirus, paramixovirus, mixovirus y hepadnavirus . Varios péptidos pequeños, oligopéptidos y/o péptidos miméticos, que corresponden, completa o parcialmente, a estas secuencias, pueden ser seleccionados y rápidamente clasificados para identifica aquéllos que inhiben efectivamente y/o previenen infecciones virales usando los ensayos de infección viral y/o las técnicas de microscopía electrónica aquí descritas, o modificaciones de estos ensayos, como serán evidentes a los expertos en la materia, dada la presente descripción. Modalidades convenientes incluyen pequeños péptidos (más de un aminoácido y menos o igual a 10 aminoácidos en longitud) que tienen una terminal de carboxi modificada, que se usan para interrumpir el ensamblado de la cápsida e inhiben la infección viral. Preferiblemente, los dipéptidos, tripéptidos y oligopéptidos y los péptidos miméticos correspondientes, que tienen una secuencia que se encuentra en la cápsida del HIV o SIV se usan. Por ejemplo, un oligopéptido de la presente invención puede tener cuatro aminoácidos, cinco aminoácidos, seis aminoácidos, siete aminoácidos, ocho o nuevo o diez aminoácidos y los péptidos miméticos de la presente invención pueden tener estructuras que asemejan cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos. Estos oligopéptidos también incluyen convenientemente las secuencias, totales o parciales, encontradas en los tripéptidos GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2,, ASG-NH2/, SLG- NH2, y SPT-NH2, . Los péptidos miméticos que asemejan dipéptidos, tripéptidos y oligopéptidos también, preferiblemente, corresponden a una secuencia que se encuentra en GPG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2, . Se prefiere que los pequeños péptidos posean un grupo de modulación (por ejemplo un grupo de amida) en sus terminales de carboxi (CO-NH2,) más bien que un grupo de carboxilo (COOH) . Los péptidos pequeños que tienen otros grupos de modulación en la terminal de carboxi, pueden también ser usados, pero, convenientemente, los grupos de modulación adjuntos tienen la misma carga y esféricamente se comportan igual como un grupo de amida. (Véase la patente de EE.UU. No. 5,627,035 de Vahine et al., para un ensayo en comparar péptidos que tienen diferentes substituyentes en la terminal de carboxilo) . En algunas modalidades, la adición de un grupo acetilo o metilo en cualquier extremo del pequeño péptido es conveniente, para así mejorar la captación de los pequeños péptidos o prevenir la digestión de la exoproteasa o ambos. En la siguiente descripción, se suministran varios acercamientos para obtener herramientas biotécnicas y las composiciones farmacéuticas que comprenden los dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos de menos de o iguales a 10 aminoácidos, y los péptidos miméticos que se asemejan a los tripéptidos y oligopéptidos menores de o iguales a 10 aminoácidos (referidos colectivamente como "gente (s) de péptidos") . Se debe notar que el término de "agentes de . -:feA., - . péptidos" incluyen los dipéptidos, tripéptidos y oligopéptidos con menos de o igual a 10 aminoácidos. Los "agentes de péptidos" son, por ejemplo, los péptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez aminoácidos y los peptidos mimeticos que asemejan peptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez aminoácidos. Además, los "agentes de péptidos" son péptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos, o los péptidos miméticos que semejan dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez aminoácidos que son provistos como agentes multiméricos o muítimerizados, como se describe abajo. Herramientas o componentes biotecnológicos convenientes para los agentes profilácticos o terapéuticos, suministran el agente del péptido en tal forma o de tal manera que una afinidad o inhibición suficiente de un virus, tal como el HIV-1, HIV-2 o SIV, se obtenga. Mientras un agente de péptido monomérico natural (por ejemplo, que aparece como unidades discretas del agente de péptido, cada uno llevando sólo un epítope de unión) es suficiente para unir una proteína de capsómero, tal como p24, y/o interferir con el ensamblado de la cápsida yo prevenir la infección viral, tal como la infección HIV-1, HIV-2 o SIV, ligaduras sintéticas o ligaduras multiméricas (por ejemplo, que aparecen como unidades múltiples del agente de péptido con varios epítopes de unión) , pueden tener mayor habilidad para unirse a la proteína del capsómero, tal como p24 y/o interferir con el ensamblado de la cápsida y/o prevenir la infección viral, tal como la infección de HlV-a, HIV-2 o SIV. Se debe notar que el término de "multimérico" significa la presencia de más de una unidad de una ligadura, por ejemplo varias moléculas individuales de un tripéptido, oligopéptido o un péptido mimético, como se distingue del término "multimerizado" que se refiere a la presencia de más de una ligadura unida como una sola unidad discreta, por ejemplo varias moléculas de tripéptidos, oligopéptidos o péptidos miméticos unidas en tándem.

Preparación de soportes multiméricos y ligaduras muí timer i zadas Un agente multimérico (sintético o natural) que se une a una proteína de capsómero, tal como p24, y/o interfiere con el ensamblado de la cápsida y/o inhibe la infección viral, tal como la infección del HlV-a, HIV-2 y SIV, puede ser obtenida acoplando un tripéptido, oligopéptido o un péptido mimético a un soporte macromolecular. El término de "soporte", según se usa aquí, incluye un portador, una resina o cualquier estructura macromolecular usada para unir, inmovilizar o estabilizar un agente de péptido. soportes sólidos incluyen, pero no se ..í aÍAt? limitan a, las paredes de los pozos de una charola de reacción, tubos de prueba, perlitas de poliestireno, perlitas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas, tal como las partículas de látex, células de glóbulos rojos de la oveja (u otro animal) , células artificiales y otros. El término de Soporte también incluye portadores, según ese término se entiende en la preparación de composiciones farmacéuticas. El soporte macromolecular puede tener una superficie hidrofóbica que interactúa con una porción el agente del péptido por la interacción no covalente hidrofóbica. La superficie hidrofóbica del soporte puede también ser un polímero, tal como de plástico o cualquier otro polímero en el cual grupos hidrofóbicos se han enlazado, tal como el poliestireno, polietileno o polivinilo. Alternativamente, el agente del péptido puede estar unidos covalentemente a portadores, que incluyen las proteínas y los oligo/polisacáridos (por ejemplo la celulosa, almidón, glicógeno, quitosán o sefarosa aminada) . En estas últimas modalidades, un grupo reactivo en el agente del péptido, tal como un grupo de hidroxi o de amino, puede ser usado para unirse a un grupo reactivo en el portador, para así crear el enlace covalente. El soporte puede también tener una superficie cargada que interactúa con el agente del péptido. Adicionalmente, el soporte puede tener otros grupos reactivos, que pueden ser activados químicamente, para así unirse a un agente de péptido. Por ejemplo, matrices activadas con el bromuro de cianógeno, matrices activadas de epoxi, geles tio y de tiopropilo, clorofor ato de nitrofenilo y enlaces de N-hidroxi-succinimida- cloroformato y soportes acrílicos de oxirano son comunes en el arte. Los soportes pueden también comprender un portador inorgánico, tal como el material de óxido de silicio (por ejemplo, gel de sílice, zeolita, tierra diatomácea o vidrio aminado) al cual el agente de péptido se enlaza covalentemente a través de un grupo de hidroxi, carboxi o amino, y el grupo reactivo en el portador. Asimismo, en algunas modalidades, una bicapa de liposoma o lípido (natural o sintética) se considera como un soporte y los agentes de péptidos se unen a la superficie de la membrana o se incorporan en la membrana por técnicas en la ingeniería de los liposomas. Por un acercamiento, los soportes multiméricos de liposoma comprenden un agente de péptido que se expone sobre la superficie de la bicapa y un segundo dominio que ancla el agente de péptido a la bicapa de lípido. Esta ancla se construye de residuos de aminoácidos hidrofóbicos, que semejan dominios conocidos de transmembrana, o pueden comprender ceramidas que se unen al primer dominio por técnicas convencionales. tatá *Í?k******Í*Í Los soportes o portadores para su uso en el cuerpo (es decir para aplicaciones profilácticas o terapéuticas) son convenientemente fisiológicos, no tóxicos y preferiblemente no inmuno-responsivos. Portadores considerados para su uso en el cuerpo incluyen la pol-L- lisina, poli-D,L-alanina, liposomas y Chromosorb® (Johns .Manville Products, Denver CO.). La ligadura conjugada Chromosorb® (Synsorb-Pk) se ha probado en humanos para la prevención del síndrome hemolítico-urémico y se informa no 0 presenta reacciones adversas. (Armstrong et al. J. Infections Diseases, 171:1042-1045 (1994). Para algunas modalidades, el presente inventor considera la administración de un portador "desnudo" (es decir, que carece del agente de péptido unido) que tiene la capacidad de unir un agente de péptido en el cuerpo de un sujeto. Por 15 este acercamiento, una terapia "tipo prodroga" se considera, en la cual este portador desnudo se administra separadamente del agente de péptido y, una vez ambos en el cuerpo del sujeto, el portador y el agente del péptido se ensamblan en un complejo multimérico. 20 La inserción de enlazadores, tal como los enlazadores ?, de una longitud apropiada entre el agente de péptido y el soporte, son también considerados como para estimular mayor flexibilidad del agente del péptido y así superar cualquier obstrucción estérica que pudiera presentarse por el soporte. La determinación de una longitud apropiada del enlazador que permite la unión óptima a una proteína del capsómero, tal como p24, y/o la interferencia con el ensamblado de la cápsida, y/o la inhibición de la infección viral, tal como la infección de HIV o SIV, puede ser determinada clasificando los agentes del péptido con enlazadores variables en los ensayos detallados en la presente descripción. Un soporte compuesto que comprende más de un tipo 10 de agente de péptido es también una modalidad. Un "soporte compuesto" puede ser un portador, una resina o cualquier estructura macromolecular usada para unir o inmovilizar dos o más diferentes agentes de péptidos que se unen a una proteína de capsómero, tal como p24 y/o interfiera con el 15 ensamblado de la cápsida, y/o inhiben la infección viral, tal como la infección de HIV o SIV. En algunas modalidades, una bicapa de liposoma o lípido (natural o sintética) se considera para el uso en construir un soporte compuesto y agentes de péptidos se unen a la superficie de membrana o se incorporan en la membrana usando las técnicas en la 20 ingeniería de liposomas. Como antes, la inserción de enlazadores, tal como los enlazadores ?, de una longitud apropiada entre el agente del péptido y el soporte, es también considerada para así estimular mayor flexibilidad en la molécula y superar cualquier obstáculo esférico que pudiera ocurrir. La determinación de una longitud apropiada el enlazador que permita la unión óptima a una proteína del capsómero, tal como p24, y/o la interferencia con el ensamblado de la cápsida y/o la inhibición de la infección viral, tal como la infección de HIV o SIV, puede ser determinada por la clasificación de ligaduras con varios enlazadores en los ensayos detallados en la presente descripción. En otras modalidades de la presente invención, los soportes multiméricos y compuestos, discutidos anteriormente, pueden tener unidas ligaduras multimerizadas, para así crear un "soporte multimérico muítimerizado" y un "soporte compuesto multimerizado" , respectivamente. Una ligadura multimerizada puede, por ejemplo, ser obtenida por acoplamiento de dos o más agentes de péptidos en tándem, usando técnicas convencionales en biología molecular. La forma multimerizada de la ligadura puede ser ventajosa para muchas aplicaciones debido a la habilidad de obtener un agente con mejor capacidad a la proteína del capsómero, tal como p24, y/o interferir con el ensamble de la cápsida y/o inhibir la infección viral, tal como la infección de HIV o SIV. Además, la incorporación de enlazadores o espaciadores, tal como los enlazadores ? flexibles, entre los dominios individuales que componen el agente multimerizado es una modalidad ventajosa. La inserción de los enlazadores ? de una longitud apropiada, entre los dominios de unión de proteínas, por ejemplo, puede estimular mayor flexibilidad en la molécula y puede superar la obstrucción estérica. Similarmente, la inserción de enlazadores entre la ligadura multimerizada y el soporte puede estimular mayor flexibilidad y limitar la obstrucción estérica presentada por el soporte. La determinación de una longitud apropiada del enlazador que permita la unión óptima a p24 y/o la interferencia con el ensamblado de la cápsida y/o la 10 inhibición de la infección de HIV o SIV, puede ser determinada clasificando las ligaduras con varios enlazadores en los ensayos detallados en esta descripción. En modalidades preferidas, los varios tipos de soportes, discutidos anteriormente, se crean usando los tripéptido GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, KOG-NH2, ALG-NH2, GVG- 15 NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2. Estos soportes multiméricos soportes compuestos, soportes multiméricos multimerizados o soportes compuestos muítimerizados, referidos colectivamente como "agentes de unión de soporte" son también construidos preferiblemente usando los 20 tripéptidos GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, KOG-NH2, ALG-NH2, GVG- NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2. En la siguiente discusión, se describen varias modalidades de la invención que tienen aplicaciones terapéuticas y/o profilácticas.

Aplicaciones terapéuticas y profilácticas Los agentes de péptidos monoméricos y multiméricos, descritos aquí, son adecuados para el tratamiento de sujetos o como una medida preventiva para evitar las infecciones virales, tal como la infección por HIV o SIV, o como substancias terapéuticas para tratar sujetos ya infectados con un virus, tal como el HIV o SIV.

Aunque cualquiera puede ser tratado con los péptidos como un profiláctico, la mayoría de los sujetos adecuados son personas con riesgo de una infección viral. Dichos sujetos incluyen, pero no se limitan a: homosexuales, prostitutas, usuarios de drogas intravenosas, hemofílieos, niños nacidos de madres infectadas con virus y aquéllos con profesión médica que tienen contacto con pacientes o muestras biológicas . Los compuestos activos farmacológicamente de esta invención se pueden procesar de acuerdo con métodos convencionales de la farmacia galénica, para producir agentes medicinales para la administración a pacientes, por ejemplo, mamíferos, que incluyen humanos. Los agentes de péptidos pueden ser incorporados en un producto farmacéutico con o sin modificación. Además, los fabricantes de agentes farmacéuticos o terapéuticos que entregan el agente de péptido o una secuencia del ácido nucleico que codifica un péptido pequeño, por varias rutas, es otra modalidad. Por ejemplo y sin limitación, el ADN, ARN y vectores virales gue tienen una secuencia que codifica un péptido pequeño que inhibe la réplica viral interrumpiendo el ensamblado de la cápsida se considera, Los ácidos nucleicos que codifican un agente de péptido deseado pueden ser administrados solos o en combinación con agentes de péptidos. Los compuestos, descritos aquí, se pueden emplear en mezcla con excipientes convencionales, es decir con substancias portadoras, orgánicas o inorgánicas, farmacéuticamente aceptables, adecuadas para la aplicación parenteral, enteral (por ejemplo oral) o tópica, que no reacciones perjudicialmente con los agentes de péptidos. Portadores aceptables farmacéuticamente adecuados incluyen, pero no se limitan a, el agua, soluciones salinas, alcoholes, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes de bencilo, polietilen-glicoles, gelatina, carbohidratos, tal como la lactosa, amilosa o almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceites de perfumes, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, esteres de ácidos grasos de pentaeritritol, hidroxi- metilcelulosa, polivinil-pirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y, si se desea, mezcladas con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, preservativos, estabilizadores, agentes humectantes, iii? A **.* emulsionantes, sales que tienen influencia en la presión osmótica, reguladores, agentes de color, de sabor y/o substancias aromáticas y similares, que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos. Ellos pueden también ser combinados, donde sea deseado, con otros agentes activos, por ejemplo vitaminas. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos que comprenden los agentes de péptidos, se administran en conjunto con otros agentes terapéuticos que tratan infecciones virales, tal como la infección del HIV, para así lograr una respuesta viral mejor. Actualmente, cuatro clases diferentes de drogas son de uso clínico en el tratamiento antiviral de la infección de HIV-1 en humanos. Ellas son (i) inhibidores de la transcriptasa inversa, tal como la zidovidina, lamivudina, stavudina, didanosina, abacavir y zalcitabina; (ii) inhibidores de la transcriptasa inversa, análogos de nucleótidos, tal como el adetovir y pivazir; (ii) inhibidores de la transcriptasa inversa, no de nucleósidos (MNRTI) , tal como el efavirentz, nevirapina y delavirdina; y (iv) inhibidores de la proteasa, tal como indinavir, nelfinavir, ritonavir, sequinavir y amprenavir. Usando simultáneamente dos, tres o cuatro clases diferentes de drogas en conjunto con la administración de los agentes de péptidos, el HIV es menos probable desarrolle resistencia, puesto que es menos probable que las múltiples 'l*?á ?M* , *?&ái*?» * . . ..- ***** ri», ,aa* *****- * * * * ** , * - — ' - ****..-******, * i. *,*^,**.**,.*** **.. * i?**** . * ^ mutaciones superen las diferentes clases de drogas y los agentes de péptidos aparezcan en la misma partícula de virus . Es así una modalidad preferida de la presente invención que los agentes de péptidos se den en combinación con los inhibidores de la transcriptasa inversa, análogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa, análogos de nucleótidos, inhibidores de la transcriptasa inversa, no de nucleósidos, e inhibidores de la proteasa, en dosis y por métodos conocidos por los expertos en la materia. Los medicamentos que comprenden los agentes de péptidos y los inhibidores de la transcriptasa inversa, análogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa, análogos de nucleótidos, inhibidores de la transcriptasa inversa, no de nucleósidos, e inhibidores de la proteasa, son modalidades de la presente invención. Los estudios de la eficacia del tratamiento de la infección de HIV con combinaciones de GPG-NH2 y agentes antivirales convencionales se pueden encontrar en el ejemplo provisto abajo.

EJEMPLO 4 En este ejemplo, los experimentos se presenten en los cuales diferentes combinaciones de un péptido pequeño, en forma de amida, y el AZT, se probaron para determinar si i.* * * .Í * :* ***,**, los dos compuestos pueden complementarse para inhibir la réplica del HIV-1. (Véase la Figura 6). Por lo tanto, 200,000 células HUT78 se infectaron con el virus HIV-2 SF-2 a 25 TCID50, con o sin la presencia de diferentes concentraciones del GPG-NH2, AZT o Ritonavir ("Rito") y combinaciones de estos compuestos. Los números mostrados en la Figura 6 representan concentraciones micromolares de los compuestos inhibidores. Las células se incubaron con virus a 37°C durante 1 hora, con los varios inhibidores y se lavaron subsiguientemente tres veces. En seguida, las células se resuspendieron en el medio RPMI 1640 que contiene el agente antiviral y/o los péptidos suplementados con 10% (vol/vol) de suero de bovino fetal, inactivado por calor (FBS, GIBCO) , penicilina (100 µ/ml) , estreptomicina (100 µ/ml) y Polybrene (Sigma, 2 µg/ml) y se cultivaron en placas de 24 pozos (Costar Corporation) a 37°C en 5% de C02, con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron cada cuatro días y el medio se cambió hasta el día 14 después de la infección. Para vigilar la réplica del virus, la proteína del antígeno p24 del HIV-1 en los sobrenadantes se ensayó usando un equipo disponible comercialmente (Abbott) . Se observó que el GPG-NH2 mejoró la inhibición de la réplica del HIV-1 en la presencia del AZT sinergísticamente, en tanto el péptido pequeño sólo exhibió un efecto antiviral aditivo a aquél del inhibidor de la proteasa, el Ritonavir. No obstante, estos experimentos validan los datos presentados anteriormente que los péptidos pequeños inhiben el HIV-1 por un mecanismo aparte de la manera en que los análogos de nucleósidos y los inhibidores de la proteasa interfieren con la réplica viral. Además, estos experimentos demuestran que un novedoso protocolo de tratamiento para la infección del HIV-1, que comprende los péptidos pequeños y el AZT y/o Ritonavir, es eficaz. En la siguiente descripción se suministran las 10 dosis y los métodos de administración.

Dosis y métodos de administración La dosis y método efectivos de administración de una formulación particular del agente del péptido puede variar con base en el paciente individual y la etapa de la 15 enfermedad, al igual que otros factores conocidos por los expertos en la materia. La eficacia terapéutica y toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar por los procedimientos farmacéuticos estándar en los cultivos celulares o animales 20 experimentales, por ejemplo la DE50 (la dosis efectiva terapéuticamente en el 50% de la población) y La DL50 (la dosis letal en 50% de la población) . La relación de dosis de los efectos tóxicos a los terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación de DL5o/DE50. Las composiciones farmacéuticas que exhiben grandes índices terapéuticos son preferidas. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios de animales se usan en formular un intervalo de dosis para el uso humano. Las dosis de dichos compuestos se encuentran preferiblemente dentro del intervalo de las concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o nada de toxicidad. Las dosis varían dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosis emplead, la sensibilidad del paciente y la ruta de administración. La dosis exacta es escogida por el médico individual, en vista del paciente que se va a tratar. Las dosis y administración se ajustan para suministrar niveles suficientes de la parte activa o para mantener el efecto deseado. Factores adicionales que pueden ser tomados en cuenta incluyen la severidad del estado de la enfermedad, edad, peso y género del paciente, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación (es) de drogas, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción corta se administran diariamente, en tanto las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se administran cada 2, 3 ó 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas. Dependiendo de la vida media y el régimen de evacuación de la formulación particular, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran una vez, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más veces por día. Cantidades de dosis normales pueden variar de aproximadamente 1 a 100,000 microgramos (µg) , hasta una dosis total de alrededor de 10 gramos, dependiendo de la ruta de administración. Dosis convenientes incluyen 250, 500, microgramos (µg) , 1, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 miligramos (mg) , 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.5, 1.7, 1.8, 10 1.8, 2, 3 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 gramos (g) . Adicionalmente, las concentraciones del agente de péptido pueden ser bastante altas en las modalidades que administran los agentes en forma tópica. Las concentraciones molares de los agentes de péptidos pueden ser usadas con algunas modalidades. Concentraciones convenientes para la 15 administración tópica y/o el equipo médico de revestimiento, varían de 100 µM hasta 800 mM. Concentraciones preferidas para estas modalidades varían de 500 µM hasta 500 mM. Por ejemplo, concentraciones preferidas para el uso en aplicaciones tópicas y/o para el equipo médico de 20 revestimiento, incluyen 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 µM, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 326, 350, 375, 400, 425, 450, 475 y 500 mM. Una guía para las dosis y métodos de entrega particulares, se /a aralMai&Mte. *** ** . t * ******k ***~ . . j.ait. . * ,* * a . . . . , _ .. , ,, . ... _.^,.? i j j suministra en la literatura, (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU., Nos. 4,657,760, 5,206,344 o 5,225,212) y en la descripción siguiente. Más específicamente, la dosis de los agentes de péptidos, descritos aquí, es una que suministre suficiente agente de péptido para obtener un efecto deseado, que incluyen la unión de una proteína de capsómero, tal como la p24 y/o la interferencia con el ensamblado de la cápsida y/o la inhibición de la infección viral, tal como la infección 10 de HIV y SIV. Por lo tanto, la dosis del agente de péptido produce preferiblemente una concentración en el tejido o en la sangre de ambos de aproximadamente 0.1 µM hasta 500 mM. Las dosis convenientes producen una concentración en el tejido o la sangre, o ambos, de 1 a 800 µM. Dosis preferidas producen una concentración en el tejido o la sangre mayor de 15 aproximadamente 10 µM hasta 500 µM. Dosis preferidas son, por ejemplo, la cantidad del péptido pequeño requerido para lograr una concentración en el tejido o la sangre, o ambos, de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 20 180, 190, 200, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480 y 500 µM. Aunque las dosis que produzcan una concentración del tejido mayor de 800 µM no se prefieren, ellas pueden ser usadas en algunas modalidades de la presente invención., Una infusión constante del péptido puede también suministrarse para así mantener una concentración estable en los tejidos, según se mide por los niveles de la sangre. Concentraciones mayores en el tejido pueden ser mantenidas sin daño, debido a la baja toxicidad de los péptidos. Los intentos en seleccionar cepas resistentes a los péptidos pequeños del HIV-1 (por ejemplo, cepas resistentes al GPC-NH2) por mucho no han tenido éxito. La capa de HIV-1, HTLV-IIIB, fue pasada en la presencia de diluciones en serie del GPG-NH (diluciones limitantes) por más de seis meses, sin signos de desarrollo de resistencia in vitro. Rutas de administración de los agentes de péptidos incluyen, pero no se limitan a, tópicas, transdermales, parenterales, gastrointestinales, transbronquiales y transalveolares. La administración tópica se logra por una crema aplicada tópicamente, gel, enjuague, etc., que contiene un péptido. La administración transdermal se logra por la aplicación de una crema, enjuague, gel, etc., capaz de permitir que el agente del péptido penetre en la piel y entre en la corriente sanguínea. Las rutas parenterales de administración incluyen, pero no se limitan a, la inyección eléctrica o directa, tal como la inyección en una línea venosa central, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Las rutas gastrointestinales de administración i?¿ák *Í . -í incluyen, pero no se limitan a, la ingestión y la administración rectal. Las rutas transbronquiales y transalveolares de administración incluye, pero no se limitan a, la inhalación, por vía bucal o intranasalmente . Composiciones de compuestos que contienen el agente de péptido, adecuadas para la aplicación tópica, incluyen, pero no se limitan , los implantes aceptables fisiológicamente, ungüentos, cremas, enjuagues y geles. Cualquier líquido, gel o sólido, en una base aceptable farmacéuticamente en la cual los péptidos son solubles, al menos mínimamente, es adecuado para el uso tópico en la presente invención. Las composiciones para la aplicación tópica son particularmente útiles durante el acto sexual para impedir la transmisión del HIV. Composiciones adecuadas, para tal uso, incluyen, pero no se limitan a, los supositorios vaginales o anales, cremas y lavados. Las composiciones de los agentes de péptidos, adecuados para la administración transdermal incluyen, pero no se limitan a, las suspensiones aceptables farmacéuticamente, aceites, cremas y ungüentos, aplicados directamente a la piel o incorporados en un portador protector, tal como un dispositivo transdermal ("parche transdermal"). Ejemplos de cremas adecuadas, ungüentos, etc. pueden encontrare, por ejemplo, en la Referencia de Escritorio del Médico, y son bien conocidos en la técnica.

Ejemplos de dispositivos transdermales adecuados se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU., No. 4,818,540, expedida el 4 de abril de 1989 a Chinen et al, que se incorpora aquí como referencia. Composiciones de los agentes de péptidos, adecuados para la administración parenteral, incluyen, pero no se limitan a, las soluciones isotónicas estériles, aceptables farmacéuticamente. Dichas soluciones incluyen, pero no se limitan a, soluciones salinas y soluciones salinas reguladas con fosfato, para la inyección en una línea venosa central, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, de los agentes de péptidos. Las composiciones de los agentes de péptidos adecuadas para la administración transbronquial y transalveolar incluyen, sin limitación, varios tipos de aerosoles para la inhalación. Por ejemplo, la pantamidina se administra intranasalmente por aerosol a los pacientes de SIDA para impedir la neumonía causada por pneumocystis carinii . Dispositivos adecuados para la administración transbronquial y transalveolar de los péptidos son también otras modalidades. Dichos dispositivos incluyen, pero no se limitan a, atomizadores y vaporizadores. Muchas formas de atomizadores y vaporizadores, actualmente disponibles, se pueden adaptar fácilmente a la entrega de los agentes de péptidos . 4ilii.

Composiciones de los agentes de péptidos, adecuadas para la administración gastrointestinal incluyen, pero no se limitan a, polvos aceptables farmacéuticamente, pildoras o líquidos para la ingestión y supositorios para la administración retal . Debido a que las rutas más comunes de la infección del HIV y la facilidad de uso, la administración gastrointestinal, particularmente oral, es la modalidad preferida de la presente invención. Cápsulas de quinientos miligramos, que tienen un tripéptido (GPC-NH2) se han preparado y se encontró que eran estables por un mínimo de 12 meses, cuando se almacenan a 4°C. Como se mostró previamente en otros sistemas huéspedes de virus, la actividad antiviral específica de los péptidos pequeños puede ser detectada en el suero, después de la administración oral. (Miller et al., Appli . Microbiol . , 16:1489 (1968)). Puesto que los péptidos pequeños aparentemente evaden la degradación por el sistema digestivo del paciente, ellos son ideales para la administración oral. Los agentes de péptidos que también son adecuados para el uso en situaciones donde la prevención de la infección del HIV es importante. Por ejemplo, el personal médico está expuesto constantemente a pacientes quienes pueden ser positivos al HIV y cuyas secreciones y fluidos del cuerpo contienen el virus de HIV. Además, los agentes de péptidos pueden ser formulados en composiciones antivirales ¡«I .*-?*l. s i-i-******:.*, para su uso durante el acto sexual para así prevenir la transmisión del HIV. Dichas composiciones se conocen en la técnica y también se describen en la solicitud internacional publicada bajo el número de publicación del PCT WO90/04390 del 3 de mayo de 1990, de Modak et al, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Los aspectos de la invención también incluyen un revestimiento para el equipo médico, tal como guantes, sábanas y superficies de trabajo, que protegen contra la transmisión del HIV. Alternativamente, los agentes de péptidos pueden estar impregnados en un dispositivo médico polimérico. Particularmente preferidos son los revestimientos para los guantes médicos y condones. Revestimientos adecuados para su uso en dispositivos médicos pueden ser provistos por un polvo que contenga los péptidos o por el revestimiento polimérico en el cual los agentes de péptidos se suspenden. Materiales poliméricos adecuados para revestimientos o dispositivos son aquéllos fisiológicamente aceptables y a través de los cuales una cantidad efectiva terapéuticamente, del agente de péptido se puede difundir. Polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, el poliuretano, polimetacrilato, poliamida, poliéster, polietileno, polipropileno, poliestireno, politetrafluoroetileno, polivinil-cloruro, acetato de celulosa, elastómeros de silicona, colágeno, seda, etc. Estos revestimientos se 11 describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU., No. 4,612,337, expedida el 15 de septiembre de 1986 a Fox et al., que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En la siguiente descripción, se suministran varios estudios toxicológicos en péptidos pequeños y acercamientos a la prueba de la toxicidad de otros agentes de péptidos.

Estudios de toxicología de péptidos pequeños Se han realizado varios estudios toxicológicos en el GPG-NH2 y estos ensayos se pueden reproducir usando otros muchos péptidos (por ejemplo el GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2,). (Véase, por ejemplo la patente de EE.UU., No. 5,627,035, de Vahine et al.). Los efectos del GPG-NH2, en los linfocitos cultivados son provistos por el siguiente ejemplo.

EJEMPLO 5 En este ejemplo, se presentan varios estudios toxicológicos que dirigen los efectos de los pequeños péptidos en los linfocitos cultivados. Generalmente, ninguno de los péptidos usados en los ensayos de inhibición del virus para el HIV-1 probados a una concentración de hasta 2 M, exhibieron algún efecto tóxico en las células usadas, como se determinó por su apariencia morfológica, el teñido del azul de tripano y el crecimiento celular. La toxicidad del GPG-NH2, se probó además en (i) un ensayo de reducción de placa e (ii) un ensayo de la inhibición del HSV-1. El GPG-NH , falló en reducir la réplica del HSV-1 a concentraciones hasta de 1 M, que no solamente confirmó su carencia de toxicidad, sino también demostró que el péptido pequeño inhibe selectivamente los virus relacionados con el HIV. Este punto es reforzado por la observación que el GPG-NH2, también falló en inhibir otros virus de la influenza o poliomielitis . En seguida se examinó la toxicidad a células linfomonocíticas humanas normales (PBMC) . A dosis tan altas como de 2 M y exposición tan grande como de 4 días, el GPG-NH2 no afectó apreciablemente la viabilidad de los monocitos cultivados y los linfocitos. El efecto del GPG-NH2 0 en la respuesta proliferativa in vi tro de las células mononucleares humanas fue también probada. El GPG-NH2 ejerció un efecto marginal si cualquier propiedad anti-proliferativa directa en las células T y no afectó la función de las células accesorias (por ejemplo las células de monocitos y dendríticas) a una dosis de 20 µM. Las concentraciones citotóxicas del 50% in vi tro (CC50) de varias líneas celulares también se evaluó. Por lo tanto, diferentes concentraciones de GPG-NH2 hasta 40 mM se suplementaron en el cultivo del medio de las líneas de células T HUT78, H9, CEM-SS, MT-1 y ACH-2 (no) inducidas, al *& * ** *%* * igual que los macrófagos derivados de las líneas celulares Jurakat-tat III, THP-1 y células U-l (no) inducidas. Después de 3 días de incubación, el número de células se contó. La exclusión del tinte azul de tripano y el conteo celular de HUT78, MT-2 y Jurkat-tat II mostraron que alrededor de un 40% de inhibición del crecimiento celular, durante 3 días de cultivo en la presencia de 40 mM de GPG-NH2, H9. , CEM-SS y THP-1 mostraron menos del 20% de disminución en el número celular en esta concentración del GPG-NH2. Por lo tanto, la relación de CC50/?c50 in vi tro es > 10*4 . Los experimentos de la toxicología presentados anteriormente probaron que los péptidos pequeños son de baja toxicidad a los linfocitos aún a altas concentraciones. Los efectos de las dosis grandes de los péptidos pequeños en roedores también se analizó y estos experimentos se presentan en el siguiente ejemplo.

EJEMPLO 6 En este ejemplo, los resultados de varios estudios de toxicología in vivo en péptidos pequeños, administrados en grandes dosis a roedores, se presenten. En un primer experimento, una sola dosis grande del péptido pequeño se entregó a ratones y se analizaron los efectos tóxicos. Una inyección intravenosa de GPG-NH2 en la vena de la cola de ratones adultos, a concentraciones de hasta 1 g por « ,1 * * . , * iiA. k Ld kilogramo de peso corpóreo, no suministraron efectos tóxicos aparentes en los animales. En un segundo experimento, varias dosis de diversas cantidades de un péptido pequeño se entregaron a ratones por casi tres semanas. Los grupos de ratones (cinco ratones en cada grupo) se suministraron inyecciones intraperitoneales de GPG-NH2 (0.01, 0.1 y 1 g por kilogramo de peso corpóreo, por día, respectivamente) comenzando en una edad de 6 días. Las inyecciones diarias se continuaron durante 18 días. Comparado con los controles, no hubo una influencia significante del GPG-NH2 en los ratones. En un experimento similar, un estudio toxicológico de cuatro semanas del GPG-NH2 se realizó por Scantox A/S en Dinamarca. El GPG-NH2 se suministró oralmente a ratas a una dosis hasta de 1 g por kilogramo de peso corpóreo por día, durante veintiocho días. No se observaron signos de toxicidad a los animales. Estos experimentos toxicológicos in vivo probaron que los péptidos pequeños, aquí descritos, son de baja toxicidad a los mamíferos y que pueden suministrarse con seguridad en grandes dosis. En estudios ulteriores. la estabilidad de los péptidos pequeños en la sangre y el plasma humanos se analizaron. El siguiente ejemplo describe estos experimentos .

EJEMPLO 7 Este ejemplo describe varios estudios que se realizaron para el acceso a la estabilidad de pequeños péptidos en la sangre y el plasma humano. Por lo tanto, se tomó sangre humana reciente y se trató con EDTA. El plasma se separó por centrifugación a 2,500 rpm durante 20 minutos. Se agregó el GPG-NH2 en la sangre o el plasma a concentraciones de 10 o 50 mM, seguido por la incubación a 37°C durante 1, 2 y 4 horas, respectivamente. Como un control, el GPG-NH2 se agregó en el medio RPMI 1640, suplementado con 10% (vol/vol) de suero de bovino fetal inactivado por calor (FBS, GIBCO) , penicilina (100 µ/ml) estreptomicina (100 µ/ml) y Polybren (Sigma, 2 µg/ml) y se incubó en la misma forma. Después de la incubación a 37°C, la sangre, que contiene el GPG-NH2 se centrifugó a 2,500 rpm durante 20 minutos, para aislar el plasma. Algunas de las muestras de plasma se trataron con CaCl2 a una concentración de 45 mM a 37°C durante 10 minutos, seguido por la centrifugación a 13,000 rpm durante 30 minutos y el sobrenadante se nombra como el plasma tratado con el CaCl2. Todas las muestras que contenían el GPG-NH2 se diluyeron en el medio RPMI para dar las concentraciones finales de 20 ó 100 µM del GPG-NH2 (diluciones de 500 veces) y luego se usaron en los ensayos de réplica del HIV-1. fc & , í Los ensayos de réplica se realizaron en células HUT78 y se usó la cepa del virus HIV-1 SF-2. En breve, aproximadamente 200,000 células se resuspendieron en el medio que contiene el GPG-amida diluido, plasma o plasma de la sangre. El medio que contiene el GPG-NH2, plasma o plasma de la sangre se incubó con las células durante 1, 2 ó 4 horas a 37°C. En seguida, el virus SF-2 se agregó a 25 TCID50. Después de la adsorción de 1 hora, las células se lavaron tres veces en el medio RPMI, luego se resuspendieron en el plasma que contiene el GPG-amida apropiado y se incubó a 37°C en 5% de C02 con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron cada cuatro días y el medio se cambió hasta el día 14 después de la infección. Para vigilar las réplicas del virus, la proteína del antígeno p24 del HIV-1 en los sobredadantes se ensayaron usando un equipo disponible comercialmente. El ensayo de p24 del HIV-1 se realizó en los sobrenadantes del día 7 y el día 14 después de la infección. Ninguna diferencia significante en la habilidad de inhibir el HIV-1 con el medio suplementado con GPG-NH2 , plasma o plasma de la sangre, se observó. La estabilidad del GPG-NH2 en el plasma humano también se evaluó químicamente por la cromatografía de capa delgada (TLC) . (Véase la Figura 7) . En este experimento, el 14C GPG-NH se incubó con el plasma humano a 37°C durante 30 minutos por dos u ocho horas y luego las proteínas se **** j lía. separaron por la TLC y se visualizaron por la exposición del cromatógrafo a una película de auto-radiografía. Como se muestra en la Figura 7, (fajas HpO, Hp0.5, Hp2 y Hp8) un leve desplazamiento en la movilidad del péptido pequeño se observó. Aunque la movilidad del péptido pequeño aumento algo después de 30 minutos de incubación en el plasma humano a 37°C, no se observó cambio en la movilidad por hasta 8 horas. El análisis de la espectrometría de masa (análisis electro-rociado) de las zonas de la TLC verificaron todas las zonas, que incluyen la zona con la movilidad aumentada, donde estaba el GPG-NH2. Los experimentos anteriores probaron que los péptidos pequeños aquí descritos son estables en la sangre y el plasma humano; ellos retienen sus propiedades antivirales y no se degradan por las proteinasas del plasma. En la siguiente discusión, se suministran varios estudios en la adsorción, distribución y metabolismo de los pequeños péptidos.

Adsorción, distribución y metabolismo de péptidos pequeños . Debido a que una administración oral de una composición farmacéutica de un péptido pequeño es conveniente, se evaluó la estabilidad en ácido de los péptidos pequeños por la incubación de GPG-NH2 etiquetado con 14C, en una solución de 50 mM de KCl y 0.1M de HCl, para varios períodos de tiempo. Después de la hidrólisis acida, el tripéptido radio-etiquetado se analizó por la cromatografía de capa delgada (TLC) y la placa de HPTLC se desarrolló con 25% de metanol; 25% de isopropanol; 15% de butanol; 35% de (0.1N HOAc y 0. ÍN NAOAc). Como se ve en la Figura 8, la incubación del tripéptido por hasta 24 horas no afectó la movilidad y así no la estructura molecular del GPG-NH2 . El resultado estableció que los péptidos pequeños sobreviven las condiciones acidas similares a las encontradas en el estómago. Adicionalmente, la admisión in vitro de pequeños péptidos del medio de cultivo en las células se estudió en una serie de experimentos. Por lo tanto, las células HUT78 Jurkat-tat III y MT-2 se incubaron con 165 nCi de GPG-NH2 etiquetado con 14C (equivalente a 0.7 µM de GPG-NH .) Una admisión del péptido pequeño se observó y entre 8% (células Jurkat-tat III) y 20% de (células HUT78) del GPG-NH2 se incorporaron en las células. Este resultado probó que la incorporación de los péptidos pequeños en varios tipos de células fue efectivo. Además, la admisión in vivo de pequeños péptidos se analizó en ratas. Las ratas se alimentaron con GPG-NH2 14C, después de varios puntos de tiempo, se recogieron muestras de sangre, orina y tejido de los animales. Las muestras de la orina de la rata tomadas ocho horas después de la alimentación y el plasma de la rata tomadas 30 minutos, dos horas y ocho horas después de la alimentación, se separaron en una placa de TLC, como se muestra en la Figura 7 (designadas orinad , rp0.5, rp2 y rp8, correspondientemente). Todos los tejidos se mantuvieron a -20°C, después de la necropsia antes de realizar cualquier ensayo. Diez a treinta microgramos de las muestras de tejido se recogieron de tres diferentes ubicaciones de cada órgano analizado y el tejido orgánico se disolvió subsecuentemente en 250 µl del solubilizador del tejido (OptiSolv, LKB-Wallac) a 45°C durante cuatro a seis horas. Las soluciones del tejido homogeneizado se decoloraron por la adición de 50 µl de H20=2 al 30% y 100 µl de isopropanol, antes de agregar 3 ml de un cóctel de escintilación acidificado de 0.05M HCl (Luma Gel, Lumac/3M) . La radioactividad se determinó con el contador de escintilación beta (LKB-Wallac 1218 Rack Beta) . El GPG-NH2 libre/sin enlazar en el plasma se recogió por precipitación con una parte de plasma y dos partes de etanol, seguido por la incubación a -70°C durante una hora y la centrifugación A 20,000XG durante 15 minutos a 4°C. Las muestras de células de la sangre se diluyeron con PBS (en la relación de 2 partes de células de sangre a 1 parte de PBS) , antes que 10 µl de la mezcla se muestrearan y analizaran como las muestras de tejido. Cinco a 20 µl de plasma y Ai *?. &-*> muestras de orina se mezclaron directamente con 3 ml del fluido Ready Safe (Beckman) antes de la cuantificación. Los resultados que suministran la distribución y la base del cálculo de la captación máxima se muestran en las Tablas 10 y 11. Los valores se expresaron en nCi . TABLA 11 1 2 3 4 5 avg Número de animal* nCi/ml o g de tejido Cerebro 48 34 31 30. 33 35 Ríñones 450 491 467 446 477 466 10 Hígado 599 413 454 507 503 495 Bazo 383 428 414 195 413 366 Timo 366 288 290 338 372 331 Células desangre 90 81 99 95 101 93 Plasma 140 126 121 142 124 130 Orina 5,846 5,068 6,841 4,557 5.986 5,660 Orina total 7.016 7,096 3,284 283 2,395 4,015 Los animales se sacrificaron después de 4 horas 15 TABLA 12 Número de animal* 10 av9 Cerebro 43 27 28 25 29 30 Ríñones 255 488 461 401 468 415 Hígado 537 419 478 458 578 494 Bazo 20 307 281 257 336 285 293 Timo 340 350 323 349 311 334 Células desangre 51 72 87 71 108 78 Plasma 138 123 135 129 148 135 Orina 2,992 5,04D 3,121 4,297 2,175 3,525 Orina total 6,463 6,653 11,173 10,227 7,613 8,426 Los animales se sacrificaron después de 8 horas ^^^¿j g¡j^ . i .** **& »í ¿ * M^i ^A^k**-.

El cálculo de la captación máxima se determinó como sigue. La alimentación total fue de 800 µCi/kg de peso corpóreo de la rata (160 µCi en total por animal) . En la suposición que el GPG-NH2 y sus metabolitos se distribuyen uniformemente en el cuerpo, el GPG-NH2 presente en los tejidos será la cuenta promedio / g de diferentes tejidos del número total de los animales estudiados, dividido por el número total de animales y multiplicado por el peso del cuerpo y el factor de 0.9. Este factor se deriva para omitir el volumen de sangre, puesto que una estimación del volumen de sangre es de aproximadamente el 10% del peso promedio del cuerpo. Por ejemplo (de los datos de los animales 1-5), si el peso total del cuerpo para cinco ratas es de 207 g y la radioactividad detectada de los varios tejidos fue de (35+466+495+356+331) o 1,693 nCi y la radioactividad detectada de la sangre fue de (93+130) o 223 nCi, y la radioactividad detectada en la orina fue de 4,015 nCi, la captación máxima del péptido pequeño se puede calcular como: tejido: (35+466+495+366+331)/5*207*0.9 = 63.240 nCi fluidos: sangre (93+130) *207*0.1=4.642 nCi orina: 4.015 nCi Suma: (63.24+4.642+4.015)/800*0.207= 0.4342 o 43% de la captación máxima. * * *t *? ?í Jajj-jJaj A . . ., * _ __ *,*-£. * l^** ^ t ^_ ..** , * at -* _&»* ***,»*** ** JL í.i? -***** La distribución relativa del GPG-NH2 retenido/ inmovilizado y sus metabolitos en los tejidos de muestra se observó ser muy alta en el hígado seguido por el riñon, seguido por el timo, seguido por el cerebro. La radioactividad en la orina se observó ser doble entre las 4 y 8 horas. Los datos espectrométricos de masa (espectrometría de masa de electro-rociado) de la zona radioactiva de la orina de la placa TLC mostró que solamente una pequeña porción de la radioactividad en la orina estaba intacta del GPG-NH2 (Figura 7) . Los resultados de estudios ín vivo anteriores probaron que una cantidad significante de péptidos pequeños son entregados efectivamente en la sangre, plasma y varios diferentes tejidos. Adicionalmente, como se muestra en las Figuras 9 y 10, una cantidad significante de los pequeños péptidos permanece en la fracción del plasma en un período prolongado de tiempo. En la Figura 9, la distribución de la radioactividad entre las células de la Sangre, proteína de plasma unida, al igual que proteína no unida (libre de radioactividad del plasma se muestran. La eliminación de la radioactividad de la facción del plasma se ilustra en la Figura 10. El tripéptido GPG-NH2 tiene una vida media de 86.5 minutos. La radioactividad unida a la proteína se ensayó después de la precipitación con dos partes de etanol al 99.5%. De los datos de la captura y distribución y los _. A.* *i. -** *-.l*--*---- .***'*. i 4 á ti, datos de la TLC anteriores, la captación mínima del GPG-NH2 intacto recuperado del plasma se calculó y, en una hora después de la alimentación de las ratas, al menos el 1% del GPG-NH2 de carga pudo recuperarse como el GPG-NH2 libre de proteínas en el plasma. Para la evaluación del GPG-NH2 activo biológicamente en el plasma de los animales alimentados con los péptidos pequeños, las muestras de plasma se prepararon de la sangre obtenida de las ratas del estudio de toxicología de cuatro semanas, un día después de la última alimentación. Las muestras de plasma se diluyeron 1/5 en el medio RPMI y se administraron al PBMC infectado con la cepa SF162 del HIV-1 como se describió antes. La infección viral luego se vigiló a los siete, once y catorce días después de la infección, detectando la cantidad de p24 en el sobrenadante con el uso del ensayo de detección disponible comercialmente. (Abbott). Como se muestra en la Tabla 12, los sueros obtenidos de las ratas tratadas con el péptido pequeño retuvo la habilidad de inhibir la infección viral .

En algunos casos, la administración de tan poco como 10 µM de GPG-NH2 suministró una concentración suficiente del péptido pequeño en el plasma para habilitar la inhibición de la réplica del HIV-1. El porcentaje de reducción se calculó como en la Tabla 6. Los resultados de estos experimentos establecieron que los péptidos pequeños, aquí descritos, pueden ser mantenidos a concentraciones en el cuerpo de un animal, que son efectivos en inhibir la réplica del HIV. TABLA 13 Animal #. Alimentación de GPG (mg/ml) p24 (pg/ml) % de reducción Exp 1 dia 7 14 0 543.0 0 34 10 93.3 82.8 53 30 24.0 95.6 73 100 174.7 67.8 dia 14 14 0 22678 0 34 10 1636 92.8 53 30 938 95.9 73 100 9211 59.4 Exp 2 dia 7 10 16 0 321.8 0 36 10 219.2 31.9 56 30 194.3 39.6 76 100 173.5 46.1 día 14 16 0 4075.4 0 36 10 4760.8 0 56 30 3574.4 12.3 76 100 2203.7 45.9 Exp 3 día 15 18 0 183.9 0 38 10 255.6 0 58 30 107.3 41.7 78 100 96.9 47.3 dia 14 18 0 7578.4 0 38 10 6700.6 11.6 58 30 6893.0 9.1 78 100 7578.4 0 ?XD 4 día 11 20 13 0 242 0 33 10 170 29.8 52 30 487.4 0 71 100 51.7 78.6 EXD 5 día 7 15 0 304.8 0 35 10 79.6 73.9 55 30 439.3 0 75 mn Rfl R? "i nBMH¡fcd*MiafcA«¿ j taJa É Las proteínas del plasma total también se analizaron por la cromatografía en columna y se fraccionaron y las proteínas crudas se separaron por la electroforesis de gel de pliacrilamida de sulfito de dodecilo de sodio (SDS/PAGE) . Las muestras del plasma de la rata se purificaron parcialmente con cromatografía de exclusión de tamaño (Sepharse G-50, Pharmacia) (0.4 x 5 cm) , en un regulador de 10 mM de Tris-HCl, pH de 8.3 y 50 mM de KCl. El eluato luego se separó por la cromatografía de intercambio aniónica usando un gradiente que aumenta en etapas de NaCl en un regulador de 10 mM de Tris-He, pH de 8.3 (Sepharose CL-6B DAE, 0.4 x 6 cm) El eluato se vigiló y se agrupó de acuerdo con la radioactividad (Ready Safe, Beckman: LKB1218, Suecia) , Las fracciones de proteína con señal fuerte se separaron en un 10% de SDS-PAGE y se mancharon subsiguientemente en una membrana de PVDF (difluoruro de polivinilideno, BioRad) , antes de ser sometida a la secuencia de aminoácidos de la terminal N, de Edman (Applied Biosystems Procoise Sequencer, USA) . Como se muestra en la Figura 11, la poca radioactividad se observó estaba asociada covalentemente con las proteínas 60 minutos después de alimentar el animal. Las proteínas marcadas con B1-B4 formaron secuencias y se determinaron eran antitripsina alfa-1 (Bl) , pentaxina (B-2) , proteína C-reactiva (B-3) y B-4, no pudieron ser identificadas. Estas proteínas son todas sintetizadas en el hígado. Una interpretación en ese GPG-NH2 hidrolizado se reutilizó en la síntesis de la proteína del hígado. Estos experimentos establecieron que los péptidos pequeños se metabolizaron en el cuerpo y, puesto que la proteínas asociadas identificadas (B-l, B-2 y B-3) son todas sintetizadas en el hígado, la hidrólisis y reutilización de los pequeños péptidos ocurrieron en el hígado. Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertas modalidades y ejemplos, se debe entender que se pueden realizar varias modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Por consiguiente, la invención se limita únicamente por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición para inhibir la réplica viral en las células huésped infectadas con un virus, esta composición comprende una cantidad efectiva de un péptido, en forma de amida, que tiene la fórmula XXX2X3NH2, donde Xi, X2 y X3 son cualquier aminoácido, y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2, y donde dicha composición inhibe la réplica viral interrumpiendo el ensamblado de la cápsida viral .
2. La composición de la reivindicación 1, en que el péptido se selecciona del grupo que consta de los péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2;, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, , Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu-Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr-NH2.
3. La composición de la reivindicación 1, en que X2 es la glicina.
4. La composición de la reivindicación 1, en que el péptido, en la forma de amida, tiene la fórmula: XX5X?XX3-NH2, donde X y X5 son cualquier aminoácido, y en q e cualquiera de uno o dos aminoácidos está ausente.
5. La composición de la reivindicación 1, en que el tripéptido X?X2X3 se encuentra en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida del virus.
6. La composición de la reivindicación 1, en que el péptido se une a un soporte.
7. La composición de la reivindicación 1, en que el péptido se incorpora en un compuesto farmacéutico, que 5 comprende un portador aceptable farmacéuticamente.
8. Un péptido, en la forma de amida, que tiene la fórmula Gly-Lys-Gly-NH2.
9. El péptido de la reivindicación 8, unido a un 10 soporte.
10. Un péptido, en la forma de amida, que tiene la fórmula Arg-Gln-Gly-NH2.
11. El péptido de la reivindicación 10, unido a un soporte . 15
12. Un péptido, en la forma de amida, que tiene la fórmula Cys-Gln-Gly-NH2.
13. El péptido de la reivindicación 12, unido a un soporte . 20
14. Un péptido, en la forma de amida, que tiene la fórmula Lys-Gln-Gly-NH2.
15. El péptido de la reivindicación 14, unido a un soporte . aMÍMa i.»^ ajfa , , ¿,,¿¿1,^.^ ^J,^, ** ^ *.** ., .a, ,„_., * . **. ,*« ** *._, * , ,J» ***.*. **. *i * A* ,j*?* i
16. Un péptido, en la forma de amida, que tiene la fórmula Ala-Leu-Gly-NH2
17. El péptido de la reivindicación 16, unido a un soporte .
18. Un péptido, en la forma de amida, que tiene la fórmula Ser-Leu-Gly-NH2.
19. El péptido de la reivindicación 18, unido a un soporte . 10
20. Un método para inhibir la réplica del HIV en una célula huésped, este método comprende: administrar a dicha célula una cantidad efectiva de un péptido, en forma de amida, que tiene la fórmula X!X2X3 H2, donde Xi7 X2 y X3 son cualquier aminoácido, y dicho 15 péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2.
21. El método de la reivindicación 20, en que el péptido se selecciona del grupo que consta de los péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, , Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val- 20 Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, , Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu-Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr-NH2.
22. El método de la reivindicación 20, que además comprende la etapa de administrar un tratamiento antiviral, seleccionado del grupo que consta de los inhibidores de la ¿**ik**É***** -i - & i I . transcriptasa inversa, análogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa, análogos de nucleótidos, inhibidores de la transcriptasa inversa, no de nucleósidos, e inhibidores de la proteasa.
23. El método de la reivindicación 20, en que el péptido se une a un soporte.
24. El método de la reivindicación 20, en que el péptido se administra en una composición farmacéutica que comprende un portador aceptable farmacéuticamente.
25. Una composición para inhibir la réplica del HIV en células huésped, que comprende una cantidad efectiva de un péptido, en forma de amida, que tiene la fórmula X?X2X3NH2, donde Xi, X2 y X3 son cualquier aminoácido, y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2 y donde dicha composición inhibe la réplica del HIV por interrumpir el ensamblado de la cápsida.
26. La composición de la reivindicación 25, en que el péptido se selecciona del grupo de péptidos que tienen la fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, , Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly- Gly-NH2,, Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu-Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr- NH2. * *. ! *. * A ¿ * .
27. La composición de la reivindicación 25, en que X3 es glicina.
28. La composición de la reivindicación 25, en que dicho péptido, en forma de amida, tiene la fórmula X4X5X?X2X3-NH2, donde X4 y X5 son aminoácidos y donde cualquiera de uno o dos aminoácidos están ausentes.
29. La composición de la reivindicación 25, en que el tripéptido X?X2X3 se encuentra< en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida del HIV.
30. La composición de la reivindicación 25, en que el péptido se une a un soporte.
31. La composición de la reivindicación 25, en que el péptido se incorpora en un compuesto farmacéutico que comprende un portador aceptable farmacéuticamente.
32. Un método para inhibir la réplica viral en las células huésped, este método comprende administrar a dichas células una cantidad efectiva de un péptido, en forma de amida, de la fórmula X?X2X3NH2, donde Xl t X2 y X3 son cualquier aminoácido, y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2.
33. El método de la reivindicación 32, en que el péptido se selecciona del grupo de péptidos que tienen la fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, , Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly- Gly-NH2/, Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu-Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr- NH2.
34. El método de la reivindicación 32, que además comprende la etapa de administrar un tratamiento antiviral, seleccionado del grupo que consta de los inhibidores de la transcriptasa inversa de análogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa de análogos de nucleótidos, inhibidores de la transcriptasa inversa no de nucleósidos e inhibidores de la proteasa.
35. El método de la reivindicación 32, en que el péptido se une a un soporte.
36. El método de la reivindicación 32, en que el péptido se administra en una composición farmacéutica, que comprende un portador aceptable farmacéuticamente.
37. Un método para interrumpir el ensamblado de la cápsida viral, este método comprende: poner en contacto una célula con una cantidad efectiva de un péptido, en forma de amida, que tiene de la fórmula X!X2X3NH2, donde Xi, X2 y X3 son cualquier aminoácido, y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2.
38. El método de la reivindicación 37, en que el péptido se selecciona del grupo de péptidos que tienen la * * * * *??*Á-.1lt ffA *- - "aia. _ .,*_* *_____**. *, ** * *** ** *** ******** ******* i i i i fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, , Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2/, Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu-Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr-NH2.
39. El método de la reivindicación 37, en que X3 es la glicina.
40. El método de la reivindicación 37, en que dicho péptido, en forma de amida, tiene la fórmula: X4X5X?X2X3-NH2, en que X4 y X5 son aminoácidos, y donde cualquiera de uno o dos aminoácidos está ausente.
41. El método de la reivindicación 37, en que el tripéptido X]X2X3 se encuentra en la secuencia de aminoácidos de una proteína del virus.
42. El método de la reivindicación 37, en que el péptido se une a un soporte.
43. Un método para identificar un agente de péptido para la incorporación en una composición anti-viral, este método comprende : poner en contacto una pluralidad de células infectadas con un virus, con una cantidad efectiva de un agente de péptido, donde dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2; r*, *J&áí analizar el virus en la formación de la cápsida incompleta; y seleccionar el agente del péptido, que induce la formación de la cápsida incompleta.
44. El método de la reivindicación 43, en que el análisis de la formación de la cápsida emplea la microscopía.
45. El método de la reivindicación 43, en que el virus se selecciona del grupo que consta del HIV-1, HIV-2 y 10 SIV.
46. El método de la reivindicación 43, en que el agente del péptido se selecciona del grupo que consta de un tripéptido, un oligopéptido y un péptido mimético.
47. El método de la reivindicación 43, en que el 15 agente de péptido se selecciona del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln- Gly-NH2/, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, , Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu- Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr-NH2. 20
48. El método de la reivindicación 43, en que el agente del péptido comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos de p24. l
49. Un método para identificar un agente de péptido, que se une a una proteína viral, este método comprende : suministrar una proteína viral; poner en contacto la proteína viral con una cantidad efectiva de un agente de péptido, en que ducho agente de péptido no es el Gly-Pro-Gly; y detectar la formación de un complejo, que comprende la proteína viral, y el agente de péptido.
50. El método de la reivindicación 49, en que la proteína viral es de un virus seleccionado del grupo que consta del HIV-1, HIV-2 y SIV.
51. El método de la reivindicación 50, en que el agente del péptido se selecciona del grupo que consta de un tripéptido, un oligopéptido y un péptido mimético. 52. El método de la reivindicación 50, en que el agente de péptido se selecciona del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2/, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, , Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu-Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr-NH2. 53. Un método para obtener una composición farmacéutica, que comprende incorporar el agente de péptido identificado en la reivindicación 59 en dicha composición farmacéutica . 54. Un método para obtener una composición farmacéutica, este método comprende: administrar" a una célula una cantidad efectiva de un péptido, en forma de amida, que tiene la fórmula X1X2X3-NH2, donde XI, X2 y X3 son cualquier aminoácido, y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2; detectar una inhibición de la réplica viral en la célula; e incorporar el péptido que causa la inhibición de la réplica viral en dicha composición farmacéutica. 55. El método de la reivindicación 54, en que el agente de péptido se selecciona del grupo que consta de péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2,, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, , Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu-Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr-NH2. 56. El método de la reivindicación 54, que además comprende la etapa de incorporar un compuesto antiviral, seleccionado del grupo que consta de inhibidores de la transcriptasa inversa de análogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa de análogos de nucleótidos, inhibidores de la transcriptasa inversa no de nucleósidos, e inhibidores de la proteasa, en dicha composición farmacéutica. 57. El método de la reivindicación 54, que además comprende la etapa de incorporar un portador en la composición farmacéutica. 58. Una composición para inhibir la réplica viral en células huésped infectadas con un virus, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula X?X2X3-R, donde Xx, X2 y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es el Gly-Pro-Gly-NH2, en que R es un grupo de modulación unido a la terminal carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amino u otra parte que tenga una carga similar y volumen esférico, y donde dicha composición inhibe la réplica viral interrumpiendo el ensamblado de la cápsida. 59. La composición de la reivindicación 58, en que el péptido se selecciona del grupo que consta de los péptidos que tienen las fórmulas: Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln- Gly-NH2,, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, , Ala-Ser-Gly-NH2, , Ser-Leu- Gly-NH2, y Ser-Pro-Thr-NH2. 60. La composición de la reivindicación 58, en que X3 es la glicina. ¡É¡É i í ** .* ?* , ***** **** 1*** **** *** ****** * \*á 61. La composición de la reivindicación 58, en que el péptido tiene la fórmula X4X5X6X7X8X9X?oX?X2X3-R, donde X4, X5, X6, X7, X8, Xs y Xio son cualquier aminoácido y donde cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoácidos está ausente, donde R es un grupo de modulación unido a la terminal de carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo de amida u otra parte que tenga carga y volumen esférico similares.
52. La composición de la reivindicación 58, en que el péptido X;?X2X3 se encuentra en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida del virus. i -.*-, . *- .*, *. Á~é á,i *<*&* lai * j