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MXPA02001205A - Composicion de vacuna. - Google Patents

Composicion de vacuna.

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MXPA02001205A
MXPA02001205A MXPA02001205A MXPA02001205A MXPA02001205A MX PA02001205 A MXPA02001205 A MX PA02001205A MX PA02001205 A MXPA02001205 A MX PA02001205A MX PA02001205 A MXPA02001205 A MX PA02001205A MX PA02001205 A MXPA02001205 A MX PA02001205A
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MX
Mexico
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gene
strain
further characterized
ampoules
sequence
Prior art date
Application number
MXPA02001205A
Other languages
English (en)
Inventor
Thiry Georges
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10858521&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MXPA02001205(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
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Abstract

La presente invencion se refiere a una vacuna gram negativa inmunoprotectora y no toxica adecuada para uso pediatrico. Los ejemplos de las sepras gram negativas de las cuales estan formadas las ampollas son N.meningitidis, M.catarrhalis y H.influezae. Las ampollas de la invencion son mejoradas mediante uno o mas cambios geneticos al cromosoma de la bacteria incluyendo la activacion de los antigenos protectores, la desactivacion de los antigenos no protectores inmunodominantes y la destoxificacion de una porcion del lipido A del LPS.

Description

COMPOSICIÓN DE VACUNA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de composiciones de vacuna de bacterias Gram negativas, su fabricación , y el uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere al campo de vacunas novedosas de vesículas (o ampollas) de membrana exterior, y métodos ventajosos para hacer que estas vacunas sean más efectivas y más seguras. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las bacterias Gram negativas están separadas del medio externo por dos capas sucesivas de estructuras de membrana . Estas estructuras, referidas como la membrana citoplásmica y la membrana exterior (OM) , difieren estructural y funcionalmente. La membrana exterior desempeña una función importante en la interacción de las bacterias patógenas con sus hospederos respectivos. En consecuencia, las moléculas bacterianas de superficie expuestas representan objetivos importantes para la respuesta inmune del hospedero, haciendo que los componentes de la membrana exterior sean candidatos atractivos para proveer reactivos de diagnóstico, terapéuticos y para vacunas. Las vacunas bacterianas de células enteras (destruidas o atenuadas), tienen la ventaja de suministrar antígenos múltiples en su microambiente natural. Los inconvenientes en torno a esta alternativa son los efectos secundarios inducidos por componentes bacterianos tales como endotoxinas y fragmentos de peptidoglucano. Por otra parte, las vacunas subun itarias acelulares que contienen componentes purificados de la membrana exterior pueden proveer sólo protección limitada, y pueden no presentar los antígenos adecuadamente al sistema inm une del hospedero. Proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos son los tres constituyentes principales presentes en la membrana exterior de todas las bacterias Gram negativas. Estas moléculas están distribuidas asimétricamente: fosfolípidos (principalmente en la membrana interior) , lipooligosacáridos (exclusivamente en la membrana exterior) y proteínas de membrana (lipoproteínas de membrana exterior e interior, proteínas de membrana integrales o politópicas) . Para muchas bacterias patógenas que tienen impacto sobre la salud humana, se ha mostrado que los lipopolisacáridos y las proteínas de membrana exterior son inmu nógenos y están sujetos a conferir protección contra la enfermedad correspondiente por medio de inmunización. La membrana exterior de las bacterias Gram negativas es dinámica y, dependiendo de las condiciones ambientales, pueden sufrir transformaciones morfológicas drásticas. Entre estas manifestaciones, la formación de vesículas de membrana exterior o "ampollas" se ha estudiado y documentado en muchas bacterias Gram negativas (Zhou, L et al. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228) . Entre estas, una lista no exhaustiva de bacterias patógenas que se ha reportado producen ampollas, incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica. Aunque no se ha entendido completamente el mecanismo bioquímico responsable de la producción de ampollas de membrana exterior, estas vesículas de membrana exterior han sido estudiadas exhaustivamente, puesto que representan una metodología poderosa para aislar preparaciones de proteína de membrana exterior en su conformación nativa. En ese contexto, el uso de preparaciones de membrana exterior es de particular interés para desarrollar vacunas contra Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa y Chlamydia. Además, las ampollas de membrana exterior combinan antígenos proteináceos y no proteináceos múltiples que probablemente confieren protección extendida contra variantes intraespecíficas. En comparación con los otros tipos de vacuna bacteriana más ampliamente usados (vacunas subunitarias purificadas y vacunas bacterianas de células enteras), los inventores mostrarán que las vacunas de ampolla de membrana exterior (si son modificadas en ciertas formas) pueden representar el compromiso ideal. El uso generalizado de vacunas subunitarias bacterianas se ha debido al estudio intensivo de proteínas de superficie bacteriana que se ha encontrado son útiles en aplicaciones en vacunas [por ejemplo, la pertactina de B. pertussis] . Estas proteínas están apenas asociadas con la membrana exterior bacteriana , y se pueden purificar a partir de sobrenadantes de cultivo o se pueden extraer fácilmente de las células bacterianas. Sin embargo, se ha mostrado también que las proteínas de membrana exterior integrales o estructurales son también antígenos protectores. Ejemplos son PorA para el serogrupo B de N. meningitidis; D15 para H. influenzae; OMP CD para M. catarrhalis; y OMP F para P. aeruginosa. Sin embargo, dichas proteínas tienen características estructurales más bien específicas, en particular láminas ß anfipáticas múltiples, lo cual complica su uso directo como vacunas subu nitarias pu rificadas (recombinantes) . Además, ha quedado claro que se requieren vacunas de componentes múltiples (en términos de proteínas de membrana integrales y proteínas de superficie bacterianas) para proveer un nivel razonable de protección. Por ejemplo, en el caso de vacunas subunitarias de B. pertussis, las vacunas de componentes múltiples son superiores a los productos monocomponentes o bicomponentes. Para incorporar proteínas integrales de membrana exterior en dicho producto subunitario, debe existir plegamiento conformacional nativo (o casi nativo) de las proteínas en el producto para que tenga un efecto inmunológico útil . El uso de vesículas o ampollas de membrana exterior excretadas puede ser i una solución elegante al problema de incluir proteínas de membrana integrales protectoras en una vacuna subunitaria, mientras se asegure que están plegadas adecuadamente. El serogrupo B de N. meningitidis (menB) excreta ampollas de membrana exterior en cantidades suficientes para permitir su fabricación a escala industrial. Se ha encontrado que dichas vacunas de proteína de membrana exterior de componentes múltiples de cepas de menB de ocurrencia natural, son eficaces para proteger a los adolescentes de la enfermedad por el menB, y se ha registrado en Latinoamérica. Un método alternativo para preparar vesículas de membrana exterior, es mediante el procedimiento de extracción de las células bacterianas mediante detergentes (véase el documento EP 1 1243). Ejemplos de especies bacterianas de las cuales se pueden obtener vacunas de ampolla, son los siguientes: Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram negativa asilada con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. Causa ocasionalmente enfermedades bacterianas invasivas tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocóccica muestra diferencias geográficas estacionales y anuales (Schwartz, B. , Moore, P. S. , Broome, C. V. ; Clin. Microbiol. Rev. 2 (suplemento), S18-S24, 1989). La mayor parte de la enfermedad en países templados se debe a cepas del serogrupo B, y varía en incidencia de 1 -10/100, 000/año de la población total, alcanzando a veces valores mayores (Kaczmarski, E. B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. et al. Clin. Infecí. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C, Pavez, G., Aguilar, E., et al. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990). Las incidencias específicas de la edad en los dos grupos de alto riesgo, infantes y adolescentes, alcanzan niveles mayores. Las epidemias dominadas por los meningococos del serogrupo A ocurren principalmente en África central, alcanzando a veces niveles de hasta 1000/100, 000/año (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (suplemento), S18-S24, 1989). Casi todos los casos de enfermedad meningocóccica como un todo son causados por meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y. Está disponible una vacuna de polisacáridos capsulares polivalentes A, C, W-135, Y (Armand, J., Xrminjon, F., Mynard, M. C, Lafaix, C, J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982). Las vacunas de polisacáridos están siendo mejoradas actualmente conjugándolas químicamente con proteínas interiores (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K., et al. JAMA 275: 1499- 1509, 1996). No está disponible una vacuna del serogrupo B, puesto que el polisacárido capsular B no es inmunógeno, más probablemente debido a que comparte similitud estructural con los componentes del hospedero (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L. , et al. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M. , Leinonen, M. , Mákelá, P. M. Lancet ii.: 355-357, 1983). Por muchos años, los esfuerzos se han enfocado en desarrollar vacunas basadas en membrana exterior meningocóccica (de Moraes, J . C, Perkins, B., Camargo, M. C , et al. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G. , Hoiby, E. A. , Gronnesby, J . K. , et al. 338: 1093-1096, 1991 ). Dichas vacunas han demostrado eficacias de 57%-85% en niños de más de 4 años de edad y adolescentes. La mayoría de estas pruebas de eficacia se llevaron a cabo con vacunas de OMV (vesículas de membrana exterior, derivadas mediante depleción de LPS de ampollas), derivadas de cepas de N. meningitidis de tipo silvestre. Muchos componentes de la membrana exterior bacteriana están presentes en estas vacunas, tales como PorA, Rmp, Opc, Opa, FrpB, y la contribución de estos componentes a la detección observada necesita aún más definición. Se ha definido que otros componentes de la membrana exterior bacteriana (usando anticuerpos humanos o de animales) son potencialmente importantes para la inducción de inmunidad protectora, tales como TbpB, NpsA, Martin, dieux, N., Hamel, J. , Brodeux, B. R. , J. Exp. Med . 185: 1 173-1 180, 1997; Lis, Maitre-Wilmotte, C , Dumas, p. et al. , Inf. Immun. 63: 884-890, 1995). El mecanismo de inmunidad protectora incluirá opsonofagocitosis y actividad bactericida mediada por anticuerpos. ÍJJ. ^-.. >tJrf , . A Ajfa l^^i^ljj^ La frecuencia de infecciones por Neisseria meningitidis ha aumentado dramáticamente en las pasadas décadas. Esto se ha atribuido al surgimiento de cepas m últiples resistentes a antibióticos, y exposición incrementada debida a un incremento en las actividades sociales (por ejemplo, piscinas o cines). Ha dejado de ser raro aislar cepas de Neisseria meningitidis que sean resistentes a todos los antibióticos estándar, o algunos de ellos. Este fenómeno ha creado una necesidad médica y demanda particular por nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, métodos de selección de fármaco y pruebas de diagnóstico para este organismo .
Moraxella catarrhalis Moraxella catarrhalis (denominada también Branhamella catarrhalis) , es una bacteria Gram negativa aislada con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo una de las principales otitis media en infantes y niños, y neumonía en personas de edad avanzada. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y, con menos frecuencia , enfermedades invasivas. Se han identificado anticuerpos bactericidas en la mayoría de los adultos puestos a prueba (Chapman , AJ et al. (1 985) J . I nfections. 1 51 :878) . Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir a la actividad bactericida del suero: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que aquellos q ue son simplemente colonizados (Hol, C et al. ( 1 993) Lancet 341 : 1 281 , Jordán K. L. et al. (1 990) Am. J . Med . 88 (supl. 5A): 28S). La resistencia al suero se podría considerar por lo tanto como un factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad opsonizante en los sueros de niños que se recuperan de otitis media. No se han identificado los antígenos dirigidos por estas respuestas inmunes diferentes en humanos, con excepción de OMP B1 , una proteína de 84 kDa, cuya expresión es regulada por hierro, y es reconocida por los sueros de pacientes con neumonía (Sethi, S, et al. (1 995) I nfect. Immun . 63: 1 51 6) , y de UspA1 y UspA2 (Chen D. et al. (1 999) , I nfect. Immun . 67: 131 0). Se han caracterizado algunas otras proteínas de membrana presentes sobre la superficie de M. catarrhalis, usando métodos bioqu ímicos para determinar su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para una revisión , véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía en ratones, la presencia de anticuerpos surgidos ante algunas de ellas (UspA, CopB), favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está altamente conservado entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porína de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado es eficaz contra esta bacteria en modelos en animales. M. catarrhalis produce vesículas de membrana exterior (ampollas) . Estas ampollas han sido aisladas o extraídas usando M iiW* diferentes métodos (Murphy T. F., Loeb M. R. 1989. Microb. Pathog. 6: 159-174; Unhanand M., Maciver, I., Ramillo O., Arencibia-Mireles O., Argyle. J. C, McCracken G. H. Jr., Hansen, E. J. 1992. J. Infect. Dis. 165:644-650). La capacidad protectora de dichas preparaciones de ampolla se ha puesto a prueba en un modelo en murinos para eliminación pulmonar de M. catarrhalis. Se ha mostrado que la inmunización activa con vacunas de ampollas o transferencia pasiva de anticuerpos anti-ampollas, induce protección significativa en este modelo (Maciver I., Unhanand M., McCracken G. H. Jr., Hansen, E. J. 1993, J. Infect. Dis. 168: 469- 472). Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae es una bacteria Gram negativa no móvil. El hombre es su único hospedero natural. Los aislados de H. influenzae se clasifican usualmente de acuerdo a su cápsula de polisacáridos. Se han identificado seis tipos capsulares diferentes designados como 'a' a 'f. Los aislados que no aglutinan con antisueros surgidos contra uno de estos seis serotipos, se clasifican como no tipificables, y no expresan una cápsula. El tipo B de H. influenzae (Hib) es claramente diferente de los otros tipos porque es una causa importante de meningitis bacteriana y enfermedades sistémicas. Cepas no tipificables de H. influenzae (NTHi) se aislan sólo ocasionalmente de la sangre de pacientes con enfermedad sistémica. NTHi es una causa común de neumonía, exacerbación de bronquitis crónica, sinusitis y otitis í ?i li ?t??-? t íínéßUaái?i iíÉm? media. Las cepas de NTHi demuestran una gran variabilidad, según se identifica mediante análisis clonal, mientras que las cepas de Hib como un todo, son más homogéneas. Se ha mostrado que varias proteínas de H. influenzae intervienen en la patogénesis, o se ha mostrado que confieren protección después de la vacunación en modelos en animales. Se ha reportado adherencia de NTHi a células epiteliales nasofaríngeas humanas (Read RC. et al. 1991. J. Infect. Dis. 163: 549). Aparte de fimbrias y pili (Brinton CC. et al. 1989. Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S54; Kar S. et al. 1990 Infecí. Immun. 58:903; Gildorf JR. et al. 1992. Infecí. Immun. 60:374; Sí. Geme JW eí al. 1991. Infecí. Immun. 59:3366; Sí. Geme JW et al. 1993. Infecí. Immun. 61: 2233), se han ideníificado muchas adhesinas en NTHi. Eníre ellas, se ha mostrado que dos proteínas de alio peso molecular expuesías de superficie designadas como HMW1 y HMW2, median la adhesión de NTHi a células epileliales (Sl. Geme JW. et al. 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2875). Se ha identificado otra familia de proteínas de alto peso molecular en cepas de NTHí que carecen de proleínas que perlenecen a la familia de HMW1/HMW2. La proíeína Hia NTHi de 115 kDa (Barenkamp SJ., St Geme S. W. 1996. Mol. Microbiol, en prensa), es altamenfe similar a la adhesina Hsf expresada por las cepas de íipo B de H. influenzae (Sl. Geme JW el al. 1996. J. Bact. 178:6281). Otra proteína, la proteína Hap, muestra similitud con serina proleasas lgA1, y se ha moslrado que interviene en adhesión y enírada de células (Sl. Geme JW. el al. 1994. Mol. Microbiol. 14:217). Cinco proteínas de membrana exterior (OMP) importantes han sido identificadas, y se les ha dado un número. Estudios origínales usando cepas de tipo B de H. influenzae mostraron que anticuerpos específicos para OMPs P1 y P2 prolegieron a ralas jóvenes de desafío subsecuenle (Loeb MR. et al. 1987. Infect. Immun. 52:2612; Musson RS. Jr. et al., 1983. J. Clin. Invest. 72:677). Se enconíró que P2 es capaz de inducir aníicuerpos bacíericidas y opsónicos, los cuales son dirigidos conlra las regiones variables présenles denlro de las estructuras de bucle expuestas de superficie de esta OMP iníegral (Haase EM. et al. 1994 Infect. Immun. 62:3712; Troelstra A. ef al. 1994 Infect. Immun. 62:779). La lipoproteína P4 puede inducir también anticuerpos bactericidas (Green BA. el al. 1991. Infecí. Immun. 59:3191). OMP P6 es una lipoproteína conservada asociada a peptidoglucanos que constituye 1-5% de la membrana exterior (Nelson MB. et al. 1991. Infecí. Immun. 59:2658). Después, se reconoció una lipoproleína de casi el mismo peso molecular denominada PCP (proíeína de reacción cruzada P6) (Deich RM. el al. 1990. Infecí. Immun. 58:3388). Una mezcla de las lipoproleínas conservadas P4, P6 y PCP no reveló protección, medida en un modelo de otitis media en chinchillas (Green BA. et al. 1993. Infect.
Immun. 61 : 1950). P6 sola parece inducir prolección en el modelo en chinchillas (Demaria TF. el al. 1996. Infect. Immun. 64:5187). Se ha descrito también una proteína fimbrina (Miyamoto N. , Bakaletz, LO. 1996. Microb. Paihog. 21 :343) con homología con OMP P5, la cual íiene homología de secuencias con la OmpA inlegral de Escherichia coli (Miyamoío N. , Bakalelz, LO. 1996. Microb. Palhog . 21 :343, Munson RS. Jr. eí al. 1993. Infecí. Immun. 61 : 1017). NHTi parece adherirse al moco medianle fimbrias. A la par con las observaciones hechas con gonococos y meningococos, NTHi expresa un recepíor de íransferrina humana doble formado de TbpA y TbpB cuando se desarrolla bajo limiíación por hierro. El aníicuerpo Anli-TbpB prolegió a ratas jóvenes (Loosmore SM. et al. 1996. Mol. Microbiol. 19:575). Se ha descrito íambién un recepíor de hemoglobina/hapíoglobina para NTHi (Maciver I. el al. 1996. Infecí. Immun. 64:3703). Se ha identificado también un receptor para Haem :Hemopexin (Cope LD. et al. 1994. Mol. Microbiol. 13:868). Un receptor de lactoferrina está lambién preseníe enire NTHi, pero aún no se ha caraclerizado (Schryvers AB. et al. 1989. J. Med. Microbiol. 29: 121 ). No se ha descrito una proleína similar a la profeína FrpB de Neisseria enire NTHi. Una OMP de 80 kDa, el anlígeno de superficie D15, brinda protección contra NTHi en un modelo de desafío en ratones (Flack FS. et al. 1995. Gene 156:97). Una lipoproleína de membrana exlerior de 42 kDa, LPD, esíá conservada enire Haemophilus influenzae, e induce anticuerpos bactericidas ié ?líl?,t,ém** * m mm^H (Akkoyunlu M. et al. 1996. Infect. Immun. 64:4586). Se encontró que una OMP menor de 98 kDa (Kimura A. et al. 1985. Infecí. Immun. 47:253) es un anlígeno protector, y esta OMP bien puede ser una de las OMPs inducibles por limitación de Fe o adhesinas de alto peso melcular que han sido caracferizadas después. H. influenzae produce aclividad de lgA1-proteasa (Mulks MH., Shoberg RJ. 1994. Melh. Enzymol. 235:543). Las lgA1-proíeasas de NTHi lienen un alio grado de variabilidad anligénica (Lomholt H., van Alphen L., Kilian, M. 1993. Infecí. Immun.61:4575). Se ha moslrado que oíra OMP de NTHi, OMP26, una proíeína de 26 kDa, iníensifica la eliminación pulmonar en un modelo en ralas (Kyd, J. M., Cripps, A. W. 1998. Infecí. Immun. 66:2272). Se ha mostrado también que la proíeína NTHi HírA es un anlígeno profecíor. Por supuesío, esla proíeína prolegió a las chinchillas coníra oíilis media y prolegió a ralas jóvenes contra la bacteremia de tipo b de H. influenzae (Loosmore S. M. et al. 1998. Infect. Immun.66:899). Se han aislado vesículas (o ampollas) de membrana exterior de H. influenzae (Loeb M. R., Zachary A. L., Smith D. H. 1981. J. Bacteriol. 145:569-604; Stull T. L., Mack K., Haas J. E., Smit J., Smith A. L. 1985. Anal. Biochem. 150: 471-480). Se ha asociado a las vesículas con la inducción de permeabilidad de la barrera hemoencefálica (Wiwpelwey B., Hansen E. J., Scheld W. M. 1989. Infecí. Immun. 57:2559-2560), la inducción de inflamación meníngea (Musíafa M. M., Ramilo O., Syrogiannopoulos G. A., -A .i É i „ i i .i l??^^ambí^iim^^^^^^^^^^^^at^ ^?tim Olsen K. D. , McCraken G H . Jr. , Hansen , E. J . 1989. J . Infecí. Dis. 1 59:91 7-922) y la caplación de ADN (Concino M . F . , Goodgal S. H . 1982 J . Bacleriol. 1 52:441 -450). Eslas vesículas son capaces de unirse a, y ser absorbidas por, el epiíelio de la mucosa nasal (Harada T. , Shimuzu T. , Nishimolo K. , Sakakura Y. 1989. Acia Oíorhinolaryngol. 246: 218-221 ), mostrando que adhesinas y/o factores de colonización podrían esíar présenles en ampollas. Se ha observado respuesla inmune a proteínas presentes en las vesículas de membrana exterior en pacientes con varias enfermedades por H. influenzae (Sakakura Y. , Harada T. , Hamaguchi Y. , J in C . S 1 998. Acta Oíorhinolaryngol. Supl. (Síockh.) 454: 222-226; Harada T. , Sakakura Y. , Miyoshi Y. 1986. Rhinology 24:61 -66). Pseudomonas aeruginosa El género Pseudomonas consisle de bacilos Gram negaíivos, polarmeníe flagelados, rectos y ligeramente cu rvos que crecen aeróbicamente y no forman esporas. Debido a sus requisitos metabólicos limitados, Pseudomonas spp. es ubicuo y esíá ampliameníe disíribuido en el suelo, el aire, aguas cloacales y en plañías. Se ha moslrado lambién que numerosas especies de Pseudomonas tales como P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei, P. maltophilia y P. cepacia, son patógenas de humanos. Entre esta lista, P. aeruginosa es considerada como un patógeno humano imporlanle, pueslo que eslá asociada con infección oporlunisía de hospederos inmunocomprometidos, y es responsable de una alta morbilidad en pacienles hospilalizados. La infección nosocomial por P. aeruginosa aféela principalmenle a pacientes sometidos a íraíamiento prolongado y que reciben agentes inmunosupresores, corticosteroides, antibiólicos antimeíaboliíos o radiación. El género Pseudomonas , y en particular P. aeruginosa, produce varias toxinas (tales como hemolisinas, fibrinolisinas, esterasas, coagulasas, fosfolipasas, endoíoxinas y exoíoxinas) que coníribuyen a la paíogenicidad de esías bacíerias. Además, esíos organismos muesíran alia resislencia intrínseca a antibióticos debido a la presencia de bombas de flujo de fármaco múltiples. Esta última caracteríslica complica con frecuencia el resullado de la enfermedad. Debido al uso sin conírol de ageníes quimioterapéuíicos aníibacíerianos, la frecuencia de infección nocosomial causada por P. aeruginosa ha aumenfado considerablemeníe duranle los últimos 30 años. En los Eslados Unidos, por ejemplo, se esíima que la carga económica de infección nosocomial por P. aeruginosa es de 4.5 mil millones de dólares anualmeníe. Por lo lanío, se requiere acíivamente el desarrollo de una vacuna para inmunización activa o pasiva contra P. aeruginosa (para una revisión, véase Stanislavsky et al. 1997. FEMS Microbiol. Letl. 21 :243-277). Varios antígenos de P. aeruginosa secreíados y asociados con células han sido el íema de desarrollo de vacunas. Enire los anlígenos de Pseudomonas, se encontró que la sustancia mucoide, la cual es un mucílago extracelular que consiste » .« .1 ... predominaníemenle de alginalo, es helerogénea en lérminos de íamaño e inmunogenicidad. Los componeníes de alginalo de alio peso molecular (30-300 kDa) parecen contener epítopes conservados, mientras que los componentes de alginalo de masa molecular menor (10-30 kDa), poseen epítopes conservados además de epítopes únicos. Eníre las proleínas asociadas con la superficie, se ha mostrado también que PcrV, la cual forma parte del aparato de translocacíón - secreción de tipo ll l, es un objeíivo iníeresaníe para vacunación (Sawa eí al. 1999. Naíure Medicine 5:392-398) . Se han usado aníígenos expueslos de superficie que incluyen antígenos O (polisacárido específico O de LPS) o anlígenos H (aníígenos flagelares) para serolipificación , debido a su naturaleza altamente inmunógena. Se han elucidado las esírucíuras químicas de unidades repeíiíivas de polisacáridos específicos O, y esíos daíos permiiieron la ideníificación de 31 quimiolipos de P. aeruginosa. Epílopes conservados eníre lodos los serotipos de P. aeruginosa, se localizan en el oligosacárido central y la región del lípido A de LPS, y los inmunógenos que contienen estos epítopes inducen inmunidad protecíora cruzada en raíones anle difereníes inmunoíipos de P. aeruginosa. Se delerminó que el núcleo exlerior de LPS es un ligando para la unión de P. aeruginosa a células epiteliales oculares y de vías respiratorias de animales. Sin embargo, existe heíerogeneidad en esía región de núcleo exlerior eníre difereníes serotipos. Los epílopes del núcleo interior son altamenle conservados, y se ha demostrado que son accesibles a nivel de superficie y no son enmascarados por el polisacárido específico O. Para examinar las propiedades protectoras de proteínas de OM, se ha usado una vacuna que conliene proleínas de OM de P. aeruginosa de masas moleculares que varían de 20 a 1 00 kDa en pruebas preclínicas y clínicas. Esla vacu na fue eficaz en modelos en animales conlra desafío por P. aeruginosa, e indujo allos niveles de anficuerpos específicos en volunlarios humanos. El plasma de voluníarios humanos que coníiene anlicuerpos aníí-P. aeruginosa, brindó proíección pasiva y ayudó a la recuperación de 87% de los pacienles con formas severas de infección por P. aeruginosa. Más recieníemenle, se mosíró que una proteína h íbrida que coníiene parles de las proleínas de membrana exterior OprF (aminoácidos 1 90-342) y Oprl (aminoácidos 21 -83) de Pseudomonas aeruginosa fusionadas a la glutatión-S-transferasa , protege a ratones anle una dosis letal 975 veces a 50% de P. aeruginosa (Knapp et al. 1999.
Vaccine. 1 7: 1 663-1 669) . Los presentes inveníores han destacado varios inconvenientes asociados con las vacunas de ampolla de tipo silvestre aníeriores (ya sea de ocurrencia naíural u obíenidas químicameníe): Ejemplos de dichos problemas son los sig uieníes: - la presencia de proleínas inmunodominanles pero variables en la ampolla (PorA, TbpB, Opa [N. meningitidis B]; P2, i , t j >?¡ É?iWá tááßi^Éi^áÉ P5 [H. influenzae no íipificable]) - dichas ampollas siendo efecíivas sólo aníe una selección restringida de especies bacíerianas. El íipo y el carácíer específico de la respuesfa de aníicuerpos bacíericidas, pueden excluir el uso de dichas vacunas en la infancia. - la presencia de anlígenos no protecíores (no relevanles) (Rmp, H8, ...) sobre la ampolla -aníígenos que son señuelos para el sislema inmune. - la ausencia de moléculas importantes que son producidas condicionalmente (por ejemplo, proleínas de membrana exlerior reguladas por hierro, IROMP's, mecanismos de expresión regulados in vivo) - dichas condiciones son difíciles de controlar en la producción de ampollas para optimizar ia cantidad de antígeno sobre la superficie. - el bajo nivel de expresión de aníígenos proíeclores (parlicularmenle conservados) (NspA, P6). - la íoxicidad del LPS que permanece sobre la superficie de la ampolla. - la inducción poíencial de una respuesla auloinmune debido a estructuras idénticas en el hospedero (por ejemplo, el polisacárido capsular en el serogrupo B de Neisseria meningitidis, la lacto-N-neoleíraosa en LPS de Neisseria, eslructuras de sacárido dentro de LPS ntHi, esírucíuras de sacárido deníro de Pili). Dichos problemas pueden eviíar el uso de vacunas de ampollas como reacíivos de vacunas humanas. Eslo es parlicularmenle de esta manera para uso pediátrico (de menos de cualro años), en donde la reaclogenicidad anfe vacunas de ampollas es paríicularmeníe imporíaníe, y donde se ha moslrado que las vacunas de ampollas (por ejemplo , la vacuna de ampollas de menB comercializada mencionada anleriormenle), son ineficaces para brindar inm unoprofección . Por consiguiente, la presente invención provee mélodos para aliviar los problemas aníeriores usando cepas bacíerianas diseñadas genéíicameníe, que producen vacunas de ampollas mejoradas. Dichos méíodos serán especialmeníe útiles en la generación de nuevas vacunas ante bacíerias paíógenas íales como Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, y otras. Las vacunas de ampollas de la invención están diseñadas para enfocar la respuesta inmu ne en unos cuantos anlígenos o epífopes proíeclores (de preferencia conservados) - formulados en una vacuna de componeníes mú lliples. En los casos en donde dichos anlígenos sean OMPs infeg rales, las vesículas de membrana exíerior de vacunas de ampollas asegurarán su plegamienío adecuado. Esía invención provee mélodos para oplimizar la composición de OMP y LPS de vacunas (ampollas) de OMV eliminando variantes inmu nodominantes, así como también OMPs no protecloras, creando OM Ps conservadas, medianíe deleción de regiones variables, sobrerregulando la expresión de OMPs prolectoras, y eliminando mecanismos de control para la expresión (lal como la reslricción por hierro) de OMPs protectoras . i iit Vf t |_ti-tJ¿=— ¡jJ^ Además, la invención provee la reducción en íoxicidad del lípido A medíanle la modificación de la porción lipídica, o cambiando la composición de fosforilo, mienfras retiene su actividad adyuvanle, o enmascarándola. Cada uno de esíos nuevos mélodos de mejora, mejora individualmenle las vacunas de ampollas; sin embargo, una combinación de uno o más de estos métodos funciona en conjunto para producir una vacuna de ampollas diseñada optimizada q ue sea inmunoproleclora y no lóxica - parlicularmenle adecuada para uso pediátrico. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee una preparación de ampollas diseñada genéticamente a partir de una cepa de bacterias Gram negativas, caracterizada porque dicha preparación se obtiene utilizando uno o más de los procedimieníos seleccionados del siguienle grupo: a) un procedimienlo para reducir anlígenos no prolecíores o variables inmunodominanles dentro de la preparación de ampollas , el cual comprende los pasos de determinar la identidad de dicho aníígeno, diseñar una cepa bacíeriana que produzca menos aníígeno o que no produzca el mismo, y obfener ampollas de dicha cepa; b) un procedimienlo para sobrerreg ular la expresión de anlígenos de OMP protectores y endógenos (y de preferencia conservados) dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de idenlificar dicho aníígeno, diseñar una 1 - ' * L *•"*— - *n| cepa bacteriana para iníroducir una secuencia de promoíor más fuerte hacia el extremo 5' de un gen que codifica para dicho aníígeno, de modo que dicho gen sea expresado a un nivel mayor que en la ampolla no modificada, y oblener ampollas de dicha cepa; c) un procedimienlo para sobrerregular la expresión de anlígenos de OMP protectores y expresados condicionalmente (y de preferencia conservados) dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho aníígeno, diseñar una cepa bacferiana para eliminar los mecanismos de conírol represivos de su expresión (íales como resíricción por hierro), y obíener ampollas de dicha cepa; d) un procedimienío para modificar la porción de lípido A de LPS bacleriano deníro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de idenlificar un gen que iníerviene en hacer que la porción de lípido A de LPS sea tóxica, diseñar una cepa bacteriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen, y obtener ampollas de dicha cepa; e) un procedimienlo para modificar la porción de lípido A de LPS bacleriano dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar un gen que interviene en hacer que la porción de lípido A de LPS sea menos tóxica, diseñar una cepa bacteriana para iníroducír una secuencia de promoíor más fueríe hacia el exlremo 5' de dicho gen, de modo que dicho gen sea expresado a un nivel mayor que en la ampolla no modificada, y oblener ampollas de dicha cepa; f) un procedimiento para reducir la toxicidad de lípido A denlro de la preparación de ampollas y aumenfar los niveles de anlígenos protectores, el cual comprende los pasos de diseñar el cromosoma de una cepa bacteriana que incorpora un gen que codifica para u n péplido de polimixina A, o u n derivado o análogo del mismo, fusionado a un aníígeno prolecíor, y oblener ampollas de dicha cepa ; g) un procedimiento para crear anlígenos de OMP conservados en la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para eliminar regiones variables de un gen que cod ifica para dicho antígeno, y obtener ampollas de dicha cepa ; h) u n procedimiento para red ucir la expresión deníro de la preparación de ampollas de un aníígeno que comparíe una similitud estrucíural con una esírucíura humana y puede ser capaz de inducir una respuesía auíoinmune en humanos (fal como el polisacárido capsular de N. meningitidis B) , el cual comprende los pasos de ideníificar un gen que iníerviene en la biosínlesis del aníígeno, diseñar una cepa bacíeriana para red ucir o inacíivar la expresión de dicho gen , y obíener ampollas de dicha cepa; o i) un procedimienlo para sobrerreg ular la expresión de aníígenos de OM P endógenos protectores (y de preferencia conservados) dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para introducir en el cromosoma una o más de oirás copias de un gen que codifica para dicho aníígeno conírolado por una secuencia de promoíor más fuerle y heleróloga, y oblener ampollas de dicha cepa . Oíros aspectos de la invención incluyen procedimientos preferenciales para oblener la preparación de ampollas aníerior, incluyendo posicionamiento óptimo de promotores fuerles para la sobrerregulación de la expresión de anlígenos deníro de las ampollas, y anlígenos preferenciales para la sobrerregulación y subregulación de varias cepas bacíerianas para obíener preparaciones de ampolla particularmente adecuadas para su uso en vacunas. Se proveen también formu laciones preferenciales que comprenden las ampollas de la invención , las cuales son parlicularmenle adecuadas para vacunas globales ante ciertos estados de enfermedad. Vectores para producir las ampollas de la invención , y cepas bacíerianas modificadas a partir de las cuales se obtienen las ampollas de la misma, son oíros aspecíos de la preseníe ¡nvención . La présenle invención provee por primera vez una vacuna de ampollas que es inmunoproíectora y no tóxica cuando se usa en niños de menos de cuatro años de edad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig ura 1 : reactividad del mAb 735 sobre diferentes colon ias. Figura 2: reacíividades de anficuerpos monoclonales específicos medianíe ELISA de células enleras.
Figura 3: represenlación esquemáíica de los vecíores pCM K usados para liberar genes, operones y/o casselíes de expresión en el genoma de Neisseria meningitidis. Figura 4: análisis de la expresión de PorA en exlraclos de proíeína íoíal del serogrupo B de N. meningitidis recombinaníe (derivados H44/76) . Se recuperaron proíeínas lolales de cepas del serogrupo B de N. meningitidis recombinaníe cps- (campos 3 y 4), cps-por>4:. pCMK+ (campos 2 y 5) y cps-porA::nspA (campos 1 y 6), y se analizaron bajo condiciones de SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida a 1 2%. Los geles fueron íeñidos con azul de Coomassie (campos 1 a 3), o íransferidos a una membrana de nilrocelulosa e inmu noleñidos con un aníicuerpo monoclonal anfi- PorA. Fig ura 5: análisis de la expresión de NspA en exíracfos de proíeína de cepas del serogrupo B de N. meningitidis recombinaníe (derivados H44/76) . Se exírajeron proíeínas de bacíerias enteras (campos 1 a 3) o preparaciones de ampollas de membrana exterior (campos 4 a 6) separadas medianfe SDS-PAGE sobre un gel de acrilamida a 12%, y se analizaron medianíe immuno-bloíling usando un suero policlonal aníi-NspA. Se analizaron mueslras que corresponden a cps-(campos 1 y 6) , cps- pora::pCMK+ (campos 3 y 4) y cps- porA . nspA (campos 2 y 5). Se deleclaron dos formas de NspA: una forma madu ra (18 kDa) que co-emigraba con el NspA purificado recombinaníe, y una forma más corla (1 5 kDa).
Figura 6: análisis de la expresión de D 1 5/omp85 en exlraclos de proíeína de cepas del serogrupo B de N. meningitidis recombinanfe (derivados H44/76) . Se exírajeron proíeínas de preparaciones de ampollas de membrana exíerior, y se separaron medianle SDS-PAGE sobre u n gel de acrilamida a 1 2% , y se analizaron medianle immuno-blolting usando un suero policlonal anti-omp85. Se analizaron muesfras q ue corresponden a cepas del serogrupo B de N. meningitidis recombinaníe cps- (campo 2) y cps-, PorA + , pCMK+Omp85/D15 (campo 1 ). Figura 7: esíralegia general para modular la expresión génica medianle liberación del promolor (RS significa sitio de restricción). Figura 8: análisis de ampollas de membrana exlerior producidas por cepas cps- del serogrupo B de N. meningitidis recombinaníe (derivado H44/76) . Se exírajeron proteínas de preparaciones de ampollas de membrana exlerior, y se separaron medianíe SDS-PAGE bajo condiciones reducloras sobre un gel de poliacrilamida con gradienfe de 4-20%. El gel fue íeñido con azul brillante R250 de Coomassie. Los campos 2, 4 y 6 correspondieron a 5 µg de proíeínas íoíales, mieníras que los campos 3, 5 y 7 fueron cargados con 1 0 µg de proleínas. Figura 9: conslrucción de un plásm ido para reemplazo de promotor usado para sobrerregular la expresión/producción de Omp85/D 1 5 en H44/76 de Neisseria meningitidis.
Figura 1 0: análisis de la expresión de OMP85 en exíraclos de proíeína total de NmB recombinante (derivados H44/76) . Los geles fueron leñidos con azul de Coomassie (A), o íransferidos a membranas de nilrocelu losa e inmunoleñidos con anlicuerpo monoclonal (B) anli-OMP85 (?/. gono) de conejo. Figura 1 1 : análisis de la expresión de OMP85 en preparaciones de OMV de NmB recombinaníe (derivados H44/76) .
Los geles fueron íeñidos con azul de Coomassie (A) , o íransferidos a membrana de niírocelulosa e inmunoteñ idos con anticuerpo policlonal (B) anti-OM P85 de conejo. Figura 12: represeníación esquemálica de la esíraíegia de PCR recombinanfe usada para eliminar lacO en el promoíor porA/lacO quimérico. Figu ra 1 3: análisis de la expresión de Hsf en exíraclos de proleína total de cepas del serog rupo B de N. meningitidis recombinante (derivados H44/76). Se recuperaron proteínas totales de cepas del serogrupo B de N. meningitidis recombinante Cps-PorA+ (campo 1 ) y Cps-PorA+/Hsf (campo 2), y se analizaron bajo condiciones de SDS-PAGE en un gel de políacrilamida a 1 2% . Los geles fueron íeñidos con azul de Coomassie. Fig ura 14: análisis de la expresión de GFP en exlracfos de proíeína íolal de N. meningitidis recombínanle (derivados H44/76) . Se recuperaron proteínas tolales de las cepas recombinanfes Cps-, PorA+ (campo 1 ) y Cps-, PorA- GFP+ (campos 2 y 3) . Las proleínas se separaron medianle SDS-PAGE en un gel -' •- ' • üirniitttin + de poliacrilamida a 1 2% , y se tiñeron eníonces con azul de Coomassie. Figura 1 5: ilustración del patrón de proíeínas principales sobre la superficie de varias preparaciones de ampollas 5 recombinaníes analizadas medianle SDS-PAG E (tinción de Coomassie) . Figura 1 6: respuesta específica de anti-Hsf para varias preparaciones de ampollas y de ampollas recombinanles usando proteína Hsf recombinante purificada. 10 Figura 1 7: análisis de la expresión de NspA en exíractos de proteína toíal de NmB recombinanle (derivados del serogrupo B). Los geles fueron leñidos con azul de Coomassie (A), o íransferidos a membranas de niírocelulosa e inmunoíeñidos con aníicuerpo monoclonal aníi-PorA (B) de ralón o aníicuerpo 15 policlonal aníi-NspA (C) de raíón . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La preseníe ¡nvención se refiere a u na serie general de herramienlas y mélodos capaces de ser usados para fabricar ampollas mejoradas diseñadas genélicamente a partir de cepas 20 bacterianas Gram negativas. La invención incluye métodos que se usan para oblener ampollas recombinanles más inmu nógenas, menos tóxicas y más seg uras para su uso en una vacuna para humanos y/o animales. Además, la presente invención describe también métodos específicos necesarios para construir, producir, 25 obtener y usar ampollas diseñadas recombinantes a partir de varias fea*"*.- • - i, r t t..i. ^n¡^^^ AMlitflÜiÜMiMl baclerias Gram negativas, para propósitos íerapéuíicos y/o de diagnósíico, y para la producción de vacunas. Medianle los mélodos de la invención , la composición bioquímica de las ampollas bacterianas se puede manipular actuando sobre/alterando la expresión de genes bacterianos que codifican para productos presentes en, o asociados con, ampollas de membrana exlerior bacleriana (proíeínas de membrana exferior u OMPs) . La prod ucción de ampollas usando u n méíodo de mod ificación genéfica para aumeníar, d isminuir o condicionar la expresión de uno o más genes que codifican para componeníes de membrana exferior, se ¡ncluye íambién deníro del alcance de esía ¡nvención . Para facilifar su enfendimienío, el íérmino "cassefíe de expresión" se referirá en la preseníe a iodos los elemeníos genéíicos necesarios para expresar un gen o u n operón , y para producir y dirigir las proleínas correspondienles de interés hacia ampollas de membrana exterior, derivadas de una bacteria hospedera deíerminada. Una lisia no exhausiiva de estas caracteríslicas incluye elementos de control (de la franscripción y/o traducción) , regiones de codificación de proleína y señales de direccionamienío, con separación apropiada enire los mismos. La referencia a la inserción de secuencias de promoíor significa, para los propósilos de esta invención, la inserción de una secuencia con por lo menos una función de promotor, y de preferencia uno o más de otros elemeníos reguladores genélicos, comprendidos denlro de un casseííe de expresión . Además, el término "casselle iníegralivo" , . ? - i linirm ri - Jiá?íM&? ^M il?mam se referirá en la présenle a lodos los elementos genéticos que se requieren para integrar un segmento de ADN en una bacteria hospedera determinada. Una lista no exhausíiva de esías caracíerísficas incluye un vehículo (o veclor) de liberación, con regiones recombinogénicas, y marcadores seleccionables y coníraseleccionables. De nuevo con el propósiío de faciliíar su eníendimienfo, los lérminos "d iseñar una cepa bacleriana para producir menos caníidad de dicho anfígeno" , se refiere a cualquier med io para reducir la expresión de un anfígeno de inferes, con respecfo a aquella de la ampolla no modificada (es decir, de ocurrencia natural) , de modo que la expresión sea por lo menos 1 0% menor que aquella de la ampolla no modificada. De preferencia, es por lo menos 50% menor. "Secuencia de promotor más fuerte" se refiere a un elemento de control regulador que aumenta la íranscripción de un gen q ue codifica para un aníígeno de inferes. "Sobrerreg ulación de la expresión" se refiere a cualquier med io para iníensificar la expresión de un aníígeno de inferes, respecío a aquella de la ampolla no modificada (es decir, de ocurrencia naíu ral). Se eníiende que la caníidad de "sobrerregulación" variará, dependiendo del anlígeno particular de inferes, pero no excederá una caníidad que desorganice la iníegridad de membrana de la ampolla. La sobrerregulación de un anlígeno se refiere a la expresión que es por lo menos 10% mayor que aquella de la ampolla no modificada. De preferencia , es por lo menos 50% mayor. Más preferiblemenle, es por lo menos 100% mayor (2 veces). Los aspectos de la invención se refieren a métodos individuales para obtener ampollas diseñadas mejoradas, a una combinación de dichos métodos, y a composiciones de ampollas obtenidas como resullado de eslos mélodos. Olro aspecto de la invención se refiere a las herramientas genéticas usadas para modificar genéticameníe una cepa bacteriana elegida para extraer ampollas diseñadas mejoradas de dicha cepa. Los pasos de diseño de los proced im ienfos de la invención se pueden llevar a cabo en varias formas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden inserlar secuencias (por ejemplo, promolores o marcos de lecíura abieríos), y se pueden desorganizar promolores/genes med ianíe la íécnica de inserción de transposones. Por ejemplo, para sobrerregular la expresión de un gen , se pod ría insertar un promoíor fuerte mediante un transposón de hasla 2 kb hacia el exlremo 5' del codón de inicio del gen (más preferiblemente, 200-600 pares de bases hacia el extremo 5' , muy preferiblemeníe alrededor de 400 pares de bases hacia el exlremo 5'). Se puede usar íambién mulación de punió o deleción (en parficular para subregular la expresión de un gen). Sin embargo, d ichos métodos pueden ser bástanle ineslables o inciertos, y se prefiere por lo tanto q ue el paso de diseño [en particular los procedimienlos a), b), c), d), e), h) e i) _ n¡ ^ como se describe a contin uación] se lleve a cabo mediante u n evenío de recombínación homologa. De preferencia , el evento ocurre entre una secuencia (una región recombinogénica) de por lo menos 30 n ucleótidos en el cromosoma bacteriano, y una secuencia (una segu nda región recombinogénica) de por lo menos 30 n ucleótidos en un vector íransformado dentro de la cepa . De preferencia , las regiones son de 40-1 000 nucleótidos , más preferiblemente de 100-800 nucleótidos, muy preferiblemente de 500 nucleótidos) . Estas regiones recombinogénicas deben ser suficientemente similares en el senfido de q ue sean capaces de hibridar con alguna otra bajo condiciones altamenle severas (como se define más adelaníe) . Los eveníos de recombinación pueden ocurrir usando una sola región recombinogénica en el cromosoma y el veclor, o medianle u n evenío de entrecruzamienío doble (con dos regiones en el cromosoma y el vector). Para llevar a cabo u n solo evento de recombinación , el vector debe ser u na molécu la de ADN circular. Para llevar a cabo un evenío de recombinación doble, el vecíor podría ser u na molécula de ADN lineal o circular (véase figura 7) . Es preferible que se use un evenlo de recombinación doble, y que el vecíor usado sea lineal , ya que la bacíeria modificada prod ucida de esta manera será más estable en íérminos de evenlos de reversión . De preferencia, las dos regiones recombinogénicas en el cromosoma (y en el vector) son de longitud similar (más preferiblemenle iguales) , para promover enlrecruzamienlos dobles.
¡.. .^? . *...„ , El entrecruzamiento doble funciona de modo que las dos regiones recombinogénicas en el cromosoma (separadas por la secuencia de nucleóíidos 'X') y las dos regiones recombinogénicas en el vecfor (separadas por la secuencia de nucleólidos 'Y'), recombinan para dejar un cromosoma inallerado, exceplo que X e Y se han iníercambiado. La posición de las regiones recombinogénicas puede esíar hacia el exíremo 5' o hacia el exíremo 3' de un marco de lecíura abierfo de interés, o pueden flanquear el mismo. Estas regiones pueden consistir de una secuencia de codificación, de no codificación, o una mezcla de secuencia de codificación y no codificación. La identidad de X e Y dependerá del efecto deseado. X puede ser un marco de lectura abierlo complelo, o parte del mismo, e Y puede carecer de nucleótidos, lo cual haría que la secuencia X sea eliminada del cromosoma. En forma allernativa, Y puede ser una región de promotor fuerte para inserción hacia el extremo 5' de un marco de lecíura abierío, y por lo íanlo X puede carecer de nucleóíidos. Los vectores adecuados variarán en composición, dependiendo de qué tipo de evenfo de recombinación se llevará a cabo, y cuál es el propósilo final del evento de recombinacíón. Los vectores iníegralivos usados para liberar la región Y, pueden ser plásmidos condicionalmeníe replicalivos o suicidas, bacíeriófagos, transposones o fragmentos de ADN lineal obtenidos medianle hidrólisis de reslricción o amplificación mediante PCR. La selección del evento de recombinación se lleva a cabo por medio del •¿^A^afaáiiálfa marcador genéíico seleccionable, lal como genes que confieren resislencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, eritromicina , cloranfenicol o genfamicina), genes que confieren resistencia a metales pesados y/o compuestos lóxicos, o genes que complemenían m ulaciones auxolróficas (por ejemplo, pur, leu, met, aro). Procedimieníos a) y f) - Subreq ulación/remoción de antíqenos inmunodominanfes variables y no protecíores Muchos aníígenos de superficie son variables entre las cepas bacterianas y, como consecuencia, son proteclores sólo anle una serie limiíada de cepas estrechameníe emparentadas. Un aspecío de esía invención abarca la reducción en la expresión o, de preferencia , la deleción de los genes que codifican para proíeínas de superficie variables, lo cual da como resulíado u na cepa bacíeriana que produce ampollas las cuales, cuando se adminisíran en una vacuna, íienen un pofencial más fueríe para reaclívidad cruzada aníe varias cepas debido a una influencia mayor ejercida por las proleínas conservadas (reíenidas sobre las membranas exteriores) sobre el sistema inmune de la vacuna. Ejemplos de dichos antígenos variables incluyen : para Neisseria - pili (PilC) que sufren variaciones antigénicas, PorA, Opa, TbpB, FrpB ; para H. influenzae - P2, P5, pilina, lgA1 -proteasa; y para Moraxella -CopB , OMP1 06. Otros tipos de genes que podrían ser subregulados o inactivados, son genes que, in vivo, pueden ser fácilmente -db£>»MÍJ>_ ««-MtiáWiiiÉM acíivados (expresados) o inacíivados por la bacleria. Pueslo que las proíeínas de membrana exíeríor cod ificadas por dichos genes no esíán siempre présenles en las bacíerias, la presencia de dichas proíeínas en las preparaciones de ampollas puede ser íambién 5 perj udicial para la eficacia de la vacu na por las razones mencionadas anteriormente. U n ejemplo preferido para subregular o eliminar, es la proteína Opc de Neisseria. La inmu nidad de anfi-Opc inducida por una vacuna de ampollas que contiene Opc tendría sólo capacidad proíeclora limilada, pueslo q ue el organismo infeccioso 10 pod ría ser fácilmenfe Opc". HgpA y HgpB de H. influenzae, son otros ejemplos de dichas proteínas. En el procedimiento a), estos genes variables o no proteclores son subregulados en expresión, o lerminalmenle inaclivados. Esío íiene la veníaja sorprendenle mencionada 15 anleriormenle de concentrar el sistema inmu ne en anfígenos mejores que esíán presentes en bajas cantidades en la superficie exterior de las ampollas. La cepa puede ser diseñada de esta forma mediante varias estraíegias que incluyen inserción de íransposones para 20 disociar la región de codificación o reg ión de promoíor del gen , o m ulaciones de pu nió o deleciones para lograr un resullado similar. Se puede usar también recombinación homologa para eliminar un gen de u n cromosoma (en donde la secuencia X comprende parte de (de preferencia toda) la secuencia de codificación del gen de 25 interés). Se puede usar además para cambiar su promotor fuerte por un promoíor más débil (o no) (en donde la secuencia de nucleóíidos X comprende paríe de (de preferencia toda) la región de promotor del gen , y la secuencia de nucleólidos Y comprende una región de promoíor más débil [dando como resulíado u na expresión disminuida de los genes/operones de interés] , o ninguna región de promotor). En este caso, se prefiere que el evento de recombinación ocurra dentro de la región del cromosoma 1 000 pares de bases hacia el extremo 5' del gen de inlerés. En forma alíernaíiva, Y puede conferir una acíividad de íranscripción condicional , dando como resulíado u na expresión condicional de los genes/operones de inferes (subregulación). Eslo es útil en la expresión de moléculas que son lóxicas para la bacleria hospedera , o que no son bien íoleradas por la misma . La mayoría de las proteínas ejemplificadas anteriormeníe, son OMPs inleg rales, y su variabilidad se puede limiíar sólo a uno o unos cuaníos de sus bucles expuesíos de superficie. Olro aspeclo de esla invención [procedimiento g)], abarca la deleción de regiones de ADN que codifican para estos bucles expuestos de superficie, lo cual conduce a la expresión de la OMP integral que contiene bucles expueslos de superficie conservados. Los bucles expueslos de superficie de P2 y P5 de H. influenzae, son ejemplos preferidos de proteínas que se podrían transformar en antígenos de reacción cruzada usando dicho método. De nuevo, la recombinación homologa es un método preferido para llevar a cabo este proceso de diseño. t . n f t -t? 'i , t ^ujart^^^^A, Procedimienío b) - Liberación y modulación del promoíor Otro aspecto de la invención se refiere a modificar la composición de ampollas alterando in situ la región reguladora que controla la expresión de genes y/u operones de interés. Esta alleración puede incluir reemplazo parcial o lotal del promotor endógeno que controla la expresión de un gen de inferes, con uno que confiera una acíividad de transcripción disíinía. Esía acíividad de íranscripción dislinta puede ser conferida por varíanles (mulaciones de punió, deleciones y/o inserciones) de las regiones de conlrol endógenas, medianíe promoíores helerólogos de ocurrencia nalural o modificados, o medianle una combinación de ambos. Dichas alleracíones conferirán de preferencia una actividad de transcripción más fueríe que la endógena (iníroducción de un promolor fuerle), dando como resulfado una expresión iníensificada de los genes/operones de interés (sobrerregulación). Dicho método es paríicularmente úíil para iníensificar la producción de componentes de ampolla inmunológicamente relevantes, tales como proleínas y lipoproleínas de membrana exterior (de preferencia OMPs conservadas, usualmente presentes en ampollas a bajas concentraciones). Promotores fuertes típicos que se pueden integrar en Neisseria son porA [SEQ ID NO: 24], porB [SEQ ID NO: 26], IgtF, Opa, p110, Ist y hpuAB. PorA y PorB se prefieren como promotores fuertes constiíutivos. Se ha establecido (ejemplo 9) que la actividad del promoíor PorB esíá coníenida en un fragmento que corresponde •U-i-iAáAááMMÉiÉIWí^ a los n ucleótidos -1 a -250 hacía el exíremo 5' del codón de inicio de porB. En Moxarella, se prefiere usar los promotores ompH , ompG , ompE , OmpB 1 , ompB2, ompA, OM PCD y Omp 1 06, y en H influenzae, se prefiere integ rar los promotores P2 , P4, P 1 , P5 y P6. Medianíe el uso de la lecnología de recombinación homologa de enírecruzamiento doble preferida para inírod ucir el promoíor en la región de 1 000 pares de bases hacía el exlremo 5', se pueden colocar promoíores en cualq uier punto de 30-970 pares de bases hacia el exíremo 5' del codón de inicio del gen , para que sean sobrerregulados. Aunque convencionalmenle se piensa que la región de promolor debe eslar relativamente cerca del marco de lectura abierto para obtener la expresión óplima del gen , los preseníes invenlores ha enconlrado sorprendenlemenle que la colocación del promolor más allá del codón de inicio prod uce grandes incremeníos en los niveles de expresión . De esta manera, se prefiere si el promotor es insertado 200-600 pares de bases a partir del codón de inicio del gen, más preferiblemente 300-500 pares de bases, y muy preferiblemente alrededor de 400 pares de bases a parlir del ATG de inicio. Procedimiento c) - Componeníes de ampollas producidos condicionalmenfe La expresión de alg unos genes que codifican para ciertos componentes de ampollas, es cuidadosameníe regulada. La producción de los componenles es modulada condicionalmenle, y depende de varias señales meíabólicas y/o ambienlales . Dichas señales incluyen , por ejemplo, limitación por hierro, modu lación del potencial redox, variaciones de pH y de lemperatu ra , y cambios nutricionales. Algunos ejemplos de componentes de ampollas que se sabe son producidos condicionalmente, incluyen proteínas de membrana exterior reguladas por hierro de Neisseria y Moraxella (por ejemplo, TbpB, LbpB), y porínas de membrana exlerior inducibles por el subslralo. La présenle invención abarca el uso de los métodos genéticos descritos anteriormenle (procedimientos a) o b)) , para hacer que sea constiiuíiva la expresión de dichas moléculas. De esla forma , la influencia de la señal ambienlal sobre la expresión de los genes de inferes, se puede superar modificando/reemplazando la región de conírol correspondienle del gen, de modo que se vuelva consíilutivameníe acíiva (por ejemplo, eliminando parte de [de preferencia toda] la secuencia de control represiva - por ejemplo, la región de operador), o inserlando un promoíor fuerte constilutivo. Para acciones reg uladas por hierro, se puede eliminar el operador fur. En forma allernaliva , el procedimienio i) se puede usar para liberar una copia adicional del gen/operón de interés en el cromosoma, la cual se coloca artificialmente bajo el control de un promotor consíiluíivo. Procedimieníos d) y e) - Desíoxificación de LPS La toxicidad de vacunas de ampollas presenta uno de los problemas principales en el uso de ampollas en vacunas. Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para desíoxificar genéticamenle el LPS présenle en ampollas. El lípido A es el - • '•' *-* * 4 componeníe primario de LPS responsable de la activación celular. Muchas mutaciones de genes que intervienen en esla vía conducen a fenotipos esenciales. Sin embargo , las mutaciones de los genes responsables de las modificaciones term inales conducen a fenolipos sensibles a la íemperaíura (htrB) o permisivos {msbB). Las muíaciones que producen una expresión disminuida (o no) de esíos genes, dan como resulíado acíividad tóxica alterada del lípido A. Por supuesío, el lípido A no lauroilado (muíanle hlrB) o no miristoilado (mutaníe msbB), es menos íóxico que el lípido A de lipo silveslre. Las mutaciones en el gen que codifica para 4-cinasa del lípido A (IpxK), disminuyen también la actividad íóxica del lípido A. El procedimienlo d) implica de esla manera la deleción de parte (o de preferencia todos) de u no o más de los marcos de , lectura abiertos o promotores anteriores. En forma alternaliva, los promolores podrían ser reemplazados con promoíores más débiles. De preferencia, las íécnicas de recombinación homologa descrilas anleriormenle se usan para llevar a cabo el proced imienlo. Las secuencias de los genes hlrB y msbB de Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis y Haemophilus influenzae, se proveen adicionalmenfe para esle propósito. La actividad tóxica de LPS pod ría ser alterada lambíén iníroduciendo muíaciones en genes/loci que inlervienen en la resistencia a polimixina B (dicha resistencia se ha correlacionado con la adición de aminoarabinosa en el 4'-fosfalo del lípido A) . Esfos genes/loci podrían ser pmrE que codifica para una UPD- glucosa deshidrogenasa, o una región de genes de resistencia a péptidos aníimicrobianos común a muchas enlerobacíerias, que podrían inlervenir en la sínlesis y íransferencia de aminoarabinosa. El gen pmrF que eslá preseníe en esta región, codifica para dolicol- 5 fosfato manosil transferasa (Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182). Las mutaciones en el sistema regulador Phop-PhoQ, el cual es un sisfema regulador bicomponente de reemplazo de fósforo 10 (de fenotipo consíituíivo PhoP, PhoPc), o condiciones de cullivo o ambieníales de baja concenlración de Mg++ (que aclivan al sislema regulador Phop-PhoQ), llevan a la adición de aminoarabinosa en el 4'-fosfalo y 2-hidroximirisfato que reemplaza a mirislato (hídroxilación de mirislaío). Este lípido A modificado exhibe 15 capacidad reducida para estimular la expresión de selectina E por células endoteliales humanas y la secreción de FNT-a de monocitos humanos. El procedimiento e) implica la sobrerregulación de estos genes usando una eslrategia como se describió anleriormenle 20 (siendo incorporados promofores fuertes, de preferencia usando técnicas de recombinación homologa para llevar a cabo el procedimienlo). En forma alternaliva, más que llevar a cabo cualquiera de dichas mulaciones, se podría usar una cepa resistente a 25 polimixina B como una cepa para la producción de vacunas (en |f'f|-|¡fti|'¡aft^j| ' conju nlo con u no o más de los oíros proced im ientos de la invención), ya que las ampollas de dichas cepas tienen lambién loxicidad de LPS reducida (por ejemplo, como se muesíra para meningococos - van der Ley, P, Hamslra , HJ . , Kramer, M, Síeeghs, 5 L, Pelrov, A y Poolman, JT. 1994, en Proceedings of íhe niníh inlernaíional paíhogeníc Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, Inglaterra). Como oíra allernaliva (y olro aspecto de la invención) , los inventores proveen un método para destoxificar una cepa de 10 baclerias Gram negaíivas, el cual comprende el paso de culíivar la cepa en un medio de crecimienlo que conlenga 0.1 mg-1 00 g de aminoarabinosa por liíro de medio de cultivo. Como otra alternativa , se pueden añadir pépíidos siniéíicos que simulen la acíividad de unión de la polimixina B 15 (como se describe a coníinuación) , a la preparación de ampollas para reducir la aclividad íóxica de LPS (Rustici, A, Velucchi, M, Faggioni, R, Sironi , M , Ghezzi, P, Quaíaerí, S , Green , B y Porro M 1993. Science 259: 361 -365; Velucchi, M, Rusíici, A, Meazza, C, Villa, P, Ghezzi, P y Porro, M . 1 997. J. Endotox. Res. 4). 20 Procedimienío f) - Anclaje de proíeínas homologas o heíerólogas a ampollas de membrana exíerior, mieníras se reduce la íoxicidad de LPS Otro aspecto de esta invención abarca el uso de 25 secuencias genéíicas que codifican para péplidos de polimixina B (o análogos de las mismas), como un medio para dirigir proteínas de fusión hacia la membrana exíerior. La polimixina B es un pépíido cíclico formado de aminoácidos no codificados por ARNt (producida por organismos actinomiceíales Gram posilivos) que se unen muy fueríemente a la parte de lípido A de LPS présenle en la membrana exíerior. Esta u nión disminuye la toxicidad inírínseca de LPS (actividad de endotoxina). Se han desarrollado pépíidos que simulan la esíructu ra de polimixina B y esíán formados de aminoácidos canónicos (codificados por ARNt) , y se unen también al lípido A con una fuerte afinidad . Estos péptidos se han usado para desfoxificar a LPS. Se moslró que uno de esíos péptidos conocidos como SAEP-2 (N-terminal-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-C-íerminal) es muy promeíedor a ese respeclo (Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A bind ing siíe by syntheíic pepíides ( 1 993) . Rusíici, A. , Velucchi , M . , Faggioni, R. , Siron i, M . , Ghezzi, P. , Quaíaert, S . , Green , B. y M . Porro. Science 259, 361 -365). El présenle procedimienlo f) de la invención provee una mejora de este uso. Se ha encontrado que el uso de secuencias de ADN que codifican para el péptido SEAP-2 (o derivado del m ismo) , fusionadas genéticamente a un gen de interés (que codifican , por ejemplo, para un antígeno de células T o un antígeno proíecíor que es usualmenle secretado tal como una loxina, o una proleína ciíosólica o periplásmica), es un medio para dirigir la proíeína recombinaníe correspondienle hacia la membrana exterior de una bacíeria hospedera preferida (mientras que al mismo tiempo reduce la toxicidad del LPS) . Este sisíema es adecuado para proíeínas lábiles que no serían expuesías dírecíameníe hacia el exíerior de la ampolla. La ampolla funcionaría por lo tanío como u n veh ículo de liberación que expondría la proíeína al sisíema inmune, una vez que las ampollas hayan sido englobadas por las células T. En forma alíernaliva, la fusión genética debe comprender también un pépíido de señal o dom inio de transmembrana tal que la proteína recombínante pueda cruzar la membrana exíerior para su exposición al sistema inmune del hospedero. Esta estraíegia de direccionamienlo podría ser de inferes paríicular en el caso de genes q ue codifican para proíeínas q ue normalmeníe no son dirigidas hacia la membrana exlerior. Esla meíodolog ía permite también el aislam ienío de ampollas recombinanles enriquecidas en la proleína de interés. De preferencia, dicha señal de direccionamiento de péptidos permite el enriquecim iento de ampollas de membrana exterior en una o varias proteínas de interés, las cuales no están naturalmeníe présenles en esa localización subcelular deíerminada. Una lisia no exhaustiva de bacterias q ue se pueden usar como hospedero receptor para dicha producción de ampollas recombinantes, incluye Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae.
Aunque se prefiere que el gen para la construcción sea diseñado en el cromosoma de la bacteria [usando el procedimiento i)], una modalidad preferida alíernafiva es q ue se obíengan independ ieníemenle proleínas recombinantes dirigidas a SAEP-2 , y unidas en una etapa posíerior a una preparación de ampollas. Otra modalidad es el uso de dichas construcciones en u n mélodo de purificación de proteínas. El sistema se pod ría usar como parle de un sisíema de expresión para producir proleínas recombinantes en general. La marca de péptidos SAEP-2 se puede usar para purificación de la proteína por afinidad con la cual se une usando una columna que contenga moléculas de lípido A inmovilizadas. Procedimiento h) - Polisacáridos de reacción cruzada El aislamiento de ampollas de membrana exterior bacterianas a partir de bacíerias Gram negativas encapsuladas, da como resultado con frecuencia la co-purificación del polisacárido capsular. En algunos casos, se puede demostrar que este maíerial "contaminanle" es útil, puesto que el polisacárido puede intensificar la respuesla inmune conferida por oíros componentes de la ampolla. Sin embargo, en otros casos, la presencia de malerial polisacárido contaminaníe en preparaciones de ampollas bacterianas puede ser perjudicial para el uso de las ampollas en una vacuna. Por ejemplo, se ha mostrado que por lo menos en el caso de N. meningitidis, el polisacárido capsular del serogrupo B no confiere inmunidad protectora y es susceptible a inducir una ^^^^m respuesla aufoinmune adversa en humanos. Por consiguíeníe, el procedimiento h) de la invención es el diseño de la cepa bacteriana para la producción de ampollas, de modo que esté libre de polisacárido capsular. Las ampollas serán entonces adecuadas para su uso en h umanos. U n ejemplo particularmente preferido de dicha preparación de ampollas, es uno del serogrupo B de N. meningitidis carente de polisacárido capsular. Esto se puede lograr usando cepas productoras de ampollas modificadas en las cuales los genes necesarios para salida y/o biosíníesis capsu lar han sido deíeriorados. La inacíivación del gen que codifica para la biosíníesis o salida del polisacárido capsular, se puede lograr m uíando (m utación de punto, deleción o inserción) la región de control, la región de codificación, o ambas (de preferencia usando las técnicas de recombinación homologa descritas anteriormente) . Además, la inactivación de los genes de biosíníesis capsular se puede log rar fambién mediante sobreexpresión antiseníido o mutagénesis por transposones. Un método preferido es la deleción de los genes cps de Neisseria meningitidis, o de algunos de los mismos, q ue se requ ieren para la salida y biosíntesis del polisacárido. Para este propósito, se puede usar el plásm ido de reemplazo pM F 1 21 (descrilo en Frosh el al. 1 990, Mol. Microbiol. 4: 1 21 5-1 21 8) para liberar u na mulación que elim ina el grupo de genes cpsCAD {+galE). En forma alternativa, el gen siaD podría ser eliminado, o subreg ulado en expresión (el gen siaD de meningococos codifica para alfa-2, 3-sialiltransferasa, una enzima que se requ iere para el polisacárido capsu lar y síníesis de LOS). Dichas mutaciones pueden eliminar también eslructuras similares en el hospedero en la porción de sacáridos del LPS de las bacterias.
Procedimienío i) - Liberación de una o más de oirás copias de un gen v/u operón en el cromosoma de u n hospedero, o liberación de un gen v/u operón heíerólogo en el cromosoma de un hospedero Una estrategia eficiente para modular la composición de una preparación de ampollas, es liberar una o más copias de un segmenío de ADN que contenga un cassetíe de expresión en el genoma de una bacíeria Gram negaíiva . Una lisia no exhausíiva de especies bacleríanas preferidas que se podrían usar como receptor de dicho cassetle, incluye Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae. Los genes contenidos en el cassetíe de expresión pueden ser homólogos (o endógenos) (es decir, exisíen naíu ralmenle en el genoma de la bacíeria manipu lada) o heíerólogos (es decir, no existen naturalmeníe en el genoma de la bacíeria manipu lada) . El casselle de expresión reinlroducido puede consisfir de secuencias de promoíor/gen/operón "naíurales" no modificadas, o casseííes de expresión diseñado en los cuales la región de promofor y/o la región de codificación , o ambas, hayan sido alferadas. U na lisia no exhausíiva de promoíores preferidos que se podrían usar para expresión incluyen los promolores porA, porB, IbpB, tbpB, p 1 10, Ist y hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae, los promoíores p2 , p5, p4, ompF , p1 , ompH , p6 y hin47 de H. influenzae, los promolores ompH , ompG, ompCD, ompE, ompB 1 , ompB2 y ompA de M. catarrhalis, los promotores ?pL, lac, tac y araB de Escherichia coli, o promotores reconocidos específicamenle por la ARN polimerasa de bacteriófagos tales como el bacíeriófago T7 de E. coli. Una lisia no exhausíiva de genes preferidos q ue podrían ser expresados en dicho sisfema, incluye NspA, Omp85, PilQ de Neisseria, complejo TbpA/B, Hsf, PldA y HasR; MOM P y HMWP de Chlamydia; OM P 1 06, HasR, PilQ , OMP85 y PldA de Moraxella; y FHA, PRN y PT de Bordetella pertussis. En una modalidad preferida de la invención , el cassette de expresión es liberado e integrado en el cromosoma bacteriano por medio de recombinación homologa y/o específica de sitio. Vectores integralivos usados para liberar dichos genes y/u operones, pueden ser plásmidos condicionalmeníe replicafivos o suicidas, bacíeriófagos, íransposones o fragmeníos de ADN lineal obíenidos medianfe hidrólisis de resfricción o amplificación med ianíe PC R. La infegración es d irigida de preferencia hacia regiones cromosóm icas dispensables para crecimienlo in vitro. Una lisia no exhausíiva de loci preferidos que se pueden usar para dirigir la infegracíón del ADN , incluye los genes porA, porB, opa, opc, rmp, omp26, lecA, cps y IgtB de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae, los genes P1, P5, hmw1/2, IgA-proteasa y fimE de NTHi; y los genes lecA 1, lecA2, omp 106, uspA 1 y uspA2 de Moraxella catarrhalis. En forma alternaliva , el casseííe de expresión usado para modular la expresión de componenfes de ampollas, puede ser liberado en una bacteria de elección por medio de vectores episómicos tales como plásmidos replicativos circulares/lineales, cósmidos, fásm idos, bacteriófagos lisogénicos o cromosomas artificiales bacíerianos. La selección del evenío de recombinación se puede llevar a cabo por med io de un marcador genético seleccionable, tal como genes que confieren resistencia a antibiólicos (por ejemplo, kanamicina, eritromícina, cloranfenicol o genlamicina) , y genes que confieren resistencia a metales pesados y/o compuestos íóxicos, o genes que complementen mutaciones auxoíróficas (por ejemplo, pur, leu, met, aro) . Genes heíerólogos - Expresión de proíeínas inírod ucidas en ampollas de membrana exterior Las ampollas bacterianas de membrana exíerior represenlan un sisíema muy alracíivo para prod ucir, aislar y liberar proíeínas recombinaníes para su uso íerapéuíico y/o de diag nóstico y en vacunas. Otro aspecfo de esía invención se refiere a la expresión , producción y direccionamienío de proíeínas heíerólogas iníroducidas hacia la membrana exíerior, y al uso de las bacíerias para producir ampollas recombinaníes. U n método preferido para lograr esto, es mediante un procedimiento que comprende los pasos de: introducir un gen , » i « -3* * * i* heterólogo, conírolado opcionalmenle por una secuencia de promolor fuerte, en el cromosoma de una cepa de bacterias Gram negativas, mediante recombinación homologa. Se pueden obíener ampollas a paríir de la cepa modificada resu líaníe. Una lisia no exhaustiva de bacterias q ue se pueden usar como hospedero receptor para la producción de ampollas recombinantes, incluye Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae. El gen expresado en dicho sistema puede ser de origen viral, bacleriano, de hongos, parásilos, o eucariontes superiores. Una aplicación preferida de la invención incluye un procedimiento para la expresión de proteínas de membrana exlerior de Moraxella, Haemophilus y/o Pseudomonas (iníegrales, politópicas y/o lipoproleínas) en ampollas recombinanles de Neisseria meningitidis. Los loci de iníegración preferibles son como se indicaron anteriormente, y los genes que son preferiblemente introd ucidos, son aq uellos que brindan proíección anie la bacíeria de la cual fueron aislados. Se describen a conlinuación genes protectores preferidos para cada bacteria. Oirás aplicaciones preferidas son: ampollas producidas a partir de una cepa de Haemophilus influenzae modificada, en donde el gen heterólogo es u na OM P proíectora de Moraxella catarrhalis; y ampollas producidas a partir de una cepa de A^n^jHHHUü Moraxella catarrhalis modificada, en donde el gen heterólogo es una OM P proíecfora de Haemophilus inlfuenzae (loci preferidos para la inserción de genes se dieron anteriormeníe, y aníígenos proíeclores preferidos se describen a continuación) . Una aplicación particularmeníe preferida de esfe aspecío esíá en el campo de la profilaxis o el traíamienío de enfermedades Iransmilidas sexualmeníe (STDs). Con frecuencia es d ifícil para los especialisías deíerm inar si la causa principal de una STD es infección por gonococos o Chlamydia trachomatis. Estos dos organ ismos son la causa principal de salpingitis - una enfermedad que puede conducir a esterilidad en el hospedero. Sería por lo tanío úíil si se pudiera vacunar contra una STD o se pudiera tralar con una vacuna combinada eficaz aníe enfermedades causada por ambos organismos. Se ha mosírado que la proíeína de membrana exlerior principal (MOM P) de C. Trachomatis, es el objetivo de anticuerpos prolecíores. Sin embargo, la iníegridad esírucíural de esía proíeína de membrana integral es importaníe para inducir dichos anticuerpos. Además, los epítopes reconocidos por eslos aníicuerpos son variables y definen más de 1 0 variedades serológicas. El aspecto de esta invención descrito anteriormente permite el plegamienlo adecuado de una o más proleínas de membrana dentro de una preparación de membrana exterior de ampollas. El diseño de una cepa gonocóccíca que exprese variedades serológicas de MOMP de C. trachomatis múltiples en la membrana exlerior, así como la prod ucción de ampollas a partir de las mismas, da u na solución individual a los problemas m últiples de proteínas de membrana correctameníe plegadas, la preseníación de variedades serológicas de MOMP suficienles para proíeger aníe un amplio especíro de variedades serológ icas, y la profilaxis/el íralamienlo simu lláneos de infección por gonococos (y, en consecuencia, el no requisito de los especialistas para decidir inicialmeníe qué organismo esíá causando sínlomas clínicos paríiculares - se puede vacu nar simu líáneamente coníra ambos organ ismos, perm iíiendo de esta manera el íraíamiento de la STD en una elapa muy temprana) . Locis preferidos para la inserción de genes en el cromosoma gonocóccico, se indicaron anteriormenfe. Otros genes proteclores y preferidos de C. trachomatis q ue pod rían ser incorporados son HMWP, PmpG, y aq uellas OMPs descritas en el documento WO 99/28475. Direccionamienío de proíeínas heíerólogas hacia ampollas de membrana exíerior La expresión de algunas proíeínas heíerólogas en ampollas bacíerianas, puede requerir la adición de señales de direccionamienlo hacia la membrana exlerior. El mélodo preferido para resolver esle problema, es crear una fusión genélica enire un gen heíerólogo y un gen que codifique para u na OM P residente, como procedimiento específico para dirigir proteínas recombinantes hacia ampollas. Más preferiblemenle, el gen helerólogo es fusionado a las secuencias de péptidos de señal de dicha OMP: Preparaciones de ampollas de Neisseria ^^^^ Uno o más de los siguieníes genes (que codifican para antígenos proteclores) se prefieren para sobrerregulación medianle los procedimienlos b) y/o i), cuando se llevan a cabo en una cepa de Neissseria, incluyendo gonococos y meningococos (en particular N. meningitidis B): NspA (véase documento WO 96/29412), tipo Hsf (véase documento WO 99/31132), Hap (véase documento PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (véase documento WO 00/23595), PilQ (véase documento PCT/EP99/03603), PldA (véase documento PCT/EP99/06718), FrpB (véase documento WO 96/31618), TbpA (véase documento US 5,912,336), TbpB, FrpA/FrpC (véase documenío WO 92/01460), Lbp/LbpB (véase documento PCT/EP98/05117), FhaB (véase documento WO 98/02547), HasR (véase documenío PCT/EP99/05989), Iipo02 (véase documenío PCT/EP99/08315), Tbp2 (véase documenío WO 99/57280), MlíA (véase documenfo WO 99/57280) y círA (véase documenlo PCT/EP00/00135). Se prefieren íambién como genes que pueden ser inlroducidos heferólogameníe en oirás baclerias Gram negativas. Uno o más de los siguientes genes se prefieren para subregulación medianfe el procedimiento a): PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa y Opc. Uno o más de los siguientes genes se prefieren para subregulación mediante el procedimiento d): hfrB, msbB y IpxK. •> i • ,-T , M.t,,ir.-ifeÍ»-.-i-aÉ,..MII Ilil, l ,M ,., |M, . l ¡ ¡l -í,m?? ¡g tttiJlt^^t?^ ^^ ß m^^^ Uno o más de los siguientes genes se prefieren para sobrerregulación mediante el procedimienfo e): pmrA, pmrB, pmrE y pmrF. Secuencias de conírol represivas preferidas para el procedimiento c) son: la región de operador fur (en particular para los genes TbpB o LbpB, o cualquiera de los mismos); y la región de operador DíxR. Uno o más de los siguieníes genes se prefieren para subregulación medianle el procedimienlo h): galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC y ctrD. Preparaciones de ampollas de Pseudomonas aeruginosa Uno o más de los siguientes genes (que codifican para antígenos protectores) se prefieren para sobrerregulación mediante los procedimientos b) y/o i): PcrV, OprF y Oprl. Se prefieren también como genes que pueden ser introducidos heterólogameníe en otras bacterias Gram negaíivas. Preparaciones de ampollas de Moraxella catarrhalis Uno o más de los siguieníes genes (que codifican para antígenos proteclores) se prefieren para sobrerregulación mediante los procedimientos b) y/o i): OMP106 (véase documentos WO 97/41731 y WO 96/34960), HasR (véase documenío PCT/EP99/03824), PilQ (véase documenlo PCT/EP99/03823), OMP85 (véase documento PCT/EP00/01468), Iipo06 (véase documento GB 9917977.2), Iipo10 (véase documento GB 9918208.1), lipo11 (véase documento GB 9918302.2), lipo18 (véase documento GB 9918038.2), P6 (véase documento PCT/EP99/03038), ompCD, CopB, (Helminen ME, el al (1993) Infecí. Immun. 61:2003-2010), D15 (véase documento PCT/EP99/03822), OmplAI (véase documento PCT/EP99/06781), Hly3 (véase documenío PCT/EP99/03257), LbpA y LbpB (véase documenlo WO 98/55606), TbpA y TbpB (véase documeníos WO 97/13785 y WO 97/32980), OmpE, UspA1 y UspA2 (véase documento WO 93/03761) y Omp21. Se prefieren también como genes que pueden ser introducidos heterólogamente en otras bacterias Gram negativas. Uno o más de los siguieníes genes se prefieren para subregulación medianíe el procedimienío a): CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA y LbpB. Uno o más de los siguienles genes se prefieren para subregulación medianle el procedimiento d): htrB, msbB y IpxK. Uno o más de los siguienles genes se prefieren para sobrerregulación mediante el procedimiento e): pmrA, pmrB, pmrE y pmrF. Preparaciones de ampollas de Haemophilus influenzae Uno o más de los siguientes genes (que codifican para anlígenos protectores) se prefieren para sobrerregulación mediante los procedimientos b) y/o i): D15 (véase documento WO 94/12641), P6 (véase documenlo EP 281673), íbpA, TbpB, P2 y P5 (véase documento WO 94/26304), OMP26 (véase documento WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 e Hif (todos los genes en este operón deben ser sobrerregulados para sobrerregular la pilina). Se prefieren también como genes que pueden ser introducidos heterólogamente en otras bacterias Gram negaíivas. Uno o más de los siguieníes genes se prefieren para subregulación medianle el procedimienlo a): P2, P5, Hif, lgA1 -proteasa, HgpA, HgpB, HMW1 , HMW2, Hxu, TbpA y TbpB. Uno o más de los siguientes genes se prefieren para subregulación mediante el procedimiento d): htrB, msbB y IpxK. Uno o más de los siguientes genes se prefieren para subregulación mediante el procedimiento e): pmrA, pmrB, pmrE y pmrF. Formulación de vacunas Una modalidad preferida de la présenle invención es la formulación de las preparaciones de ampolla de la presente invención, en una vacuna la cual puede comprender también un excipiente farmacéuticamente aceptable. La fabricación de preparaciones de ampolla a partir de cualquiera de las cepas modificadas mencionadas anteriormente, se puede lograr mediante cualquiera de los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. De preferencia, se usan los métodos descritos en los documentos EP 301992, US 5,597,572, EP 1 1243 ó US 4,271 , 147. Más preferiblemente, se usa el método descrito en el ejemplo 8.
; -»,«-»...*.»..* , ^ ^¿ La preparación de vacunas se describe generalmeníe en «Sv Vaccine Design ("The subun il and adjuvaní approach"(Powell M . F. y Newman M . J . eds.) ( 1 995) Plenum Press New York) . Las preparaciones de ampolla de la preseníe invención 5 se pueden complemeníar en la formu lación de vacu na de la invención . Adyuvantes adecuados incluyen u na sal de alum inio tal como gel de hidróxido de alumin io (alúmina) o fosfato de alum inio, pero pueden ser lambién u na sal de calcio (en parlicular carbonaío de calcio), hierro o zinc, o pueden ser una suspensión insoluble de 10 tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos catiónicameníe o aniónicamenle derivados, o polifosfazenos. Sistemas adyuvantes Th 1 adecuados q ue se pueden usar incluyen lípido A de monofosforilo, en particular lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado, y una combinación de lípido A de 15 monofosforilo, de preferencia lípido A de monofosforilo 3-des-O- acilado (3D-MPL) junto con una sal de alum inio. Un sistema mejorado incluye la combinación de un lípido A de monofosforilo y un derivado de saponina, en particular la combinación de QS21 y 3D-M PL, como se describe en el documento WO 94/001 53, o una 20 composición menos reaclogénica en donde el QS21 es exlinguido con colesíerol, como se describe en el documenlo WO 96/33739. Una formu lación de adyuvanle particularmente potente que incluye a QS21 3D-MPL y tocoferol en un aceite en emulsión acuosa, se describe en el documento WO95/1 721 0, y es u na formulación 25 preferida.
^AI^I^ La vacuna puede comprender una sapon ina, más preferiblemente QS21 . Puede comprender también un aceite en emulsión acuosa y íocoferol. Oligonucleótidos q ue contengan CpG sin metilar (véase documenío WO96/02555) , son también induclores preferenciales de una respuesla de TH 1 , y son lambién adecuados para su uso en la presente invención . La preparación de vacu nas de la presente invención se puede usar para proíeger o íralar a un mam ífero susceplible a infección , administrando dicha vacuna por vía sistémica o m ucosa. Estas adminislraciones pueden incluir inyección med ianíe las vías intramuscular, intraperiíoneal, infradérmica o subcufánea ; o medianíe adm in isíración mucosa a los íracíos oral/alimenlario, respiraíorio y geniíourinario. De esía manera, un aspecto de la presente invención es un mélodo para inmun izar a u n hospedero humano anfe una enfermedad causada por infección de una bacteria Gram negativa, cuyo método comprende administrar al hospedero una dosis inmu noprolecfora de la preparación de ampolla de la preseníe invención . La cantidad de antígeno en cada dosis de la vacuna se selecciona como u na caníidad que induce u na respuesla inmu noprolectora sin efectos secundarios adversos sig nificativos en vacunas íípicas. Dicha cantidad variará , dependiendo de qué inmunogéno específico se utiliza y cómo se presente. Por lo general, se espera que cada dosis comprenda 1 -1 00 µg de antígeno ia- . .... »J. ..... i ±?.i .AM-JA- »- — *~ de proteína, de preferencia 5-50 µg , y más típicameníe en la escala de 5-25 µg . Una caníidad óptima para una vacuna en particular se puede indagar mediante esíudios esíándar que impliquen observación de respuesías inmunes apropiadas en sujeíos.
Después de una vacunación inicial , los sujetos pueden recibir una o varias inmu nizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas. Vacunas de células eníeras faníasmas o desíruidas Los inveníores prevén que las mejoras aníeriores a las preparaciones y vacunas de ampollas, se pueden exíender fácilmenle hacia preparaciones y vacunas de células enleras fanlasmas o deslruidas (con veníajas idéníicas) . Las cepas Gram negaíivas modificadas de la invención de las cuales se obíienen las preparaciones de ampolla, se pueden usar lambién para oblener prepraciones de célu las enferas faníasma o destruidas. Métodos para obtener preparaciones fantasmas (células vacías con membranas intactas) a partir de cepas Gram negativas, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documenlo WO 92/01 791 ). Mélodos para destruir células enteras para obtener preparaciones de células inactivadas para su uso en vacunas, son también bien conocidos. Los términos "preparaciones de ampolla" y "vacu nas de ampolla" , así como también los procedimientos descritos a lo largo de esle documenlo, son por lo lanto aplicables a los términos "preparación fantasma" y "vacuna fantasma", y "preparación de célu las enteras destruidas" y "vacuna de células Sal » . . -* ..- . enleras desfruidas", respecíivamenle, para los propósilos de esía invención. Combinaciones de los méíodos a) - i) Se puede apreciar que u no o más de los procedimieníos anleriores se puede usar para producir una cepa modificada a paríir de la cual se pueden obíener preparaciones de ampolla mejoradas de la présenle invención . De preferencia , se usa uno de dichos procedimienlos, más preferiblemente dos o más (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9) de los procedimientos se usan para fabricar la vacuna de ampolla. Puesto que cada método adicional se usa en la fabricación de la vacuna de ampolla, cada mejora funciona en conjunto con los oíros méíodos usados para obíener una preparación de ampolla diseñada opíimizada . Una preparación de ampolla meningocóccica preferida (en parficular de N. meningitidis B), comprende el uso de los procedimieníos a) , b) , d) y/o e), y h) . Dichas preparaciones de ampolla son seguras (sin estrucíu ras similares a las esíruciuras del hospedero), no íóxicas y eslrucíuradas de modo que la respuesla inm une del hospedero será enfocada sobre altos niveles de antígenos prolectores (y de preferencia conservados) . Todos los elementos anteriores funcionan en conjunto para proveer una vacuna de ampolla optimizada . En forma similar para M. catarrhalis y H. influenzae no tipificable, las preparaciones de ampolla preferidas comprenden el uso de los procedimientos a) , b) y d) y/o e) .
- - « »» **• '• Oíro aspeclo de la invención es de esía manera una vacuna de célu las Gram negaíivas enteras fantasmas o destruidas de ampollas inmunoprotecíoras y no íóxicas, adecuadas para uso pediáírico. Por uso pediáírico se enfiende su uso en infantes de menos de 4 años de edad . Por inmu noprotectora se eníiende q ue por lo menos 40% (y de preferencia 50, 60, 70, 80, 90 y 1 00%) de los infaníes seroconvieríen (un incremenío de 4 veces la acíividad baclericida [la dilución de antisueros a la cual 50% de las baterías mueren -véase por ejemplo, el documenío PCT/EP98/051 1 7]) coníra una serie de cepas heíerólogas que se van a seleccionar de los grupos clónales principales conocidos. Para el meningococo B, eslas cepas deben lener un lipo PorA diferente de la cepa de producción de ampollas, y deben ser de preferencia 2 , 3, 4 ó, más preferiblemente, las 5 cepas H44/76, M97/252078, BZ1 0, NG P 1 65 y CU385. Para H. influenzae no íipificable, las cepas deben de ser de preferencia 2, 3, 4 ó, más preferiblemente, las 5 cepas 3224A, 321 9C, 3241 A, 640645 y A8401 77. Para M. catarrhalis, las cepas deben ser 2 , 3, 4 ó, más preferiblemente, las 5 cepas del No. de ATCC 4361 7, 14, 358, 21 6 y 2926. Por no tóxico se entiende que existe u na disminución sign ificativa (2 a 4 veces, de preferencia 1 0 veces) en la aclividad de endoíoxina, medida medianíe las pruebas bien conocidas de LAL y pirogenicidad .
Combinaciones de vacuna Olro aspecto de la invención, son combinaciones de vacuna que comprenden las preparaciones de ampolla de la invención con otros aníígenos que se usan veníajosameníe aníe cieríos esíados de enfermedad. Se ha enconlrado que las ampollas son parficularmeníe adecuadas para formulación con oíros anlígenos, ya que lienen venlajosamenle un efeclo adyuvanle sobre los antígenos con los que se mezclan. En una combinación preferida, las preparaciones de ampolla de meningococo B de la invención se formulan con 1 , 2, 3 ó, de preferencia, los 4 polisacáridos capsulares meningocóccicos siguientes que pueden ser simples o conjugados con un vehículo de proteína: A, C, Y o W. Dicha vacuna se puede usar veníajosameníe como una vacuna de meningococo global. Más que usar las preparaciones de ampolla de meningococo B de la invención, se prevé fambién que la formulación podría coníener en forma alternalíva preparaciones de ampolla de meningococo B de tipo silvestre de 2 ó más (de preferencia varias) cepas que pertenezcan a varios subtipos/seroíipos (por ejemplo, seleccionadas de P1 .15, p 1 .7, 16, P 1 .4 y P 1 .2) . En otra modalidad preferida, las preparaciones de ampolla de meningococo B de la invención [o la mezcla mencionada aníeriormenle de 2 ó más preparaciones de ampolla de meníngococo B de lipo silvestre], formuladas de preferencia con 1 , 2, 3 ó los 4 polisacáridos capsulares meningocóccicos simples o ^ ^& ^ conjugados A, C, Y o W, se formulan con un polisacárido capsular b de H. influenzae conjugado, y uno o más polisacáridos capsulares neumocóccicos simples o conjugados. En forma opcional, la vacuna puede comprender íambién uno o más antígenos de proteína que pueden proteger a un hospedero ante la infección por Streptococcus pneumoniae. Dicha vacuna se puede usar ventajosamente como una vacuna global para meningitis. Los antígenos de polisacárido capsular neumocóccico se seleccionan de preferencia de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (más preferiblemente de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Los antígenos de proleínas neumocóccicas preferidas, son aquellas profeínas neumocóccicas que están expuestas sobre la superficie exíerior de los neumococos (capaces de ser reconocidas por el sisíema inmune del hospedero duranle por lo menos paríe del ciclo de vida del neumococo), o son proteínas que son secretadas o liberadas por el neumococo. Más preferiblemente, la proteína es una loxina, adhesina, íransductor de señales de dos componentes, lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o fragmeníos de los mismos. Proíeínas paríicularmeníe preferidas incluyen, pero no están limitadas a: neumolisina (de preferencia destoxificada mediante traíamienío químico o mulación) [Mifchell el al. Nucleic Acids Res. 1990 julio 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae í ik í A types 1 and 2", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 enero 23; 1007(1): 67-72 "Expressíon of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties", véase documentos WO 98/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Patón et al) y WO 99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de deleción de transmembrana de la misma (véase documento US 5804193 - Briles et al.); PspC y variantes de deleción de íransmembrana de la misma (véase documenlo WO 97/09994 - Briles el al); PsaA y variantes de deleción de transmembrana de la misma (Berry y Patón, Infect Immun 1996 diciembre, 64 (12); 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putalive adhesín esseníial for virulence of Streptococcus pneumoniae"); profeínas de unión a colina neumocóccica y varianíes de deleción de íransmembrana de las mismas; CbpA y varianíes de deleción de íransmembrana de la misma (véase documenios WO 97/41151 y WO 99/51266); gliceraldehído-3-fosfafo-deshidrogenasa (Infecí. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (véase documenío WO 96/40928); PcpA (Sánchez-Beaío eí al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proíeína lípo M, soliciíud de paíeníe de SB No. EP 0837130; y adhesina 18627, solicitud de patenle de SB No. EP 0834568. Oíros aníígenos de proteína neumocóccica preferidos son aquellos descritos en el documento WO 98/18931, en particular aquellos seleccionados en los documenlos WO98/18930 y PCT/US99/30390. En otra modalidad preferida, las preparaciones de ampolla de Moraxella catarrhalis de la invención, se formulan con uno o más polisacáridos capsulares neumocóccicos simples o conj ugados, y uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedero ante la infección por H. influenzae no tifipicable. En forma opcional , la vacuna puede comprender también uno o más antígenos de proleína que pueden proíeger a un hospedero anfe la infección por Streptococcus pneumoniae. La vacuna puede comprender lambién opcionalmeníe uno o más anlígenos que pueden proíeger a u n hospedero ante RSV, y/o u no o más antígenos que pueden proíeger a un hospedero aníe el virus de influenza. Dicha vacuna se puede usar venlajosamenle como una vacuna de oíilis media global. Anlígenos de proíeína de H. influenzae no tipificables preferidos incluyen proteína fimbrina (véase documenío US 5766608) , y fusiones que comprenden péptidos de la misma (por ejemplo, fusión LBI) (véase documento US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, proíeína D, TbpA, TbpB, H ia, Hmwl, Hmw2, Hap y D 1 5. Antígenos preferidos de virus de influenza incluyen virus enteros, vivos o inactivados, virus de influenza bipartila desarrollados en huevos o células M DCK, o células Vero o virosomas de influenza enteros (como es descrito por R. Gluck, Vaccine, 1 992 , 1 0, 91 5-920) , o proteínas purificadas o recombinaníes de los mismos, íales como proíeínas HA, N P, NA o M , o combinaciones de las mismas.
L .* . i-ik?»á ,.k , ^*.JM.J Aníígenos de RSV (virus sincicial respiralorio) preferidos incluyen la glucoproíeína F, la glucoproíeína G, la profeína H N , o derivados de las mimas. En otra modalidad preferida , las preparaciones de 5 ampolla de H. influenzae no tipificable de la invención se formulan con u no o más polisacáridos capsulares neumocóccicos simples o conjugados, y uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedero ante la infección por M. catarrhalis. En forma opcional, la vacuna puede comprender también uno o más antígenos de 0 proíeína que pueden proleger a un hospedero aníe la infección por Streptococcus pneumoniae. La vacuna puede comprender fambién opcionalmeníe uno o más antígenos que pueden proleger a un hospedero aníe RSV, y/o uno o más aníígenos q ue pueden proíeger a u n hospedero anle el virus de influenza. Dicha vacuna se puede 5 usar ventajosamente como u na vacuna de otiíis media g lobal. Secuencias de nucleóíidos de la ¡nvención Oíro aspeclo de la invención se refiere a la provisión de nuevas secuencias de nucleótidos q ue se pueden usar en los procedimientos de la invención . Se proveen reg iones específicas 0 hacia el extremo 5' de varios genes de varias cepas q ue se pueden usar, por ejemplo, en los procedimientos a) , b) , d) y h) . Además, se proveen regiones de codificación para llevar a cabo el procedimiento d). uíálMmé .... .. .. , . A .., ..A.t . . ...j«afe i i Méíodo general para el análisis de la región de flangueo de no codificación de un gen bacteriano, v su explotación para la expresión modulada del gen en ampollas Las regiones de flanqueo de no codificación de un gen específico contienen elementos regu ladores imporíanfes en la expresión del gen . Esía regulación ocu rre a n ivel de franscripción y íraduccíón . La secuencia de eslas regiones, ya sea hacia el exíremo 5' o hacia el exlremo 3' del marco de lecíura abierto del gen , se puede obtener medianle secuenciación de ADN . La información de esla secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales tales como diferenles elemenlos de promoíor, secuencias de íermínador, elemeníos de secuencia inducibles, represores, elemeníos responsables de variación de fase, la secuencia de Sh ine-Dalgarno, regiones con estrucíura secundaria potencial que iníerviene en regulación , así como íambién oíros íipos de motivos o secuencias regu ladores. La información de esta secuencia permite la modulación de la expresión naíural del gen en cueslión . La sobrerregulación de la expresión del gen se puede lograr allerando el promolor, la secuencia de Shine-Dalgarno, elemeníos de operador o represor polenciales, o cualquier olro elemento involucrado. En forma similar, la subreg ulación de la expresión se puede llevar a cabo mediante íipos sim ilares de modificaciones. En forma alternativa, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen se puede poner bajo el control de la variación de fase, o se - -*• • » * puede desacoplar de esta regulación. En otra alternativa, la expresión del gen se puede poner bajo el control de u no o más elemeníos inducibles, que permitan la expresión reg ulada. Ejemplos de dicha reg ulación incluyen , pero no están limííados a, inducción por cambio de lemperatura , adición de subslraíos ind uclores íales como carbohidraíos seleccionados o sus derivados, elementos traza, viíaminas, cofaclores, iones meíálicos, ele. Dichas modificaciones como se describieron anteriormenle se pueden inlroducir mediante varios medios distiníos. La modificación de las secuencias que intervienen en la expresión de genes se puede lograr in vivo medíante muíagénesis aleatoria seguida de selección para el fenotipo deseado. Oíro procedimienío consisíe en aislar la reg ión de inferes, y modificarla medianíe muíagénesis aleaíoria, o reemplazo dirigido a siíio, insereción o mutagénesis por deleción . La reg ión mod ificada se puede reintrod ucir entonces en el genoma bacteriano medianíe recombinación homologa, y se puede evaluar el efecto de la expresión del gen . En otro procedimienlo, se puede usar el conocimiento de la secuencia de la región de interés para reemplazar o eliminar todas las secuencias reguladoras naturales, o parte de las mismas. En esíe caso, la región reguladora dirigida es aislada y mod ificada para que coníenga los elemeníos reguladores de oíro gen , una combinación de elemeníos reg uladores de difereníes genes, u na región reguladora síníélica , o cualqu ier olra región reg uladora, o para eliminar partes seleccionadas de la secuencia reguladora de tipo silveslre. Estas secuencias modificadas se pueden reintroducir entonces en la bacteria mediante recombinación homologa en el genoma. En el procedimienío b), por ejemplo, la expresión de un gen se puede modular inlercambiando su promotor con un promotor más fuerte (aislando la secuencia del gen hacia el extremo 5', modificación de esta secuencia in vitro, y reintroducción en el genoma medianíe recombinación homologa). Se puede oblener expresión sobrerregulada fanlo en la bacteria como en las vesículas de membrana exterior liberadas (o preparadas) de la bacíeria. En oíros ejemplos preferidos, los procedimieníos descriíos se pueden usar para generar cierías bacíerias recombinantes con caracterísficas mejoradas para aplicación en vacunas, como se describió aníeriormente. Esfas pueden ser, pero no están limitadas a, cepas aíenuadas, cepas con expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas con expresión deprimida (o expresión disminuida) de genes que interfieren con la respuesía inmune, y cepas con expresión modulada de proíeínas inmunodominaníes. SEQ I D NO: 2-23, 25, 27-38 son secuencias de Neisseria hacia el exíremo 5' (hacia el exíremo 5' del codón de inicio de varios genes preferidos), que comprenden cada una aproximadameníe 1000 pares de bases. SEQ ID NO: 39-62 son secuencias de M. catarrhalis hacia el exíremo 5' (hacia el exíremo 5' del codón de inicio de varios genes preferidos) que comprenden cada una aproximadamente 1 000 pares de bases. SEQ I D NO : 63- 75 son secuencias de H. influenzae hacia el extremo 5' (hacia el exíremo 5' del codón de inicio de varios genes preferidos) que comprenden cada una aproximadamente 1 000 pares de bases. 5 Todas estas secuencias se pueden usar en métodos genélicos (en particular recombinación homologa) para sobrerreg ulación , o subregulación de marcos de lectura abiertos con los cuales se asocian (como se describió anteriormente). SEQ ID NO: 76-81 son las regiones de codificación para los genes HtrB y MsbB de 10 Neisseria, M. catarrhalis y Haemophilus influenzae. Esías secuencias se pueden usar en métodos genéticos (en particular recombinación homologa) para subreg ular (en particular eliminar) paríe (de preferencia todos) de estos genes [procedimienlo d)]. Olro aspeclo de la invención es de esta manera una 15 secuencia de polin ucleótidos aislada q ue h ibrida bajo condiciones altamente severas, con por lo menos una porción de 30 nucleótidos de los nucleótidos de SEQ ID NO: 2-23, 25, 27-81 , o una cadena complemenfaria de los mismos. De preferencia, la secuencia aislada debe ser bástanle larga para llevar a cabo recombinación 20 homologa con la secuencia cromosómica si forma parte de un vecíor adecuado - a saber, por lo menos 30 nucleótidos (de preferencia por lo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 500 nucleótidos) . Más preferiblemente, el polin ucleótido aislado debe comprender por lo menos 30 nucleólidos (de preferencia por 25 lo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1 00 , 200, 300 , 400 ó 500 &eícaaílM nucleótidos) de SEQ I D NO: 2-23, 25, 27-81 , o una cadena complementaria de los mismos. Como se usa en la preseníe, condiciones de hibridación allamenle severas incluyen , por ejemplo, 6X de SSC , 5X de solución de Denhardí, SDS a 0.5% y 1 00 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmeníado y desnaíuralizado e hibridado duraníe la noche a 65°C y lavado en 2X de SSC , SDS a 0.1 % una vez a íemperafu ra ambienle du raníe aproximadamenle 1 0 minulos, segu ido por una vez a 65°C d urante aproximadamente 1 5 minuíos, seguido cuando menos por un lavado en 0.2X de SSC, SDS a 0.1 % a íemperalura ambieníe d uranle por lo menos 3 a 5 minutos. Otro aspecto es el uso de las secuencias de polin ucleótidos aisladas de la invención para llevar a cabo un evenlo de ingeniería genélica (íal como inserción de íransposones o deleción o mulación específica de sitio, pero de preferencia un evento de recombinación homologa) dentro de 1 000 pares de bases hacia el extremo 5' de u n gen cromosómico de bacterias Gram negalivas para aumenlar o dismin uir la expresión del gen . De preferencia , la cepa en la cual el evenfo de recombinación se lleva a cabo es la misma cepa de la cual se obíuvieron las secuencias de la invención hacia el exíremo 5'. Sin embargo, los genomas de los meningococos A, B, C, Y e W y de los gonococos, son suficienlemeníe similares, que la secuencia hacia el exíremo 5' de cualquiera de esías cepas puede ser adecuada para diseñar veclores para llevar a cabo dichos evenlos en oirás cepas. Este puede ser lambién el caso para Haemophilus influenzae y Haemophilus influenzae no tipificable. EJEMPLOS Los ejemplos sig uientes se llevan a cabo usando 5 técnicas estándar, las cuales son bien conocidas y de rutina para los experlos en la íécnica , excepío en donde de oíra manera se describen en deíalle. Los ejemplos son ilusíralivos, pero no limiían la invención . EJ EMPLO 1 10 Construcción de una cepa del seroqrupo B de Neisseria meninaitidis que carece de pol isacáridos capsulares El plásmido pMF121 (Frosch et al. , 1990) se ha usado para constru ir u na cepa B de Neisseria meningitidis que carece del polisacárido capsular. Esle plásm ido conliene las regiones de 15 flanqueo del locus del gen que codifica para la vía de biosíníesis del polisacárido del grupo B (B PS) y el gen de resistencia a eritrom icina . La deleción de B PS dio como resulíado pérdida de expresión del polisacárido capsular del grupo B, así como fambién u na deleción en la copia acíiva de galE que lleva a la síníesis de 20 LPS deficienle en galactosa. Transformación de cepas La cepa B H44/76 de Neisseria meningitidis (B: 15:P1 .7, 1 6; Los 3, 7, 9) se seleccionó para transformación . Después de incubación en CO2 d urante la noche sobre placa MH (sin 25 eritromicina), las células fueron recogidas en MH líquido que conlenía MgCI2 a 1 0 mM (se usaron 2 m l por placa de MH), y se diluyeron hasla una DO de 0.1 (550 nm) . A esla solución de 2 ml, se añadieron 4 µl de la solución de abaslecimiento del plásmido PM F1 21 (0.5 µg/ml) du rante u n período de incubación de 6 horas a 37°C (con agitación) . Se obtuvo u n grupo conlrol con la misma caníidad de Neisseria meningitidis, pero sin ad ición de plásm ido. Después del período de incubación , se colocaron 1 00 µl de cu líivo, lal como diluciones 1 /1 0, 1 /1 00 y 1 /1 000 en placas MH que contenían 5, 1 0, 20, 40 u 80 µg de eritrom icina/ml anles de la incubación durante 48 horas a 37°C . Transferencia de colonias Después de la incubación en placa, se desarrollaron 20 colonias, y se seleccionaron de las placas de MH que contenían 10 y 20 µg de eritrom icina/m l, mienlras no hubo desarrollo de colonias en el grupo conírol sin transformación por plásm idos. La cepa de tipo silvesíre H44/76 fue incapaz de crecer en las placas de erilromicina seleccionadas (10 a 80 µg de eriíromicina/ml). Al día sigu ieníe, íodas las colonias visibles fueron colocadas en nuevas placas de MH sin eritromicina para que crecieran. Después, fueron transferidas sobre hojas de nitrocelulosa (transferencia de colon ias) para detecíar la presencia de polisacárido B. En resumen, las colonias fueron transferidas sobre una hoja de nitrocelulosa, y enj uagadas directamente en PBS/Tween 20 a 0.05% antes de la inacfivación de las células duranle 1 hora a 56°C en PBS-Tween 20 a 0.05% (regulador de pH diluyenle) . Después, la membrana fue -c » ' j_ sobrepuesía du ranfe 1 hora en el regulador de pH diluyeníe a íemperaíu ra ambieníe. Después, las hojas fueron lavadas de nuevo 3 veces duraníe 5 min uíos en el regulador de pH diluyenle aníes de incubación con el Mab 735 anti-B PS (Boerhinger) diluido a 1 /3000 en el reg ulador de pH diluyeníe duraníe 2 horas a lemperaíura ambíeníe . Después de un nuevo paso de lavado (3 veces 5 min ulos), el aníicuerpo monoclonal fue delecíado con una Ig anli-ralón bioíinilada de Amersham (RPN 1 001 ) d ilu ida 500 veces en el regulador de pH diluyenle (u na hora a lemperatura ambiente) antes del sig uiente paso de lavado (como se describió anteriormente) . Después, las hojas fueron incubadas du rante 1 hora a temperatura ambiente con una solución de complejo de estreplavidina-peroxidasa dilu ida 1 /1 000 en el regulador de pH diluyente. Después de los ú ltimos íres pasos de lavado usando el mismo méíodo, se incubaron hojas de niírocelu losa duranle 15 min ulos en la oscuridad usando la solución de revelación (30 mg de solución de 4-cloro-1 -naftol en 1 0 ml de metanol más 40 ml de PBS y 30 mcl de H2O2 a 37% , de Merck) . La reacción se deluvo con un paso de lavado en ag ua desfilada. ELISA de células enteras Se llevó a cabo también ELISA de célu las enteras usando las dos colonias transformadas ("D" y "R") y la cepa de tipo silvestre (H44/76) como bacíerias reveslidas (20 µg de proíeína/ml), y u na serie de difereníes anficuerpos monoclonales usados para caracterizar las cepas de Neisseria meningitidis. Se pusieron a J-L prueba los siguienles Mabs: anti-B PS (735 de Dr Frosch), y los otros Mabs de NIBSC: anti-B PS (Ref 95/750), aníi-P1.7 (A-PorA, Ref 4025), aníi-P1.16 (A-PorA, Ref 95/720), anli-Los 3,7,9 (A-LPS, Ref 4047), aníí-Los 8 (A-LPS, Ref 4048) y anti-P1.2 (A-PorA Ref 95/696). Se revistieron placas de microlílulo (Maxisorp, Nunc) con 100 µl de la solución de células B meningocóccicas recombinanles duranle la noche (ON) a 37°C alrededor de 20 µg/ml en PBS. Después, las placas fueron lavadas 3 veces con 300 µl de NaCI a 150 mM - Tween 20 a 0.05%, y fueron sobrepuestas con 100 µl de PBS-caseína a 0.3% e incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron de nuevo usando el mismo procedimiento aníes de la incubación con anlicuerpos. Se usaron anlicuerpos monoclonales (100 µl) a diferentes diluciones (como se muestra en la figura 2) en PBS-caseína a 0.3% - Tween 20 a 0.05%, y se colocaron sobre las microplacas antes de su incubación a temperaíura ambieníe durante 30 minutos con agiíación, aníes del siguieníe paso de lavado idéníico. Se añadieron a las cavidades 100 µl de la Ig aníi-raíón (de conejo, Dakopaíls E0413) conjugada con bioíina y diluida a 1/2000 en PBS-caseína a 0.3% - Tween 20 a 0.05%, para delecíar aníicuerpos monoclonales unidos. Después del paso de lavado (como se indicó aníeriormenfe), las placas fueron incubadas con una solución de complejo de eslrepíavidina-peroxidasa (100 µl de RPN 1051 de Amersham) diluido a 1/4000 en la misma solución de ,áM írabajo d uraníe 30 minutos a temperalura ambiente bajo condiciones de agiíación . Después de esía incubación y el último paso de lavado, las placas fueron incubadas en 1 00 µl de la solución de cromógeno (4 mg de ortofenilend iamina (OPD) en 1 0 ml de regu lador de pH de cítrato a 0.1 M , pH 4.5 con 5 µl de H2O2) d urante 1 5 minutos en oscuridad . Las placas se leen entonces a 490/620 nm usando un espectrofotómetro. Resultados La figura 1 muestra que de las 20 colon ias aisladas, las cuales fueron capaces de crecer en el medio seleccionado con eritrom icina, se mostró que sólo dos colonias ("D" y "R") fueron negativas para la presencia de polisacárido B. Entre las otras, 1 6 fueron claramente positivas para B PS, y aún resistenfes a eriíromicina. Esíe indicó que iníegraron el plásmido en su genoma, pero en la orienlación errónea, manteniendo inlacío el gen de B PS y LPS (sin entrecruzamienlo doble) . Conlroles posiíivos y negalivos fueron íambién puesíos a prueba en las placas, y moslraron que la cepa H44/76 de Nm B de íipo silveslre fue clarameníe posiíiva para el polisacárido B , mienlras que las cepas de men ingococo A (A1 ) y meningococo C (C 1 1 ) fueron claramente negativas con esle Mab 735 anfi-B PS . Estos resultados indican que aproximadamenle 1 0% de las colon ias seleccionadas integraron correclamente el plásmido en su genoma haciendo un entrecruzamiento doble, mientras que las oirás cepas/colonias se obiuvieron después de un *- - t ^ £gg j&g enlrecruzamiento simple, maníeníendo los genes de B PS y LPS intaclos y expresados. Usando ELISA de células enteras, los resultados (figura 2 y el cuadro siguiente) indican claramenle que los dos transformanles "D" y "R" (derivados de las colonias D y R) no pueden ser reconocidos por los Mabs anti-B PS (735 y 95/759), ni por los Mabs anli-Los 3,7,9 y anti-Los 8. Sin embargo, cuando se usan Mabs anli-PorA específicos, existe una clara reacción con los Mabs anti-P1.7 y aníi-P1.16 en las células, como se observa también en la cepa de tipo silveslre. Ninguna reacción se observó con un Mab anti-PorA no específico (Mab anli-P1.2). Estos resultados confirman que la proteína PorA, y específicamenle los epítopes P1.7 y P1.16 están aún preseníes después de la transformación, pero no así los epílopes Los 3,7,9 y Los 8 (LPS) y el polisacárido B. -.afea».. . i.
CUADRO •" Carácter específico de los anticuerpos monoclonales puestos a prueba 10 15 20 EJEMPLO 2 Construcción de vectores versátiles de li beración de genes (serie pCMK) que dirigen la integración en el locus de porA de Neisseria meningitidis Se construyó un plásmido que permite recombinación 25 homologa e integración estable de ADN introducido en el locus de porA de Neisseria meningitidis. Este vector de liberación (genes, í i operones y/o cassetíes de expresión) es úíil para consíruir cepas de Neisseria meningitidis que prod ucen ampollas recombinanfes mejoradas. Típicamente, dicho vector contiene por lo menos: ( 1 ) una eslrucíura de base de plásmido replicativa en E. coli, pero no en Neisseria meningitidis (un plásmido suicida), (2) por lo menos una, pero de preferencia dos regiones de homolog ía para dirig ir la integración en un locus cromosómico lal como porA, (3) señales de íranscripción (promolor, región regu ladora y terminador) y de traducción (sitio de unión a ribosomas y codón de inicio optim izados) eficientes funcionales en Neisseria meningitidis, (4) un sitio de clonación mú lliple, y (5) genes seleccionables que permiíen el manlen imienfo del plásmido en E. coli, y la selección de iníeg raníes en Neisseria meningitidis. Oíros elemeníos incluyen , por ejemplo, secuencias de capíación para faciliíar la enírada de ADN inlrod ucido en Neisseria meningitidis, y marcadores coníraseleccionables íales como sacB, rpsL, gltS para mejorar la frecuencia de eventos de entrecruzamienfo doble. Un dibujo esquemático del vector consíruido en esle ejemplo y designado como pCMK se représenla en la figu ra 3. Su secuencia de n ucleólidos completa correspond iente se m uestra en SEQ . I D NO: 1 . PCM K deriva de u na estruciura de base de pSL1 1 80 (PharmaciaBiolech , Suecia) , un plásmido de alto n úmero de copias replicativo en E. coli, que aloja el gen bla (y confiriendo de esla manera resisíencia a ampicilina). Además de esto, pCMK contiene funcionalmente dos regiones de flaqueo porA (porA5' y porA3' que contienen un terminador de íranscripción) necesarias para recombinación homologa, un marcador seleccionable que confiere resistencia a kanamicina, dos secuencias de captación, un promotor quimérico porA/lacO reprimido en E. coli se expresa laclq, pero transcripcionalmenle activo en Neisseria meningitidis, y un sitio de clonación múltiple (5 siíios présenles: ?/del, Kpnl, Nhe\, PinA? y SphX) necesario para la inserción de ADN inlroducído en pCMK. Se construyó PCMK de la manera siguiente: las regiones recombinogénicas porAS' y porA3' y el promotor porA/lacO fueron amplificados mediante PCR usando los oligonucleóíidos indicados en el cuadro siguienle, clonados en pTOPO y secuenciados. Esíos fragmentos de ADN fueron separados sucesivamente de pTOPO y reclonados en pSL1 180. El cassetle de resistencia a kanamicina fue separado de pUC4K (PharmaciaBioíech, Suecia), y fue inlroducido enire la región de flanqueo porA5' y la región de promotor porA/lacO. . tmti ktoa. . t i .
CUADRO Oligonucleótidos usados en este estudio i .
EJEMPLO 3 Construcción de una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis gue carece de polisacáridos capsulares y el antígeno inmunodom inante principal PorA 5 La modulación del contenido antigénico de las ampollas de membrana exíerior puede ser venlajosa para mejorar su segu ridad y eficacia en su uso en vacunas, o usos íerapéuíicos o de diagnósíico. Se deben retirar componentes íales como los polisacáridos capsulares del serogrupo B de Neisseria meningitidis 0 para elim inar el riesgo de inducir aufoinmunidad (véase ejemplo 1 ) . En forma similar, es benéfico suprimir la inm unodominancia de los aníígenos de membrana exíeríor principales lales como PorA, los cuales inducen aníicuerpos bacíericidas específicos de la cepa, pero no pueden conferir prolección cruzada . Para ilustrar dicho 5 procedimiento, se usó el vector pCM K(+) para conslru ir una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis que carece de polisacáridos capsulares y el antígeno de proteína de membrana exterior PorA inmunodominante. Para esíe propósiío, se inírodujo una deleción del gen porA en la cepa H44/76 como se describe en 0 el ejemplo 1 , medianfe recombinación homologa. La cepa cps- H44/76 se preparó competente, y se transformó con 2 µg de ADN de plásm ido pCM K(+) superenrrollado como se describió anleriormenle. Se deposilaron en placas fracciones alícuoías de la mezcla de íransformación (1 00 µl) sobre 5 placas de Mueller-H inton complementadas con kanamicina (200 µg/ml) , y se incubaron a 37°C durante 24 a 48 horas. Las colonias resistentes a kanamicina se seleccionaron , se volvieron a sembrar por estría sobre MH-Kn , y se desarrollaron durante otras 24 horas a 37°C. En esta etapa, la mitad del cultivo de baclerias se usó para preparar maíeriales de abasíecimiento de g licerol (1 5% en vol./vol.), y se manfuvo congelado a -70°C. Se resuspendió olra fracción (calculada en 1 08 baclerias) en 1 5 µl de ag ua desfilada, se hirvió durante 1 0 m inutos y se usó como molde para selección mediante PCR. Los iniciadores infernos de porA, a saber, PPA1 y PPA2, se sinletizaron y se usaron para llevar a cabo amplificación mediante PC R en los Usados bacterianos hervidos en las condiciones descritas por el proveedor (ADN polimerasa HíFi, Boehringer Mannheim , GmbH) . La ciclización íérmíca usada fue la siguiente: 25 veces (94°C 1 minuto, 52°C 1 min uío, 72°C 3 minuto) y 1 vez (72°C 1 0 minutos, 4°C hasla recuperación) . Pueslo que un enírecruzamiento doble entre el ADN de pCM K y el locus de porA cromosómico elimina la región que se requiere para la unión de #1 y #2, los clones q ue carecen de un fragmento de amplificación de PCR de 1 1 70 pares de bases se seleccionaron como m utantes de deleción de porA. Estos resultados de PCR se confirmaron además analizando en paralelo la presencia de PorA en los extractos de proteínas bacterianas correspondientes. Para este propósilo, se resuspendió otra alícuota de bacíerias (calculada en 5.1 08 bacterias) en 50 µl de reg ulador de pH de PAGE-SDS (SDS a 5% , glicerol a 30%, Beta-mercapíoelanol a 15%, 0.3 mg/ml de azul de i i j . bromofenol, Tris-HCl a 250 mM , pH 6.8), se hirvió ( 1 00°C) , se congeló (-20°C)/se h irvió ( 1 00°C) 3 veces, y se separó medianíe eleclrofóresis de PAGE-SDS sobre un gel a 12.5%. Los geles fueron teñidos entonces medianíe azul brillante R250 de Coomassie, o transferidos a una membrana de n itrocelulosa y sondeados con un aníicuerpo monoclonal aníi-PorA como se describe en Maniaíis eí al. Como se represenía en la figu ra 4, la tinción de Coomassíe e immunoblot confirmaron que los clones negaíivos a PCR porA, no producen niveles delecíables de PorA. Este resultado confirma que el vector PCM K es fu ncional y se puede usar con éxito para dirigir la inserción de ADN en el gen porA, suprimiendo concomitantemente la producción del antígeno de proteína de membrana exterior PorA. EJEMPLO 4 Sobrerregulación de la pro ducción de proteína de membrana exterior NspA en ampollas d erivadas de una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis recombinante gue carece de genes porA v cps funcionales En enriq uecimiento de las vesículas de ampollas con antígenos protectores, es veníajoso para mejorar la eficiencia y la coberíura de las vacunas basadas en proíeínas de membrana exterior. En dicho contexlo, se diseñaron cepas de Neisseria meningitidis recombinaníes que carecen de los genes fu ncionales cps y porA, de modo que el nivel de expresión de la proteína de membrana exterior NspA fuera sobrerregulado. Para dicho propósilo, el gen que codifica para NspA fue amplificado medianle PCR usando los oligonucleótidos iniciadores N01 -full-?/del y ?/del-3' (véase cuadro del ejemplo 2) . Las condiciones usadas para la amplificación mediante PCR fueron las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi , Boehringer Mann heim , GmbH) . La ciclización térm ica realizada fue la sig uiente: 25 veces (94°C 1 minuto, 52°C 1 minulo, 72°C 3 minutos) , y 1 vez (72°C 1 0 minutos, 4°C hasta recuperación) . El amplicón correspondiente fue digerido con Ndel, e inserlado en el sifio de resíricción Nde\ del veclor de liberación pCMK(+) . Se verificó la orientación de la inserción , y los plásmidos recombinantes, designados como pCM K(+)-NspA, fueron purificados a gran escala usando el equipo de maxipreparaciones QIAGEN , y se usaron 2 µg de este material para transformar una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis que carece de genes cps funcionales (la cepa descriía en el ejemplo 1 ). Se seleccionaron la iníeg ración que resulla de u n entrecruzamienlo doble entre el vector pCMK(+)-NspA y el locus porA cromosómico, usando una combinación de proced imienlos de selección Western blot y PCR presentados en el ejemplo 3. Las bacterias (que corresponden a aproximadameníe 5.1 08 bacterias) fueron resuspendidas en 50 µl de regulador de pH de PAG E-SDS, congeladas (-20°C)/hervidas (1 00°C) tres veces, y fueron separadas entonces mediante electrofóresis de PAGE-SDS sobre un gel a 1 2.5% . Los geles fueron leñidos entonces mediante azul brillante R250 de Coomassie, o transferidos a una membrana _Lá, de nilrocelu losa, y sondeados con u n suero policlonal aníi-NspA. La linción de Coomassie (daíos no moslrados) y de immunobloí (véase figura 4), confirmó que los clones negativos a PCT porA, no producen niveles deteclables de PorA. La expresión de NspA se examinó en Usados bacferianos de células enteras (WCBL) o preparaciones de ampolla de membrana exterior derivadas de NmB [cps-, porA-] o NmB [cps-, porA-, Nspa+]. Aunque no se observó diferencia alguna mediante tinción de Coomassie, el immunobloting con el suero policlonal aníi-NspA, permitió detecíar un incremenío de 3 a 5 veces la expresión de NspA (con respecto al nivel de NspA endógeno) , tanío en WCBL como en preparaciones de ampolla de membrana exterior (véase figura 5). Este resulíado confirma que el veclor pCMK(+)-NspA es funcional, y se puede usar con éxito para sobrerregular la expresión de proteínas de membrana exíerior tales como NspA, suprimiendo concomitaníemeníe la prod ucción del anlígeno de proteína de membrana exterior PorA. EJEMPLO 5 Sobrerregulación del antígeno de proteína de mem brana exterior D1 5/Omp85 en am pol las derivadas de una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis recombinante gue carece de genes cps funcionales, pero gue expresa PorA Cierías poblaciones humanas aisladas geográficamenle (lales como Cuba) son infecíadas por un número limilado de aislados de Neisseria meningitidis que perlenecen principalmenle a ^SI^iM?u í^ uno o unos cuaníos serolipos de proíeína de membrana exíerior. Puesío que porA es un aníígeno de profeína de membrana exferíor principal q ue induce aníicuerpos bactericidas específicos de la cepa y protectores, es eníonces posible conferir protección mediante vacunas usando un n úmero limitado de seroíipos de PorA en una vacu na . En dicho coníexío, la presencia de PorA en vesículas de membrana exlerior puede ser venlajosa, reforzando la eficacia de la vacu na de dichas ampollas mejoradas recombinantes. Sin embargo, d ichas vacunas que contienen PorA se pueden mejorar aún más aumenlando el nivel de oirás OM Ps de reacción cruzada , íales como Omp85/D 1 5. En el sig uiente ejemplo, se usó el vector pCMK(+) para sobrerregular la expresión del antígeno de proíeína de membrana exleríor Omp85/D 1 5 en una cepa que carece de genes cps funcionales, pero que expresan PorA. Para dicho propósifo, el gen que codifica para Omp85/D 1 5 fue amplificado mediante PCR usando los oligonucleótidos iniciadores D 1 5-?/del y D 1 5-?/orl. Las condiciones usadas para amplificación mediante PCR fueron las descrilas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim , GmbH). La ciclización lérmica realizada fue la sig uieníe: 25 veces (94°C 1 minulo, 52°C 1 minuto, 72°C 3 minutos), y 1 vez (72°C 1 0 min ulos, 4°C hasla recuperación) . El amplicón correspondiente fue insertado en el vector de clonación pTOPO de acuerdo a las especificaciones del fabricante, y se llevó a cabo secuenciación confirmatoria . Este fragmento de ADN de Omp85/D1 5 fue separado de pTOPO medianle hidrólisis de restricción usando Nde\/Nsi\ , y clonado subsecuentemeníe en los sitios de restricción correspondieníes del vector de liberación pCMK(+). Los plásmidos recombinantes, designados como pCM K(+)-D 1 5, fueron purificados 5 a gran escala usando el equipo de maxipreparaciones Q IAGEN , y se usaron 2 µg de este material para íransformar u na cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis que carece de genes cps funcionales (la cepa descrita en el ejemplo 1 ) . Para preservar la expresión de PorA, se seleccionó la integración que resulta de un 10 enlrecruzamienlo simple (en Omp85/D 1 5 o en porA) , med iante u na combinación de procedimientos de selección Weslern blot y PCR. Los clones resistentes a kanamicina que probaron ser positivos medianle Weslern blof y PCR específica de porA, fueron almacenados a -70°C como materiales de abastecimienío de 15 glicerol, y se usaron para otros estudios. Las bacíerias (que corresponden a aproximadamente 5.1 08 bacterias) fueron resuspendidas en 50 µl de regulador de pH de PAGE-SDS, congeladas (-20°C)/hervidas (100°C) tres veces, y fueron separadas entonces mediante electrofóresis de PAG E-SDS 20 sobre u n gel a 12.5% . Los geles fueron teñ idos entonces mediante azu l brillante R250 de Coomassie, o transferidos a una membrana de nitrocelu losa, y sondeados con un anticuerpo monoclonal anti- porA. Como se representa en la figura 6, la tinción de Coomassie e immu noblot perm itió confirmar que los clones positivos a PCR porA 25 producen PorA. tt^^^dj^AAj Se examinó la expresión de D15 usando preparaciones de ampolla de membrana exterior derivadas de NmB [cps-, porA-] o NmB [cps-, porA+, D15+]. La íinción de Coomassie permiíió delecíar un aumenlo significalivo en la expresión de D15 (con respecío al nivel de D15 endógena) (véase figura 6). Este resultado confirmó que el vector pCMK(+)-D15 es funcional, y se puede usar con éxito para sobrerregular la expresión de proteínas de membrana exlerior tales como D15, sin suprimir la producción del antígeno de proíeína de membrana exíerior PorA principal. EJEMPLO 6 Construcción de vectores versátiles de liberación del promotor Razón fundamental La razón fundamental de este procedimiento se representa en la figura 7, y se puede resumir en 7 pasos esenciales. Algunos de estos pasos se Musirán a continuación, en donde la construcción del vecíor sobrerregula la expresión de NspA y D15/Omp85. Vector para sobrerregular la expresión del gen de NspA Paso 1. Se descubrió una región de ADN (997 pares de bases) localizada hacia el extremo 5' del gen de codificación de NspA (SEQ. ID NO: 2) en la base de datos privada Incyte PalhoSeq que contiene secuencias de ADN genómico no acabadas de la cepa de Neisseria meningitidis número de ATCC 13090. Dos oligonucleótidos iniciadores referidos como PNSI y PNS2 (véase cuadro del ejemplo 2) fueron designados usando esta secuencia, y se sinfelizaron . Estos iniciadores se usaron para amplificación mediante PCR usando ADN genómico extraído de la cepa H44/76. Paso 2. Los amplicones correspondieníes fueron depurados usando el equipo de PCR Wizard (Promega, USA) y sometidos a digestión con las enzimas de restricción EcoR\/Xba\ duranle 24 horas, usando las cond iciones descriías por el proveedor (Boehringer Mann heim , Alemania) . Los fragmeníos de ADN correspond ientes fueron purificados en gel, e insertados en los sitios correspond ieníes del vector de clonación pUC 1 8. Paso 3. Se prepararon a gran escala plásmidos recombinantes, y se usó una fracción en alícuotas como molde para amplificación med iante PCR inversa. Se llevó a cabo PCR inversa usando los oligonucleótidos PNS4 y PNS5 usando las sigu ientes cond iciones de ciclización térmica: 25 veces (94°C 1 minuío, 50°C 1 minuío, 72°C 3 minulos) y 1 vez (72°C 1 0 minutos, 4°C hasta recuperación). Se obtuvieron vectores pUC 1 8 linealízados que alojan una deleción en la región hacia el exlremo 5' de NspA. Vector para sobrerregular la expresión del gen de D1 5/omp85 Paso 1 . Se descubrió una reg ión de ADN (1 000 pares de bases) localizada hacia el extremo 5' del gen de codificación de D 1 5/omp85 (SEQ . I D NO: 3) en la base de datos privada Incyte PathoSeq que contiene secuencias de ADN genómico no acabadas de la cepa de Neisseria meningitidis número de ATCC 1 3090. Dos oligonucleóíidos iniciadores referidos como PromD1 5-51 X i i PromD1 5-S2 (véase cuadro del ejemplo 2) fueron designados usando esta secuencia, y se sintelizaron . Estos iniciadores se usaron para amplificación mediante PCR usando ADN genómico extraído de la cepa H44/76. Paso 2. Los amplicones correspondientes fueron depurados usando el equipo de PCR Wizard (Promega , USA) y sometidos a digestión con las enzimas de reslricción EcoR\/Xba\ du raníe 24 horas, usando las condiciones descritas por el proveedor (Boehringer Mannheim , Alemania) . Los fragmentos de ADN correspondientes fueron purificados en gel, e insertados en los sitios correspondientes del veclor de clonación pUC 1 8. Paso 3. Se prepararon a gran escala plásmidos recombinantes, y se usó u na fracción en alícuotas como molde para amplificación medianíe PCR inversa . Se llevó a cabo PCR inversa usando los oligonucleóíidos D 1 5-S4 y D 1 5-S5 usando las siguientes cond iciones de ciclización térmica: 25 veces (94°C 1 m inuto, 50°C 1 minuío, 72°C 3 minuíos) y 1 vez (72°C 10 minuíos, 4°C hasía recuperación) . Se obtuvieron vectores pUC 1 8 linealizados que alojan u na deleción en la inserción región hacia el exlremo 5' de D1 5/omp85. EJ EMPLO 7 Procedim ientos de fermentación para produci r ampollas recom bi nantes Los ejemplos dados a continuación describen métodos para producir ampollas recombinanles q ue carecen de polisacáridos capsulares o polisacáridos capsulares y PorA. Dicho procedimiento se puede usar para un amplia gama de cepas recombinantes de Neisseria meningitidis, y se puede adaptar sobre una escala extendida. Medios de cultivo Se propagaron cepas del serogrupo B de Neisseria meningitidis en medios de cultivos sólidos (FN E 004 AA, FNE 010 AA) o líq uidos (FN E 008 AA). Estos nuevos medios para el desarrollo de meningococos están ventajosamente libres de productos animales, y son considerados como u n aspecto más de la invención .
Culíivo en matraz de ampollas recombinaníes eos- del serogrupo B de Neisseria meningitidis Este procedimiento se llevó a cabo en dos pasos que comprenden precu líivo en medio sólido seguido de cu ltivo líquido: , . . j j Precultivo sólido: Se retiró un maíraz de siembra del congelador (-80°C), se descongeló hasta temperafura ambiente, y se sembraron por estría 0.1 ml en una caja de Petri que contenía 15 ml de FNE004AA (véase anleriormente). La caja de Pelri se incubó a 37°C duranle 18 ± 2 horas. El crecimienío de superficie se resuspendió en 8 ml de FNE008AA (véase aníeriormente) complementado con 15 mg/l de erilromicina. Culíivo en matraz: Se añadieron 2 ml de precultivo sólido resuspendido, a un matraz de 2 litros que contenía 400 ml de FNE008AA complementado con 15 mg/l de eritromicina. El maíraz se colocó sobre una mesa de agiíación (200 rpm), y se incubó a 37°C duranle 16 ± 2 horas. Las células se separaron del caldo de culíivo medianle centrifugación a 5000g a 4°C durante 15 minutos. Cultivo en lotes de ampollas recombinantes eos- del serogrupo B de Neisseria meninaitidis Este procedimiento se llevó a cabo en tres pasos que comprenden precultivo en medio sólido, cultivo líquido y en lotes: Precultivo sólido: Se retiró un matraz de siembra del congelador (-80°C), se descongeló hasta temperatura ambiente, y se sembraron por estría 0.1 ml en una caja de Peíri que contenía 15 ml de FNE004AA (véase anteriormeníe). La caja de Peíri se incubó a 37°C duraníe 18 ± 2 horas. El crecimienío de superficie se resuspendió en 8 ml de FNE008AA (véase aníeriormeníe) complemeníado con 15 mg/l de eritromicina.
Preculíivo líguido: Se añadieron 2 ml de precullivo sólido resuspendido, a u n matraz de 2 litros que coníen ía 400 ml de FN E008AA complementado con 1 5 mg/l de eritromicina. El matraz se colocó sobre u na mesa de agitación (200 rpm) , y se incubó a 37°C durante 16 ± 2 horas. El contenido del matraz se usó para inocular el fermentador de 20 litros. Cultivo en lotes en el fermentador: se añad ió el inoculo (400 ml) a un fermentador preesterilizado de 20 litros (volumen toíal) que confenía 1 0 liíros de FN E008AA complemeníado con 1 5 mg/l de eriíromicina. El pH se ajusfó y se manluvo a 7.0 mediante la adición automaíizada de NaOH (25% en p/v) y H3PO4 (25% en v/v). La lemperatura se reguló a 37°C . La velocidad de aereación se mantuvo a 20 I de aire/minuto, y la concentración de oxígeno disuelto se mantuvo a 20% de saluración medíanle el control de la velocidad de agitación. La sobrepresión en el fermentador se mantuvo a 300 g/cm2. Después de 9 ± 1 horas, el cultivo estaba en fase estacionaria . Las células se separaron del caldo de cultivo mediante cenlrifugación a 5000g a 4°C durante 1 5 min utos. Cultivo en matraz de ampollas recombinantes PorA-cps- del serogrupo B de Neisseria meningitidis Este procedimiento se llevó a cabo en dos pasos que comprenden precullivo en medio sólido seg uido de culíivo líquido: Preculíivo sólido: Se retiró un matraz de siembra del congelador (-80°C) , se descongeló hasía temperalu ra ambiente, y se sembraron por eslría 0.1 ml en una caja de Pelri que contenía 1 5 > » . .-.*. - m l de FN E01 0AA (véase anteriormente). La caja de Petri se incubó a 37°C duraníe 1 8 ± 2 horas. El crecimienlo de superficie se resuspendió en 8 ml de FN E008AA (véase aníeriormenle) complementado con 200 mg/l de kanamicina. Cultivo en maíraz: Se añadieron 2 m l de preculíivo sólido resuspendido, a un maíraz de 2 lifros que conten ía 400 ml de FN E008AA complementado con 200 mg/l de kanamícina . El matraz se colocó sobre una mesa de agilación (200 rpm) , y se incubó a 37°C durante 16 ± 2 horas. Las células se separaron del caldo de cultivo mediante centrifugación a 5000g a 4°C du rante 1 5 minutos. EJ EMPLO 8 Aislamiento v purificación de am pollas de meningococos gue carecen de polisacárido capsular Se purificaron ampollas recombinantes como se describe a continuación . La pasta de células (42 g) fue suspendida en 21 1 ml de reg ulador de pH Tris-Cl a 0.1 M , pH 8.6, conteniendo EDTA a 10 mM y desoxicolato de sodio (DOC) a 0.5%. La relación de regulador de pH : biomasa fue de 5/1 (V/W). La biomasa se extrajo mediante ag itación magnética duraníe 30 m inulos a lemperatu ra ambiente. El extracío íotal se centrifugó entonces a 20,000g durante 30 min utos a 4°C ( 1 3,000 rpm en u n rotor JA-20, centrífuga J2-HS Beckman) . La pella se desechó. El sobrenadante se ultracentrifugó a 125,000g durante 2 horas a 4°C (40,000 rpm en u n rotor 50.2TÍ, ullracenfrífuga L8-70M Beckman) para concenírar las vesícu las. El sobrenadaníe se desechó. La pella fue suspendida suavemenle en 25 ml de regulador de pH Tris-Cl a 50 mM , pH 8.6, conleniendo EDTA a 2 mM, DOC a 1 .2% y sacarosa a 20%. Después de un seg undo paso de ulíracentrifugación a 125,000g durante 2 horas a 4°C , las vesícu las se suspendieron suavemente en 44 m l de sacarosa a 3% , y se almacenaron a 4°C. Todas las soluciones usadas para la exíracción y pu rificación de ampollas conten ían tiomersalafo a 0.01 %. Como se Musirá en la figura 8, este procedimiento da preparaciones de proleína altamente enriquecidas en proteínas de membrana exleríor tales como PorA y PorB . EJEMPLO 9 Identificación de promotores bacterianos adecuados para sobrerregulación de genes que codifican para antígenos El uso de elementos de promoíor bacíerianos fuertes es esencial para obtener la sobrerregulación de genes que codifican para proteínas de membrana exíerior. En dicho coníexlo, se ha mostrado previamente q ue la sobrerregulación de los genes nspA, hsf y omp85 de Neisseria meningitidis usando el promolor porA, ha permitido aislar ampollas recombinantes en riquecidas en las proteínas NspA, Hsf y Omp85 correspondientes. Alternalivas al promotor porA pueden ser útiles para obtener diferentes niveles de sobrerregulación , para superar la variación de fase potencial de porA y/o para lograr la expresión condicional de genes (promotores regulados por h ierro) . Se describe en la presente un método que permiíe la identificación de un sitio de inicio de la transcripción preciso de elementos de promotor fuertes que posiblemente ' — *-» »fc--"-"- confieren alto nivel de expresión en bacterias. Puesto que los elementos reg uladores del promoíor son clásicameníe abarcados dentro de 200 pares de bases hacia el extremo 5' y 50 pares de bases hacia el exíremo 3' a parlir del siíio + 1 (Collado-Vides J , Magasanik B , Gralla J D, 1 991 , Microbiol Rev 55(3) :371 -94) , el resullado de dicho experimenío perm ite identificar fragmenlos de ADN de aproximadamenle 250 pares de bases que poseen actividades de promotor fueríe Profeínas de membrana exterior principales tales como PorA, PorB y Rmp de Neisseria meningitidis, P 1 , P2 , P5 y P6 de Haemophilus influenzae y OmpCD y OmpE de Moraxella catarrhalis, así como íambién algu nas proteínas ciloplásmicas y/o reg uladas por hierro de estas bacterias, poseen elementos de promotor fuerte. Como u na validación de esta metodolog ía general, los autores mapearon el sitio de inicio de la transcripción de los promotores fuertes porA y porB de Neisseria meningitidis, usando amplificación rápida de elementos de ADNc (5' RACE) . Los principios de la 5' RACE son los sig uientes: 1 ) Extracción de ARN total usando el eq uipo "RNeasy" Q IAGEN . Remoción de ADN genóm ico mediante tralamienlo con DNase, seg uido de pu rificación de Q IAGEN ; 2) transcripción inversa de ARN mensajero con un iniciador del extremo 3' específico de porA (denominado porA3) . Tamaño esperado del ADNc: 307 nucleófidos. Remoción del ARN mediante hidrólisis alcalina ; 3) ligación de un ancla de oligómero de ADN de cadena sencilla (denominado DT88) hacia el extremo 3' del ADNc usando ARN ligasa T4. Tamaño esperado del producto: 335 nucleóíidos. Amplificación del ADNc anclado usando una combinación de PCR sem ian idada ; 4) amplificación mediante PCR del ADNc ligado al ancla usando u n iniciador de ancla de secuencia complementaria como el iniciador de exlremo (denominado DT89) y u n iniciador del extremo 3' (denominado p1 -2, el cual es interno al iniciador de RT del exíremo 3' porA3. Tamaño esperado del producío: 292 pares de bases; 5) amplificación medianle PCR de productos de PCR anteriores usando DT89 como iniciador del exlremo 5', y p1 -1 como iniciador del extremo 3' (interno a p1 -2) . Tamaño esperado del prod ucto: 21 1 pares de bases; y 6) secuenciación con el iniciador p1 -1 (se puede calcular el íamaño esperado de los producios, debido a que se conoce el siíio de in icio de la transcripción porA : 59 nt anles del silio de inicio de la íraducción "ATG") . Procedimiento experimental Se extrajo ARN toíal de aproximadamenle l O9 células de la cepa cps- porA+ del serogrupo B de Neisseria meningitidis. Se llevó a cabo la extracción de 1 ml de un cultivo líquido a densidad óptica apropiada (DO600 = 1 ) medianíe el eq uipo "RNAeasy" Q IAG EN , de acuerdo a las insírucciones del fabricanle. Se removió ADN cromosómico medianfe la adición de 1 0U de DNase libre de RNase- (Roche Diag nostics, Man nheim , Aleman ia) a los 30 µl de ARN elu ido, y se incubó a 37°C durante 1 5 minufos. Se pu rificó el ARN libre de ADN con el mismo equipo QIAGEN de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción inversa usando el iniciador porA3 y 200U de transcriptasa inversa SUPERSCRIPT II (Life Technologies). Las reacciones de RT se llevaron a cabo en un volumen de 50 µl que confenía: 5 µl de dNTP a 2 mM, 20 pmoles de iniciador porA3, 5 µl de 10X de regulador de pH SUPERSCRIPT II, 9 µl de MgCI2 a 25 mM, 4 µl de DTT a 0.1 M, 40U de inhibidor de ribonucleasa recombinaníe, y 1 µg de ARN loíal. El iniciador porA3 se unió paso a paso (70°C duraníe 2 minutos, 65°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuío, 55°C duranle 1 minuío, 50°C durante 1 minuto y 45°C duraníe 1 minuto) antes de que se añadiera SUPERSCRIPT II. La reacción de RT se llevó a cabo a 42°C duranfe 30 minuíos, seguido de 5 ciclos (50°C durante 1 minuto, 53°C duranle 1 minuío y 56°C durante 1 minuto) para desestabilizar la estrucíura secundaria del ARN. Se llevaron a cabo dos reacciones paralelas, omitiendo la transcripíasa inversa de una reacción como conírol negaíivo. El ARN se removió medianíe digestión con hidrólisis alcalina con la adición de 1 µl de EDTA a 0.5 M, seguido de 12.5 µl de NaOH a 0.2 M, antes de incubación a 68°C duranle 5 minulos. Las reacciones se neutralizaron añadiendo 12.5 µl de Tris- HCl a 1 M (pH 7.4), y se precipitaron mediante la adición de 20 µg de glucógeno (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania), 5 µl de acetato de sodio a 3 M y 60 µl de isopropanol. Ambas muestras se resuspendieron en 20 µl de TE 1 0: 1 (Tris-HCl a 1 0 mM , pH 7.4; EDTA a 1 mM , pH 8) . Se usó ARN ligasa T4 para anclar un oligonucleótido de ancla DT88 bloqueado con ddCTP del extremo 3' 5'-fosforilado (véase cuadro siguiente). Se llevaron a cabo dos ligaciones paralelas durante la noche a temperaíura ambieníe cada una conleniendo: 1 .3 µ l de 1 0X de regulador de pH de ARN ligasa (Roche Molecular Biochemicals) , DT88 a 0.4 µM , 1 0 µ l de ADNc o m uesfra de conlrol de RT y 3U de ARN ligasa T4. Como coníroles negaíivos, se llevó a cabo una seg unda serie de reacciones de ligación , omifiendo la ARN ligasa T4. Las mezclas de reacción-ligación resullaníes se usaron direclameníe sin purificación en la siguienfe PCR.
El ADNc ligado al ancla se amplificó usando una combinación de procedimieníos de PCR semianidada e iniciada con calor para aumenlar el carácíer específico y/o el rendimienío de produclo. Se llevaron a cabo cuaíro PCR separadas del primer ciclo en la reacción de RT/ligasa y conlroles en u n volumen de 30 µl, cada u no coníeniendo: 3µl de 1 0X de reg ulador de pH Taq Plalinium, 3 µl de MgCI2 a 25 mM, 1 µl de dNTP a 1 0 mM, 10 pmoles de cada u no de los iniciadores y 1 µl de la reacción de ligación de ARN correspondieníe. La PCR se inició en caliente mediante el uso de ADN polimerasa Taq Plalinium (Life Technologies) (2U añadidos). La primera PCR anclada a la ligación (LA-PCR) se llevó a cabo usando 1 0 pmoles del iniciador DT89 específico del ancla y el iniciador p1-2 específico del transcrito (véase cuadro siguiente), el cual es interno al iniciador porA3 de RT del extremo 3'. La PCR se llevó a cabo usando una temperatura inicial de 95°C durante un paso de 5 minutos (para activación de ADN polimerasa), seguido de 10 ciclos a 95°C durante 10 segundos y 70°C durante 1 minuto (reduciendo 1 grado por ciclo), 15 ciclos a 95°C duraníe 10 segundos y 60°C duranle 1 minulo. La segunda LA-PCR semianidada se llevó a cabo bajo las mismas condiciones usando el iniciador DT89 y el iniciador interno p1-2, junto con 10 pmoles de p1 -1 (véase cuadro siguieníe) y 1 µl de PCR del primer ciclo. Los producios de amplificación se purificaron usando el equipo de purificación de PCR "QIAquick" QIAGEN de acuerdo a las insírucciones del fabricante antes de somelerlos a secuencíación.
Se usó el equipo de secuenciación de ciclo de terminador y colorante CEQ™ (Beckman, Francia), para secuenciar los productos de PCR RACE usando 10 pmoles del iniciador p1-1. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo de acuerdo a las inslrucciones provistas, y los productos de secuenciación se analizaron medianíe el sistema de análisis de ADN Ceq2000 (Beckman-Coulter). * i fth -~ iJa»-" -"--""« Resultados para el promoíor porA de Neisseria meningitidis El inicio de la transcripción para el ARN mensajero de 5 porA del serogrupo B de Neisseria meningitidis (cepa H44/76) , fue mapeado 59 pares de bases hacia el extremo 5' del codón de inicio ATG usando el procedimiento de 5' RACE descrito anteriormeníe. Esíe resulíado confirma el mapeo llevado a cabo mediante extensión del iniciador y publicado por van der Ende eí al ( 1 995) . 10 Esle resullado sosíiene q ue un fragmento de ADN que contiene los nucleófidos -9 a -259 con respeclo al ATG de porA, es adecuado para dirigir la expresión fuerte de genes en Neisseria meningitidis, y posiblemente en otras especies bacíerianas lales como Haemophilus, Moraxella y Pseudomonas. 15 Resulíados para el promotor porB de Neisseria meningitidis La misma estraíegia experimeníal se ha aplicado para el mapeo del silio de inicio de la transcripción de porB del serogrupo 20 B de Neisseria meningitidis (cepa H44/76) . Los iniciadores señalados en el cuadro siguiente corresponden al iniciador de RT del extremo 3' (porB3) , iniciador específico del transcrito que es interno a porB3 (porB2), e interno a porB2 (porB 1 ) , porB3, porB2 y porB 1 , y se localizan , respectivameníe, 265 pares de bases, 1 95 afe...-. pares de bases y 150 pares de bases hacia el exíremo 3' del codón de inicio ATG.
Usando los iniciadores porB 1 y DT89, se obíuvo un amplicón de PCR de aproximadameníe 200 pares de bases llevando a cabo mapeo de 5' - RACE. Puesto que porB1 se localiza 1 50 pares de bases a partir del codón de inicio ATG de porB, esíe resulíado sustenta que el sitio de inicio de la transcripción porB se localiza aproximadameníe 50 pares de bases (+/- 30 pares de bases) hacia el exíremo 5' de ATG de porB. El nucleóíido exacío que corresponde al inicio de la transcripción está aclualmenle siendo deíerminado medianle secuenciación de ADN . El resu llado de PCR anlerior sustenta que un fragmento de ADN que contiene los nucleótidos -1 a -250 con respecto al codón de inicio ATG de porB, es adecuado para dirigir la expresión fuerle de genes en Neisseria meningitidis y q uizá en oirás especies baclerianas tales como Haemophilus, Moraxella y Pseudomonas. EJEMPLO 10 Sobrerregulación del gen Omp85 del serogrupo B de Neisseria meningitidis mediante reemplazo del promotor t¿A* - ' - - - * •*'-*-*£ *- - » ?. ............. ttt i íá^^ M El propósito del experimento fue reemplazar la región de promotor endógeno del gen de D 1 5/Omp85 por el promotor porA fuerte para sobrerreg ular la producción del antígeno D 1 5/Omp85. Para dicho propósito, se construyó u n plásmido de reemplazo del 5 promotor usando melodologías de clonación de £. coli. Se descubrió una región de ADN (1 000 pares de bases) localizada hacia el extremo 5' del gen de codificación de D 1 5/omp85 (SEQ I D NO: 3) en la base de datos privada I ncyte PathoSeq que contiene secuencias de ADN genómico no acabadas de la cepa de Neisseria 10 meningitidis número de ATCC 1 3090. Los pasos principales de este procedimienlo se representan en la figu ra 9. En resumen , un fragmento de ADN (1 000 pares de bases) que abarca los nucleótidos -48 a -983 con respecto al codón de inicio (ATG) del gen de D 1 5/Omp85, fue amplificado mediante PCR usando los 15 oligon ucleótidos ProD15-51 X (5' -GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG CAC ACC GTT G-3') y ProD15-52 (5' -GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3') q ue contenían respectivameníe silios de resíricción EcoRI y Xbal (subrayados) . Esfe fragmenlo fue sometido a restricción , e inseríado en el 20 plásmido pUC 1 8 resíringido con las mismas enzimas. La construcción obtenida se sometió a mutagénesis in vitro usando el sisíema Genome Priming (usando el plásmido donador pGPS2) comercializado por New England Biolabs (MA, USA) . Se seleccionaron clones que íienen inseríado u n mini-lransposón 25 (derivado de Tn7 y q ue aloja un gen de resistencia a cloranfenicol) .
Se aisló un clon que conliene una inserción de mini-lransposón localizada en la región de flanqueo 5' de D1 5/Omp85, 401 pares de bases hacia el extremo 3' del sitio EcoPI , y se usó para oíros estudios. Este plásmido se someíió a m ulagénesis de PCR circular (Jones & Winisíofer (1 992) , Bioíech niques 1 2 : 528-534) para (i) eliminar una secuencia de ADN repeíida (Tn7R) generada por el proceso de íransposición , (ii) inseríar secuencias de caplación meningocóccicas que se requieren para la fransformación , y (¡ii) inseríar siíios de restricción adecuados que permiten la clonación de material de ADN introd ucido, tales como promotores. La PCR circular se llevó a cabo usando los oligon ucleótidos TnRD1 5-Kpnl/Xbal + US (5' -CGC CGG TAC CTC TAG AGC CGT CTG AAC CAC TCG TGG ACÁ ACC C-3") y TnR03Cam(Kpnl) (5' -CGC CGG TAC CGC CGC TAA CTA TAA CGG TC-3') q ue coníienen secuencias de captación y sitios de restricción adecuados {Kpn\ y Xbal) . El fragmento de PCR resultaníe fue purificado en gel, digerido con Asp 71 8 (isoesquizómero de Kpnl) , y ligado a un fragmento de ADN de 1 84 pares de bases q ue conten ía el promoíor porA y generado medianíe PCR usando los oligon ucleóíidos PorA-01 (5' -CGC CGG TAC CGA GGT CTG CGC TTG AAT TGT G-3') y PorA02 (5' -CGC CGG TAC CTC TAG ACÁ TCG GGC AAA CAC CCG-3') que conlen ían siíios de reslricción kpn\ . Se seleccionaron clones recombinaníes que poseen un promoíor porA inseríado en la orienlación corréela (procedimienlo de transcripción en la dirección EcoR\ a Xbal) , y se usaron para transformar una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis q ue carece de polisacárido capsular (cps-) y una de las proleínas de membrana exlerior principales, -PorA (por>4-) . Se seleccionaron clones de Neisseria meningitidis recombinante resultado de un evento de entrecruzamiento doble (selección mediante PCR usando los oligonucleóíidos Cam-05 (5' GTA TTG CGA TGA GTG GCA GG-3') y proD15-52) sobre medio de GC que coníen ía 5 µg/ml de cloranfenicol , y se analizaron para expresión de D1 5/Omp85. Como se representa en la figura 1 0, la producción de D 1 5/Omp85 fue incrementada sign ificativameníe en los exíraclos de proleína total de cepas Nm que resultan de reemplazo del promotor, en comparación con la cepa progeniíora (cps-). Este resulíado se observó íambién cuando se analizaron ampollas de membrana exterior preparadas a partir de las mismas cepas (véase figura 1 7). Estos resultados son atribuibles al reemplazo del promotor D 15 endógeno por el promotor porA fuerte. Además, se encontró sorprendentemenle que la expresión , en donde el promotor porA fue introducido aproximadameníe 400 pares de bases hacia el exíremo 5' del codón de inicio, fue aproximadameníe 50 veces mayor que cuando el promotor fue colocado aproximadamente 1 00 pares de bases hacia el extremo 5' . En conjunto, eslos experimenlos suslenlan que la estralegia de reemplazo del promotor fu nciona y permite la sobrerregulación de la síníesis de proteínas de membrana exterior inlegrales en ampollas de membrana exlerior. ?^^¿^ £^^^ ^m?? ikmsaa^ m Cierlas poblaciones humanas aisladas geográficameníe (íales como Cuba) , son infecíadas por un número limiíado de aislados de Neisseria meningitidis que perlenecen principalmeníe a uno o unos cuaníos seroíipos de proteína de membrana exterior. Puesto que PorA es un antígeno de profeína de membrana exlerior principal que puede inducir proleínas y anlicuerpos bactericidas específicos de la cepa, puede ser posible conferir protección medianle vacunas en dicha población usando un número limiíado de serotipos de PorA. Además, PorA puede interactuar con otras proteínas de membrana exterior, o estabilizar alg u nas de ellas. En este contexto, la presencia de PorA en vesículas de membrana exterior puede ser ventajosa, reforzando la eficacia de la vacuna en dichas ampollas mejoradas recombinantes. Por dicha razón , puede ser posible sobrerregular la expresión de la proíeína de membrana exíerior D 1 5/Omp85 en las cepas del serogrupo B de Neisseria meningitidis que carecen de genes cps funcionales, pero que expresan oíros. Se exlrajo ADN genómico de la cepa cps-, porA-, D15/Omp85+ del serogrupo B de Neisseria meningitidis recombinanle, usando el equ ipo 1 00-G de punías genómicas QIAG EN . Se línealizaron 1 00 g de esíe malerial, y se usaron para íransformar cps- del serog rupo B de Neisseria meningitidis siguiendo un prolocolo de íransformación clásico. Se obtuvo Neisseria recombinante en placas de agar de GC que coníen ían 5 µg/ml de cloranfenicol .
Se seleccionaron inlegraciones que resu lían de un enírecruzamienío doble hacia el exíremo 5' del gen D 15 med ianíe PCR como se describió aníeriormeníe. Puesío q ue pueden ocurrir recombinaciones homologas en cualquier punió en el cromosoma, se llevó a cabo una segu nda selección medianle PCR para controlar la integ ridad del locus porA en la cepa recombinante. Para este propósiío, se usaron los iniciadores de porA internos PPA1 (5- GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C -3') y PpA2 (5- GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC -3') en un experimento de selección mediante PCR. La amplificación de un fragmento de 1 1 70 pares de bases, confirma la presencia del gen porA en las bacterias recombinanfes. Las bacíerias recombinantes (que corresponden a aproximadamente 5.1 08 baclerias) , pueden ser resuspendidas en 50 µl de regulador de pH de PAGE-SDS , congeladas (0°C/hervidas (1 00°C) íres veces, y separadas enlonces mediante electrofóresis de PAGE-SDS sobre u n gel a 0.25%. Los geles pueden ser teñidos entonces medianle azul brillante R250 de Coomassie, o transferidos sobre una membrana de nitrocelulosa y sondeados con un anticuerpo monoclonal anti-porA, o con un anticuerpo policlonal de conejo anti-D 1 5/Omp85. Se puede llevar a cabo también análisis de ampollas de membrana exterior preparadas a partir de las mismas cepas.
EJ EMPLO 1 1 Sobrerregulación del antígeno de proteína Hsf en una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis recom binante que carece de genes cps funcionales, pero que expresan PorA Como se describió anteriormente, en ciertos países, la presencia de PorA en vesículas de membrana exleríor puede ser veníajosa, y puede reforzar la eficacia de las vacunas de ampolla mejoradas recombinantes. En el siguiente ejemplo, se ha usado u n veclor pCMK(+) modificado para sobrerreg ular la expresión del anlígeno de proleína Hsf en una cepa que carece de los genes cps funcionales, pero que expresa PorA. El veclor pCM K(+) original conliene un promotor porA/lacO quimérico reprimido en E. coli q ue expresa Iacl9, pero activo transcripcionalmente en Neisseria meningitidis. En el vector pCMK(+) modificado, el promofor por4 nafivo se usó para dirigir la íranscripción del gen hsf. El gen que cod ifica para Hsf fue amplificado medianíe PCR usando los oligonucleólidos in iciadores HSF 01 -?/del y HSF 02- Nhe\ , preseníados en el cuad ro siguieníe. Debido a la secuencia del in iciador HSF 01 -?/del , la profeína Hsf expresada contendrá dos resid uos de metion ina en el extremo 5' . Las cond iciones usadas para la amplificación mediante PCR, fueron las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim , GmbH). La ciclización térmica fue la siguiente: 25 veces (94°C 1 minuto, 48°C 1 minulo, 72°C 3 minuios) y 1 vez (72°C 10 minutos, 4°C hasta recuperación) . El amplicón correspondiente fue clonado •• -- - subsecuenlemenie en los siíios de restricción correspondientes del veclor de liberación pCM K(+). En este plásmido recombinante, designado como pCMK(+)-Hsf, se eliminó el lacO presente en el promotor quimérico porA/lacO mediante una estrategia de PCR recombinante (véase fig ura 2) . El plásmido pCM K(+)-Hsf se usó como molde para amplificar mediante PCR dos fragmentos de ADN separados: El fragmento 1 contiene la región recombinogénica porA 5', el gen de resistencia a kanamicina y el promotor porA. Los oligonucleótidos iniciadores usados, RPI (Sacl l) y RP2, se presentan en el cuad ro sig uiente. El iniciador RP 1 es homólogo a la secuencia apenas hacia el exlremo 5' del operador lac. El fragmento 2 contiene la secuencia de Shine-Dalgarno del gen porA, el gen hsf y la región recombinogénica por>4 3'. Los oligonucleótidos iniciadores usados, RP3 y RP4 (>4pcl) , se presenían en el cuad ro sig uieníe. El in iciador RP3 es homólogo a la secuencia apenas hacia el extremo 5' del operador lac. El extremo 3' del fragmento 1 , y el exíremo 5' del fragmento 2, tienen 48 bases traslapantes. Se usaron 500 ng de cada PCR (1 y 2) para una reacción de PCR final, usando los iniciadores RP1 y RP4. El amplicón final obtenido fue subclonado en el vector pSL1 1 80 restring ido con Sacl l y Apa\ . El plásmido mod ificado pCM K(+)-Hsf fue purificado a gran escala usando el equipo de maxipreparaciones QIAGEN , y se usaron 2 µg de esfe material para transformar una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis que carece de "**J'" genes cps funcionales (la cepa descriía en el ejemplo 1 ) . Para preservar la expresión de porA, se seleccionó la inlegración que resulta de un entrecruzamienío individual mediante una combinación de procedim ientos de selección Western bloí y PC R. Los clones de resisfencia a kanamicina que demosíraron ser posilivos medianíe PCR específica de porA- y Wesíern blot, fueron almacenados a -70°C como materiales de abastecimienfo de glicerol, y se usaron para otros estudios. Las bacíerias (que corresponden a aproximadameníe 5.1 08 baclerias) fueron resuspendidas en 50 µl de regulador de pH de PAGE-SDS , congeladas (-20°C)/hervidas (1 00°C) fres veces , y separadas entonces mediante elecírofóresis de PAGE-SDS sobre un gel a 12.5%. La expresión de Hsf se examinó en Usados bacterianos de células enteras (WCBL) derivados de NmB [Cps-, PorA+] o NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. La íinción de Coomassie permiíió deíeclar un incremenío significativo en la expresión de Hsf (con respecto al nivel de Hsf endógena) (véase la figura 13). Esíe resulíado confirma que el vector pCMK(+)-Hsf modificado es funcional, y se puede usar con éxito para sobrerreg ular la expresión de proteínas de membrana exterior, sin suprimir la producción del anfígeno de proíeína de membrana exíerior PorA principal .
Oligonucleóíidos usados en este esíudio EJEMPLO 12 Expresión de la proteína fluorescente verde en una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis recombinante gue carece de genes cps funcionales, pero gue expresan PorA En el sig uiente ejemplo, se usó el vecíor pCM K para poner a prueba la expresión de una proíeína heferóloga citoplásmica en Neisseria meningitidis. La proteína fluorescente verde fue amplificada a partir del plásmido pKen-Gfpmut2 con los inciadores GFP-Asn-mut2 y GFP-Spe (véase cuadro en el ejemplo 1 1 ) . Asn\ da exíremos cohesivos compalibles con ?/del , y Spel da exiremos cohesivos compaíibles con Nhe\ . Las condiciones usadas -- - r-«¡,k*j ?.?iÉ aá*Am para la amplificación medianíe PCR, fueron las descriías por el proveedor (ADN polimerasa H iFi, Boeh ringer Mannheim , GmbH) . La ciclización fórmica fue la siguienfe: 25 veces (94°C 1 min uío, 48°C 1 minuto, 72°C 3 min uíos) y 1 vez (72°C 1 0 minulos, 4°C hasla recuperación). El amplicón correspondiente fue clonado subsecuentemente en el vecíor de liberación pCM K(+) digerido con enzimas de reslricción ?/del y Nhe\ . En esíe plásm ido recombinanle, designado como pCM K(+)-G FP, se eliminó el lacO preseníe en el promoíor quimérico porA/lacO medianíe una eslraíegia de PCR recombinanle. El plásmido pCM K(+)-GFP se usó como molde para amplificar medianíe PCR dos fragmentos de ADN separados: El fragmento 1 coníiene la región recombinogén ica porA 5', el gen de resislencia a kanam icina y el promolor porA . Los oligonucleóíidos iniciadores usados, RP I (Sacl l) y RP2, se presentan en el cuadro del ejemplo 1 1 . El iniciador RP 1 es homólogo a la secuencia apenas hacia el extremo 5' del operador lac. El fragmento 2 contiene la secuencia de Shine-Dalgarno de PorA, el gen gfp y la región recombinogénica porA 3'. Los oligon ucleótidos iniciadores usados, RP3 y RP4 (-4pcl) , se presentan en el cuadro del ejemplo 1 1 . El iniciador RP3 es homólogo a la secuencia apenas hacia el extremo 5' del operador lac. jSMí áiU^*, El extremo 3' del fragmento 1 , y el extremo 5' del fragmenío 2, íienen 48 bases íraslapantes. Se usaron 500 ng de cada PCR (1 y 2) para una reacción de PC R final, usando los iniciadores RP 1 y RP4. Veiníe µg de esíe fragmento de PCR se usaron para transformar una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis que carece de genes cps funcionales. La transformación con ADN lineal, es menos eficiente que con ADN de plásmido circular, pero iodos los recombinaníes oblenidos llevaron a cabo un enlrecruzamiento doble (confirmado medianíe una combinación de procedimieníos de selección Western blot y PCR) . Los clones resislenles a kanamicina se almacenaron a -70°C como maleriales de abastecim ienío de glicerol, y se usaron para oíros estudios. Las bacterias (que corresponden a aproximadameníe 5.108 bacíerias) fueron resuspendidas en 50 µl de reg ulador de pH de PAGE-SDS , congeladas (-20°C)/hervidas (1 00°C) fres veces, y fueron separadas entonces mediante electrofóresis de PAGE-SDS sobre u n gel a 12.5% . La expresión de GFP se examinó en Usados bacterianos de células enteras (WCBL) derivados de NmB [Cps-, PorA+] o NmB [Cps-, PorA-, G FP+]. La Unción de Coomassie permiíió detecfar la expresión de GFP auseníe en la cepa de Neisseria meningitidis receptora (véase figura 14). ... . * l i ? EJEMPLO 13 Sobrerregulación del gen NspA del serogrupo B de N. meningitidis mediante reemplazo del promotor El propósiío del experimento fue reemplazar la región de promotor endógeno del gen NspA por el promotor fuerte porA, para sobrerreg ular la producción del antígeno NspA. Para dicho propósiío, se conslruyó un plásm ido de reemplazo del promoíor usando melodolog ías de clonación de E. coli. Se descubrió una región de ADN (942 pares de bases) localizada hacia el exíremo 5' del gen de codificación NspA (SEQ I D NO: 7) en la base de dalos privada I ncyle PathoSeq que contenía secuencias de ADN genómico no acabadas de la cepa de Neisseria meningitidis número de ATCC 1 3090. Un fragmento de ADN (675 pares de bases) que abarca los nucleótidos -1 1 5 a -790 con respecto al codón de inicio (ATG) del gen NspA, fue amplificado med iante PC R usando los oligonucleótidos PSN 1 ' (5'-CCG CGA ATT CGA CGA AGC CGC CCT CGA C-3') y PNS2 (5'-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3') q ue coníen ían silios de restricción EcoRI y Xbal (subrayados) , respecíivamente. El fragmento de PC R fue sometido a restricción con EcoRI y Xbal e insertado en pUC 1 8. Este plásm ido fue sometido a mutagénesis de PCR circular (Jones & Winistofer ( 1 992) , Bioíechniques 1 2: 528-534) para inserfar secuencias de captación meningocóccicas q ue se requieren para transformación , y sitios de restricción adecuados que permiíen la clonación de un cassefíe de promolor CmR/PorA. La PCR circular se llevó a cabo usando los oligonucleótidos BAD01 -2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCT TAT CGA TGG AAA ACG CAG C-3') y BAD02-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTT CAG ACG GCG CGC TTA TAT AGT GGA TTA AC 3-') que contenían secuencias de captación y sitios de restricción adecuados (Xmal y Xbol), subrayados. El fragmento de PCR resultante fue pu rificado en gel, y digerido con Xbol . El cassette de promolor CmR/PorA fue amplificado a parlir del plásmido pUC D1 5/Omp85 descrito anteriormenle, usando los oligonucleóíidos iniciadores BAD 1 5-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTC TAG ACÁ TCG GGC AAA CAC CCG-3') y BAD 03-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCA CTA GTA TTA CCC TGT TAT CCC-3') q ue conten ían sitios de resfricción adecuados (Xmal , Xbal , Spel y Xbol), subrayados . El fragmenlo de PRC obten ido fue someíido a digesíión , e inseríado en el plásmido de PCR circu lar resíringido con las enzimas correspondienfes. 1 0 µg del plásmido recombinanle fueron linealizados y usados para transformar una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis que carece de polisacárido capsular (cps-) y una de las proteínas de membrana exterior principales - PorA {porA-) . Los clones de Neisseria meningitidis recombinantes que resultan de un evento de entrecruzam ienlo doble [selección mediante PCR usando los oligon ucleótidos BAD 25 (5' -GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3') y BAD08 (5'- CTT AAG CGT CGG ACÁ TTT CC-3')] se seleccionaron sobre placas de agar de GC que coníen ían 5 µg/ml de cloranfenicol , y se analizaron para expresión de NspA. Las bacterias recombinantes (que corresponden a aproximadamenle 5.1 08 baclerias) fueron resuspendidas en 50 µl de regulador de pH de PAGE-SDS, congeladas (-20°C)/hervidas (100°C) tres veces, y se separaron entonces mediante electrofóresis de PAGE-SDS sobre un gel a 1 2.5% . Los geles fueron teñ idos entonces med iante azul brillante R250 de Coomassie o transferidos a una membrana de nitrocelulosa y sondeados con un anlicuerpo monoclonal anli-PorA o con anficuerpo policlonal aníi-NspA (figura 1 7). Como para Omp85, existe u na indicación sorprendente de q ue la inserción del promoíor aproximadameníe 400 pares de bases hacia el extremo 5' del codón de inicio de NspA, expresa más proteínas que si se coloca aproximadamenle 1 00 pares de bases hacia el exíremo 5' . El mismo plásmido pUC recombinanle se puede usar para sobrerregular la expresión de NspA en una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis q ue carece del gen cps funcional, pero que expresa aún PorA. EJEMPLO 14 Sobrerregulación del gen pldA (o plA) del serogrupo B de N. meningitidis mediante reem plazo del promotor El propósito del experimento fue reemplazar la región de promotor endógeno del gen pldA (omplA) por el promotor porA fuerte para sobrerregular la producción del antígeno pldA (omplAI ) . Para dicho propósito, se construyó un plásmido de reemplazo de promotor usando metodologías de clonación de E. coli. Se descubrió una región de ADN (373 pares de bases) localizada hacia el exíremo 5' de la secuencia de codificación de pldA (SEQ I D NO: 1 8) en la base de datos privada I ncyte PaíhoSeq de la cepa de Neisseria meningitidis número de ATCC 1 3090. Esíe ADN confiene la secuencia que codifica para un gen rpsT puíaíivo. El codón de defención de rpsT se localiza 1 69 pares de bases hacia el extremo 5' de ATG de p/d-4. Para evitar la disolución de esfe gen potencialmente ¡mportanle, se decidió inseríar el casselte de promolor CmR/PorA apenas hacia el exlremo 5' de ATG de pdlA . Para dicho propósito, un fragmento de ADN de 992 pares de bases que corresponde al gen rpsT, la secuencia iníergén ica de 169 pares de bases y los primeros 499 nucleóíidos del gen pdlA , fue amplificado medianle PCR a parlir de ADN genómico del serog rupo B de Neisseria meningitidis usando los oligonucleótidos PLA1 Amo5 (5' -GCC GTC TGA ATT TAA AAT TGC GCG TTT ACÁ G-3') y PLA1 Amo3 (5' -GTA GTC TAG ATT CAG ACG GCG CAA TTT GGT TTC CGC AC -3') que conten ían secuencias de capíación (subrayadas). PLA1 Amo3 contiene también un sitio de reslricción Xbal. Este fragmento de PCR fue depurado con u n equipo High Puré (Roche, Mann heim , Alemania) y clonado directamente en u n vector pGemT (Promega, USA). Este plásmido se sometió a muíagénesis de PCR circular (Jones & Win isíofer (1 992) para insertar sitios de restricción adecuados que permiíen la clonación de u n cassetíe de promotor CmR/PorA. Se llevó a cabo la PCR circu lar usando los oligon ucleótidos CI RC 1 -Bg l (5' -CCT AGA TCT CTC CGC CCC CCA TTG TCG -3') y C I RC 1 -XH-RBS/2 (5' -CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G-3') o CI RC2-XHO/2 (5'-CCG CTC GAG ATG AAT ATA CGG AAT -3') que coníenían sitios de restricción adecuados (Bg/W y Xbol), subrayados. El casselte de promolor CmR/PorA fue amplificado a partir del plásm ido pUC D1 5/Omp85 descrito aníeriormenle, usando los iniciadores BAD20 (5' -TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC 3') y CM-PORA-3 (5' -CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GC-3') q ue conten ían sitios de restricción adecuados (Bg/W y Xbol), subrayados. Este fragmenlo de PCR fue clonado en el plásmido de PCR circu lar obíenido con los iniciadores C I RC 1 -Bg l y CI RC 1 -XH-RBS/2. Esie plásmido se puede usar para íransformar las cepas (cps-) y (cps- porA-) del serog rupo B de Neisseria meningitidis. La inlegración med ianle enírecruzamiento doble en la región hacia el extremo 5' de pldA, d irigirá la inserción del promoíor porA d ireclameníe hacia el exfremo 5' de ATG de pldA . Oíro casselte fue amplificado a partir del ADN genómico de la cepa {cps- porA-, D15/Omp85+) del serogrupo B de Neisseria meningitidis recombinante que sobreexpresa D 1 5/Omp85 mediante reemplazo del promotor. Esíe cassetíe contiene el gen cmR, el promotor porA y 400 pares de bases que corresponden a la secuencia de flanq ueo 5' del gen de D15/Omp85. Se ha demostrado que esía secuencia es eficaz para la sobrerregu lación de la expresión de D1 5/Omp85 en Neisseria, y se pond rá a prueba para la sobrerregulación de la expresión de otros antígenos de Neisseria. Los iniciadores usados para la ; amplificación fueron BAD 20 y CM-PORA-D 1 5/3 (5' -CGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3') que contenían sitios de restricción Xbol (subrayados) . Este fragmento de PCR fue clonado en el plásmido de PCR circular obtenido con los in iciadores CI RC 1 -Bg l y CI RC2-XHO/2. Esíe plásmido se usará para íransformar las cepas (cps-) y (cps-, porA-) del serog rupo B de Neisseria meningitidis. La integración mediante enírecruzamienlo doble en la región hacia el exíremo 5' de pldA , dirigirá la inserción del promolor porA 400 pares de bases hacia el exíremo 5' de ATG de p/d4. EJEMPLO 1 5 Sobrerregulación del gen tbpA del serogrupo B de N. meningitidis mediante reemplazo del promotor El propósito de este experimento fue reemplazar la reg ión de promotor endógeno del gen fbp>4 por un promotor porA fueríe, para sobrerreg ular la producción del aníígeno TbpA. Para dicho propósiío, se consíruyó un plásmido de reemplazo del promolor usando metodolog ías de clonación de E. coli. Se descubrió u na región de ADN (731 pares de bases) localizada hacia el extremo 5' a parlir de la secuencia de codificación de tbpA (SEQ I D NO: 1 7) en la base de datos privada I ncyte PalhoSeq de la cepa de Neisseria meningitidis número de ATCC 1 3090. Este ADN contiene la secuencia que codifica para el antígeno TbpB. Los genes están organizados en un operón . El gen tbpB será eliminado y remplazado por el casseííe de promolor CmR/porA. Para dicho propósito, un fragmento de ADN de 321 8 pares de bases que corresponde a la región de flanqueo 5' de 509 pares de bases del gen tbpB, la secuencia de codificación de tbpB de 21 39 pares de bases, la secuencia intergénica de 87 pares de bases y los primeros 483 nucleóíidos de la secuencia de codificación de tbpB, fue amplificado medianle PCR a parlir de ADN genóm ico del serogrupo B de Neisseria meningitidis usando los oligonucleótidos BAD 1 6 (5'-CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC- y BAD1 7 (5'-GGC CAA GCT ICA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3') que contienen las secuencias de capíación y silios de restricción Nhel y Hind\ \ \ (subrayadas). Este fragmento de PCR fue depurado con u n equipo H ígh Puré (Boerhinger Mannheim , Alemania) y clonado directameníe en un vector pGemT (Promega, USA) . Este plásmido fue sometido a mutagénesis de PCR circular (Jones & Winistofer ( 1 992)) para (i) inseríar siíios de reslricción adecuados que permiíen la clonación de un casselle de promoíor CmR/PorA, y (ii) elim inar 209 pares de bases de la secuencia de flanqueo 5' de tbpB y la secuencia de codificación de tbpB. La PCR circular se llevó a cabo usando los oligonucleóíidos BAD 1 8 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC J_GG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3') y BAD 1 9 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3") que conlienen siíios de resíricción adecuados Xmal , BglW y Xbol (subrayados) . El casseííe de promoíor CmR/PorA fue amplificado a partir del plásmido pUC D15/Omp85 descrito anleriormenle, usando los iniciadores BAD21 « & A (5' -GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACÁ TCG GGC AAA CAC CCG- 3') y BAD20 (5'- TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') que contienen sitios de restricción adecuados Xmal , Spel , Sg/l l y Xbol (subrayados). Este fragmento de PCR fue clonado en el plásmido de PCR circular. Este plásmido se usará para transformar las cepas (cps-) y (cps- porA-) del serog rupo B de Neisseria meningitidis. La integración mediante entrecruzamiento doble en la región hacia el extremo 5' de tbpA, d irig irá la inserción del promotor porA directamente hacia el extremo 5' de ATG de tbpA. EJ EMPLO 16 Sobrerregulación del gen P/7Q del serogrupo B de N. meningitidis mediante reemplazo del promotor El propósito del experimento fue reemplazar la región de promotor endógeno del gen p/7Q por el promotor porA fuerte, para sobrerregular la producción del anlígeno PMQ. Para dicho propósito, se construyó un plásmido de reemplazo del promofor usando metodolog ías de clonación de E. coli. Se descubrió una región de ADN (772 pares de bases) localizada hacia el extremo 5' de gen de codificación de p/7Q (SEQ I D NO: 1 2) en la base de dalos privada I ncyíe PathoSeq de la cepa de Neisseria meningitidis número de ATCC 1 3090. Este ADN contiene la secuencia q ue cod ifica para el antígeno PMP . El gen p/7Q forma parte de u n operón que no se quiso perturbar, siendo las pilinas elemeníos esenciales de las bacíerias. El casselle de promolor CmR/PorA fue inlroducido hacia el extremo 5' del gen pilQ sigu iendo la misma estrategia descrita para la sobrerregulación de la expresión del gen pldA. Para dicho propósilo, un fragmento de ADN de 866 pares de bases que corresponde a la parte 3' de la secuencia de codificación de p/7P, la secuencia intergénica de 1 8 pares de bases y los primeros 392 nucleóíidos del gen p/7Q, fue amplificado mediante PCR a partir de ADN genóm ico del serogrupo B de Neisseria usando los oligonucleólidos PQ-rec5-N he (5'-CTA GCT AGC GCC GTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3') y PQ-rec3-H in (GCC AAG CTT TTC AGA CGG CAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3') que conten ían secuencias de captación y silios de resíricción Nhe\ y Hind\ \ \ (subrayados) . Esle fragmenlo de PCR fue clonado direclamente en un vector pGemT (Promega , USA). Esíe plásm ido fue somelido a mutagénesis de PCR circular (Jones & Winisíofer ( 1 992)) para inseríar siíios de reslricción adecuados q ue permiíen la clonación de un casselte de promotor CmR/PorA. La PCR circu lar se llevó a cabo usando los oligonucleótidos CI RC1 -PQ-Bgl (5'-GGA AGA TCT AAT GGA GTA ATC CTC TTC TTA-3') y C I RC 1 -PQ-XHO (5' -CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA TTA CCA AAC TGA CAA AAA TC-3') o C I RC2-PQ-X (5'-CGG CTC GAG ATG AAT ACC AAA CTG ACÁ AAA ATC-3') que contienen sitios de restricción adecuados Bg/W y Xbol (subrayados). El cassetíe de promolor CmR/PorA fue amplificado a paríir del plásmido pUC D 1 5/Omp85 descrito anteriormeníe, usando los oligon ucleólidos in iciadores BAD20 (5' -TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT _^^^^^^ ATC CC-3') y CM-PORA-3 (5' -CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3') que coníienen sitios de restricción adecuados Bg/W y Xbol (subrayados) . Este fragmenlo de PCR fue clonado en el plásmido de PCR circular obíen ido con los iniciadores C I RC 1 -PQ-Bgl y CI RC 1 -PQ-XHO. Esle plásmido se puede usar para íransformar las cepas (cps-) y (cps-, porA-) del serog rupo B de Neisseria meningitidis. La integración med iante enlrecruzamiento doble en la región hacia el exíremo 5' de p/7Q, dirigirá la inserción del promoíor porA directameníe hacia el exlremo 5' de ATG de p/7Q. Ofro casselte fue amplificado a partir del ADN genóm ico de la cepa (cps-, porA-, D 15/Omp85+) del serogrupo B de Neisseria meningitidis q ue sobreexpresa D1 5/Omp85 mediante reemplazo del promotor. Esfe cassette contiene el gen cmR, el promotor porA y 400 pares de bases que corresponden a la secuencia de flanqueo 5' del gen de D 15/Omp85. Se ha mostrado que esta secuencia es eficaz para sobrerregulación de la expresión de D15/Omp85 en Neisseria meningitidis, y se pondrá a prueba para la sobrerregulación de la expresión de otros antígenos de Neisseria. Los iniciadores usados para la amplificación fueron BAD 20 y CM-PORA-D1 53 (5' -GGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3') que conten ían sitios de restricción Xbol (subrayados) . Este fragmento de PCR fue clonado en el plásm ido de PCR circular obtenido con los iniciadores CI RC 1 -PQ-Bg l y C I RC2-PQ-X. Este plásmido se puede usar para transformar las cepas (cps-) y (cps-, porA-) del serogrupo B de Neisseria meningitidis. La integración mediante entrecruzam iento doble en la región hacia el extremo 5' de p/7Q, dirigirá la inserción del promoíor porA 400 pares de bases hacia el exíremo 5' de ATG de p/7Q. EJEMPLO 1 7 Construcción de un cassette kanR/sacB para introducir mutaciones "lim pias" no marcadas en el cromosoma de N. meningitidis El propósito del experimento es consíruir u n casselte de ADN versátil q ue contenga un marcador seleccionable para la selección positiva de recombinación en el cromosoma de Neisseria meningitidis (es decir, el gen kanR) , y u n marcador conlraseleccionable para eliminar el cassette del cromosoma después de recombinación (es decir, el gen sacB9). Mediante este método, cualquier ADN heterólogo inlrod ucido duranle la recombinación homologa , será removido del cromosoma de Neisseria. Se obluvo un fragmento de ADN que contiene el gen neoR y el gen sacB expresados bajo el control de su propio promotor medianle restricción del plásmido pIB 279 (Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF , Eisensteín Bl ( 1 991 ) , Mol Microbiol 5: 1447-57) con enzima de restricción BamH\. El vector receptor se derivó del plásmido pCMK, descrito anteriormente. El gen kanR del vecíor pCM K fue elim inado medianíe resíricción con enzimas Nru\ y EcoRV. Esle plásmido fue denominado pCM Ks. El cassetle neoR/sacB fue insertado en el plásmido pCMK en un siío de resíricción BglW compaíible con exfremos BamH\ . E. coli que aloja el plásmido, es incapaz de crecer en presencia de sacarosa a 2% en el med io de cultivo, confirmando la funcionalidad del promotor sacB. Este plásmido contiene secuencias recombinogénicas que permiten le inserción del cassette en el locus de porA en el cromosoma del serogrupo B de Neisseria meningitidis. Se obtuvo Neissseria recombinaníe en placas de agar de GC conteniendo 200 µg/ml de kanamicina. I nfortu nadamente, el promotor sacS no fue fu ncional en Neisseria meningitidis: no se observó diferencia de crecimiento alg una en placas de agar de GC conteniendo sacarosa a 2%. Se construyó un nuevo cassetíe q ue conten ía el gen sacB bajo el control del promoíor kanR. Se llevó a cabo una PCR circular usando el plásmido pUC4K ((Amersham Pharmacia Bioíech , USA)) como molde con los oligonucleóíidos C I RC-Kan-Nco (5'-CAT GCC ATG GTT AGA AAA ACT CAT CGA GCA TC-3') y CI RC-Kan-Xba (5'-CTA GTC TAG ATC AGA ATT GGT TAA TTG GTT G-3') que conten ían sitios de reslricción ?/col y Xbal (subrayados). El fragmenlo de PCR resulíante fue pu rificado en gel, digerido con ?/col y ligado al gen sacB generado medianle PCR a paríir del plásmido pl B279, con el oligonucleótido SAC/NCO/N EWS (5'-CAT GCC ATG GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GCA A-3') conteniendo un sitio de resfricción ?/col (subrayado) y un RBS (en negriías) y el oligon ucleótido SAC/NCO/N EW3 (5'-GAT CCC . • ritÉ -^-^f^^r -* - - - » *•- -* ^ -*^ ATG GTT ATT TGT TAA CTG TTA ATT GTC-3') coníeniendo un sitio de restricción ?/col (subrayado). Los clones de E. coli recombinanles se pueden poner a prueba en cuanlo a su sensibilidad en placas de agar conteniendo sacarosa a 2%. El nuevo cassetle kanR/sacB puede ser subclonado en pCMKs y usado para fransformar una cepa cps- del serogrupo B de Neisseria meningitidis. La sensibilidad adquirida a la sacarosa será confirmada en Neisseria. El plásmido pCMKs se usará para transformar el cassetle kanR/SacB recombinante de Neisseria, para eliminar el cassetle completo insertado en el cromosoma en el locus de porA. Se obtendrá Neisseria recombinante limpia en placas de agar de GC que contienen sacarosa a 2% . EJEMPLO 18 Uso de secuencias recombinogénicas pegueñas gue permiten recom bi nación homologa en el cromosoma de Neisseria meningitidis El propósito del experimento es usar secuencias recombinogénicas pequeñas (43 pares de bases) para dirigir inserciones, modificaciones o deleciones en el cromosoma de Neisseria. El log ro de este experimento facilitará en g ran medida los trabajos futuros, en términos de evitar pasos de subclonación de secuencias homologas en E. coli (se pueden añadir fácilmente secuencias recombinogénicas de 43 pares de bases en el iniciador de amplificación de PCR) . El gen kanR fue amplificado mediante PCR del plásm ido pUC4K con oligonucleólidos Kan-PorA-5 (5'-GCC GTC TGA ACC CGT CAT TCC CGC GCA GGC GGG AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG CCA CGT TGT GTC-3') que contienen 43 pares de bases homólogos a la secuencia de flanqueo 5' del gen porA de NmB (en negriías) y una secuencia de captación (subrayada) y Kan-PorA-3 (5'-TTC AGA CGG CGC AGC AGG AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG CTG AGG TCT GCC TCG-3') conteniendo 43 pares de bases homologas a las secuencias de flanqueo 3' del gen porA de NmB (en negritas) y una secuencia de captación (subrayada) . El fragmento de ADN de 1 300 pares de bases obtenido fue clonado en el vector pGemT (Promega , USA) . Este plásmido se puede usar para transformar una cepa cps-del serogrupo B de Neisseria meningitidis. Se oblendrá Neisseria recombinanle en pacas de GC que coníienen 200 µg/ml de kanamicina. Se seleccionarán integraciones que resulten de un entrecruzamiento doble en el locus de porA mediante PCR con iniciadores PPA1 y PPA2 , como se describió anleriormente. EJEMPLO 1 9 Protección activa de ratones inmunizados con ampollas de Neisseria meningitidis recombinantes v de ti po silvestre Se inm unizó a animales 3 veces (vía intraperitoneal) con 5 µg de los diferentes OMVs adsorbidos sobre AI(OH)3 en los días 0, 14 y 28. Se realizaron sangrías en los días 28 (día 14 Post I I) y 35 (día 7 posl l ll), y se desafiaron en el día 35 (vía iníraperiíoneal) . La dosis de desafío fue 20 x de LD50 (aproximadameníe 1 07 CFU/ratón) . Se moniíoreó la fasa de mortalidad d urante 7 días después del desafío. Los OMVs inyectados fueron : Grupo 1 : ampollas de Cps-, PorA+ Grupo 2: ampollas de Cps-, PorA- Grupo 3: ampollas de Cps-, PorA-, NspA+ Grupo 4: ampollas de Cps-, PorA-, Omp85+ Grupo 5: ampollas de Cps-, PorA-, Hsf+ La figura 15 ilustra el patrón de estos OMVs medianíe SDS PAG E analizado (linción de Coomassie) . 24 horas después del desafío, h ubo 1 00% de mortalidad (8/8) en el grupo control negalivo (inmunizado sólo con AI(OH)), m ienfras que los ralones inm unizados con las 5 diferenfes preparaciones de OMVs esfaban aú n vivos (7 a 8/8 ratones sobrevivieron) . Se monitoreó íambién la enfermedad duraníe los 7 d ías, y los raíones inmunizados con las ampollas sobreexpresadas en NSPA parecieron estar menos enfermos q ue los otros grupos. Es posible que PorA presente en las ampollas de PorA+ confiera amplia protección ante la infección por la cepa homologa. Sin embargo, es probable que la protección inducida por ampollas sobrerreguladas en PorA se deba por lo menos hasta cierto grado a la presencia de una cantidad incrementada de NspA, Omp85 o Hsf. EJEMPLO 20 Inmunogenicidad de ampollas recombi nantes medida mediante métodos de ELISA específicos v de cél ulas enteras Para medir la capacidad de los anticuerpos para reconocer los anfígenos presentes sobre la superficie de células Men B, se pusieron a prueba los sueros reunidos de ratones (del ejemplo 1 9) mediante ELISA de célu las enteras) (usando células inactivadas por tetraciclina), y los títu los se expresaron como títulos de punto medio. Todos los tipos de anticuerpos de ampollas inducen u n alio íííulo de Ab de células enteras, m ientras que el grupo control negativo fue claramente negativo.
Se llevó a cabo la respuesta específica de Ab a proíeína HSF recombinanle disponible. Las microplacas fueron revestidas con 1 µg/m l de molécula de HSF de longitud íotal. Los resultados ilustrados en la figura 16 muestran que h ubo u na buena respuesta específica de HSF cuando se usaron OMVs sobreexpresados en HSF para inmu nizar a ratones (usando -j . l HSF recombinanle purificada en las placas). Las ampollas sobreexpresadas en HSF inducen un buen nivel de anlicuerpos específicos.
SEQ.D)NO:l Secuencia del Nucleotido del vector pCMK(+) t rcu^t:«pcoCTcacTC C^^ A TACGpTATeCACM-V TCA>3GGC ^^ AAAAGQCCC prrGCTJCKXTrrri CCATAGGCTC^ TCCX A ACCCaC «M»jCTATA aTACC fl^^ cx:cscntAccGcatAcpCTc8^ (jjA8it Tcr 8ctKpsctACAGAGvrc ^ cxx;ctctijCrjAAGca«ptACCtrcGca^^ TG cexpOiotcxia cavAAACTCAcgp TAAA.p.AAAAATGAACTTTtAAATCAATCr^^ GA8C?CCTATCK?GCG^^ GGAG8CTRACCATCTGGCCC AGTCC.^^ ACCAGCCAGCOKAAG8CCGAE^^ cGGttAftacrccrrcsítcctca»tcsttstc^^ CATAATTcrcTTAcrsrcATGX?TccrrAA? srt7rAtc?GscG>^auAtrtscrctTC AAAAAA8Gj?ATAA8aCaACACG VAATtm^^ A??GTC&CACCTCI?CGTCTAAGA?ACC^^ OU3CACiATICT. CTaASAG^^ CAGarC n I'lAACauVTASGCCG TCSGC ^ GATGG CCACTACsrt3AACC?TCAC aUUlTC?A(>rT^^ (jKXKrr GGcx xrtGGauupGT?GC^^ AtgTCCTGCAACreCGATTAAGTrsGgrA CGCC C^^ 8cGGG ATccAGTccGrrcacrttcGgrcAtrrcc^ mu, ív» AtAgrACGG ACCGAt.C Ci,GGlT.H. ,C^^ AGa_CAtcGexxaxAa»Gsrc^ GTGTCTCAAAATCtCIt?T_TTACAtTC«?CAACavtAAA^ ?CTAATACAVJIJGC?XGGGATGJX ATACT .^ISáii i LJ ATGxxx?G?spfrrrcTGAA? »»^^ GCTCACGCHUOTTATOCCTCrTCa^^ TCCrCOGGAAAACACK?TTCCACsTATjtAOAAiV^ CTGCGccstfn tiqapc ?iuT n?it-Li i i t CA8carcGa.r ?trrcGtctcsCTcaGGCoa>ATC ACGAATGAATAACG?rpCGTrj?TC>t AGT? AAATGCATAAGCTrrrGCCATTCTCACCGCUrraV^^ aiGTKA ATrAATAgGTTsrATTGATO ctt?:ctcG<p?3Acrrp crccrrcArrACAaAAAC^^ TGCAGt?tcAttrGAri?tswrGAGttttrCT ÍA_^GACCÜTGAA T G<-AA GCAA AGTGC A ATCA C AC^^ CCTCACTTTCTGG?X^TGATG88^ CCCCXCCCCCCCCRGCAGGAGGT^^ TAtAT AAAAtATAATCATl 11 lA A TA AOJ íCCKKarrr TCaGAra^^ 111-CGGG rCAAATTTACAAAAGCUi?íJ CCATATGCATCCTAGGC rATrAATAT^^ CCaLrrAarrCTAGAACTATACCrACCATGCGCAA^ TTCCCTAykAACGCAATAA 8CATCGGCAAC^^ TTCAGCCCCAAACAAAAACCCG(»tACGCyvAGAAAA?í^ crrAtrrcGA^ttt?tsGctTCatttGCA^ AAAtGCGCCAAAAAATTTTCAATTGCCTAAAACCtr CtAATATIt^^ -rrTra AATGACAtTsAGCATAAAArrtTAGtAAc^ KJ-ATCTAÜÍ'CIUI IKÍ'ITICAGTTA'?^ CI-rri lU tAATrüriATCCGCTCACAATT CAC^ TGCCTAAIGA? C<jUÍCTAACTCACAtrAApGCtXn TGCAXTA?TtjV-TCGCCr??Ctj^GCaGOS^^ SEQ.IDN0:2 Secuencia del Nucleoíido de la región de ADN (997 bp) ascendeníe desde el gen NspA en la Neisseria Meningitiditis cerogrupo A cepa Z2491 8??cccuAC?CGca?rrc8ru^^ TACACGc?x?x?roGAAACKx?x¡sCTtr^ AATrTGAACTACTT5lAK2SjCTtt-»XX^^ ceuuxreaccCTCCGCcgctGC TtK^AKi?sCGCACCGsCffrACCGAGtGCCAAAAT^ CGACrCOSCCGTATTCCGCCCGACCCL-^^ ACAAAAACCAGTACC TGGCCTCGCCTGA!^^ tccsrACTATCTCtACi?ici ^^^ «^CCaCC8sGAAAACCCCCCCGAACtí^ ptK^ACAAjj^ sACAt?TAC8CTsrrrrrrccAA^ CCATTTA?AGGjCAACGCscaXptAACGG TTtsCCG SEQ. roNO:3 Secuencia del N ucleoíido de la región de ADN (1 000 bp) ascendente desde el gen D 1 5/Omp85 en la Neisseria Meningitiditis cerogrupo B cepa ATCC 1 3090 ACCATTOCCGCCCGCOCCUMC?G CAAAJ^^ CCG<aCCATCGAtCK:CgCAGGCAC^ AAATCA??vC?nTIKX<33TGSCC7rGG?AA?AGGC^ GCCGCCGACGaCAAACCCATTAC ATGGC^^ (aAC.ACGAACsCCeCCGACAAACCtlA.ACCre G ?TTcaccATt?jscTtx?aAAAAAcccrrp-ccc^ sx:ctccGTCAGCC TAtpxxGccccGct«j-ij ?^^ AtrtGaAAi-1-rrii^cACTG rra'ji-A^TC^ CI U Ü? I' JJA?GCCO ATCGAT CGCIWC AA I II^^ TGCCGTC?GAAAaMC?TTexGCACCAaij^^ SEO. ID NO 4 Secuencia del N ucleotido de la región de ADN (1 000 bp) ascendenle desde el gen Hsf-loke en la Neisseria Meningitidiíis ATTCCCGCGCAt^GGßAATCCAGAAACGCAACGCAACAGGAAT^ CC«»A?JU;CG«SAATCTAGAAACACA-CGCGGM^ ;-JkACCO8UlTCCACaCCCCTCGGCA^ CTTTCGCGGG?ATGACßAGATTTTAGATTAtGGGAATTTATC^^ TCAGAAAAAACAOUUCCCCCACCGCGTCA.rrCCCGCGC^^ AAAAAACCGAAACCCCACCGACCG.CATTCCCGCAAAAG^ AAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATC^^ Jtt??ACCCC?CCGACCGTC?jrrCCeGCAAAA8 AAACCCCCACCGACCCTrCArrCCCGCGa'^ ACCCCACCC?CCCTOttTCCCGCAA?AGCTGGAA^ CCACCGCCGTC?TTCCCGCAAAAGCGGGAATCC?GACC^ AAA?CCGGGCGGA.GCCGC?CCATCCGCCCCCAAACCCCG^ Secuencia del Nucleoíido de la región de ADN (772 bp) ascendeníe desde el gen PilQ en la Neisseria Meningitidiíis GCGATGTCGGGAAGCCrCCTCCCGAATCATT?CCCCrrGAGTCGCTGAAAAtCGCCCAATCTCCG^ C?TGACGGC?AG?GC?GC?TCCTGAACCTa 8C?p^ AGAAGCGGCACAAAATGCCGAsC?AAAAT?ACTrACGT. AGGGAAAK^ G8TCTCTCCG GTGrrCCCA?GGTrCTGAGGACCTAA?CGA?TGG?TGGCAC?» ' CGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAA tCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTrACAGG8 -TCCGCCGCATGGAA?CCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCG?CAC tTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTrrGAACTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCW ACACTGTCGGTCTCGGCAACTA.reGGGACAAAACTACG^ GAGCTC?TAGAAGACAGCACGGGCAACTGGsTtTCCCGTAAAGCAGAACtGCTstTsAAT^ ACAAGCGGClAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTACTCCATr SEQ. ID NO.6 Secuencia del N ucleoíido de la región de ADN (1 000 bp) ascendente desde el gen Hap en la Neisseria Meningitidilis. GTGCGGCAJ?AJ-WAGCAAAAGCCCGCTGTCG^ GGCTTGGJGCGTGT-CCCACACAAAGCCTCTGC^ GCGCCCGßGTGCGCTAGCGACTGCCGC?ATCGTT^^ ATTATAGCAAAT8CG.CTGaAGTCCG?CGGTrrGßCTCT^ CGCCTGACCtAATATJ?CCATATGGAAAAACGAAA«CA^ CCATCCCGCAAAA?CC8CATCCGCCCCAATCCC8^ AGAA?GCGCG?AAATGACCGAAA?CGCAC?GGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAA?CCGTCGTC?AATCCCCGG?GC TCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTCKyiMTAATGATAGCCCGGCGTTTCCATtCGGGATC GACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGAC?GCATT?TGGK^VA scACGAAACCATACGGauiG?ccAAACCTrcAACAGGCK TTTT.GCCGTCTTCCTCGTATG ?8GGCT^ GGTG ITrCGTGATrGG?AGAAGCCG?G?CCA?GGCA?AAATTA?rrGCAAATCCTAG^ Í?GCCGAACCGCACATATAGGCA<»TCCCGCGCGCCGCCG TCAGATAAGGAAAAATA SEQ. IDNO:7 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (924 bp) ascendente desde el gen NspA en la Neisseria Meningitidiíis (cerogrupo B) (ATCC13090) GGAACCGAACACKCG,rrCGGTCAT?CGCCGCCGAM tAC3VCG8GCGCTGGAAGGCCCGG< "ITG.CCACTACGAAA AATTTGAACTACTGGCACíreCGGCGACTATTrAGGCATAGGC8 CGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCIAACGACTAC^ AAACCGTTGCCGCCGAAGATTTGCCGTTrGAGT.CATGATGAACK^ TGCAGG?GCi3a«GGGCGTACCGAGtGCCAAMTCAT8CGCAM^ GACCCCSCCGTATTCCGCCCGACCOAAAAAKaCGCr^^^^ CA????CCAGT?CGGCGrrGC tCGCCrTAGCTCAAAGAGAACG?TTCTCT?AGGTGC GA?GC?^ CCGTJ?TATTTGtACTGTCTGCGGCTTCGTCGCC^ CGGCCKCCGCKaUUVACCCGCCCCGA^ GCG"mCAGACGGCACAGCCGCCGCCGCa^TGTCCGA8^ GCAACAATCCGACAGATACCGCTtVpTI I TCCAAACCG TTGCA SEQ. ID NO:8 Secuencia del Nucleoíido de la región de ADN (1000 bp) ascendenle desde el gen Fro 'ABAGT eGnGGM laT N CTeAAisAsAAeTriGAaAA MAGeCnAAiC?AaÍiGtAidATitirisrA. (cerogrupo B) GGGAATGAC& GACAG<?GTTsCTsTTATA_TGGATGAACAAAAACCAGTACGTCGtT ACGApCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAA.CGGTTCCGTCCTAT^ GATTTCTGTtCÜl' tCGGTTATTCCCGATAAATTACCGCCGtttCTCGTCAirrC'frfAACCCTTCGTCATTCCCGCGC AGGCGGGAATCTAGTTrTrTTC_«^TCCA?TrrGTTtCTGATAAATTCTTGCAGCTrrGAG^ TGGG?ATGACGßTGGAAAAGTTGCCGTGATT.CGGAT?AATTTrC^ CGCAATCTCAAATCCCGta.TTCCCCAAAAACAAAAAATCAAA^ AGACCTTAGAA CAGOVATArrCAAAGATTATCTGAAACTCCGAGATTCTAGATTCCCM TmAGGTTTCTGTrrTTGGTTpCTGTCCT.GCGGGAATGATG^ AAACCGCTCCGCCG?CATTCCCG?TÓAGGCTTCGTCATTCCCGCGCAGGC?TCGTCATTCCC TATTCCCGCCGTTTTT?ACATTTCCGACAAAACCTGTCAACAAAAAACAACACTTCGCAAATAAAAACGATM TGCAAAAATCCCCCCCCCCTGTTAATATAAATAAAAATAARRAATTAATRATTTTTCN'ATCC?GCCAAA?CTTAACGGT TTGGATGGACTTCCCTTCATACACTCAAGAGGACGATTGA SEQ. IDN0.9 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen FrpA en la Neisseria Meningitiditis (cerogrupo B) CTATAAAGATGTAAATAAAAATCTCGGTAACGGTAACACTTGGGCTCAGCAAGGCAGCTACACCAAAA CCGCAAAAATG?X^TTTACTM?GC?GCCGACAATCTGCAC^ GTrCGGG?AAACACGATrTCCCCGl' lGITt?AGGCTCrCTAAACAAATAACCATAAATGTATATCTTtATTtAAAATAA ?T?AA?GT?TTTA?CT?TT?TTGACGA??TTrT?GAGAA?G?GT?GACTGTCGATTAA?TGACA??CA?T?GTGAGAA?G GA TATTtACTATCCGAGCACAGAGCATATTTrAGGTAGCC.CTAACtGTTCCTGCtGGCGGAA« CTTACCCt»GAATAA?TGTCCTGTTGTG.sA.ATGGATGCCAT^ TGAATGAA?CCTCTCGTTG »GAATtTGAAAACGC.ATm GCTGCATGAAACCGTGttGGAATAAATGCACACCTACGATAATTAATAATTTTCGT T t l? GATTCTACAAGCTATGTATA TATsATTGCTAAAAGTTTATTrTTTAGATGCCAAAA?ATATATrTTATATACTr^ ATATATCTTACGATGGGGAAATArrTATATATTtTATAAtAAArrrTACrCATTTG r AATATGTCATGGAATAtTACTT GTATTTTGTAGAAI. ri'TCCATATGAAAATArrCCATTTACTAIitlll.TGAACtTTATtAGTrTA.Tt'l IAATAII I'l 1 A .- i i ACCtCWATATrrACCAtAAGAGAGCTAATTGAtTCATATTATATTGAGtCGATAATTAATTTATTCTtAATTtTMTTC CTCACGTTATTTTTTTAArrTACTrGAAAGGAAAGCAßAT SEQ. ID NO: 10 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendenle desde el gen FrpC en la Neisseria Meningilidiíis (cerogrupo B) 5 GGAAACAGAGA?AAAAGrWCTCTTCTATCTTC^tAAATATA^ TAAGTAGTAAAAGrrAGTAAATTATTTTTAACTAAAGAGTTAGTATCT TTGAAATTA-GAGACCATATGCTACTACCATTTATCAACTTTp^ TGTGAACCTGTGAATGAAAAG?C?G?TCAAAAAGCAGTA?GTGCG UlCAGGCT???G?ACAAACC^ CGAGCCAATGACAGGATTTGAACATACGGnACATTrGATTTTCAGGGCACCAAAATGGTTATCCCCTA^ CACGGTATACGCAAG?avATGCC?CA?AATGGCrpCCGAtt^^ ATTAGCGTCTATTACAAAAAAACCGACCAAGGCTGGGTTCTTGAGCCATACAACCAGCAAAACAAAGC^ ATTTCTACGCGACGGTTTGGATAGCGTC?»CGAtATTGTTATCCGAAAAGATGCGtGTAGTTrAAGTA^ AAAGAT.GCTLTACTTACGGGGTTAAAAAAATGCCATCTGCC.ATOT CCTGAAAATCC?TArrTTCATG?ArrTrACTATATtAAAAAA AATAAACCAAACTGAAGAAGATAGTTATAGCACTAGCGTAGGTGCCTCTATTAACGGTTTCACGGTACAGTATTACCCGT TTATTCGGGAAAA?3C?~CAGCTC?CA(-AGCAGGAGrrGGTAGsTTATC^^ GTAAACAATTCAAATAAAAAATAATTGAAAGGATCTTATT SEQ. IDNO.ll 10 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen SEQ. ID NO: 12 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (772 bp) ascendente desde el gen PílQ en la Neisseria Meningitidiíis (cerogrupo B) (ATCC13090) GCG?TCtCGGG?AGCCTTCTCCCG??TC?TTACCCCTrGA^ C?tG?CGGCA?G?GCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCApGCCAC^ AGAAGCGGCAO?AATGCCGAGCAAA?ATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACAC^^ 20 GGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAßGTTCTGAGGACCTAAACGA?T^ TCATACCTTTCCAAGC?CCTACCCTGCCGCTrGCGCCeGTATA^ TTCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCCT^^ mGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGTCTGGACAGA?AGTCTCC^^ ACACTGTCGGTGTCGGC??CT?TTTGGGACAAAA>rr?CGGT?GAATCG??AGC?TT?CCGACGAC^ GAGCTGATAG??GAC?GC?CGGG ?ACTGGGTTTCCCGT???Gl^G?ACTGCtGTTGA?TTCTTCCG?C?AAA^ ACA?GCGGC?GC^CCTGCCGa^AACA?AATT??GAAGAGGATT?CTCC?TT SEQ. ID NO: 13 Secuencia del Nucleolido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Hsf-like en la Neisseria Meningitidiíis (cerogrupo B) /- tpGrp 'crrrrcstttGtpci tcGTTAAAtcGGGGtp j GGtTGGGGGri ICTGATAAATTCeCCCAACTTAAAATCTCGtCATtCCCGCGAAGGCGGGAATCTGGGACCT AAGGAAACTGTTTTATCCGGTAAGTTTCCGtGCCGACGGGTCT8^ TC.GTTTTrTCCG?T?AATTCCTGT.GCGTTCCGTTTrtC<^^ GTrtTTrCCßATAAACTCCTGCCGCCTTGTGTrTCt MATTCCCGCCTGCGCGG<a?TGACGCT TTTTGCtGATAGATTCCTGTGÜ f T t 'p-CGGTTGCtGGATTCCCGCTTTTGCsGGAAtGACGGTCGGTGGGGTTTCTGTTT ttrccGAtAAAttcctGtt x:GtrstsrrtctGGATtcccGCCTGCGCGGGAATGACGCGGtGGGGGit?ctGt?t?ttc CGAtAAATTCCTGTTGCGTtGCGTrrTTGGATTCCAACTTTTGCGGGAATGACGGTCGGtGGGGTTtCGtj.i 1 m J.CCGA TAAAGTCCT_CCGCGTrGTGTtTCtGGATtCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGCTTrCtCTTTTTTCT TTCCTGtGGTTTTTCTATGGAttCAATCATTCCTGATAAATTCCCATAATCTAAAATCTCGTCATTCCCGCGAAAGCGGG AATCtAGGACGTGGAATCTAA8AAACTGTTtTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGArrcCCGCTtTtGCGG GAATGACGGCGGTgGGPrrrCTGTtTtTtCT iVATAAAstCCTGCCGCGTTGTGTTTCTAGATTCCCG^ GACGGCGGTGAGG-rTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGT SEQ. ID NO: 14 30 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Hap en la Neisseria Meningiliditis (cerogrupo B) iiBiiÉÉfÉÉii AATCAGavTAGGTTGCCACGCGCGGCTTGGGCGrrTTCC?CACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGGTTTrrCCC^ ATGCGTATUCG :CC?CGCCGCCGCGCCCGGGTGCGGTAGCGjVi rrGCCGC??TCGTTGGAACGTTATCCGAC?T??AACC CCCGAAAATTCAA??CAGCC8G?TTAT?GCAAATGCCGTCrGA?GTCCG?CGGTTTGGCTTTUGACGGCATAAA?^ CAAAAATGCTTGATAAATCCGTCCGCCTGACCTAATATAACCATATGC?AAA?8^ AT?GGCTCGCTGCTGGGTCTGTTCCATCCCG«AAAACCGCCATCCGCCCr^ CGGCG?TTTrC??CGCGCC?T?G?G?AAGCGCG?AAATG?CCG???ACGC?CAGG?CAAGGCGCGGC?GG rGtCG???C CGTCGTC??ATCCCCGG?GCTTGTCG?GC??ATCCrGTCCG?CGAGTACGTGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCC?TT CGGGATCGTTCCCGCCGCCGTCCGACTTGGCGa?TA UCGACAp^ GCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCGO?CGAAACCA.ACGGCAAGACCA?ACCTrCAACA^ MTC?GCGTWTCCrGATACTG rrrTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCG GCGGC?CAGTGGTTGCCjrrGGCGGGTG rrTCOTGATTGGjUG?AGCCG?G?CCA?GGCA?AA?TTAAp GGGCGTGCTTCAT?TCCGCCCG?ACGCCGAACCGaU»TAT?GGC?C?TCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCC CTCCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATA SEQ. ID NO: 15 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen SEQ. ID NO: 16 Secuencia del Nucleolido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen LbpB en la Neisseria Meningitiditis (cerogrupo A) CGGCGTTAGAGTTT^GCGCAGTAAGGGCG GTCCGCCCTGAGATCG^^ CrrrGACrrTTTTrGACCrAAaSGTCaVAAGakCCCTTACTGCTTAAAGTCCAACGACAW TTATTACCCTAAAATCGAAaVCCCATAAATGACCTTTTTTGTCTTTGGCGjAGGCGGCAGTAAGGGCGCCT^ ATCTGTAAGTTAT'IATTCCGTTAAATAGCCTrrACtGACTTTGAGpTTTI'GACCTAAGGGCGGACGCGCCCTTACTGCT TCACCTTCAATGG TTTGAATTTTGTTCGCTTTGGCTTGCTTGACCTAAG KTGAAAGCACCCTTACT8 A?AGACGA???GGGTTATTT?CGGGGGTTGG?TTTT?GGC?GTA?GGGCGCGTCCGCCCTrAG?TCTGT?AGjnATG?p CCGTTAAATAGCtrrTTACTaACTTTGAO T TT TTGACerAAGGGTGa>AACCACCCrrACTGCrT(aCCrTCAATGGGCtT TGAATTTTGTrCGCTCTGGCTTGCrTGATCTAAGGGTGAAAGC_U:CCTTACT TTTACGGCGTTAGAGTTTAGGG ?CTAAGGGCGCGTCCGCC rTAGATCCAGACAGTt^CGCCTTTGAATAGTC» GCCAAAGAACrCTA?AACGCAGG?CCTAAGGGTG?AAGC?CCCjrrACTK TCCACGCACCCTTACTGCCCTACGtCC?CGCACCCTTACrGCCCTACATK^ ACAGACGCCGAGCAGCGGAACAGGACTAAAAACAATTAAGTGATATTTTTGCCa?CTATAATAGACATGTATAATTATA ji?ACTATTAATAATAATTAGTTTATCCTCCTTTTCATCCC SEQ. ID NO: 17 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (731 bp) ascendente desde el gen TbpA en la Neisseria Meningitidilis (cerogrupo B) (ATCC13090) TATGAAGTCGAACTCTGCTGTTCI?CCTTCAArrAtCTGAATTACGGAATGTTGACGCGC AAAAA _AGC??GTCCGCG?TGa G«»GGAG?AAGC?GT?GTCAAGCTGATGCT?A??CG GAAO>>AGTTGG?CAAAGTATGTTCCTCaMGGCGAGCGUCCGATG???A?G?GATTCCA AAC»CC??AACGTCGTTT?TCGGGGGTCTTOjpACGGGaT?TTGC WCGGC?aV?GC TGGAGCGGCAATG rrtCCGATAAAGAGGGCGGCAACAGGGCGGACTTTACTsTGAATTTC GGTACG??A?AA?TT?ACGGC?CGTTAACCGCTG?C??C?GGCAGGCGGC?ACCTTT?CC ATTGTGGGCGATATTGAGGGC??CGGTTTTTCCG pACa^GA?A?CTGCTGACTCAGGT TTTG?TCTCGATCAAAGCAATAAC?CCCGC?CGCCT??GGCAT?TATCACAA?CGCC??G GTGCAGGGCGGTTTTTACGGGCCCAAAGCCGAAsAGTTGGGCGGATGGTTTGCCTATTCG G?CG?TAA? ?^CGAAAA?tGCUC?G?TGCATCCGGCAATGG?A?TTCAGCAAGCAGT GCAACrGTCGTA'TTCGGTGCGAA?CGCCAA?AGCCTGTGCAATA?GC?CGGTTGCCG??C AATav?G?AT??GGCCTCAG?C iOCACCGCTCCrTCCGATACCGTCTGAAAGCG?AGAGT AGGGAAACACT SEQ. ID NO: 18 Secuencia del Nucleoíido de la región de ADN (373 bp) ascendente desde el gen SEQ. ID NO: 19 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascenden ;e desde el gen Pial en la Neisseria Meningitiditis (cerogrupo B) TTTTGGCTTCCAGCTrTTCATTGtTTTCsTACA?GÁrC^ r tllll l i^AAÜl ri üACCCTACTCTCATt-AAC^ TTGAAAGCAGT8ULGCAGGeGATAAAGCTK AAAAGCCsrCTCTCTGaUkAACtAAAA8 «nTGATACGCGATAACC i-GAAAAfrCIGAAGCC sACs^ aXXX¡GO?AATCCC<»AATO3^^ J 0 ATCCL-?-ri-l^ AA -A tATGCCG C TGGqGGCtX^G SEQ,ID NO:20 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen FhaB en la Neisseria Meningiliditis (cerogrupo B) TACGGAAACTGCAAGCGGATCCAGAAGGGACAGCGTGCATTATTCGGTGCCCG AAAAAAATGGCTGGTIICITTTAATC ACA?TGG?aTCGTr?CaiCGA?GC?ACCGA?GGCT?TTCCG>TavATT?CG?TT?aUVC^^ CTGGCCGCCGACTCGCATa rtTGGCGTAAC^C?CtTCATAA^ T?A?TACATCGACGATGC aU?TCGAAGTGC?j?CGCCW^ ACCTCAACCGTTGGCAGCTTGACGGCAAGTTGTCTTACAAACGCCK^^ GAAAACGßCGGCGATATTCTTCC?GGTACATCTCCTATGAAAATC?^ 15 TTTAGGCAAACAGCA l'l'11 ICTACGq CWCCATTaVAGCTaaTGGAACjAAAACGCCGTTGGTTGCCCA&GATAAAT TArrCAATC6GaVGCC K:TACACCGTTCGCA>5AtTrcaTGGGGAGCAGAGTCTTTTC8 AATACTTTAACrtGCTATTTTíaTCCGAACC?TCAGTTCTATCrCGGTGCGßACTATt^ At^TATGTATCGGGa?GCAGCTGATGGGTGOVGTGGTCGGCTTC^ ATGATCTGTTT8CGGa_.GCCGCTTCATAAACCC?A?GGCTTT«GACGA^ TAajjGTjpCTAACCTCTGAArrr rrACTGATATTTAGACGdTCTTTC ?CTTGGCGCGaup?CG rC?TCjpCA???TGGA?T?GAC el gen 5 SEQ. IDNO:22 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Tbp2 en la Neisseria Meningiíiditis (cerogrupo B) CCTACTCacCGATTCCAATATGCTCCGCGCGACCCACCMGCCAAAGACp GT ??ACCCATTATGGGCCnrTsCCrTTTGGG?CGAAAACGrrGAA^ ?GGCGTGCCGGTTGa^CTCA?CGGCAA?G??TACGCCG?CCCCGTCGA? rCpTCCTCGA?GC ??CCGCATC GC«CGGCTrGGGTAT«AGCGACCAAATCGAAAACCGWTCA.rCC^^ ATGGCGI TG f !O(^CATCGCCTACGAACGCTTGGTGACCGCXaT«aa\ACGAAGACACCATCGAAaUlTACCCCATCAA CGGCCrGCGCCTCGGCCGTrrGCTCTACCAAGGCCGCTGGTrCGACAGCCAAGCOT GCTGGGTCGCCAAAGCCGTTACCG8GAAGTTACCCTCGAACrGC rc^ 0 TCGCCC?ACCTGACCTACC?ACCCG?ACGCCTG?GTATGGA????GTCG??GGTGCGGCGTrrACCCCGCTCGACCGC?T CGGACAGCTC?CGATGCGC?AC(rrcC»CATCACCG?C?CCCGCGCOUUlCTGGGC?TCT?CTCGCA?AGCGGTn CGCTGGGCGAAGCKrrCGGTATTACCGCAGTtGGGCAATAAGAAATAAGGTTTCCrU GCTCGTCTGAAAAG?TGATCCCrmTGTTAAAA8AATCCrATGA^ TTGTCCAGCCTsrTTTrCG€CGCGGa^ßGTCAACCCCG^ C rGGCGGGTCGAGACCTrrGCAATAACATAGGCTACTAA SEQ. ID NO:23 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendeníe desde el gen SEQ. ID N0.24 Región promotor del gen PorA de Neisseria Meningitidis (serogrupo B) GATATCGAGGTCTGCGCTTGAATTGTGTTGTAGAAACAa CGTTTrtGAAAAAATAAGCTATTGTTTTATATCAAAATA TAATCA'l IW IAAAATAAAGGTTGCGG ;ATtTATa«atATTrGTTCTGAAAAAT8TTTTTTsCGGGGGGGGGGGTATA ATTGAAGACGTATCGGGTCiTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATaUlATTTAaUUUVGGAAGCCCAT SEQ. IDNO:25 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen SEQ. IDNO:26 Región promotor del gen PorB de Neisseria Meningitidis (serogrupo B) GTTTRCTGTTTTTGAGG<AATGACGGGATGTAGGTTCGTAAGAATG^ ATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGAACGTGGAATCTAAGAAACCÜT?I LATCCGATAAHI"!II CGTGCGGACAAGTTTG GATTCCCGCCTGCGCGGAAATGACGG^ARRNRAGGTTTCTAATTTTGGITTTCTGTTTRTGAGGGAATGACGGGATGTAG GTRCGTAGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCGT?TTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCRRAGAA CAAC?GCAATATRCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTCRAGATTCCCG^ ATGACGGTTAGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTG GGAAGCACTAAGTGAATCG<GGTCCGT ACTATTTGTACTGTC?GCGGCRRCGTCGCCRRGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTAT SEQ. ID NO:27 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen siaABC en la Neisseria Meningitiditis (serogrupo B) ATACGGCC^TGGCTGCAGAAAGCGATAAGCCTCTGGCTGAAAAACC^ CGTAAAGGTATAGGGATTGGTAATCATGGTAACCACAT?.CCGCGACG?>.GCAAAATATTTTGTCGCGGATTTGCAACTA AATCTTCCAAGGCAAOLGTRCGTACTAMTTGCCACGTGT?WBRRGCACATTCGTATCCTGCA^ CCTACCGCAGCC?CCGC?TCCAACAMCG?XACCGGCTGCCCT CGACACATTCGCCGCATTATTCTGCACCAAACGCACCATCACTTGTGGCTGATTGGCCAT T I T'TL' RCAGGCGGCCTTTAA TAATTTCCTGAACCTGACCAG?CGTTRTACCGAC(?CCGAAATATCGCCAAOU>ACG«? GTGACC^CRGCRCTGGCAAC?TAGTRTGATGCGCAC.ACCCGAGCCC^^ CGGCGGCGCTTCCCAAATWTAATATCCAATACATCACCAATATTTAGCGTACAGCCGAAGCATAACCATCGCCAAACT GA_TGAATGACTGATTRATCRGAGCCT.ATATAATAACTGAGCAACCCTATGACT^ ATTRGAACTTCAGATTGTTGCCCTAAAGAGA?AIITTTTRTGCGCTGGGGCCTGATGAAGGAATCGCAGAGCATCCTAC AATTAAACTTCCACACAATAATAATACTGCGTGACGAATATAAAAT?TCACT TAAACACAAGCCAAATCCTAATATAAT TATAAATGGCCTAATTATAGCACTTAATCGAAATAAATTTATGAGTACGTAGAGTATAATTAGTATTC TCTTTCCAACT TCCTTATACTTATATAIATATACTTATAGATTCTAAAAGC SEQ. ID NO:28 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Igt en la Neisseria Meningitiditis (serogrupo B) GCCAAAGC?TTGGGCGCGGATGCCKCGCTGCCGAACGCGCCGCGCCT CGGCGAGTTCCCCGAACTGCAAGGCACGATGGGCAAATA GATGCCGGTTTGGACSGCGAAACCGAA CCGTCGAGCAGC?CTATCAGCCGCGTTTTGCCCKCGACAAGCT8C^^ GACA??CTAGAAACCTTGCTCGGUTTTG8GCATCGGTCTGAjnCCG?CCGGCG?C?AAG?CCCCT?CGC^ CGCTGCOTGGGTAr GCGTATGCTGATKACTATGGrrTGG?CCTGA TCCCCAAAGGTTTGCTCAACC?AAAAACßC8TCTGAAACCGCCGAC . ^ AACGATTATCXGC.AGACATCGTrGX:CGCCGTACTCGCaVAACA«^ 5 8CCGTTGCC«C?rrCAAAC?ACTGCCCGAA8CKCGCGCTCGCCGCC«^ AAGCCGATGCCGAGTTGGGCCK^GTTAACGAAACTCCTGTTGCAAWGGACGAAGAAAAAGCCCTCT^ GGCnGCAGCCGAAAATCGCCGCCGCCGTCGCCGAAGGCAATTTCCAAACCGCCTTGTCCGAACTGGCTTCCGTCAAACC GCAAGTCGATGCATTCTTTGACGGCGTGATGGTAATGsCsGAAGATGCCGCCGTAAAACAAAACCGCCTGAACCTsCTGA ACCGCTTGGCAGAGCAAATGAACGCGGTAGCCGACATCGCGCTTTTGGGCGAGTAACCGTTGTACAGTCCAAATGCCGtC TGAAGCCTTCAGACGGCATCGTGCCTATCGGGAGAATAAA SEQ. ID NO:29 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen 10 GGGARRRCAGCTT?TGGGTATT?ACCGGAAAAAA VGAAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGGTC TGTCGGTGCGGAAACTTATCGGATAAAACGGTTTCTTGAGARRTTTCGTCCTGGATTCCCACTTTCGTGGG^ AA?VGAAACCTSCTCCGCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGAC^^ GAAACTCAAAAAACTGGATTCCOICGTTCGTGGGAATGACGTGGTGCA8TTTCCGTATGGATGGATTCGTCATTCCCGC GCAGGCGGGAATCTAGACCTTCAATACTAAGGCAATRRAT WAAATGACTGA^ GTGGGAATGACGCGATTAGAGTTTCAAAATTTARRCTAAATAGCTGAAACTCAAC?^ ATGACG?AGTGG?AGTT?CCCGAUCTT???ACAAGCG?jAACCGAACGAACTGGATTCCCACTTTCGTGGGA?TGACGG? ATGTAGGTTCGTGGGAATGACG<K:GGAGCGGTTTCTGCT'RRT?CCAATAAAT ACCCCAACT?AAAATCCCG?CATTCCC GCGCAGGCGOGAATCGA8TCTGTCGGTCCGGAAACTTATCGG^ CACTTTCGTG?A?TGACGGAATGTAGGTTCGTGGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGACGCGTTCGGATTCATG ACTGCGCGGGAATGACGGGATTRR??,GTATTCCCTAAAAAAATAAAAA^ ATAATAATCCTTATC?TTCTTTAATTGAATTGGATTTATT SEQ. ID NO:30 15 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen opc en la Neisseria Meningitiditis (serogrupo A) CAAAGGCT?CG?C?GTGCGG???ACCGGa-UaTCTGG?AG??UTC^ G? AACCGTCCGCTGTCGGAAACGCAAACC»AACGCAACCGGTATTTGTC6^ CAGCACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAAATAGTACGGCAAGGCGAG^ AAGTGAGTGCGCAAA8CATCTGAAGGCGATGTGTrTGAACCTGTTGAA?GCC^ GCCTAAAAG<2VGACCGGATGCCTGATTATCGGGTATCCGG<WAGGGTTAAGGC^ TGGGGCGAAAATAGACG?AAACCTSTGTTTGGGTTTCGGCTGTCGGGAGGCyU?^ TATTTtC?CAAAAACAGAAAACCAAAAACAGCAACCTGAAATTCsTC?TTCC^^ GCGGCAGGAATCTATCGGAAATAACCGAAACCGGACGAACCTAGATTCCCGCTTTCGCG^ 20 «GTTGCrcCCGATAAATGCC8C?TCTCAAGTCTCGTC?.^ TCGTC?TTCCC?TAAAAAACAGAAAAC VAGTGAGAATAACAATTCGTTGTAAACAAATAACTATTTGTTAATT AATATATGtAAAATCCCCCCCCCCCCCCCCCGAAAGCTTAAGAATATAATTGTAAGCsTAACGATTATTTACGTTATGTT ACCATATCCGACTACAATCCAAATTTTGGAGATTTTAACT SEQ. ID NO.31 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendeníe desde el gen siaABC en la Neisseria Meningitiditis (serogrupo B) ?TAATGC?GGCGCTGAAGTTGTT?A?CATCAA?C?C?CATCGTTGA?GACG?A?TGTCTG?TG?GGCCAAAC??GTCATT CCAGGCAATGOLGATGT(RRCTATTTATCBVAATTATGGAACGTRGCGCCCTGAATGAAGAAGATGAGATTAAAT?AW ATACGTAGAGAGTAAGGGTATGATTTTTATCAGTACTCCTTTCT GCGTGCAGCTGCTTGACGATTACAACGTATGGATA RRCCAGCATATAAAATCGGCTCTGGCGAATGTAATAACTACCCATTAATTAAACTGGTGGCCTCTTTTGGTAAGCCTATT Z ATTCTCRCTACCGSCATGAATTCTATTGAAAGCATCAAAAAGTCGGTAGAAATTATRCGAGAAGCAGGGGTACCRR ATGC -mGCTTCACTCTACauvCATCTACCCA?CCreTTACGAAGATGp^ TTCCAGACGCJ?TCATTGGCCTGTCTGACCATACCrTAGATAACTATGCTTGCTTAGGAGCAGTAGCTTTAGGCGGTTCG ATTTTAGAGCGT«CTrTACTGACCGCATGGATCGCCCAGGTCCGGATATTGTATGCTCTATGAATCCGGATA rTTTAA AGAGCrCAAGC?AGGCGCTaVTGCTTT?A?ATTGGCACGCGGCGGCAAAAA?GACACGArr?TCGCGGGAGAAAAGCCAA CTAAAGATTTCGCCTTTGCATCTGTCCrTAGCAGATAAAGACATrAAAAAAGGAGAACTGtTGTCCGGAGATAACCTATGG GTTAMt^COU?GCAA.GGAGACTTCAGCGTCAACGAATATGA? CAAA8TGCTCAAAT8AAAAAACTGATATTGAATAATGCTTArrAACTTAG-rTACrTTATTAAC?GAGGATTGGCTATT ACATATAGCTAATTCTCArrAATrTTtAAsAGATACAATA SEQ. ID NO:32 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendeníe desde el gen 30 círA en la Neisseria Meningitiditis (serogrupo B) AtACCTGCAC TGAGTTGCCGACCATAAArrTAGa.TGttTCAATAAGACTAAAAAATATTCa?AATCGAATGGM TGCAATAMTTTATCAGATrGATATTrrAATAATTCTTGCAG _VTAC"I' TCAGTCCCa GTCT TAATGATATTTrGGCCACTrMTTCTAATGCTrrGA??TATTGi^ ACGGiSGTGAAAiaTAGAMtACCTTAATTTTCGTATGGTAAACCGTAATATTCrriGAOrr 'TCTAAGGATGGGAGGGT GGAAGAGGCCATAACATCTAAAtCGGGGGAGCCGATGATGTGAATATGCI I ILn'Tl'TTCTCCCATTTGC?CT?CGCG?G TGACA6Cri'(.TrCATTTGCTAC(aAGTGGATATGAGAAAGTTTACrAATAC;AATCACGAATGGAGTCATCtACTGTACCA GATAGTTCACC?CCTTCGATATGG AAACTAAACGGCTGCTTAATGeACCTAC^^ GTCGCCCTGAATCATGACCATATCAGGTTCAATTTCATCAGATAGACGAGAC->jTAAACGtAATGGTATTGCCT CACCMjrrGGTTCACCTTGGATTTGATTTGAAAAC?GATATGTATG^ CTGCCATATGTrrTCATCATATGCATACCAGTrAa?TCAAATtK?ATTCAAGGTCTßGGTGAT^ TAAAGGTrrTAG rTGCCGAAGTCGGCtCT6GTACCTGTAATGCAAAGAATTCTTTTaVTGATTTTAGAATCTATAAGTA TATATATATAAGTATAAGGAAGTTGGAAAGAAGAATACTAATTATACTCTACGTACT<»TAAATTTATTTCGATTAAGTG CTATAATtAGGCCATTTATAATTATATTAGGATTTGGCTT 5 SEQ. ID NO:33 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen IgtF en la Neisseria Meningiíiditis (serogrupo A) CTTTTTCGGACTGAAAGGACGaiTCATCCCGACATCGAGCGCGTGTTCGTCCGGCAGCCAAGGCATAGGTTATGCCTAC GAAGCUTCAMTACGGTCTGACCGAT?TG?T8TGGCGGSCGG?GGCGMG??TTTncCCGTCCGAAGTGTATGtTTT CGACTCGCTTTATG£CGCCAGCCGCCGC??CSKGAACCGGA?AAA?CCCCGCGCCCAT?CGACGCGAACCGCGACGGGC TGGTCATCGGCGAAGGCGCGGGGAN'TTCGTGCTGGAAGAATRCGAACACGGCAAACGGCGCGGTGCGATAATTTACGCC GAACTCGTCGGCT?CGGAGCC?ACAGCG?TGCCT?CCAT?TTTCCACGCCCCGCCCCG?CGCGCAAGGCGCAATCCTTGC 10 CTGTCAGACGGCATTGCAACACGCAGACCTTGCGCCCGAAGACATCGGCTGGATTAATCTGCACGGCACCGGGACGCACC A ?CG?CAGT?TGGAAAGCCGCGCCGTTG VGCGGTTTTC8C?AUíAT?CGCCCTGCACGTCC?CC??GCCGCAA?CC GGACAO^GCTGGGCGCGGCGC<KG{^rCGAAGCCGCGTTCGCGTGGGGC*pK^ GAAACrrCCGCCCOlGCTT.GG?»CGGGCAGAACGATCCCGACCmcCK GGGAA?CCG?AAAACGC?TTGCCGCC?GCTCGTCGTTTGCCTTCGGAGGAAGC?ACTGCGrrrT?CTCATCGGATGAAAT AAGTTTGT(»?TCCC?CCGCT?TGCT?T?aWTACGCGCCT?CTCTTG?TGGGTCTGTAGCTUGGGGTTAGAGCAGGGG ACTCATAATCCCTTGGTCGTGGGTrCGAGCCCCACCW^CCACCAA^ GCCGCCCTGTG???CCAAAATGCTTTGAGAAACCTTG?TA SEQ. IDNO:34 Secuencia del Nucleolido de la región de ADN (1000 bp) ascendeníe desde el gen 15 ° TAGAAAAATA «CGCCCAATCACT^CGCCGTCCT GGCTCG?C?GACGGT?CGCTTGCC?TTGCC?AGGATTTTC?AAAGCGGG?C?GCCGT?TaUUV?TCCrTGU AAACTCCGGCCTGATtCCCTCTTTAAACATCGGGCTGGACGAATTGGCAAAGTCAí^ CCGATGCCGACGATATTGCCGCCCCCGACrGGATTG?GAAA?TCCpGGGCG?GATGG?AAA?G?CCGC?GCATCATCGCG ATGGGCGCGTGGCTGGAAGTTTrGTCGGA?GAAAAGGACGGaU^CGGCTGGCre GAAAMGCCGACCCGGCACGAAGATATTGCCGACrriX CCCrrtCGGCAACCCCATACACMaUVCACGATGATTATGA GGCGCAGCGT ^TTGACGGCOTrTrKCrrrACAACACCGAGC K«» AGCIU TTGGGa>AGCTGGCTT?TT?TCCCGA?GCCTTGGTaV??T?CCGCCrrCACGCC??tC?GGTTTC?TCC^ CAGCATCCGCC?ACACGAAATCGCsaVAGGCATCCAAAAAACCGCCAGAMCGATTTtTTGCAGtCtA CCCGGCTCGACAGCCTTGAATACCGeCAAAT?A?AGCAGTAGCßtATGAATTGCT^^ TTTGAACGCGCCCGCCGGTTTpGTACCAATGCTtCAAACGGAajKUlCAC6<rrGCCCGCCGGCGCGTGGCTGGATTp 20 GGCAGACGGCAGGATGCGGCGGCTGTTTACCTTGAGSCAATACTTCGGaiT^ ??ACGCCGCTTT?TCCAACAG?CAAAAAACAGG?T???TT SEQ. ID NO:35 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Isl en la Neisseria Meningiíiditis (serogrupo B) GCGatfGGCn TTCrrCATCGGTTTGAGGGTCGGCAGGATAATCCGGGACGG UWGCCrrrAGACTg - c TCGCGGCGCTakGTrGAGGTACGGATGC«rtCATGtTCGGCAGTTTGATTACGTTTGCATCGGGCrGTtTCACCAGTTC J CCCjUnCGGCAAGCGCGTCGGGiT?CGCGCTGCGCTTCGGTC?G?T?TTCGGGG??TGCCGCa?UUVT?CGGCCGG?CAG GGAAATCTCGGCAGTTTTWCATCAATATCGGCGTGGCGGGCAAACGCCTGCACAATCG^ GCGCGCGGGCTTCCTCGGTAtGGGTATAAACAATGGTGGAÍ l T lTGAGTCATAGGATTATTCTCTTGTAGstTG 'fTr'H TCTTTTGGAA(^CATTGCGCGGGGAATGTGCGCGGCTATTATGGCATATTrtGGCGGCTTTGTTCCCG fTT&TrCGATC TTGGCCTGTpGAACGCGGa.GCGTGAAAGGAAGGGGGAAATGGTTrTCCCGCGTTTGGCGGCGGTGTCGGAGGTGCTGT GCCTGATGTGCGGCGGCATATTTTCGGTsAAATTGATTrTATAGTGGTTTAAATrTAAACCAGtACAGCGTTGCCTCGCC TTGTCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCTTCGTTGCCTTGTCCTGATTTAAATTTAAACCACTATAATATTCGGTAACTG TCGGAATATCTGCTAAAATTCC?»TTrrrCCGCCTCGGGACACTCGGGGCGTAtGTtTAATTTGTCGGAATGGAGTTTT AGGGAT SEQ. ID NO:36 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen 0 msbB en la Neisseria Meningitiditis (serogrupo B) GCCCGACGGCGAAOlGACACCTCsTGAAATCAACCGCrTGGACAGtACGGCsGCGCAATACGACAtGCTtGCAGGrrATC TTGAAAGACTTGCCGGAAAMCCGACCGTTG KCGtGCGCCTACCGCCAAAATGCCGTCTGAACACCCGATTATCCTTTT GAAAGCGCGATTATGCCCCATACCCTTCCCGATATTTCCCAATGTATe?GACAAAATTTGGAACAATATTTCAAAGACCT G?ACGGT?CCGA?CCTTGCGGCGTGTACG?T?TGGTCTTGC?TCAGGTGG?????CCGCTGCTGGTGTGCGTG?TGG??C AATGCGGCGjGCAACC?GTCCA?AGCCTCCGTCATGTTGGG?CTGAACCGCA?TACT^ GGTTTGCTGTßAATATsTCGGCAACCGTCCGTATCtTGGGTATtGACCCGGGCAGTCGCGTAACGGGTTTCGGTGTCATC GATGTCAGGGGGCGCGATCATTTTTACGTCGCCTCCGGCTG^TCAAMCGCCTGCCGATGCGCCTCTGGCAGAC?GGAT TGCCGTGATTGTGCGGCATATCGGCGAAAGTCGTTACCGtTIACAAGCCTCAACAGGCGGCAGTGGAACAGGTG^ t ». i i Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Mita en la Neisseria Meningitiditis (serogrupo B) CACAAAAACCAAGTTATGAC XXjV?TAAGGTAC?iSaU^ srCGGATGGtCGatATAGCCGAAAAATCC<-CCG^ T8?ATA.>TTtGATGjVp GAACAC ATC^ TGCAGCGakCGCAiGCG??CCGGCAAGCj?GACC?GC^^ GTCCAAC«!?AAAACpCGCC»G?TrC?KKOa.TC ATCACGGCG<ra>GCCAAAACCCC ?nACCGCACs3G^ TGTTTGA?TACGGCAAitKAGG?AAAA??CGCrCTCC?^ AACGCCATACsiACCAAOGC XlATCCTtaACCTCTsCC^ GGA Tcrrctx Lv i jicsau roGA^ CGC3 3ctGCAGcrtj?csccc?vrurr AAA ccaprTC SEQ. ID NO:39 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen ompCD Moraxella catarrhalis <^TtjA.TTTGTGAGCAAGCGGGCGCATCAG<j-GATTACCrTGCATTTGCGAGAAGATC_tCG ACATATTCAAGATGAAGATGTTTATGAATtGATTGGGCAA TCiAa?.CACGCATC?ATCT TG?G?TGGC?GTUCTG?TGAGATGCTA?AT?TTGCCCTAA?GGT?<»?CC?GCATGGGT GTGTTTAGTAC GAA?A?CGCCA?GAGCTG?CTAau»AGGTGGGCTTGAT?TCGCC?A TT?ATCAAATATTO'AG ^TTTATACACAG?C?TCAGCAGGCGGATATTAAGGTT CRX'T ATTCATCGATCCAGATCCGC?TCTAATTGATGCTGCAATTGCTGGGGGTGCTGATGCGAT TG?GCTGC?T?CGGG?arrTATGCTC?AGCG?CTTrACAAMT?ATCAAA?GCTTGTTGA TAAAGAGCTTGACCXTATTC?A?A?GC rpGt??TGGCACA?A?AA??TC?TC?p^ GATTAATGa^GGTCATGGTTTGACGCGTGATAATGTTGCAGCGATTGCCCAAATTGATGG TATTCATGAGCTGAATATCGGGCATK?TTGATTrCAGATGCGATATTTATGGGGCrrGA TAATG?GTCAAGGCAATGAAAATGGCTTTTATTCAAGATAAAACGACCAATCATTGATG CGTTAGAAAGAAAATCGTAAATAATGATGACTATTGTGTAATATTATGTATTTTTGTTCA AAAAAAGGTTGTAAAAAMTTCATTTACCATTAAGCTAAGCCCACAAGCCACAATGAATA CCTATTGGTTTGAC CATTAGaCTAAGAATCTGaü?AAtTT_TAACAGATTAtGGC AGGTCTTGGATCGCTATGCrAAAATAGGTGCGGTAATCTrGAAAAACCAACCATTCCTTG GAGGAATTTATGAAAAAG8ATATAAACßCTCtTiK?sTCATCGCAGCCGTTGCACCTCC AGTrGCAGCTCCAGTTGCTGCTCAAGCTGGTGTGACAGTC SEQ. ID NO:40 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendenle desde el gen copB Moraxella catarrhalis GATGCTGTTAAAGTGGGTATTGGTCCTGGTGCTATTTGTACAACCCGTATTGTTGCAGGC ATTGGCGTCCCGCAGATAAGTGCCATTGATACTGTGGCAAGTGCGTTAAAAGATCGCATT SEQ. ID NO:41 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen D15 Moraxella catarrhalis AAAACTGíp'GATGTCTTCACTGCTATTCATGGTGAACCAATCAATGATTGCCTAAGTGCC ACCAAG?TT?TTC?GSC???TCC?GAA?CCATGCTTG?TGTG?A(»GTC?TGCGTCA?GGT ?AGUGGTTG?TTTAA??TTAATGCCCCGTGGTGTAAAGAC?CA?A?CGGCGT?GTCGGT CAACTG TGATTCGCCCCCAGATTGATATCGATACGCTCATTCCTGATGAATATCGTATG ACGATTCAATATGATGTCGGTGAGG?TTTACTC ?GCCATCCGACGAACTTATGAJRRTA TC??TAAATG?CCTTAG?TGCGATGGGTA?G?TG?TT?C?GG?TTGATTGGCATTGA?A?T CTATC?GGTCCCATTGCCATTGCCCATGTTTCTAAGACCAGTTTTGAGTTGGGATTTCAA GAAGTGTTATCGACAGCCGCaATCAT«GTTTAAGCTTGCKAGTACTGAATCTTTTACCC ATTCCAGtGTTAGATGGCGGGCATTrGGTATTTTATACTfATGAATGGATTATGGGCAAA TCTATGAATGAAGCGGTGCAGATGGCAGCATTTAAAGCGGGTGCGTTATTGCTTTTTTGT TTCATGTTACTTGCAATCAGTAAC?»TATC»TGCGATTTtTTGGCTAAGTrCTGATrTAT CGTACCATtAACAAAAn'TpGGCprp'TAAGCTGAAATACTTGCaUOlTTTAACrrrr TGGCrrACCTTTAt ACAATATAAATTTGGGTGTA -VAAATTTTGGATACATT IT TATACC TTATTTTTAGAAArtTTAAAAATTAAG rTGGATAC?CTTATGCGTAATTCATATTTTAA AG TTTTCAG^GT aGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACtCaTGCACA A KGGCG ?TTtTATGGCAAATGACATTGCCATCACAGGACTACAaCGAGTGACCArrGA A?GCTT?C???GCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTG SEQ. ID NO:42 v _, „ ., ., , Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen omplA Moraxella catarrhalis ACtTGGCGAAAATACCArrtATATCGATTCTGATGTTATACAGGCAGATG-GCGGTACACs OlCAGCC?GT?TC?GTGGTGCTGCGGTGGCACTT?TTG?TGCTTTACAACACTTGCAGCG TCGT.A??A?GCTT?CCC??G?TCCGCrTTTGGGCTTGGTGGC?GCGGT'tTCTGTGGGTGT TA?TCAAGGCCGTGTATTGCTTG?TTTGG?TTATGCTG??G?TTC??CTTGTG?T?CCGA TTTAAATGTOTrC?TGACGa^GC?GGTGGGrrrATTGAG?TTC??GGC?C?GC?G?AG? ???GCCATTTACrCGTGCTG??GCTAATGCG?TGCTTG?TTrGGCAGAGCjKKG??TTGG GC?G?TT?TCGA?GCCCAAAAGC??GT?TT?GGCTGGTGAT?TGCT??TCGTTG??GAT? ATGGCGTGATCATCACATTAAATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGGTGGTCGATGA TATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCAI I IVp'TGATTGCACCCGTTTTTTATG CAATCGGTGCGTTGGCTTTATTTC »GTTGTGGTATTTGTGTTTAATATTCAAAGGCAAA AAGCCAAAATrTGTCATATGTTrra«^U.GsTCGCTrGAAGAttACGtCCAAACGCTTTG AGATTCATAACAAATCACTAAC 1TATCAGCATCGGC?ACJU.TATCTGCTAAAG^ AAATGAa?TTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGTTTTGCTGATGACCGTG A??rr?AT?T?GCCAA?C^GGT?C^TTTGGGAAAGTCAATC??A?CC??TGCGGTGGCGG TAACATTGGCTAAGTAorf G rTGTGATACAGACAGGTTGGATGGTCTTTAACTCCACCCA CCTAACTTII Id ri'tÁ.i lTGGATTTAAGAGTATGTTATGATGGGCAgCATTTTATTTTAA GTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAGTAGCCGTTC de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen hly3 Moraxella catarrhalis GTGATCGGCAACACCC?VCCATTCAGGAGCAACCAAAATTGCCCGTGCCTTGCCTGTCTT GGTGGTATCATTTGGCAGGGCAATGTGGCTAAGTAGTGSTCRGCCATCAGGTSCGGTGGT GGTGAGTSTACGAT?CSTTATTGTCATAAAATTATCCTTTTGGGTTGGATGATATCAATG AAATACCCTACGGTTG ATGGAATTTTATCCATTGTACCACGG?ARTGGTCTTT'N'AAAT TAACAAGCAGCTTCTAGCAAGTCAAAGTTTTTATGCCTATTTTTTCAGATTTTAAGGTAC AATAAAGCCAATTGTTAATAATATGG?ATTGTCATGATTTATGATGAATTGCGACCAAAA TGGTGGGAAAATTATCCCTTAGATGCGTTAACAGATGCTGAATGGGAAGCATTATGTGAC GGATGTGGCGCGTGTTGTTTGGTGAAATT?CTTGATGATGACAATGTTAAATTGACCGAA TATACCGATGTTGCCTGCC?GCTATTGGATTGCTCAA?.GGATTTTGCCAAAACTATGCC AAGCGT UUCßAjrrGTGC?GATTGTACTCGCTTAAaCCTGATATGCTGCCTGATATG CTCTGGTTGC(»CGCCATTGTGCTTATAAGCGGTTGTATCTTGGGCAAAATCTGCCAGCA TGGCACAGGCTCATTAAACATAGC(»AAACCATGCrGCAGGATTTGCGAAAGTrrCAACT CCTGGGCGATGTGTGAGTG?GCTTGGT?TG?GTG?TG??GAC?T?G??AGCCG?GTGGTG AA?.GGGTrAAACCTTßACATG?TTGTrGACATGATrGACA^ TTTGATAAAATTGGTGTATGirGTGTGATTrrATCAAAAßCACTTGAATAAAACCGAGTßA TA8CTAA?CTCTA<KA eCAATC_Wr.(»TCATAATTp^ TATACrGTCrATGTCTGATGACAATTCAAGCACTrGGTCG SEQ. ID NO:44 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen IbpA Moraxella catarrhalis TAACAAAGGCAACCCAACACGCAGTTATTTTGTGCAAGGCGGTCAAGCGGATGTCAGtAC TCAGCTGCCCAGtWAOTA??TTC?CCTATAATGGTCTrrGGG^ GAAAAAAGAC»A?8TT?TAGC?AAGATG?GG?TACXATC?AGC?A?A?GGTCrTA?AjGA TTATATATTGACCAAAC?CTTTATCCCACAAGATGACGATGACGATGACsATGACGATAG TTTGACCGC?TCtGATGATTCACAAGATGATAATACACATGGCGATGATGATTTGATrGC ATCTGATGATTCAOU.GATGATGACGCAGATa>CGATCa«GAjAtCAGATGATTTGGGTGA TGGTGCAGATGATGACGCCGCAGGCAAAGTGTATCATGCAGCTAATATTCGCCCTGAATT TGAAAACAAATACTTGCCC?TTAATGAGCCTACTC?TGAAAAAACCTTTGCCCrAGATGG TAAAAATAAGGCTMGTTTGATGTAAACTTTGACACCAA ?GCCTAACTGCTAAATTAM CGATGAGAGAGGTGATATCGTCTTTGATATCAAAAATGGCAAAATTGATC«?CAGGATT TACCGCCAAAGCCGATGTGCCAAACrATCGTGAAGMGTGGG?AACAW rrrcrTATACAACaTCAAAGATATTGATgTTAAGGGC -.ITTT TGGCAa»ATGGCGA 10 AGAGTTGGC?G^?CGGTTACATCATGA ÍJ?8CGATGGCATT?CTOAU?CCGCCGAAAA AGCAGGGGCTGTCTTTGGGGCGGTTAAAGATAAATAAAGCCCCCCTCATCATCGTTTAGT CGCRRGACCGACAGTTGATGACGCCCRRWXA?TGTCTTAAAACAGCACTTTGAAACAGT GCC TGGGCGAATTCTTGGATAAATGC_.CCAGATTTKCTCGGGCRAATATCTTGATAAA ACATCGCCATAAAATAGAAAATAAAGTTTAGGATTTX ITT SEQ. ID NO:45 ascendente desde el gen SEQ. ID NO:46 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen tbpB Moraxella catarrhalis 25 AGTTTGCCCTGATTTTGAGAGCCACTGCCATCATGAATTTGTTGGCGTAAACACCACTCs TATTCTTCTTCGGTrrCCCCTTTC<aTGCAAAa aiGGGATACaKK:GGCCGCCATGGCA aGGCG KGTGGTCrrGGGTGCTAAAAATATTGCATGATGTCaiGCGAACTTCTGCACCC AAGGCAACO?AGTCTCAATCAGCACCGCrGTTTGAATGGTCATGTGGATACaiGCCTAGG ATTTTAGCACCCTTAAdTGGTTGCTGßTCTTGATAa:sTrrrCTTAACCC»TCAGGGCT GGCATCTCAGCTTCTGCCAAGGC?ATCTCACCWCGACCATAATCGGCTAAACGGATATCA GCGACTTTATAATCG r B?GTTTTGGGT ?rrACTTGGATTGATTGAGGTAGGCATATCT TTATTCCTAAGCTATTTTAAAGTATTTTTAACAATAATTTTGATGAATTTGAGATAATTG ATGCt?AAAGGTTGAATGACCAAACCATCGCTAACAATCAAGAAAAGACArrTTAAGCAT AAAAAGCAAATCTGTCrTGATGGCTTATTATAACAGtTATTATGATAAATTTGGGTAGAA AGTTAMT«»TCGrrGGGTAAGTTtGTTGGCTATCCTTAATTAATTATAATrrrrTAAT AATGCTTTTACTTrATTTTAAAAATAGAGTAAAAAATGGTTGGCrrrGGGTTTTTATCTC ACTATGG AGATAAAATTGATA «-?T?5GTTrsTATTATCACrrGTATTTGTATrATAA TRRTACTTATTRRTA?U?CTATACACTAAAATCAAAAATTAATCACTTTGGTTGGGTGG 30 TGGGAGCAA ÍCAAATGGTTATTTTGGTA CAATTAAGTTCTTAAAAACGATACACGCTC J " ATAAACAGATGGTTTTRGGCATCTGÍAA?TTGATGCCTGCCTTGTGATTGGTTGGGGTG? ATCGGTGTATCAAAGTGCAAAAGCCAACAGGTGGTCATTG SEQ. ID NO:47 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen tbpA Moraxella catarrhalis TTGGGGGCGGATA?AAAXJTCGTCTTTGCCCA?ACKX»X?T^^ ATCTATGGCAAAO.TCATCAAAATCACAAAAAATAOLACGACCATTG??GCAGJ-^ GCAAATGGGGGCTTTGCT6ATGCCAAAAAAOACCTGAGCA.TC^ AGATTTTATGGG?^TGAGCGTTATACCGACACC?TCG KATACGCATGTCGST?GATTAT AG??TC»?CCC??A?TTrC???GCCT?A?CGCC?T?G?C?T?TC?CGCCT??CCA?CCAT CG?CGCCCAGGGCTGACAGTAATAACACTTTATACAGCACATCATTGAT^ AATGCCACACGCTATTAT TT i GGGGGGCAGACTTTTATGATGAAAAAGTGCCACAAGAC CCATCTGACAGCGATGAGCGTCGTGGCATACGCACAGCGTGGGGGCAAGAATGG^ GGTCTTTCAAGCCGTGCCCAAATCA6<»T ?CAAACGCCATTACCAAGGGGCAAACCTA ACCAGTGGCGG?CA?ATTCGCCATG?TAAAC?ij»TGC??GCGT rTT?TCG rrrGGC?C AGAG?»TTCAC?A?TGGGGCATCACGCa.CGGCTGACC?TC?GTACAAAC?TCA?TAA? AGCAATGAa\TCAAGGCAAATTATCACAAAAAT kAATGTTTGTTGAGTrrAGTCGCATT TTTTGATGGGATAAGCACGCCCTACnTTGTTTTTGTAAAAAAATGTGCCATCATAGACA ATATCAACJAAAAAAATCAAGAAAAAAAGATTACAAATTTAATGATAATTGTTATTGTTTAT GTTATTATTTATCAATGTAAATTTGCXGTATTTTGTCCATCACAAACGCATTTATCATCA ATGCCC?G?C???TACG£CAAATGCAC?TTGTC??C?TGCCAA??T?GG »TT??CAG?C TTTTTTAGATAATACCATCAACCCATCAGAGGATTATTGT SEQ. IDNO:48 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen ompE Moraxella catarrhalis AAAGA ?TTACAaTC?TCACTa-UlCGCCCAACC?TGTACCTCTGCCCCGTGßTCGCAC GCCAACGCTTT'lTGATgCGGTGCGTTGGGTTCAGATGGCTTGTCAATCATTTGGTT'rTAT TAAAATTCATACCTTTGGTAGTTrGGCrrrACCTGATATGTCATTTGATTATCGAAACAA TAC»»»GTTG?CC???aTCA?TTTrrAGCC?TTTGCC--U?C?CTC?AT?TT?CCGCTC? TACGACCATGCTTGsrATTAAATCATCACATAAAGATACrTTA ?TCCATTTGAA'rrGAC ArrACCOUUTO.CGGCC?TGCCrCAAATT?TG?TGATGA?TT^ GGCTTATTTTCATa?CrGTCTGCCCTCTGCCGATATTTTTATACCCAAACGGTTTGTAT TGTTGGCGGTGAAAGCTCAGGGAAAACTACCTTGCTGCAAAAACTTGCCAATTATTATGG TGCCAGCATCGCACCT lAAATA^rrcGArTATACACACACTCCCATCTCGGCG<rrA^ ACTTGCCCTTCAATACAGCGACTACGCATCCAGGGCCATCJ_.TCACGCCAACGCTATCGA AACCGCTCGTACCACTKCAGCTCTGCTGTTACACTGATGGATACTGATTTGGCGACAAC GCAAGCATTTTGTGAAATTTATGAAG?KGAACGCATCCGCTTGTCGCAGAATTTGCTAA A G?TGCGATTGGATTTTACGATTTATTTAGATAATAATO RGCTRGGGTCGCTGATGG CATGCGTAGG rTGGTijaiTGAT(aTaU> GCAGrrT-n'CGCCAATAiA TrTGa»CGATATGATArrAGTTATCATATCATTAATGACACCGACTACC?CAAACGCTA TCTACAA K ArrAA XrrTGATAGACAATCATATTITfAATCATTTTAC-AAAAATTCATGA C?ATT??TTAGGGAA?ATCTGATGA?AATTG?T?TTTT?G SEQ. ID NO:49 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen uspal Moraxella catarrhalis GGATGTGGiCATATCTGCCCATCGACCCAATACACATCGGTCGAGGCTATCAAGATGTGGT AaUMTT??TAGCaG?TC?GGT??GGGCGGTGCTGCGT?T?TCrrGa>jGCGGC?TTTTGG TTTTAATTTACt^GCTGGACACAGA,rrGATTTTGCTCGT^ AAGTATGCCGCGTGAACTAAAAACTGATGAGCTSCTTGAAATTTTTACCaLAGCGTATCT T??GC??G?TA??TTXXGCCT??GTG?Cr?T?CC?TaGCAAT???GGCGATGCTGTC?G CTTCCAAGGCCAAGTAGCGACACCCAAAGCGGTGTrT W«GTC»TTGGTCAAGGCW TGCGTTAtcrGCGTTCATtGATOjK?TGGTGAAATCCACAGGaW1?aW»rrCATGTa^ CJ TTACKCG?IACACGCCATCGATAACAAAACCCATCAAAAAACCGATACGGATAACCA AACCGATGCCGCCGTGCCGCTTATATCCAC rrGTCGGT?G?GG€GCAG?TTr?TTC?GGC ATCGCC?CTTGC.»TAGaU:CGTATCCGC<»TGCTJ-^^ CACGCGT8TAATCTGACCCAATCAAAATCCTGCATGATGGCAGGATTTTATtATTTAGT GGGCtGCCCAA ?.TGAtGATCATCAGCATCTGAGCAAAT8CTGGCGTAAATGACTGAT GAGTGT r?TTT??TGA??G?T?TaMT?TAT???ACTTGACT?T?8GATGC??T?CAG TAAAATtTGTTACGGCTAAAa.TAACGACGGTCCAAGATGGCGGATATCGCCATTTACCA ACCT?TAATCAG TTGATAGC ?TTAGCGATGGC?Ta«sTrsTGTrGTTGTArrGTO. TATAAACGGTAAATTTGGTTGGGTGGATGCCCCATCTGATTTACCGTCCCCCTAATAAGT G?GGGGGGGGG?G?CCCC?GTCATTTATT?GGAG?C AAG SEQ. ID NO:50 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen uspa2 Moraxella catarrhalis CCCCAAGCrrTCCGtTTCTsTGCCTsCTGßTsTCsGGCGGTCATACCATGCTGGTGCGTG CCG?TGGTGTGGGCGTGT?TaU»T?TTGGGCG?GTCT?TCGATGATGCGGTGGGTG??T GCTTTGATAAAACGGCAAAAATGCTCAAACTGCCCTATCCTGGTGGCCCAAATATCGAAA AAttAGCa*AAAACGGCA?CCC?CACGCCT?TCjVXTGCCAAG^ CGC.GC?TTTTTCGTrCAGTGGC_lTGA?AACCCre«TTC^^ C?A?CGCCC???8G?CCCCGCC?C?CG?GC?GAUTCGCCGa GCCTTGAGT?TGCGG TGGTGGATACTTTGGTC?AA?AATGCACOUUkGCACTACA^ TGGTGTTCGCACKGGGCsTCtCTGCa?TCAGATAKTACsCCGCACCCTGACCGAGACGC TCCGCCAA?TCGATGCGTCGGTGTACTATGCCCCGACCGAGCTATGCACGGATAATGGTG CGATGATCG8TATGCTGGCHTTGTCGGgrt^GCTGTGGACAGtaaaTGAC^ TTCGCTCTAjitCCCCGA.aK»TATGACC?-XC rrG^ ATCa?TC?TACCAACCAAAICGTACAAACC ?TGATAaiTGCCAAAAATAa»TATTGAA AGTAGGGTTTGGGTATTATrTATGTAACTTATATCrAATTIGGTßtTGATACTTTGATAA AGCCTTGCTATACTGTAACCTAAATGGATATCATAGAGATTTTTCCATTTATGCCAGCAA AAGAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGi-UacrCTCXT TATCrSTCCCCTGATGCrT TCTGCCTGCCACCGATGATATCATGTATCTGCIpiGAGGCATCAGTTAGGGCACCGTGA TGACTGATGTGATGATGAACCACCAAAAGAGAGTGCTAA Secuencia de Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen omp21 Moraxella catarrhalis GAGTGAACTTTATTsTAAAATATGATTCATTAAAGTAtCAAAATCATCAAACGCAGCATC AOSGTTTGCTAAATCAATTTTTTCACCATAATTATAGC iTAACGCACAGCAAGCGTAGT TATGCCAGCGGCTTGCCCTGATAAAATATaiTTtTTGGAATCACCAACCATAATGGCATC AGTCGGtGCGATGCCCAGTGArrGACACAGGTATAATAAAGGCGTTGGGtCGGGCTTTTt GACGCTGAGCGTATCACCGCCAATCACTTGGTCAAACAGTGTCAGCCATCCAAAATGTGA TAAAATTTTAGGCAAATAACGCrCAGGCTTATTCGTACAAATTGCCAAATAAAACCCCGC TGCTTTTAATCGTTCAAGCCCTTCrrATAACCCCTGCATAKTTTffiGTATTrrCAATTGT TTTATGGGCATATTCTGCCAAAAATAACTrCATGiAKK?TGGTGAATCAtAGTCGTATCATA GATATGATGTGCjTtGCATTGCTa??CAACCMTTTTAGCGAAO?TTGCCCr^ TTTGATG?T?TC??TTGGC?T?GGCGGT??GTTAAGCTTGGC?TAC?TGCCATTG?CCGC CGCCGCX?AATCAGGGGOVCTATCGATAAßCCTACCATCC?AATCAAATATAATCAGTTT TTTGCCAGTCarrGAaVgrGTTTGCATGCTp?i'CCTTATTCTTAAAATTGGCGGCTGTT TGGTATTTTrTAAATCAGTCAATTTTtACCATTTGTCATATAATGAC?AAiTrAC^ AGCAATATTTTAGTKATTTtTTGGCGAAGTrTtATGAAAACTGGTttTTGGrrGaUU^ CTTTACACAGTACCrATAAAACTTaaM?GTTAATAAGAAATATTTTGTTACTATAGGGG CGTCATTTGGAACAAGAC?sTTATTTGTAAATAGTTATTTGCAAAAGACGGCTAAAAGAC AGAACAGCGTTTGTTTCAGTGATTAACTAGGAGAAAAACA SEQ. ID NO:52 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen omp f T1r0c6rae MGo?r XaIxGeClClaCa cCaTtaaTrjtTrh»aTliGsATTTACTCAAAAauaa6GCTrGATCGTGCTG GCAGGTCTGACC(»AAACCAAACC ??tK»nCATCGATGCCTACTCGCCTTATGTTA8 CTTGATACGCOVrmGTTATGCAGATGCCaUGACTGCC^^ ?TC???CCTACC??CCCAT??GCG?T?TGCC?TG??KC?CA??CCT??GC£??aCCGCT ATATCAAaU GtTGAC^AGACCGCCAAGCGtTATTTTGAGACATTGGGCGATGCTCATAC TCATGATGTCTATGCCAC'm"p T«j CGAATTTCa-^AAACCG »»rrCATCGCCGCACT Oi?TC?C?CGCACGGCAATC?GTC?A?A?CCGCCCA??TCCTTGGTATCA?TCGTGGC?C ATTACGO?O>AAATsAAAACCaVTaiCTTACrrrAfflwrGCCAGTTATCGCCAT^ TGGGCAIAÍ»TGTGCTCGCCTGCCSTATGATGGCGATGACACCC?VT?TGCCC«TATCRGC ACGATTTGA«TGATTTJ?CATGTGATATGATTGAACATGTGACATGATTTAACAT^^ TAATACTGTTGCCATCATTAC<ATAATTTAGTAACGCATTTCTAAAAAT»TTGC XCCT TTTTTTATGTGTATC?TATGAATAGAATATTATGAJRRCTATCTSATTATTGTATCAGAAT GGTGATGCCRACGAGTRGATTTGGGTTAATCACTCTATTATTTGATATÜRTTL'GAAACTA ATCTATTGACRTAAATCAC»TATG?TTATAATTTAGOLTJ«?TGGTAGGCTTTTTSTA^ AATOkOlTCG<^TATTtOTCTACTGTTACCAC<»TG<^ AGACTCATTauurrGAtGTGTTTGTATACGCACCATWACCCTA GCCTATGtCAGCATGTATCArrT? i r TAAGGTAAACCACC Secuencia del ucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen HtrB Moraxella catarrhalis ACTATTCTG I i aGTl tcaCGAATGCC»aTGCCCAA rCACG jJ«rrGGCGATrAT CAACTTCAGC GGTGCTTCGGTCAATGGGCAATCTGCCGTCTTGGTTTTTGGGAAGGCGA Taka^TCACGGATTGAGCrGGakC ?CCATaua»TAAT U58GATCTAGACCAAATG CCAAACUCCGTGCGGCGGTGC?CC???ACGCA?TGC?TCC?TCA?A?ACTTA??CTTA? GCTCTGCTTCTTCTTTAGAAATACCa?GGCATCAAATACCGCCTCTTG .TGTCAACCG TATTAATACGCAGCGAACCGCO :a?TTTCTGTGCCATTrAGTACCATGTCATl«KKAA TGGATAGGGCGGrrTCGGGACrrTGtTTGACTTCCTCAACCGAGCCTTTTGGGCGTGTAA AAGGAtGATGAACTGATGTC ^TTAC»TCATCAGTTTCCrCAAACATTGGAAAATCAA CGACCCAAAGCGGTCCCCATTaiCAGGTAAATAAATTrAAAT ?GTACCGATrrtAACAC GCAATGCACCCATAGCATCATTGACGATTTTGGCrrTATCGGCACCAAAGAAAATGATAT CGCCAGTTTGGOCATCGGTACGCTOiATC?GCrCAATa?AACCTCATCGGTCATATrrT TAATGATGGGTGATTGTAATCCTGATTCTTTTrC?ACGCCATTATTGATATtGCTTGCGT OmíGACCTTA?TATATGCCA?TCCACGACEGCaVTA^^ CATCAATCTGCRTGCGACTCATGTRACCGC ATTTGGAATGCGTAAGGCAA?U^ CGGGAGGATCGTGGCCGGGCCCTGAAAATACTTGAAATTCAACATGTTCCATGATGTCAG CAA ?TC?ATAAGTTRTAAGG? TGCGTAAAT<»GGCTTATCTGAGG?^RAATCACGCA TGGCATCrsCstAAGTCATGCCGGGGAAGGTATCAAACTCA Secuencia del ucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen MsbB Moraxella catarrhalis TGGATCaTATrCTTTATTAATGgrACTgTTTAAACCTGTATTTTAAAGTTTATTGGGTCA ? T?jjTTrOUlSCTC?TCCC?jrCGCTC?AGCT rCATC?TC?A?Ai?CTCATCU •> ATCGCT<^CCAGCCrrCGTTGCTGCCGC _>ATCGGTATTAAACCATGAACCATCT^^ T TrrTGGCAAGCtßTGCCTG rCTTCrrTCAAGTGCAaaATTTCATTAGGC^ CAAGT.CACGCTGCTCTpATAGCTGAsmGCO.TTr.GGGC ACGCCT GTTTßATTTGGATGjtKTTWGCGGGTTrrGTCGCCTTAfiGTTTATTGTCTGTGßCGTGAT GAGCAAGCCAGCTTGCATGCTGTTGTAC?TAGTCGGCATAACCGCCAACATATTCCAAAA CGATJVCCSTCGCCGTACTTATCASRATCAAATACCCAAGTTTGSGTAACAACATTATCCA TAAAAGC?CGGTCATTCCTGATGAG?AATACCGTGCCTTTAAAATTGACCACAAAATCTT CTAAAAGCTCAAGTGTTGCCA?ATCCAAATCATTGGTAGGCTCATC^GC^ TGGCAG RRTTTAGCAATAATTTGGCCAATAAAACGCGTGCTTTTTCACCGCCTGATAGTG CTrTj%AC?GGTGTGCG?G<»CG?TTTGGCGTGA?T?AA???TCTTGC?AAT?GCrrAAA? TGTGCGTAGTTTTTCCACaUCATa»«TGGTCAGAGKjrrCTGAJ?CATTATCTGCGA TAGATTTTT üXKrrcTAGGTCGTCTTTG?GTtG_TCAAAAA^ TGCCAAGCTTAACTGAACCTGACTGAATCGCTGAATCATCCAAACCCAAAATGCG?GAA n?AGGTTGTTTT?CC??CGCCATTTTTGCCA?TG?TACCA?CTTTATC?CCACG??C?? j o GGTTTTA'GTGTCGTAT de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen pilQ Moraxella catarrhalis C?ACTT »AAATCAGCTCAATGrrcT8CACGCACAGCACCGATGAG^ ATG?TAAAT?CC??AG »C?AKGGTT??TGTGC?GGTGCI 3>iGTGC?TC?GTTC?AGC? GGTCGTGAACAGi^TT?TTAT?CCGAACGCCCTATCGaupGAGTGCG?C?GGGGATT?T C?TGCTTTGGGTCG?TGGTT?CTTG?GTTGT UUUK»T??CC?TrrGCTG?CAGTGC?T i ?TTTTGATCTGAAGGCTGGTTTG?ACC?TCAGCTG?TG?TG?TTGTTCjAG?TGAA??CT T?TC??GCGA?C?AACGCCC?Aj??CC?GTTGCTC?GC?GGtGCCTG?TGTTC??TGAAT? 1 C TTATCGCTGGGGOlTTTTGGGTaSTGGATTTGCXnTGGGATTGGATGTGCTGATAGCAC 1 CACTCAA-i X^rTGAT(aTAAflCTrG(aCAtATTACCCATGAAGAGCGTATGGCGAtCAG T AGCctstGCCGATACCArrrA crG sccGATGATA AT vGCAAGG AAAGArctrpt TATCAATCCTTATAGjAAATCrrrGAGGTTCpTGATACCAATCATGCCGCTGATC.^^ TGAGCaUVAA?CCjS??TCTACC???GCTTGGCp?TGGa?ACACr?TGCa ATCTGATACTCATCAGtCTGCCAAGGCTCAGGCACMGTCTTCAAAGGCGATCCGATAGT C?rrGAT?CCA?CCGTGTTCGAGAGCpTT?GAA?GCT?TG?GTTAjj^UlGCCT?CGCT? TCATGGTC?TATTTTTGATGAT?TTAGACTTGTGGCACTCATTATGAGTCCTGATGGCAT CGTTCATCGTGTGAGTACTGGACAATATCGGGGTAAAAATCACGGAAAAATTACCCATAT TGACAGTCGTACGATACATCGGATTGAAGCGGTCGCTGATACACAAGGTGGCTATTATCG CCGTGATGT???C?TTC?TTT.ATTC?T?AGCA?TG?CAC SecuencMpNÍcleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendeníe desde el gen 20 Npo18 Moraxella caíarrhalis TTCATGOVACAAGCGACC?TCTTGGCCGATGATAC?TC rGCTCACCTAAGAAAATCAG TTTATCAGCTTGCaGG^CAAtGG rKmXgrCACTGCTACATC'fTCTGCCAATAGATrAAA A?TTTCGCCCGTAACCGAAA?ACCTGTCGGTCCT?STAGG?C?AT?TGGTCATTATCCA? ATTATGGCG??TGGC?TCG?C?TaUVTTG?8GT?CCT »CCTGTC^TCTGAT??T(^ ACCATCTCTGATGCCGTAAGGGCGAGCGGTGAaUiMTTACCCGAAATGGCATCAATACG AGATCCGTACArrG KK»GTrAGCAAGCCCCATCGACAGCCGAGCTTCGATTTsTAGACG A?TTGAGCCG?CTGCCTC GATGGCAi8UT?G?TTCAT?CGGTGTT?C?CGC?C?rr CTCATGTAGGTTTGATAT(-AGCTTSCGATTTTGtAAAl 1111 rt l'CCACTTGTGGGCGTAC ACCATGCACAAGCACCAATTT ?TGCCCAAGCTGTGTAG«GTGCAAAATa.TGAAtCAG CGTACTAAAATTGTCACGAGCGACCGCCTCATCACa--.CATAACCACAAAGGl 1' t GCC ACGATGGGTGTTAATGT?CGGGGC?G?ATTACGAA?CC??TGCAC?GGTGTG?GTGCAGG AGTGTTCTGATAGGTGCTGACAGAATTC?TG?ATGCTCC?AAGAGTCAATGGCTGGTA?? ATAAGAATGGCGAACAATATATGGCGAGAGCGTCTGATGTGGGTCAAATGTCCCATTAAT 25 AACTATCAAGATACCATCATACCATAGCAAAGTTTTG<AXAGATGCCAAGICGAATTTATC AGCTTGATAAGGTTGGCATATGATAAAATCTACCATCATCSTCGCCAGTTTTGAGCATGT GTAAGT?GTT?CC?TA?TTAAACAGTC?AGA?ATTCAC?CCGTCA?TCAGCTGTGCTATG CTT?TGGGC?C?TA?AACTTGACC?AC?CAGG?TAA?TTT? S?cuer?cffde??3ucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen lipol 1 Moraxella catarrhalis GGCATACrrrTG8ATGCTtrATTTTajXATAACTGCTATflAGCCCAjrrGCTACT'r fl'IA TCATTTATCCATATGTCCAATAATGTGCTTTATGTAATTTAGGCACACTATTAACTCGTG CC?CTGTT?AC?TTCAGC?T??A??TCTTAACA?TGAATCAAAGCATCGTATTGGCTGTT 30 AAATGATAAGCTTATAGGTATTTAAATT(»GACTAAATGATTGTAATATGGACATATCAA ?GTtGAAATCAAAAATTTTGGAGACTTATGTAaaTAATCATAAAAAATTGACCACCATC GTAGGGßTGTrCTATACGßTGTerrATATTGC« ATetóTTGGTCAGTGGCrATATTttA TGGGGCTGGATtG rrsTGACAGGATTTACTCGTGCGATA rrrGGCrGATCG(^ ATTGTCWGTACGATlGCtGATAGAATtCTGATACCGArrATrTrGACCGTCCTGGrrGCG rrAttttct?tc?tttttGAAAAAAGGCGATAATtr6GttAttrrtta?au>JuvAAta?t GAriTt'Tp'IGTAAACTAtCTAAAATATCAATTATGTTATATTATGTGATAAAAGATGgG OkTG rTAA? rTrr KaTTßCAAAAAT(XTAATATC?TCACTGACCAAAGCTGTG^ ATCAAAACrrTATCAAAGTTCTTAGGGTArrATCAAGATATlAATACCAAATGAATACW CCCAACTTACTATAAAAATCAAATGATATGACTGTGATTTTATTATCATAGATACAAAAA TCAAAACGCATGAGCC?AAGGTATGATCH?TGA?TACJUA?TTT^^ ATCTAAATGTCGCCAGAAACGCTCy>XATTGCGGTGATTTGGtGGGATAGGGGTCAA GTGCGATTAAGCTAMTTTTTATGTGa?AATCC arGACrnATTpATrT GGAACAATTCGTGGTCTAATGTATTTATTTTAAGGAGATAA SEQ. IDNO:58 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen P TCTGGTCrACATCCCAAj8t mÁCACAAGAAACACTAAAGAC» CTCAAAAAGG(»TCTT?T?GT??TTTGAC?Gp??TTrrCGTa\AGTGCTTGT?CA?AAA TA(»CCATCGTGCAAGAAGTTTGTACaUVTTTAAGCACAATCATTTTGGCA<»CAC^ A?GC??TGCrraVG^X^UATTAGCTGCTGGTA??G?TACTrGGGTC?TC?TGC?ATCG» TCAAC8RRCTTGCTGCGTTGAAGCGATAAGTTTGCCATCTTGCCAAAATTGACCATGGT TTAGACCCTTGGCCTGGCTTGTGGTATCG GCCACATGTCGTAGAGTAGATATGCGGTCA T?TaUWAGGG8?TGGA??TGT?TGC»ÜkTGGTa?iT?Cr?GCC?TTTGTA?»CCrrGTG TC?TCAGGCCT.?iGCCCATGACTC?TTAAACCTGTGCT^ ACGCAA rrAGTGCTTGATGAATGGCAACTGGCTKTCCCCAATATt^GCGATACGC? A?TT8CTTGGCGTGGACGCTC?GGCrTGGGTGTC?aiGGGTCTCGTGGT^ GGATTTCGAÍ?TGACGCTGAaK?TAAATCTTOCTTTGACT^ AATAATCCGCTTIGAÜTTCCTGCTCGttTpTTAGGCTTTCAGGGGGTGGATAATCAGGCA TGGTrrCitGGTA?TC?AGCCCGC rrCCATGO rpyUU ATGAGGC?^ TGACCrGTTCATTGCTCGTATGATrACCGTTTTTGTCGGTCKrTCG^ C??TGACTTCrr<^?GCTGAT?AAs:GCGTCC%TC?CGT??£CGGCGT?CTTGAT?G?TGA CTGGT?G?CG??TATCSCC?CCTCGTAAAA??T??CCATGT?GGCTATG?C??GGTTT?T CAATCGTT??TGTGTTAG r C?GC?AGCAGaSrTTGGGC? SEQ. IDNO:59 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Secuencia ael' ucleoíido de la región de ADN (1000 bp) ascendeníe desde el gen lipo7 Moraxella calarrhalis AGTA??aUvTGGT??a-UlT?aUX kG GTCGCAC?GTCCTC?GT?CG?TGATTCT TTGAATATGCAG<?TTTTGGATACGAITGGTGGCATGTCTTCTCGATAATTGAAJ>TGTTA TGATTATAATTGCACCGTATTGGTTTTATAATTATCAGCAAATGATGGCCATGCCTGCTG ACCAAATACCGT?TTATAGTGTRGGGGATGCCATCCTTTATAGTGCTGGGGATGCTATCC TAAACRRAGTCI?TGGCGGCGGCGG?TGTTTGGTTTTGGGTA?AAAAAGGTGCAACACCAG CTAAAATGCTC L-RGGSCRG?VAGTCCGTGATGCCAAAACAGGGCAATTTATCAGTGTGC OUlGGGCATrATTGCGATATTTTAGTrATCTGATTTCATCCsTGATTCTTTGrrrGGGAC rrATTrGCßTrGGTrrTGATAAGJ_ ?AACAAGCCTGGCATGATAAAATTGCCAAAACTG TTGTGGT??AACGC^TTCGCTG?TGGGTCGCC?GTT??AC??t????CC?TC???CGC?? GCAGGGCGAIGTttrTTGAGCAGTTGSCGGTAGATAAGCTAAAACAAG(»GGCTATGAAAT TATTTTAACCAACrrTACCACCCCATTTGTTGGTGAGATTGATArrATCGCCAGACAGCC TTTGGAGC??TCGCACCGTTTGGTGCAGCC?AG?TTnGT?CGGTATTTGTTG?AGTGCG TAGCCGAAO>?írjKrrGTGtATCGTACAGCGOT^ i-U»AATCTACCGAACAGCAGjKACGATTTTIAAtCMTTATCCCAAAtATATTGATGATGC ATACCGTTTTGATGTCATGGrrTpGATTTGGTTGATGGATTGATTGAACATGAATGGAT AAAAAATGCGTTTTC»TTGGCTC??TGGTCGTGA?TTA???TCA?Ta>?AGC?ATCCGT?G -ti i - ¿a ttil-i¿^J_áM._?a< ra^^r^^M CTTTACTATAAGATATATCCCAGTAATATGGAAACATAGCA SEQ. ID N0:61 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen lipo6 Moraxella catarrhalis CGT TAGCTTCATACGCAGACCTTGTGCACCTTCGGGCAACCGAAGCATCACGCCAGCAT CACGCATCCGCACAAAACCCATCATGCCATCAAGGTCGCTGCTGATATGATATACCCCCA CCAAAG.AAACCGCRTAAATCGTGGAATA?C6CCTGCTGCTGAGGCTGAG^ AAACCAAGGTAACCTT?TCCCCCj??Cp??GTCCUTGTC?G?GACMTGGAsrCACCT? ATATAATACCAA?CTCGCCGATATGT?AAT8TCaU?TTGCeTG^ CAATGATAGAAACrrGCTTTTCCTAATCAG-CTir?ATGCCAGAAACCACsAttCCAGTC^ CCTGAC rTCUGCGGTTAACATACCTTßTAGTTGAATATAAGGGGCAAXTGCTTGaiCTT CTGGArrrTGCATTTTGATTTTTTCGGCAAGTTCTTGCCAATrrGTCAAAATTTCTGTTG AGGT??CTGA?GCpG?GGC?CC?TGCC?AGAATGCGTG?TTT??TTTCACGGTC??AGC CAjpC?TG?CCG?C?AA?CCGTG?T??GCACTGCAACCCC??GCGT?AGCCC??raGTTG AGATAAAAGAAATAAAGGAAATAAAGCCAT Til XACGCTTAsCTTTGGTATATCTAAGCC aWT??AT?ACGCaUGGGACG?AACATA?GCTGTGTTCC???CG?CCC?ACCGTGCTAG TTTAGCACTTTrTIGGAaUVATACCAAACATCACATAACAAATC-?TCaTa»j8TT&GTT TTGTTGCGCTTCTGTATCTGTATGATAAGTTXX i .GCTAAAAa«^lrTTITTATCTCAGA ATAaGAAAAGCTATATACTTATATTTTTAACTTTAAATAßATCTGCrrrTTrATACCGA TGATTTGGCATGAAGTTTATCGGTCTGATATGCTGGATATAAGTTTATCGGCTTGATATA AATTTTAATTAATCATCAAATTTTTAAGGAATTTATCATTA SEQ. EDNO:62 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen P6 Moraxella catarrhalis TAAGGATACCAGATrrTGGCTrGTCAATCGTTGTGTTAATCATTGTAAaKírrrATAGTG ATTGTCAATTAATA? .GG7?A??AAGT?TrTATC?AGTA?T??TCTTTCTT?T?TGTGAA TATAATGACAAATTT -.TCACAITTTTACAAGGAX 1 f 1 IATCAAGATTAGGATATGTTCC AGCTTAATTATTAG- .ATGAGCGTGTGATTATTTGGCATCGTTAAAjrTTATGAGTGCTAA AATTGCCAAATGAT- ^AAATTTTGCTAACATGATAGC8CTTTaJrAGi-CTTTATrTGGT ATTGATGAGCA?TA TAATAT?CCG?GTT?A?TGG?TTA?CTT??CAT?CGCC??A?ACT T??C??CGAA??Gl JATGATTATGACAGATACAGTACAAAAAGATACAGCACAGTCCCC CAAAAAAGTT- G' - »?AAAGACTA<»CCCCGCa.GTATATGCAGTTAATAAAffrGGATTT GGATATCCGCTTGT-TCaTGATttTGCTGl-CGrrGGTGCCAAACTTAAAATGACACGA g ACACg^GGCGAGC-rrCGGCTTCTTGGGCGAGATTTAAAGCTTAAAAiSCATTCACXTAAA TGCTCA8A,\ttAGACTCGCAGGC rrATCATCTTGATAAGs U.GGCrrAACAATrrTA? TGOlCC^ATGTCGCAGTGArrGAGAeArrGGTTGAGATTTC^ ACTTGAAGGGCTAT XTtyiAGCAGGAACAAAArrGATGATAACATGTTTGtGACACAATGCGA ACCTAaGG XT TCGCAAAATCACCn iTX CCTGACCGCCCTGA'rGTTTTGACAGAATA C?CCA VCGCCrAGAAGC?CC??AG ^TTTTAA??CCTTGCTTGCa>k?TCGT^ TGAGTCAGGAGATGTGGATG???ATCG X?p?T?CC?TTTGGUTG?TCCT?Ca???? ACCOl?CTATCTATTCG8GCjO?rCATTGCCAATCTAGAAG SEQ. IDNO:63 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Mso&T SSitó ?CCGCCAA??CatGGaA.CTtaU7rGAGC???CCTA? GTGCC??aGATTrrGAACrrC?CC?^??TCG«??3?GA?TGGTT?G??T?GCATTGAGGTA? AT M TATGGATATCGGiaTTGATCTTrtAGCiAATATTÜXt^X lVt' GGXTTrGTCGCA TCArrTATCGATGCAATTG?pGK«rrGGTßGATTAATCAC«TTCaUKGTTACT ACAGOTATGCCACCAGCAATGGCGTTAGGCACCAACAAATTGCAAGCtATGGGCGGTGCA TTATCCGCAAGCCTTTA I ICI lGCGAAAAAGAGCGGTCiAATTTACGCGATATTTGGTTt ATTTTt»TTTGGGTrnCTTAGGTTCrGCCCTAGGTACATTATTAATTCAATCAATTGAC GTGGCGATTTTCAAAAAMTGCTTCCTTTTnGATTTTAGCCATTGGTCTATATTTTTTA TTTACTCCTAAATTAGGTC?TGAAGATCGAAAAaU.CGATTAAGTrATCTGTTA'rrtGßT CrTTTACTTAGCCCA'rTTitAGGtTTTTATGATGGC? CTTTGGGCCAGGGACTGGCTCA ATCATGAGTTTAGCCrGtGTTACTTTGCTAGGATTTAATCrCCCGAMGCGGCAGCACAT GCAAAAGTGATGjAAertCACrfaaACCTtGCWCTTTTGaiCTTtTCI'TATtGGK CAAATTCrTTGGAAAGTOKrrTTCGTGAT<»TGGCTGGGAG(_ATTrrAGGTGCAAA GGTGCCAA?ATGCpG?TG?CGAAAGGT?AA?CCTTG?TTCGACCGATGGTTGTTATC?TG TCRTTTATGATGACGGCTJ?AATGGTTTACGATCAGGGTTGGTTT?TTTTTAATTCGGA AAGCGCGCAAAAGTGCGGTTAAAATTAATTACATGTTATTA SEQ. ID NO:64 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen HtrB de Haemophilus influenzae (HiRd) TTGAAG CCCCAATTTACCCACCAaATTCCmKGGCAAC»TTGß?AGGTAAC AGAT CTTCGAAACAACGTCCATCTGCTAATGTG rrrGCTAATACACTAATGACAGTGTCACCGG CTCCCGTCACATCAAACACrJCl l tlGaU.CGGTTGgCAAATGATAAGGCTCTTGATTTG GGCGTAATAATGTCATGCCr TI l tCAGAACGCGT(aCCAAAAGTGCGOTtAATtCAAtAT CGGCTTCAAArrCJU»UT?TTGGGTGTC??T??TGT?GCCCC?CG?TA?CGTTC?A??T OGTTCCCTTTGGATCGATCAACACAGGCACATTCGCRRRKGTGCAATTTGAATCATT^ TCTGAACATCTTTAAG??GCCRRTGCCGTAATCAGAAAGAATCAAAGCACCGTAATTTT TC»CCGCACTTTCTAACTTCGCTAATAAATCCTTGCMJRCTACATTATTGAAATCTTC-W CAAAATCAAGGCGGAGCAGCTGTTGATGACGAGATAAAATACGTAATTTACTAATGGTGG GATGqGTTTCTAATGCAACAAAATTACAATCAAt t l't t.l"l.TpCTAATAAGTGGGAAA GTGCAGAACCTGTCTCATCTTGTCCAATCAATCCWTTAACTGAACGGGTACATTGAGTG AAGCAATATTCATCGCCA?GGTGCAGCACCGCCCGCGCGTTCTTCATTTGCTTGTACGC GAACTACTGGCACTGGTGCTTCTGGTG?AAT?CGGTTGGTTGC?CCGA?CCAAT?ACGAT CAAGCATCACATCGCCTAA?ACAAG?ACTRN'GCCTGCCTAAATTCTGCTGAATATTGAG Ca.TTTTAAA?TCTCTCT?TrrG??TAACCA?A?TTGTGGCG?TTTT?CC?CA?CrCAAA rrTACGATAAACTACGCCCCTAACTTACGTGGAAAGAACAA SEQ. IDNO.65 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Proteína D de Haemophilus influenzae (HiRd) AGCAATAATTATAG rrGG?ATATTCTTTAAAG?TGAA?GAGATCGT?TAAG?C?AAA?GA ATTTTATATTGGAGjAATTATTAGaUVTTATTGGTTCGCTAATATTCGTAATAAATAGTTC AAATAATGATGGAAATACAGACT'rTTTTCTTGGGGatflTAXXXCIIl XtACAGCTATTTT TATTCAATCTGTACA lAATtTAATtCrrAAAAAAAGtAGCCAAAAA »TAAATGCTCrrTGT AATAAGTGCATCGACAGCAAOUirp AGGACTATTATTTTTATGTTTAGCTTTTAATAC TAAACAAATATATTTATTACAAGATGTTGGCATTGGAATGTTGATAGsTTTAGTTTGCGC TGGCTTTTATGßaTGCTAACAGGGATGTTGATGGCTrrTTATATTGTrCAAAAACAG?5G AATa-CTGTTTTTAACATTTTG UTTATTAATTCCTCTTTCAACTGCGATAATAGGTTA CTTAACATrAGATGAAAC_-.TAAATATCTATCAGGGAATTAGCGGTArrATTGTAATTAT TGGjrTGTGT?TTC jjC?TT?AAAAG?A?AAAaUVGG?GTGTrGATAT?TA?AGT?G?TGAT GTTGGTGGAATAGGTATAGTtAAATATCTGGTTCAATTGGI n'TATTAAGCCCGTTAGCA ATTCTCaTTTA?GTTT?TGTTTG??TTAG?T?TTTrGGG??AAGATGGAAG??T???GC TGGGAJJATAATGCTGAAACATATGAACTATACCAATACTCAAATAAAAATAAGTCTGCTG GAAATGATTATAAATtrr rAATTCTAACrrGTAGAGAGGATAATGACTATCAATCAGAM GAATGAjTT]^AAßC »TTAAAAATATTATTCArrGTATGACTAATAATCATCAACCTATTT CAAGTGCTGAAACATCTTTAGAAACTATTAAAATtATtCACGGAATAATTAAriCTGrfA AAATAGGTA?TGATCCT?ACAATATATAAGGAGAATAAGT SEQ. IDNO:66 Secuencia del Nucleolido de la región de ADN (1000 bp) ascendeníe desde el gen Hin47 de Haemophilus influenzae (HiRd) TAMTACTCt^AAATAAATTTCAGATAACsTGGTCTGTAAGACAAAAAAATAAAAAAAAT GTTCAATAAGA«3U?AGa_?TTATCTTGrmAAAAGGAAATCGGAG«^ GTCTtACAAGtAGCAAATTCTATAAATTrATGTTCTAATASsCGCA?TII'rCTAGTCAAT AAAAAGGTCAAAAAATGAGCTGGATTAACCGAAT TTTAGTAAAAGTCCTtCTrC'lTCCA CTCG?A??GCCAATGTGCCAGA?GGCGT?TGG?C??AATGTACTGCTTGTG??C?AGT?C TTTATAGTGAAGAACTCAAACGTAATCTGTATGTTTGCCCGAAATGTGGTCATCATATGC GT?TTGATGCTCGTGAGCGTTT?TT???TTTATTGGACGAAGATTC?AGCCA?GA??TTG CGGC?GATTTAGAACCA?A?GATATTTT?A??rrC??AGATTT???GAAAT?TAAAG?TC GTATCAATGCGGCGCAAAAAGAAACGGGCGAGAAA »TGCGCTAATTACTATGACAGGTA <aCTrtATAATATGCCAATCGTTGTGGCTGCATCGAACTTTGCT ITTATGGGCGGTTCAA TG K7rTCTGT?GTTGGTGCAAA?TTTCrrAAAGCGGCTGAAA?AGCG?TGGA??TGA?TT GTCCATTrGTGTGtTrCTCTGCGAGTGGTGGTGCTCGTATG »GGAAGCATTATTCTCTT TAATGaUUTGGCAAAAACTAGTGCC^ACirGCTCAAATGCGTGAAAAGGGTGTGCCAT TTATTrCAGT-?rrAACGGATCCGACTrrAGGCGGCGTATCAGCCAGfTTTGCGATGTTAG GGGATTTAAATArrGCCGAGCCAAAÍ rCTTAATTGGTTTTGCAGGGCCACGCGTTATTG AAC???CTGTGCGTGA????TTGCC.- _AAGGTrTCCAACGTAGTGAGTTTCTACTTGAGA AAGGGGCAATTGATATGATCsTGAAACGTTCAGAAATGCGT SEQ. ID NO:67 _, _, , Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen P5 de Haemophilus influenzae (HiRd) TC?CTTAATTa?CKGCATCAATGTTTTCTAAAACATCAACaGAATTsACCGCACTTGTA TCTAAAATTTCGCCATTTATTAAGACTGCGCGTAATGCCAAAACATGATTAGAGCTTTTA CCATATTGCAATGAGCCTTGCC?GAGGCATCGGTGTTAATCATTCCACCTAAAGTCGCT CGATTGCTGGTG<a»GTTCTGGGGCA?AGAACAAACCATGTGGri f.AAAAATTGATTA AGTTGAT rrrrA rACKCTGCTTGTftCTCGAACCCAACGTTCTTTTACATTGAGTTCT AAGATGGCTGTCATATGACGAGAAAC. '.•CCACTATTATATTGTTATTGATGGATTGCCCA TTTsTGCCAGTGCCtCCACCGCGAGGCGTAAAGCTGATtGATTGATATTCAGGTAAATTT GCCAATTrTGTTATCCGCACTATATCAGCAACCGTTTTCGGAAAAAGAATTGCtTsTGsA AGTrGTTGGTAAACGCTGTtATCCGTAGCCAGACTrAATCTATCTGCATAGTTTGTCGCA ATATCCCCCTCAAAATGTTGGCATTGAAGATCATCAAGATAATCAAGTACATATTGTTCA ACTTGAGGAATGCGATTrAC?TTTGGCAACATAGtATTtGACCCATTTAAACATATCAGA TGG?GGCTTTGATA?T?TCCTAAGGCT?GA?T??TGTCGATTAGGAA?GAG?G?GG?G?? AstAAAAAGTCtGTrTAAGAAAGTGTTATTTTC?_.TAAAAACTAAACAAAAAATTCAAAA GAATTTGATC'n 1 tCAAT?'t' l ATAGGATAATAAGCCCACTTTTGAACGTTCCTTTGGGG T???»TAAG(»A?C^?ATTGA?TTTGTCA?A??p?ATA?AGTAGGGau>ATTCAAA?C CCTAGTTAAGTGACTCrrTTATAATGTAGCTTTAATTAAAAGTTCACTATAAACAAGGAJCA C f TT XATTACTATTCGATCACTAAATAGAGGACATCAAAA SEQ. IDNO:68 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen D15 de Haemophilus influenzae (HiRd) TCGAGGCTATCCTATATAAATTATAGACGTAAAAAATCATTAAATAATGCAAACACCGTT AAGCTrAATAAC?GTGCTGCGCa?.TrCGATAACAGATGCTTrGCACCCG<rrCAGAAACA GGrrTrCCTrrAAaMXpTCCATTGTTAAAAAAACTAAATGACCGCCATCTAATACTGGT AATGGAAATAAATTCATAATCCCTAAArrTACACTAATavATGCCATAAAACTTAAAAAA TACACC?TCCA?T?TT.GCTGAT88ttG<?CCTTro AAATTATGGAATGACAAATCGCCAGTAAGTAATTTCCCTAATATTTTCAAGGTGAAAAGG GAAAGCTGTCCTGTTTTTTCAATGCCTTTTIGTAAAGATTCAAGAATACCATATTTTAAT tCAGTACGCTATTCATCCGCTAATTTTGTTAAGGCTGGa rjt ACCCCAAa^AACCATTTG CC?TTTTGATTACGCACTGGAGTTAGGACTrrGT(»AATGTTrCTCC_ATTACG^^ TTAATAGAAAAAGArrCGCCrrGrrCGACCTGTTTTATAAAATCTTGCCAAGGAAGTGCG GTTAAATTrTCTrrrAAAATTTTATCACCGATTTGTAAACCAGCTTrcrCAGCGGGAGAA TTTTGAACAAC?TTAGAAAGCACCATTTCAATTRRAGGACGCATAGGCATAATCCCTAAT GCCTCAAAAGCACGGTCTTTTGCAGGATCGAATCTCCJ?TTTCTAAGATTTA T?TTGTTCAATARRAGAATTGAAAGGAGAAAGGCTAATCT?U.CATTAGGCTCCCCCATT TrTGTGGCAACTAGCaTATTGATGGTrfCCa TCTTGAG TTCTTCGC aTCAATTGTA AGAATTTGCGTATTKKpTCjAATGTGGßCTtGTGCTGCGATTGAGTTTGGTGTTACT TOU.TCACTG rrrrAACCGTrGGCATrCCATAAAGGTAAAT sScO riciá derÑucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen Omp26 de Haemophilus influenzae (HiRd) TTTCaTAAATATCCTrAATrAAATGAT«a?rrTAATATTTTCTCTGCtXAATTAAATrAG GtA?GAGAACGTTCrrrTTTGAGTTCTGATGAAGAAAAAAGArTCJU.TrrATTAGAAAGAM TCOÜlTACTAAAtTGGAACTGTTCGACATCATCATTTTCATATTTn'TAATTGCrrtGGC A7AAGAGAATACCAATGGCCCAATAG _V ?TT-CCATTGGAATCCGACACCTGTAGAGGC CCGAATACGGCTTGATTT«aiTAATCGGCTAAßCTTTTTAATACATTGTrATCTAACCC ACICrrATCCGATTTCXACrTAsTATT XAAAC?CTTGCCGCATCAAaUATAGGG^ TCGGACTGTATTTTGG TTTTATCACT ?CAAACGGTGTrGsTACAATAAGTrCTGCACT CGCAGTrCTG?TrGC?ri?CC?CCMTCAC?TC?G?ACTrATCTTCTTA?A?GT?CC?TT ACCATT? ^TGTTCTGC?TAMTTGCGTT?GGTCaU TACriiCC?T?AGC?A??CaiCG TAATGAACCGATGCCacCCGCTGTATAAGTrrGATAGAACGGTAAACGCrTGITT€CAAA ACCATTTGí?TATCCTGCAGATGCrrTTTGCAGATACAACCCAGAGGTGAtCT rGTCTAA TGGOTAGAAACCCTCTACGTCTGCACrrAj.rTl-rAGTAXXT l fATCAGAACCTGGAAT AGTAACTCGTCC?CCAAGACTTGCTTTAACCCCTTTAiTrTGGGAAATAGCCrCTATTAAG GCTGTTATAGtrCCAACCAAAAC»AAAATCAAAGTCAT T VG 11 I . AATGCCATT ACCTTT AAATTTCATTGATTGAATATATAAATTACßGTTATATrCTAGAGCAAA^tACTAATTTT ATTATAG rrATGGCCTAATCCtACATAATAGGAsTTATTrrCATTTACAGj>GAA^ AGTAACATTACTTCCATAAGTCGTACGCTTATAGTTAGAGG SEQ. IDNO:70 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 ascendente desde el gen AACrTOTGC?ßAACC?CrrCTATCGGATGTAAATAAAAjrrGAATTrCCGT rGGCGACCA CGCTGGTTCAGTATTATTACCCGCACCACTCCTCAATTGAGTAGGTGTACCGCCATTTGC TCCCATAACCTAAATAGG«GAACACCATCACGAGAAGAAGCJU__>.GCTAAACGAGAACC ATCTGGCGAAAA MXTGGTCCGCCATTATGCCCTGGAAAAGATGCCACTACTTTACGTGC GXAGAATTRAAATCCTGTAC?A?U«TTGTGATTTTTTATTTTCAAACGATACATAAGC CAAACGCTGGCCGTCTGGAGACCAAGCTGGAGACATAATTGGTTGGGCACTACGATTGAC G?T??ATTG?TT?TAGCCATC?TA?TCTGCTAC?CG??CTTC?T??GGTTGCGA?CCGCC Ar TTT XTTGCA»ACATAAGC?»TACGAGTtCTAJU«aKACCACGGATCGaiGTrAATTT TTCAAAAACTTa^TCGCTCACaGTATGCGCGCCaTAGCGTAACCATTTATirGITACTGT ATAGCTATTTTGCATTAATA?GTCCCTGGCGTACCTGATGCACCAACCGTATCAATTAA TTGATAAGTAATACTATAACCATTACCCGATGGAACCACTT SEQ. ID NO.71 ascendente desde el gen C??-ATGTATTATGAAGACCCACTTAAAGAAGAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAC OULGAAAAAAAAGJI ?AAGAAAAACAAACGACGACAACATCTATCGAGACTTATTATCAA TTCTTAJRTAGCTCACCGTACTGCCAAGGCCGACATACCTGCAACGGGAAACGTGAAATAT CGCGATAATTGGTTTGCTRATATTGGTGATCA.CAC<»C?TCTTACR<XACTACTG AAAAATGCTCTCGCCGAGTTTGATGTAAAGGTTGCCGATAAAAAGCTAACAGGCGAATTA AAACGA«CGATAATG ??ATACCGTATTTAAAATTACTGCAGACCTT?UKAGTGGTAAG AATGACrrCACTGGTACAG lAACCGCAACAAArrTTGTAATAGATGGTAACAATAsT^ ACT OjAATACCCAAATTAATATTAAAACTGAACTAAATGGGGCATTrrATGGACCT GCTACAGAATTAG «^_rrATTTCACCTATAACa»AATTCTACAGCTA^ ACCG ACCTr?^CCACCCAATrCjV:CAAATGj AAGAGCTGaU-TTGTGTTTGGAGCT AAACAACAAGTAGAAACAACCAAGTAATGGAATACTAAAAA SEQ. ID O:72 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen TbpB de Haemophilus influenzae (HiRd) TACaATTATATTCTTATACAAMTTGATAATtGTTCGCATTArCATTl't't'Xrt'TTGTAAT AATGTCAACTTATA?i'? V I I AAGTTC?TGGATA?A?TATG?AAA?TGGCGTA?AACAAC TTTTrCTCTTATCATrAATA8Cp'ATCArrAA?GAATGTAGCTTGG«?G^ GTCCTAAAAATßATACATTGACAAATACGATTaU?GTGCGGAATTAAAAACCTCCTCTT TTTCCTCTATGCCTAAGAAAßAAATACCAAATAGßttTAnATrrCTCTTTCCAAAAGCC AATrAGCGCACaVTtXAAGGCrf n?fGCGTGGGTrAArreCTGCrrTATATCAAAATA ACACTCAGGCAGTTCAACTGrrArrACC»CTATATAAACAATTTCCTa_UaVAGATAATT TCTTACTAACpGGG -UGGCT?rrGAAGCTCGTGA?(-??GGTG?TTT?ACTC?ATsr? TTGCTTAWATCCprGAATTATTCßC CGAGACGCATCTTTACTACCTrtACGTTATTAAT TAGCTCAAGCTCTAXTrrTTAACTATGAAAATGAAGCTGCa-ÜATTaU^rrTGAAAJA TACGTACAGAGCTAGATGATGAAAAATTGGTACGTGTTATTGATCAGTATCGGTTAACAC TAAATCAGCGGAATCAATGGATATGGCAAGTAGGATTAAATTRRNAAATGATGATAATT TGAATAACOrrC ^AAAAGTGGaU^UVAAATTGGTAsrTGGACCGCTTGGGAAAAAGAAA GTGGGC?GGGGGrr?GGGT?TTCTTTATC?GT?G??????A?TGGa^ TTTTTAGTAAAACTATGTTTAATGGGAATGGAAAATATTATTGGGATAATAAAAAATACA ATGAGGCTACTGTGCGTATACGTG tWm'AGGCTATCAAACTGC^^ C T T'rrCLXlTTCAAGAAAAACGCTGGTATGCAGGCGGT SEQ. ID NO:73 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen HifA (pilin) de Haemophilus influenzae (genoma 1 serotipo LKP) .AATAAATTGCTCCATAAAGAGGrrrrsTGC rTATAAATAAaíCAATAAAsATTAATATA ?ACCGTp?p????TG a?AGGCTTAAT??AaGc???crrrG^ TAjAAAAACrCTTCCATTATATATATATATATATATAACTAAASCCCl'lt 'l?AAAAATTT C;ATAittTTTTfflUlTTiÜ^TtCGCTGTAGGTTGGqtn?rGCCCACATGGAGACATATAAA AAAGATTTCTAGGGTGGGCGTAAGCC«CG GCa?iCAT(^TCAAACAAC^ ATTAGGCACGGTGGGCTTATGCCTCCCCTACGGGGAAATGAAT?AG ?TAAATAT KWCT TAGCCC?GTTT?TGGATrT??rr?TGTTGA?ATGGGG?A??CA?TGTrT????A??CACT TTTAt T tX t ACCGCACTA l"t' ? t rGCCGCACTrTGTGCatTTTCAGCCAATGCAGATGT GATTATCACtGGC?CCAG?GTGATTrATCCCGCTGGGC?A???AATGTT?TCGTGAAGTT AGAAj?.CAATGATGATTCGGCAGCATTGGtGCAAGCCTGGATTGATMTGGCAATCC.^ T8CGATCCAAAATAaVC UUUl8CCrrTX'sTgATTACCCCGCCTGtTGCTCGAGTGGA AGCG?A?TCAGGKX^ü?unTTGCGGATTACGTT(»C?GGC?GCG?GCCTTTACCTa tcGCGAAATC rcrrttAttrr ATT Gt c^ ATtccGca^-u.cctGAT^KGG .rr TCT ^LKJ?AACACGGCAGCTTTATGCAAATTGCCATTCGCTCA^ TCGCCCTGCGAAACTCTCGATGGATTCTCGTGATGOUITGAAAAAAGTAGTGTTTAAAGC CACACCTGAAGGGGTGTTGG-rGGATAATCAAACCCCTTATTATATGAACTACATTGGTTT GTTACATCAAAATAAACCTGCGAAAAATCTCAA?ATGGTTG SEQ. IDNO:73 Secuencia del Nucleotido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen HifE (tippilin) de Haemophilus influenzae (genoma 1 serotipo LKP) TAGTAGATrrCCGCACa 3CAAAAATACAATGGT rp'ATTrAACCTCACTTTGC GCGAGCOlCT8CA?TGGC?TCC?CCGCAC?AG?T?GCGA?GGGGCATTrGTGGGCGATG TGGTGCAAGsTGGTGTGCITXTCGCTAATAAACTTACC ^»XAAAAGGCGAGTTAATCG TCAAATG X8TGAGCGAG???CCG??C?ATGCCGTTTCC??T?TCA?GTTG?TTTGG?TA ACGC?CAAATACAAACTC?CGATArrCAATGCAAAACCGCA?AATAAATAAtTGAAGAGs ATTTATGCAAAAAACACCCAAAAAATTAACCCKGCTTTTCCATCAAAAATC ?CTGCTAC TTGTAGTGGA?3aU?TTATAGtGGAGa_?TTATAGTGGCTCAAAATGCTTTAGsTTTCA TCGTCrGGCTCrGCTTGXrrTGCsTGGCT rGCTrGATTGCATTGTGGCACTGCCTGCTTA TGCTTACGATGG VGAGTGACCTtrCAAGG K»GATTTTAAGTGAtGGCACTTGTAAAAT TGAAACAG?C?GCC???ATCG u:GGTT?CCCTGCCAACAGTGGG??A?GCTA?TTT??G CCACGCAGGGCAAACCGCCGCCCCTGTGCCI IT p'CCATCACGTTAAAAGAATGCAATGC AGATGATGCTATCAAAGCTAATCTGCTATTTAAAGGGGGAGAawauy?VCAGGGCAATC TTATCTTTCCa?TAAS??a AACGG VAAGCCACCAACGTGGGaiTTaU^ AGCCGATGGC?TAGGCACGCCTATC??GGtGGACG«<»CCG?AGCC?AC?GCG??A??GC CCCCGAC?CAGGT?AAGCGOU?UU GGC?OVGTrATTC??CCCCGTTTTt^GCT?CTTTGG CTCffrTATTACGCCACAGGTGAACCC?CCGCAG«:GACGjnGAAGCCACTGCAACrrTTG ?AGTGC?GT?T?ACTAAAAT?TTT?TTATCCAGTGAA?A?? SEQ. ID N0.75 Secuencia del Nucleoíido de la región de ADN (1000 bp) ascendente desde el gen P2 de Haemophilus influenzae (HiRd) i TTATCCG GA ACAGTTCATC AGTAATGCCA TGAACTTPAA TCGCATCAGG Sl ATCANCGGGG CGATCTGGCT TAATATAAAT ATGAYAATTA TTACCTGTGT 101 AACGACGATT TATTAATTCA ACTGCACCAA TTTC??T??T GCAGTGTCCT 151 TCATAATGCG CGCCAAGCTG ATTCATACCT GTAGTTTCAG TATCTAATAC 201 AATTTGGCGA TTGGGATTAA TCATTTGTTC AACCTATCTC TTTCCATTAA 251 AATACTTGCC ATTCTACACA ACJ?CCTTTT TGTTATCCCK AAACAGATTG 301 AAATTTTTAC TGATGGATCT TGCTTAGGT? ATCCAGGGGC GGGCGGAATT 351 GGTGCCGTAT TGCGTTAT?? ACAACATGAA AAA?C?CTCT CCAAAGGCTA 401 TTTCCAAACC ACCAAT??TC GAATGGAATT ACGCGCTGTC ATTGAAGC?T 451 TAAATACATT AAAAGAACCT TGCTTGATCA CGCTTTATAG TGATAGCCAA 501 TATATGAAAA ATGGCATAAC CAAATGGATC TTT??CTGGA AAAAAAATAA 551 TTGGAAAGCA AGTTCTGGA? AGCCTGTAAA AAACCAAGAT TTATGGATAG 601 CCTTAGATGA ATCCATCCAA CGTCATAAA? TTAATTGGCA ATGSGT??AA 651 GGCCATGCTG GACACAGAGA AAATGAAATT TGCGATGAAT TAGCAAAAAA 701 AGGGGCAGAA AATCCGACAT TGGAAGATAT GGGGTACAT? GAAGAATAAT 751 ACAACTGATA TAACGTCATA TTTTTCGATA CCTAAAAATA TTTAATACTT 801 AAACCTAAAA CAG??T???A A?T??TCAA? TTCATTT??? AAATGTGATC 10 851 TCGATCAGAT TTCAAGAAAA TTAAAATTTT GGAGTATTGA CATCAAAAAT 901 TTTTTTTGTA AAGATGCAGC TCGTCCGTTT TGGCGATTGG ACAATTCTAT 951 TGGAGAA??G TTCAATCATA GATAGTAAAC ??CCAT??GG AATACAAATT 1001 A SEQ. f NO;76 Secuencia del Nucleotido de ADN región codón (parcial) de Moraxella Catarrhalis HtrB 1 TCAGTGCTTG GTTTTTTAAG ATATGTACCG CTGTCAGTCC TGCATGGATT 51 GGCGGCGTGT GCGTCTTATA TTTCCTATCA TTGCAGGCTT AGTATTTATC 101 GCAGCATCCA AGCCAATTTA ATCTTGGTTC ACCCCAAGAT GCCAGACGCA J 5 151 CAGCGGCAA? A?CTCGCC?? ?CAAATCCTA AAAAATCAGC TCATCAGTGC 201 AGTCGACAGT CTT???ACTT GGGCAATGCC ACC??AATGG TCTATCGCAC 251 AAATTAAAAC GGTTCATCAT GAAGATATCC TAATCAAAGC ACTTGCCAAT 301 CCAAGTGGTA TGCTTGCCAT TGTGCCTCAT ATCCGCACTT GGGAGATG?T 351 GA?TGCTTGG CTCAATACCT TTGGCTCCCC TACTATCATG TATAAGCCCA 401 TCAAAAATGC GGCGGTAGAT CGCTTTGTTT TACAGGGGCG TG???GACT? 451 AATGCCAGCC TTGTACCC?C AGATGCTAGT GGTGTTAAGG CAATTTTT?? 501 AACACTCAAA GCAGGTGGAT TTAGTATCAT ?CTGCCCG?C CATGTACCTG 551 ATCCATCAGG TGGTGAG?TT GCTCCTTTTT TTGGTATTAA AACCCTAACC 601 AGTACGCTGG CGTCAAAGCT TGCTGCAAAA ACTGGTTGTG CTCTTGTTGG 651 CTTAAGCTGT ATTCGGCGTG AAGATGGCGA TGGTTTTGAA AITTTTTGTX 701 ATGAATTAAA TGATGAACAA CTTTATTCA? AAAATACCAA AATTGC?ACC 751 ACTGCTTTAA ATGGTGCGAT GG??C???TG ATTTA?CCAC ATTTTTTGCA 801 TTATATGTGG AGCTATCGTC GGTTCAAGCA TACACCACTA TTAAATAATC 851 CTTATTTACT TAATGAAAAT GAGCT????? AAATAGCCAT AAAGCTTCAA 901 GCCATGTCAA AGGATAGTTA TGAG 20 Secuencia de proteína 25% de identidad y 35% similar con HtrB de E coli 1 SVLGFLR?VP SVLHGIAAC AS.ISYHCRL SIYRSIQANL ILVHPKMPDA 51 QRQKLA QXL KMQ ISAVDS LKTO?MPPKH SIAQIKTVHH EOILIKA AN 101 PSGMLAIVPH I TpfEMMNAH YK. Iia.AAVD RFVLQGRERX. 151 SAS VPTDAS GVKAIF TLK AGGFSII PD HVPDPSGGCX APFFGIKTLT 201 ST ASKLAAK TGCALVGLSC XRReOGDGFE XFCYEU.DEQ 1YSKHTKIAT 251 TA1NG?MEOM IYPHFLHYMH SYRRFKHTP UmPY LHEH ELKI.IAI10Q 301 AMSKDSYE SEQ. ID NO:77 Secuencia del Nucleotido de ADN región de codón de Neisseria (meningococcus B) Z? gen fJH'rtTTtCGTT TACAATTCGG GCTGTTTCCC CCTTTGCGAA CCGCCATGCA 51 CATCCTGTTG ACCGCCCTGC TCAAATGCCT CTCCCTGCTG CCACTTTCCT 101 GTCTGCACAC GCTGGGAAAC CGGCTCGGAC ATCTGGCGTT TTACCTrTTA 151 AAGG??GACC GCGCGCGCAT CGTCGCCAAT ATGCGTCAGG CAGGCATGA? 201 TCCCGACCCC AAAACAGTCA ?AGCCGTTTT TGCGGAAACG GC ???GGCG 2 1 GTTTGGAACT TGCCCCCGCG TTTTTCAGAA AACCGGAAGA C?TACA??CA 301 ATGTTC???G CGGTACACGG CTGGGAACAT GTGCAGCAGG CTTTGG?CA? 351 ?C?CGAAGGG CTGCTATTCA TCACGCCGC? CATCGGCAGC T?CGATTTGG 401 GCGGACGCTA CATCAGCCAG CAGCTTCCGT TCCCGCTGAC CGCCATGTAC 451 A??CCGCCG? A??TC???GC GATAGACAAA ATCATGCAGG CGGGCAGGGT 501 TCGCGGC??? GG???AACCG CGCCTACCAG CATACAAGGG GTCAAACAA? S51 TCATC???GC CCTGCGTTCG GGCGAAGCAA CCATCCTCCT GCCCGACCAC 30 601 GTCCCCTCCC CTCAAGAAGG CGGGGAAGGC GTATGGGTGG ATTTCTTCGG 651 CAAACCTGCC TATACCATGA CGCTGGCGGC AAAATTGGCA CACGTC???G 701 GCGTGAAAAC CCTGTTTTTC TGCTGCGAAC GCCTGCCTGG CGGACAAGGT 751 TTCG?TTTGC ACATCCGCCC CGTCCAAGGG GAATTGAACG GCGACAAAGC 801 CCATGATGCC GCCGTGTTCA ACCGCAATGC CGAATATTGG ATACGCCGTT 851 TTCCGACGCA GTATCTGTTT ATGTACAACC GCTACAAAAT GCCG Secuencia de proteína -30% de identidad y 38% similar a Hlrb E. colí 1 HFRLQFGI.FP PLRTAMHI L TAXAXCLSI.I. P SC HTLGH RLGHLAFYiL 51 KEORAAXVAH URQAGMNPOP TVKAVFAET AKGGLELAPA FFRKPeDIET 101 HFKAVHGHEB VCX3ALD HEG L FITPHIGS YDLGGRYISQ QLPrPLTAMY 151 KPPKIKAIDK IMOAGRVRGK GKTAPTSIQG VKQIIXALRS GEATIV PDH 201 VPSPQEGGEG VWVDFFGKF? YTMT AAKLA HVKGV T FF CCERLPGGQG 251 FDLHIRPVQG E NGDKAHDA ?VFNRHAEXH IRRFPTQYLF MYNRYKMP SEQ. ID NO:78 Secuencia del Nucleolido de ADN región de codón de Haemophilus influenzae (no-tipificado) gen HtrB 1 ATG AAAACß AAAAACTCCC TCAATTTCAA CCGCACTTTT TAGCCCCAAA 51 ATACTGGCTT TTTTGCCTAG GCGTGGCAAT TTGGCGAAGT ATTTTATGTC 101 TTCCCTATCC TATrrrGCGC CATATTGGTC TTG6CTGTTT 151 TCACATTTAA A?GTGGGTA? ACGTCGAGCT GCCATTGCAC GCCGTAATCT 201 TGAACTTTGT TTCCCTGATA TGCCTGAAAA CGAACGTGAG ACCATTTTGC 251 AAGAAAATCT TCGTTCAGTA GGCATGGCAA TTATCGAAAC TGGCATGGCT 301 TGGTTTTGGT CGGATTCACG TATCAAAAAA TGGTCGAAAG TTG??GGCTT 351 ACATTATCTA AA?G????TC AAAAAGATGG AATTGTTCTC GTCGGTGTTC 401 ATTTCTTAAC GCTAGAACTT GGCGCACGCA TCATTGGTTT ACATCATCCT 451 GGCATTGGTG TTTATCGTCC AAATGATAAT CCTTrGCTTG ATTGGCTACA 501 ??C?CAAGGC CGTTT?CGC CCAATAAAGA TATGCTTGAT CGTAAAGATT 551 TACGCGGAAT GATC???ßCT TTACGCCACG AAGAAACCAT TTGGTATGCG 601 CCTGATCACG ATTACGGCAG AAAAAATGCC GTTTTTGTTC 'fWTfWC 651 AGTACCTGAC ACTTGCACTA CTACTGGTAG TTATTATTTA TTGftAATCCT 701 CGCAAAACAG CAAAGTGATT CC?TTTGCGC CATTACGCAA TAAAGATGGT 751 TCAGGCTATA CCGTGAGTAT TTCAGCGCCT GTTGATTTTA CGGAtTTACA 801 AGATG???CG GCGATTGCTG CGCGAATGAA TCAAATCGTA GAAAAGG??? 851 TCATGAAGGG CATATCACAA TATATGTGGC TACATCGCCG TTTTAAAACA 901 CCTCCAGATG AAAATACGCC TAGTTTATAC GATTAA Secuencia de Proteína -57% idénlico y 66% similar a TRB E.coli 1 tOQ.EKI.PQFa PHFLAPKYHL FWLGVAIWRS XLC PYPXX.R HIGHGFGWLF 51 SHU VGKRRA AI?BMI ELC FPDMPEHERE TIWSMIJtSV GMAIIETGMA 101 KFHSDSRIKK WSKVEG KY KEHQKDGIVL VGVHFLTLEL GARIIGtHHP 151 GIGVYRPNDH P .D CJTQG R RStHCOKLD RJ.DLRGMIKA LRHEETXRY? 201 POHDYGRKHA VFVPFFAVPD TCTTTGSYYL KSSQHSKVX PFAPLRNKDG 251 SGYTVSXSAP VDFTOLQDET AIAARHHQIV EKEIMKGISQ YKHLHRRFKT 301 RPDE TPSI.Y D* SEQ. ID NO:79 Secuencia del Nucleotido de ADN región de codón de Haemophilus influenzae (no-tipificado) gen MsbB 1 ?TGTCGGAT? ATCAAC???A TTTACGTTTG ACGGCGAGAG TGGGCTATGA 51 AGCGCACTTT TCATGGTCGT ATTTAAAGCC TCAATATTGG GGGATTTGGC 101 TTGGTATTTT CT'l t'l 1ATTG TTGTTAGCAT TTGTGCCTTT TCGTCTGCGC 151 GATAAATTGA CGGC????TT AGGTATTTGG ATTGGGCATA AAGCAAAGAA 201 ACAGCGTACG CGTGCAC??? CTAACTTGCA ATATTGTTTC CCTCATTGGA 251 CTGAACAACA ?CGTGAGC?? GTGATTCATA ??TGTTTGC GGTTGTCGCT 301 CACGTTATGT TTGGTATTGG TGAGATTGCC ATCCGTTC?? AGA??CATTT 351 GCAAAAACGC A-CGAATTTA TCGGTCTTGA ACATATCGAA CAGGC??AAG 401 CTG??GG??A GAATATTATT CTTATGGTGC CACATGGCTG GGCGATTGAT 451 GCGTCTGGCA TTATTTTGCA CACTCAAGGC ATGCCAATGA CTTCTATGTA 501 TAATCCACAC CGTAATCCAT TGGTGGATTG GCTTTGGACG ATTACACGCC 551 AACGTTTCGG CGG?????TG CATGCACGCC AAAATGGTAT TAAACCTTTT 601 TTAAGTCATG TTCGTAAAGG CGAAATGGGT TATTACTTAC CCGATGAAGA 651 TTTTGGGGCG GAACAAAGCG TATTTGTTGA IT tCI tTGCG ACTTATAAAG 701 CGACATTACC AGGGTTAAAT AAAATGGC?? AACTTTCTAA AGCCGTTGTT 751 ATTCC??TGT TTCCTCGTT? T??CGCTG?? ?CGGGC???T ATG???TCGA 801 AATTCATCCT GCAATGAATT TAAGTGATGA TCCTGAACAA TCAGCCCGAß 851 CAATGAACGA AGAAATAGAA TCTTTTGTTA CGCCAGCGCC AGAGCAATAT 901 GTTTGGATTT TGCAATTATT GCGTACAAGG AAAGATGGCG AAGATCTTTA 951 TGATTAA Secuencia de proteína -45% idéntico y 56% similar a MsbB E .coli 1 HSDNQQNUU. TARVGYEAHF SM3YUCPQYH GXWI.GIFFU. AFVPFRLR 51 DKI.TGK GXH XGHKAKKQRT RAQTNXQYCF PHWTEQQREQ VXDKMFAWA 101 QVKFGIGeXA XRSKKH QKR SEFIGLEHIE QAKAEGKHII MVPHGHAIO 151 ASGIILHTQG HPHTSKYI.PH RHPLVDHLWT XTRQRFGGXK H?RONGXKPF 201 LSHVRKGEMG YYLPDED GA EQSVFVOFFG TYKATLPG N KMAK SKAW 251 IPMFPRYNAX TGKYEMEIHP AMHLSODPEQ SARAMNEEIE SFVT.PA.EQY 301 VHILQLUtT KDGEDLYD» SEQ. IDNO:80 Secuencia del Nucleoíido de ADN región de codón de Moraxella catarrhalis gen MsbB a 1 ATGAGTTGCC ATCATCAGCA TAAGCAGACA CCCAAACACG CCATATCCAT Sl TAAGCATATG CCAAGCTTGA CAGATACTCA TAAACAAAGT AGCCAAGCTG 101 AGCCAAAATC GTTTGAATGG GCCTWT'r?C ATCCCAAATA TTGGGGAGTT 151 TGGCTGGCTT TTGCGTTGAT TTTACCGCTG ATTTTICTAC CGCTGCGTTG 201 SCAGTtTTGG ATCßGCAAGC GTCTTGGCAT TTTG6TACAT TACTTAGCTA 251 AAAGCCGAGT TCAAGACACT CTAACCAACC TGCAGCTTAC CTTCCCAAAT 301 CAACCAAAAT CAAAACACAA GGCCACCGC? CGGCAAGTAT TTATTAATCA 351 AGGTATTGGT ATTTTTGAAA GTTTATGTGC ATßGTTTCGC CCTAATGTCr 401 TTAAACGCAC TTTTAßCATT TCTGGTrrAC AGCATTTGAT TGATGCCCAA 451 AAACAAAATA AAGCGGTGAT TTTACTTGGT GGACATCGCA CGACGCTTGA 501 TTGGGGCGGT CGGtTATGTA CACAGTTTTr TGCGGCGGAC TGCGTGTATC 551 GCCCACAAAA CAACCCTTTG CTTG?ATGGT RTATCTATAA TGCACGCCGC 601 TGTATCTRTG ATGAGCAAAT CTCAAA?CGT GATATGAAAA AACTCATCAC 651 TCGGC?CAAA CAAGGTCGGA TAATTTGGTA TTCACCTGAT CAAGATTTTG 701 CGGCGGGAGCA TGGCGTGATG GCGACCTTTT TTGGTGTGCC TGCAGCAACG 751 ATTACCGCTC AGCGTCGTCT TATTAAGCTG GGTGATAAAG CCAATCCTCC 801 TGTCATC?TC ATGATGGATA TGCTCAGACA AACGCCCGAT TATATCGCAA 851 AAGGTCACCG TCCACATTAT CACATCAGCC TAAGCGCTGT GTTAAAAAAT 901 TATCCCAGCG ATGACGAAAC CGCCGATGCT GAACGCATCA ATCGACTGAT 951 TGAGCAAAAT ATTCAAAAAG ATTTAACCCA GTGGATGTGG TTTCATCGCC íooi G rrr????c TCAAGCCGAT GACACCAATT ACTATCAACA TTAATG Secuencia de proteína -28% idénlico y 37% similar a MsbB de E.coli 1 MSCHHQH QT PKHAISIKHM PSLTDTHKQS SQAEPKSFEW AFLHPKYWGV 51 WAFALIWL IF PLRWQFW IGKR GILVH YAKSRVQDT TNLQLTFPH 101 QPSSKHKATA RQVFXNQGIG IFES CAMFR PHVFKRTFSI SG QgLIOAQ 151 KQHK?VI LG GHRTTLDLGG RCTQFTAAD CVYRPQN1.PÍ. LE riYNARR 201 CIFDEQISHR DMKK ITR1K QGRXIWYSPO QOFGLEHGVM ATFTGV.AAT 251 XTAQRB XIU. GOKAHPPVII MMDMRQTPD YIAKGHRPHY HSSLSAVUCM 301 YPSDOETADA ERINR IEQN IQKJDLTQMKH FHRRFKTQAO DTHYYQH» SEQ. ID NO:81 Secuencia del Nucleoíido de ADN región de codón de Neisseria (Meningococcus B) gen MsbB 1 ATGAAATTTA TATTTTTTGT ?CTGTATGTT TTGCAGTTTC TGCCGTTTGC 51 GCTGCTGCAC AAACTTGCCG ACCTGACGGG TTTGCTCGCC TACCrTTTGG 101 TCAAACCCCG CCGCCGTATC GGCGAAATCA ATTTGGCAAA ATGCTTTCCC 151 GAGTGGGACG GAAAAAAGCG CGAAACCGTA TTGAAGCAGC ATTTCAAACA 201 TATGGCGAAA CTG?TGCTTG AATACGGCTT ATATTGGTAC GCGCCTGCCG 251 GGCGTGGGAA ATCGCTGGTG CGTTACCGCA ATAAGCATTA TTTGGACGAC 301 GCGCTGGCGG CGGGGG???A AGTCATCATT CTGTACCCGC ACTTCACCGC 351 GTTCGAGATG GCGGTGTACG CGCTTAATCA GGATGTA CG CTGATCAGTA 401 TGTATTCCCA CCAAAAAAAC AAGATATTGG ACGCACAGAT TTTGAAAGGC 451 CGCAACCGCT ACGACAATGT CTTCCTTATC GGGCGCACCG AAGGCGTGCG 501 CGCCCTCGTC AAACAGTTCC GCAAAAGCAG CGCGCCGTTT CTGTATCTGC 551 CCGATCAGGA TTTCGGACGC AACGATtCGG TTTTTGTGGA TTGTTTCGGT 601 ATTCAGACGG CAACGATTAC CGGCTTGAGC CGCATTGCCG CGCTTGCAAA 651 TGCAAAAGTG ATACCCGCCA TCCCCGTCCG CGAGGCGGAC AATACGGTTA 701 CATTGCATTT CTACCCGGCT TGGGAATCCT TTCCGAGTGA AGATGCGCAG 7S1 GCCGACGCGC AGCGCATGAA CCGTTTTATC GAGGAACCGT GCGCGAACAT 801 CCCGAGCAGT ATTTTTGGCT GCACAACCGT TTC???ACCC GTCCGG??GG 851 CAGCCCCGAT TTTrACTGAT ACGTAA Secuencia de proleína -25% idéntico y 36% idéntico a MsbB E coli 1 KKFIFFV YV LQFLPFALLH KLADLTGL A YI?VXPRRRI GeiN AKCFP 51 EWOGKKRETV LKQHFKHMAK LMLEYGLYWY APAGRLKSLV RYRM HYLD0 101 AIAAGEKVII LYPHFtAFEM AVYALNQOVP LISMYSHQKN KILDAQILKG 151 RKRYONVp.1 GRTEGVRALV KQFRKSSAPF I.YI.PDQ0FGR HDSVFVDFFG 201 IQTATITGLS Rl?ALANA V XPAXPVREAO NTVT .FYPA WESFPSEDAQ 251 AOAQRMHRFI EEPCANIPSS IFGCTSVSKP VRKAAPIFTD T*

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 .- U na preparación de ampolla diseñada genéticamenle de una cepa de bacíerias Gram negalivas, caraclerizada porque dicha preparación se obtiene utilizando uno o más procedimientos seleccionados del siguiente grupo: a) un procedimienío para reducir aníígenos no proíecíores o variables inmunodom inaníes deníro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de deferminar la identidad de d icho antígeno, d iseñar u na cepa bacteriana q ue prod uzca menos anlígeno o q ue no prod uzca el mismo, y oblener ampollas de dicha cepa; b) un proced imiento para sobrerregular la expresión de antígenos de OMP protectores dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para introducir una secuencia de promotor más fuerte hacia el extremo 5' de un gen que codifica para dicho antígeno, de modo que dicho gen sea expresado a un nivel mayor que en la ampolla no modificada, y obtener ampollas de dicha cepa; c) un procedimiento para sobrerregular la expresión de anlígenos de OM P protecíores y expresados condicionalmente deníro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de idenlificar dicho antígeno, diseñar u na cepa bacteriana para eliminar los mecanismos de conírol represivos de su expresión , y obtener ampollas de dicha cepa; d) un procedimienío para modificar la porción de lípido A de LPS bacíeriano dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar un gen que iníerviene en hacer que la . ' H it porción de lípido A de LPS sea tóxica, diseñar una cepa bacteriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen, y obtener ampollas de dicha cepa; e) un procedimiento para modificar la porción de lípido A de LPS bacteriano deníro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de idenlificar un gen que iníerviene en hacer que la porción de lípido A de LPS sea menos lóxica, diseñar una cepa bacteriana para introducir una secuencia de promoíor más fuerle hacia el exlremo 5' de dicho gen , de modo q ue dicho gen sea expresado a un nivel mayor que en la ampolla no modificada, y obtener ampollas de dicha cepa; f) un proced imiento para reducir la toxicidad de lípido A dentro de la preparación de ampollas y aumentar los niveles de antígenos protecíores, el cual comprende los pasos de diseñar el cromosoma de una cepa bacíeriana que incorpora un gen que codifica para un péptido de polimixina A, o un derivado o análogo del mismo, fusionado a un antígeno protector, y obtener ampollas de dicha cepa; o g) un procedimiento para crear antígenos de OM P conservados en la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para eliminar regiones variables de un gen que codifica para dicho antígeno, y obtener ampollas de dicha cepa. 2.- La preparación de ampolla diseñada genéíicamenle de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizada además porque dicha preparación se obtiene uíilizando u no o más de oíros procedimieníos seleccionados del siguienle grupo: h) un procedimiento para reducir la expresión denlro de la preparación de ampollas de un anlígeno que comparte una sim ilitud esíructural con u na estruclura humana y puede ser capaz de ind ucir una respuesía autoinmune en humanos (tal como el polisacárido capsular de N. meningitidis B) , el cual comprende los pasos de identificar un gen q ue interviene en la biosíntesis del aníígeno, d iseñar una cepa bacíeriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen , y obtener ampollas de dicha cepa; o i) un procedimienfo para sobrerreg ular la expresión de aníígenos de OM P endógenos prolectores (y de preferencia conservados) dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar d icho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para iníroducir en el cromosoma una o más de oirás copias de u n gen que cod ifica para dicho antígeno controlado por u na secuencia de promolor más fuerte y heteróloga, y obtener ampollas de dicha cepa. 3.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque los pasos de diseño de los procedimientos a), b), c) , d) , e) , h) e i) se llevan a cabo mediante evenlos de recombinación homologa entre una secuencia de por lo menos 30 nucleótidos en el cromosoma bacteriano, y una secuencia de por lo menos 30 nucleótidos en un vector transformado dentro de la cepa. 4.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porq ue los pasos de diseño se llevan a cabo mediante eventos de recombinación homologa de entrecruzam iento doble entre dos secuencias de por lo menos 30 nucleótidos en el cromosoma bacteriano separadas por las secuencias de nucleótidos 'X', y dos secuencias de por lo menos 30 nucleótidos en u n vecíor transformado denlro de la cepa , separadas por la secuencia de nucleólidos 'Y' , en donde d uranle el evenfo de recombinación X e Y son inlercambiados. 5.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque las dos secuencias de n ucleótidos son de casi la misma longitud, y en donde el vecíor es u na molécula de ADN lineal. 6.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizada además porque los eventos de recombinación de los procedimientos a) , b), c) , d) , e) y h) se llevan a cabo dentro de la región del cromosoma 1 000 pares de bases hacia el extremo 5' del codón de inicio del gen de interés . 7.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque para los procedimientos a) , d) o h) , la secuencia de nucleótidos X comprende parte de la región de promotor del gen , y la secuencia de nucleótidos Y comprende una región de promotor débil o carece de la misma. 8.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porq ue para los procedimientos b) o e) , la secuencia de nucleótidos Y comprende una región de promolor fuerle para la bacteria. 9.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porq ue la secuencia de nucleótidos Y es inserlada 200-600 pares de bases hacia el exfremo 5' del codón de inicio del gen de inferes. ¿jt 5 1 0.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la secuencia de nucleótidos Y es insertada aproximadameníe 400 pares de bases hacia el extremo 5' del codón de inicio del gen de interés. 1 1 .- La preparación de ampolla de conformidad con la 10 reivindicación 6, caracterizada además porque para el procedimiento c) , la secuencia de n ucleótidos X comprende parte de la secuencia de control represiva del promolor, y la secuencia de nucleótidos Y no comprende dicha secuencia. 1 2.- La preparación de ampolla de conformidad con las 15 reivindicaciones 4 ó 5, caracterizada además porque los eventos de recombinación de los procedimieníos a), d) y h) se llevan a cabo de modo que las secuencias de nucleótidos X comprenden parte de la secuencia de codificación del gen de interés. 1 3.- La preparación de ampolla de conformidad con las 20 reivindicaciones 4 ó 5, caracterizada además porque los eventos de recombinación del procedimienío i) se llevan a cabo de modo que la secuencia de nucleótidos Y comprende la otra copia del gen dentro de un casseíte de expresión . 14.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 1 a 1 3, caracterizada además porque se aisla de una cepa B de Neisseria meningitidis mod ificada . 1 5.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque se obtiene utilizando por lo menos los procedimientos b) y/o i) , en donde uno o más genes son sobrerregulados de u na lista que comprende: NspA, lipo Hsf, Hap, PorA, PorB, OMP85, PilQ , PldA, FrpB, TbpA, TbpB, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, FhaB, HasR, Iipo02, Tbp2 (lipo28), MltA (lipo 30) y ctrA. 16.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 14 ó 1 5, caraclerizada además porq ue se obtiene utilizando por lo menos el procedimienío a), en donde uno o más genes son subregulados de una lista q ue comprende: PorA, PorB, PilC , TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa y Opc. 1 7.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 14-1 6, caracterizada además porque se obtiene uíilizando por lo menos el procedimienlo d) , en donde uno o más genes son subreg ulados de una Usía que comprende: hírB, msbB y IpxK. 1 8.- La preparación de ampolla de conform idad con las reivindicaciones 14-1 7, caracterizada además porque se obtiene utilizando por lo menos el procedimiento e) , en donde uno o más genes son sobrerregulados de una lista que comprende: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF. 19.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 14-18, caracterizada además porque se obtiene ufilizando por lo menos el procedimienlo c), en donde la secuencia de conlrol represiva del promotor es la región de operador fur de los genes TbpB o LbpB, o de cualquiera de los mismos. 20.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 14-19, caracterizada además porque se obtiene utilizando por lo menos el procedimiento h), en donde uno o más genes son subregulados de una lista que comprende: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC y ctrD. 21.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 1-13, caracterizada además porque se aisla de una cepa de Moraxella catarrhalis modificada. 22.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada además porque se obtiene utilizando por lo menos los procedimientos b) y/o i), en donde uno o más genes son sobrerregulados de una lista que comprende: OMP106, HasR, PilQ, OMP85, Iipo06, Iipo10, lipo11, lipo18, P6, ompCD, CopB, D15, Omp1A1, Hly3, LbpA, LbpB, TbpA, TbpB, OmpE, UspA1, UspA2 y Omp21. 23.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizada además porque se obtiene ulilizando por lo menos el procedimiento a), en donde uno o más genes son subregulados de una lista que comprende: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA y LbpB. ^^^ ^^ 24.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 21 -23, caracterizada además porque se obtiene utilizando por lo menos el procedimiento d) , en donde uno o más genes son subregulados de una lista que comprende: hfrB , msbB y I pxK. 25.- La preparación de ampolla de conform idad con las reivindicaciones 21 -24, caracíerizada además porque se obtiene utilizando por lo menos el procedimiento e), en donde uno o más genes son sobrerregulados de una Usía que comprende: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF. 26.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 1 -1 3, caracterizada además porque se aisla de una cepa de Haemophilus influenzae modificada. 27.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porq ue se obtiene utilizando por lo menos los procedimienlos b) y/o i) , en donde uno o más genes son sobrerreg ulados de una lisia que comprende: D 1 5, P6, TbpA, TbpB, P2, P5, OMP26, HMW1 , HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 y Hif. 28.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 26 ó 27, caracterizada además porque se obtiene utilizando por lo menos el procedimienío a) , en donde uno o más genes son subreg ulados de una Usía que comprende: P2, P5, Hif, lgA1 -proteasa , HgpA, HgpB, HMW1 , HMW2, Hxu , TbpA y TbpB. **-« • • '" ji 29.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 26-28, caracterizada además porq ue se obtiene utilizando por lo menos el procedimiento d) , en donde uno o más genes son subregulados de una lista que comprende: htrB, msbB y IpxK. 30.- La preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 26-29, caracterizada además porque se obtiene utilizando por lo menos el procedimiento e) , en donde uno o más genes son sobrerregulados de una lista que comprende: pmrA, pmrB , pmrE y pmrF . 31 .- U na preparación de ampolla diseñada genéticamente de una cepa de bacterias Gram negativas, caracterizada porq ue dicha preparación se obtiene uíilizando u n procedimienlo que comprende los pasos de: introducir un gen heterólogo conlrolado opcionalmente por una secuencia de promotor fuerte en el cromosoma mediante recombinación homologa, y obtener ampollas de dicha cepa. 32.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la cepa de bacferias Gram negativas es Neisseria gonorrhoeae, y el gen heterólogo es una OM P proteclora de C. trachomatis. 33.- La preparación de ampolla de conform idad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la cepa de bacterias Gram negaíivas es Haemophilus influenzae, y el gen heterólogo es una OMP protectora de Moraxella catarrhalis. Í?-?..Í.U , 34.- La preparación de ampolla de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porq ue la cepa de bacterias Gram negativas es Moraxella catarrhalis, y el gen heterólogo es una OMP protecíora de Haemophilus influenzae. 35.- Una vacuna, caracíerizada porque comprende la preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 1 -34, y un excipienle farmacéuficamenle acepíable. 36.- U na vacuna meningocóccica , caracíerizada porque comprende la preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 14 a 20, y uno o más polisacáridos capsulares meningocóccicos simples o conjugados seleccionados de los seroiipos A, C Y o W. 37.- Una vacu na de meningiíis , caracterizada porque comprende la preparación de conformidad con las reivindicaciones 14-20, o la preparación de ampolla de conformidad con la reivind icación 32 , un polisacárido capsular b de H. influenzae conjugado, y uno o más polisacáridos capsulares neumocóccicos simples o conjugados. 38.- Una vacuna de otitis med ia, caracíerizada porque comprende la preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 21 -25, u no o más polisacáridos capsulares neumocóccicos simples o conjugados, y uno o más anlígenos que pueden profeger a u n hospedero ante infección por H. influenzae no tipificable. 39.- La vacuna de otiíis media, caracterizada además porque comprende la preparación de ampolla de conform idad con las reivindicaciones 26-30, uno o más polisacáridos capsulares neumocóccicos simples o conjugados, y uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedero ante infección por Moraxella catarrhalis. 40.- La vacuna de otilis med ia de conform idad con las reivindicaciones 38 ó 39, caracíerizada además porque la vacuna comprende además uno o más aníígenos de proteína q ue pueden proteger a u n hospedero ante Streptococcus pneumoniae, y/o uno o más aníígenos que pueden proleger a u n hospedero anle RSV, y/o uno o más anlígenos q ue pueden proteger a un hospedero ante el virus de influenza. 41 .- U n vector adecuado para llevar a cabo los eventos de recombinación que se describen en las reivind icaciones 3 a 34. 42.- U na cepa de bacíerias Gram negaíivas modificadas de la cual se obtiene la preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 1 a 34. 43.- U na vacu na de ampolla de bacterias Gram negativas, fantasma o de células enteras desfruidas inmunoprotecíora y no íóxica, adecuada para uso pediáírico. 44.- U na secuencia de polinucleótidos aislada que hibrida bajo condiciones altameníe severas con por lo menos una porción de 30 nucleótidos de los nucleótidos de SEQ I D NO: 2-23, 25, 27-81 , o una cadena complemenlaria de la misma. 45.- La secuencia de polin ucleótidos aislada de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque comprende por lo menos 30 nucleótidos. 46.- La secuencia de polinucleótidos aislada de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque comprende por lo menos 30 nucleófidos de SEQ ID NO: 2-23, 25, 27-81 , o una cadena complementaria de la m isma. 47.- El uso de la secuencia de polin ucleótidos aislada de conformidad con las reivindicaciones 44-46, en la realización de u n evenlo de recombinación homologa deníro de 1 000 pares de bases hacia el exíremo 5' de un gen cromosómico de bacíerias Gram negalivas , para incremeníar o dism in uir la expresión de dicho gen . 48.- Un procedimienfo para sobrerregular genéticamenle la expresión de un gen deníro de u na cepa de baclerias Gram negativas, caracterizado porque comprende los pasos de: obíener un veclor que comprenda una secuencia de promotor fuerte y una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30 nucleótidos que sea capaz de recombinación con una secuencia de por lo menos 30 nucleótidos en los 1 000 pares de bases hacia el exfremo 5' del gen , íransformar u na cepa bacteriana con el vector, y realizar un evenío de recombinación homologa enire el cromosoma y el vector para introducir el promotor denlro de 1 000 pares de bases hacia el extremo 5' del codón de inicio del gen . f 49.- El procedimienlo de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque el promotor es introducido dentro de 200-600 pares de bases hacia el extremo 5' del codón de inicio del gen . 5 50.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porq ue el promotor es introducido aproximadamente 400 pares de bases hacia el extremo 5' del codón de inicio del gen . 51 .- El procedimiento de conformidad con las 10 reivindicaciones 48-50 caracterizado además porque el evento de recombinación homologa se efectúa a través de un entrecruzamiento doble entre dos secuencias de por lo menos 30 nucleótidos en el cromosoma bacíeriano separadas por la secuencia de nucleótidos 'X', y dos secuencias de por lo menos 30 15 nucleótidos en el veclor separadas por la secuencia de nucleólidos 'Y' que comprende la secuencia de promotor fuerte, en donde el vector es una secuencia de nucleótidos lineal, y en donde durante el evenío de recombinación X e Y son inlercambiados. 52.- El procedimiento de conformidad con la 20 reivindicación 51 , caracterizado además porque las dos secuencias de nucleótidos son de aproximadamente la misma longiíud. 53.- U na cepa bacteriana modificada obtenible mediante los procedim ienlos de conformidad con las reivindicaciones 48-52. 54.- Un método para producir u na preparación de 25 ampolla diseñada genéticamenle de una cepa de bacterias Gram j . JUfcmi-iy „ negativas, caracterizado porque dicha preparación se obtiene utilizando uno o más procedimientos seleccionados del sig uiente grupo: a) un procedimiento para reducir antígenos no protectores o variables inmunodominantes dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de determinar la ideníidad de dicho aníígeno, diseñar una cepa bacteriana que produzca menos antígeno o que no produzca el mismo, y obíener ampollas de dicha cepa; b) un procedimienlo para sobrerreg ular la expresión de aníígenos de OMP proteclores dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para introducir una secuencia de promotor más fuerte hacia el extremo 5' de un gen que codifica para dicho antígeno, de modo que dicho gen sea expresado a un nivel mayor que en la ampolla no modificada, y obtener ampollas de dicha cepa; c) un proced imiento para sobrerregular la expresión de antígenos de OM P protectores y expresados condicionalmente dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho antígeno, d iseñar una cepa bacteriana para elim inar los mecanismos de control represivos de su expresión , y obtener ampollas de d icha cepa ; d) u n procedimiento para modificar la porción de lípido A de LPS bacteriano dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar un gen que interviene en hacer que la porción de lípido A de LPS sea tóxica , diseñar una cepa bacteriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen , y obtener ampollas de dicha cepa; e) un procedim ienlo para modificar la porción de lípido A de LPS bacteriano dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar un gen que iníerviene en hacer que la porción de lípido A de LPS sea menos tóxica, d iseñar una cepa bacteriana para iníroducir una secuencia de promotor más fuerte hacia el extremo 5' de dicho gen , de modo que dicho gen sea expresado a un nivel mayor que en la ampolla no modificada, y obtener ampollas de dicha cepa; f) un procedimiento para reducir la toxicidad de lípido A dentro de la preparación de ampollas y aumentar los niveles de antígenos protectores, el cual comprende los pasos de diseñar el cromosoma de u na cepa bacteriana que incorpora un gen que codifica para un péptido de polimixina A, o un derivado o análogo del m ismo, fusionado a un antígeno proteclor, y obtener ampollas de dicha cepa; g) un procedimiento para crear antígenos de OMP conservados en la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de ideníificar dicho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para eliminar regiones variables de un gen que codifica para dicho antígeno, y obtener ampollas de dicha cepa; h) un procedimienfo para reducir la expresión dentro de la preparación de ampollas de un antígeno que comparíe una similiíud esírucíural con una esírucíura humana y puede ser capaz de inducir una respuesía auíoinmune en h umanos, el cual comprende los pasos de identificar un gen que interviene en la biosíntesis del antígeno, diseñar una cepa bacteriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen , y obtener ampollas de dicha cepa; o i) un procedimiento para sobrerregular la expresión de antígenos de OMP protectores dentro de la preparación de ampollas, el cual comprende los pasos de identificar dicho antígeno, diseñar una cepa bacteriana para iníroducir en el cromosoma una o más de oirás copias de un gen que codifica para dicho antígeno controlado por una secuencia de promotor más fuerte y heteróloga , y obtener ampollas de d icha cepa. 55.- Un método para inmun izar a un hospedero humano aníe u na enfermedad causada por infección de uno o más de los sig uientes: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumonia, caracterizado porque dicho méíodo comprende adm in istrar al hospedero una dosis inmunoprotecíora de la preparación de ampolla de conformidad con las reivindicaciones 1 -34. 56.- El uso de la preparación de ampolla como se reclama en las reivindicaciones 1 -34, en la fabricación de un med icamenlo para inmu nizar a un hospedero humano anle una enfermedad causada por infección de uno o más de los siguientes: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae.
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