MXPA02001086A

MXPA02001086A - Secuencias de acido nucleico que codifican para isomerasa de acido graso polienoico y usos de las mismas.

Info

Publication number: MXPA02001086A
Application number: MXPA02001086A
Authority: MX
Inventors: Yuan Ling
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2002-08-12
Also published as: EP1218497A1; BR0012873A; AU6749400A; CA2379813A1; WO2001009296A1

Abstract

Se proveen secuencias de acido nucleico y metodos para producir acidos grasos conjugados en celulas hospederas; se obtienen secuencias de acido nucleico a partir de fuentes algaceas que codifican para isomerasa de acido graso polienoico; las secuencias de acido nucleico se pueden utilizar en las construcciones de expresion para dirigir la expresion de las secuencias de PFI en celulas hospederas; la expresion de PFI en celulas hospederas transgenicas ayuda a la produccion de acidos grasos conjugados en la celula hospedera.

Description

SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN PARA ISOMERASA DE ACIDO GRASO POLIENOICO Y USOS DE LAS MISMAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U.A. con número de serie 60/146,458 presentada el 30 de julio de 1999, la cual se incorpora en su totalidad a la presente como referencia.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a secuencias y construcciones de ácido nucleico y aminoácidos, y métodos relacionados con las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se requieren novedosos medios mejorados y/o composiciones de aceite vegetales para obtener o manipular composiciones de ácido graso, a partir de fuentes vegetales biosintéticas o naturales. Dependiendo del uso de aceite destinado, se desean diferentes composiciones de aceite. Por ejemplo, las fuentes de aceite comestible que contienen las mínimas cantidades posibles de ácidos grasos saturados son convenientes por razones dietéticas íSBßSSS?-* Íiá_£___.AJí-->t~i--? f - ___ , ""iWitoiiíii y también se necesitan alternativas para fuentes actuales de productos de aceite altamente saturado, tal como aceites tropicales. Además, también son necesarias en la técnica, composiciones de aceite que contienen especies de ácido graso raras o exóticas que tienen beneficios alimenticios. Los ácidos grasos conjugados, tal como ácido linoleico conjugado (CLA), están obteniendo reconocimiento por sus beneficios en salud en la alimentación animal y en nutrición humana. El ácido graso conjugado es un término general para ácidos grasos que contienen enlaces dobles alternando con enlaces sencillos. Por ejemplo, ácido linoleico conjugado se refiere a un serie de isómeros geométricos y de posición de ácido linoleico (una molécula de 18 carbonos que contiene enlaces dobles en las posiciones cis-9 y cis-12). Uno de los diferentes isómeros de CLA, los isómeros cis-9, trans-10, cis-12, han recibido la mayor parte de atención. Los datos recientes sugieren (Parks, ef al. (1999), Lipids, 34: 235-243) que el trans-10, cis-12 es la forma biológicamente activa. Sin embargo, se reconoce que otros isómeros de CLA, y/u otros ácidos grasos conjugados, también pueden demostrar que tienen actividades biológicas. CLA es ahora reconocido como un suplemento alimenticio y un inhibidor efectivo de carcinogénesis epidérmica y neoplasia del estómago anterior en ratones, y de tumores de colon y mamarios en rata inducidos por carcinógeno. Además, CLA ha demostrado reducir LDL y aterosclerosis en hámsters y conejos, reducir grasa corporal e incrementar masa corporal ^ •->-- ^ i i i escasa en pollos, cerdos, ratas y ratones, incrementar eficiencia de alimentación en pollos y cerdos, reducir suero PGE2 en ratas, incrementar masa ósea en ratones y pollos, así como reducir pérdida de peso durante desafío inmunológico en ratones, pollos y ratas. De esta forma, la identificación de enzimas objetivos y fuentes para secuencias de ácido nucleico de dichas enzimas objetivo capaces de producir ácidos grasos conjugados en células hospederas es necesaria en la técnica. Finalmente, se necesitan construcciones útiles de ácido nucleico que tengan los elementos necesarios para proveer una modificación fenotípica y células hospederas que contienen dichas construcciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a isomerasas de ácido graso polienoico (PFl), y en particular a polipéptidos y polinucleótidos de PFl. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención incluyen aquellos derivados de fuentes vegetales y fúngicas. En otro aspecto de la invención, se proveen polinucleótidos que codifican para novedosos polipéptidos, particularmente, polinucleótidos que codifican para PFl. En un aspecto adicional, la invención se refiere a oligonucleótidos derivados de las proteínas de PFl y oligonucleótidos los cuales incluyen secuencias codificantes de PFl parciales o completas.

Además, es un aspecto de la presente invención, proveer construcciones de ADN recombinante las cuales se pueden utilizar ya sea para transcripción y/o expresión de PFl. En particular, se proveen construcciones las cuales son capaces de transcripción y/o expresión en células hospederas. Las construcciones particularmente preferidas son aquellas capaces de transcripción y/o expresión en células vegetales. Incluso en otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para producción de PFl en una célula hospedera o progenie de la misma. En particular, las células hospederas son transformadas o transfectadas con una construcción de ADN la cual se puede utilizar para transcripción y/o expresión de PFl. Las células recombinantes que contienen PFl también son parte de la presente invención. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a métodos para utilizar secuencias de polinucleótido y polipéptido para modificar la composición de ácido graso en una célula hospedera, particularmente en aceite de semilla de cultivos de semilla oleaginosa. En particular, la composición de ácido graso modificada comprende una cantidad alterada de ácidos grasos conjugados. También se contemplan en la presente células vegetales que contienen dichos ácidos grasos modificados. Las plantas, semillas y aceites modificados obtenidos por la expresión de las proteínas vegetales de PFl, también se consideran parte de la invención. la É. l,._.m_<_í ... ._ ii,..»>.__2..

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proveen secuencias de nucleótidos que codifican para una proteína, polipéptido o péptido, los cuales son activos en la formación de ácidos grasos conjugados a partir de substratos de ácido graso polienoico. Dichas secuencias son referidas en la presente como isomerasas de ácido graso polienoico (también referidas como PFl). Las novedosas secuencias de ácido nucleico encuentran uso en la preparación de construcciones para dirigir su expresión en una célula hospedera. Además, las novedosas secuencias de ácido nucleico encuentran uso en la preparación de construcciones de expresión vegetal para modificar la composición de ácido graso de una célula vegetal. Una secuencia de ácido nucleico de isomerasa de ácido graso polenoico de esta invención incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína, polipéptido, o fragmento peptídico, que se puede obtener de una fuente la cual es activa en la formación de ácidos grasos conjugados a partir de un substrato de ácido graso poliinsaturado en una célula hospedera vegetal, es decir, in vivo, o en un ambiente similar a célula vegetal, es decir, in vitro. Como se utiliza en la presente, "conjugado" se refiere a la interacción de los sistemas de electrón pi en donde la cadena de carbono contiene enlaces dobles y sencillos alternos (C=C-C=C) de modo que los electrones de los enlaces dobles están lo suficientemente cerca para interactuar entre sí. Esto a diferencia de enlaces dobles "aislados", en donde <* *Í?rk .i I los sistemas de electrón pi están separados por un carbono saturado (C=C-C-C=C) o "acumulado" en donde los enlaces dobles comparten un carbono central (C=C=C). "Un ambiente similar a célula vegetal" significa que cualquier condición necesaria está disponible en dicho ambiente (es decir, factores tales como temperaturas, pH, falta de sustancias inhibidoras) las cuales permitirán que la enzima funcione. Los ácidos grasos utilizados como substratos por la proteína codificada por la secuencia de polinucleótidos de la presente invención, incluyen cualquier substrato de ácido graso poliinsaturado. Dichos substratos de ácido graso incluyen, pero no se limitan a dienos, trienos, tetraenos, pentaenos y hexaenos. Los substratos de ácido graso de interés particular en la presente invención incluyen pero no se limitan a ácido linoleico, ácido linolénico, estearidónico, ácido eicosapentanoico, ácido dihomo-?-linolénico, ácido adrénico, ácido eicostrienónico, ácido a-linolénico, ácido docosahexaenoico y ácido araquidónico.

Proteínas, polipéptidos v polinucleótidos aislados Un primer aspecto de la presente invención se refiere a polipéptidos de PFl aislados. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos aislados expuestos en el listado de secuencias, así como polipéptidos y fragmentos de los mismos, particularmente aquellos polipéptidos que presentan actividad de PFl y también aquellos polipéptidos que tienen aproximadamente por lo menos 50-79% de identidad, de preferencia, aproximadamente por lo menos 80% de identidad, e incluso preferiblemente cerca de por lo menos 90% de identidad, con una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo de secuencias expuestas en el listado de secuencias, y también incluye porciones de dichos polipéptidos, en donde dicha porción del polipéptido, de preferencia incluye por lo menos 30 aminoácidos y preferiblemente incluye por lo menos 50 aminoácidos. "Identidad", como se entiende en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótido, según se determina al comparar estas secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según lo determinado por la coincidencia entre filas de dichas secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente a través de métodos conocidos que incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1 |994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., Stockton Press, New York (1991 ); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math, 48:1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Además, los métodos para determinar la i_j_¡___ ,__.;_ ?.+ .-a»»*.»..-... M_t_auam* idefltt?lad están codificados en programas públicamente disponibles. Los programas de cómputo que se pueden utilizar para determinar identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1 ):387 (1984); paquete de cinco programas BLAST, tres diseñados para investigaciones de secuencias de nucleótido (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñados para investigaciones de secuencia de proteínas (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1: 543-559 (1997)). El programa BLAST X está públicamente disponible por NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul. S., et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul. S., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). También se puede utilizar el algoritmo conocido de Smith Waterman para determinar identidad. Los parámetros para comparación de secuencias de polipéptido normalmente incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970) Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff and Hentikoff, Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:10915-10919 (1992) Sanción por espacio: 12 Sanción por longitud de espacio: 4 Un programa que se puede utilizar con estos parámetros está públicamente disponible como ei programa de "espacio" de Genetics Computer Group, Madison Wisconsin. Los parámetros anteriores junto con fc^il fe^^Ka- ial^fe-^^^-^fe-a.^^ « **fr . * ¡ * t, ^. ^--^ , s^^*.^ *. ^* & >*& & ^ «. ^ *, _*, * -» k t ninguna sanción por espacio final son los parámetros predeterminados para comparaciones de péptidos. Los parámetros para comparación de secuencias de polinucleótidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970) Matriz de comparación: igualdades = + 10; desigualdades = 0 Sanción por espacio: 50 Sanción por longitud de espacio: 3 Un programa el cual se puede utilizar con estos parámetros está públicamente disponible como el programa de "espacio" de Genetics Computer Group, Madison Wisconsin. Los parámetros anteriores son los parámetros predefinidos para comparaciones de ácido nucleico. La invención también incluye polipéptidos de la fórmula: en donde, en la terminal amino, X es hidrógeno, y en la terminal carboxilo, Y es hidrógeno o un metal, Ri y R3 son cualquier residuo de aminoácidos, n es un entero entre 1 y 1000, y R2 es una secuencia de aminoácidos de la invención, particularmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo expuesto en el listado de secuencias y de preferencia SEQ ID Nos: 2 y 4. En la fórmula, R2 está orientado de modo tal que su residuo amino terminal está a la izquierda, unido a R1 f y su residuo carboxi terminal está a la derecha, unido a R3. Cualquier tramo de residuos de aminoácidos denotado ya sea por •¡ata el grupo R, en donde R es mayor a 1 , puede ser un heteropolímero o un homopolímero, de preferencia un heteropolímero. Los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos aislados codificados por un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo de una secuencia contenida en SEQ ID Nos: 1 y 3. Los polipéptidos de la presente invención han demostrado tener actividad de PFl y son de interés debido a que PFl está involucrada en la producción de ácidos grasos conjugados a partir de moléculas de substrato de acilo graso polienoico. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser una proteína madura o pueden ser parte de una proteína de fusión. Los fragmentos y variantes de los polipéptidos también son considerados parte de la invención. Un fragmento es una variante polipeptídica la cual tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma como parte pero no por completo de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos previamente descritos. El fragmento puede ser "independiente" o estar comprendido dentro de un polipéptido mayor del cual el fragmento forma una parte o una región, de preferencia como una región continua sencilla. Los fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos los cuales son aquellos fragmentos que median actividades de los polipéptidos de la invención, incluyendo aquellos con actividad similar o actividad mejorada o con una actividad disminuida.

También se incluyen aquellos fragmentos que son antigénicos o inmunogénicos en un animal, particularmente un humano. Las variantes del polipéptido también incluyen polipéptidos que varían de las secuencias expuestas en el listado de secuencias por sustituciones de aminoácidos conservativas, las cuales son sustituciones de un residuo por otro residuo con características y/o propiedades similares. En general, dichas sustituciones están entre Ala, Val, Leu e lie; entre Ser y Thr; entre Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre Lys y Arg; o entre Phe y Tyr.

Particularmente preferidas son variantes en las cuales 5 a 10; 1 a 5; 1 a 3 o un aminoácido(s) son sustituidos, suprimidos, o añadidos en cualquier combinación. Las variantes que son fragmentos de los poliéptidos de la invención se pueden utilizar para producir el polipéptido de longitud total correspondiente mediante síntesis peptídica. Por lo tanto, estas variantes se pueden utilizar como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud total de la invención. Otro aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos de PFl aislados. Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención incluyen polinucleótidos aislados que codifican para los polipéptidos de la invención que tienen una secuencia de aminoácidos deducida seleccionada del grupo de secuencias expuestas en el listado de secuencias y a otras secuencias de polinucleótidos estrechamente relacionadas con dichas secuencias y variantes de las mismas.

La invención también provee una secuencia de polinucleótidos idéntica en toda su longitud a cada secuencia codificante como se expone en el listado de secuencias. La invención también provee la secuencia codificante para el polipéptido maduro o un fragmento del mismo, así como la secuencia codificante para el polipéptido maduro o un fragmento del mismo en un marco de lectura con otras secuencias codificantes, tales como aquellas que codifican para una secuencia líder o secretoria, una secuencia de pre-, pro-, o prepro- proteína. El polinucleótido también puede incluir secuencias no codificantes, que incluyen, por ejemplo, pero que no se limitan a secuencias no codificantes 5' y 3', tal como las secuencias transcritas, no traducidas, señales de terminación, sitios de unión a ribosoma, secuencias que estabilizan ARNm, intrones, señales de poliadenilación, y secuencia codificante adicional que codifica para aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede incluir una secuencia marcadora para facilitar la purificación del polipéptido fusionado. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que comprenden un gen estructural y las secuencias naturalmente asociadas que controlan expresión de genes. La invención también incluye polinucleótidos de la fórmula: X-(R?)n-(R2)-(R3)n-Y en donde, en el extremo 5', X es hidrógeno y en el extremo 3' Y es hidrógeno o un metal, Ri y R3 son cualquier residuo de ácido nucleico, n es un entero entre 1 y 3000, de preferencia entre 1 y 1000 y R2 es una secuencia de ácido nucleico de la invención, particularmente una secuencia de ácido nucleico _V?¡£ -. Á ? . ??ís seleccionada del grupo expuesto en el listado de secuencias y de preferencia SEQ ID Nos: 1 y 3. En la fórmula, R2 está orientada de modo tal que su residuo de extremo 5' está a la izquierda, unido a Ri, y su residuo de extremo 3' está a la derecha, unido a R3. Cualquier tramo de residuo de ácido nucleico denotado ya sea por el grupo R, en donde R es mayor a 1 , puede ser un heteropolímero o un homopolímero, de preferencia un heteropolímero. La invención también se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos en la presente que codifican para variantes de los polipéptidos de la invención. Las variantes que son fragmentos de los polinucleótidos de la invención se pueden utilizar para sintetizar polinucleótidos de longitud total de la invención. Las modalidades preferidas son polinucleótidos que codifican para variantes de polipéptidos en donde 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácido de una secuencia de polipéptido de la invención es sustituido, añadido o suprimido, en cualquier combinación. Se prefieren particularmente sustituciones, adiciones y deleciones que son silenciosas de modo que no alteren las propiedades o actividades del polinucleótido o polipéptido. Las secuencias de nucleótido que codifican para isomerasas de ácido graso polienoico se pueden obtener de fuentes naturales o pueden ser parcial o completamente sintetizadas de manera artificial. Pueden corresponder directamente a una isomerasa de ácido graso polienoico endógena a una fuente natural o contener secuencias de aminoácidos modificados, tal como secuencias que han sido mutadas, truncadas, o ¿itÁ. ?.?t.*,. ?aj.A . aadfeajj^ similares. Las isomerasas de ácido graso polienoico se pueden obtener a través de una variedad de métodos, que incluyen pero no se limitan a purificación parcial u homogénea de extractos de proteína, formación de modelos de proteína, sondas de ácido nucleico, preparaciones de anticuerpos y comparaciones de secuencias. Normalmente, una isomerasa de ácido graso polienoico se derivará completamente o en parte de una fuente natural. Una fuente natural incluye pero no se limita a fuentes procarióticas y eucarióticas, que incluyen bacterias, levaduras, plantas, incluyendo algas y similares. Son de especial interés isomerasas de ácido graso polienoico que son obtenibles de fuentes de algas, incluyendo aquellas que se obtienen de Ptilota, Bossiella, Lithotham, por ejemplo P.filicina, o de isomerasas de ácido graso polienoico que son obtenibles a través del uso de estas secuencias. "Obtenible" se refiere a aquellas isomerasas de ácido graso polienoico que tienen secuencias suficientemente similares a las de las secuencias provistas en la presente para proveer una isomerasa de ácido graso polienoico biológicamente activa. Modalidades adicionalmente preferidas de la invención son aquellas por lo menos aproximadamente 50-79% idénticas sobre toda su longitud a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención, y polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos. Se prefieren polinucleótidos que comprenden una región que es aproximadamente por lo menos 80% idéntica sobre toda la longitud a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención y polinucleótidos que son complementarios al mismo. Son particularmente preferidos polinucleótidos por lo menos aproximadamente 90% idénticos sobre toda su longitud, y son especialmente preferidos aquellos de por lo menos aproximadamente 95% idénticos. Además, aquellos con por lo menos aproximadamente 97% de identidad son altamente preferidos y aquellos con por lo menos aproximadamente 98% y 99% de identidad, son particularmente preferidos, con aquellos de por lo menos aproximadamente 99% siendo los de mayor preferencia. Las modalidades preferidas son polinucleótidos que codifican para polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica como los polipéptidos maduros codificados por los polinucleótidos expuestos en el listado de secuencias. La invención se refiere además a polinucleótidos que hibridan las secuencias anteriormente descritas. En particular, la invención se refiere a polinucleótidos que hibridan bajo condiciones severas a los polinucleótidos antes descritos. Como se utiliza en la presente, los términos "condiciones severas" y "condiciones de hibridación severas" significan que la hibridación generalmente ocurrirá si existe por lo menos aproximadamente 95% y de preferencia, por lo menos aproximadamente 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo de condiciones severas de hibridación es incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, SSC 5x (150 mM NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, y 20 Je?- _t * íi microgramos/mililitros de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, fragmentado, seguida de lavado del soporte de hibridación en SSC 0.1x aproximadamente a 65°C. También se conocen otras condiciones de hibridación y lavado y se ejemplifican en Sambrook, ef al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente Capítulo 11. La invención también provee un polinucleótido que consta esencialmente de una secuencia de polinucleótido obtenible mediante selección de una genoteca adecuada que contiene el gen completo para una secuencia de polinucleótido expuesta en el listado de secuencias bajo condiciones de hibridación severas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia de polinucleótido o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia de polinucleótido. Los fragmentos útiles para obtener dicho polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas e iniciadores como se describe en la presente. Como se discute en la presente con respecto a análisis de polinucleótido de la invención, por ejemplo, se pueden utilizar polinucleótidos de la invención como una sonda de hibridación para ARN, ADNc o ADN genómico para aislar ADNc de longitud total o clones genómicos que codifican para un polipéptido y para aislar ADNc o clones genómicos de otros genes que tienen alta similitud de secuencia con un polinucleótido expuesto en el listado de secuencias. Dichas sondas generalmente comprenderán por lo menos 15 bases. De preferencia, dichas sondas generalmente comprenderán por lo menos 15 bases. De preferencia, dichas sondas tendrán por lo menos 30 bases y pueden tener por lo menos 50 bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán inclusive, entre 30 bases y 50 bases. La región codificante de cada gen que comprende o que está conformado por una secuencia de polinucleótido expuesta en el listado de secuencias, se puede aislar mediante selección utilizando una secuencia de ADN provista en el listado de secuencias para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención, se utiliza entonces para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para identificar elementos de la genoteca que hibridan la sonda. Por ejemplo, se preparan oligonucleótidos sintéticos que corresponden a la secuencia N-terminal del péptido de PFl. Las secuencias parciales así preparadas, se utilizan entonces como sondas para obtener clones de PFl a partir de una genoteca preparada de Ptilota fílicina, un alga marina roja. De manera alternativa, cuando se preparan oligonucleótidos de baja degeneración a partir de péptidos de PFl particulares, dichas sondas se pueden utilizar directamente para seleccionar genotecas para secuencias de genes de PFl. En particular, la selección de genotecas de ADNc en vectores fago es útil en dichos métodos debido a niveles inferiores de hibridación de fondo. Normalmente, una secuencia de PFl que se obtiene del uso de sondas de ácido nucleico mostrará aproximadamente 60-70% de identidad de secuencias entre la secuencia de PFl objetivo y la secuencia codificante 1 .1. . ? . <1f.?_. .A _ &-.*_ .. .F S tal utilizada como una sonda. Sin embargo, también se pueden obtener secuencias extensas con solo aproximadamente 50-60% de identidad de secuencias. Las sondas de ácido nucleico pueden ser un fragmento extenso de la secuencia de ácido nucleico, o puede ser una sonda de oligonucleótido más corta. Cuando se utilizan como sondas fragmentos de ácidos nucleico más grandes (mayores aproximadamente 100 pb), se puede seleccionar en severidades inferiores con el fin de obtener secuencias a partir de la muestra objetivo la cual tiene 20-50% de desviación (es decir, 50-80% de homología de secuencia) de las secuencias utilizadas como sonda. Las sondas de oligonucleótido pueden ser considerablemente más cortas que toda la secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima PFl, pero debe tener por lo menos aproximadamente 10, de preferencia por lo menos aproximadamente 15 y preferiblemente por lo menos alrededor de 20 nucleótidos. Es aconsejable un mayor grado de identidad de secuencia cuando se utilizan regiones más cortas a diferencia de regiones más grandes. De esta forma, puede ser deseable identificar regiones de secuencia de aminoácido altamente conservada para diseñar sondas de oligonucleótido para detectar y recuperar otros genes de PFl relacionados. Las sondas más cortas, con frecuencia son particularmente útiles para reacciones de cadena de polimerasa (PCR), especialmente cuando se pueden identificar secuencias altamente conservadas. (Véase, Gould, et al., PNAS E.U.A (1989) 86:1934-1938). jlfainfeá m, jt-teá áajtj,^ El experto en la técnica apreciará que en muchos casos, una secuencia de ADNc aislada estará incompleta, debido a que la región que codifica para el polipéptido está truncada con respecto a la terminal 5' del ADNc. Esto es una consecuencia de la transcriptasa inversa, una enzima con baja "capacidad de procesamiento" (una medida de la capacidad de la enzima para permanecer unida al molde durante la reacción de polimerización) empleada durante la síntesis de la primer hebra de ADNc. Existen diferentes métodos disponibles y que son conocidos para el experto en la técnica para obtener ADNc de longitud total, o extender ADNc cortos, por ejemplo, aquellos basados en el método de Amplificación Rápida de Extremos dé ADNc (RACE) (véase por ejemplo, Frohman et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85:8998-9002). Recientes modificaciones de la técnica, ejemplificada por la tecnología Marathoná (Clonetech Laboratories, Inc.) por ejemplo, se han simplificado significativamente obteniendo secuencias de ADNc de longitud total. Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden utilizar por ejemplo, en la transformación de diferentes células hospederas, como se discute más adelante en la presente. La invención también provee polinucleótidos que codifican para un polipéptido que es una proteína madura más aminoácidos adicionales amino o carboxilo terminal, o aminoácidos dentro del polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura de la proteína tiene más de una cadena de polipéptidos). Dichas secuencias, por ejemplo pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor a una forma madura, permitir transporte de proteína, acortar o alargar la vida media de proteína, o facilitar la manipulación de la proteína en análisis o producción. Se contempla que se pueden utilizar enzimas celulares para remover cualquier aminoácido adicional de la proteína madura. Una proteína precursora, que tiene la forma madura del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Los precursores inactivos generalmente son activados cuando son removidas las prosecuencias. Algunas o todas las prosecuencias pueden ser removidas antes de activación. Dicha proteína precursora es generalmente llamada proproteína. Las secuencias de polinucleótido y polipéptido también se pueden utilizar para identificar secuencias adicionales las cuales son homologas a las secuencias de la presente invención. El método más preferido y conveniente es almacenar la secuencia en un medio legible por computadora, por ejemplo, disco flexible, CD ROM, unidades de disco duro, unidades de disco externo y DVD, y luego utilizar la secuencia almacenada para buscar una base de datos de secuencias con herramientas de búsqueda conocidas. Los ejemplos de bases de datos públicas incluyen la Base de Datos de ADN de Japón (DDBJ)(http://www.ddbj. nig.ac.jp/); Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/lndex, htlm); y la Base de Datos de Secuencia de Acido Nucleico del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html). Un número de diferentes algoritmos de búsqueda están disponibles para el experto en la técnica, un ejemplo de los cuales es el conjunto de programas referido como programas BLAST. Existen cinco implementaciones de BLAST, tres diseñados para investigaciones de secuencias de nucleótidos (BLASTN, BLASTX y TBLASTX) y dos diseñados para investigaciones de secuencias de proteínas (BLASTP y TBLASTIN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1 : 543-559 (1997)). Están disponibles programas adicionales en la técnica para el análisis de secuencias identificadas, tales como programas de alineación de secuencia, programas para la identificación de secuencias relacionadas de manera más distante, y similares, y son conocidos para el experto en la técnica.

Construcciones vegetales y métodos de uso Es de particular interés el uso de las secuencias de nucleótido, o polinucleótidos, en construcciones de ADN recombinante, para dirigir la transcripción y/o expresión de las secuencias de PFl de la presente invención en una célula vegetal hospedera. Las construcciones de expresión generalmente comprenden un promotor funcional en una célula vegetal enlazado de manera operable a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una isomerasa de ácido graso polienoico de la presente invención y una región de terminación de la transcripción funcional en una célula vegetal. Los expertos en la técnica reconocerán que existe un número de promotores que son funcionales en células vegetales que han sido descritos en la literatura. Además, también están contemplados promotores específicos de organelos y plastidios tales como promotores funcionales de cloropiasto o plastidio y promotores operables por cloroplasto o plastidio. Un conjunto de promotores son promotores constitutivos tales como los promotores CaMV35S o FMV35S que producen altos niveles de expresión en la mayoría de órganos vegetales. Versiones aumentadas o duplicadas de los promotores CaMV35S o FMV35S son útiles en la práctica de esta invención (Odell, et al. (1985) Nature 313:810-812; Roger, patente de E.U.A. Número 5,378,619). Además, también se puede preferir ocasionar expresión del gen de PFl en tejidos específicos de la planta, tales como hoja, tallo, raíz, tubérculo, semilla, fruto, etc., y el promotor seleccionado debe tener el tejido deseado y especificidad de desarrollo. Es de particular interés la expresión de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención a partir de regiones de iniciación de la transcripción, las cuales de preferencia se expresan en un tejido de semilla vegetal. Ejemplos de dichas secuencias de iniciación de la transcripción preferencial de semilla incluyen aquellas secuencias derivadas de secuencias que codifican para genes de proteína de almacenamiento vegetal o de genes involucrados en biosíntesis de ácido graso en semillas oleaginosas. Ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de dichos genes tales como napin (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991 )), faseolina, zeína, inhibidor de tripsina de semilla de soya, ACP, estearoil-ACP ¿ *¿ *!¿¿^^ ¿.?, ¿ ~a^ -- -*&_ -,* ^___ kám*?^á desaturasa, subunidad a' de semilla de soya de b-conglicinina (soya 7, (Chen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 83:8560-8564 (1986))) y oleosina. Sería conveniente dirigir la localización de proteínas que confieren PFl a un compartimiento subcelular particular, por ejemplo, al mitocondrio, retículo endoplásmico, vacuolas, cloroplasto u otro compartimiento plastídico. Por ejemplo, cuando los genes de interés de la presente invención sean orientados a plastidios, tales como cloroplastos para expresión, las construcciones también emplearán el uso de secuencias para dirigir el gen hacia el plastidio. Dichas secuencias son referidas en la presente como péptidos de tránsito de cloroplasto (CTP) o péptidos de tránsito de plastidio (PTP). De esta manera, cuando el gen de interés no sea directamente insertado en el plastidio, la construcción de expresión contendrá adicionalmente un gen que codifica para un péptido de tránsito para dirigir el gen de interés hacia el plastidio. Los péptidos de tránsito de cloroplasto se pueden derivar del gen de interés, o pueden derivarse de una secuencia heteróloga que tiene un CTP. Dichos péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Véase por ejemplo, Von Heijne et al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Che,. 264:17544-17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer ef al. (1993) Biochem. Biophys. Res Commun. 196:1414-1421 ; y, Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Péptidos de tránsito adicional para la translocación de la proteína de PFl hacia el retículo endoplásmico (ER), o vacuola también pueden encontrar uso en las construcciones de la presente invención.

Dependiendo del uso destinado, las construcciones pueden contener la secuencia de ácido nucleico que codifica para toda la proteína de PFl o una porción de la misma. Por ejemplo, cuando se desea una inhibición antisentido de una proteína de PFl dada, no es necesaria toda la secuencia de PFl. Además, cuando las secuencias de PFl utilizadas en construcciones estén destinadas para uso como sondas, puede ser conveniente preparar construcciones que contengan solamente una porción particular de una secuencia codificante de PFl, por ejemplo, una secuencia que se descubra que codificar para una región de PFl altamente conservada. El experto en la técnica reconocerá que existen diferentes métodos para la inhibición de expresión de secuencias endógenas en una célula hospedera. Dichos métodos incluyen pero no se limita a supresión antisentido (Smith, et al. (1988) Nature 334:724-726), cosupresión (Napoli, ef al. (1989) Plant Cell 2:279-289), ribozimas (publicación de PCT WO 97/10328), y combinaciones de sentido y antisentido Waterhouse, ef al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13959-13964. Los métodos para la supresión de secuencias endógenas en una célula hospedera, normalmente emplean la transcripción o transcripción y traducción de por lo menos una porción de la secuencia para ser suprimida. Dicha secuencias pueden ser homologas a regiones codificantes, así como no codificantes de la secuencia endógena. Las regiones reguladoras de terminación de la transcripción pueden estar provistas también en construcciones de expresión vegetal de esta invención. Las regiones de terminación de la transcripción pueden ser Í~*k.? Á.,..*, *,..£.-__-_.-.. provistas por la secuencia de ADN que codifica para la isomerasa de ácido graso polienoico o una región de terminación de la transcripción conveniente derivada de una fuente de gen diferente, por ejemplo, la región de terminación de la transcripción la cual está naturalmente asociada con la región de iniciación de la transcripción. El experto en la técnica reconocerá que cualquier región de terminación de la transcripción conveniente que sea capaz de terminar la transcripción en una célula vegetal, se puede emplear en las construcciones de la presente invención. De manera alternativa, se pueden preparar construcciones para conducir la expresión de las secuencias de PFl directamente desde el plastidio de célula vegetal hospedera. Dichas construcciones y métodos se conocen en la técnica y se describen de manera general, por ejemplo en Svab, ef al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530 y Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917 y en la patente de E.U.A. No. 5,693,507. Una célula vegetal, tejido, órgano o planta en el cual se han introducido construcciones de ADN recombinante que contienen las construcciones de expresión se considera transformado, transfectado o transgénico. Una planta o célula transgénica o transformada también incluye progenie de la célula o planta y progenie producida a partir de un programa de cruza que emplea dicha planta transgénica como una parental en una cruza y que presenta un fenotipo alterado resultado de la presencia de una secuencia de ácido nucleico de PFl.

Las construcciones de transcripción o expresión vegetal que tiene una PFl vegetal como la secuencia de ADN de interés para expresión incrementada o disminuida de la misma, se pueden emplear con una amplia variedad de vida vegetal, particularmente, vida vegetal involucrada en la producción de aceites vegetales para usos comestibles e industriales. Se prefieren de manera especial cultivos de semillas oleaginosas templados. Las plantas de interés incluyen, pero no se limitan a semilla de colza (Cañóla y variedades de ácido erúcico alto), girasol, cártamo, algodón, semilla de soya, cacahuate, aceite de palma y coco, y maíz. Dependiendo del método para introducir las construcciones recombinantes en la célula hospedera, se pueden requerir otras secuencias de ADN. De manera importante, esta invención es aplicable igualmente a especies dicotiledóneas y monocotiledóneas y será fácilmente aplicable a nuevas y/o mejoradas técnicas de transformación y regulación. De particular interés, es el uso de construcciones de PFl vegetales en plantas las cuales han sido genéticamente manipuladas para producir un ácido graso particular en el aceite de semilla vegetal, en donde TAG en las semillas de plantas no manipuladas de las especies manipuladas, no contienen naturalmente ese ácido graso particular. De esta forma, la expresión de PFl novedosa en plantas puede ser aconsejable para la incorporación de grupos acilo graso únicos en la posición sn-3. Las aplicaciones de manipulación genética de plantas adicionales para proteínas de PFl de esta invención, incluyen su uso en preparación de lípidos vegetales estructurados que contienen moléculas TAG que tienen grupos acilo graso deseables incorporados en posiciones particulares en las moléculas TAG. Se contempla que las secuencias de genes se pueden sintetizar, ya sea completamente o en parte, especialmente cuando es aconsejable proveer secuencias preferidas de plantas. Así, todo o una porción del gen estructural deseado (esa porción del gen que codifica para la proteína de PFl) puede ser sintetizado utilizando codones preferidos por un hospedero seleccionado. Los codones preferidos de hospedero se pueden determinar por ejemplo, a partir de los codones utilizados de manera más frecuente en las proteínas expresadas en una especie hospedera deseada. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que se pueden preparar y utilizar preparaciones de anticuerpos, sondas de ácido nucleico (ADN y ARN) y similares para seleccionar y recuperar PFl "homologa" o "relacionada" a partir de una variedad de fuentes vegetales. Las secuencias homologas son encontradas cuando existe una identidad de secuencia, la cual se puede determinar mediante comparación de información de secuencia, ácido nucleico o aminoácido, o a través de reacciones de hibridación entre una PFl conocida y una fuente candidata. Los cambios conservativos, tales como Glu/Asp, Val/lie, Ser/Thr, Arg/Lys y Gln/Asn también se pueden considerar en la determinación de homología de secuencia. La secuencias de aminoácidos son consideradas homologas con tan sólo 25% de identidad de secuencia entre las dos proteínas maduras completas. (Véase de manera l»tí ?' .-.í.kÁi i' 1 « * ari i. ,._, . , general, Doolittle, R.F., OF URFS y ORFS (University Science Books, CA, 1986). Así, otras PFl se pueden obtener a partir de las secuencias de PFl P tilota ejemplificadas específicas provistas en la presente. Además, será 5 evidente que se pueden obtener PFl naturales y sintéticas, incluyendo secuencias de aminoácidos modificadas y materiales de partida para formación de modelos de proteína sintética a partir de las PFl ejemplificadas y de PFl las cuales se obtienen a través del uso de dichas secuencias ejemplificadas. Las secuencias de aminoácidos modificadas incluyen 10 secuencias que han sido mutadas, truncadas, incrementadas y similares, ya sea que dichas secuencia estén parcial o completamente sintetizadas. Las secuencias que son realmente purificadas a partir de preparaciones vegetales o que son idénticas o codifican para proteínas idénticas de las mismas, sin considerar el método utilizado para obtener la proteína o secuencia, son 15 igualmente consideradas como naturalmente derivadas. Para análisis inmunológico, se pueden preparar anticuerpos para la proteína de PFl inyectando a conejos o ratones con la proteína purificada o porción de la misma, dichos métodos de preparación de anticuerpo siendo conocidos para los expertos en la técnica. Se pueden producir anticuefos 20 monoclonales o policlonales, aunque normalmente los anticuefos policlonales son más útiles para aislamiento de genes. Se puede realizar análisis Western para determinar que una proteína relacionada está presente en un extracto crudo de la especie vegetal deseada, según lo determina la * i _á¡máu mH ^^ * fe&.-,fei ._. -... - .. -*,__ . .- > . . , . ^ __> * > . n ? * Í \ \ reacción cruzada con los anticuefos para la proteína de PFl de P filicina. Cuando se observa reactividad cruzada, los genes que codifican para las proteínas relacionadas son aislados mediante selección de genotecas de expresión que representan la especie vegetal deseada. Las genotecas de expresión se pueden construir en una variedad de vectores comercialmente disponibles, que incluyen Lambda gt11 , como se describe en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Las secuencias de ácido nucleico asociadas con proteínas de PFl vegetales se pueden utilizar para una variedad de usos. Por ejemplo, se pueden preparar construcciones recombinantes las cuales se pueden emplear como sondas, o las cuales dirigirán expresión de la proteína de PFl en células hospederas para producir una rápida fuente de la enzima y/o para modificar la composición de triglicéridos encontrados en las mismas. Otras aplicaciones útiles se pueden encontrar cuando la célula hospedera es una célula hospedera vegetal, ya sea in vitro o in vivo. Por ejemplo, al expresar una proteína de PFl en una célula vegetal hospedera, se pueden producir diferentes ácidos grasos conjugados en un tejido vegetal determinado. De manera similar, para algunas aplicaciones puede ser conveniente disminuir la cantidad de PFl endógenamente expresada en una célula vegetal a través de diferentes tecnologías de supresión de genes discutidas supra. Se aprecia que las construcciones de expresión que contienen las secuencias de polinucleótido de la presente invención, encuentran uso con construcciones de expresión adicionales que tienen secuencias responsables de la alteración de ácidos grasos en una célula hospedera. Ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero no se limitan a tioesterasas, desaturasas, elongasas, KASas y similares. La modificación de composiciones de ácido graso también puede afectar la fluidez de membranas vegetales. Se han observado diferentes concentraciones de lípidos en plantas endurecidas por frío, por ejemplo. A través de esta invención, se pueden introducir rasgos los cuales proveerán tolerancia al enfriamiento. Las regiones de control reglamentario de iniciación de la transcripción constitutivas o inducibles por temperatura pueden tener aplicaciones especiales para dichos usos. Como se discutió anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para una PFl vegetal de esta invención puede incluir secuencia genómica, ADNc o ARNm. Por "codificante" significa que la secuencia corresponde a una secuencia de aminoácido particular ya sea en una orientación en sentido o antisentido. Por "extracromosomal" se refiere que la secuencia está fuera del genoma vegetal del cual está naturalmente asociada. Por "recombinante" se refiere que la secuencia contiene una modificación genéticamente manipulada a través de manipulación vía mutagénesis, enzimas de restricción y similares. Una vez que se obtiene la secuencia de ácido nucleico de PFl vegetal deseada, ésta se puede manipular en una variedad de formas. Cuando la secuencia involucra regiones flanqueantes no codificantes, las t-faj*.*^». regiones flanqueantes se pueden someter a resección, mutagénesis, etc. Así, las transiciones, transversiones, deleciones e inserciones se pueden realizar en la secuencia natural. Además, toda o parte de la secuencia puede ser sintetizada. En el gen estructural, se pueden modificar uno o más codones para proveer una secuencia de aminoácido modificada, o se pueden introducir una o más mutaciones de codón para proveer un sitio de restricción conveniente u otro propósito involucrado con construcción o expresión. El gen estructural puede ser modificado adicionalmente al emplear adaptadores sintéticos, enlazadores para introducir uno o más sitios de restricción convenientes o similares. Las secuencias de ácido nucleico o aminoácido que codifican para una PFl vegetal de esta invención, se pueden combinar con otras secuencias no nativas o heterólogas en una variedad de formas. Por secuencias heterólogas, se refiere cualquier secuencia que no se encuentre naturalmente unida a la PFl vegetal, incluyendo por ejemplo, combinaciones de secuencias de ácido nucleico de la misma planta, las cuales no se encuentran naturalmente unidas. La secuencia de ADN que codifica para una PFl vegetal de esta invención, se puede emplear junto con toda o parte de las secuencias de genes normalmente asociadas con la PFl. En sus componentes, una secuencia de ADN que codifica para PFl se combina en una construcción de ADN que tiene, en la dirección 5' a 3' de transcripción, una región de control de iniciación de la transcripción capaz de promover transcripción y traducción l*j>i.a- ?.. M3.I >< fc&a» en una célula hospedera, la secuencia de ADN que codifica para PFl vegetal y una región determinación de la transcripción y traducción. Las células hospederas potenciales incluyen células procarióticas y eucarióticas. Una célula hospedera puede ser unicelular o se puede encontrar en un organismo multicelular diferenciado o no diferenciado dependiendo del uso destinado. Las células de esta invención se pueden distinguir por tener una PFl vegetal externa a la célula de tipo silvestre presente en la misma, por ejemplo, por tener una construcción de ácido nucleico recombinante que codifica para una PFl vegetal en la misma. Los métodos utilizados para la transformación de la célula vegetal hospedera no son críticos para la presente invención. La transformación de la planta de preferencia es permanente, es decir, mediante integración de construcciones de expresión inducidas en el genoma de la planta hospedera, para que las construcciones inducidas pasen a generaciones sucesivas de las plantas. Un experto en la técnica reconocerá que en ésta existe una gran variedad de técnicas de transformación, y cada vez hay más técnicas nuevas disponibles. Se puede emplear cualquier técnica que sea adecuada para la planta hospedera objetivo, dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las construcciones se pueden introducir en una variedad de formas que incluyen, pero que no están limitadas a, un estándar de ADN, en un plásmido o en un cromosoma artificial. La introducción de las construcciones en las células vegetales objetivo se puede lograr mediante una variedad de técnicas, que incluyen, pero que no están . j «.A i ÍA__:A .* .A ¡ l . a . v Jl . limitadas a, la co-precipitación de cálcio-fosfáto-ADN, electroporación, microinyección, infección por Agrobacterium, transformación de liposomas o microproyectiles. El experto en la técnica puede referirse a la literatura para los detalles, y seleccionar las técnicas adecuadas para utilizarlas en los métodos de la presente invención. Normalmente, habrá un gen estructural incluido con la construcción de ADN, que tiene las regiones reguladoras necesarias para la expresión en un hospedero y auxiliar en la selección de las células transformantes. El gen puede ayudar en la resistencia a un agente citotóxico, por ejemplo, antibiótico, metal pesado, toxina, etc., la complementación proporciona prototrofia a un hospedero auxotrófico, inmunidad viral o similares. Dependiendo del número de diferentes especies de hospedero, se introduce la construcción de expresión o los componentes de la misma, se pueden emplear uno o más marcadores, en donde se utilicen diferentes condiciones para la selección, para los diferentes hospederos. Cuando se utiliza el Agrobacterium para una transformación de célula vegetal, se puede utilizar un vector que se pueda introducir en el hospedero Agrobacterium para la recombinación homologa con T-ADN o con el plásmido Ti- o Ri- que está presente en el hospedero Agrobacterium. El plásmido Ti- o Ri que contiene el T-ADN para la recombinación, se puede armar (capaz de causar la formación de aspereza) o desarmado (incapaz de causar la formación de aspereza), el último siendo permisible, siempre y cuando los genes vir estén presentes en el hospedero Agrobacterium transformado. El plásmido armado puede dar una mezcla de células vegetales normales y aspereza. En algunos ejemplos en donde se utiliza el Agrobacterium como el vehículo para transformar las células vegetales hospederas, la construcción de expresión o transcripción bordeada por la (las) región(es) de borde de T-ADN, será insertada en un vector de amplia escala hospedera capaz de replicarse en E. Coli y en Agrobacterium, los vectores de amplia escala hospedera están descritos en la literatura. El que se utiliza comúnmente es el pRK2 o los derivados del mismo. Para ejemplos refiérase a Ditta, ef al., (roe. Nat. Acad. Sci., U.S.A. (1980)77:7347-7351 ) y al documento EPA 0 120 515, los cuales están incorporados aquí a manera de eferencia. Alternativamente, se pueden insertar las secuencias que se van a expresar en células vegetales en un vector que contiene secuencias de replicación separadas, una de las cuales estabiliza el vector en E. Coli, y la otra en Agrobacterium. Ver, por ejemplo, McBride y Summerfeit (Plant Mol. Biol (1990) 14:269-276), en donde se utiliza el origen de replicación del pRiHRI (Jouanin, ef al. Mol. Gen. Genet. (1985) 201 :370-374) y proporciona una estabilidad agregada de los vectores de expresión vegetal en las células de Agrobacterium hospederas. Incluidos con la construcción de expresión y el T-ADN, habrá uno o más marcadores, lo cual permite la selección del Agrobacterium transformado y las células vegetales transformadas. Varios marcadores han sido desarrollados para utilizarse con células vegetales, como la resistencia al cloranfenicol, canamicina, el aminoglicósido G418, higromicina, o similares. El marcador particular que se emplea no es esencial para esta invención. El marcador preferido dependerá del hospedero en particular y de la construcción específica que se emplee para la transformación de dicho hospedero. Para la transformación de células vegetales utilizando Agrobacterium, se pueden combinar e incubar las plantas con el Agrobacterium modificado durante un tiempo suficiente para hacer posible que dicha célula vegetal sea transformada por el Agrobacterium. Entonces se matan las bacterias, y las células vegetales se cultivan en un medio selectivo apropiado. Una vez que se forma un callo, se puede estimular la formación del vastago empleando las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con los métodos conocidos, y los vastagos se transfieren a un medio de arraigo para la regeneración de las plantas. Entonces se pueden cultivar las plantas para producir semillas y las semillas se pueden utilizar para establecer generaciones repetitivas y para el aislamiento de los aceites vegetales. Hay muchas manera posibles de obtener las células vegetales de esta invención que contienen múltiples construcciones de expresión. Cualquier medio para producir una planta que comprenda una construcción que tiene una secuencia de ADN que codifica para la isomerasa de ácido graso polienoico de la presente invención, y por lo menos otra construcción que tenga otra secuencia de ADN que codifique para una enzima, están abarcadas por la presente invención. Por ejemplo, la construcción de expresión se puede utilizar para transformar una planta al mismo tiempo que la segunda construcción, ya sea por la inclusión de ambas construcciones de expresión en un solo vector de transformación, o utilizando vectores separados, cada uno de los cuales expresa los genes deseados. La segunda construcción se puede introducir en una planta que ya ha sido transformada con la construcción de expresión PFl, o de manera alternativa, plantas transformadas, una que expresa la construcción PFl y una que expresa la segunda construcción, se pueden cruzar para unir las construcciones en la misma planta.

Otras construcciones v métodos de uso La invención también se refiere a vectores que incluyen un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células hospederas que han sido transformadas genéticamente con vectores de la invención y a producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Se pueden emplear sistemas de translación libres de células para producir la proteína que utiliza ARN derivados de las construcciones de ADN de la invención Para una producción recombinante, las células hospederas se pueden modificar genéticamente para incorporar sistemas o porciones de expresión de las mismas, o los polinucleótidos de la presente invención. La introducción de un polinucleótido en una célula hospedera se puede efectuar mediante los métodos descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) y Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Dichos métodos incluyen, pero no están limitados a la transfección de fosfato de calcio, la transfección mediada por dextrano de DEAE, transfección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, introducción balística cargada por raspado e infección. Ejemplos representativos de hospederos apropiados incluyen células bacterianas, tales como las células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. Coli, estreptomices, y Bacillus subtilis, células fúngicas, como células de levadura y células de Aspergillus; células de insectos, como las células Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 y Bowes; y células vegetales como las descritas anteriormente. Se puede utilizar una variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Dichos vectores incluyen, pero no están limitados a, vectores cromosómicos, episomales, y vectores derivados de virus, por ejemplo vectores de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transpositores, epidomas de levadura, elementos de insección, elementos cromosómicos de levadura, virus como vaculovirus, virus de pavoba, como el SB40, virus de vacuna, adenovirus, virus pustular de las aves, virus de seudorabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de dichos virus, como aquellos que se derivan de elementos genéticos plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan, así como engendran expresión. Generalmente, se puede utilizar cualquier sistema o vector que sea adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un hospedero. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en una expresión elegida mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como, por ejemplo, aquellas que se describen en Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (supra). Se pueden incorporar señales de secreción apropiadas, ya sea homologas o heterólogas, en el polipéptido expresado para permitir la secreción de la proteína en el lumen del retículo endoplásmico, el espacio periplásmico o el ambiente extracelular. Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes, mediante una variedad de métodos bien conocidos, que incluyen, pero que no están limitados a, la precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxil apetita, y cromatografía de lecitina. Es más preferible utilizar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para la purificación. Se puede utilizar cualquiera de las técnicas bien conocidas para el redoblamiento de las proteínas para regenerar una confirmación activa si9 el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o la purificación. i Las combinaciones de aceite obtenidas a partir de las células hospederas que expresan la secuencias PFl de la presente invención pueden utilizarse en una variedad de aplicaciones industriales, de alimentación de animales y de nutrición humana. El aceite que se produce mediante los métodos de la presente invención, que contiene los ácidos grasos conjugados, tiene una variedad de usos. Se conocen en la técnica, por ejemplo, métodos para el uso de varios ácidos grasos conjugados, por ejemplo el ácido linoleico conjugado (CLA). Una variedad de métodos para el uso del CLA se describen en las patentes de E.U.A. 5,428,072, 5,430,066, 5,504,114, 5,554,646, 5,585,400, 5,674,901 , 5,760,082,5,760,083, 5,770,247, 5,804,210, 5,814,663, 5827,885, 5,851 ,572, 5,855,917. De esta manera, las composiciones de aceite de la presente invención que tienen un contenido alterado de ácido graso conjugado, tienen un uso en la preparación de alimentos, productos alimenticios, alimentos procesados, ingredientes para alimentos, composiciones aditivas para alimentos, o suplementos dietéticos que contienen aceites y/o grasas. Ejemplos de dichos usos incluyen, pero no están limitados a, margarinas, mantequillas, mantecas, aceites para cocinar, aceites para freir, aderesos, alimentos para untar, mayonesas, y suplementos de vitamina/minerales. Ejemplos adicionales incluyen, pero no están limitados a, cubiertas, productos lácteos como queso y queso procesado, carne procesada e imitaciones de carne, pastas, cereales, salsas, postres que incluyen postres congelados y autoestables, salsas para sumergir. Papas fritas, alimentos horneados, pastas secas, galletas, barras de bocadillo, confecciones, chocolates, bebidas, semillas no extraídas, y semillas no extraídas que han sido cultivas, trituradas, molidas, enrolladas, extruidas, laminadas, degrasadas, deshidratadas o procesadas de alguna otra manera, pero que todavía contienen los aceites, etc. Que se describen aquí. Las composiciones de aceite de la presente invención que tiene ácido graso alterado y conjugado también tienen un uso en las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de la composición de ácido graso conjugado, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden encontrar en la forma de un sólido o un líquido. Los sólidos pueden estar en forma de polvo, granulo, pastilla, tableta, un gel o un extrudado; los líquidos pueden ser soluciones o suspenciones. Ahora que la invención ha sido descrita de manera general, será más fácil entenderla haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen solamente con el propósito de ilustrar, y que no pretenden limitar la presente invención. *l -4^ «t.»< *.*& EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación de una secuencia de ácidos nucleicos de isomerasa de ácido graso polienoico A. Preparación de la genoteca de ADN complementario El ARN total de la alga marina roja Ptilota filicina fue aislado para utilizarse en la construcción de genotecas de ADN complementario (ADNc). El material fresco se cultivó en nitrógeno líquido con un mortero/triturador. Se mezclaron aproximadamente 5 g de polvo de P. fílicina con 5 ml de un amortiguador de extracción (1 % SDS, 10 mM EDTA, 0.2 M NaAC, pH 4.8) y 3 ml de fenol ácido (pH 4.3). La mezcla fue incubada a 60°C durante 30 minutos agitándola cada 5 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se le agregaron 3 ml de cloroformo. Después de agitarla la temperatura ambiente durante 10 minutos, la mezcla fue centrifugada a 5000 x g durante 30 minutos. La fase acuosa se extrajo una vez con 6 ml de fenol/cloroformo (1 :1 v/v) durante 10 minutos y después se centrifugó a 5000 x g durante 5 minutos. La capa acuosa superior fue recuperada, extraía una vez con 6 ml de cloroformo. Después de la última extracción, el ARN fue precipitado de la capa acuosa con un volumen igual de 4M LiCl en hielo durante una noche, y se centrifugó a 10000 x g durante 30 minutos. El ARN precipitado fue lavado con etanol al 70%, se secó al vacío y se disolvió en agua.

El ARN total resultante se utilizó para preparar genotecas de ADNc utilizando el sistema plásmido SuperScript para la síntesis de ADNc y el equipo de clonación de plásmidos (BRL Life-Technologies, Gaithersburg, MD). Para identificar las secuencias de ácidos nucleicos candidatos, se preparó un par de oligonucleótidos sintéticos (5'-GAYYYNGAYGAYACNATHGC-3", 5'-TGYTGNBWRTADATYTCNAC-3' (Y=CT, N=ATGC, H=ACT, B=GCT, W=AT, R=AG, D=AGT)(SEQ ID NO:5 y 6)) correspondientes a los 38 aminoácidos N-terminales y (DDFDDTIAWGAGYSGLSAAFTLVKKGYTNVEIYSQQY, SEQ ID NO:7) (Wise(1995) Biosynthesis and enzymology of conjugated polyenoic fatty acid production in macrophytic marine algae, Ph.D. Thesis State University, Corvalis, OR, UMI Dissertation Services) para utilizarlos en las reacciones PCR para amplificar las sondas para utilizarlas en el cribado de hibridización de la genoteca de ADNc del P. filicina. La amplificación de PCR incluyó un paso inicial de desnaturalización de 95°C durante 5 minutos seguido por 5 ciclos de 94°C (30 seg.) -45°C (30 seg.) -72°C (30 seg.) y 30 ciclos de (94°C (30 seg.) -52°C (30 seg.) -72°C (30 seg.). Los productos de PCR entre 70 y 150 bp fueron purificados en gel y se utilizaron como moldes para una segunda reacción de PCR. Después de la amplificación, los productos de PCR fueron clonados en pCR2.1. Utilizando el sistema de clonación TA de Invitrogen Co. Se llevaron a cabo cribados de genoteca utilizando protocolos estándar de manchado de colonia (Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (supra)). i> .*k*. afc-á m ljsfi& *.a»»--i->_*&.a * - *- v - s * * * - . ^ «* ** - ».-»« .*_«&., -^ - *^- $ ¿, s «, a ^ *fe Se identificaron dos secuencias de ADNc que se habían hibridizado en la sonda de oligonucleótidos. Estas dos secuencias de ADN, a las que se hace referencia como PFI-B2 (SEQ ID NO:1 ) y PFI-F3 (SEQ ID NO:3), contenían el vector de clonación pSPORTI (BRL Life-Technologies, Gaithersburg, MD), pCGN10100 y pCGN10101 , respectivamente. La secuencia de aminoácidos deducida para PFI-B2 (SEQ ID NO:2) y PFI-F3 (SEQ ID NO:4) también se determinaron.

EJEMPLO 2 Preparación de la construcción 2A. Construcciones de expresión bacteriana Se preparó una serie de construcciones para expresar las secuencias PFl en células hospederas. Para la expresión en E. coli, se prepararon construcciones que contenían etiquetas o a las que les faltaban dichas secuencias de etiqueta. El vector pCGN10102 se diseñó para expresar la proteína codificada por la secuencia PFI-B2 con el péptido líder nativo con una secuencia His-tag con 6 residuos C-terminales en el vector PQE-60 (Qiagen). El vector pCGN10103 es similar a pCGN10102, excepto que este contiene la secuencia que codifica para la proteína PFI-F3 con su péptido líder nativo. También se prepararon un conjunto de construcciones para expresar las secuencias PFl en E. coli sin las secuencias líderes. El vector Má*»i iluAi *.. •» .teta - . pCGN10104 contiene la secuencia PFl- B2 de pCGN10100 sin el péptido líder clonado en el vector pQE-60 con un His tag de 6 residuos en el término C de PFl. El vector pCGN10105 es similar a pCGN10104, excepto que éste contiene la secuencia que codifica para pFI-F3 de pCGN10101. Finalmente, para la expresión en E. coli, se preparó un conjunto de construcciones a las que les faltaba His tag de 6 residuos C-terminales. La construcción pCGN10106 contiene la secuencia codificadora PFI-B2 de pCGN10100 que incluye el péptido líder nativo en el vector pQE-60. El vector pCGN10107 es similar a pCGN10106, excepto que contiene la secuencia codificadora PFI-F3, incluyendo el péptido líder nativo. Para la expresión de PFl en el citoplasma de E. coli, se utilizó el sistema pQE60 de Qiagen Inc. La región de codificación PFl con y sin el péptido líder putativo, fue amplificada con PCR utilizando los iniciadores hacia adelante: 5'-CGCCATGGCTTTGAATAGAGTTCTTCAC-3' o 5'-CGCCATGGACGATTTTGATGACACGATTGC-3' (SEQ ID NO:8 Y 9), el iniciador reverso: 5'-CGAGATCTGAAGAAATCCTTGATCAAATTATCCG-3' (SEQ ID NO:10). Los sitios Ncol (subrayados) fueron introducidos en los iniciadores hacia adelante mientras que el sitio BglU (subrayado) fue introducido en el iniciador reverso. Los productos PCR fueron subclonados en pCR2.1 utilizando el sistema de clonación TA (Invitrogen Co.). Después se envió el producto resultante para secuenciación. Después de la confirmación de secuencia, se cortaron los insertos utilizando la digestión completa de BglU y la digestión parcial de ?/col seguida por la purificación en gel utilizando el i_*i sistema de purificación en gel de Qiagen Inc. Las subclonaciones de los insertos en el vector pQE60 y la expresión de las proteínas recombinantes se hicieron como lo recomienda el fabricante. Los transformantes de E. coli fueron cultivados a diferentes temperaturas a un OD600 de 0.7 a 0.8 antes de ser inducidos por ¡sopropil-b-D-tiogalactopiranosido 1 mM durante 1 a 5 horas. Después se cosecharon las células inducidas y se sometieron a lisis por sonicación, seguida por pruebas enzimáticas. La expresión plásmica del PFl se llevó a cabo fusionando el péptido líder de fosfotasa alcalina (PhoA) de E. coli PFl sin su péptido líder nativo. La región de codificación de la proteína de fusión fue diseñada para ser accionada por el promotor nativo del gen de fosfotasa alcalina (phoA) de E. coli. Se designaron tres iniciadores: PPF, 5' AAGCTTTGGAGATTATCGTC-3'(SEQ ID NO:11 ), se derivó de la secuencia de corriente arriba del promotor de phoA; PPM, 5'-TCGTGTCATC AA TCATGGGCTTTTGTCACAGGGGTAA-3'(SEQ ID NO: 12), contenía la secuencia de codificación parcial del péptido líder PhoA (subrayado) y la región de codificación parcial de PFl sin el péptido líder; y EPR, 5'- GCAGGATCCGTATCGAGCTC T GATT CG-3' (SEQ ID NO: 13), se derivó de la secuencia de corriente debajo de la región de codificación PFl del clon ADNc. Para hacer la construcción de fusión, se llevaron a cabo dos reacciones de PCR. La primera reacción de PCR se hizo utilizando iniciadores PPF apareados con PPM y ADN genómico K-12 de E. coli, como molde. La segunda reacción de PCR se llevó a cabo utilizando iniciadores PPF y EPR.

Los moldes para la segunda reacción de PCR se generaron mezclando 1 ml del primer producto de PCR, y 1 ml de ADN de plásmido diluido 1 :50 del clon de ADNc de PFl. El producto final de PCR fue clonado en pCR2.1 utilizando el sistema de clonación Topo-TA (Invitrogen Co.) y el inserto se verificó mediante la secuenciación de ambas sepas. Los transformantes de E. coli fueron cultivados en un medio ECLB a 37°C a una fase estacionaria temprana y subsecuentemente se cosecharon para un análisis de proteínas por centrifugado. Construcciones de expresión vegetal se preparó una serie de construcciones para la expresión de las secuencias de codificación PFl en células vegetales hospederas. Las construcciones se preparan para dirigir la expresión de las secuencias de codificación PFl de manera constitutiva, así como preferencialmente, en forma particular, los tejidos vegetales. Un plásmido que contiene el cassette napin derivado de pCGN3223 (se describe en el documento USPN5, 639,790, que se incorpora aquí por completo a manera de referencia) fue modificado para hacerlo más útil para clonar los fragmentos grandes de ADN que contienen múltiples sitios de restricción, y para permitir la clonación de múltiples genes de fusión napin en vectores vegetales de transformación binarios. Un adaptador comprendía el oligonucleótido autoanelado de la secuencia CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGACAGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATT TAAAT (SEQ ID NO: 14), fue ligado en el vector de clonación pBCSK+ (estratagen) después de la digestión con endonucleasa de restricción BssHIl al vector de construcción pCGN7765. Los plásmidos pCGN3223 y pCGN7765 fueron digeridos con Notl y se ligaron juntos. El vector resultante, pCGN7770, contiene la estructura principal con el cassette madre de expresión específica napin de pCGN3223. El cassette de clonación, pCGN7787, tenía esencialmente los mismos elementos reguladores que pCGN7770, con la excepción de las regiones reguladoras napin de pCGN7770 que han sido remplazadas con el promotor doble CAMV 35S y la región de poliadenilación tml y de determinación transcripcional. Un vector binario para la transformación vegetal, pCGN5139, fue construido a partir de pCGN1558 (McBride y Summmerfeít, (1990) Plant Molecular Biology, 14:269-276). El lígador múltiple de pCGN1558 fue reemplazado como un fragmento de Hindlll/Asp718 con un ligador múltiple que contenía sitios únicos de endonucleasa de restricción, Ascl, Pací, Xbal, SwaI, BamHl, y Notl. Los sitios de endonucleasa de restricción Asp 718 y Hindlll están retenidos en pCGN5139. Una serie de vectores turbo binarios fueron construidos para permitir la clonación rápida de secuencias de ADN en vectores binarios que contenían regiones de iniciación transcripcional (promotores) y regiones de terminación transcripcional. El plásmido pCGN8618 fue construido ligando los oligonucleótidos 5'-TCGAGGATCCGACGGCCGCAAGCTTCCTGACAGG-3' (SEQ ID NO:15) y 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO:16) en el pCGN7770 doblemente digerido Sall/Xhol. Un fragmento que contenía el promotor napin, el ligador múltiple y la región 3' napin fue separado de pCGN8618 mediante digestión con Asp7181 ; al fragmento se le achataron los extremos llenándolo en las salientes 5' con el fragmento de Klenow, después se ligo en pCGN5139 que había sido digerido con Asp7181 y Hindlll y se le achataron los extremos llenándolo en las salientes 5' con el fragmento de Klenow. Un plásmido que contenía el inserto orientado de tal manera que el promotor napin estuviera más cerca del sitio Asp7181 achatado de pCGN5139 y el extremo 3' napin estuviera más cerca del sitio Hindlll achatado. Subsecuentemente, estas regiones fueron sometidas a análisis de secuencia para confirmar la orientación del inserto y la integridad de las uniones de clonación. El plásmido resultante fue designado como pCGN8622. El plásmido pCGN8619 se construyó ligando los oligonucleótidos 5' TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO; 17) y 5' y 5' TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 18) en el pCGN7770 doblemente digerido con Sall/Xhol un fragmento que contenía el promotor napin, el ligador múltiple y la región 3' napin fue removido de pCGN8619 por digestión, con Asp7181 ; al fragmento se le achataron los extremos llenándolo en las salientes 5' con el fragmento de Klenow, después se ligo en pCGN5139 que había sido digerido con Asp7181 y Hindlll, se le achataron los extremos llenándolo en la salientes 5' con el fragmento de Klenow. Un plásmido que contenía el inserto orientado para que el promotor ? 3. . ^__ .» ?- t íi napin estuviera más cerca del sitio Asp7181 achatado de pCGN5139 y el extremo 3' napin estuviera más cerca del sitio Hindlll achatado, fue sometido a análisis de secuencias para confirmar la orientación del inserto y la integridad de las uniones de clonación. El plásmido resultante fue designado como 5 pCGN8623. El plásmido pCGN8620 fue construido ligando los oligonucleótidos 5'- TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTCCTGCAGGAGCT-3' (SEQ ID NO:19) y 5'- CCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO:20) 10 en pCGN7787 doblemente digerido con Sal l/Sacl. Un fragmento que contenía el promotor d35S, el ligador múltiple y la región 3' tml fue removido de pCGN8620 mediante la digestión completa con Asp7181 y la digestión parcial con Notl. Al fragmento se le achataron los extremos llenándolo en las salientes 5' con el fragmento Klenow, después se ligó en pCGN5139 que 15 había sido digerido con Asp718l y Hindlll, y se le achataron los extremos llenándolo en las salientes 5' con el fragmento Klenow. Un plásmido que contenía el inserto orientado para que el promotor d35S estuviera más cerca del sitio Asp7181 achatado de pCGN5139 y el extremo 3' tml estuviera más cerca del sitio Hindlll achatado, fue sometido a análisis de secuencia para 20 confirmar la orientación del inserto y la integridad de las uniones de clonación. Al plásmido resultante se le designó como pCGN8624. El plásmido pCGN8621 fue construido ligando los oligonucleótidos 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAGCT- 3' (SEQ ID NO:21 ) Y 5'- GGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO:22) en pCGN7787 doblemente digerido con Sal l/Sacl. Un fragmento que contenía el promotor d35S, el ligador múltiple y la región 3' tml fue removido de pCGN8621 mediante la digestión completa con Asp7181 y la digestión parcial con Notl. Al fragmento se le achataron los extremos llenándolo en las salientes 5' con el fragmento Klenow después se ligó en pCGN5139, que había sido digerido con Asp718l y Hindlll y se le achataron los extremos llenándolo en las salientes 5' con el fragmento Klenow. Un plásmido que contenía el inserto orientado de manera que el promotor d35S estuviera más cerca del sitio Asp718l achatado de pCGN5139 y el término 3' tml estuviera más cerca del sitio Hindlll achatado, fue sometido a análisis de secuencia para confirmar la orientación del inserto y la integridad de las uniones de clonación. Al plásmido resultante se le designo como pCGN8625. Para clonar en las construcciones de expresión vegetal, las regiones que codifican para PFl con o sin el péptido líder putativo fueron amplificadas por PCR utilizando iniciadores hacia delante, PLF1 5'-GGATCCGCGGCCGCATGTCTTTGAATAGAGTTCTTC-3' (con el péptido líder) (SEQ ID NO:23) Y PLF2 5'- GGATCCGCGGCCGCATGGATTTTGATGACACGATTGC-3' (sin el péptido líder) (SEQ ID NO:24), y el iniciador reverso PLR 5'-CCTGCAGGAAGCTTCTAGAAGA AATCCT TGATC-3'(SEQ ID NO:25). Los sitios ?/ofl (subrayados) fueron colocados corriente arriba de los codones iniciadores (en negritas) en los iniciadores PLF1 y PLF2, mientras que el sitio vás Psfl (subrayado) fue colocado corriente abajo del codón de detención (en negritas) en PLR. Los productos de PCR primero fueron clonados en pCR2.1 (Invitrogen) y la presencia de los insertos que poseían la secuencia correcta fue verificada por la secuenciación de ambas cepas. Dos construcciones que empleaban la secuencia de codificación PFI-B2 fueron preparadas en el vector pCGN8622 para la expresión a partir del promotor napin. El vector pCGN10108 contiene la secuencia de codificación PFI-B2 que contiene la secuencia líder nativa. El vector pCGN10109 contiene la secuencia de codificación PFI-B2 que no tiene la secuencia líder nativa. Dos construcciones que emplean la secuencia de codificación PFI-B2 fueron preparadas en el vector pCGN8624 para expresión desde el promotor 35S. El vector pCGN10110 contiene la secuencia de codificación PFI-B2, que contiene la secuencia líder nativa. El vector pCGN10111 contiene la secuencia de codificación PFI-B2 a la que le falta la secuencia líder nativa. Dos construcciones que emplean la secuencia de codificación PFI-F3 fueron preparadas en el vector pCGN8622 para la expresión a partir del promotor napin. El vector pCGN10112 contiene la secuencia de codificación PFI-F3 que contiene la secuencia líder nativa. El vector pCGN10113 contiene la secuencia de codificación PFI-F3 que no tiene la secuencia líder nativa. Una sola construcción que emplea la secuencia codificadora PFI-F3 se preparó en el vector pCGN8624 para la expresión a partir del promotor 1*1 J. _&_¿_b r* . . i ré._ ¿_? 35S. El vector pCGN10114 contiene la secuencia de codificación PFI-B2 que contiene la secuencia líder nativa.

EJEMPLO 3 Transformación y análisis de la célula hospedera Para expresar la proteína PFl en E.coli, se hicieron construcciones utilizando el sistema QIAexpressionist (Qiagen). La transformación y la inducción de las células M15 se realizaron de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Se realizó la preparación y la transformación de una célula competente de levadura, utilizando el equipo de transformación de levadura Frozen-EZ (Zymo Research). El vector de expresión que se empleo fue pYES2 (Invitrogen) y la cepa de levadura seleccionada fue INVd (Invitrogen). Se han desarrollado una variedad de métodos para insertar una secuencia de ADN de interés adentro del genoma de una planta hospedera para obtener la transcripción y la translación de la secuencia para efectuar cambios fenotípicos. Se obtuvieron plantas Brassica transgénicas obtenidas por transformación mediada por Agrobacterium, como lo describen Radke et al. (Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (1992) 11 :499-505). Las plantas Arabidopsis thaliana transgénicas se pueden obtener por transformación mediada por Agrobacterium como lo describen Valverkens et as ;•* ¿- -j al., (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540), o como lo describe Bent et al. ((1994), Science 265:1856-1860), o Bechtold et al. ((1993), C.R.Acad.Sci, Life Sciences 316:1194-1199). Otras especies de plantas se pueden transformar de manera similar utilizando técnicas relacionadas. Alternativamente, también se pueden utilizar métodos de bombardeo con microproyectiles, tales como los que describen et al. (Bio/Technology 10:286-291 ) para obtener plantas transformadas nuclearmente. La proteína expresada PFl, así como la proteína PFl de P. Filicina, de tipo silvestre, fue evaluada como se describió aquí. La actividad enzimática fue evaluada como lo describe Wise ((1995) PhD Thesis, supra) con algunas modificaciones. Preparación del extractó crudo de proteína de Ptilota filicina: se cultivó tejido congelado en un mortero/triturador con nitrógeno líquido. Se mezclaron aproximadamente 200 mg de polvo del tejido con 1 ml de amortiguador de extracción (100 mM NaH2PO4, 5 mM EGTA, 5 mM DTT, y 5 mM MgCl2, pH6.5) y se homogeneizo con un homogenizador. El homogenado fue centrifugado en microfuga a 14 k rpm durante 5 minutos y el sobrenadante fue recogido para las pruebas enzimáticas. Se utilizaron métodos similares para la preparación del extracto crudo de proteína a partir del material transgénico (E. coli, levadura, Schizochitrium, y Arabidopsis): los materiales de prueba fueron descompuestos y homogeneizados en el regulador de extracción y fueron centrifugados en microfuga. El sobrenadante se utilizó para la prueba de enzimas.

El sobrenadante recogido fue analizado para la actividad de PFl de la siguiente manera. Se mezcló aproximadamente 20 ml de extracto crudo de proteína con 300 ml del amortiguador de reacción (100 mM NaH2PO4, pH7.2 con 0.02% Tween 20) y el espectrofotómetro (DU650, Beckman) fue vaciado. La reacción se inició añadiendo 2 ml de la solución de substrato almacenada y se midió la formación de ácido graso conjugado mediante análisis de longitud de honda entre 200nm y 300nm. Específicamente, se midió la formación de trieno y dieno conjugado mediante el monitoreo de absorbancia a 278nm y 234nm, respectivamente. La solución de substrato almacenada fue preparada agregando ácidos grasos poliinsaturados libres en etanol a 95% a una concentración final de 25 mg/ml. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación, indican el nivel de experiencia de los expertos en la técnica a los cuales está dirigida esta invención. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente se incoforan aquí a manera de referencia, en la misma extensión como si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera específica e individualmente indicada para incorporarse como referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalla por medio de la ilustración y ejemplo, con propósitos de claridad y de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. .. ??ÍÁ LISTADO DE SECUENCIAS <110> Zheng, Wei Yuan, Ling Metz, James G. <120>SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN ISOMERASA DE ACIDO GRASO POLIENOICO Y USOS DE LAS MISMAS <130>MTC6711 <140> <141> <150> 60/146,458 <151> 1999-07-30 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 211> 1507 <212>ADN <213> Ptilota filicina <400> 1 cgcaaaatgt ctttgaatag agttcttcac attttcctta tcgcatatct cgcatgcact 60 gccctaaccc atgattttga tgacacgatt gccgttgtgg gagctggcta ctctggactg 120 agcgctgctt ttactctcgt caagaaaggg tacaccaacg ttgagattta cgaatcccag 180 ggcgaagttg gggggtatgt ctactctgtt gactataaca acgtcgcgca tgacctggcc 240 acgtacgctc tgactcctgc atactggaaa ttccaggagg ccatgaaaag tatcggcgtt 300 gggttttgtg agctcgatgt tgcaattgtg caaacgaatt ctacgcctgt ctcagtcccg 360 ttcgagaaat ggatggccgc ctactgggct gcgaaagtcc caaacccact caacctcgtg 420 aggaaggtct cgactcaagt ttcgacgtac gttgaagttt ggaagaagct cttcaatatg 480 gacttcattg acacgagcac gaagcgcact aatcgcctct ttccgttgaa gaccaacgac 540 gtcgacgtcc ttgcccaatt ttcaatgccc atgaaagatt ttgttgcatt gcataagctg 600 gacttgctcg agcctctttt tatccaggca accgactccc aggcgtacgg tccgtatgac 660 acgacaccgg cactctacta catggtgtgg ttccctccga accttttcaa cggtgaggaa 720 aataccgttc catgtggtac gtataactcg atgcagtcca tggccgagca catggccgaa 780 tggttgaaga gcaaaggagt cacgttccac atgaatacga aggtgacgaa aatctctcgc 840 gccaccgatg gatctagtcc atccctcttg gaagaaggtg tagctacgcc gaagctcttc 900 gacaccataa tcagtacgaa caagctgccg tctgcgaacc gtgccgaagt tgtgacacct 960 ctgcttccga aggagcggga ggccgccgat acgtacgagg agctacaaat gttctctgct 1020 cttctcgaga cgaatcgcag cgatgccatt ccgacgacag gcttcttgat ggtggatgcg 1080 gacgcaatta tagctcacga ccctaacacc gggttttggg gttgtttgaa tgctgagcgt 1140 cgcggaggct attcggatga gaatgctatt ctaagctcgg atactgtgac gcgcgtcagc 1200 gccatctact actatacaga gcgtgcaaac aacgaacgca tcgacttttc tctcgacgag 1260 aagattcagc aggtgaagac caatcttgcg acgtgggact cggctacctg gaccaatcta 1320 acctcccgta cgttcggtgg atatttccag aggtggagga cgccggatgt tatgggtcaa 1380 aagccgtgga atctggctga cattcaagga gaaggagatg tgtactacgt caactcggct 1440 gcatgcgggt tcgagtccgt cggccacgtt ttcgattgcg cggataattt gatcaaggat 1500 tttttct 1507 <210> 2 <211> 500 <212> PRT <213> Ptilota filicina <400> 2 Met Ser Leu Asn Arg Val Leu His He Phe Leu He Ala Tyr Leu Ala 1 5 10 15- Cys Thr Ala Leu Thr His Asp Phe Asp Asp Thr He Ala Val Val Gly 20 25 30 Ala Gly Tyr Ser Gly Leu Ser Ala Ala Phe Thr Leu Val Lys Lys Gly 35 40 45 Tyr Thr Asn Val Glu He Tyr Glu Ser Gln Gly Glu Val Gly Gly Tyr 50 55 60 Íti. _.:A> i..J_.

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240 acaatttcac acagaaacag ctatgaccat gattacgcca agetetaata cgactcacta 300 tagggaaagc tggtacgcct gcaggtaccg gtccggaatt cccgggtcga cccacgcgtc 360 cgcaaaatgt ctttgaatag agttcttcac attttcctta tegeatatet cgcatgcact 420 gccctaaccc atgattttga tgacaegatt gccgttgtgg gagctggcta ctctggactg 480 agcgctgctt ttactctcgt caag'aaaggg tacaccaacg ttgagattta cgaatcccag 540 ggcgaagttg gggggtatgt ctactctgtt gactataaca acgtcgcgca tgacctggcc 600 acgtacgctc tgactcctgc atactggaaa ttccaggagg ccatgaaaag tatcggcgtt 660 gggttttgtg agetegatgt tgcaattgtg caaaegaatt ctacgcctgt ctcagtcccg 720 ttcgagaaat ggatggccgc ctactgggct gcgaaagtcc caaacccact caacctcgtg 780 aggaaggtct cgactcaagt ttcgacgtac gttgaagttt ggaagaaget cttcaatatg 840 gacttcattg acacgagcac gaagcgcact aatcgcctct ttccgttgaa gaccaacgac 900 gtcgacgtcc ttgeccaatt ttcaatgccc atgaaagatt ttgttgcatt gcataagctg 960 gacttgctcg agcctctttt tatccaggca accgactccc aggcgtacgg tccgtatgac 1020 acgacaccgg cactctacta catggtgtgg ttccctccga accttttcaa cggtgaggaa 1080 aataccgttc catgtggtac gtataactcg atgcagtcca tggccgagca catggccgaa 1 140 tggttgaaga gcaaaggagt cacgttccac atgaatacga aggtgacgaa aatctctcgc 1200 gccaccgatg gatetagtec atccctcttg gaagaaggtg tagctacgcc gaagetette 1260 gacaccataa tcagtacgaa caagctgccg tctgcgaacc gtgccgaagt tgtgacacct 1320 ctgcttccga aggagcggga ggccgccgat acgtacgagg agctacaaat gttctctgct 1380 ettetegaga cgaatcgcag egatgecatt ccgacgacag gcttcttgat ggtggatgcg 1440 gacgcaatta tagetcaega ccctaacacc gggttttggg gttgtttgaa tgctgagcgt 1500 cgcggaggct attcggatga gaatgetatt etaagetegg atactgtgac gcgcgtcagc 1560 gccatctact actatacaga gcgtgcaaac aacgaacgca tcgacttttc tctcgacgag 1620 aagattcagc aggtgaagac caatcttgcg aacgtgggac tcggctacct gaccaatcta 1680 acctcccgta cgttcggtgg atatttccag aggtggagga cgccggatgt tatgggtcaa 1740 aagccgtgga atctggctga cattcaagga gaaggagatg tgtactacgt caactcggct 1800 gcatgcgggt tcgagtccgt cggccacgtt ttcgattgcg cggataattt gatcaaggat 1860 tttttctaga taaacacaac agaagtagac tgccgtcaaa gtctggttac ctcatggaaa 1920 <210> 27 <211> 1860 <212> ADN <213> Ptyas mucosus <400> 27 gcgcgttggc cgattcatta atcagctggc acgacaggtt tcccgcgaaa acggccatgg 60 agcgcaacgc aattaatgta agttagctca ctcattaggc accccaggct tttacacttt 120 atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 180 agctatgacc atgattacgc caagctctaa tacgactcac tatagggaaa gctggtacgc 240 ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg tccgctctcg cagaaaagct 300 gcatttccct cttctctcaa aatgtctttg aatagagttc ttcacatttc ccttatcgca 360 tatctcgcat gcactgccct aacccatgat tttgatgaca cgattgccgt tgtgggagct 420 ggctactctg gactgagcgc tgcttttact ctcgtcaaga aagggtacac caacgttgag 480 atttacgaat cccagggcga agttgggggg tatgtctact ctgttgacta taacaacgtc 540 gcgcatgacc tggccacgta cgctctgact cctgcatact ggaaattcca ggaggccatg 600 aaaagtatcg gcgttgggtt ttgtgagctc gatgttgcaa ttgtgcaaac gaattctacg 660 cctgtctcag tcccgttcga gaaatggatg gccgcctact gggctgcgaa agtcccaaac 720 ccactcaacc tcgtgaggaa ggtctcgact caagtttcga cgtacgttga agtttggaag 780 aagctcttca atatggactt cattgacacg agcacgaagc gcactaatcg cctctttccg 840 ttgaagacca acgacgtcga cgtccttgcc caattttcaa tgcccatgaa agattttgtt 900 gcattgcata agctggactt gctcgagcct ctttttatcc aggcaaccga ctcccaggcg 960 tacggtccgt atgacacgac accggcactc tactacatgg tgtggttccc tccgaacctt 1020 ttcaacggtg aggaaaatac cgttccatgt ggtacgtata actcgatgca gtccatggcc 1080 gagcacatgg ccgaatggtt gaagagcaag gagtcacgtt ccacatgaat tacgaaggtg 1140 acgaaaatct ctcgcgccac cgatggatct agtccatccc tcttggaaga aggtgtagct 1200 acgccgaagc tcttcgacac cataatcagt acgaacaagc tgccgtctgc gaaccgtgcc 1260 gaagttgtga cacctctgct tccgaaggag cgggaggcca ccaatacgta cgaggagcta 1320 caaatgttct ctgctcttct cgagacgaat cgcagcgatg ccattccgac gacaggcttc 1380 ttgatggtgg atgcggacgc aattatagct cacgaccctg acaccgggtt ttggggttgt 1440 ttgaatgctg agcgtcgcgg aggctattcg gatgagaatg ctattctaag ctcggatact 1500 gtgacgcgcg tcagcgccat ctactactat acagagcgtg caaacaacga acgcatcgac 1560 ttttctctcg acgagaagat tcagcaggtg aagaccaatc ttgcgacgtg ggactcggct 1620 acctggacca atctaacttc ccgtacgttc ggtggatatt tccagaggtg gaggacgccg 1680 gatgttatgg gtcaaaagcc gtggaatctg gctgacattc aaggagaagg agatgtgtac 1740 tacgtcaacg cggctgcatg cgggttcgag tccgtcggcc acgtttcgat ttgcgcggat 1800 aatttgatca aggatttctt ctagataaac acaacagaag tagactgcgc ccaaagtctg 1860 . Á&i

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Una secuencia de ADN aislada que codifica para una enzima activa en la formación de ácidos grasos conjugados a partir de substratos de acilo de graso polienoico. 2.- La secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ácido 10 graso nucleico codifica para isomerasa de ácido graso polienoico. 3.- La secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico se aisla a partir de una fuente de células eucarióticas. 4.- La secuencia de ADN aislada de conformidad con la 15 reivindicación 3, caracterizada además porque dicha fuente de células eucarióticas se selecciona del grupo que consiste en células fúngicas y células vegetales. 5.- La secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha secuencia de ADN es 20 Ptilota filicina. 6.- La secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha proteína isomerasa de ácido graso polienoico es codificada por una secuencia que incluye una l'-^_t_ÉÍ__ÍÍ_ll_tt Íl¡MÍ_ÉÍÍ^ í ?? t -_.¡»..¿.,_>á«i, . ,, <_a»«- « f ',--- .¿I . _. . , . - »».._... .»-»_ ,"»».,. . .._»_. 8. . . _ » ... . .... AMt. fe ??.? . itti secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 1 y 3. 7.- Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. 8.- Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. 9.- Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO:2; b) un polinucleótido aislado que comprende SEQ ID NO: 1 ; c) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad con la de SEQ ID NO:1 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:1 ; d) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad con la de SEQ ID NO:1 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:1 ; e) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad con la de SEQ ID NO:1 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:1 ; f) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad con la de SEQ ID NO:1 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:1 ; g) un polinucleótido aislado que hibridiza, bajo condiciones rigurosas, a SEQ ID NO:1 o un fragmento de la misma; y h) un polinucleótido aislado «"«*»-*- complementario a la secuencia de polinucleótidos de (a), (b), (c), (d), (e), (f), o (g). 10.- Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO:4; b) un polinucleótido aislado que comprende SEQ ID NO: 3; c) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad con la de SEQ ID NO:3 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:3; d) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad con la de SEQ ID NO:3 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:3; e) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 90% de identidad con la de SEQ ID NO:3 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:3; f) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad con la de SEQ ID NO:3 sobre toda la longitud de SEQ ID NO:3; g) un polinucleótido aislado que hibridiza, bajo condiciones rigurosas, a SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma; y h) un polinucleótido aislado complementario a la secuencia de polinucleótidos de (a), (b), (c), (d), (e), (f), o (g). 11.- Una construcción de ácido nucleico que comprende, cuando está ligada operativamente a los componentes en la dirección 5' a 3' de transcripción: una región de iniciación transcripcional; y una secuencia de polinucleótidos que codifica para una enzima activa en la formación de ácidos grasos conjugados a partir de substratos de acilo graso polienoico. 12.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha enzima es ¡somerasa de ácido graso polienoico. 13.- Una célula hospedera que comprende una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 11. 14.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha célula hospedera se selecciona del grupo que consiste en células bacterianas, de insectos, fúngicas, de mamífero y vegetales. 15.- Un organismo no humano transformado con la construcción de la reivindicación 11 ó 12. 16.- El organismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho organismo se selecciona del grupo que consiste de organismo bacteriano, de insecto, fúngico, de mamífero y vegetal. 17.- El organismo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho organismo es un vegetal. 18.- Un método para producir una célula hospedera recombinante, caracterizado porque comprende: transformar o transfectar una célula con una construcción de ácido nucleico, que comprende una región de iniciación transcripcional y una secuencia de polinucleótidos que codifica para una enzima activa en la formación de ácidos grasos conjugados a partir de - «S' y5'"*; substratos de acilo grado polienoico, de tal manera que dicha célula hospedera, bajo condiciones de cultivo apropiadas, produce una proteína isomerasa de ácido graso polienoico. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha célula hospedera se selecciona del grupo que consiste en células vegetales, células bacterianas, células de levadura, y células de algas. 20.- Un organismo no humano transformado mediante el método de la reivindicación 18 ó 19. 21.- El organismo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho organismo se selecciona del grupo que consiste de bacterias, levadura, algas y vegetales. 22.- El organismo de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho organismo es un vegetal. 23.- Un método para producir una célula hospedera recombinante, caracterizado porque comprende: transformar o transfectar una célula con una construcción de ácido nucleico, que comprende una región de iniciación transcripcional y una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 y un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10, de manera que dicha célula hospedera, bajo condiciones apropiadas de cultivo, produce una proteína isomerasa de ácido graso polienoico. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha secuencia de polinucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 1. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha célula hospedera es una célula vegetal. 26.- Un organismo no humano transformado de acuerdo con el método de la reivindicación 23 ó 24. 27.- El organismo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el organismo es un vegetal. 28.- Un método para modificar la composición de ácido graso en una célula hospedera, dicho método comprende: transformar una célula hospedera con una construcción de ácido nucleico, que comprende una región de iniciación transcripcional y una secuencia de polinucleótidos que codifica para una enzima activa en la formación de ácidos grasos conjugados a partir de substratos de acilo graso polienoico, de manera que dicha célula hospedera, bajo condiciones de cultivo apropiadas, produce una proteína isomerasa de ácido graso polienoico. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicha producción de una ¡somerasa de ácido graso polienoico produce un incremento de ácidos grasos conjugados en dicha célula hospedera. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicha secuencia de polinucleótidos está en una orientación seleccionada del grupo que consiste en orientación de sentido y orientación de antisentido. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicha célula hospedera se selecciona del grupo que consiste en una célula vegetal, una célula bacteriana, y una célula fúngica. 32.- Un organismo no humano transformado mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30. 33.- El organismo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque dicho organismo se selecciona del grupo que consiste de vegetal, bacterias y hongos. 34.- El organismo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho organismo es un vegetal.