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MXPA02000960A - Compuestos terapeuticos que contienen agentes para union a los anti-receptores fc. - Google Patents

Compuestos terapeuticos que contienen agentes para union a los anti-receptores fc.

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Publication number
MXPA02000960A
MXPA02000960A MXPA02000960A MXPA02000960A MXPA02000960A MX PA02000960 A MXPA02000960 A MX PA02000960A MX PA02000960 A MXPA02000960 A MX PA02000960A MX PA02000960 A MXPA02000960 A MX PA02000960A MX PA02000960 A MXPA02000960 A MX PA02000960A
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MX
Mexico
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cells
receptor
antibody
cell
Prior art date
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MXPA02000960A
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Inventor
Goldstein Joel
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Medarex Inc
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Abstract

Se describen moleculas multiespecificas que inducen muerte mediada por celulas efectoras de celulas blanco. Las moleculas son "multiespecificas" porque se unen a multiples (dos o mas) objetivos distintos, uno de los cuales es un receptor de Fc sobre la superficie de una celula inmune. Las moleculas multiespecificas de la invencion incluyen moleculas compuestas de cuando menos una porcion que se une a un receptor de Fc, como puede ser un receptor de Fc? (por ejemplo Fc?RI) o un receptor de Fc?, y cuando menos otra porcion que se une a un objetivo diferente, como puede ser un antigeno o una celula de tumor o un patogeno. Las moleculas multiespecificas de la invencion tambien incluyen "complejos multimeros" del antigeno compuestos de multiples (es decir dos o mas) porciones que se unen a una molecula sobre una celula presentadora de antigeno (APC), como puede ser un receptor de Fc, ligadas a uno o mas antigenos. Estos complejos multimeros se dirigen a los antigenos, como pueden ser los auto-antigenos, a las APC para inducir y/o mejorar la internalizacion (endocitosis), el procesamiento y/o presentacion del antigeno por parte de la APC. Por tanto, estas moleculas pueden utilizarse para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria in vivo o in vitro contra una proteina normalmente no inmunogenica, como puede ser un antigeno propio. En una modalidad particular, cuando menos una porcion de las moleculas multiespecificas comprende un anticuerpo humanizado o humano o fragmento de anticuerpo (por ejemplo ScFv o Fab') que se une a un receptor de Fc o a un receptor sobre una celula objetivo (por ejemplo EGF-R o HER2).

Description

COMPUESTOS TERAPÉUTICOS QUE CONTIENEN AGENTES PARA UNION A LOS ANTI-RECEPTORES FC Solicitudes relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de la serie de los Estados Unidos No. 09/364,088, presentada el 30 de julio de 1999, la cual es una continuación en parte de la serie de los Estados unidos 09/188,082 presentada el 6 de noviembre de 1998, la cual es una continuación en parte de la serie de los Estados Unidos No. 08/661,052 presentada el 7 de junio de 1996, ahora publicada como la Patente Estadounidense No. 5,837,243 que es una continuación en parte de la 08/484,172 titulada "Compuestos Terapéuticos que Contienen Anticuerpos Anti-Receptor FC" presentada el 7 de junio de 1995. El contenido total de cada una de las solicitudes antes mencionadas y todas las referencias, patentes publicadas y solicitudes de patente publicadas mencionadas en la presente se incorporan por este medio como referencia.
Antecedentes de la invención Las inmunoglobulinas (las Ig) están compuestas de dos cadenas pesadas y dos ligeras, cada una de las cuales contiene un dominio variable que se une al antígeno NH2 terminal y un dominio constante COOH terminal responsables de las funciones efectoras de los anticuerpos. Los dominios COOH terminal de las cadenas pesadas del Ig forman la región Fc y están involucradas en la actuación de las actividades celulares mediante la interacción con los receptores específicos conocidos como receptores de Fc (los FcR) . Los receptores de Fc para todas las clases de Ig, o isotipos (por ejemplo, IgG (Fc?R), IgE (FceR) , IgA (FcaR) , IgM (FcµR) e IgD (FcdR) han sido identificados. Las diferentes actividades biológicas de los anticuerpos de diferentes isotipos se basan en parte en su capacidad para unirse a los diferentes FcR expresados en distintas células inmunes (efectoras) (Fridman, W. H. (sept. 1991) The FASEB Journal Vol. 5. 2684-2690). Ya han sido preparados los anticuerpos murinos que se dirigen contra los FcR (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,954,617 titulada An ticuerpos Monoclonales Para Receptores Fc Para Inmunoglobulina G en Fagoci tos Mononucleares Humanos y la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No.
WO 91/05871 titulada Anticuerpos Monoclonales Específicos Para el Receptor IgA) .
Los anticuerpos monoclonales murinos pueden ser útiles como terápicos humanos y pueden producirse libres de contaminación mediante patógenos humanos como el virus de hepatitis o el de inmunodeficiencia humana. No obstante, el uso de los anticuerpos monoclonales murinos en algunos tratamientos humanos ha dado origen al desarrollo de una respuesta inmune a las proteínas murinas "ajenas". Esta respuesta ha sido denominada un anticuerpos anti-ratón humano o respuesta HAMA (Schroff, R. y col., (1985), Cáncer Res., 45, 879-885) y es una condición que causa enfermedad sérica en humanos y origina el aclaramiento rápido de los anticuerpos murinos de la circulación de un individuo. Se ha demostrado respuesta inmune en humanos contra las regiones variable y la constante de las inmunoglobulinas murinas.
Es posible utilizar la tecnología del DNA recombinante para alterar anticuerpos, por ejemplo, mediante la sustitución de las regiones de inmunoglobulina específica de una especie con regiones de inmunoglobulina de otra especie. Neuberger y col., (Solicitud de Patente del PCT No. PCT/GB85/00392) describe un proceso mediante el cual los dominios variables de la cadena pesada y ligera complementarios de una molécula Ig de una especie puede combinarse con los dominios constantes de la cadena pesada y ligera complementarios de la Ig de otra especie. Este proceso puede utilizarse para sustituir los dominios de la región constante murina para crear un anticuerpo "quimérico" que pueda utilizarse para tratamiento humano. Un anticuerpo quimérico producido como esta descrito por Neuberger y col., tiene una región Fc humana para estimulación eficaz de las funciones efectoras mediadas por los anticuerpos, como puede ser la fijación de complemento, pero todavía tiene el potencial para elucidar una respuesta inmunitaria en humanos contra las regiones variables murinas ("ajenas") .
Winter (Solicitud de Patente Británica No. GB 2188538A) describe un proceso para alterar anticuerpos sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) con las de otra especie. Este proceso puede utilizarse para sustituir las CDR de los dominios de la región variable murina de un anticuerpo monoclonal con propiedades de unión deseables (por ejemplo a un patógeno humano) en los dominios de la región variable Ig de la cadena pesada y ligera humana.
Estas regiones variables Ig alteradas pueden entonces combinarse con las regiones constantes Ig humanas para crear anticuerpos que sean totalmente humanos en su composición salvo por las CDR murinas sustituidas. Los anticuerpos "reformados" o "humanizados" descritos por Winter elucidan una respuesta inmunitaria considerablemente reducida en humanos en comparación con los anticuerpos quiméricos debido a los componentes considerablemente menos murinos. Además, la vida media de los anticuerpos alterados en la circulación debe aproximarse a la de los anticuerpos humanos naturales. No obstante, como lo menciona Winter, la simple sustitución de las CDR con las CDR complementarias de otro anticuerpo que sea específico para un antígeno como puede ser una proteína viral o bacteriana, no siempre conduce a un anticuerpo alterado que conserve la capacidad de unión deseada. En la práctica, algunos aminoácidos en el entramado de la región variable del anticuerpo interactúan con los residuos de aminoácidos que constituyen las CDR de modo que las sustituciones de los aminoácidos en las regiones variables Ig humanas son probablemente necesarias para restablecer la unión al antígeno.
Las moléculas biespecíficas, (por ejemplo, los heteroanticuerpos) que comprenden una porción antireceptor de Fc y una porción anti-objetivo han sido formuladas y se utilizan en tratamiento, por ejemplo, para tratar cáncer (por ejemplo de mama u ovario) o infecciones patogénicas (por ejemplo, VIH) (véase, por ejemplo, la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 91/05871 titulada Heteroanticuerpos Biespecifícos con Doble Función Efectora ; y la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 91/00360 titulada Reactivos Biespecíficos Para Tra tamien to de SIDA) . Además, las moléculas biespecíficas, que reconocen los antígenos y células presentadoras de antígenos pueden ser administrados a un individuo para estimular una respuesta inmunitaria (véase, por ejemplo, la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 92/05793 titulada Inmunoesti ulación Dirigida con Reactivos Biespecíficos) .
Compendio de la invención La presente invención proporciona moléculas multiespecíficas recombinantes y sintetizada por medios químicos que se dirigen a las células inmunes. Las moléculas son "multiespecíficas" porque se unen a múltiples (dos o más) objetivos distintos, uno de los cuales es una molécula sobre la superficie de una célula inmune, como puede ser una célula efectora y/o una célula presentadora de antígeno (APC) . Los objetivos células inmune preferidos incluyen receptores de Fc, particularmente FcdRI y FcaR.
En una modalidad, las moléculas multiespecíficas de la invención incluyen moléculas compuestas de cuando menos una porción que se une a una molécula sobre una célula efectora, como puede ser un receptor de Fc, y cuando menos una porción (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más porciones) que se une a un objetivo diferente, como puede ser un antígeno o una célula tumoral o un patógeno. Por tanto, estas moléculas pueden utilizarse para inducir la eliminación de un objetivo mediada por células efectoras. En una modalidad preferida, las moléculas multiespecíficas compuestas de anticuerpos humanos o humanizados (o fragmentos de anticuerpos) como especificidades de unión.
En otra modalidad, las moléculas multiespecíficas de la invención incluyen "complejos multímeros" antígeno compuestos de múltiples (es decir, dos o más) porciones que se unen a una molécula sobre una célula presentadora de antígeno (APC) , como puede ser un receptor de Fc, ligada a uno o más antígenos. Estos complejos multiméricos dirigen los antígenos, como pueden ser los auto-antígenos, a las APC para inducir y/o mejorar la internalización (endocitosis) , el procesamiento y/o presentación del antígeno por la APC. Por tanto, estas moléculas pueden utilizarse para inducir o mejorar una respuesta inmune ín vivo o in vi tro contra una proteína normalmente no inmunogénica, como puede ser un auto-antígeno.
En otro aspecto, la invención caracteriza moléculas multiespecíficas que normalmente comprenden una porción anti-receptor de Fc, una porción anti-objetivo y opcionalmente una tercera porción dirigida contra un tercer objetivo. Esta tercera porción, también mencionada en la presente como una porción "anti-factor de mejoramiento" (anti-EF) , puede ser por ejemplo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un ligando para el receptor celular. En una modalidad preferida, las moléculas multiespecíficas comprenden anticuerpos humanos o humanizados (o fragmentos de anticuerpos) como especificidades de unión.
En otro aspecto, la invención incorpora los métodos para generar moléculas multiespecíficas. En una modalidad, ambas especificidades son codificadas en el mismo vector y se expresan y ensamblan en una célula hospedera, por ejemplo, como moléculas biespecíficas o proteínas de fusión. En otra modalidad, cada especificidad de unión es generada por separado (por ejemplo, en forma recombinante) y luego se conjuga químicamente a otra por, por ejemplo, enlaces sulfhidrilo de las regiones bisagra C terminales de la cadena pesada en el caso de anticuerpos.
En todavía otro aspecto, la invención incorpora moléculas multiespecíficas, también conocidas en la presente como "complejos antígeno multímero" que comprenden dos o más especificidades de unión ligadas a cuando menos un antígeno. Las especificidades de unión se unen a un componente sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno, como puede ser un receptor de Fc, el cual es capaz de mediar la internalización del complejo molecular cuando se une mediante las especificidades de unión. En una modalidad preferida, el complejo molecular comprende tres o más especificidades de unión, y cuando menos una de las especificidades de unión es específica para un receptor de Fc (por ejemplo Fc?RI o FcaR) . En una modalidad particularmente preferida, el antígeno es no inmunogénico cuando se administra en forma no acomplejada.
La invención también incorpora los métodos para inducir o mejorar una respuesta inmune contra un antígeno en un individuo, administrando al individuo un complejo antígeno multímero de la invención. La invención además incluye los métodos para inmunizar un individuo, mediante la administración al individuo de un complejo antígeno multímero de la invención.
Las moléculas multiespecíficas de la invención también pueden utilizarse en múltiples inmunoterapias con base en su posibilidad para causar muerte mediada por células efectoras o células objetivo. En una modalidad particular, las moléculas multiespecíficas pueden utilizarse para matar o inhibir el crecimiento de una variedad de células tumorales.
Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de una porción de una región bisagra de un anticuerpo Fc?RI humanizado, H22, [A] que fue alterada para producir una versión truncada, de un solo sulfhidrilo, [B] y luego alterada además para manipular dos sitios de clonación únicos [C] . Los nucleótidos subrayados indican cambios de la secuencia anterior. Los nucleótidos sobre lineados son las secuencias de reconocimiento para los sitios de restricción indicados.
La Figura 2 es una presentación esquemática de una construcción cadena pesada-expresión por fusión EGF pJG055.
La Figura 3 es una representación esquemática de la generación de las moléculas biespecíficas anti-receptor de Fc-ligando.
La Figura 4 es una representación esquemática del ensayo de citometría de flujo utilizado para probar la actividad del receptor de Fc? humanizado-proteína de fusión factor de crecimiento epidérmico.
La Figura 5 es una gráfica, la cual representa la Intensidad de Fluorescencia Promedio (MFI), un indicio de la unión de diferentes concentraciones de la proteína de fusión factor de crecimiento epidérmico (EGF) (fusión H22-EGF) y el H447 (BsAb) biespecífico completamente humanizado a las células 1483 que expresan el receptor EGF (EGFR) .
La Figura 6 es una gráfica, la cual representa la unión de diferentes concentraciones de la proteína de fusión EGF o el BsAb H447 a las células A431 en presencia y ausencia de anticuerpos murinos M425, los cuales se unen a EGFR.
La Figura 7 es una gráfica que representa la citotoxicidad dependiente de los anticuerpos (ADCC) resultante de la unión de diversas concentraciones de la proteína de fusión EGF, BsAb H447 o el anticuerpo H425 a las células A431.
La Figura 8 es una gráfica de barras que representa la ADCC resultante de la unión de la proteína de fusión EGF, BsAb H447 o el anticuerpo H425 en presencia de medio solo, medio conteniendo 25% de suero humano (HS) o medio conteniendo un fragmento Fab del anticuerpo receptor de Fc? m22.
La Figura 9 es un diagrama esquemático representando el número de células A 431 viables cultivadas en presencia de diferentes cantidades de EGF, H22-EGF, el fragmento Fab de H22 (H22 Fab), o el fragmento F(ab')2 de H425 (H425 F(ab' )2) .
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión H22Fd-HRG.
La Figura 11 es un histograma indicando el porcentaje de la muerte de células tumorales PC-3 o SKBr-3 específica resultante de la incubación de estas células son monocitos tratados con interferón gamma y una dilución 1:3 o 1:30 del sobrenadante proveniente de células de mieloma expresando una proteína de fusión H22-heregulina.
La Figura 12 es un diagrama que indica el porcentaje de lisis de células tumorales PC-3 en presencia de monocitos y en presencia de diferentes concentraciones de proteína de fusión H22-bombesina .
La Figura 13 es una representación esquemática del ensayo citométrico de flujo utilizado para probar la actividad de BsAb 447 generado por el método o-PDM o en DTNB.
La figura 14 es una gráfica que representa la MFI de diferentes concentraciones de BsAb 447 provenientes de o-PDM y DTNB para EGFR y células A431 que expresan Fc?RI .
La Figura 15 es una gráfica que representa la citotoxicidad dependiente de anticuerpos resultante de la unión de BsAb 447 provenientes de o-PDM y DTNB para células A431.
La Figura 16 es un diagrama de flujo que representa la construcción de anticuerpos triespecífieos.
La Figura 17 representa la transformación de un anticuerpo biespecífico, bivalente en un anticuerpo trivalente, biespecífico. El conjugado bivalente, biespecífico se reduce y mezcla con Fab' 520C9 tratado con o-PDM originando el TsAb.
La Figura 18 representa un ensayo de clasificación de células activadas por fluorescencia, bifuncionales para HER2/neu (sección A) y EGFR (sección B) .
La Figura 19 es una gráfica que representa la unión de diferentes concentraciones del anticuerpo, BsAb o TsAb, a las células objetivo. La Intensidad de la Fluorescencia Promedio (MFI) aumenta conforme se incrementa la unión del Ab. Se muestra que la unión de TsAb a HER2/neu sobre las células SKBr-3 y Fc?RI soluble simultáneamente en un modo dependiente de la dosis.
La Figura 20 es una gráfica que muestra la unión de TsAb tanto a EGFR en las células A431 como a Fc?RI soluble simultáneamente en un modo dependiente de la dosis. El ensayo es semejante al que se utiliza en la Figura 19.
La Figura 21 es una gráfica que muestra que TsAb, M22x H425x 520C9, y los BsAb, M232x 520C9 fueron capaces de inducir ADCC de las células SKBr-3, no así los BsAb, M22x H425. Las diferentes concentraciones de los anticuerpos fueron incubadas con células SKBr-3 y PMN preactivados .
La Figura 22 es una gráfica que muestra que los TsAb, M22x H425x 520C9, y los BsAb, M22x H425 fueron capaces de inducir ADCC de células A431 pero los BsAb, M22x 520C9, no la indujeron. El ensayo se realizó en un modo similar al ensayo de la Figura 21.
La Figura 23 es un diagrama de flujo para un ensayo de modulación en sangre completa (sección A) y los resultados del ensayo (sección B) . El anticuerpo trivalente rápidamente modula el Fc?RI de la superficie de los monocitos.
La Figura 24, sección A, muestra la secuencia de aminoácidos de los oligonucleótidos que codifica los péptidos de la toxina tetánica tipo nativo (TT830) y mutante (TT833) . La sección B es un diagrama de una proteína de fusión H22Fd-TT.
La Figura 25 secciones A, B, y C representan los resultados del análisis por citometría de flujo que muestran la unión de MDXH210, Fab22-TT830 y H22-TT833S a las células U937 positivas para Fc?RI, respectivamente. Las líneas discontinuas representan los controles negativos, las líneas continuas definen la tinción con las proteínas de fusión y las líneas punteadas representan la unión de la proteína de fusión bloqueada por mAb 22 F(ab') murino.
La Figura 26 es un diagrama esquemático mostrando la intensidad de fluorescencia promedio resultante de la incubación de diversas cantidades de proteínas de fusión MDXH210, Fab22-TT830 y Fab22-TT833S a células U937 positivas para Fc?RI .
La Figura 27 es una representación gráfica de la proliferación de células T incubadas con monocitos irradiados y diferentes concentraciones de TT830, Fab22-TT830, TT o TT947, mostrando que la proteína de fusión Fab22-TT830 mejora la presentación del epítope Th aproximadamente 1000 veces en comparación con TT830.
La Figura 28 representa un histograma que muestra la proliferación de las células T incubadas con TT830 a una concentración 1000 nM o Fab22-TT830 a 10 nM y monocitos, preincubados o no con cantidades saturantes de mAb22 F(ab')2 antes de la adición de las células T y del antígeno.
La Figura 29 representa un histograma mostrando la proliferación de las células T incubadas con monocitos y Fab22-TT830 a 5 nM o TT830 a 1000 nM en ausencia (control) o presencia de IgG.
La Figura 30, secciones A y B, son representaciones gráficas mostrando la concentración de IFN-? (sección A) y de IL-4 (sección B) en el sobrenadante de células T cultivadas durante dos días con monocitos y diferentes concentraciones de TT830 o Fab22-TT830.
La Figura 31 es una representación gráfica de la proliferación de las células T incubadas con monocitos y diferentes concentraciones de TT833S, Fab22-TT833S o TT830.
La Figura 32 es una representación gráfica de la proliferación de las células T incubadas durante dos días con TT830 y monocitos, preincubadas durante la noche con diferentes concentraciones de TT833S.
La Figura 33 es una representación gráfica del porcentaje de inhibición de la proliferación de células T incubadas durante dos días con TT830 y monocitos, preincubadas durante la noche con diferentes concentraciones de TT833S o Fab22-TT833S .
La Figura 34 es un histograma que representa la proliferación de las células T incubadas durante dos días con monocitos, los cuales primero fueron incubados con TT830 durante 4 horas (pre-pulso) y luego incubados durante la noche con TT833S 10 µM o Fab22-TT833S 0.1 µM (Chase) antes de la adición de las células T.
La Figura 35 es un histograma que representa la concentración de interferón gamma (IFN-?) y IL-4 en el sobrenadante de células T cultivadas con monocitos y TT830, Fab22-TT830, T833S y Fab22-TT833S .
La Figura 36 es una representación gráfica de la proliferación de células T estimuladas durante un día con monocitos en medio solo, con TT833S o con Fab22-TT833S y luego reestimuladas con monocitos y diferentes concentraciones de TT830 durante dos días, indicando que TT833S y Fab22-TT833S no conducen a la anergia de las células T.
La Figura 37 es una representación gráfica de dos construcciones de expresión que codifican moléculas biespecíficas monocatenarias teniendo una especificidad de unión para un Fc?RI (H22) y una especificidad de unión para un antígeno carcinoembriónico (CEA) (construcciones 321 adn 323) y una construcción de expresión que codifica un anticuerpo monocatenario teniendo una especificidad de unión para un Fc?RI . Las regiones codificantes están bajo el control del promotor CMV (CMV Pr) . Además de las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de los anticuerpos, las proteínas codificadas por estas construcciones se fusionan a un péptido proveniente de c-myc (c-myc) y a un péptido hexa-histidina (H-6) .
La Figura 38 muestra un histograma que indica el nivel de unión de las moléculas biespecíficas monocatenarias H22-anti-CEA codificadas por las construcciones de expresión 321 (321-A5 y 321-B4) y 323 (323-B2 y 323-C4) y el anticuerpo monocatenario H22 codificado por la construcción 225 (225-C2) según se midió por ELISA biespecífico.
La Figura 39 muestra la secuencia del ácido nucleico del anticuerpo anti-Fc?RI humanizado, monocatenario y la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico.
La Figura 40 muestra la secuencia del ácido nucleico de la molécula biespecífica monocatenaria teniendo una especificidad de unión para el Fc?RI y una especificidad de unión para el CEA y la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico.
La Figura 41 es una representación esquemática de la formación de complejos multiméricos constituidos de múltiples fragmentos Fab' ligados a un antígeno.
La Figura 42 (a) es un gel SDS-PAGE no reductor mostrando un multímero M22 F(ab')2 purificado (franja 1) y un complejo multimérico M22 Fab' ligado químicamente (franja 2). La Figura 42 (b) es una gráfica que muestra que la incubación con M22 F(ab')3+ causa hasta 50% de reducción en la expresión CD64 sobre las superficies de macrofagos en un modo dependiente de la dosis.
La Figura 43 (a) muestra que títulos elevados de anticuerpo específico de M22 se generaron en todos los ratones transgénicos CD64 inmunizados tres veces, en comparación con sus compañeros de carnada no transgénicos. La Figura 43 (b) muestra que la inmunización de ratones transgénicos Fc?RI (CD64) con tan poco como 0.25 mg de un complejo multimérico todavía da origen a una respuesta inmune detectable.
Las Figuras 44 (a) y 44 (b) son gráficas que muestran la respuesta inmune de ratones transgénicos Fc?RI (CD64) y no transgénicos según se consideró por los títulos de anti-520C9 y anti-M22. Los ratones fueron inmunizados con un fragmento Fab' de un anticuerpo murino, 520C9, acoplado a un complejo multimérico M22.
La Figura 45 (a) muestra un mapa de un vector de expresión que codifica un complejo multimérico genéticamente ligado conteniendo dos regiones H22 sFv ligadas a una región M32.2 sFv ligada a un antígeno (complejo H22(2x)-32.2 antígeno). La Figura 45 (b) es un dibujo del complejo multimérico resultante.
La Figura 46 es una gráfica de barras mostrando la capacidad de los complejos multiméricos M22 Fab x M22 Fab x M32 y H22sFv-H22sFv-32.2sFv-gp75 para unirse a Fc?RI con eficiencia e inducir internalización.
La Figura 47 (a) muestra un mapa de un vector de expresión que codifica un complejo multimérico genéticamente ligado conteniendo dos regiones H22 sFv ligadas entre sí a un antígeno (complejo multimérico H22 (2x) -antígeno) . La Figura 47 (b) es un dibujo de un complejo multimérico resultante.
La Figura 48 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de competición de unión utilizando H22 Fab' , el multímero H22sFv2-EGF y el multímero H22 Fab2. Los resultados se muestran en términos de la inhibición de la unión de un conjugado M22-ficoeritrina por estos multímeros.
~?ZCJt?» La Figura 49 (a) muestra un mapa de un vector de expresión que codifica un complejo multimérico genéticamente ligado conteniendo tres fragmentos H22sFv ligados a un antígeno (complejo multimérico H22(3x)-antígeno). La Figura 49 (b) es un dibujo de la proteína resultante.
La Figura 50 es una gráfica de barras mostrando la capacidad de un complejo multimérico H22(3x)-CEA para inducir internalización de Fc?RI en comparación con otros complejos multiméricos.
La Figura 51 es una representación esquemática de la producción de las moléculas de fusión anti-CD89 (14A8) HuMAb. Las construcciones PJZ906 (14Afd-EGF) y pJZ907 (14A8 cadena-L) fueron co-transfectadas por electroporación en células NSO, y seleccionadas en medios conteniendo G418 e higromicina. Del mismo modo se transfectó y seleccionó pJZ909 (14A8sFv-EGF) en medios conteniendo G418. Las líneas celulares que expresaban la proteína de fusión fueron subclonadas limitando la clonación por dilución.
La Figura 52 (a) es una gráfica que muestra la unión (según se midió por citometría de flujo) de la construcción de fusión 14A8Fab'-EGF a EGF-R sobre células A431. La Figura 52 (a) es una gráfica que muestra la unión de la construcción de fusión 14A8sFv-EGF a EGF-R en células A431. Las células A431 fueron teñidas con anti-IgG Fab-2 humana de cabra conjugado con ficoeritrina . El fragmento Fab-2 de 14A8 (un anticuerpo monoclonal anti-FcaRI humano, también conocido como 14.1) que no contiene EGF, se utilizó como control. La Figura 52 (c) muestra que las proteínas de fusión y EGF obtenido en el comercio compiten para unirse a células A431 con un conjugado EGF-FITC (7 nM) .
La Figura 53 (a) es una gráfica que muestra la unión (según se midió por citometría de flujo) de la construcción de fusión 14A8Fab'-EGF a células U937. La proteína de fusión unida a las células U937 fue teñida con anti-IgG Fab-2 humano de cabra conjugado con ficoeritrina. El fragmento Fab-2 del mAb humanizado H415, que es específico para EGF-R, se utilizó como control. La Figura 53 (b) muestra la unión de la construcción de fusión 14A8sFv-EGF a las células U937. El experimento se realizó en la misma forma como en la Figura 53 (a) , excepto que diversas concentraciones de 14A8sFv-EGF fueron ensayadas para su capacidad para inhibir la unión del 14A8Fab'-EGF (23nM) . Se utilizó como control la proteína de fusión H22 sFv-EGF. El mAb H22 se une a CD64 (Fc?RI), un receptor de Fc diferente sobre las células U937.
La Figura 54 es una gráfica que muestra la citotoxicidad mediada por las proteínas de fusión, dependiente de la dosis, de células A431. Los ensayos de liberación de cromo fueron realizados con un periodo de incubación de 16-18 horas y utilizando una proporción efector a objetivo (para monocitos y PMN) de 100:1. Las células efectoras incluyeron monocitos frescos (Figura 5 (a) ) , los PMN (Figura 54 (b) ) y sangre completa (Figura 54 (c) ) . Se utilizó como control el fragmento Fab-2 de 14A8.
La Figura 55 es una gráfica de barras que compara los resultados en las Figuras 54 (a) -(c).
La Figura 56 (a) es una gráfica de barras que muestra que la citotoxicidad mediada por la proteína de fusión 14A8 Fab' -EGF (1 µg/mL) de las células A431 se inhibe por el fragmento Fab-2 de 14A8. La Figura 56 (b) es una gráfica de barras mostrando que la citotoxicidad mediada por la proteína de fusión 14A8sFv-EGF (1 µg/mL) de las células A431 también es inhibida por el fragmento Fab-2 de 14A8 (40 µg/mL) .
La Figura 57 es una representación esquemática de moléculas de fusión monocatenarias biespecíficas, 931 y 934, y sus HuMAb precursores. Las regiones de la cadena ligera y pesada variables de 14.1 y 3F2 se utilizaron para generar las construcciones 931 y 934 (w/EGF) .
La Figura 58 es una representación esquemática de una molécula biespecífica químicamente conjugada, constituida de los fragmentos Fab' de 14.1 y 3F2 (anti-HER2 ) , utilizadas como control positivo.
La Figura 59 (a) es un gráfica de barras mostrando los ensayos de detección (unión) para las proteínas de fusión 931 y 934 expresadas en sobrenadantes de transfectoma según se midió por análisis de citometría de flujo. El sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) fue incubado con líneas de células tumorales SKBr-3 ó A431. La unión de la proteína de fusión fue detectada tiñendo con anti-IgG Fab-2 humano de cabra conjugado a ficoeritrina .
La Figura 59 (b) es una gráfica de barras mostrando el análisis ADCC para las proteínas de fusión 931 y 934.
Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y una proporción del efector (monocitos, PMN) al objetivo (SKBr-3, A431) de 100:1, La muerte de las células tumorales fue detectada utilizando sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) para mediar lisis específica.
La Figura 60 (a) es una gráfica que muestra la unión (según se midió por citometría de flujo) de las proteínas de fusión monocatenarias 931 y 934 a células U937. Un fragmento Fab' de 425, un mAb U937 anti-EGF que no se une a células U937, se utilizó como control negativo. La molécula biespecífica químicamente ligada (14.1 x 3F2) mostrada en la Figura 58 se utilizó como control positivo. La Figura 60 (a) [sic] es una gráfica que muestra la unión (medida por citometría de flujo) de las proteínas de fusión monocatenarias 931 y 934 a las células SKBr-3. Se utilizó como control negativo 14.1 Fab-2. La molécula biespecífica químicamente ligada (14.1 x 3F2) mostrada en la Figura 58 nuevamente se utilizó como control positivo.
La Figura 61 es una gráfica que muestra la unión (medida por citometría de flujo) de la proteína de fusión monocatenaria 934 a las células A431. Este experimento se realizó en la misma forma como se muestra en la Figura 60, excepto que fueron utilizadas células tumorales A431 que sobre-expresan el EGF-R. Una proteína de fusión consistente en el fragmento sFv de 14.1 fusionado a EGF se utilizó como control positivo, y como control positivo 14.1 Fab-2.
La Figura 62 es una gráfica que muestra citotoxicidad mediada por PMN (células efectoras) de células tumorales SKBr-3 (Figura 62 (a) ) y BT474 (Figura 62 (b) ) por la proteína de fusión monocatenaria 931. Se realizaron los ensayos de liberación de cromo con un periodo de incubación de 16-18 horas y una proporción efector a objetivo de 100:1. Se utilizó como control negativo 14.1 Fab-2 en cada experimento.
La Figura 63 es una gráfica que muestra citotoxicidad mediada por monocitos (células efectoras) de células tumorales SKBr-3 (Figura 62 (a) ) y BT474 (Figura 62 (b) ) por la proteína de fusión monocatenaria proteína 931. Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y una proporción del efector al objetivo de 100:1. Se utilizó como control negativo 14.1 Fab-2 en cada experimento.
La Figura 64 es una gráfica que representa la citólisis dependiente de anticuerpos de células tumorales SKBr-3 y BT474 por células polimorfonucleares, mediada por una molécula biespecífica anti-HER2/neu x anti-CD89 humana (14.1 x 3.F2), según se midió por liberación de La Figura 65 es una gráfica que representa la citólisis dependiente de anticuerpos de las células tumorales SKBr-3 y BT474 por monocitos, mediada por una molécula biespecífica anti-HER2/neu x anti-CD89 humana (14.1 x 3. F2 ) , según se midió por liberación de 51Cr.
La Figura 66 es una gráfica que representa la citólisis dependiente de los anticuerpos de células tumorales BT474 por sangre completa, mediada por una molécula biespecífica anti-HER2/neu x anti-CD89 humana (14.1 x 3. F2 ) , según se midió por liberación de 51Cr.
Descripción detallada Moléculas mul tiespecíficas La presente invención se refiere a las moléculas multiespecíficas recombinantes y sintetizadas químicamente que se orientan a las células inmunes. Las moléculas son "multiespecíficas" porque se unen a múltiples (dos o más) objetivos distintos, uno de los cuales es una molécula sobre la superficie de una célula inmune. En una modalidad, las moléculas multiespecíficas de la invención incluyen moléculas compuestas de cuando menos una porción que se une a una molécula sobre una célula efectora, de preferencia un receptor de Fc, y cuando menos una porción (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más porciones) que se unen a un objetivo distinto, como puede ser un antígeno sobre una célula tumoral o un patógeno. En otra modalidad, las moléculas multiespecíficas de la invención incluyen "complejos multiméricos" antígeno compuestos de múltiples (es decir, dos o más) porciones que se unen a una molécula sobre una célula presentadora de antígeno (APC) , como puede ser un receptor de Fc, ligada a uno o más antígenos. Estos complejos multiméricos orientan los antígenos, como pueden ser los auto-antígenos, a las APC para inducir y/o mejorar la internalización (endocitosis), procesamiento y/o presentación del antígeno por la APC. Por tanto, estas moléculas pueden ser utilizadas para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria in vivo o in vi tro contra una proteína normalmente no inmunogénica, como puede ser un auto-antígeno.
En las modalidades particularmente preferidas, las moléculas multiespecíficas de la invención incluyen anticuerpos humanos o humanizados (quiméricos) o fragmentos de anticuerpos que se unen a un receptor de Fc, por lo regular FcdR (por ejemplo, FcdRI) o FcaR. Las moléculas multiespecíficas además incluyen uno o más especificidades de unión, como puede ser un ligando y/u otro anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo, que se una a un antígeno sobre una células objetivo distinta (por ejemplo una célula tumoral) . Tales moléculas multiespecíficas pueden estar químicamente ligadas o genéticamente expresadas como proteínas de fusión. Más aún, debido a que estas células efectoras objetivo, por ejemplo, a través de FcdRI o FcaR, estas pueden utilizarse para inducir la muerte de las células objetivo (por ejemplo, tumorales) mediada por células efectoras (por ejemplo PMN, macrofagos y monocitos) o, si están ligadas a un antígeno, pueden utilizarse para mejorar la presentación del antígeno por parte de las células efectoras presentadoras de antígeno (AP) (por ejemplo las células dendríticas) .
Cuando se utiliza en la presente para describir las moléculas multiespecíficas de la presente invención, el término una "porción que se une a" se utiliza de manera indistinta con el término una "especificidad de unión para". Ambos términos se refieren a regiones de las moléculas multiespecíficas que se unen a un epítope objetivo. Como se describe con detalle más adelante, estas porciones o especificidades de unión incluyen cualquier compuesto capaz de unirse a un epítope objetivo que incluye, pero no se limita a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv monocatenario) y miméticos de estos (por ejemplo miméticos peptídicos, químicos y orgánicos que "mimetizan" la unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) . Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos adecuados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales murinos, humanizados (quiméricos) , monocatenarios, y humanos y fragmentos de estos. En una modalidad particular, las especificidades de unión incluyen uno o más anticuerpos seleccionados de H22 (depósito ATCC No. CRL 11177), M22 (depósito ATCC No.
HB12147), M32.2 (depósito ATCC No. HB 9469) y fragmentos de unión al antígeno de estos, cada uno de los cuales se une a Fc?RI (CD64). El anticuerpo humanizado H22, y su equivalente murino, M22, proporcionan la ventaja de unirse a Fc?RI fuera del sitio de unión del ligando natural (IgG) y, así, no son bloqueados ni compiten por el ligando endógeno, cuando se administran in vivo . En otras modalidades particulares, las especificidades de unión incluyen uno o más anticuerpos seleccionados del anticuerpo monoclonal humano 14.1 que se une a FcaR (CD89) y el anticuerpo monoclonal humano 3. F2 que se une a HER2.
El término "porción que se une al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción del anticuerpo") , cuando se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, un receptor de Fc) . Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción que se une al antígeno" de un anticuerpo incluye: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd consistente en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Na ture 341: 544-546), que consiste en un . _. _. __,__. » . . . ¡. .. .. .. ... . i, i .___¿ájfa¿l»Mit dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, estos pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permita formarse como una sola cadena proteínica en la cual las regiones VL y VH se apareen para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase por ejemplo Bird y col., (1988) Science 242 423-426; y Huston y col, (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 8_5: 5879-5883) . Tales anticuerpos monocatenarios también están propuestos para estar comprendidos dentro del término "porción que se une al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando las técnicas habituales conocidas para el trabajador experto, y se detecta la utilidad de los fragmentos en la misma forma como se hace con los anticuerpos intactos.
I. Moléculas multiespecíficas que comprenden antígeno complejos multiméricos que se dirigen a las células presentadoras de antígeno (APC) Los complejos antígeno multímero de la invención incluyen múltiples porciones o especificidades de unión que se dirigen a un componente sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno (componente de la superficie celular de las APC) , ligadas a uno o más antígenos. Las múltiples especificidades de unión pueden unirse al mismo o diferentes epítopes sobre el componente de la superficie celular de las APC, o a diferentes componentes de la superficie celular de las APC. En una modalidad preferida, el complejo multimérico incluye cuando menos tres especificidades de unión sobre el componente de la superficie celular de las APC, o a diferentes componentes de la superficie celular de las APC. En una modalidad preferida, el complejo multimérico incluye cuando menos tres especificidades de unión para el (los) componte (s) de la superficie celular de las APC. Los componentes convenientes sobre las APC para la orientación incluye aquellos que, cuando se unen mediante la especificidad de unión, median su internalización, de modo que el antígeno ligado a la especificidad de unión se internaliza eficientemente y es presentado por la PC.
Cuando se utiliza en el presente, el término "célula presentadora de antígeno" o "APC" se refiere a una célula inmune capaz de internalizar y procesar un antígeno, de modo que se presentan determinantes antigénicos en la superficie de la célula como complejos MHC, en un modo capaz de ser reconocido por el sistema inmunológico (por ejemplo, los linfocitos T cooperadores restringidos por MHC clase II) . Las dos propiedades necesarias que permiten a una célula funcionar como una APC son la capacidad para procesar antígenos endocitados y la expresión de los productos génicos de MHC clase II. Las APC mejor definidas para las células T cooperadoras incluyen los fagocitos mononucleares (por ejemplo, macrofagos) , linfocitos B, células dendríticas, células de Langerhans de la piel y, en humanos, células endoteliales .
En una modalidad preferida, el componente de la superficie celular de las APC elegido por la especificidad de unión es un receptor de Fc, por lo regular FcaR. Por tanto, en una modalidad particular de la invención, el complejo multimérico incluye múltiples especificidades de unión (por ejemplo dos o más, de preferencia tres o más) que eligen epítopes diferentes sobre el Fc?RI . De otro modo, el multímero puede incluir múltiples especificidades de unión que eligen el mismo epítope en Fc?R. No obstante, también pueden ser elegidos otros componentes de la superficie celular de las APC convenientes. Tales componentes puede ser identificados, por ejemplo, inmunizando un animal (por ejemplo ratones transgénicos para Fc?RI humano) con las APC y determinando los componentes de la superficie celular unidos mediante sueros tomados de los animales, por ejemplo, utilizando los ensayos normales (por ejemplo el Western blot). Estos componentes de la superficie celular de las APC entonces pueden ser probados por su capacidad para internalizar un compuesto que se una al componente.
Por consiguiente, en una modalidad, el complejo multimérico incluye cuando menos un anticuerpo o fragmento de este (por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv monocatenario) que se una a un receptor de Fc, como puede ser un receptor de IgG humana, por ejemplo, un receptor de Fc-gamma (Fc?R), como puede ser FcaRI (CD64), Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) . Un receptor de Fc? preferido es el receptor de Fc? de alta afinidad, Fc?RI . No obstante, también pueden ser elegidos otros receptores de Fc, como pueden ser los receptores de IgA humana (por ejemplo FcaRI). El receptor de Fc, esta ubicado sobre la superficie de una célula APC, por ejemplo, un monocito o macrofago. En una modalidad particular, el complejo multimérico se une a un receptor de Fc en un sitio que sea distinto del sitio de unión de la inmunoglobulina (por ejemplo, IgG o IgA) del receptor. Por tanto, la unión del complejo multimérico no se bloquea por las concentraciones físicas de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos monoclonales anti-Fc?R humanizados, preferidos están descritos en la Solicitud del PCT WO 94/10332 y la Patente Estadounidense No. 4,954,617, las enseñanzas de las cuales se incorporan completamente en la presente como referencia) .
Como se describe en los ejemplos de la presente, los anticuerpos anti-Fc?RI monoclonales humanizados y murinos particulares y fragmentos de anticuerpos convenientes para uso en los complejos antígeno multímero de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos humanizados H22 (ATCC depósito No. CRL 11177), su contraparte murina, M22 (ATCC depósito No. HB12147), y M32.2 murino (ATCC depósito No. HB 9469) así como fragmentos que se unen al antígeno de estos anticuerpos.
Los complejos multiméricos de la invención que se dirigen a las APC además incluyen uno o más antígenos. El término "antígeno", cuando se utiliza en la presente, se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, proteína, péptido, carbohidrato, etcétera) que sea capaz de ser reconocido por una célula inmune (es decir, que elucide una respuesta inmune, como puede ser una respuesta inmune mediada por células T) . Los antígenos incluyen . ?i?M?'ttr???ft?HÍ? "autoantígenos" que normalmente están presentes en un hospedero, y que normalmente no elucidan una respuesta inmune del hospedero (debido a que el sistema inmunitario los reconoce como "propios" y no como "extraños". En ciertos trastornos, los antígenos que normalmente no están presentes en un hospedero, y, por tanto deben elucidar una respuesta inmune por un sistema inmunitario del hospedero, no lo hacen así. En otras palabras, estos "se escapan" del reconocimiento de un sistema inmunitario del hospedero. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, ciertos antígenos de tumor y antígenos patogénicos (por ejemplo virales y bacterianos). En estos casos, puede ser deseable modificar el antígeno en un modo que induzca o mejore su reconocimiento por parte de las células inmunitarias, de modo que el antígeno o la célula/organismo que produce el antígeno sea eliminada del hospedero. En otras palabras, se modifica el antígeno para que ya no sea reconocido por las células inmunitarias como un "autoantígeno" .
Los complejos antígeno multímero de la invención pueden ser preparados por enlace químico o uno o más antígenos a múltiples (dos o más) especificidades de unión para un componente sobre una APC, como se describe en la presente, utilizando los reactivos reticuladores normales y los protocolos de conjugación bien conocidos en la técnica. De otro modo, los complejos antígeno multímero pueden ser producidos de modo recombinante como una sola proteína de fusión, como también se describe en la presente.
Por consiguiente, en todavía otra modalidad, la presente invención ofrece un ácido nucleico que codifica un complejo antígeno multímero. Por lo regular, el ácido nucleico esta ligado de manera operante, dentro de un vector de expresión, a un promotor y otras secuencias reguladoras genéticas que controlan la expresión del complejo multímero. Un ácido nucleico esta "ligado de manera operante" cuando esta colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta ligado de manera operante a una secuencia codificante si éste afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, ligado de manera operante significa que las secuencias de DNA que van a ser ligadas están contiguas y, según sea necesario, unen dos regiones codificantes de la proteína, contiguas y en el marco de lectura. Para las secuencias swith (de intercambio) , ligado de manera operante indica que las secuencias son capaces de efectuar recombinación por ¿-. «s- * ¡x& ? intercambio (switch) .
El término El término "vector", cuando se utiliza en la presente, se propone para referirse a una molécula de 5 ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", lo cual se refiere a un bucle de DNA bicatenario, circular en el cual pueden estar ligados otros segmentos de DNA. Otro tipo de vector es un vector 10 viral, en donde otros segmentos de DNA pueden estar ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de reaplicación autónoma en una célula hospedera en la que estos están introducidos (por ejemplo, los vectores bacterianos que tienen un origen de replicación 15 bacteriano y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (por ejemplo, los vectores no episomales, de mamífero) pueden estar integrados en el genoma de una célula hospedera con la introducción en la célula hospedera, y por este medio se replican junto con el 20 genoma del hospedero. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales estos están ligados de manera operante. Tales vectores se mencionan en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión") . 25 En general, los vectores de expresión de utilidad en las ^..^jiUI técnicas de DNA recombinante, suelen estar en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse de manera indistinta en vista de que el plásmido es la forma de vector que se utiliza con mayor frecuencia. No obstante, se propone que la invención incluya estas otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectivos de replicación, adenovirus y virus adeno-relacionados) , que realizan funciones equivalentes.
El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera") , cuando se utiliza en la presente se propone para referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que estos términos están propuestos para referirse no solo a la célula objetivo particular sino a la progenie de esta célula. Debido a que es posible que ocurran ciertas modificaciones en las generaciones sucesoras debido a influencias en la mutación o ambientales, de hecho, esta progenie puede no ser idéntica a la célula precursora, pero estar todavía incluida dentro del alcance del término "célula hospedera" cuando se utiliza en la presente.
Los complejos antígeno multímero de la invención pueden utilizarse para inducir o mejorar la internalización, procesamiento y presentación de un antígeno mediante una célula inmune (por ejemplo, una APC) . Por consiguiente, la presente invención además proporciona un método para inducir o mejorar una respuesta inmune contra un antígeno en un individuo administrando al individuo una cantidad eficaz de un complejo antígeno multímero. Por ejemplo, un complejo antígeno multímero puede ser administrado para inducir una respuesta inmune contra un autoantígeno (incluidos los antígenos tumorales no reconocidos por un sistema inmunitario) , o para mejorar una respuesta inmune contra un antígeno, como puede ser un antígeno tumoral o un componente de un patógeno. Como tales, los complejos antígeno multímero también pueden utilizarse como vacunas para inmunizar un hospedero.
II. Moléculas multiespecíficas que se dirigen a las células efectoras Las moléculas multiespecíficas de la invención también incluyen moléculas diseñadas para elegir células efectoras, por ejemplo, para provocar una eliminación mediada por la célula efectora de una célula objetivo, ?i^iñaÉi patógeno, alérgeno u otra entidad. Por consiguiente, la presente invención proporciona, en otro aspecto, una molécula multiespecífica compuesta de cuando menos una porción que se une a un componente sobre una célula efectora, por lo regular un receptor de Fc, y cuando menos una porción (por ejemplo dos, tres, cuatro o más porciones) que se una a un objetivo diferente, como puede ser un antígeno sobre una célula tumoral o un patógeno.
Una "célula efectora", cuando se utiliza en la presente se refiere a una célula inmune. Las células efectoras específicas expresan receptores de Fc específicos y realizan funciones inmunes específicas. Por ejemplo, los monocitos, macrofagos, neutrófilos y células dendríticas, que expresan Fc?RI y FcaR, están involucradas en la muerte específica de células objetivo y presentan antígenos a otros componentes del sistema inmunitario. Así pues, los Fc?RI y FcaR, debido a que estos están expresados en cada uno de estos tipos de células efectoras, son objetivos accionadores preferidos para uso en la invención. Más aún, la expresión de un FcR particular sobre una célula efectora puede ser regulada por factores humorales como las citokinas (citocinas). Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de Fc?RI sufre una regulación ascendente por el interferón gamma (IFN-?). Esta expresión mejorada aumenta la actividad citotóxica de las células Fc?RI contra objetivos.
Las moléculas multiespecíficas que se dirigen a las células efectoras tienen una o más especificidades de unión o porciones que se unen a un componente sobre una célula efectora, como puede ser un receptor de Fc. En una modalidad, la especificidad de unión es proporcionada por un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo Fab' o Fv monocatenario), como ya se describió en la presente. En una modalidad particular, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humano o es "humanizado" (es decir, obtenido de un anticuerpo humano, pero teniendo cuando menos una porción de una región determinante de la complementariedad (CDR) proveniente de un anticuerpo no humano, siendo la porción seleccionada para proporcionar especificidad del anticuerpo humanizado por ejemplo, para un receptor de Fc humano) . El anticuerpo humanizado tiene las CDR obtenidas de un anticuerpo no humano y las porciones restantes de la molécula anticuerpo son humanas .
El anticuerpo puede ser completo, es decir, teniendo cadenas pesadas y ligeras o cualquier fragmento de este, por ejemplo, el fragmento Fab o F(ab')2. El anticuerpo además puede ser un dímero de la cadena ligera o de la cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo de estos, como puede ser un Fv o una construcción monocatenaria como esta descrito en Ladner y col., (Patente Estadounidense No. 4,946,778, publicada el 7 de agosto de 1990), los contenidos de la cual se incorporan expresamente como referencia. El anticuerpo humanizado o fragmento puede ser cualquier anticuerpo humano capaz de retener las CDR no humanas. El anticuerpo humano preferido es derivado de las proteínas NEWM y KOL conocidas para las regiones variables de la cadena pesada (VH) y REÍ para las regiones variables de la cadena kappa de la Ig (VK) .
La porción de la CDR no humana insertada en el anticuerpo humano se selecciona para que sea suficiente para permitir la unión del anticuerpo humanizado al receptor de Fc. Es posible seleccionar una porción suficiente insertando una porción de la CDR en el anticuerpo humano y probando la capacidad de unión del anticuerpo humanizado creado utilizando el ensayo de inmunoabsorción de enzimas ligadas (ELISA) .
Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden ser sustituidas con cuando menos una porción de una CDR no humana o solo algunas de las CDR pueden ser sustituidas con CDR no humanas. Solo es necesario sustituir el número de las CDR necesario para la unión del anticuerpo humanizado al receptor de Fc . Una CDR no humana derivada de un anticuerpo monoclonal murino (mab) , mab 22, esta descrita en la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/10332, el contenido de la cual se incorpora en la completamente en la presente como referencia. El anticuerpo mab 22 es específico para el receptor de Fc y además esta descrito en la Patente Estadounidense No. 4,954,617 publicada el 4 de septiembre de 1988, el contenido de la cual también se incorpora expresamente como referencia. La línea celular productora del anticuerpo mab 22 humanizado fue depositada a la American Type Culture Collection el 4 de noviembre de 1992 con la designación HA022CL1 y tiene el número de acceso CRL1177.
Un anticuerpo puede ser humanizado por cualquier método, que sea capaz de sustituir cuando menos una porción de una CDR de un anticuerpo humano con una CDR proveniente de un anticuerpo no humano. Winter describe un método que puede utilizarse para preparar anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987), el contenido de la cual se incorpora expresamente como referencia. Las CDR humanas pueden ser sustituidas con CDR no humanas utilizando mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos como se describe en la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/10332 titulada, An ticuerpos Humanizados Para los Receptores Fc Para Inmunoglobulina G Sobre Fagoci tos Mononucleares Humanos .
Además de una porción anti-receptor de Fc, las moléculas multiespecíficas pueden comprender una "porción anti-objetivo", es decir, un anticuerpo, un fragmento funcional de anticuerpo o un ligando que reconozca y se una a un patógeno (por ejemplo, virus, bacterias, hongos) , una célula infectada por un patógeno, una célula cancerosa o tumoral (por ejemplo de mama, ovario, próstata, etcétera) u otra célula no deseada en un individuo (por ejemplo humano o animal) o un antígeno o forma modificada de este. Además, la porción objetivo puede comprender o estar dirigida contra un antígeno. Una modalidad preferida contiene un antígeno que puede utilizarse para estimular el sistema inmunitario, por ejemplo, en casos de infección crónica, para agotar el antígeno en circulación y para tratar tumores. Una modalidad particularmente preferida tiene un antígeno que .^MMgtfi esta unido a una molécula multivalente que contiene un anticuerpo anti-FcR.
En una modalidad específica de la invención, la molécula multiespecífica contiene un ligando. El ligando puede ser cualquier ligando que interactué con una molécula. En una modalidad preferida, el ligando se une a una proteína, por ejemplo, una proteína superficial sobre una célula objetivo, como puede ser una célula cancerosa. Los ligandos preferidos incluyen ligandos para receptores, como puede ser los factores de crecimiento o diferenciación. Por ejemplo, una molécula multivalente puede comprender un factor de crecimiento epidérmico, o cuando menos una porción o forma modificada que sea capaz de interactuar con un receptor, por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento epidérmico. En otra modalidad preferida de invención, el ligando es un péptido pequeño, como puede ser bombesina, el péptido liberador de gastrina (GRP) , litorina, neuromedina B o neuromedina C. Las secuencias de los péptidos pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5,217,955, el contenido de la cual se incorpora en la presente como referencia. El ligando también puede ser una forma modificada de cualquiera de estos péptidos. La modificación puede aumentar la unión al receptor, disminuir la unión o no afectar la unión a un receptor. La modificación del ligado también puede transformar un agonista en un antagonista, de modo que el ligado inhiba y no estimule la proliferación celular. La modificación del ligando puede ser una adición, una deleción, una sustitución o una modificación de cuando menos un aminoácido.
En una modalidad específica de la invención, una molécula multivalente o biespecífica comprende un antígeno. Cuando se utiliza en la presente, el término "antígeno" significa cualquier sustancia inmunogénica natural o sintética, fragmento o porción de una sustancia inmunogénica, un epítope peptídico o un hapteno. El término "antígeno" también incluye las sustancias que son no inmunogénicas en forma no acomplejada, pero que son inmunogénicas cuando están acomplejadas. El término "no acomplejada" incluye sustancias que no están ligadas para formar un complejo molecular de la presente invención. El término "acomplejado" incluye sustancias que están ligadas para formar un complejo molecular de la presente invención.
En una modalidad de la invención, se emplea una molécula bi- o multiespecífica para dirigir un antígeno a la célula a fin de potenciar el proceso de internalización y presentación por parte de estas células, y finalmente, para estimular una respuesta inmunitaria en estas. En una modalidad específica, el agente de unión biespecífico se une específicamente al antígeno (directamente a un epítope del antígeno o indirectamente a un epítope unido al antígeno) y, al mismo tiempo, se une a un receptor de superficie de una célula presentadora de antígeno que puede internalizar el antígeno para el procesamiento y presentación. En otra modalidad, el antígeno esta ligado a la molécula multi- o biespecífica y al mismo tiempo se une a un receptor de superficie de una célula presentadora de antígeno. El componente que se une al receptor de esta molécula bi- o multiespecífica (y así la propia molécula bi- o multiespecífica) se une al receptor de la célula presentadora de antígeno. En algunos casos, la unión de la molécula ocurre sin que la molécula este substancialmente bloqueada por el ligando natural para el receptor. Como resultado, la orientación del antígeno al receptor no se impedirá por las concentraciones fisiológicas del ligando y el receptor elegido seguirá siendo capaz de unirse al ligando y funcionar.
Un tipo de antígeno puede ser un alérgeno. Un "alérgeno" se refiere a una sustancia que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un individuo susceptible. La lista de alérgenos es enorme y puede incluir polen, veneno de insectos, polvo de desechos de animales, esporas de hongos y medicamentos (por ejemplo penicilina) . Los ejemplos de los alérgenos naturales, de animales y plantas incluyen proteínas específicas para los siguientes géneros: Canine (Canis familiares) ; Derma tophagoides (por ejemplo, Derma tophagoides faringe) ; Felis (Felis domesticus) ; Ambrosia (Ambrosia artemiisfoli ; Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium mul tiflorum) ; Cryptomeria (Cryptomeria japónica) ; Alternarla (Al ternaría al terna ta) ; Alder; agnus (Agnus gul tinosa) ; Betuna (Betuna verrucosa) ; Quercus (Quercus alba) ; Olea (Olea europa) ; Artemisia (Artemisia vulgaris) ; Plantago (por ejemplo, plantago lanceola ta) ; Parietaria (por ejemplo, Parietaria officinalis o Parietaria j udaica) ; Bla ttella (por ejemplo, Bla t tella germánica) ; Apis (por ejemplo, Apis mul tiflorum) ; Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens , Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa) ; Juniperus (por ejemplo Juniperus sabinoides , Juniperus virginiana , Juniperus communis y Juniperus ashei) ; Thuya (por ejemplo Thuya orientalis) ; Chamaecyparis (por ejemplo, Chamaecyparis . X.Í? * obtusa,); Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana) ; Agropyron (por ejemplo Agropyron repens) ; Sécale (por ejemplo, Sécale cereale) ; Tri ticum (por ejemplo Tri ticum aestivum) ; Dactylis (por ejemplo Dactylis glomera ta) ; Festuca (por ejemplo, Festuca ela tior) ; Poa (por ejemplo Poa pra tensis o Poa compressa) ; Avena (por ejemplo, Avena sa tiva) ; Holcus (por ejemplo Holcus lana tus) ; Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxan thum odora tum) ; Arrhena therum (por ejemplo Arrhena therum ela ti us) ; Agrostis (por ejemplo Agrostis alba) ; Phleum (por ejemplo Phleum pra tense) ; Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea) ; Paspalum (por ejemplo, Paspalum nota tum) ; Sorghum (por ejemplo, Sorghum halepensis) ; y Bromus (por ejemplo, Bromus inermis) Muchos alérgenos se encuentran en el polen portado en el aire de ambrosía, pastos o árboles, o en hongos, animales, el polvo de la casa o alimentos. Como una clase, estos son relativamente resistentes a la digestión proteolítica. Los alérgenos preferibles son aquellos que se unen a IgE sobre los mastocitos y basófilos, causando así una reacción de hipersensibilidad anafilaxis tipo I. Cuando al menos una especificidad del agente multivalente es para un epítope del receptor de Fc de alta afinidad que este fuera del dominio de unión al ligando para la IgG, este agente de unión biespecífica puede disminuir la hipersensibilidad en un individuo. Esto se logra cuando el agente de unión biespecífica compite por un alérgeno que se une a IgE antes de que el alérgeno se una a la IgE en un mastocito o basófilo, reduciendo así la posibilidad de una reacción de hipersensibilidad tipo I. Además, como resultado de dirigir el alérgeno al Fc?R, es posible inducir un estado de tolerancia de las células T al alérgeno que interfiera con las reacciones tipo I mediadas por la IgE. La tolerancia puede ser lograda induciendo la competencia de la IgG con la IgE para unirse al alérgeno utilizando dosis de alérgeno substancialmente menores que las que se utilizan actualmente .
En algunos casos, puede ser deseable acoplar una sustancia que sea débilmente antigénica o no antigénica por sí misma (como puede ser un hapteno) a una molécula portadora, como puede ser una proteína inmunogénica grande (por ejemplo, una toxina bacteriana) para administración. En estos casos, se puede hacer que el reactivo de unión biespecífica se una a un epítope del portador al cual se acopla la sustancia, en lugar de a un epítope de la propia sustancia.
El antígeno que puede estar ligado directa o indirectamente a una molécula multi- o biespecífica de la invención puede ser soluble o particulado; puede llevar epítopes de células B, epítopes de células T, o ambos. El antígeno puede ser de origen bacteriano, viral o parásito. Con frecuencia el antígeno comprenderá un componente de la estructura superficial de un organismo patógeno. Por ejemplo, el antígeno puede comprender una estructura de la superficie viral como puede ser una glucoproteína de la envoltura del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o el antígeno de superficie del virus de hepatitis. Además, el antígeno puede estar asociado con una célula enferma, como puede ser una célula tumoral, contra la cual es posible aumentar una respuesta inmunitaria para el tratamiento de la enfermedad. El antígeno puede comprender un antígeno específico del tumor o asociado con el tumor, como puede ser el producto proto-oncogen HER-2/neu que se expresa en células de cáncer de mama y ovario humanas (Slamon y col., (1989) Science 244: 707).
Las células de un individuo se pueden exponer in vi tro o in vivo a las moléculas multivalentes de la invención. La molécula multivalente puede utilizarse para dirigir un antígeno a las células presentadoras de antígeno en cultivo. Las células inmunocompetentes se separan y purifican de la sangre del paciente. Luego se exponen las células a una molécula multivalente que comprenda el antígeno o las células pueden ser expuestas 5 al antígeno junto con una molécula multivalente que tenga una especificidad de unión para el antígeno. Las células presentadoras de antígeno elegidas procesarán el antígeno y presentarán los fragmentos en su superficie. Después de la estimulación, las células pueden ser regresadas al 10 paciente.
El método de esta invención puede utilizarse para • mejorar o reforzar la respuesta inmune a un antígeno. Por ejemplo, el método es valioso para el tratamiento de 15 infecciones crónicas, como hepatitis y SIDA, donde el sistema inmunológico sin ayuda es incapaz de superar la infección. También se puede utilizar en el tratamiento de las etapas agudas de infección cuando puede ser necesario el reforzamiento de la respuesta inmune contra el 20 organismo invasor. • El método puede utilizarse para reducir la dosis del antígeno necesaria para obtener una respuesta inmune protectora o terapéutica o en casos cuando el hospedero 25 no responde o responde mínimamente al antígeno. Aunque es generalmente deseable, la reducción de la dosis eficaz puede ser especialmente deseable cuando el antígeno es tóxico al hospedero como en el caso de alergias. Los métodos y usos para las moléculas bi- o multiespecíficas que comprenden un antígeno o que comprenden un ligando, por ejemplo, un anticuerpo interactuando con un antígeno, además están descritos en la Solicitud del PCT publicada PCT/US91/07283.
En otra modalidad de la invención, una molécula multiespecífica comprende un antígeno que ha sido modificado, de modo que su efecto sobre la activación de las células T se modifica con la presentación del antígeno modificado a la célula T mediante una célula presentadora del antígeno. Alian y col., han demostrado que la sustitución de uno o más aminoácidos de un péptido que estimula células T, por ejemplo, que estimula la proliferación de células T, puede originar que un antígeno no estimule la célula T o que induzca anergia en la célula T. Tales péptidos modificados se denominan Ligandos de Péptidos Alterados (APL) . Por consiguiente, estos APL puede estar ligados a moléculas biespecíficas o multiespecíficas que tengan cuando menos una especificidad de unión para el Fc?RI . Con la fagocitosis de estas moléculas por parte de las células presentadoras de antígeno y la presentación a las células T, es posible inhibir o anergizar la proliferación de las células T. Por consiguiente, la administración a un individuo de una molécula multiespecífica que comprende: (a) cuando menos 5 un péptido alterado de un antígeno que normalmente estimula células T, pero que con la modificación induce anergia de las células T, y (b) cuando menos un • anticuerpo anti-Fc?RI originará inducción de tolerancia del individuo al antígeno. Así pues, tales moléculas 10 multi- o biespecíficas pueden utilizarse para hacer tolerante a un individuo a una variedad de antígenos, por ejemplo, autoantígenos. Así pues, dependiendo del antígeno que se utilice, los métodos de la invención proporciona los métodos para aumentar una respuesta 15 inmunitaria, es decir, al utilizar un antígeno que estimule las células T, y la invención también proporciona los métodos para reducir una respuesta inmunitaria, inhibiendo la estimulación de las células T o induciendo anergia de las células T. 20 • Las moléculas multiespecíficas, multivalentes de la invención también pueden incluir una "porción anti-factor de mejoramiento (anti-EF)". La "porción anti-factor de mejoramiento" puede ser un anticuerpo, fragmento 25 funcional de anticuerpo o un ligando que se una a un ,. », antígeno y por este medio conduzca a un mejoramiento del efecto de la porción anti-receptor de Fc o la porción anti-objetivo . La "porción anti-factor de mejoramiento" puede unirse a un receptor de Fc o un objetivo. Una molécula multivalente que comprende una porción antiobjetivo que se une a un antígeno celular objetivo y una porción anti-factor de mejoramiento que se une a un antígeno objetivo diferente es particularmente útil donde la célula objetivo sufre modulación del antígeno o variación antigénica (por ejemplo, como se ha descrito para ciertos parásitos (como los tripanosomas) . De otro modo, la porción anti-factor de mejoramiento puede unirse a una entidad que sea diferente de la entidad a la cual se une la porción anti-objetivo o anti-receptor de Fc . Por ejemplo, la porción anti-factor de mejoramiento puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que dé origen a una respuesta inmune incrementada contra el objetivo) .
Métodos para preparar moléculas multiespecíficas Las moléculas multiespecíficas antes descritas pueden ser preparadas por diversos métodos. Por ejemplo, ambas especificidades pueden ser codificadas en el mismo vector y expresadas y ensambladas en la misma célula hospedera. Este método es particularmente útil donde la molécula multiespecífica es una proteína de fusión (ligando) x (fab) como esta descrito en el Ejemplo 2 más 5 adelante. Una molécula biespecífica de la invención también puede ser una molécula biespecífica monocatenaria, como puede ser un anticuerpo biespecífico • monocatenario, una molécula biespecífica monocatenaria comprendiendo un anticuerpo monocatenario y un ligando, o 10 una molécula biespecífica monocatenaria comprendiendo dos ligandos. Las moléculas multivalentes también pueden ser moléculas monocatenarias o pueden comprender cuando menos ( dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar anticuerpos bi- o multivalentes, por ejemplo, están 15 descritos en la Patente Estadounidense No. 5,260,203; Patente Estadounidense No. 5,455,030; Patente Estadounidense No. 4,881,175; Patente Estadounidense No. 5,132,405, Patente Estadounidense No. 5,091,513; Patente Estadounidense No. 5,476,786; Patente Estadounidense No. 20 5,013,653; Patente Estadounidense No. 5,258,498; y ( Patente Estadounidense No. 5,482,858.
La unión de las moléculas monocatenarias a sus objetivos específicos se puede confirmar por ELISA biespecífico como 25 esta descrito en los ejemplos en la presente.
De otro modo, cada especificidad de una molécula multiespecífica puede ser generada por separado y las proteínas o péptidos resultantes pueden ser conjugados ente sí. Por ejemplo, dos anticuerpos humanizados pueden ser conjugados por enlace sulfhidrilo de las regiones bisagra C terminales de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, de preferencia uno, antes de la conjugación.
Las moléculas biespecíficas de la presente invención pueden prepararse conjugado las porciones anti-FcR y anti-objetivo utilizando los métodos descritos en los siguientes ejemplos o los bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para la conjugación covalente se puede utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o reticuladores. Los ejemplos de los agentes reticuladores incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y col., (1984) J. Exp.
Med. 160: 1686; Liu, MA y col., (1985) Proc. Nati. Acad.
Sci. USA 82: 8648). Otros métodos incluyen los descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan y col., (Science (1985) 229: 81-83), y Glennie y col., (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Los - agentes para la conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .
En el caso de utilizar anticuerpos como especificidades de unión dentro de las moléculas multiespecíficas, los anticuerpos preferidos incluyen los anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos humanizados (incluidos los fragmentos, por ejemplo Fab' y Fv monocatenario) de estos. Se conocen en la técnica los métodos para preparar los anticuerpos humanizados y están descritos con detalle en los ejemplos más adelante. Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales completamente humanos también son conocidos en la técnica. Estos anticuerpos pueden producirse por una variedad de técnicas, que incluye la metodología habitual de los anticuerpos monoclonales, por ejemplo la técnica de hibridación de células somáticas normal de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975) . Aunque se prefiere los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, es posible emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo la transformación viral u oncogénica de linfocitos B.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos para la inmunización y las técnicas para 5 aislar esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la técnica. Las contrapartes de fusión (por ejemplo ^^ células de mieloma murino) y los procedimientos para la fusión también son conocidos. 10 En una modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos se generan utilizando ratones transgénicos que lleven las partes del sistema ^P inmunitario humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos, mencionados en la presente como 15 ratones "HuMab", contienen un miniloci del gen de la inmunoglobulina humana que codifica secuencias de la inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y de cadena ligera K no re-arregladas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena µ y K endógenos 20 (Lonberg, N. y col., (1994) Na ture 368 (6474): 856-859).
• Por consiguiente, los ratones presentan expresión reducida de la IgM o K de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y de la cadena ligera introducidos sufren intercambio (switching) 25 de clase y mutación somática para generar IgG? monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. y col., (1994), supra; revisado en N. (1994) Handbook of Experimen tal Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N y Huszar, D. (1995) Intern . Rev. Immunol . vol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N (1995) Ann . N. Y. Acad. Sci . 764: 536-546). La preparación de los ratones HuMab esta descrita con detalle en la Sección II más adelante y en Taylor, L. y col. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen. J. y col, (1993) In terna tional Immunology 5: 647-656; Tuaillon y col., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90: 3720-3724; Choi y col., (1993) Na ture Genetics 4: 117-123; Chen, J. y col., (1993) EMBO J 2 : 821-830; Tuaillon y col., (1994) J. Immunol . 152: 2912-2920; Lonber y col., (1994) Na ture 368 (6474): 856-859; Lonberg N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. y col., (1994) Interna tional Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern . Rev. Immunol . Vol. 13: 65-93; Harding. F. y Lonberg, N. (1995) Ann N. Y. Acad Sci 764: 536-546; Fishwild, D. y col., (1996) Na ture Biotechnology 14: 845-851, los contenidos de todas las cuales se incorporan por este medio en su entereza. Véase además, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,806 y 5,625,825, ambas de Lonberg y Kay, y GenPharm International; la Patente Estadounidense No. 5,545,807 de Surani y col.; Publicaciones Internacionales Nos. WO <___________.__ «>..____,.___ . , -Ajaat" ...» . *« .'. . - ,<-,*. i é ,_._j|&ga¡_É__É 98/24884, publicada el 11 de junio de 1998, WO 94/25585 publicada el 10 de noviembre de 1994, WO 93/1227 publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22645 publicada el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918 publicada el 19 de marzo de 1992, las descripciones de todas las cuales se incorporan por este medio como referencia en su entereza. De otro modo es posible utilizar los ratones transgénicos HC012 descritos en el Ejemplo 2 para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos.
Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos, los ratones pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida del inmunógeno deseado y/o las células que expresen el inmunógeno deseado, como esta descrito por Lonberg, N. y col., (1994) Na ture 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. y col., (1996) Na ture Biotechnology 14: 845-851 y WO 98/24884. De preferencia, los ratones serán de 6-16 semanas de nacidos en la primera infusión. Por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida (5-20 µg) del antígeno HER2/neu puede utilizarse para inmunizar por vía intraperitoneal ratones HuMab. En el caso de que las inmunizaciones utilizando una preparación purificada o enriquecida del antígeno HER2/neu no de como resultado anticuerpos, los ratones pueden también ser inmunizados con células que ... ~ t expresen HER2/neu, por ejemplo, una línea de células tumorales, para promover respuestas inmunes.
La experiencia acumulada con diversos antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos HuMab responden mejor cuando inicialmente se les inmuniza por vía intraperitoneal (IP) con el antígeno en coadyuvante completo de Freund, seguido por inmunizaciones IP en semanas alternas (hasta un total de 6) con el antígeno en coadyuvante incompleto de Freund. Es posible supervisar la respuesta inmune durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas por sangrados retroorbitales . El plasma puede ser detectado por ELISA (como se describe más adelante) y los ratones con suficiente título de la inmunoglobulina humana contra el inmunógeno deseado pueden utilizarse para las fusiones. Los ratones pueden ser reforzados por vía intravenosa con el antígeno 3 días antes del sacrificio y de retirar el bazo. Se espera que para cada antígeno se necesite realizar 2-3 fusiones. Para cada antígeno se inmunizará 6 ratones. Por ejemplo, es posible inmunizar un total de 12 ratones HuMab de las cepas HC07 y HC012.
Después se puede aislar y fusionar esplenocitos de ratón con PEG a una línea celular de mieloma de ratón con base en los protocolos normales. Los hibridomas resultantes entonces pueden ser detectados para la producción de los anticuerpos específicos del antígeno. Por ejemplo, suspensiones de células individuales de los linfocitos esplénicos provenientes de los ratones inmunizados se fusionan a una sexta parte del número de las células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. Se plaquean las células a aproximadamente 2 x 10 en placas de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación durante dos semanas en medio selectivo conteniendo 20% de suero de clon fetal, 18% de medio acondicionado "653", 5% del origen (IGEN), L-glutamina 4 mM, L-glutamina 1 mM; piruvato de sodio lmM, HEPES 5 M, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 unidades/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 50 mg/mL de gentamicina y IX HAT (Sigma; el HAT se adiciona 24 horas después de la fusión) . Dos semanas después, las células se cultivan en medio en el que el HAT ha sido sustituido con HT . Los pozos individuales entonces se detectan por ELISA para los anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos contra el inmunógeno deseado. Una vez que ocurre el crecimiento extenso del hibridoma, se observa el medio por lo regular después de 10-14 días. Se vuelve a plaquear los hibridomas secretores de anticuerpos, se detectan nuevamente, y si todavía son positivos para los anticuerpos monoclonales IgG humanos contra el inmunógeno deseado, pueden ser subclonados cuando menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables entonces 5 se cultivan in vi tro para generar cantidades pequeñas del anticuerpo en medio de cultivo tisular para la caracterización.
Para caracterizar la unión de los anticuerpos 10 monoclonales humanos, es posible probar sueros de ratones inmunizados, por ejemplo, por ELISA. En resumen, las placas de microtitulación se recubren con el inmunógeno deseado (purificado) a aproximadamente 0.25 µg/mL en PBS, y luego se bloquean con albúmina sérica de bovino al 5% 15 en PBS. Las diluciones de plasma de los ratones inmunizados con el inmunógeno deseado se adicionan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y luego se incuban con un reactivo policlonal específico de Fc anti-IgG humana de cabra 20 conjugado a fosfatasa alcalina durante una hora a 37°C. Después del lavado, las placas se revelan con sustrato pNPP (1 mg/mL), y se analizan a una DO de 405-650. De preferencia, los ratones que desarrollan títulos más altos serán utilizados para las fusiones. 25 También es posible utilizar un ensayo ELISA como ya se describió para detectar hibridomas que muestren reactividad positiva con el inmunógeno deseado. Los hibridomas que se unen con alta avidez al inmunógeno deseado serán subclonados y además caracterizados. Un clon de cada hibridoma, que conserve la reactividad de las células precursoras (por ELISA) , puede ser elegido • para preparar 5-10 bancos de células viales almacenados a -140°C, y para la purificación de los anticuerpos. 10 Para purificar anticuerpos monoclonales humanos contra el inmunógeno deseado, los hibridomas seleccionados pueden ser crecidos en matraces rotatorios de dos litros para purificación de anticuerpos 15 monoclonales. Los sobrenadantes pueden ser filtrados y concentrados antes de la cromatografía por afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . La IgG eluida pude ser verificada por electroforesis en el gel y cromatografía líquida de alta resolución para garantizar 20 la pureza. La solución buffer puede ser cambiada en PBS, y se puede determinar la concentración por DO280 utilizando el coeficiente de extinción 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden ser divididos en alícuotas y almacenados a -80°C. 25 Para determinar si los anticuerpos monoclonales humanos seleccionados se unen a los epítopes únicos en el inmunógeno deseado, cada anticuerpo puede ser biotinilado utilizando los reactivos disponibles en el comercio (Pierce, Rockford, IL) . Es posible realizar estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados utilizando placas de ELISA recubiertas con el inmunógeno deseado como ya se describió. La unión de los mAb biotinilados puede ser detectada con una sonda Estrep-avidin-fosfatasa alcalina.
Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, es posible realizar los ensayos ELISA del isotipo. Los pozos de las placas de microtitulación pueden ser recubiertos con 10 µg/mL de anti-lg humana durante la noche a 4°C. Después de bloqueo con BSA al 5%, las placas reaccionan con 10 µg/mL de los anticuerpos monoclonales o los controles isotipo purificados, a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se hace la reacción en los pozos con sondas conjugadas a la fosfatasa alcalina específicas de IgGl humana o IgM humana. Las placas se revelan y analizan como ya se describió.
-**"• - A fin de demostrar la unión de los anticuerpos monoclonales a las células vivas que expresan el inmunógeno deseado, por ejemplo, el receptor de células tumorales, es posible utilizar citometría de flujo. En resumen, las líneas celulares que expresan el inmunógeno deseado (crecido bajo condiciones de crecimiento estándar) se mezclan con diferentes concentraciones de los anticuerpos monoclonales es PBS conteniendo 0.1% de Tween 20 y 20% de suero de ratón, y se incuban a 37 °C durante una hora. Después del lavado, las células reaccionan con anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluoresceína bajo las mismas condiciones como la tinción del anticuerpo primario. Las muestras pueden ser analizadas por el instrumento FACScan utilizando propiedades de dispersión de luz y lateral para inhibir en las células individuales. Otro ensayo alternativo es la microscopia de fluorescencia que puede utilizarse además o en lugar del ensayo de citometría de flujo. Es posible teñir las células exactamente como ya se describió y examinarlas por microscopia de fluorescencia. Este método permite la visualización de las células individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno. : t ,l A MB ^¡g|§ag Las IgG humanas que se unen al inmunógeno deseado además pueden ser probadas para la reactividad con el inmunógeno deseado por Western blot. En resumen, los extractos celulares de las células que expresan el inmunógeno deseado pueden ser preparados y sometidos a electroforesis en gel con dodecilsulfato de sodio poliacrilamida. Después de la electroforesis, los antígenos separados serán transferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados con suero de ratón al 20% y sondeados con los anticuerpos monoclonales que van a ser probados. Se puede detectar la unión de la IgG humana utilizando anti-IgG humana fosfatasa alcalina y se revela con tabletas sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co . , St . Louis, MO) .
Usos terapéuticos para las moléculas mul tiespecíficas Con base en su capacidad para unirse a las células inmunes portadoras de FcR y a las células objetivo específicas, es posible administrar a un individuo una molécula multiespecífica específica para tratar o prevenir una variedad de enfermedades o estados que incluyen: cáncer (por ejemplo, de mama, ovario, de células pequeñas, carcinoma de pulmón) , infecciones patógenas (por ejemplo, virales, (como VIH)), por protozoarios (como Toxoplasma gondii) , micóticas (como candidiasis) ; autoinmunidad (por ejemplo, trombocitopenia púrpura inmune y lupus sistémico) . El multivalente multiespecífico también puede ser administrado en forma profiláctica para vacunar a un individuo contra infección mediante una célula objetivo. Para uso en tratamientos, es posible administrar a un individuo una cantidad eficaz de una molécula multiespecífica adecuada, por cualquier modo que permita a las moléculas ejercer su efecto terapéutico propuesto. Las vías de administración preferidas incluyen oral y transdérmica (por ejemplo, mediante un parche) . Los ejemplos de otras vías de administración incluyen inyección (subcutánea, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intratecal, etcétera) . La inyección puede ser en un bolo o una infusión continua.
Es posible administrar una molécula multiespecífica junto con un portador aceptable para uso farmacéutico. Cuando se utiliza en la presente, la frase "portador aceptable para uso farmacéutico" se propone incluir sustancias que puedan ser co-administradas con una molécula multiespecífica y permitan a la molécula realizar su función propuesta. Los ejemplos de tales portadores incluyen soluciones, solventes, medios de dispersión, agentes retardantes, emulsiones y similares. El uso de estos medios para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Cualquiera de los portadores habituales convenientes para uso con las moléculas entra dentro del alcance de la presente invención.
La frase "cantidad eficaz" de una molécula multiespecífica se refiere a aquella cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una molécula multiespecífica, en la que la porción anti-objetivo reconozca una célula patogénica podría ser aquella cantidad necesaria para eliminar un tumor, cáncer, o infección bacteriana, viral o micótica. Para cualquier aplicación particular, la cantidad eficaz puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o el estado que este siendo tratado, la molécula multiespecífica que este siendo administrada, la talla del individuo o la gravedad de la enfermedad o estado. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de una molécula multiespecífica particular sin necesitar experimentación debida.
La siguiente invención [sic] además se ilustra mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser considerados como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, solicitudes de patente pendientes y patentes 5 publicadas, mencionadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente como referencia por este medio.
Ejemplos 10 Ejemplo 1 : Producción de anticuerpos biespecificos que comprenden anticuerpos murinos o humanizados específicos para un receptor de Fc y un anticuerpo anti-her 2 neu 15 Anti cuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-Fc?RI, M22, M32.2 y 197 fueron purificados a partir del sobrenadante de hibridomas por cromatografía de intercambio iónico y DZ33, un 20 mAb IgGl anti-VIH-1 fue purificado a partir de sobrenadantes de hibridomas por cromatografía de afinidad proteína A (Pharmacia, Piscataway, NJ) y filtración en gel. El M32.2 fue depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD20852, el 1 de julio de 1987 y 25 ha sido designado con el acceso ATCC No. HB9469.
Líneas celulares El mieloma de murino NSO (ECACC 85110503) es una línea no sintetizadora de Ig y se utilizó para la expresión de los mAbs recombinantes. Las células NSO fueron cultivadas en DMEM más 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco, Paisley, U. K) . La SKBR-3 es una línea celular de carcinoma de mama que sobre-expresa el protooncogen HER2/neu (ATCC, Rockville, MD) y se cultivó en medio de Dulbeco modificado de Iscove (IMDM, Gibco, Grand Island, NY) . La U937 es una línea celular monocitoide que expresa Fc?RI y se obtuvo del ATCC y se creció en RPM-1640 más 10% de FBS (Gibco, Grand Island, NY) .
Clonación de genes de la región V de inmunoglobulina murina El RNA citoplásmico del hibridoma murino 22 se preparó como se describe en Favaloro y col., (Favaloro J., R. Treisman y R. Kamen (1982) Transcription maps of polyoma-specific RNA: analysis by two-dimensional SI gel mapping. Meth. Enzymol. 65: 718) . Los cDNA de la región V de la Ig fueron preparados a partir de RNA a través de trascripción inversa iniciada a partir de los cebadores CG1F0R y CK2FOR como se describe en la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/10332 titulada, An ticuerpos Humanizados Para los Receptores Fc Para Inmunoglobulina G en Fagoci tos Mononucleares Humanos . La síntesis del cDNA se realizó en condiciones normales utilizando 100 U de la transcriptasa inversa MMLV (Life Technologies, Paisley, UL) . Los cDNA de las VH y V? fueron amplificados por PCR, (Orlandi, R., D. H. Güssow, P. T. Jones y G. Winter (1989) (Cloning immunoglobulin variable domains for expresión by the polymerase chain reaction) , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833), utilizando los cebadores del cDNA en concierto con SH2BACK y VK7BACK como se describe en la publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/10332. Los DNA de las VH y V? amplificados fueron purificados, clonados en M13 y secuenciados por el método dideoxi utilizando T7 DNA polimerasa (Pharmacia, Piscataway, NJ) .
Construcción de genes de anticuerpos quiméricos Para facilitar la clonación del DNA de la región V murina en vectores de expresión, se colocaron sitios de restricción en proximidad cercana a los términos de ambos genes de región V del M22. Para VH, fueron introducidos un sitio 5' PstI y un sitio 3' BstEII en un gen de VH murino, clonado por PCR utilizando VH1BACK y VH1F0R (Id) . Para V? se introdujeron un sitio 5' vulI y un sitio 3' Bglll en un gen de V? murino, clonado, por PCR utilizando los cebadores VK1BACK y VK1F0R (Id) . En algunos casos, estos cebadores cambiaron uno o más aminoácidos de los que se encuentran en forma natural. Estos genes de las regiones V (ChVH y ChVK) fueron cortados con las enzimas de restricción adecuadas y clonados en M13VHPCR1 y M13VKPCR1 (Id). Los cuales contienen un promotor Ig, secuencias señal y sitios de empalme. El DNA fue escindido de M13 como fragmentos Hi.ndIII-Ba.mHI y clonados en los vectores de expresión pSVgpt y pSVhyg conteniendo IgGl humana, (Takahashi, N. y col., (1982), Structure of Human immunoglobulin gamma genes:: implications for evolution of a gene family, Cell, 29: 671) , y el DNA genómico de la región constante kappa humana (Hieter, R. A. y col., (1980) Cloned human and mouse kappa inmmunoglobulin constant and J región genes conserve homology, in functional segments, Cell 22: 197).
Construcción de genes de anticuerpos humanizados Se construyeron dos cadenas pesadas humanizadas y fueron basadas en las VH humanas de NEWM, (Poljak, R. J. y col., Amino Acid sequence of the VH región of a human mycloma immunoglobulin, (IgG New) , Biochemistry, 16: 3412), y KOL, (Marquat, M. y col., (1980) Crystallographic refinement and atomic models of the intact immunoglobulin molecule Kol and its antigen-binding fragment a 3. OA y 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 141: 369. La cadena ligera humanizada fue obtenida de la proteína Bence-Jones humana REÍ, (Epp, O. y col., (1974) Cristal and Molecular structure of a dimer composed of the vandible portion of the Bence-Jones humana REÍ, Eur. J. Biochem 45: 513), con algunos cambios en la región del armazón (FR) . Se hicieron modificaciones para hacer más común el dominio V? del subgrupo I humano, e incluyeron la sustitución de Thr39, Leul04, Glnl05 y Thrl07 con Lys39, Vall04, Glul05 y Lysl07. Además, se cambió Met4 a Leu4 para acomodar un sitio de restricción PvulI.
El DNA que contenía las FR VH de NEWM y V? de REÍ con las CDR irrelevantes fueron clonados en los vectores M13VHPCR1 y M13VKPCR1 (Favaloro y col., supra) . El DNA que codifica la VH de KOL fue construido por una serie de reacciones PCR en secuencia, utilizando oligodeoxiribonucleótidos que codifican lo aminoácidos FR de KOL y las CDR irrelevantes. Las construcciones luego fueron clonadas en M13VHPCR1.
Los oligodesoxiribonucleótidos fueron sintetizados para codificar las CDR de los mAb M22 que fueron flanqueadas por los nucleótidos correspondientes a las FR humanas. Para la VH humanizada basada en NEWM, los cebadores incluyeron los aminoácidos de la FR murina Phe27, Ile28 y Arg71 dado que estos probablemente influirían la unión al antígeno, (Chothia, C.y A. M. Lesk (1987), Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196: 901; Tramontano, A. y col., (1990), Framework residue 71 is a major determinant of the position and conformation of the second hypervariable región in VH domains of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 215 : 175). Para la V? humanizada, el aminoácido murino Phe71 del mismo modo fue incluido como un residuo capaz de afectar la afinidad, (Foote, J. y G. Winter, (1992), Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable llops, J. Mol. Biol. 224: 487. Ninguno de los residuos de las FR murinas fueron incluidos en las VH de KOL. Los oligodeoxiribonucleótidos fueron fosforilados en la posición 5' , y con el cebador de avance universal M13 templado para los genes de la región V humana, clonados en M13 en reacciones que contenían la plantilla ssDNA de M13. El DNA fue extendido y ligado con 2.5 U de T7 DNA polimerasa (United States Biochemicals, Claveland, OH) y i , ?'??-i, a,M 0.5 U de la T4 DNA ligasa (Gibco BRL, Grand Island, NY) . La hebra mutada fue amplificada preferencialmente a partir de la mezcla de extensión/ligación utilizando el cebador de secuenciación inversa M13 con una U de la Vent DNA polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MA) y luego se amplificó por PCR utilizando los cebadores de avance e inversos de M13. El DNA producto fue cortado con BamRl y • fíindlll, clonado en M13 y mutantes injertados con CDR triples identificados por secuenciación del DNA. 10 Los clones de M13 conteniendo las regiones V humanizadas fueron secuenciados en su entereza para garantizar ausencia de mutaciones espúreas. El DNA de las RF [sic] proveniente de los clones confirmados fue 15 digerido con HindIII y BamRI , clonado en pSVgpt o pSVhyg y las regiones constantes de la IgGl humana o kappa humana adicionadas exactamente como se describe para la construcción de los genes de los anticuerpos quiméricos. 20 Expresión y puriricación de los mAbs recombinantes • Los vectores de expresión de la cadena pesada (5 µg) y ligera (10 µg) fueron digeridos con Pvul, precipitados con etanol y disueltos en 50 µL de agua. Células NSO (1-2 25 x 10 7 ) fueron cosechadas por centrifugaci•ó 'n, resuspendidas en 0.5 ml DMEM y mezcladas con el DNA en una cubeta para electroporación de 0.4 cm. Después de 5 minutos, sobre hielo, se dio a las células un solo impulso de 170 V, 960 µF (GenePulser, Bio-Rad, Melville, 5 NY) y se incubaron durante otros 15 minutos en hielo. Se permitió que las células se recuperaran en DMEM durante 24-48 horas. Luego el medio se hizo selectivo mediante la • adición de ácido micofenólico (0.8 UG/mL) y xantina (250 mg/mL) . Alícuotas de 200 µL fueron distribuidas en placas 10 de 96 pozos. Después de otros 10-12 días, las células de los pozos que contenían los niveles más altos del anticuerpo medidos por ELISA fueron seleccionados y • clonados por dilución limitante. 15 Los anticuerpos fueron purificados de los cultivos crecidos en exceso por cromatografía de afinidad proteína A (Boehringer Mannheim, Lewes, U. K. ) se determinaron las concentraciones midiendo la A280nm Y se confirmaron por ELISA y SDS-PAGE. 20 ELISA para medir la unión de los an ticuerpos Los pozos de una placa de microtitulación fueron cubiertos con anticuerpos anti-IgM humanos de cabra 25 (Sera-Lab, Crawley Down U. K. ) en buffer de bicarbonato 50 mM, pH 9.6. La placa fue bloqueada con BSA al 1% y seguida por la adición de una proteína de fusión soluble consistente en el dominio extracelular del Fc?RI humano y la cadena pesada de la IgM humana (sFc?RI-µ) obtenido de las células COS transfectadas de manera transitoria (el vector de expresión fue proporcionado amablemente por el Dr. Brian Seed, Massachussets General Hospital, Boston, MA) . Los mAbs 22 recombinantes o control fueron luego adicionados en presencia de anticuerpos IgGl humanos (2.2 µg/pozo) en exceso (Sigma, St . Louis MO) que contenían las cadenas ligeras ? para bloquear la unión no específica de los mAbs de prueba a través de su porción Fc. Los mAbs 22 unidos fueron detectados con anticuerpos anti-cadena kappa humana de cabra marcados con peroxidasa (Sera-Lab Crawley Down, U. K. ) y o-fenilendiamina.
Fluoresceinación de anticuerpos El pH de una solución de mAb se ajustó a 9.3 adicionando Na2C03 0.1 M. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma, St. Louis, MO) se disolvió en DMSO a una concentración de 2 mg/mL. Se adicionaron 40 µg de FITC por cada miligramo de mAb y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Los mAb fluoresceinados fueron separados del FITC libre por cromatografía G-25. i,lii Preparación de cél ulas sanguíneas Se prepararon capas amarillentas a partir de sangre venosa completa heparinizada . La sangre completa fue diluida con RPMI conteniendo 5% de dextrano en una proporción 2.5:1 (v/v). Se dejó sedimentar los eritrocitos durante 45 minutos en hielo, luego las células en el sobrenadante fueron transferidas a un tubo nuevo y empaquetadas por centrifugación. Los eritrocitos resicuales fueron retirados por lisis hipotónica. Los linfocitos, monocitos y neutrófilos restantes se mantuvieron en hielo hasta su uso en los ensayos de unión. Para algunos experimentos, se separaron los neutrófilos de las células mononucleares por separación en gradiente ficoll hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Para la regulación ascedente de Fc?RI, los neutrófilos y células mononucleares fueron tratados con citokinas. Los cultivos de las células mononucleares fueron incubados a 37°C, 5% de CO2 durante 48 horas en cajas de teflón a 4 x 10 células/mL de RPMI conteniendo 2.5% de suero humano normal tipo AB (Sigma, St. Louis, MO) y 500 IRU/mL de IFN-? (R&D systems, Minneapolis, MN) . Los neutrófilos fueron cultivados durante 48 horas (37°C, 5% de C02) en medio AIM V (Gibco, Grand Island, NY) con 50 ng/mL de G-CSF (amablemente proporcionado por R. Repp, U. of .. ..^ . 1 1 pii?MliVAihÉi Erlanger, Alemania) y 500 IRU/mL de IFN-?.
Ci tometría de flujo Se realizaron los ensayos de unión celular utilizando placas de microtitulación de 96 pozos como se describe anteriormente, (Guyre, P. M. y col., Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on Fc?R are able to trigger receptor function. J. Immunol. , 143 : 1650). En resumen, las células fueron lavadas en PBS; pH 7.4 conteniendo 2 mg/mL de BSA y 0.05% de NaN3 (PBA), y ? ajustado a 2.0 x 10 células/mL con PBA. Los anticuerpos marcados con FITC y no conjugados fueron preparados en PBA. Las células (25 µL) , anticuerpos (25 µL) y suero humano (25 µL) , o IgG humana (10 mg/mL, Sigma, St . Louis, MO) (25 µL) , o PBA (25 µL) fueron adicionados a la placa de microtitulación y se dejaron en hielo durante 45-60 minutos. El anticuerpo no unido fue retirado de los pozos lavando las células tres veces con PBA. Se fijaron las células con 1% de paraformaldehído. La fluorescencia asociada con las células fue analizada en un FACScan Becton Dickinson. £.¿&,A é* ¿>a j.« * * *&.*, *. ¿^^ t . *, .** - * . •*.»«- *.•*. i *- ' ¡fiaifir»-*»—« Procedimien to del acoplamien to de los BsAb Los BsAb fueron construidos utilizando el método de Glennie y col., (Glennie, M. J. y col., (1987), 2 Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma) , antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments, J. Immunol. , 139: 2367). Los mAbs 22 (murinos y humanizados) y los anticuerpos 520C9 (anti-HER2/neu) fueron producidos por cultivo ín vi tro de las células de hibridoma respectivas. Los anticuerpos fueron digeridos por separado con pepsina hasta F(ab')2, y después reducidos a Fab' por adición de mercaptoetanolamina (MEA) 10 mM durante 30 minutos a 30 °C. Los fragmentos Fab' fueron aplicados a una columna Sephadex G-25 equilibrada con acetato de Na 50 mM, EDTA 0.5 mM, pH 5.23 (4°C). Orto-fenilendimaleimida (o-PDM, 12 mM) disuelta en dimetilformamida y enfriada en un baño de metanol/hielo fue adicionada (medio volumen) al 22 Fab' murino en el caso de M22 x 520C9, y a 520C9 Fab' en el caso de H 22 x 520C9 y se incubaron durante 30 minutos en hielo. El Fab' -maleimida fue luego separado de la o-PDM libre en Sephadex-G25 equilibrida en acetato de sodio 50 mM, EDTA 0.5 mM, pH 5.3 (4°C). Para la preparación de los BsAbs, los M22 Fab' -maleimida fueron adicionados a los 520C9 Fab' o los 520C9 Fab' -maleimida se adicionó a H22 Fab' en *•-*»*"-~*" una relación molar 1:1. Los reactantes fueron concentrados en argón al volumen inicial utilizando una membrana Diaflo en una cámara Amicon (todo a 4°C). Después de 18 horas se ajustó el pH a 8.0 con Tris-HCl 5 1M, pH 8.0. Luego se redujo la mezcla con MEA 10 mM (30 minutos, 30°C) y se alquiló con yodoacetamida 25 mM. Los F(ab')2 biespecíficos fueron separados de los Fab' sin reaccionar y otros productos mediante una columna Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en 10 PBS.
Ci totoxicidad cel ular dependiente de an ticuerpos • (ADCC) 15 Las células de carcinoma de mama humano sobre- expresando HER2/neu, SKBr-3, fueron utilizadas como objetivos para lisis por neutrófilos activados por citokina (véase la preparación de las células sanguíneas) . Los objetivos fueron marcados con 100 µCi de 20 51Cr durante una hora antes de combinarlos con los neutrófilos y los anticuerpos en una placa de microtitulación con fondo en forma de U. Después de la incubación durante 5 horas a 37 °C se recolectaron los sobrenadantes y se analizó su reactividad. Se calculó la 25 citotoxicidad por la fórmula: % de lisis = (CPM experimental - CPM fuga del objetivo/CPM lisis con detergente - CPM fuga del objetivo) x 100%. Lisis específica = % de lisis con el anticuerpo - % de lisis sin anticuerpo. Los ensayos se realizaron por triplicado. 5 Inducción de superóxido Se utilizaron células U937 para medir la capacidad de H22 para activar un estallido de superóxido a través 10 de Fc?RI, (Pfefferkorn, L. C. y G. R. Yeaman (1994), Association of IgA-Fc receptors (Fc x R) with FceRI? subunits in U937 cells, J. Immunol. 153: 3228; Hallet, H. B. y A. K. Campbell (1983), Two distinct mechanisms for stimulating of oxygen-radical production in 15 polymorphonuclear leucocytes Biochem J. 216: 459) . Se cultivaron células U937 durante cinco días en RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY) con 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) en presencia de 100 U/mL de IFN-? (Genentech, S. San Francisco, CA) para inducir la diferenciación y aumentar 20 la expresión de Fc?RI . En el día del experimento, estas células diferenciadas fueron incubadas durante 20 minutos en RPMI-1640 fresco con 10% de FBS a 37°C. Las células luego fueron empacadas y resuspendidas a una concentración de 3 x 10 células/mL en PBS suplementado 25 con CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, glucosa 11 mM y 100 µg/mL de j^^|j¡£^^¡ a¿i ¿ ..<.,;..» i, .*¿í.,,.i,.t ... .* ...
BSA (Sigma, St . Louis, MO) . Para activar la liberación del superóxido, 100 µL de células fueron adicionadas a 100 µL de una solución de reacción conteniendo luminol 0.1 mM (Sigma, St. Louis, MO) , vanadato de sodio 0.5 mM (Sigma, St . Louis, MO) y cualquier mAb M22, H22, o 197, y fueron colocadas en el luminómetro a 22 °C. Las mediciones de la producción espontánea del superóxido se hicieron cada 30 a 40 segundos comenzando inmediatamente después de la adición de las células a la solución de reacción en el luminómetro. Para comparar el superóxido activado por el Fc?RI reticulador con M22, H22 ó 197, se utilizó cada mAb a una concentración de 10 µg/mL. La producción del superóxido en mV/segundo fue verificada durante 20 minutos. Los mAb M22, M32.2 y 197 fueron adicionados a diferentes concentraciones para establecer la dosis-respuesta de la producción del superóxido.
Resultados Genes de la región V de la Ig murina Se prepararon los cDNA de la región V de la Ig a partir del RNA del hibridoma M22 utilizando cebadores específicos para las regiones constantes pesada y kappa de murino y fueron amplificados por PCR con el uso adicional de una serie de cebadores basados en las secuencias de señales conocidas y/o secuencias 5' de las regiones V maduras. Los productos de la PCR de los tamaños esperados para VH y V? fueron obtenidos utilizando combinaciones de los cebadores SH2BACK/CG1FOR y VK7BACK/CK2FOR. El DNA amplificado fue digerido con enzimas de restricción adecuadas, clonado en M13 y la secuencia en ambas direcciones determinada a partir de cuando menos 24 clones independientes. Las secuencias de aminoácidos deducidas se muestran en las SEQ ID NOS: 29 y 30. Los cuatros residuos N-terminales de la V? son codificados por el cebador VKBACK.
Las VH y V? de M22 son miembros del subgrupo IIID de la cadena pesada y el subgrupo I K de murino (Kabat, E.
A. y col., (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. US Departament of Healt and Human Services), respectivamente. Además del residuo en L97, la secuencia de aminoácidos de la V? de M22 es idéntica a la del mAb A17 de anti-IgG murina (Shlomchik, M. y col., Variable región sequences of murine IgM anti-IgG monoclonal autobodies (rheumatoid factors) . II Comparison of hybridonias derived bylipopolsaccharide stimulation and secondary protein immunization, J. Exp. Med. 165: 970) .
£*»¿ Los mAbs humanizados y la caracterización inicial de su unión La FR de la VH de M22 mostró mayor homología (79%) para KOL (subgrupo III humano) que para NEWM (57%) (Subgrupo II) . Para observar como podría afectar la unión esta diferencia, las cadenas pesadas fueron construidas basadas en la VH de NEWM incluyendo los residuos murinos Phe27, Ile28 y Arg71, o en la VH de KOL sin aminoácidos de la FR murina. Ambas VH humanizadas fueron apareadas con la misma cadena ligera humanizada proveniente de REÍ.
La afinidad de los mAbs humanizados inicialmente fue evaluada por ELISA midiendo la unión a la proteína de fusión Fc?RI/cadena pesada de la IgM. Los datos mostraron que el mAb KOL VH/REI V? tuvo la misma unión que el mAb quimérico, mientras que el mAb NEWM VH/REI V? presentó una afinidad aproximadamente cinco veces menor. La unión baja de un mAb IgG 1 humano no específico mostró que >95% de la unión de los mAbs humanizados fue a través de la porción Fv en lugar de a través del dominio Fc.
Aunque se esperaría que cambios adicionales a la FR de NEWM restablecieran la afinidad de unión, estos podrían crear epítopes novedosos que podrían provocar una respuesta inmunológica no deseada. El mAb KOL VH/REI V?, denominado H22, por tanto, fue elegido para examen adicional de sus características de unión.
Caracterización funcional del mAbH22 Se realizó una serie de experimentos de unión para establecer la especificidad y el isotipo del anticuerpo H22. Leucocitos de sangre periférico teñidos con M22 o H22 conjugados con fluoresceína desmotraron unión 4 especifica a los monocitos con aproximadamente 10 sitios de unión por célula. Por el contrario, los linfocitos o neutrófilos no estimulados tuvieron poca o ninguna unión específica (Tabla 1): Tabla 1: Unión específica de H22 a los monocitos. sitios de anticuerpos por célula, promedio de duplicados -i 'i J.<t í Para demostrar que H22 se une a Fc?RI en el mismo sitio como M22 y que también se une como un ligando al dominio de unión Fc, se realizaron experimentos de competición con 2 mAb murinos anti-Fc?RI (M22 y M32.2) y un mAb IgG humano. Los H22 y M22 no conjugados compitieron igualmente para la unión de M22 fluoresceinado o H22 fluoresceinado en presencia de IgG humana en exceso que saturo los sitios de unión Fc sobre el Fc?RI. Como se esperaba, el anticuerpo anti-Fc?RI M32.2 que se une en un sitio diferente en el Fc?RI en comparación con M22 (Guyre, P. M. y col., J. Immunol. 143 : 1650) también fue incapaz de repetir con el M22- FITC. Además, la inhibición de H22-FITC por H22 y no por un mAb IgG 1 humano irrelevante confirmó la especificidad de la unión a Fc?RI a través de las regiones V del H22.
El H22, pero no el M22, fue capaz de competir para la unión mediada por Fc a Fc?RI mediante una IgG 1 humana fluoresceinada . Este experimento demostró que la porción Fc de H22, pero no la de M22, se une al dominio de unión Fc de Fc?RI . Esto es consistente con la capacidad de la porción Fc de los anticuerpos IgG 1 humanos, pero no de la IgG 1 murina, para unirse a Fc?RI con alta afinidad.
Ya que la humanización de M22 fue principalmente para aumentar su potencial inmunoterapéutico, la actividad de unión de H22 a los monocitos y neutrófilos activados con citokina se determinó en presencia de suero humano. El H22-FITC se unió con afinidad similar al Fc?RI sobre los monocitos en presencia o ausencia de suero humano. Por el contrario, la unión mediada por Fc de una IgG-FITC humana irrelevante fue completamente inhibida por el suero humano. Del mismo modo, el H22-FITC se unió con afinidad similar a los neutrófilos tratados con IFN-? en ausencia y en presencia de suero humano. En forma colectiva, los datos demuestran que H22 se une a través de sus regiones V a un sitio distinto del dominio de unión Fc y a través de su región Fc al dominio de unión al ligando de Fc?RI . La actividad de unión del primero supera eficazmente el bloqueo por anticuerpos de la IgG 1 humana.
Actividad funcional de los BsAb H22 La mayor aplicación de los anticuerpos anti-Fc?RI para inmunoterapia es el desarrollo de los BsAbs que ligan las células efectoras portadoras de Fc?RI a una célula tumoral, un virus, o una célula infectada por virus. Estos BsAb han sido desarrollados con M22; por tanto, se hizo una comparación de la capacidad de los BsAb antitumorales de M22 (520C9 x M22) y un BsAb de H22 correspondiente (520C9 x H22) para mediar la citotoxicidad. Estos BsAbs consistieron en el Fab' de H22 o de M22 químicamente conjugado al Fab' de un anticuerpo anti-HER2/neu (520C9) y así fueron específicos para la molécula Fc?RI activadora de las células efectoras y el antígeno tumoral.
La comparación de los BsAbs obtenidos de M22 y obtenidos de H22 se realizó por ensayos ADCC. Los BsAbs obtenidos de M22 y H22 mediaron la muerte de células SKBr-3 sobre-expresando HER2/neu. Ambos BsAbs murinos y humanizados presentaron niveles de lisis similares de células objetivo portadoras del antígeno. Además, ambos BsAb conservaron la actividad ADCC en presencia de suero humano, aunque el F(ab')2 de M22 en exceso originó completa inhibición de la muerte. Reunidos estos resultados muestran que la lisis inducida por BsAb H22 es mediada a través del epítope de M22 y que la ADCC es específica de Fc?RI .
Por último se evaluó la capacidad de H22 y M22 para estimular la producción de superóxido mediante la línea de células U937 tipo monocitos. El M22, que se une a Fc?RI solo por sus regiones V, indujo una explosión de oxígeno de muy bajo nivel, tal vez debido a que es incapaz de reticular el receptor con eficiencia. No obstante, el H22, que puede reticular el Fc?RI uniéndose como un ligando por su dominio Fc y, adicionalmente, como anticuerpo a través de su Fv, induce una liberación más substancial del superóxido.
Ejemplo 2 : Generación de una proteina de fusión funcional H22-factor de crecimiento epidérmico Materiales y métodos Vectores de expresión y clonación Los vectores de expresión para los clones genómicos de las cadenas pesada (pSVgpt) y ligera (pSVhyg) de H22 son como esta descrito en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/10332 titulada, An ti cuerpos Humani zados Para los Receptores Fc Para Inmunoglobulina G en Fagoci tos Mononucleares Humanos . Para la construcción de fusión Fab-ligando fue necesario alterar la cadena ligera. No obstante, para la cadena pesada los dominios CH2 y CH3 tuvieron que ser retirados y sustituidos con las secuencias codificantes de los ligandos. El vector de la cadena pesada contiene dos sitios BamRI , uno en el intrón entre VH y CH1, y el otro justo atrás de CH3. Utilizando los sitios de restricción BamHI, el DNA que codifica los dominios constantes fueron sustituidos por una versión truncada que codifica solo CH1 y la mayor parte de la bisagra. Al hacer esto, se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para manipular nuevos C terminales del fragmento de la cadena pesada con las alteraciones que se muestran en la Figura 1.
La construcción mostrada en la Figura 1 [C] , consistente en un codón de terminación de la traducción corriente abajo de los sitios de restricción de la clonación, Xhol y Notl , y corriente arriba de un sitio BamRI que fue utilizado para clonar el nuevo fragmento CHI generado por PCR corriente abajo de VH, se utilizó para generar las construcciones proteínas de fusión. Los sitios de clonación, que se ubican corriente debajo de la mayor parte de la bisagra para retener la flexibilidad entre los dominios Fd y el ligando, se utilizó para insertar DNA que codifica EGF u otros ligandos. Asimismo, el único residuo Cys ha sido conservado de la construcción anterior para permitir conjugación para la formación de moléculas diméricas.
Los DNA que codifican los ligandos fueron amplificados por PCR para tener un sitio Xhol en el N-terminal y un sitio Notl en el C-terminal de la región codificante, y luego fueron insertados en el marco de lectura adecuado en los mismos sitios del fragmento truncado de la cadena pesada de H22 recién manipulado antes descrito. El cD?A que codifica el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se obtuvo del ATCC (#59957) . Solo el D?A que codifica los 53 residuos de aminoácidos del EGF maduro de entre los aproximadamente 1200 precursores de residuos fue clonado comenzando con Asn 971 y terminando con Arg 1023 (Bell, G. I., Fong, ?. M. , Stempien, M. M. , Wormsted, MA., Caput, D. Ku. L., Urdea, M. S., Rail, L. B & Sánchez-Pescador, R. Human Epidermal Growth Factor Precurser: cD?A Sequence, Expression In Vitro and Gene Organization. ?ucl. Acids. Res. 14: 8427-8446, 1986) .
Expresión El mieloma murino ?SO (ECACC 85110503) es una línea no sintetizadora de Ig y se utilizó para la expresión de las proteínas de fusión. El vector de expresión final, ?^ ^^¡ una construcción pSVgpt con DNA codificando Fd de H22 fusionado en marco a EGF (mostrado en la Figura 2) fue transfectado por electroporación utilizando el pulsador BioRad Gene Pulser en NSO que había sido previamente transfectado con la construcción pSVhyg conteniendo el DNA codificante de la cadena ligera de H22. Estos polipéptidos fueron expresados por un promotor de Ig y un potenciador de Ig presentes en el vector, y secretados por el péptido señal de la cadena pesada del mAb 22 ubicado en el N terminal de las construcciones. Uno o dos días después de la transfección, ácido micofenólico y xantina fueron adicionados a los medios para seleccionar las células que tomaron el DNA. Se aislaron colonias en crecimiento individuales y fueron subclonadas después de haber demostrado por ELISA su actividad de unión.
Purificación Las células que expresaban la proteína de fusión H22-EGF fueron subclonadas y extendidas. El clon que expresaba la proteína de fusión fue extendido y crecido en cultivos en rotación y el sobrenadante fue clarificado y concentrado. La purificación a pequeña escala se realizó por cromatografía de afinidad sobre una columna con afinidad para anti-cadena kappa humana (Sterogene, Carlsbad, CA) . La proteína purificada fue analizada por SDS-PAGE en un gel con gradiente de acrilamida 5-15% en condiciones no reductoras. La Figura 3 es una representación esquemática de la generación de las 5 proteínas de fusión anti-receptor de Fc-ligando.
Citometría de flujo biespecífica • Para mostrar que la proteína de fusión puede unirse 10 a Fc?RI y a EGFR al mismo tiempo, se desarrolló un ensayo de citometría de flujo (Figura 4). En este ensayo diferentes concentraciones de la proteína de fusión H22- EGF o el anticuerpo biespecífico, BsAb H447 (H22 x H245, una versión humanizada del anticuerpo monoclonal murino 15 M425, que se une a EGFR en el sitio de unión al ligando (E. Merck) se incubó con células A431, una línea celular que expresa el receptor EGF (EGFR) (ATCC, Rockville, MD) . Después del lavado, se adicionó un sobrenadante que contenía una proteína de fusión consistente en el dominio 20 extracelular del Fc?RI y la porción Fc de la IgM humana. • Por último, se adicionó un mAb (32.2), etiquetado con ficoeritrina (PE), que se une a Fc?RI en un sitio que es distinto del que se une el mAb 22. Las células fueron luego analizadas mediante el FACSCAN. De otro modo, se 25 bloqueó la unión a EGFR mediante un exceso (100 µg/mL) 4„ fc.. •' ' "— ^| del mAb murino 425 (E. Merck) y la unión del bsAb o proteína de fusión se detectó mediante el anti-IgG humana etiquetado con PE.
ADCC La ADCC mediada por la proteína de fusión se • determinó utilizando un ensayo con 51Cr. La línea celular que sobre expresa EGFR, A431, se utilizó como objetivos 10 para lisis por los monocitos humanos cultivados en interferón gamma (IFN-?) durante 24 horas. Los objetivos fueron etiquetados con 100 µCi de 51Cr durante una hora • antes de la combinación con las células efectoras y los anticuerpos en una placa de microtitulación con fondo U. 15 Después de la incubación durante 5 horas a 37 °C, los sobrenadantes fueron recolectados y analizados por su radioactividad. Se calculó la citotoxicidad por la fórmula: % de lisis = (CPM experimental - CPM fuga del objetivo/CPM lisis con detergente - CPM fuga del 20 objetivo) x 100%. Lisis específica = % de lisis con • anticuerpo - % de lisis sin anticuerpo. La capacidad de la proteína de fusión para mediar ADCC se comparó con la de los BsAb respectivos. El ensayo también se realizó en presencia de 25% de suero humano para demostrar que la 25 IgG u otros factores encontrados en el suero humano no ^^u^?¡g^jgfa^^^^J^& inhiben la ADCC mediada por la proteína de fusión.
Resultados 5 Purificación Células NSO expresando la cadena kappa de H22 fueron • transfectadas con la construcción cadena pesada H22-EGF, y los clones seleccionados para resistencia al ácido 10 micofenólico y xantina fueron extendidos y la proteína de fusión fue purificada por afinidad a partir del sobrenadante en una columna anti-kappa humana (Sterogene, Carlsbad, CA) . La proteína purificada fue analizada por SDS-PAGE. La proteína purificada migró a un peso 15 molecular aparente de 50-55 kDa, indicando que la proteína de fusión se expresa como un monómero, no como un dímero ligado con disulfuro. Además, se observó una banda a un peso molecular aparente de 25 kDa y probablemente es la cadena ligera libre. 20 • Especificidad de unión Para demostrar que la proteína de fusión podría unirse a Fc?RI y EGFR al mismo tiempo se ideó un ensayo 25 FACS biespecífico. La Figura 5 muestra que el BsAb completamente humanizado, químicamente reticulado H447 (H22 (anti-Fc?RI) x H425), el cual se preparó como se describe en el siguiente Ejemplo 3, y la proteína de fusión H22-EGF se unen a EGFR en las células A431 y a Fc?RI soluble simultáneamente en un modo dependiente de la dosis.
La especificidad de la proteína de fusión para EGFR se demostró por la capacidad del mAb murino, M425, el cual se une a EGFR en el sitio de unión al ligando, para inhibir la proteína de fusión o la unión de H22 x H425. Diversas concentraciones del BsAb H447 o de la proteína de fusión H22-EGF fueron incubados con células A431 en presencia o ausencia de un exceso de M425. La Figura 6 muestra que la unión del BsAb y la proteína de fusión fueron inhibidas por M425, demostrando la especificidad de la proteína de fusión para EGFR.
ADCC Utilizando células A431 como objetivos se analizó la capacidad de la proteína de fusión para mediar ADCC. Monocitos humanos cultivados durante 24 horas en presencia de IFN-? fueron utilizados como células efectoras. La Figura 7 demuestra la lisis de células ? ? i ' . mtil mtái¡ A431, dependiente de la dosis, mediada por los anticuerpos completos, H425, los BsAb H447 (H22 x H425) y la proteína de fusión. La Figura 8 demuestra que aunque la ADCC mediada por los anticuerpos completos es inhibida por suero humano al 25% (25% HS) , la ADCC mediada por la proteína de fusión no fue inhibida por el suero humano y, en este experimento particular, la ADCC mediada por la proteína de fusión fue mejorada por el suero humano. Estos resultados dan soporte a la utilidad clínica de estas moléculas al demostrar que la proteína de fusión fue capaz de matar células que sobre expresan EGFR, incluso en presencia de células efectoras que expresan Fc?RI como estarían presentes in vivo.
Propiedades inhibidoras de crecimiento de las proteínas de fusión H22-EGF Aunque el EGF actúa para estimular el crecimiento de células normales que expresan los receptores para éste, el EGF también actúa para inhibir el crecimiento de células tumorales que sobre expresan EGF-R (Barnes, D. W. (1982) J. Cell Biol. 93: 1, MacLeod, C. L. y col., (1986) J. Cell. Physiol. 127: 175). La capacidad del EGF y de la proteína de fusión H22-EGF para inhibir el crecimiento de células A431 se examinó como sigue. 2 x 10 A431 fueron adicionadas a placas de seis pozos solo en medio completo o en medio conteniendo diversas concentraciones de EGF, H22-EGF, el fragmento Fab de H22, o el fragmento F(ab')2 de H425. Las células viables fueron contadas después de 7 días utilizando un hemocitómetro. Los análisis fueron realizados por duplicado y repetidos como promedios ± desviaciones estándar.
Los resultados se presentan en la Figura 9. Estos resultados indican que EGF y H22-EGF inhibieron significativamente el crecimiento celular en un modo dependiente de la dosis. Por el contrario, el fragmento F(ab')2 de H425, que tuvo alguna actividad inhibidora solo a concentraciones altas y el fragmento Fab de H22 no tuvo actividad inhibidora del crecimiento.
Así pues, la H22-EGF puede unirse al mismo tiempo a Fc?RI y a EGF, indicando que la molécula se había plegado adecuadamente y había mantenido la flexibilidad necesaria para unirse a ambos receptores al mismo tiempo. Además, la proliferación de la línea de células tumorales que expresan EGF-R, A431, inhibida por H22-EGF, indicando que, al igual que EGF, la proteína de fusión H22-EGF puede señalizar a través del EGF-R. La H22-EGF también media la muerte potente de células A431 en presencia de células efectoras que expresen Fc?RI . Así pues, la H22- EGF media ambos efectos citotóxico y citostático sobre células que expresan EGF-R. La administración de H22-EGF 5 a un individuo que tenga tumor originará el reclutamiento de células efectoras citotóxicas naturales del cuerpo para mediar la muerte de las células tumorales mediante potencialmente tres modos diferentes: citotoxicidad, inhibición del crecimiento y fagocitosis. Más aún, además 10 de la citotoxicidad mediada por las células de las células tumorales, las células efectoras reclutadas por H22-EGF también pueden además aumentar la inmunidad • antitumoral secretando citocinas inflamatorias y/o procesando y presentando antígenos tumorales a las 15 células T específicas del tumor.
Ej empl o 3 : La proteína de fusión H22- eregulina (H22- gp30) media la muerte de células tumorales 20 La heregulina (HRG) es un ligando para las moléculas • HER3 y HER4. Ambos receptores pueden formar heterodímeros con HER2, una molécula que es sobre expresada en algunas células cancerosas de mama. La afinidad de HRG para HER3 y HER4 aumenta de manera importante cuando estas células 25 forman heterodímeros con HER2. Este ejemplo demuestra que una molécula biespecífica, que comprende heregulina y una especificidad de unión para el Fc?RI inhibe el crecimiento de una línea de células tumorales y media citotoxicidad dependiente de la proteína de fusión de estas células en presencia de células efectoras citotóxicas portadores de Fc?RI.
La proteína de fusión H22-heregulina fue construida en el mismo modo como la proteína de fusión H22-EGF descrita en el Ejemplo 2. En resumen, DNA genómico que codifica el fragmento Fd del mAb anti-Fc?RI humanizado, H22, fue fusionado a cDNA que codifica el dominio EGF de la forma ß2 de HRG. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión H22-HRG (SEQ ID NO: 4) se muestra en la Figura 10. Esta proteína de fusión comprende los aminoácidos 171-239 de la heregulina ß2 mostrada en la Patente Estadounidense No. 5,367,060. Otras porciones de heregulina ß2, así como las porciones de otras moléculas heregulina, como las descritas en la Patente Estadounidense No. 5,367,060 también pueden utilizarse. El vector de expresión H22Fd-HRG resultante fue transfectado en una línea de células de mieloma previamente transfectadas con un vector que contenía DNA que codifica la cadena ligera kappa de H22. La proteína de fusión resultante fue expresada principalmente como un monómero, aunque la proteína contiene un residuo Cys libre en la región bisagra del componente Fab de H22. La citometría de flujo mostró que esta proteína de fusión pudo unirse a la línea de células tumorales que sobre 5 expresan HER2, SKBr-3, así como a células que expresan Fc?R.
Para probar la actividad biológica de la proteina de fusión H22Fd-HRG, sobrenadante de las células de mieloma 10 que expresan esta proteína de fusión fue diluido tres veces o 30 veces y adicionado a células PC-3 o células tumorales SKBr-3 expresando HER2, HER3 y HER4 en ^P presencia de monocitos tratados con IFN en una relación de 100:1 monocitos a células tumorales objetivo. Los 15 monocitos fueron tratados con IFN-? y las células objetivo fueron etiquetadas con Cr como se describe en el Ejemplo 2. Se calculó el porcentaje de lisis específica como se indica en el Ejemplo 2. Los resultados se presentan en la Figura 11. Los resultados indican que 20 aproximadamente 45% de las células SKBr-3 y hasta aproximadamente 49% de células PC-3 son usadas durante la incubación de las células con el sobrenadante diluido tres veces. 25 Esta proteína de fusión inhibe el crecimiento de las células tumorales SKBr-3 y media citotoxicidad dependiente de la proteína de fusión de estas células en presencia de células efectoras citotóxicas portadoras de 5 Fc?RI . Así pues, los resultados de este ejemplo muestran que una proteína de fusión anti-Fc?RI-heregulina puede mediar actividades citotóxicas antitumorales bajo • condiciones fisiológicas e indica que tal proteína de fusión tendrá utilidad terapéutica en el tratamiento de 10 diversos cánceres.
Ej emplo 4 : La proteina de fusión H22-bombesina media • la muerte de las células tumorales 15 La proteína de fusión H22-bombesina fue construida del mismo modo que la proteína de fusión H22-EGF antes descrita. No obstante, dado que la bombesina es un péptido corto (14 residuos de aminoácidos), en lugar de amplificar cDNA que codifica bombesina utilizando la 20 tecnología de la PCR, los oligómeros de DNA que codifican las hebras sentido y antisentido de bombesina fueron hibridados para crear la región codificante. La secuencia de aminoácidos del péptido bombesina fusionada al extremo carboxilo de la cadena pesada en el anticuerpo H22 es la 25 siguiente: -Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Gly (SEQ ID NO: 5) que corresponde a los aminoácidos 2-14 de bombesina (Anastasi y col., (1971) Experientia 27: 166) y contiene un residuo de glicina adicional en el extremo carboxilo del péptido. Los oligómeros tuvieron extremos traslapantes que no hibridaron sino que crearon extremos cohesivos para un sitio Xhol en el N-terminal y un sitio Notl en el carboxilo terminal de modo que se podía clonar en el vector de expresión de la cadena pesada de H22 antes descrito.
La actividad biológica de la proteína de fusión H22-bombesina en la muerte de células tumorales se investigó como ya se describió para las proteínas de fusión H22-EGF y H22-heregulina . En resumen, células tumorales PC-3 portadoras de receptores para bombesina fueron etiquetadas con Cr e incubadas con monocitos y diversas concentraciones de H22-proteína de fusión [sic] , y se determinó la lisis dependiente de la proteína de fusión como ya se describió. Los resultados, mostrados en la Figura 12, indican que las células objetivo se lisan y que el nivel de lisis de células objetivo aumenta proporcionalmente con la cantidad de la proteína de ~ L***^~. fusión adicionada al ensayo.
Las proteínas de fusión que tienen H22 como una entidad de unión y CD4 (recipendario de SIDA) o gpl20 (recipendario de SIDA) como una segunda entidad de unión también fueron producidas.
Ej emplo 5 : Producción de anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos humanizados, modificados Materiales y métodos Vectores de expresión y clonación Los vectores de expresión para los clones genómicos de las cadenas pesada (pSVgpt) y ligera (pSVhyg) del H22 fueron como se describe en la publicación de solicitud de Patente Internacional No. WO 94/10332 titulada, Anticuerpos Humanizados Para Receptores Fc Para Inmunoglobulina G en Fagoci tos Mononucleares Humanos . Para la construcción del Fab' , no fue necesario alterar la cadena ligera. No obstante, para la cadena pesada, los dominios CH2 y CH3 tuvieron que ser retirados y sustituidos con un codón de terminación. El vector de la cadena pesada contiene dos sitios BamHI , una en el intrón entre VH y CH1, y el otro justo corriente abajo de CH3. Al utilizar los sitios de restricción BamRI , el DNA que codifica los dominios constantes fueron sustituidos por una versión truncada que solo codifica CH1 y la mayor parte de la bisagra. Para hacer esto, se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para manipular los nuevos carboxilos terminales del fragmento de la cadena pesada con las alteraciones que se muestran en la Figura 1. La Figura 1 [B] muestra las alteraciones para la generación de una versión truncada con un solo sulfhidrilo.
Expresión El mieloma murino NSO (ECACC 85110503) es una línea no sintetizadora de Ig y se utilizó para la expresión del anticuerpo H22 modificado. El vector de expresión final, una construcción pSVgpt con DNA que codifica el fragmento Fd de H22 fue co-transfectado con la construcción pSVhyg conteniendo el DNA que codifica la cadena ligera de H22 por electroporación utilizando un BioRad Gene Pulser. Estos polipéptidos fueron expresados por un promotor de Ig y un potenciador de Ig presentes en los vectores, y secretados por el péptído señal de la cadena pesada del mAb 22 ubicado en el N-terminal de las construcciones. Uno o dos días después de la transfección, se adicionó ácido micofenólico y xantina al medio para seleccionar las células que captaran el DNA. Las colonias en 5 crecimiento individuales fueron aisladas y subclonadas después de que se demostró la actividad de unión para Fc?RI . • Purificación 10 La forma de un solo sulfhidrilo del anticuerpo H22 y el anticuerpo H425 completo (anti-EGFR) fueron producidas por cultivos in vi tro de las células NSO transfectadas, respectivas. El H425 fue purificado por cromatografía de 15 afinidad de la proteína A. La forma de un solo sulfhidrilo del anticuerpo H22 fue purificada por cromatografía de intercambio iónico utilizando Q- Sepharose seguida por SP-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . La pureza de la forma de un solo 20 sulfhidrilo del anticuerpo H22 fue evaluada por SDS-PAGE.
Generación de anticuerpos específicos (BsAb) Los BsAb fueron construidos utilizando el método de 25 Glennie y col., (Glennie, M. J. y col., (1987), 2 Preparation and Performance of bispecific F(ab' gamma) antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments, J. I munol . , 139: 2367). Se generó el F(ab')2 de H425 por proteólisis con pepsina, limitada en buffer de citratos 0.1 B, pH 3.5, y el F(ab')2 se purificó por cromatografía de intercambio iónico. Los mAbs fueron reducidos por adición de mercaptoetanolamina (MEA) 20 mM durante 30 minutos a 30 °C. Los fragmentos Fab' fueron aplicados a una columna Sephadex G-25 equilibrada en acetato de sodio 50 mM, EDTA 0.5 mM, pH 5.3 (4°C). Orto-fenilendimaleimida (o-PDM, 12 mM) disuelta en dimetilformamida y enfriada en un baño de metanol/hielo fue adicionada (medio volumen) al Fab' de H22 e incubada durante 30 minutos en hielo. El Fab' -maleimida entonces se separó de la o-PDM libre en una columna Sephadex G-25 equilibrada en acetato de sodio 50 mM, EDTA 0.5 mM, pH 5.3 (4°C). Para la preparación de los BsAb, se adicionó el Fab' -maleimida de H22 al Fab' de H425 en una relación molar 1.2:1. Los reactantes fueron concentrados en nitrógeno hasta el volumen inicial utilizando una membrana Diaflo en una cámara Amicon (todo a 4°C). Después de 18 horas se ajustó el pH a 8.0 con Tris-HCl 1 M, pH 8.0. La mezcla luego se redujo con MEA 10 mM (30 minutos, 30°C) y se alquiló con yodoacetamida 25 mM. El F(ab')2 biespecífico se separó de los Fab' sin reaccionar y otros productos mediante una columna Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en PBS.
Ci tometría de flujo biespecífica Para demostrar que los BsAb generados por el método de la o-PDM así como los generados por el método DTNB son capaces de unirse a Fc?RI y EGFR simultáneamente, se desarrolló un ensayo de citometría de flujo (Figura 13) . En este ensayo, diferentes concentraciones de los dos BsAb fueron incubadas con células A431, una línea de células que expresa el receptor EGF (EGFR) . Después del lavado, un sobrenadante que contenía una proteína de fusión consistente en el dominio extracelular de Fc?RI y la porción Fc de la IgM humana se incubó con las células. Por último, las células fueron incubadas con un anticuerpo específico de anti-IgM humana etiquetado con FITC. Las células fueron luego analizadas por FACSCAN.
ADCC La ADCC mediada por BsAb se determinó utilizando un ensayo de muerte Cr. La línea de células que sobre expresan EGFR, A431, se utilizó como los objetivos para lisis por monocitos humanos cultivados en interferón gamma durante 24 horas. Los objetivos fueron marcados con 100 µCi de 51Cr durante una hora antes de combinarse con células efectoras y el anticuerpo en una placa de microtitulación de base plana. Después de la incubación durante 16 horas a 37 °C, los sobrenadantes fueron recolectados y analizados para su reactividad. La citotoxicidad se calculó por la fórmula: % de lisis = (CPM experimental - CPM fugado del objetivo/CPM de la lisis con detergente - CPM fugado del objetivo) x 100%. La lisis dependiente de los Ab = % de lisis con anticuerpo - % de lisis sin anticuerpo.
Resultados Purificación Las células NSO fueron co-transfectadas con la construcción de la cadena pesada, truncada de H22 y la construcción de la cadena kappa intacta. Los clones seleccionados para la resistencia al ácido micofenólico y xantina fueron extendidos y la proteína fue purificada a partir del sobrenadante por cromatografía de intercambio iónico con una columna Q-Sepharose seguida por SP-Sepharose. La proteína purificada fue analizada por SDS-PAGE. La proteína purificada migró a un peso molecular aparente de 50 kDa, indicando que la proteína se expresa como un monómero, no como un dímero ligado con disulfuro.
Construcción y caracterización de un BsAb compuesto de H22 con un solo sulfhidrilo ligado a Fab ' del H425 (anti -EGFR) El BsAb fue construido donde la forma monosulfhidrilo de H22 fue ligada al fragmento Fab' de H425, un mAb anti-EGFR humanizado. El BsAb fue generado utilizando o-PDM como ligador por el método de Glennie y col., (Glennie, M. J. y col., (1987), preparation and 2 Performance of bispecific F(ab' gamma) antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments, J. Immunol. , 139: 2367). La actividad de este BsAb fue comparada con la de uno generado por el método DTNB utilizando los fragmentos Fab' preparados a partir de digestión con pepsina y reducción del H22 completo. Para demostrar que estos BsAb podrían unirse a Fc?RI y EGFR simultáneamente, se ideó un ensayo FACS biespecífico. La Figura 14 muestra que el BsAb ligado a o-PDM y el BsAb preparado por el método DTNB se unieron a EGFR en las células A431 y al Fc?RI soluble simultáneamente en un modo dependiente de la dosis.
Utilizando células A431 como objetivos se analizó la capacidad de los dos BsAb para mediar ADCC. Monocitos humanos cultivados durante 24 horas en presencia de IFN-? fueron utilizados como células efectoras. La Figura 15 5 muestra la lisis dependiente de la dosis mediada por los dos BsAb de las células A431 en un modo comparable. Estos resultados demuestran que los BsAb generados a partir de la forma monosulfhidrilo, truncada de H22 fue capaz de matar células que sobre expresan EGFR en presencia de 10 células efectoras que expresan Fc?RI .
Ejemplo 6: Producción de anticuerpos trivalentes Ma teriales y métodos 15 Líneas de células y anticuerpos M22, 520C9, H425 , SKBR3 y A431 M22 y 520C9 fueron purificados a partir del 20 sobrenadante de hibridoma por cromatografía de intercambio iónico (Pharmacia, Piscataway, NJ) y el 520C9 fue además purificado por cromatografía de afinidad de la proteína A (Pharmacia, Piscataway, NJ) . El H425 fue purificado a partir del sobrenadante de hibridoma por 25 cromatografía de afinidad de la proteína A (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Los hibridomas de murino productores de M22 y 520C9 fueron descritos anteriormente (Guyre y col., (1989) Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on FcgRI are able to tringger receptor function, 5 J. Immunol. 143: 5, 1650-1655; Frankel y col., (1985) Tissue ditribution of breast cancer-associated antigens defined by monoclonal antibodies, J. Biol. Response Modifiers, 4:273-286). Las células NSO de mieloma murino (ECACC 85110503) es una línea no sintetizadora de Ig y se 10 utilizó para la expresión de los mAb humanizados, H425 (Kettleborough y col., (1991) Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation, Protein Eng. , 4: 773) . Las células SKBr-3, (ATCC, Rockville, MD) una línea 15 de células de carcinoma de mama humano que sobre expresa el protooncogen HER2/neu, y células A431 (ATCC, Rockville, MD) , una línea de células de carcinoma escamoso humano que sobre expresa EGFR (ATCC; Rockville, MD) fueron cultivados en medio de Dulbecco modificado de 20 Iscove (MDM, Gibco, Grand Island, NY) . • Preparación de neutrófilos Se separan los neutrófilos de las células 25 mononucleares por separación en gradiente ficoll hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Para regular en forma ascendente los Fc?RI, los neutrófilos son tratados con citocinas. Se cultivan los neutrófilos durante 24-48 horas (37°C, 5% de C02) en un medio AIM V (Gibco, Grand Island, NT) conteniendo 2.5% de suero humano normal tipo AB (Sigma, St. Louis, MO) , 50 ng/mL G-CSF (amablemente proporcionado por R. Repp, U. de Erlanger, Alemania) y 100 IRU/mL de IFN-?.
Método de conj ugación Los BsAb fueron construidos utilizando el método de Glennie y col., (Glennie M. J. y col., (1987), 2 Preparation and performance of biespecific F(ab') , antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments. J. Immunol., 139 2367). Los mAbs M22, 520C9 (anti-HER2/neu, 33) y los anticuerpos H425 (anti-EGFR) fueron producidos por cultivos in vi tro de las células de hibridoma respectivas. El F(ab')2 de cada anticuerpo fueron generados por proteólisis de pepsina limitada en buffer de citratos 0.1 M, pH 3.5 y los F(ab')2 fueron purificados por cromatografía de intercambio iónico. Los mAb M22 y H425 fueron reducidos a Fab' mediante la adición de mercaptoetanolamina (MEA) 20 mM durante 30 minutos a 30 °C. Los fragmentos Fab fueron aplicados a una columna Sephadex G-25 equilibrada con acetato de sodio 50 mM, EDTA 0.5 mM, pH 5.3 (4°C). Para la preparación de los BsAb, el Fab' de M22-maleimida fue adicionada al Fab' de H425 en una relación molar 1:1. Los reactantes fueron 5 concentrados bajo nitrógeno al volumen inicial utilizando una membrana Diaflo en una cámara Amicon (todos a 4°C). Después de 18 horas se ajustó el pH a 8.0 con Tris-HCl 1 • M, pH 8.0. Luego se redujo la mezcla con MEA 10 mM (30 minutos, 30 °C) y se alquiló con yodoacetamida 25 mM. Los 10 F(ab')2 biespecíficos se separan de los Fab' sin reaccionar y otros productos mediante una columna Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en salina amortiguada con fosfatos (PBS) . El BsAb M22 x 520C9 se preparó en un modo similar excepto que se 15 utilizó 520C9 en lugar de H425.
El anticuerpo triespecífico compuesto de M22 x H425 x 520C9 se preparó en dos etapas (Figura 16) . En la primera etapa, M22 fue ligado a H425 como ya se describió 20 para crear el BsAb M22 x H425 excepto que en lugar de una reducción y alquilación final, los reactantes fueron tratados con DTNB para bloquear los grupos sulfhidrilos libres restantes. El BsAb bivalente fue purificado por filtración en gel sobre una columna Superdex 200, se 25 redujo a F(ab')2(SH) y se mezcló en una relación molar »-»Aa?l*a*-J -'^ uí.Jt,* ,..„*.-í..i.~* .,*. , «-a^_. __. -— . - - ,., .. - ^ ..-.^ -^ , _ - . ,.^.. - .... -_? * * I irrrMriiaaítt 1:1 con 520C9 tratado con o-PDM. El F(ab)3 triespecífico, resultante, fue purificado en una columna Superdex 200. El TsAb fue analizado por cromatografía de exclusión de tamaño HPLC utilizando una columna TSK 3000 (ToJo Haas, 5 Japón) . Al utilizar el mismo procedimiento como el anterior se había producido otro TsAb comprendido por m22 Fab' x 32.2 Fab' x m22 Fab'.
Citometría de flujo biespecífica 10 El TsAb puede unirse simultáneamente a EGFR y Fc?RI o puede unirse a HER2/neu y Fc?RI simultáneamente. Las • células A431 (células con elevada expresión de EGFR) o células SKBr-3 (células con alta expresión de HER2/neu) 15 fueron incubadas con diferentes concentraciones de BsAbs (M22 x 520C9 ó M22 x H425) o con el TsAb, M22 x H425 x 520C9. Las células fueron lavadas y luego incubadas con el Fc?RI soluble. La unión a Fc?RI soluble fue detectada con el mAb 32.2-FITC que se une al Fc?RI en un sitio que 20 es distinto del sitio de unión de 22. Las células luego fueron analizadas por FACSCAN. 25 t*ll? Í¡l*SmMtíHrr1 'b A . s ¡ -¡ «fcJS-.-s.uUA , .. . .. . . . . ......... .. * ..+ « ;^A. — » ...
ADCC Se utilizaron células SKBr-3 o A431 como objetivos para lisis por neutrófilos activados por citocina. Los 5 objetivos fueron etiquetados con 100 µCi de 51Cr durante una hora antes de la combinación con neutrófilos y anticuerpos en una placa de microtitulación de fondo U. Después de la incubación durante 16 horas a 37 °C, los sobrenadantes fueron recolectados y analizados para 10 reactividad. La citotoxicidad se calculó por la fórmula: % de lisis = (CPM experimental - CPM fugado del objetivo/CPM de la lisis del detergente - CPM fugado del objetivo) x 100%. Lisis específica = % de lisis con anticuerpos menos - % de lisis sin anticuerpo. Los 15 ensayos se realizaron por triplicado.
Ensayo de modulación del FcyRI Se utilizó el BsAb M22 x 32.2 x M22 para modulación 20 de Fc?RI sobre monocitos en sangre completa. El procedimiento del ensayo se muestra en el diagrama de flujo (véase la Figura 23A) . La Figura 23B muestra que el tratamiento con 10 µg/mL de este BsAb disminuyó la expresión de Fc?RI en monocitos en aproximadamente 50% 25 del nivel anterior al tratamiento con BsAb. • 'tn?í?tlrl»í1?Bll¡IT ?? i ? ¡ m A.A. I** * ., . .. ... . . __. *, . , ._ .. .. ...... . . . . .. . ...... ,-í.?, i : i l?TiÉüM«¡MÍI Resultados Construcción y caracterización bioquímica de los TsAb El TsAb se preparó de acuerdo con el diagrama de flujo representado en la Figura 16. En la primera etapa del procedimiento, M22 se acopló a H425, se trató con DTNB, y el F(ab')2 biespecífico, resultante, fue purificado por filtración en gel. En la segunda etapa, este F(ab' )2 biespecífico se redujo y mezcló con Fab' de 520C9 tratado con o-PDM originando el TsAb, M22 x H425 x 520C9. Este TsAb esta representado como un esquema en la Figura 17. En esta figura, el Fab' -A representa M22, Fab'-B representa H425 y Fab' -C representa 520C9.
Unión (Bs FACS) Para demostrar que el TsAb, M22 x H425 x 520C9, podría unirse a Fc?RI y a HER2/neu simultáneamente se ideó un ensayo FACS biespecífico. Este ensayo esta representado como un esquema en la Figura 18A. La Figura 19 muestra que ambos TsAb se unen a HER2/neu en las células SKBR-3 y al Fc?RI soluble simultáneamente en un modo dependiente de la dosis. El BsAb, M22 x H425, generó una señal insignificante en este ensayo sobre un amplio intervalo de concentraciones. Para demostrar que el TsAb, M22 x H425 x 520C9, podría unirse simultáneamente a Fc?RI y a EGFR se ideó un ensayo similar utilizando la línea 5 celular que sobre expresa EGFR, A431, en este caso. El ensayo esta representado como un esquema en la Figura 18B. La Figura 20 muestra que los TsAb y los BsAb, M22 x • H425, se unen a EGFR en las células A431 y al Fc?RI soluble simultáneamente en un modo dependiente de la 10 dosis. El BsAb, M22 x 520C9, generó una señal insignificante en este ensayo sobre un amplio intervalo de concentraciones.
ADCC 15 Se analizó la capacidad de los TsAb para mediar ADCC utilizando células SKBr-3 o A431 como objetivos. Como células efectoras fueron utilizados los neutrófilos humanos cultivados durante 24-48 horas en presencia de 20 IFN-? y G-SF. La Figura 21 demuestra que tanto los BsAb, • M22 x H425 x 520C9, y el TsAb, M22 x H425 x 520C9, median lisis de células SKBr-3, no así el BsAb, M22 x H425. Por otra parte, la Figura 22 demuestra que el BsAb, M22 x H425, y el TsAb, mediaron lisis de las células SKBr-3, no 25 así el BsAb, M22 x 520C9. Estos resultados demuestran que el TsAb fue capaz de aniquilar células que sobre expresan HER2/neu y EGFR en presencia de células efectoras que expresan Fc?RI . 5 El anticuerpo triespecífico antes descrito incluye M22, la versión murina del mAb anti-Fc?RI. Un anticuerpo triespecífico así podría ser construido utilizando la forma con un solo sulfhidrilo del mAb anti-Fc?RI humanizado, H22. La única diferencia siendo que la forma 10 de un solo sulfhidrilo es secretada como fragmento F(ab')2 de este anticuerpo. La forma de un solo sulfhidrilo se purifica a partir de sobrenadantes de cultivo utilizando cromatografía de intercambio iónico con Q-Sepharose seguido por SP-Sepharose (Pharmacia, 15 Piscataway, NJ) . Una vez que la forma de un solo sulfhidrilo del H22 se purifica, la creación de un anticuerpo triespecífico utilizando este reactivo sería idéntica a la antes descrita utilizando el fragmento F(ab' )2 de M22. 20 Ej emplo 7: Mejor Presentación del antigeno con las proteinas de fusión H22-antigeno Este ejemplo demuestra que: (a) los péptidos 25 antigénicos generalmente injertados sobre la región ^ ___¡___| ÍÉÉ>aBaa^ai«¿Íi^É?j .. ^.^..... ^ ., .. . ........-_,... . __. ,*». ?*¡?* L sa?m**~*. <k~?MA** *t Aifct. constante de un anticuerpo anti-Fc?RI son significativamente más eficientes en la presentación del antígeno del antígeno y la estimulación de las células T, en comparación con el antígeno solo, y (b) que los péptidos antagonistas generalmente injertados sobre la región constante de un anti-Fc?RI son significativamente más eficientes en la inhibición de la estimulación de las células T en comparación con el péptido antagonista solo. Así pues, tales proteínas de fusión aumentarán eficazmente el suministro de péptidos a las células presentadoras de antígeno. (APC) in vivo y serán útiles en diferentes métodos terapéuticos.
Materiales y métodos Reactivos Como medio de cultivo se utilizó AIM V (GIBCO, Grand Island, NY) . El toxoide tetánico (TT) se compró de ACCURACTE CHEMICAL CO. (Westbury, NY) . El fragmento F(ab')2 estéril y bajo en endotoxinas del mAb 22 anti-Fc?RI de ratón y el Ab, biespecífico MDXH210 (consistente en el Fab' de Ab 22 humanizado ligado químicamente al Fab' del mAb del Ag de tumor anti-HER2/neu, 520C9) fueron proporcionados por MEDAREX, INC. (Annandale, NJ) . El epítope Th universal de la TT, TT830-844 (QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 6), mencionado en adelante como TT830) (Valmori D. y col., (1994) J. Immunol . 152: 2921-29) y la forma mutante de este epítope, TT833S (QYISANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9) , lisina en la posición 833 cambió en serina) fueron sintetizados y purificados para >95% por PEPTIDOGENIC CO. (Livermore, CA) . Otro epítope Th universal de TT, TT947-967 (FNNFTVSF WLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 12), mencionado en adelante como TT947), (>80% de pureza) (Valmori D. Supra ) se utilizó como péptido control en este estudio. La IgG humana disponible en el comercio para inyección intravenosa (IVI) se utilizó en experimentos de bloqueo.
Células La línea de células monocíticas, U937, que expresan Fc?RI, se obtuvo del ATCC. El método para generar las células T específicas el péptido TT830, CD4 , fue modificado del protocolo antes descrito para las líneas de células T específicas de TT (Grosselin E. J. (1992) J. Immunol . 149: 3477-81). En resumen, las células mononucleares fueron aisladas de sangre periférica utilizando Ficoll Hypaque. 150 x 10 células mononucleares fueron estimuladas en 50 mL de medio AIM V con TT830 10 µM. Después de un periodo de incubación de tres días a 37 °C en un incubador con 5% de C02, las no unidas (principalmente células no específicas) fueron retiradas lavando el matraz IX con 10 mL de medio RPMI 1640 amortiguado con HEPES; las colonias de células T especificas junto con los monocitos adherentes permanecieron en el matraz. 50 mL de medio AIM V más 20 U/mL de IL-2 humana (IMMUNEX, Seattle WA) , y 1 mL (2% concentración final) de suero humano combinado fueron adicionados nuevamente al matraz. Después de 10-14 días del tiempo de incubación total, las células T fueron cosechadas y las células muertas fueron empaquetadas a través de Ficoll Hypaque, produciendo una población altamente enriquecida (95-98%) de células T específicas del Ag, CD4 , viables. Se confirmó que las células T eran específicas para el péptido TT830 como se muestra en la Figura 3. Grandes cantidades de monocitos fueron purificadas de paquetes de leucoforesis utilizando el método de agregación en frío (Mentzer, S. J. y col., (1986) Cell. Immunol. 101: 132) el cual produjo 80-90% de pureza. Los monocitos y las células T fueron congelados en alícuotas para uso futuro y se mostró que funcionaron normalmente después de ser descongeladas.
Ensayo de presentación del Ag En ensayos de proliferación, las células T (5 x 104), monocitos irradiados (3000 rad, 10 /pozo) y diferentes concentraciones de la proteína de fusión al péptido TT830, Fab22-TT830, fueron incubados juntos en un volumen final de 200 µL/pozo en placas de cultivo tisular de 96 pozos, de fondo plano, durante 2 días. Luego se adicionó a cada pozo 10 µL (1 µCi/pozo) de H-timidina. Después de la incubación durante la noche, las placas fueron cosechadas y contadas en un contador de centelleo líquido. La proliferación de las células T fue expresada como la cuenta promedio/min (CPM) de tres duplicados ± DE. Las CPM del fondo (células T y monocitos sin Ag) fueron restadas de todos los puntos de datos. Los experimentos con APL se realizaron de acuerdo con los protocolos similares reportados por Sette y col., (DE Magistris (1992) Cell 68: 625). En resumen, para los ensayos de inhibición, los monocitos irradiados fueron tratados con diferentes concentraciones de TT833S o Fab22-TT833S durante la noche. Luego se adicionó TT830 20 nM y células T. Después de un periodo de incubación de 2 días más, se midió la proliferación de células T como ya se describió. En experimentos "previos a la pulsación", los monocitos irradiados fueron pulsados con TT830 20 nM ¿ .i . 4 horas antes de la adición de TT833S 10 µM o Fab22-TT833S 0.1 µM. Después de la incubación durante la noche, entonces fueron adicionadas las células T. Después de otros 2 días de incubación, las células T fueron estimuladas con monocitos irradiados y TT833S o Fab22-TT833S durante un día, fueron recuperadas después de centrifugación sobre Ficoll Hypaque, y nuevamente estimuladas con monocitos y diferentes concentraciones de TT830 durante 2 días. Luego se midió la proliferación de 3 células T por la incorporación de H-timidma y se gráfico las CPM promedio de tres duplicados. En algunos casos, el porcentaje de inhibición se calculó mediante la fórmula % de inhibición = (CPMs?n inhibidor CPM?nhlbldor) /CPM s?n mhi idor x 100. Todos los experimentos fueron repetidos cuando menos tres veces.
Tinción y ci tometría de flujo Los procedimientos de tinción fueron adaptados de los anteriormente descritos (Gosselin E. J. y col, (1990) J. Immunol . 144-1817-22). En resumen, a los pozos individuales de una placa de 96 pozos a 4°C, 30 µL de RPMI + mg/mL de BSA conteniendo una de las proteínas Fab22-TT830, Fab22-TT833S o el BsAb MDXH210 en diferentes concentraciones [sic] . Después de una hora de incubación a 4°C, las placas fueron centrifugadas, se desecharon los sobrenadantes y las células fueron lavadas tres veces con PBS/BSA a 4°C. Luego las células fueron incubadas durante una hora con 40 µL/pozo de IgG anti-humana de cabra F(ab')2 etiquetado con FITC (JACKSON IMMUNORESEARCH LOBORATORIES, INC. West Grove, PA) seguido por tres lavados con PBS/BSA y resuspendidas en PBS/BSA conteniendo 1% de paraformaldehído (KODAK, Rochester, NY) . Entonces las células fueron examinadas por FACScan (BECTON DICKINSON & CO., Mountain View, CA) , y se midió la intensidad promedio de la fluorescencia (MFI) .
Medición de la a tocina Los sobrenadantes fueron recolectados de las placas de 96 pozos de los ensayos de presentación del Ag después de 2 días de estimulación y fueron congelados hasta su uso. Se midieron las concentraciones de IFN-? y de IL-4 a partir de estas muestras por ELISA específico. Los pares de Ab para el ensayo ELISA específico para IFN-? e IL-4 fueron adquiridos de PHARMINGEN (San Diego, CA) los ensayos ELISA se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante.
Generación de las proteinas de fusión H22-péptido TT Con el fin de generar proteínas de fusión Fab22- TT830 y Fab22-TT833S, oligonucleótidos sintéticos que codifican cada péptido fueron manipulados por separado en la región bisagra en la cadena pesada del mAb anti-Fc?RI humanizado 22 (H22) de acuerdo con el método que se menciona más adelante.
Vectores de expresión y clonación El mAb 22 había sido humanizado injertando sus regiones CDR en un entramado de IgGl humana (véase en lo anterior y en Graziano R. F. y col., (1995) J. Immunol. 155: 4996-5002). El vector de expresión para el clon genómico de la cadena pesada (pSVgpt) de H22 fue modificado para permitir la incorporación de la secuencia codificante para otras moléculas, en este caso, los péptidos TT. El fragmento BamHI de este vector que contiene CH1, bisagra y sitios de clonación Xhol y Notl recién manipulados (véase la Figura 2) fue insertado en el sitio BamHI de pUC19 para generar el vector pUC19/H22CHl (X+N) . Este vector se utilizó para clonar secuencias de oligonucleótidos que codifican los péptidos TT, como se describe más adelante.
Las secuencias de oligonucleótidos que codifican los péptidos de la toxina tetánica (TT) fueron diseñadas para tener un sitio Xhol en el N-terminal y un sitio Notl en el carboxilo terminal de la región codificante (Figura 24A) . Estos oligonucleótidos fueron sintetizados y purificados por GENOSYS Biotechnologies (The Woodlands, TX) . Los oligonucleótidos sintéticos fueron entonces templados y ligados en el vector de clonación pUC19/H22CHl (X+N) . Los clones que se habían incorporado a las secuencias codificantes para los péptidos TT fueron detectados por mapeo de restricción. El fragmento BamHI conteniendo CH1, bisagra y TT830 o TT833S entonces fue cortado del pUC19 e insertado en el vector de expresión que ya contenía VH. La construcción de expresión final de la cadena pesada de H22 fusionada con los péptidos de TT se muestra en la Figura 24B.
Expresión de las proteínas de fusión H22-TT El mieloma murino NSO (ECACC 85110503) es una línea que no sintetiza Ig y se utilizó para la expresión de las proteínas de fusión H22-TT. Primero, las células NSO fueron transfectadas con el vector pSVhyg conteniendo la secuencia codificante de la cadena ligera de H22. Las células NSO que expresaban la cadena ligera de H22 fueron luego transfectadas con la construcción del vector de expresión conteniendo la secuencia Fd de la cadena H de H22 fusionada en el marco a las secuencias codificantes de TT (Figura 24B) . Se utilizó un aparato de electroporación BioRad Gene Pulser para realizar la transfección empleando 200 v y 960 µFard. Uno o dos días después de la transfección se adicionó al medio ácido micofenólico (0.8 µg/mL; SIGMA) y xantina (2.5 µg/mL; SIGMA) para seleccionar los transfectantes que habían captado con éxito los vectores de expresión. Se aislaron las colonias individuales con base en la actividad de unión de los sobrenadantes del cultivo al Fc?RI en las células U937 según se demuestra por citometría de flujo. Las colonias positivas fueron subclonadas por dilución limitante.
Purificación de las proteínas de fusión Fab22-TT El clon pW5 que expresa la proteína de fusión Fab22-TT830 y el clon pM4 que expresa la proteína de fusión Fab22-TT833S fueron extendidos en cultivos en botellas rotatorias. Los sobrenadantes fueron clarificados y concentrados. La purificación a escala pequeña se realizó por cromatografía de afinidad en una columna de afinidad anti-H22. El análisis SDS-PAGE de un gel en gradiente de acrilamida de 5-10% bajo condiciones no reductoras mostró que las proteínas de fusión fueron > 90% puras y tuvieron un peso molecular de 50 kDa como se esperaba. La concentración de la proteína se determinó por absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción del Fab' de la IgG = 1.53.
Resultados Las proteínas de fusión H22Fd-TT se unen a las células U937 Primero se examinó la capacidad de las proteínas de fusión de H22, Fab22-TT830 y Fab22-TT833S, para unirse a Fc?RI . Como control positivo se utilizó un Ab biespecífico anteriormente descrito, MDXH210, el cual contiene el mismo componente de unión a Fc?RI (el Fab' del mAb 22 humanizado) (Valone F. H. y col., (1995) L Clin. Oncol. 13: 2281-92), la unión de las proteínas de fusión y MDXH210 a las células U937, que expresan constitutivamente Fc?RI, se midió por tinción con el Ab de cabra etiquetado con FITC específico para IgG humana y citometría de flujo. Como se indica en las Figuras 24A y 24B, las proteínas de fusión Fab22-TT830 y Fab22-TT833S se unieron a las células U937 en un modo dependiente de la dosis similar a MDXH210. La unión de las proteínas de fusión fue bloqueada completamente por el F(ab')2 de mAb 22 anti-Fc?RI humano de murino, demostrando la especificidad de las proteínas de fusión para Fc?RI .
Las proteinas de fusión H22Fd-TT mej oran la presen tación del péptido TT de 100 a 1000 veces La proteína de fusión, Fab22-TT830, se utilizó en los ensayos de presentación del Ag para determinar si el epítope Th, TT830, cuando se expresa en la región constante de H22, podría ser presentado eficazmente por los monocitos a las células T autólogas. Como se muestra en la Figura 26, se requirió aproximadamente 1000 veces menos Fab22-TT830 que el péptido TT830 solo para obtener el mismo nivel de proliferación de células T. Además, la Figura 26 muestra que la presentación de Fab22-TT830 fue aproximadamente 10,000 veces más eficaz que la presentación de la TT intacta, sugiriendo que la presentación mejorada de Fab22-TT830 no resulta simplemente del mayor peso molecular ni de la estabilidad incrementada de Fab22-TT830 contrario al péptido TT830. Otro epítope de TT antigénico, TT947, falló en estimular las células T, confirmando que las células T fueron específicas para el péptido TT830. Estos resultados de este modo proporcionan evidencia clara que los epítopes Th expresados en la región constante de H22 pueden ser presentados eficaz y específicamente.
El bloqueo de FcyRI en monoci tos anula el mej oramiento de la presen tación del Ag por la proteina de fusión H22Fd-TT Para determinar directamente si el mejoramiento de la presentación del péptido a través del uso de la proteína de fusión es mediada por Fc?RI, la unión de Fab22-TT830 al Fc?RI en los monocitos presentadores de Ag se bloqueó tratando los monocitos con el F(ab')2 del mAb 22 durante una hora antes de la adición de Fab22-TT830 los péptidos TT830. El mejoramiento de la presentación del péptido o la proteína de fusión fue anulado por el F(ab')2 del mAb 22, mientras que la presentación de TT830 no fue afectada (Figura 27). El hecho que la unión del F(ab')2 del mAb 22 al Fc?RI no dio origen a un mejoramiento de la presentación de los péptidos libres implica que la unión del mAb 22 a Fc?RI solo no alteró el estado funcional de los monocitos en un modo que mejore la presentación de Ag. Por tanto, el enlace del péptido al Ab 22 anti-Fc?RI parece ser necesario para los efectos de mejoramiento observados sobre la presentación del Ag, sugiriendo que la presentación mejorada probablemente es un resultado de la captura eficiente del Ag a través del Fc?RI .
El mej oramiento de la presentación del péptido por H22 no se afecta por la presencia de IqG humana En condiciones fisiológicas, el dominio de unión al ligando del Fc?RI se satura por IgG la cual bloquea la orientación eficiente del AgAb a este receptor. Una ventaja única para utilizar derivados de mAb 22 para activar la función del Fc?RI es que Ab 22 se une a un epítope fuera del dominio de unión al ligando. Por tanto, las funciones accionadas por el mAb 22, como puede ser la ADCC, fagocitosis y presentación del Ag no se inhibieron por las concentraciones fisiológicas de IgG (Gosselin E. J. supra , Guyre P. M. (1989) J. Im unol . 143-1650-55). Del mismo modo, la presentación mejorada del péptido TT830 utilizando la proteína de fusión Fab22-TT830 no se inhibió por la IgG (Figura 28), sugiriendo que la proteína de fusión a base de H22 también es un modo eficaz para dirigir los Ag peptídicos al Fc?RI in vivo .
La producción de IFN-y y de IL-4 se incrementa después de la presentación del Ag mej orada de la proteína de fusión H22Fd-TT 5 Después de la activación, las células T no solo sufren expansión clonal a través de proliferación, sino también producen citocinas como IFN-? e IL-4 para ejercer su función efectora de la diferenciación de las células B y la activación de los monocitos (Paul W. E. y Seder, R. 10 A. (1994) Cell 76: 241-251). Por tanto, se examinó la producción de IFN-? y de IL-4 después de la presentación del Ag mejorada de la proteína de fusión con H22. Como se muestra en las Figuras 28A y 28B, los niveles de producción del IFN-? y de IL-4 fueron mejorados por 15 Fab22-TT830, en especial en concentraciones subóptimas del Ag. No obstante, en estos experimentos, el mejoramiento para la producción de las citocinas (aproximadamente 20 veces) fue menor que para la proliferación de las células T (aproximadamente 600 20 veces) . • Así pues, los epítopes Th expresados en la región constante del mAb H22 anti-Fc?RI pueden ser procesados eficazmente y presentados por monocitos humanos, 25 originando activación mejorada de células T y producción de citocina.
La presentación de APL, TT833S ? Fab22-TT833S fracasa en estimular la proliferación de células T Se ha demostrado que los péptidos que contienen uno o dos cambios de aminoácidos a partir de los epítopes de células T nativas, denominados Altered Peptide Ligands (APL) Ligandos de Péptidos Alterados (Alien y colaboradores), son agonistas parciales o antagonistas para las células T (Sette y col., (1994) Ann. Rev. Immunol . 12: 413 y Evavold y col., (1993) Immunol Today 14: 602) . El reconocimiento de los APL por parte de las células T específicas a través de las TCR en algunos casos activó la transducción de la señal parcial y dio origen a: (i) inhibición de la estimulación de las células T por el superantígeno (Evavlold y col., (1994) Proc. Nati. Acad. Sci USA. 91: 2300), anergia de células T (Sloan-Lancaster y col., (1993) Nature 363: 156 y Sloan-Lancaster y col., (1994) J. Exp. Med. 185: 1195), o (iii) modulación de la diferenciación Thl/Th2 (Nicholson y col (1995) Immunity 3: 397; Pfeiffer y col., (1995) J^ Exp. Med. 181: 1569; y Windhagen y col., (1995) Immunity 3: 373). Se ha demostrado que los agonistas parciales estimulan algunas funciones de células T como puede ser . i. -*.MÜUÍ la producción de IL-4 por las células T, pero no otras como la proliferación de las células T (Evabold y col., (1991) Science 252: 13808). Los agonistas parciales también pueden inducir anergia. Ciertos APL no activan ningún suceso de señalización detectable con la interacción con TCR, pero pueden funcionar como antagonistas de TCR para inhibir la proliferación de células T en respuesta al antígeno peptídico tipo nativo y de este modo se denominan antagonistas de la TCR (DeMagistris y col., (1992) Cell 68: 625 y Ruppert y col., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2671.
Este ejemplo demuestra que el péptido TT833S, un péptido antagonista para el epítope TT830 de células T de la toxina tetánica y la Fab22-TT833S fracasan en estimular la proliferación de las células T. Como se muestra en la Figura 30, incluso con dosis tan altas como 100 µM para TT833S y 1 µM para Fab22-TT833S, no se observó proliferación significativa de células T específicas de TT830. Esto indica que el cambio de lisina a serina en la posición 833 del péptido TT830 eliminó la reactividad de las células T de este epítope de células T. Además, cuando los péptidos TT830 y TT8833S fueron presentados simultáneamente a las células T específicas de T830, la proliferación de las células T en respuesta a TT830 se inhibió por TT833S en un modo dependiente de la dosis, mostrando que TT833S puede funcionar como antagonista para las células T específicas de TT830 (Figura 31) . 5 Fab22-TT833S es cuando menos 100 veces más eficaz que TT833S en la inhibición de la activación de las • cél ulas T 10 Este ejemplo compara la eficacia relativa de TT833S y Fab22-TT833S en la inhibición de la proliferación de células T en respuesta a TT830. Como se muestra en la • Figura 32, Fab22-TT833S fue aproximadamente 100 veces más eficaz que TT833S en la inhibición de la proliferación de 15 células T estimulada por TT830. Esto sugiere que el APL, TT833S, cuando se expresa en la región constante del mAb H22, puede ser presentado correcta y eficazmente por las APC. La eficacia antagonista incrementada de la proteína de fusión Fab22-TT833S sobre la proliferación de las 20 células T probablemente refleja una captura más eficiente • del Ag mediada por Fc?RI en comparación con los péptidos libres . 25 La inhibición de la activación de las células T es mediada por la competición por la unión al receptor de células T en l ugar de por la unión del MHC clase II Los efectos antagonistas del APL TT833S y la proteína de fusión Fab22-TT833S podrían ser a través de la competición a nivel de la unión al MHC o de la unión a TCR, o ambos. Para obtener una idea de los mecanismos involucrados, se realizaron experimentos "pre-pulsación", descritos por primera vez por Sette y colaboradores (DeMagistris, M. T. y col., (1992) Cell 68: 625-634), este ambiente experimental permite al agonista (TT830) unirse al MHC clase II en ausencia de competición del inhibidor (TT833S) y así, solo los antagonistas de TCR pero no los bloqueadores de MHC puros serían eficaces en la inhibición de la proliferación de células T estimuladas por el agonista. Los monocitos presentadores de Ag fueron pulsados con TT830 subóptimo (20 nM) durante 4 horas para permitir que TT830 se una con MHC clase II en ausencia de competición por parte de TT833S. El APL, TT833S o Fab22-TT833S, entonces fue incubado con los monocitos pre-pulsados durante 16 horas adicionales. Se adicionaron células T sensibles y se midió su proliferación como ya se describió. Incluso en condiciones tales donde el bloqueo del MHC desempeña una función mínima, la proliferación de las células T todavía fue inhibida (Figura 33) . Así pues, parece ser que la inhibición es un resultado de la competición por el receptor de las células T en lugar de por la unión al MHC clase II.
La presentación de TT833S ? Fab22-TT833S falla en estimular la producción de IL-4 e IFN-y por la células T En algunas circunstancias, el APL puede estimular la producción de citocinas pero no la proliferación de las células T (Evavold B. D. y Alien P. M. (1991) Science 252: 1308-1310). Para determinar si la presentación de TT833S estimula la producción de citocinas, se determinó el nivel de IL-4 y de IFN-? en los sobrenadantes obtenidos de los ensayos de presentación del Ag. Como se muestra en la Figura 34, TT833S y Fab22-TT833S fueron ineficaces en estimular la producción de IFN-? y de IL-4 por las células T.
La presentación de TT833S y de Fab22-TT833S no da origen a anergia de las células T Alien y colaboradores reportaron que la interacción de TCR con algunos complejos APL-MCH clase II condujo a la anergia de las células T (Sloan-Lancaster J. y col., (1993) Nature 363: 156-159, Sloan-Lancaster J. y col., (1994) J. Exp. Med. 180: 1195-1205). Un esquema experimental similar al de ellos se utilizó para 5 determinar si la presentación de TT833S también podría causar anergia de células T. Como se muestra en la Figura 35, cuando las células T fueron recuperadas después de incubación con APC y TT833S o Fab22-TT833S durante un día, 2 días, o 4 días, éstas respondieron al desafío 10 antigénico subsiguiente así como las células T que habían sido incubadas solo con APC. Por tanto, el antagonista, presentado por el uso del péptido solo o Fab22-TT833S no • produjo anergia de células T. Además, el mismo porcentaje de las células T viables (aproximadamente 50%) fue 15 recuperado de los cultivos sin péptidos, TT833S o Fab22- TT833S, sugiriendo que la presentación de TT833S tampoco aumentó la muerte de las células T.
La observación que la inmunogenicidad se incrementa 20 en aproximadamente 1000 veces por péptidos antigénicos • orientadores para Fc?RI utilizando una proteína de fusión basada en mAb 22 anti-Fc?RI indica que tales proteínas de fusión serán útiles para vacunas a base de péptidos, por ejemplo, enfermedades infecciosas y cáncer. Los péptidos 25 manipulados en los dominios constantes del mAb humano que son específicos para las moléculas de superficie de las APC particulares representan un enfoque general para aumentar la potencia antigénica para las vacunas basadas en péptidos. 5 Más aún, la observación que el péptido antagonista dirigido a Fc?RI inhibió la proliferación de las células T específicas de TT830 incluso cuando las APC fueron pulsadas primero con el péptido nativo, una situación 10 comparable con la que se encontraría in vivo cuando se intenta aminorar una respuesta auto-inmune, muestra que la presentación dirigida de los péptidos antagonistas • puede utilizarse como terapias específicas del Ag para trastornos, por ejemplo, las enfermedades auto-inmunes 15 mediadas por las células T. El tratamiento a base de APL proporcionará una inmunoterapia específica del antígeno para enfermedades autoinmunes mediadas por células T como puede ser la artritis reumatoide y esclerosis múltiple. Además, el uso de una proteína de fusión que tenga una 20 especificidad de unión para un Fc?RI y un péptido que sea un agonista parcial de un antígeno involucrado en los trastornos inmunes caracterizados por respuestas inmunes excesivas será útil en el tratamiento de estos trastornos inmunes induciendo anergia específica del antígeno. Así 25 pues, la invención proporciona los métodos para tratar diversos trastornos inmunológicos proporcionando un método que permita la presentación de antígeno mejorada de los antígenos, que estimulen las células T, que bloqueen la proliferación de las células T y/o la 5 secreción de citocinas o que induzcan anergia en las células T.
• Ejemplo 8 : Moléculas biespecificas anti-Fc?RI- anti-CEA monocatenarias , funcionales 10 Este ejemplo demuestra que una molécula monocatenaria, biespecífica, recombinante que comprenda un anticuerpo anti-Fc?RI humanizado fusionado a un anticuerpo anti-carcinoembriónico (anti-CEA) es capaz de 15 unirse a Fc?RI y a CEA.
La Figura 37 es una representación esquemática de construcciones de expresión de mamífero que codifican moléculas monocatenarias biespecíficas (construcciones 20 321 y 323) que tienen una especificidad de unión para el • Fc?RI y una especificidad de unión para el antígeno carcinoembriónico (CEA) que fueron preparados. La secuencia de aminoácidos de la molécula monocatenaria, biespecífica H22-anti-CEA codificada por la construcción 25 321 (SEQ ID NO: 16) y el ácido nucleico que codifica esta proteína de fusión (SEQ ID NO: 15) se muestran en la Figura 40. La molécula monocatenaria, biespecífica H22-anti-CEA codificada por la construcción 323 difiere de la proteína de fusión codificada por la construcción 321 solo en que están intercambiadas las cadenas VH y VL del H22.
También se preparó una construcción de expresión de mamífero que codifica un anticuerpo monocatenario teniendo una especificidad de unión para el Fc?RI (construcción 225). La secuencia de aminoácidos del anticuerpo H22 monocatenario codificada por la construcción 225 (SEQ ID NO: 14) y el ácido nucleico que codifica este anticuerpo monocatenario (SEQ ID NO: 13) se muestran en la Figura 39.
Cada una de estas construcciones fue clonada en los sitios Hind III y Xbal del pcDNA3 (InVitrogen), a partir del cual se impulsa la expresión desde el promotor CMV. Cada una de estas construcciones también contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido a partir de c-myc y un péptido hexa-histidina, los cuales fueron utilizados para la purificación de la proteína recombinante a partir del cultivo celular. La etiqueta c-myc corresponde a los aminoácidos 410 a 420 de c-myc humana (Evan y col., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 3610). El anticuerpo monocatenario anti-CEA, denominado MFE-23, además está descrito en Casey y col., (1994) J. Immunol Methods 179: 105 y Chester y col., (1994) Lancet 343: 455.
Las moléculas biespecíficas, monocatenarias H22- anti-CEA y el anticuerpo H22 monocatenario fueron utilizadas en los ensayos de unión que se realizaron como sigue. Placas ELISA se cubren con CEA y se bloquean con PBA al 5%. Los sobrenadantes de las células transfectadas con las construcciones que codifican las moléculas monocatenarias (transfectomas) fueron adicionadas a las placas, se adicionó Fc?R Fc?RI soluble/IgM-µ (sobrenadante de las células COS transfectadas, antes descritas) y se detectó la unión por incubación de las placas con anti-IgM humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (AP) revelada con PNPP, y se leyeron las placas a 504-650 nm.
Los resultados se presentan en la Figura 38. Los resultados indican que las moléculas H22-anti-CEA biespecíficas, monocatenarias, codificadas por las construcciones 321 y 323 se unen a Fc?RI y a CEA. Por otra parte, el anticuerpo H22 monocatenario (codificado por la construcción 225) no se une a Fc?RI ni a CEA, como se esperaba.
Ej emplo 9 : Orientación de CD64 (Fc?RI) para inducir y/o mejorar el procesamiento y presentación del antigeno Con el fin de determinar si la dirección de un antígeno normalmente no inmunogénico (por ejemplo un antígeno propio) para CD64 humano (Fc?RI) puede superar la no respuesta inmunológica in vivo, se prepararon y probaron como se describe más adelante algunos complejos multímeros que contienen tales antígenos ligados a los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 dirigidos a los receptores de Fc sobre las células presentadoras de antígeno. En particular, ratones transgénicos para CD64 humano, así como sus compañeros de carnada no transgénicos, fueron inmunizados con el fragmento F(ab')2 del mAb anti-CD64 humano de murino, M22 (producido por el hibridoma que tiene el deposito ATCC No. HB-12147) . Los ratones fueron sangrados 7 días después de recibir su cuarta inmunización quincenal. Mediante el análisis por ELISA, tres de los seis ratones transgénicos, pero ninguno de los seis compañeros de carnada no transgénicos, presentaron títulos de anticuerpos específicos de Id anti-M22 significativos. Estos antisueros fueron específicos de M22 y no reaccionaron con otros anticuerpos murinos. 5 Para determinar si los complejos multiméricos del Fab' de M22 inducirían más eficazmente la internalización del antígeno y, de este modo, mejorarían la presentación • del antígeno y una respuesta inmunitaria Id anti-M22 más fuerte, los multímeros de la molécula Fab' de M22 fueron 10 sintetizados química y genéticamente y probados. Estos multímeros comprenden los antígenos que pueden estar ligados químicamente al F(ab')2 de 22 (u otros agentes de • unión al receptor de Fc) y moléculas Fab' de 22 adicionales. El multímero final consiste en varias 15 especies moleculares que contienen, por ejemplo, múltiples brazos Fab' de 22 (por ejemplo dos o más) y una o más moléculas antigénicas. Estas especies pueden ser purificadas por cromatografía de exclusión de tamaño o afinidad si se desea. La Figura 41 muestra una 20 representación esquemática para el desarrollo de estos antígenos objetivo multiméricos químicamente ligados.
Los multímeros sintetizados por medios químicos fueron preparados mediante la incubación de F(ab')2 del 25 M22 con un exceso 20 molar de succinimidil 4- (N- maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC) a temperatura ambiente durante 2 horas. El SMCC libre fue eliminado del complejo resultante, F (ab' ) 2-SMCC, por cromatografía G-25. Los antígenos con los grupos tiol 5 (SH) libres fueron adicionados al complejo F(ab')2-SMCC de M22 en una relación molar 1:1. La mezcla resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La • reacción fue interrumpida adicionando un exceso de yodoacetamida y el conjugado resultante se purificó por 10 cromatografía de exclusión de tamaño.
Los mul tímeros M22 F (ab' ) 2+ = antígeno • mejoran/ inducen una respuesta inmuni taria 15 La Figura 42A muestra un gel SDS-PAGE no reductor conteniendo F(ab')2 de M22 (franja 1) y el multímero Fab' de M22 ligado químicamente (franja 2). El multímero consistió en algunas especies moleculares representando F(ab')3, F(ab')4, F(ab')5, F(ab')6, y moléculas de peso 20 molecular mayor.
Para determinar la capacidad de F(ab')2 del M22, comparada con el multímero F(ab')3 de M22, para mediar la internalización de CD64 humano, diversas 25 concentraciones de M22 F(ab')2 o M22 F(ab')3+ fueron incubados durante 2 horas con macrofagos aislados de ratones transgénicos-CD64 humano. La expresión de superficie del CD64 humano fue detectada por el mAb anti-CD64 humano etiquetado con FITC, M32.2 (producido por el hibridoma que contiene el depósito ATCC No. 9469) que se une a un sitio en un CD64 humano que es distinto del epítope de M22. Como se muestra en la Figura 42B, la incubación con el F(ab')2 de M22 no originó reducción significativa de CD64 humano de la superficie de los macrofagos. No obstante, la incubación con el F(ab')3 a 37 °C originó hasta 50% de reducción en la expresión de CD64 humano en un modo dependiente de la dosis. La incubación con el F(ab')3 a 4°C no originó reducción en la expresión de CD64 humano, demostrando dependencia de la temperatura de este fenómeno.
Se realizaron otros experimentos para determinar si ocurriría modulación in vivo . Ratones transgénicos CD64 humano fueron inyectados con F(ab')2 de M22 o F(ab')3 de M22 y fueron sangrados una hora después. La expresión de superficie del CD64 humano fue significativamente reducida en los monocitos circulantes de los animales inmunizados con el F(ab')3 de M22, pero no de los animales inmunizados con F(ab')2 de M22. La hipótesis que se hizo fue que la reducción de la expresión de CD64 humano en la superficie representó la internalización del receptor junto con el multímero F(ab')3 .
La capacidad de los compañeros de carnada 5 transgénicos-CD64 humano y no transgénicos para generar una respuesta del idiotipo ("Id") anti-M22 después de tres inmunizaciones con el multímero F(ab')3 del M22 • después fue estudiada. Los datos mostrados en la Figura 43A demuestran que títulos altos del anticuerpo 10 específico de M22 fueron generados en todos los ratones transgénicos-CD54 humano (n = 12) inmunizados tres veces (25 µg/inmunización) con el multímero, pero no se generó • anticuerpo específico de M22 en ninguno de los compañeros de carnada no transgénicos inmunizados del mismo modo (n = 15 10). La respuesta inmunitaria en los transgénicos-CD64 humano que fue elucidada por el multímero F(ab')3 de M22 fue significativamente mejor que la elucidada por el F(ab')2 de M22. Todos los ratones inmunizados con el multímero respondieron y fueron necesarias menores 20 inmunizaciones (tres contra cuatro) para generar una respuesta inmunitaria inmunizando con el multímero en comparación con el F(ab')2. Estos resultados demuestran que los complejos multiméricos Fab' originan mejor internalización de un antígeno a través del CD64 humano, 25 dando origen a una mejor respuesta inmunitaria específica del antígeno. De hecho, los datos que se muestran en la Figura 43B demuestran que la inmunización de ratones transgénicos-CD64 humano con tan poco como 0.25 µg del multímero todavía origina una respuesta inmunitaria detectable en la mayoría de los ratones.
Es difícil observar una respuesta inmunitaria potente para muchos antígenos asociados con tumor dado que el sistema inmunitario con frecuencia es tolerante a estos antígenos. Con el fin de determinar si al dirigir tal antígeno normalmente no inmunogénico hacia CD64 humano origina una respuesta inmunitaria para este antígeno, un antígeno modelo, el fragmento Fab' del anticuerpo monoclonal murino, 520C9, fue acoplado al multímero de M22.
Después de la inmunización de las camadas de animales transgénicos con CD64 humano y sus contrapartes no transgénicos, fueron evaluados los títulos del Id anti-520C9 y los títulos del Id anti-M22. Como se muestra en la Figura 44A, siete de ocho ratones transgénicos CD64 inmunizados desarrollaron fuertes títulos de anti-520C9 y anti-M22. Ninguno de los siete ratones no transgénicos inmunizados desarrollo títulos medibles para 520C9 ni para M22. Estos datos demuestran que al acoplar una proteína normalmente no inmunogénica con CD64 humano de modo que sea internalizado por las células presentadoras del antígeno CD64 humano origina una respuesta inmunitaria potente para el antígeno. Algunos grupos han mostrado que al desarrollar inmunidad específica para el idiotipo expresado por la Ig de superficie en células de linfomas de células B puede originar potente inmunidad específica de las células tumorales. El ejemplo demuestra que una respuesta Id anti-520C9 específica puede elucidarse rápidamente dirigiendo el idiotipo 520C9 al CD64.
La calidad de la respuesta inmunitaria para dar un antígeno, particularmente un antígeno asociado con tumor o viral, puede ser tan importante como la cantidad de la respuesta. Las células T cooperadoras han sido divididas en Thl y Th2 dependiendo del tipo de citocinas que secretan y también el tipo de ayuda que proporcionen a las células B cuando se les estimula. Las células Thl secretan IL-2 e IFN-? cuando se estimulan y por lo regular estimulan células B para secretar anticuerpos del isotipo IgG2a. Las células Th2 secretan IL-4 e IL-5, cuando se les estimula, y por lo regular estimulan células B para secretar anticuerpos del isotipo IgGl o IgE. En general, se considera que las células Thl estimulan el brazo celular de la respuesta inmune mientras que las células Th2 estimulan el brazo humoral. El título del anticuerpo específico de 520C9, de cualquier isotipo IgGl o IgG2a, fue examinado utilizando reactivos de revelado específicos del isotipo después de haber inmunizado ratones transgénicos-CD64 humano con 520C9 acoplado al multímero de M22. Los datos mostrados en la Figura 44B demuestran que se elucidó un fuerte título específico de IgGl así como un fuerte título específico del Id IgG2a, demostrando la capacidad de este método de inmunización para activar una respuesta de Thl y una respuesta de Th2.
El mul tímero H22 sF -H22 sFv- 32.2 sFv- an tígeno induce respuestas inmuni tarias La Figura 45 (a) muestra el mapa de un vector que codifica un antígeno elegido, multimérico, genéticamente ligado. Este vector codifica para una proteína con dos regiones sFv del anticuerpo anti-Fc?RI humanizado, H22 (producido por el hibridoma con el depósito ATCC No. CRL 11177), y una región sFv del anticuerpo M32.2, todos ligados entre sí a un antígeno. La proteína de fusión resultante H22sFv-H22sFv-32.2sFv-antígeno (que se muestra en la Figura 45 (b) ) , es capaz de unirse a Fc?RI ^. . ^.t* ^.á i i en múltiples sitios, y por este medio inducir la internalización a través de la agregación del receptor.
El multímero H22sFv-H22-sFv-32.2sFv-antígeno se preparó utilizando gp75 murino (antígeno de melanoma Trp-1) como antígeno para estudios modelo en ratones transgénicos. Se encontró que esta proteína de fusión se une a Fc?RI eficazmente e induce la internalización del receptor. Como se muestra en la Figura 46, el M22Fab x M22Fab x M32Fab ligado químicamente y el H22sFv-H22sFv-32.2sFv-antígeno ligado genéticamente cada uno indujo internalización de Fc?RI . El estudio se realizó mediante la adición de las muestras a células U-937 tratadas con IFN-? durante dos horas a 37°C. Luego se midió la expresión de Fc?RI por tinción de las células con IgGl humana-FITC durante una hora a 4°C, y las muestras fueron analizadas por FACscan. Se calculó el porcentaje (%) de modulación por la fórmula: [1-(MFI de la muestra/MFI del control)] x 100%, en donde MFI es la intensidad de la fluorescencia promedio. . ******* .?Í?J* .,*. MtA*i ti*Á El H22sFv2- antígeno se une a FcyRI con afinidad aproximadamente igual a H22Fab2- antígeno La Figura 47 (a) muestra un mapa de un vector que 5 codifica una proteína de fusión constituida de dos regiones H22sFv genéticamente ligadas entre sí a un antígeno. La proteína de fusión resultante, H22sFv- H22sFv-antígeno (mostrada en la Figura 47 (b) ) , es capaz de unirse a dos moléculas Fc?RI . Esta proteína de fusión 10 tendría mayor afinidad para Fc?RI que las proteínas de fusión consistentes en solo un H22sFv. La capacidad de este multímero para unirse a dos moléculas Fc?RI también puede inducir mayor internalización del receptor. 15 Para probar estas hipótesis, (es decir, si la proteína de fusión H22sFv-H22sFv-antígeno se une a Fc?RI con mayor afinidad que una sola fusión H22sFv-antígeno) , se realizó un experimento de competición. Células U937, previamente tratadas con IFN-? para mejorar la expresión ^ 20 del Fc?RI, fueron teñidas con un anticuerpo H22 y conjugadas con ficoeritrina. Como se muestra en la Figura 48, el conjugado fue inhibido por diferentes concentraciones de H22 Fab, la proteína de fusión H22sFv 2-EGF o H22 Fab 2. Como también se muestra en la Figura 48, la proteína de fusión H22sFv2-EGF se une a Fc?RI con una afinidad aproximadamente igual a la de H22 Fab 2. Se ha demostrado anteriormente que H22 Fab' y H22sFv tienen afinidad similar para Fc?RI (Goldstein y col. (1997) J. Immunol . ) .
H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA induce la internalización de Fc?R I La Figura 49 (a) muestra un mapa de un vector que codifica una proteína de fusión multimérica que contiene tres fragmentos H22sFv ligados a un antígeno. La proteína de fusión, H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA (mostrada en la Figura 49 (b) ) , contiene el antígeno de tumor CEA ligado con las tres H22sFv. La proteína de fusión debe unirse a Fc?RI con alta afinidad (debido a la unión trivalente de tres moléculas sFv) , y también debe originar internalización del Fc?RI por agregación de tres moléculas de Fc?RI .
La capacidad de la fusión H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA ligado genéticamente para inducir la internalización de Fc?RI fue probada como ya se describió, y los resultados se muestran en la Figura 50. Es importante señalar que el &^^^^^^^^^^!&^^^^¡^ ^ ^^^^^^^£^^^^^Í H22 Fab-CEA no medió la internalización en concentraciones similares, probablemente debido a que se une en forma monovalente al Fc?RI . El ejemplo fue realizado mediante la adición de muestras a células U-937 5 tratadas con IFN-? e incubándolas durante una hora o durante la noche a 37 °C. Luego se midió la expresión de Fc?RI por tinción de las células M32.2-FITC durante una hora a 4°C, y se analizaron las muestras por FACscan. 10 Ejemplo 10: Las proteinas de fusión de anticuerpos humanos dirigidas a CD8 (FcaR) y antigenos de tumor (por ejemplo el receptor para EGF) promueve la citotoxicidad mediada por 15 las células de las células tumorales Los siguientes estudios incluyen la producción y caracterización de las construcciones de fusión biespecíficas que inducen la muerte mediada por las 20 células efectoras de células tumorales que expresan el receptor para EGF (EGF-R) . Las construcciones incluyen el EGF ligado a un anticuerpo anti-CD89 (anti-FcaR) (ScFv ó Fab' ) . Por tanto, las construcciones activan las funciones efectoras de las células que expresan CD89 que 25 han sido dirigidas a las células tumorales. ?a^¡^a??_s_a__.
El CD89 (FcaRI) es un receptor que se une a la porción Fc de la IgA, la Ig más abundante en el cuerpo humano. El CD89 se expresa constitutivamente principalmente en las células efectoras inmunitarias 5 citotóxicas que incluyen los leucocitos polimorfonucleares (PMN), monocitos, macrofagos, neutrófilos y eoxinófilos. Las IgAl y la IgA2 monoméricas • y acomplejadas con el Ag se unen a CD89, sugiriendo que el receptor puede ser saturado con IgA monomérica in 10 vivo. La reticulación de CD89 en células efectoras mieloides por los mAb específicos para epítopes dentro o fuera del sitio de unión al ligando estimula la degranulación, liberación del superóxido, secreción de citocinas inflamatorias, endocitosis y fagocitosis. Por 15 tanto el CD89 puede ser un receptor activador clínicamente importante sobre células efectoras inmunitarias citotóxicas.
Los miembros de la familia de receptores del factor 20 de crecimiento tipo I son receptores ligados a la tirosina cinasa que han sido reportados como sobre expresados durante el desarrollo de diversos cánceres. Un miembro de esta familia es el receptor para el factor de crecimiento epidérmico (EGF-R, el producto del gen c- 25 erjB-1) . El EGF-R se sobre expresa en casi todos los tumores de cabeza y cuello, aproximadamente una tercera parte de los tumores de mama y ovario y puede sobre expresarse en cánceres de próstata, riñon, vejiga, pulmón, cerebro, páncreas y sistema gastrointestinal. A 5 pesar de la existencia del receptor en algunas células normales como los queratinocitos y hepatocitos, la sobre expresión de EGF-R en células tumorales puede ser útil • para dirigir terapias específicas para el tumor. Las terapias dirigidas pueden incluir un mAb específico para 10 EGF-R, o uno de los ligados para el receptor, como puede ser EGF. El EGF es un modulador de la división celular y las funciones de diferenciación de diferentes tipos de • células que expresan EGF-R. El EGF es un polipéptido no glucosilado de 53 aminoácidos que contiene tres enlaces 15 disulfuro, y se procesa proteolíticamente a partir de un precursor de 1207 aminoácidos.
Generación de las construcciones de fusión 20 Para generar proteínas de fusión biespecíficas se utilizó la tecnología HuMAb-Mouse™, como ya se describió, para generar un mAb CD89 completamente humano. Este mAb, 14A8 (también conocido como 14.1) se une a un epítope que es distinto del sitio de unión del Fc 25 conservando al mismo tiempo la capacidad para accionar las funciones efectoras. De este modo, el anticuerpo supera el bloqueo potencial del sitio de unión al ligando causado por la saturación de la IgA monomérica. En este caso, los fragmentos Fab' y sFv del mAb 14A8 fueron 5 fusionados a EGF. En resumen, la línea de células de hibridoma 14A8 se obtuvo a partir de ratones HuMAb inmunizados con CD89 soluble. Las regiones v fueron • clonadas utilizando RT-PCR a partir del RNA aislado de la línea de células. El análisis de la secuenciación del DNA 10 reveló que el anticuerpo consiste en la VH de 30.3 con el segmento D de DNI y el segmento J de JH4, y la Vk de L18 con el segmento J de JK3.
Utilizando el DNA que codifica las regiones 15 variables del mAb anti-CD89 completamente humano generado a partir de HuMAb-Mouse™, las proteínas de fusión del anticuerpo que funcionan como moléculas biespecíficas (BMS) fueron construidas y expresadas. Como se muestra en la Figura 51, estas moléculas consistieron en un 20 fragmento de anticuerpo que se une al receptor para la • porción Fc de la IgA humana (Fc?RI, CD89) en un epítope distinto del sitio de unión Fc pero todavía activa las funciones de las células efectoras, y un brazo que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) , 25 que se sobre expresa en diferentes líneas de células tumorales. Para preparar las BMS, el fragmento Fab ó scFv del mAb 14A18 (anti-CD89) fue fusionado por un ligador peptídico flexible al EGF, un ligando para EGF-R. Las regiones variables del mAb 14A8 fueron clonadas y caracterizadas usando RT-PCR y secuenciación del DNA.
La construcción de fusión del Fab se preparó insertando el DNA de la VH de 14A8 en un vector de expresión conteniendo el cDNA de la CH1 de la IgGl humana y las regiones bisagra fueron fusionadas a EGF. El DNA de la VL de 14A8 del mismo modo fue insertado en un vector de expresión que contenía el cDNA de la región CL humana. La proteína de fusión de sc-Fv también fue expresada como una sola cadena desde un vector. Como se muestra esquemáticamente en la Figura 51, el pJZ906 (14Afd-EGF) y pJZ907 (cadena L de 14A8) fueron co-transfectados por electroporación en células NSO, y seleccionadas en medio conteniendo G418 e higromicina. El pJZ909 (14A8sFv-EGF) del mismo modo fue transfectado y seleccionado en medio conteniendo G418. Las líneas de células que expresan la proteína de fusión fueron subclonadas por clonación con dilución limitante. Para purificar las construcciones de fusión, los sobrenadantes de las líneas celulares que expresan la proteína de fusión fueron corridas sobre una columna de proteína L, y aproximadamente 2 µg de la proteína purificada fueron cargados en un gel tris- glicina al 4-15% bajo condiciones reductoras y no reductoras . 5 Caracterización de la construcción de fusión que se une a las células tumorales • Como se muestra en la Figura 52 (A y B) y la Figura 53, los experimentos de citometría de flujo confirmaron 10 que el fragmento del anticuerpo y la porción EGF en estas BMS se unen específicamente a sus receptores de la superficie celular respectivos. La Figura 52 (a) muestra que la proteína de fusión 14A8fab'-EGF se une a EGF-R sobre las células A431. La Figura 52 (b) muestra que 15 14A8sFv-EGF se une a las células A431 (teñidas con fab-2 anti-IgG humana de cabra conjugada con ficoeritrina) . El fragmento fab-2 de 14A8, que no contiene EGF, se utilizó como control. La Figura 52 (c) muestra que las proteínas de fusión con 14A8 y el EGF obtenido en el comercio 20 compiten por la unión a las células A431 con un conjugado • EGF-FITC (7 nM) . La Figura 53 (A) muestra que la proteína de fusión 14A8fab'-EGF se une a las células U937 que expresan CD89 (teñidas con Fab-2 anti-IgG humana de cabra conjugada con ficoeritrina) . El fragmento Fab-2 del mAb 25 humanizado H415, que es específico para EGF-R, se utilizó como control. La Figura 53 (b) muestra que la proteína de fusión 14A8sFv-EGF también se une a las células U937 que expresan CD89. El experimento se realizó en la misma forma como en la Figura 53 (A) , excepto que fueron valoradas diferentes concentraciones de 14A8sFv-EGF para su capacidad para inhibir la unión de la fusión 14A8fab'-EGF (23 Nm) . La proteína de fusión H22sFv-EGF se utilizó nuevamente como control. El mAb H22 se une a CD64 (Fc?RI), un receptor de Fc diferente en las células U937.
Lisis mediada por células efectoras de las células tumorales que expresan EGF-R Ensayos de liberación de cromo (lisis celular) confirmaron que las construcciones de fusión 14A8fab'-EGF y 14A8sFv-EGF median lisis específica de células tumorales que expresan EGF-R con las células efectoras purificadas leucocitos polimorfonucleares (PMN), monocitos y sangre completa que expresan CD89 en un modo dependiente de la dosis.
Como se muestra en las Figuras 54 (A) , 54 (B) y 54 (C) y la Figura 55, las proteínas de fusión de 14A8 mediaron citotoxicidad de células A431 utilizando monocitos (54A) , PMN (54B) y sangre completa (54C) . Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y utilizando una relación efector a objetivo (para monocitos y PMN) de 100:1. El fragmento fab-2 de 14A8 se utilizó como control. Como se muestra en la Figura 56, la citotoxicidad de las células A431 mediada por la fusión 14A8fab'-EGF (1 µg/mL) (56A) y la fusión 14A8sFv-EGF (1 µg/mL) es inhibida por el fragmento Fab-2 de 14A8 (40 µg/mL) . Esto demuestra que la lisis celular por las proteínas de fusión es específicamente mediada por la unión a CD89.
En general, los estudios anteriores describen la generación de las proteínas de fusión por medios genéticos ligando EGF a los fragmentos Fab' o sFv de 14A8, expresando las construcciones en cultivos de células de mamífero, y purificando las construcciones a casi la homogeneidad utilizando la cromatografía de la proteína L. Estas proteínas de fusión son mínimamente inmunogénicas en humanos debido a que 14A8 es completamente humana y EGF es de origen humano, lo cual puede mejorar la eficacia terapéutica de las proteínas de fusión. Los estudios anteriores también demuestran que estas proteínas de fusión, 14Afab' -EGF y 14A8sFv-EGF, puede unirse a las células que expresan CD89 y EGF-R. Es importante señalar que los estudios además demuestran que, en presencia de células efectoras inmunes que expresan CD89, estas proteínas de fusión median la muerte de células que sobre expresan EGF-R en un modo dependiente de la dosis. La lisis de células tumorales 5 también fue evidenciada en presencia de sangre completa.
Ejemplo 11 : Moléculas biespecificas y • triespecíficas gue contienen porciones de unión a anticuerpos 10 humanos dirigidas a CD89 (FcaR) y antigenos tumorales (por ejemplo el receptor de EGF y/o HER2) favorecen • la citotoxicidad mediada por las células de las células tumorales 15 Los siguientes estudios incluyen la producción y caracterización de las moléculas biespecí'ficas y triespecíficas que inducen la muerte mediada por células efectoras de las células tumorales que expresan el 20 receptor para EGF (EGF-R) y/o HER2/neu (también conocido como HER2 ) . Las construcciones biespecíficas incluyen un anticuerpo anti-CD89 monoclonal humano (anti-FcaR) (ScFv ó Fab'), conocido como 14.1, ligado a un anticuerpo monoclonal humano anti-HER2 (ScFv ó Fab' ) , conocido como 25 3. F2. La construcción triespecífica incluye la construcción biespecífica anti-CD89 (ScFv) x anti-HER2 (ScFv) , se fusionó a EGF. Estas construcciones activan las funciones efectoras de las células que expresan CD89 que han sido dirigidas a las células tumorales. También 5 proporcionan la ventaja de ser completamente humanas.
Generación de las construcciones de fusión biespecíficas y triespecíficas 10 La Figura 57 y 58 muestran las moléculas bi- y triespecíficas seleccionadas de la invención y sus anticuerpos humanos precursores (los HuMab) . La Figura 57 muestra moléculas de fusión biespecíficas monocatenarias (ScFv), 931 y 934, que son las mismas salvo que 934 15 incluye EGF, mientras que 931 no lo incluye. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de 14.1 (anti- CD89) y 3F2 (anti-HER2) se utilizaron para generar las construcciones. La Figura 58 muestra una molécula biespecífica Fab' anti-CD89 x anti-HER2 químicamente 20 conjugada. Los fragmentos Fab' de 14.1 y 3F2 fueron ligados por enlace disulfuro utilizando los procedimientos de reticulación química normales para generar esta molécula biespecífica. 25 "»•••' AMttJBfiri -liir-iffl ' - i Las moléculas bi- y triespecíficas monocatenarias (931 y 934) fueron producidas transfectando células NSO con plásmidos (por ejemplo, pJZ934) (como se muestra en la Figura 51 para las fusiones anti-CD89 x EGF) y 5 seleccionadas en medio conteniendo G418. Las líneas celulares fueron detectadas para la expresión de la proteína de fusión subclonada por clonación con dilución limitada. Por último, la proteína de fusión fue purificada corriendo el sobrenadante de las líneas de 10 células que expresan la proteína de fusión sobre una columna para proteína L y luego cargando aproximadamente 2 µg de la proteína purificada sobre un gel tris-glicina al 4-15% bajo condiciones no reductoras y reductoras. La construcción 934 se purificó principalmente como una 15 especie trimérica, la cual se disocia a los monómeros en condiciones reductoras.
Caracterización de la molécula bi- y triespecífica que se une a las células tumorales 20 Se utilizó citometría de flujo para caracterizar la unión de las moléculas bi- y triespecíficas. La Figura 59 (A) muestra la unión a las células tumorales de las proteínas de fusión en sobrenadantes de transfectoma . El 25 sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) se incubó con líneas de células tumorales SKBr-3 ó A431. La unión de la proteína de fusión entonces se detectó haciendo la tinción con Fab-2 anti-IgG humana de cabra conjugado con ficoeritrina. Como se muestra en la Figura 59 (B), los sobrenadantes de las células transfectadas (931 y 934) también mediaron lisis celular (ADCC) . En estos estudios, se realizaron ensayos de liberación de cromo con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación efector (monocitos, PMN) a objetivo (SKBr-3, A431) de 100:1. La muerte de las células tumorales fue detectada utilizando el sobrenadante transfectado (931 & 934) y no transfectado (NSO) para mediar lisis específica.
La Figura 60 (A) muestra la actividad de unión de las moléculas bi- y triespecíficas purificadas (931 y 934) a las células U937 (a través del receptor para CD89) . El fragmento Fab-2 del anticuerpo 425 (mAb anti-EGF-R) , que no se une a las células U937, se utilizó como control negativo. Como control positivo se utilizó la molécula biespecífica químicamente acoplada anti-CD89 (Fab') x anti-HER2 (Fab') (mostrada en la Figura 58). La Figura 60 (B) es la misma que la Figura 60 (A) , excepto que se probó la unión a las células SKBr-3 (mediante el receptor HER2) . Como control negativo se utilizó el fragmento Fab-2 del anticuerpo anti-CD89, 14.1. La Figura 61 muestra la unión de la construcción triespecífica 934 a las células A431. Este experimento se realizó del mismo modo como se muestra en la Figura 60, excepto que fueron utilizadas células tumorales A431 que sobre expresan EGF-R. Una proteína de fusión consistente en el fragmento sFv de 14.1 fusionado a EGF se utilizó como control positivo, y como control negativo se utilizó el fragmento Fab-2 del anticuerpo anti-CD89, 14.1.
Lisis mediada por cél ulas efectoras de las cél ulas tumorales que expresan EGF-R y HER2/neu Las moléculas bi- y triespecíficas monocatenarias (931 y 934) también fueron probadas para su capacidad para mediar lisis celular (ADCC) de células tumorales que expresan EGF-R y HER2/neu en presencia de células efectoras. Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del efector (monocitos, PMN) al objetivo (SKBr-3, A431) de 100:1. La muerte de las células tumorales fue detectada utilizando el sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) para mediar lisis específica. Como se muestra en la Figura 59 (B), los sobrenadantes de las células transfectadas (931 y 934) mediaron lisis de células (ADCC) de los monocitos, PMN y sangre completa) . En estos estudios, los ensayos de liberación de cromo fueron realizados en un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del efector (monocitos, PMN) al objetivo (SKBr-3, A431) de 100:1. La muerte de las células tumorales fue detectada utilizando el sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) para mediar lisis específica.
La Figura 62 y la Figura 63 muestran lisis mediada por células efectoras de células SKBr-3 (Figura 62 (A) y Figura 63 (A) ) y de células BT474 (Figura 62 (B) y Figura 63 (B) ) mediante la construcción biespecífica monocatenaria purificada, 931, en presencia de PMN y monocitos, respectivamente. Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación efector a objetivo de 100:1. El fragmento Fab-2 del anticuerpo anti-CD89, 14.1, se utilizó como control negativo en cada experimento.
Además, la molécula biespecífica químicamente conjugada, purificada, 14.1 x 3. F2 (Figura 58), conteniendo dos fragmentos de anticuerpo Fab' reticulados (contrario a los anticuerpos monocatenarios como en las construcciones 931 y 934) fue probada para muerte con ADCC con células polimorfonucleares (PMN), monocitos y sangre completa de células tumorales humanas SKBr-3 o BT- 474 marcadas con 51Cr. Después de incubación durante la noche a 37 °C, se determinó la cantidad de muerte de las 5 células tumorales por análisis del 51Cr liberado en los sobrenadantes del cultivo. Se calculó lisis específica como la cantidad de lisis de células tumorales en presencia de la lisis de células tumorales por la molécula biespecífica solo con células 10 polimorfonucleares. Como se muestra en la Figura 64, la molécula biespecífica 14.1 x 3. F2 medió la muerte de las células por PMN de ambas células tumorales SKBr-3 y BT474 expresando HER2/neu en un modo dependiente de la dosis. Además, como se muestra en la Figura 65, la molécula 15 biespecífica 14.1 x 3. F2 medió la muerte celular por monocitos de las células tumorales SKBr-3 y BT474 expresando HER2/neu en un modo dependiente de la dosis. En ambos casos, la adición de 10 µg/mL del Fab' 2 de 14.1 bloqueó completamente ADCC de las células tumorales por 1 20 µg/mL de la molécula biespecífica 14.1 x 3.F2, • demostrando que la muerte de las células elegidas fue mediada exclusivamente por la unión de CD89 a las células efectoras. La Figura 66 muestra que la molécula biespecífica 14.1 x 3. F2 también medió la muerte celular 25 por sangre completa de células tumorales BT-474 expresando HER2/neu en un modo dependiente de la dosis.
En general, los estudios anteriores describen la generación de moléculas bi- y triespecíficas conteniendo 5 anticuerpos monoclonales humanos (incluida la cadena individual y los fragmentos Fab'). Además, estos ejemplos demuestran que estas moléculas bi- y triespecíficas • median eficazmente la muerte de las células tumorales que expresan HER2/neu y EGF-R en presencia de las células 10 efectoras.
Equivalentes Los expertos en la técnica se darán cuenta, o podrán 15 averiguar utilizando no más que la experimentación habitual, múltiples equivalentes a las modalidades específicas de la invención en la presente descritas. Tales equivalentes están propuestos para estar comprendidos por las siguientes cláusulas. 20 aaaaali MÍ ^A?aiS&a.4.A^i *. * ±.AA?? Í'- - -— .,... . . .... . . . ^.. __._, ____.»______-~->-— ~~— ?& ** * *~iki?**ijM ÁA1* LISTADO DE SECUENCIAS <110> Medarex, Inc. et al. <120> COMPUESTOS TERAPÉUTICOS QUE CONTIENEN AGENTES PARA UNIÓN A LOS RECEPTORES ANTI-FC <130> MXI-043CP3PC <140> 09/523,279 <141> 2000-03-10 <150> 09/364,088 <151> 1999-07-30 <160> 19 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) .. (24) <400> 1 act cac acá tgc cea ceg tgc cea 24 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) .. (18) <400> 2 act cac acá tgc cea ceg tgaggatcc 27 Thr His Thr Cys Pro Pro 1 5 <210> 3 <211> 42 10 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS 15 <222> (1) • (33) <400> 3 act cac acá tgc teg age ett cac ggc ggc cgc tgaggatcc 20 Thr His Thr Cys Ser Ser Leu His Gly Gly Arg 1 5 10 <210> 4 25 <211> 300 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe lie Phe Ser Asp Asn 35 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 40 Ala Thr lie Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 45 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 50 100 105 110 SXJEaA*C*á?***¡?'----^^ - ^*^. j. jí.?. *.?**.. r Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Arg Val Thr Val Ser 145 150 155 160 10 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 15 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 20 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Ser Thr Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His Leu 225 230 235 240 25 Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu 245 250 255 Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys 30 260 265 270 Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala 275 280 285 35 Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln Lys Arg 290 295 300 <210> 5 40 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 45 Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly 1 5 10 50 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe He Gly He Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 7 10 <211> 54 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 15 tcgagccagt acatcaaggc gaattccaag ttcatcggca tcaccgagct ctga 54 <210> 8 <211> 53 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 25 cggtcatgta gttccgctta aggttcaagt agccgtagtg gctcgagact ceg 53 <210> 9 <211> 15 30 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 35 Gln Tyr He Ser Ala Asn Ser Lys Phe He Gly He Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 10 40 <211> 54 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 45 tcgagccagt acatcagcgc gaattccaag ttcatcggca tcaccgagct ctga 54 <210> 11 50 <211> 53 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 cggtcatgta gtcgcgctta aggttcaagt agccgtagtg gctcgagact ceg 53 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 13 <211> 913 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (11) ( 913 ) <400> 13 aagcttcacc atg gga tgg age tgt atc atc ctc ttc ttg gtg gcc acá 49 Met Gly Trp Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ala Thr 1 5 10 gct acc ggt gtc cac tcc gat atc caá ctg gtg gag age ggt gga ggt 97 Ala Thr Gly Val His Ser Asp He Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 15 20 25 gtt gtg caá cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc teg tct ggc 145 Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly 30 35 40 45 ttc agt ttc agt gac aat tac atg tat tgg gtg aga cag gca cct gga 193 Phe Ser Phe Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 60 aaa ggt ett gag tgg gtt gca acc att agt gat ggt ggt agt tac acc 241 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr He Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr 65 70 75 tac tat cea gac agt gtg aag gga aga ttt acá ata teg aga gac aac 289 Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn 80 85 90 age aag aac acá ttg ttc ctg caá atg gac age ctg aga ccc gaa gac 337 Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp 95 100 105 acc ggg gtc tat ttt tgt gca aga ggc tac tat agg tac gag ggg gct 385 10 Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala 110 115 120 125 atg gac tac tgg ggc caá ggg acc ceg gtc acc gtg age tea gga ggt 433 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly • 15 130 135 140 ggc ggc tcc gga ggt gga ggc age gga ggg ggc gga tcc gac atc cag 481 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gln 145 150 155 20 ctg acc cag age cea age age ctg age gcc age gtg ggt gac aga gtg 529 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 160 165 170 25 acc atc acc tgt aag tcc agt caá agt gtt tta tac agt tea aat cag 577 • Thr He Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln 175 180 185 aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aag cea ggt aag gct cea aag 625 30 Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 190 195 200 205 ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggt gtg cea age aga 673 Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg 35 210 215 220 ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc acc ttc acc atc age age 721 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser 225 230 235 40 ctc cag cea gag gac atc gcc acc tac tac tgc cat caá tac ctc tcc 769 Leu Gln Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser 240 245 250 45 teg tgg acg ttc ggc caá ggg acc aag gtg gaa atc aaa tct age tgc 817 Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys Ser Ser Cys 255 260 265 teg age gga ggc ggg ggt age gat atc gcg gcc gca gaa cag aaa ctc 865 50 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu 270 275 280 285 atc tea gaa gag gat ctg aat ggc gcc gca cat cac cat cat cac cat 913 He Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His 290 295 300 <210> 14 <211> 301 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Gly Trp Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp He Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr He Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gln Leu Thr Gln 145 150 155 160 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr 165 170 175 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr 180 185 190 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 195 200 205 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Gln Pro 225 230 235 240 Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr 245 250 255 10 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys Ser Ser Cys Ser Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Asp He Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu He Ser Glu 275 280 285 • 15 Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His 290 295 300 20 <210> 15 <211> 1679 <212> DNA <213> Mus musculus <220> 25 <221> CDS <222> (11) .. (1669) <400> 15 30 aagcttcacc atg gga tgg age tgt atc atc ctc ttc ttg gtg gcc acá 49 Met Gly Trp Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ala Thr 1 5 10 35 gct acc ggt gtc cac tcc gat atc caá ctg gtg gag age ggt gga ggt 97 Ala Thr Gly Val His Ser Asp He Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 15 20 25 gtt gtg caá cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc teg tct ggc 145 40 Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly 30 35 40 45 ttc att ttc agt gac aat tac atg tat tgg gtg aga cag gca cct gga 193 Phe He Phe Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 45 50 55 60 aaa ggt ett gag tgg gtt gca acc att agt gat ggt ggt agt tac acc 241 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr He Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr 65 70 75 50 Vr?¡??-?-ai¡¿attaí8fe)r r i -litliilTli -Í...Í ... ,i ^ . ..rnt-t^ -3» ...,-.. tac tat cea gac agt gtg aag gga aga ttt acá ata teg aga gac aac 289 Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn 80 85 90 age aag aac acá ttg ttc ctg caá atg gac age ctg aga ccc gaa gac 337 Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp 95 100 105 acc ggg gtc tat ttt tgt gca aga ggc tac tat agg tac gag ggg gct 385 Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala 110 115 120 125 atg gac tac tgg ggc caá ggg acc ceg gtc acc gtg age tea gga ggt 433 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 ggc ggc tcc gga ggt gga ggc age gga ggg ggc gga tcc gac atc cag 481 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gln 145 150 155 ctg acc cag age cea age age ctg age gcc age gtg ggt gac aga gtg 529 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 160 165 170 acc atc acc tgt aag tcc agt caá agt gtt tta tac agt tea aat cag 577 Thr He Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln 175 180 185 aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aag cea ggt aag gct cea aag 625 Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 190 195 200 205 ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggt gtg 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380 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 385 390 395 400 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr 405 410 415 -Í..Í H ? 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Claims (36)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula biespecífica que comprende una primera especificidad de unión que es un anticuerpo o fragmento de éste que se une a un receptor para Fca y una segunda especificidad de unión que es un anticuerpo o fragmento de éste que se une a un receptor para EGF (EGFR) o a un receptor para HER2 (HER2/neu) , en donde cuando menos uno de los anticuerpos es un anticuerpo humano o fragmento de éste.
2. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en donde la primera y segunda especificidades de unión están genéticamente fusionadas.
3. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en donde la primera y segunda especificidades de unión están ligadas en forma covalente.
4. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en donde las especificidades de unión son anticuerpos humanos o fragmentos de estos.
5. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario. j^j^?^Aiíí^^A¿t_
6. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo Fab' .
7. Una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo humano o fragmento de éste que se une a un receptor para Fca, ligado a EGF.
8. Una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo humano monocatenario o fragmento de éste que se une a un receptor para Fca, ligado a EGF.
9. Una molécula multiespecífica que comprende: una primera especificidad de unión para un receptor para Fca una segunda especificidad de unión para un receptor para HER2; y una tercera especificidad de unión para un receptor para EGF en donde cuando menos una de las especificidades de unión es un anticuerpo humano o un fragmento de éste.
10. La molécula multiespecífica de la reivindicación 9, en donde la primera, segunda y tercera especificidades de unión están genéticamente fusionadas. ,.t i i.
11. La molécula multiespecífica de la reivindicación 9, en donde la primera y segunda especificidades de unión son anticuerpos humanos o fragmentos de estos. 5
12. La molécula multiespecífica de la reivindicación 9, en donde cada una de la primera, segunda y tercera especificidades de unión son anticuerpos humanos o • fragmentos de estos. 10
13. La molécula multiespecífica de la reivindicación 9 u 11, en donde la tercera especificidad de unión comprende el EGF.
14. Una molécula multiespecífica que comprende: 15 un anticuerpo humano o fragmento de éste que se une a un receptor para Fca un anticuerpo humano o fragmento de éste que se une a un receptor para HER2, y EGF. 20
15. La molécula multiespecífica de la reivindicación 14, en donde la primera, segunda y tercera especificidades de unión están genéticamente fusionadas.
16. La molécula multiespecífica de la reivindicación 14, 25 en donde la primera y segunda especificidades de unión son anticuerpos monocatenarios y fragmentos de anticuerpos .
17. Un método para inducir la muerte de células mediada por células efectoras de una célula tumoral caracterizada por la sobre expresión del receptor para EGF (EGFR) o del receptor para HER2 (HER2/neu) , comprende poner en contacto la célula tumoral con una molécula biespecífica o multiespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
18. Un complejo molecular que comprende: a) dos o más especificidades de unión para un componente sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno; y b) cuando menos un antígeno ligado a las especificidades de unión, en donde el componente media la internalización del complejo molecular cuando se une por las especificidades de unión.
19. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde el complejo comprende tres o más especificidades de unión.
20. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde las especificidades de unión comprenden un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno de éste.
21. El complejo molecular de cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en donde cuando menos una de las especificidades de unión se une a un receptor para Fc (FcR) sobre una célula presentadora de antígeno.
22. El complejo molecular de la reivindicación 21, en donde el FcR es un receptor para Fc? o un receptor para Fca.
23. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde una o más de las especificidades de unión comprende un anticuerpo seleccionado de H22 (ATCC depósito No. CRL11177), M22 (ATCC depósito No. HB12147), M32.2 (ATCC depósito No. HB 9469) y fragmentos que se unen al antígeno de éstos.
24. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde las especificidades de unión se unen al mismo epítope del componente de la superficie celular.
*A? **0*&**-A vi*-.***. t k 25. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde las especificidades de unión se unen a epítopes diferentes del componente de la superficie celular.
26. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde las especificidades de unión se unen a diferentes componentes de la superficie celular.
27. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde el antígeno se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de tumor, un autoantígeno y un antígeno propio .
28. El complejo molecular de la reivindicación 18, en donde el antígeno se une a Fc?RI .
29. El complejo molecular de la reivindicación 28, en donde el antígeno comprende un anticuerpo seleccionado de H22 (ATCC depósito No. CRL11177), M22 (ATCC depósito No. HB12147), M32.2 (ATCC depósito No. HB 9469) y fragmentos que se unen al antígeno de éstos.
30. Un método para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria contra un antígeno en un individuo, consiste en administrar al individuo un complejo molecular de cualquiera de las reivindicaciones 18-29, de modo que se mejore o induzca la respuesta inmunitaria contra el antígeno en el individuo. 5
31. Un método para inmunizar a un individuo, consiste en administrar al individuo un complejo molecular de cualquiera de las reivindicaciones 18-29.
32. Un método para inducir o mejorar la presentación de 10 un antígeno por una célula presentadora de antígeno, consiste en poner en contacto el antígeno con la célula presentadora de antígeno, en donde el antígeno está ligado a una o más especificidades de unión para un componente sobre la superficie de la célula presentadora 15 del antígeno que media la internalización del antígeno cuando se une mediante las especificidades de unión.
33. El método de la reivindicación 32, en donde el antígeno se une a tres o más especificidades de unión. 20
34. El método de la reivindicación 32, en donde las especificidades de unión comprenden un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno de éste. 25 ¡jMjßÉÜH
35. El método de la reivindicación 32, en donde el anticuerpo se une a un receptor de Fc (FcR) .
36. El método de la reivindicación 32, en donde el 5 antígeno se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de tumor, un autoantígeno y un antígeno propio. ??ÍÍ¡^'t IAÍ^*^'-''-^~ - ¿t.?&jt*?j,lutl??* .. * ... . ?i i .- ^., -:.....„-, ..a--^..:^„..^. . .--...„.. .- .. .i i r i 1 VlUA^^ RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describen moléculas multiespecíficas que inducen muerte mediada por células efectoras de células blanco. Las moléculas son "multiespecíficas" porque se unen a múltiples (dos o más) objetivos distintos, uno de los cuales es un receptor de Fc sobre la superficie de una célula inmune. Las moléculas multiespecíficas de la invención incluyen moléculas compuestas de cuando menos una porción que se une a un receptor de Fc, como puede ser un receptor de Fc? (por ejemplo Fc?RI) o un receptor de Fca, y cuando menos otra porción que se une a un objetivo diferente, como puede ser un antígeno o una célula de tumor o un patógeno. Las moléculas multiespecíficas de la invención también incluyen "complejos multímeros" del antígeno compuestos de múltiples (es decir dos o más) porciones que se unen a una molécula sobre una célula presentadora de antígeno (APC) , como puede ser un receptor de Fc, ligadas a uno o más antígenos. Estos complejos multímeros se dirigen a los antígenos, como pueden ser los auto-antígenos, a las APC para inducir y/o mejorar la internalización (endocitosis) , el procesamiento y/o presentación del antígeno por parte de la APC. Por tanto, estas moléculas pueden utilizarse para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria in vivo o in vi tro contra una proteína normalmente no inmunogénica, como puede ser un antígeno propio. En una modalidad particular, cuando menos una porción de las moléculas multiespecíficas comprende un anticuerpo humanizado o humano o fragmento de anticuerpo (por ejemplo ScFv o Fab') que se une a un receptor de Fc o a un receptor sobre una célula objetivo (por ejemplo EGF-R o HER2) .
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