MXPA02000837A - Conjugados de proteasa que tienen regiones epitopes protegidas estericamente. - Google Patents

Abstract

La presente descripcion se refiere a conjugados de proteasa de subtilisina que comprenden una porcion de proteasa y una o mas porciones de adicion, cada porcion de adicion esta covalentemente unida a una posicion de proteccion del epitope de la porcion proteasa, los conjugados de proteasa tienen inmunogenicidad disminuida en relacion con una proteasa parental; la presente descripcion ademas se refiere a composiciones para limpieza cuidado personal que comprenden los conjugados de proteasa.

Description

CONJUGADOS DE PROTEASA QUE TIENEN REGIONES EPITOPES PROTEGIDAS ESTERICAMENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteasas de subtilisina químicamente modificadas las cuales son útiles en composiciones tales como, por ejemplo, composiciones de cuidado personal, composiciones para lavandería, composiciones para limpieza de superficies duras, y composiciones de limpieza para carga pesada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enzimas hacen la clase más grande de proteínas que ocurren naturalmente. Una clase de enzimas incluye proteasas las cuales catalizan la hidrólisis de otras proteínas. Esta capacidad para hidrolizar proteínas típicamente se ha explotado al incorporar proteasas que ocurren naturalmente y diseñadas genéticamente dentro de composiciones de limpieza, particularmente aquellas relevantes para las aplicaciones de lavanderías. En las técnicas de limpieza, la más ampliamente utilizada de estas proteasas son las serinproteasas. La mayoría de estas serinproteasas se producen mediante organismos bacterianos aunque algunas se producen t«« t?. .t a,_ '. bat uta» . <tik*»> M ^AiiU li por otros organismos, tales como hongos. Véase Siezen et al., "Homology Modelling and Protein Engeenering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serin Proteases", Protein Engeenering, Vol. 4, No. 7, pp. 719-737 (1991 ). Desafortunadamente, la eficiencia de las proteasas de tipo silvestre en sus ambientes naturales frecuentemente no se optimiza para el ambiente artificial de una composición de limpieza. Específicamente, las características de las proteasas tales como, por ejemplo, estabilidad térmica, estabilidad de pH, estabilidad oxidativa, y especificidad de sustrato no se optimizan necesariamente para la utilización fuera del ambiente natural de la proteasa. Varios métodos se han empleado para alterar la secuencia de aminoácidos de las serinproteasas de tipo silvestre con el objetivo de incrementar la eficiencia de la proteasa en el ambiente de lavado no natural. Estos métodos incluyente que el re-diseño genético y/o la modificación química de proteasas para mejorar su estabilidad térmica y para mejorar la estabilidad de oxidación de bajo condiciones muy diversas. Sin embargo, debido a que dichas proteasas modificadas son extrañas a los mamíferos, de esta son antígenos potenciales. Como antígenos, estas proteasas causan una respuesta inmunogénica y/o alergénica (en adelante colectivamente descrita como respuesta inmunogénica) en mamíferos. Además, mientras que el re-diseño genético y la modificación química de las proteasas ha sido prominente que en la búsqueda continua ^fc^^ MiUMlilfMikflaMM para proteasas más altamente efectivas para aplicaciones para lavandería, dichas proteasas no se han utilizado comercialmente en composiciones de cuidado personal y detergentes para carga pesada. Una razón principal para la ausencia de éstas proteasas en productos tales como, por ejemplo, 5 jabones, geles, lavados corporales, champú, y detergentes para vajillas de alta carga de debe al problema de sensibilización humana que lleva a respuestas ¡nmunogénicas no deseables. Por lo tanto sería altamente ventajoso promover una composición de cuidado personal de un detergente de carga pesada la cual proveería de las propiedades de limpieza de 10 proteasas sin la provocación de una respuesta inmunogénica. Actualmente, la respuesta inmunogénica a las proteasas puede minimizarse al inmovilizar, granular, revestir, o disolver proteasas modificadas químicamente para evitar que estén sueltas en el aire. Estos métodos, a pesar de que se dirigen a la exposición del consumidor a las proteasas en el aire, 15 aún presenta los riesgos asociados con extendido contacto al tejido con la composición terminada y exposición del trabajador al polvo o aerosol que contiene proteasas durante su elaboración. También se ha propuesto que la reducción en la inmunogenicidad de una proteasa puede lograrse al unir polímeros a la 20 proteasa. Véase, por ejemplo., patente de E.U.A. No. 4, 179, 337, Davies et al., expedida el 18 de diciembre de 1979; patente de E.U.A. No. 5, 856, 451 , Olsen et al., asignada a Novo Nordisk, expedida el 5 de enero de 1999; el documento WO de 99/00489, Olsen et al., asignada a Novo Nordisk, publicada el 7 de enero de 1999; el documento WO 98/30682, Olsen et al., asignada a Novo Nordisk, publicada el 16 de julio de 1998; y el documento WO 98/35026, Von Der Osten et al., publicada el 13 de agosto de 1998. Sin embargo, dichas propuestas no han sugerido la importancia de los polímeros unidos a la regiones de aminoácidos de la proteasa las cuales son responsables para la respuesta inmune (es decir, epítopes). Recientemente se ha descubierto que la proteasa subtilisina comprende tres regiones de epítopes y que la conjugación de uno o más polímeros, polipéptidos, u otros grupos deben unirse a una o más de esta regiones para efectuar la reducción significativa en la inmunogenicidad de la proteasa. Véase, por ejemplo., solicitud de patente de E.U.A. No. 09/088, 912, Weisgerber et al., asignada a The Procter & Gamble Co., expedida el 2 junio de 1998. Los presentes inventores han descubierto que la protección estérica cerca de una o más de la regiones epítopes de la proteasa es un mecanismo alternativo para prevenir o impedir la presentación de un epítope y disminuir la ¡nmunogenicidad de la proteasa. De conformidad, los presentes inventores proveen subtilisinas modificadas en donde la modificación está en una región en proximidad estérica a una o más de la regiones epítopes. Los presentes inventores han descubierto por lo tanto proteasas subtilisina las cuales evocan una respuesta inmunogénica disminuida manteniendo aún su actividad como una proteasa eficiente y activa. De conformidad, los conjugados de proteasa presentes son adecuados para uso en varios tipos de li i i.? „ ». ,. . «. i. . .. «» ; , - ^ . » tl r ti ?iu_r __________ _É___|_________; composiciones incluyendo, pero no limitados a, composiciones para lavandería, vajillas, superficies duras, cuidado de la piel, cuidado del cabello, cuidado de belleza, cuidado oral, y cuidado de lentes de contacto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a conjugados de proteasa que comprenden una porción de proteasas y una o más porciones de adición, en donde cada porción esta covalentemente unida a una posición de protección del epítope de la porción de proteasa, en donde: (a) las posiciones de protección del epítope para la primera región del epítope se seleccionan a partir de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41 , 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215, y 216 que corresponden a la subtilisina BPN'; (b) las posiciones de protección del epítope para la segunda región del epítope se seleccionan a partir de 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 91 , 99, 100, 101 , 102, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141 , 144, y 145 que corresponden a la subtilisina BPN'; y (c) las posiciones de protección del epítope para la tercera región del epítope se seleccionan a partir de 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 265, 269, 271 , 272, y 275 que corresponden a la subtilisina BPN'; y donde las porciones de adición cada una, independientemente, tiene la estructura: donde X se seleccionan a partir de cero y una porción de unión; R-i se selecciona partir de cero, un primer polipéptido, y un primer polímero; y R2 se selecciona a partir de cero, un segundo polipéptido, y un segundo polímero; donde al menos uno de X, RL y R2 no es cero. Los conjugados de proteasa de la presente invención tienen inmunogenicidad disminuida en relación a la proteasa parental. De conformidad, dichos conjugados de proteasa son adecuados para uso en varios tipos de composiciones incluyendo, pero no limitadas a, composiciones para lavandería, vajillas, superficies duras, cuidado de la piel, cuidado del cabello, cuidado de belleza, cuidado oral, y cuidado de lentes de contacto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los componentes esenciales de la presente invención se describen a continuación. También se incluyen descripciones no limitantes de varios componentes opcionales y preferidos útiles en las modalidades de la presente invención. La presente invención puede comprender, consistir de, o consistir esencialmente de cualquiera de los componentes requeridos u opcionales y/o limitaciones descritas en la presente. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso a menos que se indique de otra manera. Todos los porcentajes se calculan basándose en la composición total a menos que se indique de otra manera. Todos los niveles de componentes o de composición que están en referencia al nivel activo de ese componente o composición, que están sin impurezas, por ejemplo, solventes residuales o subproductos, los cuales pueden estar presentes en las fuentes comercialmente disponibles. Todos los documentos referidos en la presente, incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Referidos en la presente que están los nombres registrados para materiales incluyendo, pero no limitados a, enzimas. Los inventores en la presente no pretende limitarse por los materiales bajo un cierto nombre registrado. Los materiales equivalentes (por ejemplo, aquellos obtenidos a partir una fuerte diferente bajo un hombre diferente o número de catálogo (referencia)) a aquellos referidos mediante el nombre registrado pueden substituirse y utilizarse en los conjugados de proteasa y en las composiciones en la presente. Como se utilizan en la presente, las abreviaturas se utilizarán para describir aminoácidos. El cuadro uno provee una lista de las abreviaturas utilizadas en la presente: -i. .ti CUADRO 1 Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "mutación" que se refiere a una alteración en una secuencia génica y/o una secuencia de aminoácidos producida por aquellas secuencias génicas. Las mutaciones incluyen deleciones, sustituciones, y adiciones de residuos de aminoácidos a la secuencia de proteína de tipo silvestre. Como se utiliza en la presente, el término "parental" se refiere una proteína (de tipo silvestre o variante) de la cual se utiliza para modificación adicional para formar un conjugado de proteasa en la presente. Cromos utiliza la presente, el término "tipo silvestre" se refiere una proteína, por ejemplo una proteasa, u otra enzima producida mediante organismos no mutados. Como se utiliza en la presente, el término "variante" significa una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos la cual difiere a partir de la proteína correspondiente de tipo silvestre. Como se utiliza en la presente, todos los pesos moleculares de los polímeros se expresan como presos de peso molecular promedio. Como se refiere en la presente, aunque los conjugados de la presente invención no se limitan a aquellos que comprenden subtilisina BPN' y variantes de los mismos, todos los aminoácidos se enumeran con referencia a la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' la cual se representa por SEQ ID NO:1 . La secuencia de aminoácidos para subtilisina BPN' se describe adicionalmente por Wells et al., Nucleic Acid Research, Vol. II, pp. 791 1-7925 (1983).

Conjugados de proteasa de la presente invención Los conjugados de proteasa de la presente invención son compuestos que comprenden una porción proteasa y una o más porciones de adición, en donde la porción proteasa y las porciones de adición están conectadas mediante uniones covalentes (es decir, enlaces covalentes).

Porciones de proteasa Las porciones de proteasa en la presente son proteasas similares a subtilisina, ya sea de tipo silvestre o variantes de la mismas. Como 5 se utiliza la presente, el término "proteasa semejante a subtilisina" significa una proteasa que tiene al menos 50%, y preferiblemente 80%, de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de subtilisina BPN'. Las proteasas semejantes a subtilisina de tipo silvestre se producen por, por ejemplo, de microorganismos Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, ío Bacillus amylosaccharicus, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, y Bacillus subtilis. Una discusión que se refiere a las serinproteasas semejantes a subtilisina y a sus homologías puede encontrarse en Siezen et al., "Homology Modelling and Protein Engeenering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", Protein Engeenering, Vol. 4, No. 7, pp. 719- 15 737 (1991 ). Las porciones de proteasa preferidas para uso en la presente incluyen, por ejemplo, aquellas obtenidas a partir de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, y Bacillus subtilis, subtilisina BPN, subtilisina BPN', subtilisina Carisberg, subtilisina DY, subtilisina 309, 20 proteinasa K, y termitasa, incluyendo Alcalse ® A S (comercialmente disponible a partir de Novo Industries, Copenhagen, Dinamarca), Esperase ® (Novo Industries), Savinase ® (Novo Industries), Maxatase ® (comercialmente disponible a partir de Genencor International Inc.), Maxacal ® (Genencor ?t jfr- te& **l??e!¡¡t _ J , '¿ . . A- t . i i International Inc.), Maxapem 15® (Genencor International Inc.), y variantes de los precedentes. Las porciones de proteasa especialmente preferidas para uso en la presente incluyen aquellas que se obtienen a partir de Bacillus amyloliquefaciens y variantes de la misma. Las porciones de proteasa más 5 preferidas en la presente son subtilisina BPN' y variantes de la misma. Las variantes especialmente preferidas de subtilisina BPN', en adelante referida como "Proteasa A", para uso como secuencias de aminoácidos parentai en la presente se describen en la patente de E.U.A. No. 5, 030, 378, Venegas, expedida el 9 de julio de 1991 , como se caracteriza ío mediante la secuencia de aminoácidos para subtilisina BPN' con las siguientes mutaciones: (a) Gly que la posición 166 se sustituye con un residuo de aminoácido seleccionado partir de Asn, Ser, Lys, Arg, His, Gln, Ala y Glu; Gly en la posición 169 se sustituye con Ser; y Met en la posición 222 se sustituye 15 con un residuo de aminoácido seleccionado partir de Gln, Phe, His, Asn, Glu, Ala y Thr; o (b) Gly de la posición 160 se sustituye con Ala, y Met de la posición 222 se sustituye con Ala. Las variantes adicionalmente preferidas de subtilisina BPN', en la 20 presente referidas como "Proteasa B", para uso como secuencias de aminoácidos parentales en la presente se describen en EP 251 , 446, asignada a Genencor International. Inc., publicada el 7 de enero de 1988, como caracterizada por la secuencia de aminoácidos de subtilisina BPN' de tipo -*a ^MM^^M*M^M^- silvestre con mutaciones en una o más de las siguientes posiciones: Tyr21 , Thr22, Ser24, Asp36, Ala45, Ala48, Ser49, Met50, His67, Ser87, Lys94, Val95, Gly97, Ser101 , Gly102, Gly103, Ile107, Gly1 10, Met124, Gly127, Gly128, Pro129, Leu135, Lys170, Tyr171 , Pro172, Asp197, Met199, Ser204, Lys213, Tyr214, Gly215, y Ser221 ; o dos o más de las posiciones listadas anteriormente en combinación con una o más mutaciones en las posiciones seleccionadas a partir de Asp32, Ser33, Tyr104, Alai 52, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217, y Met222. Otras variantes de subtilisina BPN' preferidas para uso la presente de que se refieren en adelante como "Proteasa C", y se describen en el documento WO 95/10615, asignada a Genencor International Inc., publicada el 20 de abril de 1995, como caracterizada por la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de tipo silvestre con una mutación en la posición aSN76, en combinación con mutaciones en una o más de las posiciones seleccionadas a partir de Asp99, Ser101 , Gln103, Tyr104, Ser105, Ile197, Asn109, Leu126, Gly127, Gly128, Leu135, Glu156, Gly166, Glu195, Asp197, Ser204, Gln206, Pro210, Ala216, Tyr217, Asn218, Met222, Ser260, Lys265, y Ala274. Otras variantes de subtilisina BPN' preferidas para uso la presente, referidas en adelante como "Proteasa D", se describen en la patente de E.U.A. No. 4, 760, 025, a Estell et al., expedida el 26 de julio de 1988, como caracterizada por la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de tipo silvestre con mutaciones en una o más de las posiciones seleccionadas a m í^ ^ .»....^...... ^^£^^^¡^^¿ partir del grupo que consiste de Asp32, Ser33, His64, Tyr104, Asn155, Glu156, Gly169, Phe189, Tyr217, y Met222. Las porciones de proteasa más preferidas en la presente se seleccionan a partir del grupo que consiste de subtilisina BPN', Proteasa A, Proteasa B, Proteasa C, y Proteasa D, con la Proteasa D siendo la más preferidas. Sin pretender limitarse por la teoría, las porciones de proteasa en la presente tiene entre regiones epítopes: una primera región epítope, una segunda región epítope, y una tercera región epítope. La primera región epítope ocurre en las posiciones 70 -84 que corresponden a la subtilisina BPN'; la segunda región epítope ocurre en las posiciones 103 - 126 de corresponden a la subtilisina BPN'; y la tercera región epítope ocurre en las posiciones 220 -246 que corresponda la subtilisina BPN'. Véase, por ejemplo., solicitud de patente de E.U.A. No. de serie 09/088, 912, a Weisgerber et al., asignada a The Procter & Gamble Co., presentada el 2 de junio de que 998; la solicitud de patente copendiente provisional de E.U.A. No. de serie 60/144, 991 , a Rubingh et al., "Serine Protease Variants Having Amino Acid Substitutions and Deletions in Epitope Regions" presentada el 22 de julio de 1999; y la solicitud de patente copendiente provisional de E.U.A. No. de serie 60/144, 980, Sikorski et al., "Serine Protease Variants Having Amino Acid Substitutions in Epitope Regions" presentada el 22 de julio de 1999. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente posiciones de protección en epítopes de las cuales están en proximidad estérica a al menos uno de las regiones de epítopes precedentes. Además se ha descubierto que estos epítopes están protegidos de la hidrólisis, y por lo tanto de exposición de epítopes, mediante uniones covalentes a una o más porciones de adición a un aminoácido de la porción proteasa en una posición 5 de protección del epítope. Las posiciones de protección del epítope que son apropiadas para modificación covalente con una porción de adición depende de que epítope uno desea proteger. De más preferiblemente, al menos una porción de adición se une covalentemente a una posición de protección del epítope 10 para la primera región del epítope. Se ha descubierto que las posiciones de protección del epítope para la primera región del epítope son 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41 , 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215, y 216 que corresponden a la subtilisina BPN'. Preferiblemente, las posiciones de 15 protección del epítope para la primera región del epítope son 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 40, 41 , 43, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 214, y 215 que corresponden a la subtilisina BPN'. Más preferiblemente, las posiciones de protección del epítope para la primera región del epítope son 1 , 2, 3, 4, 5, 17, 40, 41 , 43, 67, 86, 87, y 214 que corresponden a la subtilisina BPN'. 20 Se ha descubierto adicionalmente que las posiciones de protección del epítope para la segunda región del epítope son de 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 91 , 99,100, 101 , 102, 127,128, 129, 130, 531 , 732, 133, 134, 136, 737, 138, 140, 141 , 144, y 145 que corresponden a la ¿i¿,*,>*uAt-{ - - — "- subtilisipa BPN'. Preferiblemente, las posiciones de protección del epítope para la segunda región del epítope son de 27, 47, 48, 50, 52, 102,127,128, 130, 131 , 132, 134, 138, y 141 que corresponden a la subtilisina BPN". Se ha descubierto adicionalmente que las posiciones de protección del epítope para la tercera región del epítope se seleccionan a partir del grupo que consiste de 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 271 , 272, y 275 que corresponden a la subtilisina BPN'. Preferiblemente, las posiciones de protección del epítope para la segunda región del epítope son 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 789, 197, 203, 204, 253, 254, 265, y 275 que corresponden a la subtilisina BPN'. En una modalidad preferida de la presente invención, la porción proteasa comprende una secuencia modificada de una secuencia de aminoácidos parental. La secuencia de aminoácidos parental puede ser cualquiera de las proteasas anteriormente descritas, con las mismas limitaciones preferidas que se describieron anteriormente. En esta modalidad, la secuencia de aminoácidos parental se sustituye en uno o más de los residuos de aminoácidos parental es con un aminoácido sustituye que para producir una porción proteasa adecuada para unión con una o más de las porciones de adición presentes. De conformidad con la presente invención, la sustitución debe hacerse en una o más de las posiciones de protección del epítope. Las posiciones de protección del epítope, y limitaciones preferidas de las mismas, se describieron anteriormente.

L.-t « , A ^«., • "^ • - Con el objeto de lograr la mejor unión selectiva en una o más de las posiciones de protección del epítope de una o más de las porciones de adición de la porción proteasa, la sustitución debe hacerse con un aminoácido sustituyepte el cual no ocurre en (es único a) la secuencia de aminoácidos parental. En este respecto, cualquier aminoácido sustituyente él cuál es único a la secuencia de aminoácidos parental puede utilizarse. Por ejemplo, debido a que un residuo de cisteína no ocurre en la secuencia de aminoácidos del tipo silvestre para la subtilisina BPN', una sustitución de la subtilisina BPN' con una o más residuos de cisteína en una o más de las posiciones de protección del epítope es adecuada para la presente invención. En donde un residuo de cisteína ocurre en una posición diferente a la posición de protección del epítope de la secuencia de aminoácidos parental, es preferible sustituir otro residuo de aminoácidos para cada una de ésas posiciones para capacitar el acoplamiento selectivo con una o más porciones de adición de una posición de protección del epítope. La cisteína es el aminoácido sustituyente más preferido para sustitución en una o más de las posiciones de protección del epítope. Otros aminoácidos sustituyentes preferidos incluyen lisina. Donde el aminoácido sustituyente es lisina, se prefiere mutar los residuos de lisina que ocurren en las posiciones diferentes a las posiciones de protección del epítope de la secuencia de aminoácido parentales a otro residuo de aminoácido de tal manera que la funcionalización de uno o más de los residuos de lisina en una posición de protección del epítope es selectiva. Por ejemplo, un residuo de lisina ocurre en la posición 43 de la subtilisina BPN' la cual es una posición de protección del epítope como se definen en la presente. Las mutaciones sitio selectivas de todos los demás residuos de lisina que ocurren en la secuencia de subtilisina BPN' pueden llevarse a cabo mediante la funcionalización selectiva de residuo de lisina en la posición 43 con una porción de adición. Alternativamente, los residuos aminoácidos en cualesquiera de las posiciones de protección del epítope pueden mostrarse a lisina (por ejemplo) después de la funcionalización selectiva en aquellas posiciones mediante una porción de adición.

Porciones de adición Los conjugados de proteasa de la presente invención comprenden una o más porciones de adición en donde cada una de las porciones de adición está covalentemente unida a uno de los residuos de aminoácidos en la posición de protección del epítope como se describe en la presente. La porción de adición puede ser cualquier estructura química. Preferiblemente, la porción de adición oculta estéricamente la posición de protección del epítope al cual está unida, o cualquier otra posición de protección al epítope como se define en la presente. Los ejemplos no limitantes de porciones de adición ¡ncluyen moléculas orgánicas incluyendo, pero no limitadas a, moléculas que tienen un peso molecular menor que aproximadamente 1600, preferiblemente menor que aproximadamente 800, más preferiblemente menor que aproximadamente 400, y más preferiblemente íMMtiMüiMÉkiau ÁUMW<U> . * *& menor que aproximadamente 300; polipéptidos; y polímeros. Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" significa una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos. Como se utiliza en la presente, el término "polímero" significa cualquier molécula que comprende dos o más unidades 5 monoméricas idénticas (preferiblemente cinco o más idénticas). Preferiblemente, la porción de adición tiene la estructura: X — 10 donde X se selecciona a partir de cero y una porción de unión; Ri se selecciona a partir del grupo que consiste de cero, un primero polipéptido, y un primer polímero; y R2 se selecciona a partir del grupo que consiste de cero, un segundo polipéptido y un segundo polímero; donde al menos uno de X, R1 t y R2 no es cero. 15 Preferiblemente, el conjugado de proteasa comprende de 1 a aproximadamente 15, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, y más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 porciones de adición. Donde Ri y R2 son cada una, independientemente, porciones 20 polipeptídicas o porciones poliméricas, Ri y R2 pueden ser idénticas o diferentes. Preferiblemente, donde Ri es una porción polipeptídica, R2 se selecciona a partir de cero y una porción polipeptídica, y más preferiblemente es cero. Más preferiblemente, donde Rt es una porción polipeptídica, R2 se l^^ |j &^ ß?. selecciona a partir de cero y una porción polipeptídica idéntica, y más preferiblemente es cero. Preferiblemente, donde Ri es una porción polimérica, R2 selecciona a partir de cero y una porción polimérica. Más preferiblemente, donde Ri es una porción polimérica R2 se selecciona a partir de cero y una 5 porción polimérica idéntica. Donde al menos uno de Ri y R2 es respectivamente, el primer polímero y el segundo polímero, entonces X preferiblemente no es cero.

Porciones polipeptídicas 0 Las porciones polipeptídícas descritas en la presente incluyen aquellas que comprenden dos o más residuos de aminoácidos. Las porciones polipeptídicas preferidas se seleccionan a partir de proteínas, incluyendo enzimas. Las enzimas preferidas incluyen proteasas, celulasas, lipasas, amilasas, peroxidasas, microperoxidasas, hemicelulasas, xilanasas, 5 fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, queratinasas, reductasas (incluyendo, por ejemplo, NADH reductasas), oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, ß- glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasas, transferasas, isomerasas (incluyendo, por ejemplo, glucosa isomerasa y xilosa isomerasa), liasas, ligasas, sintetasas, y enzimas basadas en fruta (incluyendo, por ejemplo, papaína). Las enzimas más preferidas para uso como porciones polipeptídicas ¡ncluyen proteasas, celulasas, amilasas, ßÍHk. *. . » i >*..» . . , ,*.,.-., »..* Iipasas, y enzimas basadas en fruta, con las proteasas siendo incluso más preferidas. Los ejemplos de lipasas para uso como porciones polipeptídicas incluyen aquellas derivadas a partir de los siguientes microorganismos: Humicola, Pseudomonas, Fusarium, Mucor, Chromobacterium, Aspergillus, Candida, Geotrícum, Penicillium, Rhizopus, y Bacillus. Los ejemplos de lipasas comerciales incluyen Lipolase®, Lipolase Ultra®, Lipozyme®, Palatase®, Novozym435®, y Lecitase® (todas las cuales están comercialmente disponibles a partir de Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), Lumafast® (comercialmente disponible a partir de Genencor, Int., Rochester, NY), y Lipomax ® (Genencor, Int.). Los ejemplos de proteasas para uso como las porciones polipeptídicas incluyen serinproteasas, quimotripsina, y enzimas tipo elastasa.

Las proteasas más preferidas para uso como porciones polipeptídicas incluyen serinproteasas, como se definieron en la presente anteriormente en la discusión de "porciones proteasas". Más preferiblemente, donde la porción polipeptídica es una serinproteasa, la porción polipeptídica porta, independientemente, la definición de una porción proteasa como se describe en la presente anteriormente. Preferiblemente, como se describe anteriormente, la porción polipeptídica tiene una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos parental donde la modificación es en una o más de las posiciones de protección del epítope como se describe en la presente anteriormente (cuya secuencia de aminoácidos parental puede referirse como una "segunda" secuencia de aminoácidos parental). En este caso, una de las porciones de unión (donde la porción de unión no es cero) o la porción proteasa (donde la porción de unión es cero) está covalentemente unida a la porción polipeptídica a través de uno de los aminoácidos sustituyentes presentes en una de las posiciones de protección del epítope de la porción polipeptídica. Donde la porción polipeptídica es una serinproteasa, los mismos grupos preferidos de posiciones de protección del epítope se aplican como se describe en la presente anteriormente, para las porciones proteasa y sus secuencias correspondientes de aminoácidos parentales. Más preferiblemente, donde la porción polipeptídica es una serinproteasa, la porción polipeptídica y la porción proteasa son porciones equivalentes. En este caso, la porción polipeptídica y la porción proteasa más preferiblemente están unidas a través de un puente disulfuro, donde X es cero, y más preferiblemente, R2 es cero.

Porciones poliméricas Las porciones de adición en la presente pueden comprender una porción poiimérica. Como se utiliza en la presente, el término porción polimérica significa cualquier molécula que comprende dos o más (preferiblemente cinco o más idénticas) unidades monoméricas idénticas. Los ejemplos de porciones poliméricas adecuadas incluyen óxidos de polialquileno, polialcoholes, polivinilalcoholes, policarboxilatos, ^^^^^¡^^^^ ^^j^^ A^^^^^ polivinilpirrolidonas, celulosas, dextranos, almidones, glucógeno, agarosas, goma guar, pululano, inulina, goma xantán, carragenano, pectina, hidrolizados de ácido algínico, y hidrolizados de quitosán. Los óxidos de polialquileno preferidos incluyen polietilenglicoles, metoxipolitilenglicoles, y 5 polipropilenglicoles. Los dextranos preferidos incluyen carboximetildextranos. Las celulosas preferidas incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa, e hidroxipropilcelulosa. Los almidones preferidos incluyen almidones de hidroxietilo y almidones de hidroxipropilo. Los polímeros más preferidos son óxidos de polialquileno. La 10 porción polimérica más preferida es polietilenglicol. Donde Ri y R2 son cada uno, independientemente, porciones poliméricas , Ri y R2 preferiblemente tienen un peso molecular colectivo (es decir, peso molecular de R1 más peso molecular de R2) de aproximadamente 0.2 kD (kilodaltones) a aproximadamente 40 kD, más preferiblemente de 15 aproximadamente 0.5 kD a aproximadamente 40 kD, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0.5 kD a aproximadamente 20 kD, y más preferiblemente de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 10 kD. Donde Ri y R2 son cada uno porciones poliméricas, Ri y R2 cada uno, independientemente, preferiblemente tiene un peso molecular de 20 aproximadamente 0.1 kD a aproximadamente 20 kD, más preferiblemente de aproximadamente 0.25 kD a aproximadamente 20 kD, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0.5 kD a aproximadamente 10 kD, y más preferiblemente de aproximadamente 0.5 kD a aproximadamente 5 kD.

Donde Ri y R2 son cada uno porciones poliméricas, la relación de pesos moleculares de R-. a R2 preferiblemente tiene un intervalo de aproximadamente 1 :10 a aproximadamente 10:1 , más preferiblemente de aproximadamente 1 :5 a aproximadamente 5:1 , y más preferiblemente de aproximadamente 1 :3 a aproximadamente 3:1. Donde R-. es una porción polimérica y R2 es cero, R1 preferiblemente tiene un peso molecular de aproximadamente 0.1 kD a aproximadamente 40 kD, más preferiblemente de aproximadamente 0.5 kD a aproximadamente 40 kD, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0.5 kD a aproximadamente 20 kD, y más preferiblemente de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 10 kD.

Porciones de unión Como se utiliza en la presente, X puede ser cero o una porción de unión la cual está opcionalmente covalentemente unida a una o más porciones polipeptídicas o una o más porciones poliméricas, o a ambas, y también está covalentemente unida a un residuo de aminoácido en una de las posiciones de protección del epítope de la porción proteasa. La porción de unión puede ser, generalmente, cualquier molécula pequeña, es decir, una molécula que tiene un peso molecular menor que aproximadamente 1600, preferiblemente menor que aproximadamente 800, más preferiblemente menor que aproximadamente 400, y más preferiblemente menor que aproximadamente 300. Las porciones de unión más preferidas incluyen ^j^^t^tJMU?t?iááM aquellas capaces de estar covalentemente unidas a un residuo de cisteína o a un residuo de lisina, más preferiblemente a un residuo de cisteína. Los ejemplos de porciones de unión y su química relacionada se describe en la patente de E.U.A. No. 5,446,090, de Harris, expedida el 29 de agosto de 1995; patente de E.U.A. No. 5,171 ,264, de Merrill, expedida el 15 de diciembre de 1992; patente de E.U.A. No. 5,162,430, de Rhee et al., expedida el 10 de noviembre de 1992; patente de E.U.A. No. 5,153,265, de Shadle et al., expedida el 6 de octubre de 1992; patente de E.U.A. No. 5,122,614, de Zalipsky, expedida el 16 de junio de 1992; Goodson et al., "SíteDirected Pegylation of Recombinant lnterleukin-2 at its Glycosylation Site", Biotechnology, Vol. 8, No. 4, pp. 343-346 (1990); Kogan, "The Synthesis of Substituted Methoxi-Poly(ethylene glycol) Derivatives Suitabie for Selective Protein Modification", Synthetic Communications, Vol. 22, pp. 2417-2424 (1992); e Ishii et al., "Effects of the State of the Succinimido-Ring on the Fluorescence and Structural Properties of Pyrene Maleimide-Labeled aa-Tropomyosin", Biophysical Journal, Vol. 50, pp. 75-80 (1986). La porción de unión más preferida es succinimida sustituida (por ejemplo, alquilo) o no sustituida. Como ejemplos adicionales, los siguientes reactivos no limitantes pueden utilizarse para formar la porción de unión: éster de N-[alfa-maleimidoacetoxijsuccinimida; N-5-azido-2-nitobenzoiloxisuccinimida; bismaleimidohexano; éster de N-[beta-maleimidopropiloxi]succinimida; bis[2- (succinimidiloxicarboniloxi)-etil]sulfona; bis[sulfosuccinimidil]suberato; 1 ,5- ...* . , - .U..?..I . * -', . . Adfc iA.^. .., .* . .. ... ^.1 -I .J difluoro-2,4, -dinitrobenceno; dimetiladipimato • 2HCI; dimetilpimelimidato • 2HCI; dimetilsuberimidato • 2HCI; disuccinimidil glutarato; disuccinimidil suberato; éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida; ácido N-hidrox?succinimidil-4-azidosalicílico; N-succinimidil-6-[4'-azido-2'-nitrofenilaminojhexanoato; N-hidroxisuccinimidil-2,3-dibromopropionato; succinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexan-1 -carboxilato; succinimidil 4-[p-maleimidofenilj-butirato; succinimidil 6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoato]; bis[2-(sulfosuccinimidiloxicarboniloxi)-etiljsulfona; éster de N-[gama-maleimidobutiriloxi]sulfosuccinimida; N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato; éster de N-[kapa-maleimidoundecanoiloxijsulfosuccinimida; éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida; sulfosuccinimidil[4-azidosalicilamido]hexanoato; sulfosuccinimidil 7-azido-4-metilcumarina-3-acetato; sulfosuccinimidil 6-[4'-azido-2'-nitrofenilamino]hexanoato; sulfosuccinimidil 4-[p-azidofenil]butirato; sulfosuccinimidil[4-iodoacetil]aminobenzoato; sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1 -carboxilato, y sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirato. Cada uno de estos reactivos está comercialmente disponible a partir de Pierce Chemical Co., Rockford, IL.

Porciones opcionales Los conjugados de proteasa pueden comprender adicionalmente una o más de otras estructuras químicas, incluyendo (por ejemplo) una o más moléculas pequeñas, polipéptidos, y/o polímeros unidos a otros residuos de la proteasa no ejemplificados en la presente o incluso en la posición de protección del epítope no conteniendo una porción adicional (en adelante referidas como "porciones suplementarias"), Las porciones suplementarias pueden incluir porciones polipeptídicas, porciones poliméricas, y porciones de unión como se describe en la presente anteriormente. Adicionalmente, por ejemplo, uno o más polímeros (más preferiblemente polietilenglicol) que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 Da, preferiblemente de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 2000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 5000 Da, preferiblemente de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 2000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 100 Da a aproximadamentelOOO Da, aún más preferiblemente de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 750 Da, y más preferiblemente aproximadamente 300 Da pueden estar covalentemente unidas a la porción proteasa en la presente en residuos diferentes a aquellos ejemplificados en la presente. Dichas pociones poliméricas pueden estar unidas directamente a la porción de proteasa en la presente, en cualquier ubicación de la porción proteasa, utilizando técnicas como se describen en la presente así como técnicas bien conocidas en la técnica (incluyendo a través de porciones de unión como se describe en la presente). Los ejemplos no limitantes de la conjugación del polímero de este tipo opcional se establecen en el documento WO 99/00849, de Olsen et al., Novo Nordisk A S, publicado el 7 de enero de 1999. , í . ? ? « , . . , ..** , Métodos de elaboración Las porciones proteasa que tienen una sustitución en uno o más de las posiciones de protección del epítope (o en cualquier otra localización de la porción) se preparan al mutar las secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de aminoácidos parental. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica; un ejemplo no limitante de uno de dichos métodos se establece a continuación: Un fagémido (pSS-5) que contiene el gen de subtilisina BPN' de tipo silvestre (Mitchinson, C. y J. A. Wells, "Protein Enginnering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN", Biochemistry, Vol. 28, pp. 4807-4815 (1989) se transforma en Escherichia coli dut- ung- cepa CJ236 y se produce un molde de ADN que contiene uracilo de una sola hebra utilizando el fago auxiliar VSCM13 (Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Methods in Enzymology, Vol 154, pp. 367-382 (1987), como se modificó por Yuckenberg et al., "Site-Directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors", Directed Mutagenesis a Practical Approach. McPherson, M. J. ed., pp. 27 - 48 (1991 ). La mutagénesis sitio-dirigida del iniciador modificada a partir del método descrito en Zoiler, M. J. y M. Smith, "Oligonucleotide - Directed Mutagenesis Using M13 - Derived Vectors: An Efficient and General Procedure for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA", Nucleic Acid Research, Vol. 10, pp. 6487 - 6500 (1982) se utiliza para producir todos los mutantes (esencialmente como se presentan por Yuckenberg et al., anteriormente mencionado).

-•* ^|^ Los oligonucleótidos se elaboran utilizando un sintetizador de ADN 380B (Applied Biosystems Inc.). Los productos de reacción de mutagénesis se transforman dentro de Escherichia coli cepa MM294 (American Type Culture Collection E. coli 33625). Todas las mutaciones se 5 confirmaron mediante secuenciación de ADN y el ADN aislado se transformó dentro de Bacillus subtilis cepa de expresión PG632 (Saunders et al., "Optimization of the Signal-Sequence Cleavage Site for Secretion from Bacillus subtilis of a 34-Amino Acid Fragment of Human Parathyroid Hormone", Gene, Vol. 102, pp. 277 - 282 (1991 ) y Yang et al., "Cloning of the ío Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis and the Use of the Cloned Gene to Créate an in vitro -Derived Deletion Mutation", Journal of Bacteriology, Vol. 160, pp. 15 - 21 (1984). La fermentación es como sigue: Las células de Bacillus subtilis (PG632) que contienen la proteasa de interés se crecen a fase logarítmica 15 media en un litro de caldo LB que contiene 10 g/L de glucosa, y se inoculan en un fermentador Biostat C (Braun Biotech, Inc., Allentown, PA) en un volumen total de 9 litros. El medio de fermentación contiene extracto de levadura, hidrolizado de caseína, almidón hidrolizado parcialmente soluble (Maltrin M- 250), antiespuma, amortiguadores, y minerales traza (véase "Biology of ßac/7//': 20 Aplications to Industry", Doi, R. H. y M. McGloughIin, eds. (1992)). El caldo se mantiene a pH constante de 7.5 durante la corrida de fermentación. La canamicina (50 µg/mL) se añade para selección de antibiótico del plásmido ^ H¡| [ Éla^ririUMdi^^Miii áHMAÉiiÉiMiliMtiá&IMaik&i mutagenizado. Las células se crecen por 18 horas a 37°C a una A6oo de aproximadamente 60 y el producto de cosecha. El caldo de fermentación se pasa a través de los siguientes pasos para obtener proteasa pura. El caldo se aclara de células de Bacillus subtilis mediante flujo tangencial en contra de una membrana de 0.16 µm. El caldo libre de células se concentra entonces mediante ultracentpfugación con una membrana con límite de peso molecular de 8,000. El pH se ajusta a 5.5 con amortiguador MES concentrado (ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico). La proteasa se purifica adicionalmente mediante cromatografía de intercambio catiónico con S-sefarosa y elución con gradientes de NaCl. Véase Scopes, R. K., "Protein Pupfication Principies and Practice", Springer-Verlag, New York (1984). Un ensayo de pNA (DelMar et al., Analytical Biochemistry, Vol. 99, pp. 316 -320 (1979)) se utiliza para determinar la concentración de proteasa activa para las fracciones colectadas durante el gradiente de elución. Este ensayo mide la velocidad a la cual la p-nitroanilina se libera conforme la proteasa hidroliza el sustrato sintético soluble, succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilina (sAAPF-pNA). La velocidad de producción del color amarillo a partir de la reacción de hidrólisis se mide a 410 nm en un espectrofotómetro y es proporcional a la concentración de la porción de proteasa activa. Además, las mediciones de absorbancia a 280 nm se utilizan para determinar la concentración total de proteína. La relación proteasa ?..Í,J? Au*-?. *«»*.. • * " -"fcj _i_í_ activa/proteína total da la pureza de la proteasa, y se utiliza para identificar las fracciones a ser agrupadas para la solución de almacenamiento. Para evitar la autolisis de la proteasa durante el almacenamiento, un peso igual de propilenglicol se añade a las fracciones agrupadas obtenidas a partir de la columna de cromatografía. Después de la terminación del procedimiento de purificación la pureza de la solución de almacenamiento de proteasa se monitorea con SDS-PAGE (electroforesis en gel de acrilamida docedil sulfato de sodio) y la concentración absoluta de enzima se determina mediante un método de titulación de sitio activo utilizando el inhibidor de tripsina tipo ll-T: clara de huevo de tortuga (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri). En la preparación para uso, la solución de almacenamiento de proteasa se eluye a través de una columna de exclusión de tamaño de Sephadex-G25 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) para retirar el propilenglicol y cambiar el amortiguador. El amortiguador MES en la solución de almacenamiento de proteasa se cambia por solución KH2PO 0.01 M, pH 5.5. Con la proteasa preparada ésta se puede utilizar para funcionalización de una o más porciones de adición para producir el conjugado de proteasa. El precursor a la porción de adición (el precursor a la porción de adición reacciona con el precursor a la porción de proteasa para formar el conjugado de proteasa el cual está comprendido de la porción de adición y la porción de proteasa. Dicha activación se conoce bien en la ^^#^^^^^ - ^^^^^^^^^5 técnica. Los ejemplos no limitantes de la preparación de conjugado de proteasa se proveen a continuación: EJEMPLO 1 Una proteasa que comprende un residuo de cisteína en una de las posiciones de protección del epítope se acopla con una porción polimérica de conformidad con el esquema anterior utilizando el siguiente método (donde "P" representa la porción proteasa menos el grupo tiol que resulta de la sustitución de cisteína y n es el número de unidades monoméricas repetidas del polietilenglicol (por ejemplo, n = 77). Se prepara una variante de subtilisina BPN' con una sustitución de leucina por tirosina en la posición 217 y una sustitución de cisteína por serina en la posición 3. Se logró una concentración de aproximadamente 2 mg/mL en amortiguador de fosfato (pH 5.5) de la variante. El pH entonces se eleva a 7.5 con hidróxido de sodio diluido. La variante se mezcla con la monometil polietilenglicol maleimida en una relación de 25:1 de polímero activado a exceso de variante. Después de una hora de mezclado a -,, .. > ¡ i liiftf^ temperatura ambiente, el pH de la mezcla se ajustó a 5.5 con el ácido fosfórico diluido y se filtra a través de un ultrafiltro con límite de peso molecular para retirar el exceso de polímero. El concentrado contiene el conjugado purificado de proteasa.

EJEMPLO 2 ( P )— SH ^^^^?*ja^j^^ i niift Una porción de proteasa que comprende un residuo de cisteína en una de las posiciones de protección del epítope se acopla con una porción polimérica de conformidad con el esquema anterior utilizando el siguiente método (donde "P" representa la porción proteasa menos el grupo tiol que resulta de la sustitución de cisteína y n es el número de unidades monoméricas repetidas del polietilenglicol (por ejemplo, n = 77). Se prepara una variante de subtilisina BPN' con una sustitución de leucina por tirosina en la posición 217 y una sustitución de cisteína por fenilalanina en la posición 17. Se logró una concentración de aproximadamente 2 mg/mL en amortiguador de fosfato (pH 5.5) de la variante. El pH entonces se eleva a 7.5 con hidróxido de sodio diluido. La variante se mezcla con la dimetil polietilenglicol maleimida en una relación de 25:1 de polímero activado a exceso de variante. Después de una hora de mezclado a temperatura ambiente, el pH de la mezcla se ajustó a 5.5 con el ácido fosfórico diluido y se filtra a través de un ultrafiltro con límite de peso molecular para retirar el exceso de polímero. El concentrado contiene el conjugado purificado de proteasa.

EJEMPLO 3 El polímero protegido con succinimida se acopla selectivamente a lisina en una o más de las posiciones de protección del epítope (donde "MPEG" y "PEGM" son equivalentes y representan monometilpolietilenglicoles ^^^^t^^^^^aai>^tt __M_______?_____É____»___ i ir ir na- t i TU, r i m u i m n pmimir • ni a iiiffl. i r» y donde "P" representa la porción proteasa menos el grupo lisina amina que se muestra): pH 8.5 M EJEMPLO 4 El polímero protegido con carbodiimida se acopla selectivamente a lisina en una o más de las posiciones de protección del epítope (donde "MPEG" y "PEGM" son equivalentes y representan monometilpolietilenglicoles y donde "P" representa la porción proteasa menos el grupo lisina amina que -» * ,! ..* H?Kt . i. ^ «.&**.., »- * « »-*- se muestra, y X y X' son cadenas laterales que comprenden la porción carbodnmida, por ejemplo, alquilos): EJEMPLO 5 •-"- --• • *•* »-» * Una porción de proteasa que comprende un residuo de cisteína en una de las posiciones de protección del epítope se acopla con una alquilmaleimida utilizando el siguiente método (donde "P" representa la porción proteasa menos el grupo tiol que resulta de la sustitución de cisteína y "R" es un grupo alquilo). En este ejemplo, Ri y R2 son cada una cero y la porción de unión se deriva a partir de la alquilmaleimida. Se prepara una variante de subtilisina BPN' con una sustitución de leucina por tirosina en la posición 217 y una sustitución de cisteína por serina en la posición 86. Una solución de 20 mL de la variante se prepara a una concentración de aproximadamente 1 mg/mL en amortiguador KH2PO 0.01 M (pH 7). A esta solución, se le añaden 1.5 equivalentes de alquilmaleimida (por ejemplo, metilmaleimida). La solución se mezcla suavemente a temperatura ambiente por aproximadamente una hora. El conjugado de proteasa resultante se obtiene a partir de la solución mediante métodos estándares. EJEMPLO 6 2 Equivalentes 1 Equivalente Una porción de proteasa que comprende un residuo de cisteína en una de las posiciones de protección del epítope forma un dímero utilizando ^^ .^«¡^ . t.» j* a ? i. el siguiente método (donde "P" representa la porción proteasa menos el grupo tiol que resulta de la sustitución de cisteína). En este ejemplo, la porción proteasa y la porción polipeptídica son equivalentes (y X es cero). Se prepara una variante de subtilisina BPN' con una sustitución de leucina por tirosina en la posición 217 y una sustitución de cisteína por serina en la posición 214. Una solución de 20 mL de la variante se prepara a una concentración de aproximadamente 1 mg/mL en amortiguador KH2PO 0.01 M (pH 7). El oxígeno se burbujea suavemente a temperatura ambiente por aproximadamente una hora para formar el conjugado dimérico de proteasa deseado. El conjugado de proteasa resultante se obtiene a partir de la solución mediante métodos estándares.

Métodos analíticos Los conjugados de proteasa presentes pueden evaluarse para actividad enzimática y respuesta inmunogénica utilizando los siguientes métodos, ambos conocidos por el experto en la técnica. Otros métodos bien conocidos en la técnica pueden utilizarse alternativamente.

Actividad del conjugado de proteasa La actividad proteasa de un conjugado de proteasa de la presente invención puede evaluarse mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Dos de dichos métodos se establecen a continuación en la presente: Método de actividad en hojuelas de piel 5 Utilizando cinta Scotch® #3750G, las hojuelas de piel humana se retiraron a partir de las piernas de un sujeto hasta que la cinta estaba substancialmente opaca con hojuelas. Entonces la cinta se cortó en 2.54 cm por 2.54 cm cuadrados y se deja a un lado. En una caja de Petri de 10 mm por 35 mm, se añaden 2 mL de una enzima control (por ejemplo, subtilisina BPN') o a 0.75 mg/mL o se añade el conjugado de proteasa a ser evaluado en amortiguador KH2PO 0.01 M pH 5.5. A esta solución, se añade 1 mL de una solución de laurato de sodio al 2.5% pH 8.6. La solución se mezcla suavemente sobre un agitador de plataforma. Los cuadrados de cinta previamente preparados se sumergen en la solución (con las hojuelas viendo 5 hacia arriba) por diez minutos continuando con la agitación suave. Los cuadrados de cinta se enjuagan suavemente en agua corriente por 15 segundos. Se pipetea colorante Stevenel Blue (3 mL, comercialmente disponible a partir de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) dentro de una caja de petri limpia. El cuadrado de cinta enjuagado se coloca dentro del colorante 0 por tres minutos (hojuelas viendo hacia arriba) con mezclado suave. El cuadrado de cinta se retira a partir del colorante y se enjuaga consecutivamente en dos vasos de precipitados de 300 mL con agua destilada, por quince segundos por enjuague. El cuadrado de cinta se deja EAitesA, > . ... , .. i >._, ... . ^¡^j^J^^ secar al aire. La intensidad de color entre el cuadrado de cinta obtenido a partir de la enzima control y el cuadrado de cinta obtenido a partir del conjugado de proteasa se compara visualmente o al utilizar un cromómetro. Con relación al cuadrado de cinta de la enzima control, un cuadrado de cinta del conjugado de proteasa que muestra menos intensidad de color es indicativo de que el conjugado de proteasa tiene mayor actividad.

Método de actividad por colágena seca Se combinan 50 mL de amortiguador tris 0.1 M (tris-hidroximetil-aminometano) que contiene CaCI2 0.01 M para dar pH 8.6, y 0.5 g de azocoll (colágena impregnada con colorante azo, comercialmente disponible a partir de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) Incubar esta mezcla a 25°C mientras se agita suavemente con un agitador de plataforma. Filtrar 2 mL de la mezcla a través de un filtro de jeringa de 0.2 mieras y leer la absorbancia a 520 nm a cero en un espectrofotómetro. Añadir 1 ppm de una enzima control (por ejemplo, subtilisina BPN') o el conjugado de proteasa a ser evaluado en los remanentes 48 mL de la mezcla tris/azocoll. Filtrar 2 mL de la solución que contiene control/conjugado de proteasa a través de un filtro de jeringa de 0.2 mieras cada dos minutos por un total de diez minutos. Para cada muestra filtrada, leer la absorbancia inmediatamente a 520 nm. Graficar los resultados contra el tiempo. Las pendientes del control y del conjugado prueba son indicativas de las actividades relativas de las muestras. Una pendiente mayor es indicativa de una actividad mayor. La actividad del conjugado de proteasa i ?t ? ?.? ...afsü..¡? prueba (pendiente) puede expresarse como porciento de la actividad control (pendiente).

Prueba para inmunoqenicidad intranasal en ratón 5 El potencial inmunogénico de los conjugados de proteasa de la presente invención pueden determinarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica o mediante la prueba para inmunogenicidad intranasal en ratón presentada en la presente a continuación. Esta prueba es similar a los ensayos descritos en Robinson et al., "Specific Antibody Responses to 10 Subtilisin Carisberg (alcalase) in Mice: Development of an intranasal Exposure Model", Fundamental And Applied Toxicology, Vol. 34, pp. 15 - 24 (1996) y Robinson et al., "Use of the Mouse Intranasal Test (MINT) to determine the Allergenic Potency of Detergent Enzymes: Comparision to the Guinea Pig Intratracheal (GPIT) Test", Toxicological Science, Vol. 43, pp. 39 - 46 (1998), 15 ambos ensayos pueden utilizarse en lugar del ensayo establecido a continuación. Ratonas BDF1 (Charles River laboratories, Portage, Ml) con un peso de aproximadamente 18 a 20 gramos se utilizaron el la prueba. Las ratonas se pusieron en cuarentena una semana antes de la dosificación. Las 20 ratonas se alojaron en cajas con camas de viruta de madera en cuartos controlados para humedad (30 - 70%), temperatura (19.4 - 25°C) y ciclos de luz oscuridad de 12 horas. Las ratonas se alimentaron con Purina® mouse chow (Purina Mills, Richmond, IN) y agua ad libitum. tü^Bi ^ jfc , El antígeno potencial a ser evaluado (ya sea subtilisina BPN' como control positivo o un conjugado de proteasa de la presente invención9 se dosificó a un grupo de cinco ratonas. Antes de dosificar, cada ratona se anestesió mediante una inyección peritoneal (i.p.) de una mezcla de Ketaset 5 (88.8 mg/kg) y Rompun (6.67 mg/kg). El animal anestesiado se mantiene en la palma de la mano, con la parte trasera hacia abajo, y se dosifica intranasalmente con 5 µL de proteasa en solución de amortiguador (KH2PO4 0.01 M pH 5.5). Aunque que cada grupo recibe la misma dosis, pueden evaluarse varias dosis. Las soluciones de dosis se colocar suavemente en la ío parte exterior de cada nostrilo y se inhala por el ratón. La dosis se repite en los días 3, 10, 17, y 24. Las muestras de suero se colectaron al día 29. El anticuerpo lgG1 específico de la enzima en el suero de ratón se midió el método ELISA de captura del antígeno. Las inmunogenicidades del conjugado de proteasa I5 pueden compararse contra aquellas de la subtilisina BPN' utilizando valores estándares ED50.

Composiciones de la presente invención Los conjugados de proteasa en la presente pueden utilizarse en "> o cualquier aplicación que sea adecuada para la proteasa parental respectiva. Uno de dichos ejemplos ¡ncluyen composiciones de limpieza. Debido a las propiedades deseables de inmupogenicidad reducida de los presentes conjugados de proteasa, los conjugados de proteasa pueden utilizarse adicionalmente en aplicaciones las cuales se han beneficiado históricamente mínimamente a partir del uso de proteasas. Los ejemplos de dichas aplicaciones incluyen aquellas en las que el conjugado de proteasa necesariamente se pone en contacto con la piel del mamífero (especialmente piel de humano), tal como con el uso de composiciones de cuidado personal.

Composiciones de limpieza Los conjugados de proteasa pueden utilizarse en composiciones de limpieza que incluyen, pero no se limitan a, composiciones para lavandería, composiciones de limpieza para superficies duras, composiciones de limpieza para carga ligera incluyendo composiciones de limpieza para vajillas, y composiciones detergentes para lavavajillas automático. Las composiciones de limpieza en la presente comprenden una cantidad efectiva de uno o más conjugados de proteasas que necesariamente logran la actividad proteolítica necesaria en las composiciones de limpieza específicas. Dichas cantidades efectivas se determinan fácilmente por un experto en la técnica y se basan en varios factores, tales como el conjugado de proteasa particular utilizado, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición de limpieza, y si se requiere o no una composición líquida o seca (por ejemplo, granular, barra), y similares. Preferiblemente, las composiciones de limpieza comprende de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 1 %, y más preferiblemente de .-*-*:* -*- aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 0.1 % de uno o más conjugados de proteasas de la presente invención. Varios ejemplos de varias composiciones de limpieza en donde los conjugados de proteasas pueden emplearse se discuten en mayor detalle a continuación. Además de los presentes conjugados de proteasas, las presentes composiciones de limpieza comprenden adicionalmente un vehículo de composición de limpieza que comprende uno o más materiales de composición de limpieza compatibles con el conjugado de proteasa. El término "material de composición de limpieza", como se utiliza en la presente, significa cualquier material seleccionado a partir del tipo particular de composición de limpieza deseada y la forma del producto (por ejemplo, líquido, granulos, barra, aspersión, aplicador, pasta, gel), cuyos materiales también son compatibles con el conjugado de proteasa utilizado en la composición. La selección específica de los materiales de la composición de limpieza se elabora fácilmente al considerar la superficie del material a ser limpiado, la forma deseada de la composición para la condición de limpieza durante el uso (por ejemplo, a través del uso de lavado con detergente). El término "compatible" como se utiliza en la presente, significa que los materiales de la composición de limpieza no reducen la actividad proteolítica del conjugado de proteasa hasta tal grado que la proteasa no es efectiva como se desea durante situaciones de uso normal. Los materiales específicos de la composición de limpieza se ejemplifican en detalle a continuación. .^ .i a^¿».?..

Los conjugados de proteasa de la presente invención pueden utilizarse en una variedad de composiciones detergentes en donde se desea alta supresión de espuma y buena limpieza. Por lo tanto los conjugados de proteasa pueden utilizarse con varios ingredientes convencionales para proveer limpiadores para superficies duras completamente formulados, composiciones para lavado de vajillas, composiciones para lavado de telas, y similares. Dichas composiciones pueden estar en la formar de líquidos, gr nulos, barras, y similares. Dichas composiciones pueden formularse como detergentes "concentrados" los cuales contienen tanto como aproximadamente 30% a aproximadamente 60% en peso de agentes tensioactivos. Las composiciones de limpieza en la presente pueden opcionalmente, y preferiblemente, contener varios agentes tensioactivos (por ejemplo, agentes tensioactivos aniónicos, no iónicos, o zwitteriónicos). Dichos agentes tensioactivos están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 5% a aproximadamente 35% de las composiciones. Los ejemplos no limitantes de agentes tensioactivos útiles en la presente incluyen los sulfonatos de alquilbenceno de Cn-C-iß convencionales y sulfatos de alquilo primarios y aleatorios, los sulfatos de alquilo (2,3) de C10- C18 secundarios de las fórmulas CH3(CH2)x(CHOS03)"M+)CH3 y CH3 (CH2)y(CHOS03)"M+)CH2CH3 donde x y (y+1 ) son enteros de al menos aproximadamente 7, preferiblemente de al menos aproximadamente 9, y M es un catión soluble en agua, especialmente sodio, los sulfatos de alquilalcoxi de Cío-Ciß (especialmente sulfatos de etoxi EO de 1-5), carboxilatos de alquilalcoxi de C?0-C?8 (especialmente etoxicarboxilatos EO de 1-5), poliglucósidos de alquilo de C10-C?8, y sus poliglucósidos sulfatados correspondientes, esteres de ácido graso alfa-sulfonado de C? -C18, alquilo de C-?2-C18 y alquilfenol alcoxilatos (especialmente etoxilatos y etoxi/propoxi mezclados), betaínas de C?2-C 8 y sulfobetaínas ("sultaínas"), óxidos de amina de C?o-C?8, y similares. Los sulfatos de alquilalcoxi (AES) y los carboxilatos de alquilalcoxi (AEC) se prefieren en la presente. El uso de dichos agentes tensioactivos en combinación con el óxido de amina y/o agentes tensioactivos de betaína o sultaína también se prefiere, dependiendo de los deseos del formulador. De otros agentes tensioactivo convencionales útiles se enlistan en los textos estándares. Los agentes tensioactivos particularmente útiles incluyen las N-metil glucamidas de C?0-C18 descritas en la patente de E.U.A. No. 5, 194, 639, de Connor et al., expedida el 16 de marzo de 1993. Una amplia variedad de otros ingredientes útiles en las composiciones detergentes de limpieza pueden incluirse en las composiciones en la presente incluyendo, por ejemplo, otros ingredientes activos, vehículos, hidrotopos, auxiliares de procesamiento, colorantes o pigmentos, disolventes para formulaciones líquidas. Si un incremento adicional de formación de espuma se desea, los reforzadores de espuma tales como alcolamidas de C10-C16 pueden incorporarse dentro de las composiciones, típicamente a niveles de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%. Las amidas de monoetanol y dietanol de alquilo de Cío-Cu es una clase típica de dichos haat Í ?,*... i.» ¿fa».* ; reforzadores de espuma. Uno de dichos reforzadores de espuma con altos agentes tensioactivos adjuntos para formación de espuma tales como los óxidos de amina, betaínas y sultaínas que se mencionaron anteriormente también son ventajosos. Si se desea, las sales de magnesio solubles tales como MgCI2, MgSO , y similares, pueden añadirse a niveles de, típicamente, de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 2%, para proveer formación de espuma adicional. Las composiciones detergentes líquidas en la presente pueden contener agua y otros solventes, vehículos. Los alcoholes primarios o secundarios de bajo peso molecular ejemplificados por metanol, etanol, propanol, e isopropanol son adecuados. Los alcoholes monohídricos que se prefieren para agentes tensioactivo solubilizantes, pero los polioles tales como aquellos que contiene de aproximadamente 2 aproximadamente 6 átomos de carbono y de aproximadamente 2 aproximadamente 6 grupos hidroxi (por ejemplo, 1 ,3-propanediol, etilenglicol, glicerina, y 1 ,2-propanediol) también puede utilizarse. Las composiciones pueden contener de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, típicamente de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% de dichos vehículos. De las composiciones detergentes en la presente preferiblemente se formularan de tal manera que durante el uso en operaciones de limpieza acuosas, que el agua de lavado tendrá un pH entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 11. Los productos terminados así típicamente se formulan en este intervalo. Las técnicas para controlar el pH a *^- *• niveles de uso recomendados incluyen el uso de, por ejemplo, amortiguadores, álcalis, y ácidos. Dichas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Cuando se formulan las composiciones de limpieza para superficies duras y las composiciones de limpieza para telas de la presente invención, el formulador puede desear emplear varios agentes mejoradores de detergencia a niveles de aproximadamente 5% a aproximadamente 50% en peso. Los agentes mejoradores de detergencia típicos incluyen las zeolitas de 1-10 mieras, policarboxilatos tales como citrato y oxidisuccinato, silicatos estratificados, fosfatos, y similares. Otros agentes mejoradores de detergencia convencionales se enlistan en las formulaciones estándares. Similarmente, el formulador puede desear emplear varias enzimas adicionales, tales como celulasas, lipasas, amilasas, y proteasas en dichas composiciones, típicamente niveles de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 1 % en peso. Varias enzimas detersivas o para cuidado de telas se conocen bien en la técnica de detergentes para lavandería. Varios compuestos de blanqueado, tales como los percarbonatos, perboratos y similares, pueden utilizarse en dichas composiciones, típicamente a niveles de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15% en peso. Si se desea, dichas composiciones también puede contener activadores de blanqueado tales como tetraacetil etilendiamina, sulfonato de nonanoilbenceno, y similares, las cuales también se conocen en la técnica. Los niveles de uso típicamente tienen un intervalo - -*•*• •'-«- * - - Í.Í. de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10% en peso. Los agentes liberadores de suciedad, especialmente del tipo oligoéster aniónico, agentes quelantes, especialmente los aminofosfonatos y etilendiamindisuccinatos, que agentes de remoción de suciedad de arcilla, de especialmente tetraetilenpentamina etoxilada, agentes dispersadores, especialmente poliacrilatos y poliaspartatos, abrillantadores, especialmente abrillantadores aniónicos, agentes supresores de espuma, especialmente siliconas y alcoholes secundarios, suavizar de telas, especialmente arcillas de esmectita, y los similares todos pueden utilizarse en dichas composiciones a niveles que tienen un intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 35% en peso. Las fórmulas estándares y las patentes publicadas contienen descripciones múltiples, detalladas de dichos materiales convencionales. Los estabilizadores de enzimas de también puede utilizarse en las composiciones de limpieza. Dichos estabilizadores de enzimas incluyendo propilenglicol (preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%), formato de sodio (preferiblemente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1%) y formato de calcio (preferiblemente de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1 %). Las presentes variantes son útiles en composiciones de limpieza para superficies duras. Como se utiliza en la presente "composición de limpieza para superficie dura" se refiere a composiciones detergentes líquidas y granulares para limpieza de superficies duras tales como pisos, paredes, mosaicos de baño, y similares. Las composiciones de limpieza para superficie i'i- »-' T t a^»^.^ »^ - — - dura de la presente invención comprenden una cantidad efectiva de uno a más conjugados de proteasas de la presente invención, preferiblemente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 5%, y más preferiblemente de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 1 % en peso de conjugado de proteasa de la composición. Además de comprender uno a más de los conjugados de proteasa, dichas composiciones de limpieza para superficie dura típicamente comprenden un agente tensioactivo y un mejorador de detergencia de secuestro soluble en agua. En ciertos productos especializados tales como limpiadores de aspersión para ventanas, sin embargo, los agentes tensioactivos de algunas veces no se utilizan puesto que éstos pueden producir una película y/o residuo pegajoso sobre la superficie del vidrio. El componente de agente tensioactivo, cuando está presente, puede comprender tan poco como 0.1 % de las composiciones en la presente, pero típicamente las composiciones contendrán de aproximadamente 0.25% a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5% de agente tensioactivo. Típicamente las composiciones contendrán de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 50% de un agente mejorador de detergencia, preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%. Preferiblemente el pH debe estar en el intervalo de aproximadamente 7 a 12. Los agentes de ajuste convencional para pH tales como hidróxido de sodio, carbonato de sodio, o ácido clorhídrico pueden utilizarse si el ajuste es necesario. Los solventes pueden incluirse en las composiciones. Los solventes útiles incluyen, pero no se limitan a, éteres de glicol tales como éter de dietilenglicol monohexilo. éter de dietilenglicol monobutilo, éter de etilenglicol monobutilo, éter de etilenglicol monohexilo, éter de propilenglicol monobutilo, éter de dipropilenglicol monobutilo, y dioles tales como 2,2,4-trimet?l-1 ,3-pentanediol y 2-etil-1 ,3-hexanediol. Cuando se utilizan, dichos solventes están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 15%, más preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 11 %. Adicionalmente, los solventes altamente volátiles tales como isopropanol o etanol pueden utilizarse en las presentes composiciones para facilitar la evaporación más rápida de la composición a partir de superficies cuando la superficie no se enjuaga después de la aplicación de "fuerza total" de la composición a la superficie. Cuando se utilizan, los solventes volátiles típicamente están presentes a niveles de aproximadamente 2% a aproximadamente 12% en las composiciones. -fc t*f EJEMPLOS 7 - 12 Composiciones líquidas para limpieza de superficies duras Todas las fórmulas se ajustan a pH 7. En otra modalidad de la presente invención, las composiciones para lavado de vajillas comprenden una o más variantes de la presente invención. Como se utiliza en la presente, "composición de lavado de vajillas" se refiere todas las formas de composiciones para lavado de vajilla que incluyen, pero no limitan a formas granulares y líquidas. '-» -'• * - « * •*— •* *»-•"•- '••fe* EJEMPLOS 13 - 16 Detergente líquido para vajilla Composiciones para cuidado personal Los conjugados de proteasa presentes son particularmente útiles para uso en composiciones de cuidado personal tales como, por ejemplo, acondicionadores para el cabello para permanencia y para enjuague, champús, composiciones para acné de permanencia y para enjuague, leches faciales y acondicionadores, geles para ducha, jabones, limpiadores faciales formadores de espuma y no formadores de espuma, cosméticos, lociones para manos, lociones faciales, y lociones corporales, humectantes, parches, y máscaras, humectantes faciales de permanencia, paños cosméticos y limpiadores, composiciones de cuidado oral, soluciones, y composiciones de cuidado para lentes de contacto. Las composiciones de cuidado personal presentes comprenden uno o más conjugados de proteasa de la presente invención y un vehículo para cuidado personal. Para ¡lustrar, los presentes conjugados de proteasa son adecuados para inclusión en las composiciones descritas en las siguientes referencias: patentes de E.U.A. No. 5, 641 , 479, de Linares et al., expedida el 24 de junio de 1997 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5, 599, 549, de Wivell et al., expedida el 4 de febrero de 1997 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5, 585, 104, de Ha et al., expedida el 17 de diciembre de 1996 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5, 540, 852, de Kefauver et al., expedida el 30 de julio de 1996 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5, 510, 050, de Dunbar et al, expedida el 23 de abril de 1996 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5, 612, 324, de Guang et al., expedida el 18 de marzo de 1997 (preparaciones anti-acné); patente de E.U.A. No. 5, 587, 176, de Warren et al., expedida el 24 de diciembre de 1996 (preparaciones anti-acné); patente de E.U.A. No. 5, 549, 888, de Venkateswaran, expedida el 27 de agosto de 1996 (preparaciones anti-acné); patente de E.U.A. No. 5, 470, 884, de Corless et al., expedida el 28 de noviembre de 1995 (preparaciones anti-acné); patente de E.U.A. No. 5, 650, 384, de Gordon et al., expedida el 22 de julio de 1997 (geles para la ducha); patente de E.U.A. No. 5, 607, 678, de Moore et al., expedida el 4 de marzo de 1997 (geles para la ducha); patente de E.U.A. No. 5, 624, 666, de Coffindaffer et al., expedida de 29 de abril de 1997 (acondicionadores para Ll^U^^^MH^H cabello y/o champús); patente de E.U.A. No. 5, 618, 524, de Bolich et al., expedida el 8 de abril de 1997 (acondicionadores para cabello y/o champús); patente de E.U.A. No. 5, 612, 301 , de Inman, expedida el 18 de marzo de 1997 (acondicionadores para cabello y/o champús); patente de E.U.A. No. 5, 573, 709, de Wells, expedida el 12 de noviembre de 1996 (acondicionadores para cabello y/o champús); patente de E.U.A. No. 5, 482, 703, de Pings, expedida el 9 de enero de 1996 (acondicionadores para cabello y/o champús); patente de E.U.A. No. Re. 34, 584, de Grote et al., re expedida el 12 de abril de 1994 (acondicionadores para cabello y/o champús); patente de E.U.A. No. 5, 641 , 493, de Date et al., expedida el 24 de junio de 1997 (cosméticos); patente de E.U.A. No. 5, 605, 894, de Blank et al., expedida el 25 de febrero de 1997 (cosméticos); patente de E.U.A. No. 5, 585, 090, de Yoshioka et al., expedida el 17 de diciembre de 1996 (cosméticos); patente de E.U.A. No. 4, 939, 179, de Cheney et al. , expedida el 13 julio de 1990 (lociones para manos, cara, y/o corporales); patente de E.U.A. No. 5, 607, 980, de McAtee et al., expedida el 4 de marzo de 1997 ((lociones para manos, cara, y/o corporales); patente de E.U.A. No. 4, 045, 364, de Richter et al., expedida el 30 de agosto de 1997 (paños cosméticos y de limpieza); solicitud de patente Europea, EP 0 619 074, de Touchet et al., publicada el 12 de octubre de 1994 (paños cosméticos y de limpieza); patente de E.U.A. No. 4, 975, 217, de Brown-Skrobot et al., expedida el 4 de diciembre de 1990 (paños cosméticos y de limpieza); patente de E.U.A. No. 5, 096, 700, de Seibel, expedida el 17 de marzo de 1992 (composiciones para limpieza oral); patente de E.U.A. No. 5, 028, 414, de Sampathkumar, expedida el 2 de julio de 1991 (composiciones para limpieza oral); patente de E.U.A. No. 5, 028, 415, de Benedict et al., expedida el 2 julio de 1991 (composiciones para limpieza oral); patente de E.U.A. No. 5, 028, 415, de Benedict et al., expedida el 2 de julio de 1991 5 (composiciones para limpieza oral); patente de E.U.A. No. 4, 863, 627, de Davies et al., septiembre 5 de 1989 (soluciones de limpieza para lentes de contacto); patente de E.U.A. No. Re. 32, 672, de Huth et al., re expedida el 24 de mayo de 1988 (soluciones de limpieza para lentes de contacto); y patente de E.U.A. No. 4, 609, 493, de Schafer, expedida el 12 septiembre de 1986 ío (soluciones de limpieza para lentes de contacto). Para ilustrar adicionalmente las composiciones para limpieza oral de la presente invención, una cantidad farmacéuticamente aceptable de uno o más conjugados de proteasa de la presente invención se incluye en composiciones útiles para remover manchas proteináceas a partir de dientes o 15 dentaduras. Como se utiliza en la presente, "composiciones para limpieza oral" se refiere a dentríficos, pastas dentales, geles dentales, polvos dentales, enjuagues dentales, aspersiones bucales, geles bucales, gomas de mascar, trociscos, perfumador, tabletas, biogeles, pastas para profilaxis, soluciones para tratamiento dental, y similares. Preferiblemente, las composiciones para 20 limpieza oral comprenden de aproximadamente 0.0001 % aproximadamente 20% de uno o más conjugados de proteasa de la presente invención, más preferiblemente de aproximadamente 0.001% aproximadamente 10%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 5%, en i i l airüii in irin - - - peso de la composición, y a un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza la presente, que "farmacéuticamente aceptable" significa que los fármacos, medicamentos, con ingredientes inertes que describen el término son adecuados para uso en contacto con los tejidos de órganos y animales inferiores sin llevar a cabo toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuesta alérgica, y similares, proporcionados en una relación razonable de beneficio/riesgo. Típicamente, los componentes vehículos para limpieza oral farmacéuticamente aceptables de los componentes para limpieza oral de las composiciones de limpieza oral generalmente comprenderán de aproximadamente 50% a aproximadamente 99.99%, preferiblemente de aproximadamente 65% a aproximadamente 99.99%, más preferiblemente de aproximadamente 65% a aproximadamente 99%, en peso de la composición. Los componentes vehículos y componentes opcionales farmacéuticamente aceptables que pueden incluirse en las composiciones de limpieza oral de la presente invención se conocen bien por los expertos en la técnica. Una amplia variedad de tipos de composiciones, componentes vehículos y componentes opcionales útiles en las composiciones de limpieza oral se describen en las referencias citadas a continuación de la presente. En otra modalidad de la presente invención, las composiciones para limpieza de dentaduras para limpiar la parte externa de las dentaduras de la cavidad oral comprenden de uno o más conjugados de proteasas de la presente invención. Dichas composiciones para limpieza de dentaduras ,.± .i ? ¿.?..*4.t . *• * * * comprenden una cantidad efectiva de uno o más de los conjugados de proteasa, preferiblemente de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 50%, más preferiblemente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 35%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 20%, en peso de la composición, y un vehículo para limpiador de dentaduras. Varios formatos de composiciones para limpieza de dentadura tales como tabletas efervescentes y similares son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5, 055, 305, de Young), generalmente son apropiadas para incorporación de uno o más de los conjugados de proteasa para remover manchas proteináceas a partir de dentaduras. En otra modalidad de la presente invención, de las composiciones para limpieza de lentes de contacto comprenden uno o más conjugados de proteasa de la presente invención. Dichas composiciones para limpieza de lentes de contacto comprenden una cantidad efectiva de uno o más de los conjugados de proteasa, preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 50% de uno o más de los conjugados de proteasa, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 20%, más preferiblemente aún de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5%, en peso de la composición, y un vehículo para limpiador de lentes de contacto. Varios formatos de composiciones de limpieza para lentes de contacto tales como tabletas, líquidos, y similares son bien conocidas en la técnica y generalmente son apropiadas para incorporación de uno más de los «MMMfatfiaMhi conjugados de proteasa de la presente invención para remover manchas proteináceas a partir de lentes de contacto.

EJEMPLOS 17 - 19 Composiciones líquidas para limpieza de telas EJEMPLOS 20 - 23 Solución de limpieza para lentes de contacto 15 20 EJEMPLOS 24 - 27 Productos para limpieza corporal £g^ tfán&Éfcábri?* EJEMPLOS 28 - 31 Productos para limpieza facial Jjíg^ EJEMPLOS 32 - 33 Composición humectante para permanencia en la piel EJEMPLO 34 Composición de limpieza para aplicar con paño La composición anterior se impregna sobre una lámina absorbente tejida comprendida de celulosa y/o poliéster a aproximadamente =fc-a-s,. j - -*--*- K? & .1 1, 250%, en peso de la lámina absorbente.

LISTADO OE SECUENCIA <110 > The Procter i Gamble Company <120 » Conjugados de proteasa que tienen regiones de epftopes estérlcaaente protegidas <120 > Protección del epftope <140> PCT/USOO/ <141> 23CC-0"-ll <16D> 1 <170> Patentlr. Ver. 2.0 <21ü> 1 <2 1> 2~5 <2L2> PP.T <212> Bac llus arpvlolisuefacier.s <40C> 1 Ala Glr. Ser Val Prc Tyr Gly Val Ser Glr. ía Pro Ala J?U 10 15 His Ser 31y Tyr Thr Gly Ser sn Val Lys Val Ala Val He Asp 20 23 30 Ser Gly He Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 ' 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 51y Thr H s Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser He sly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Ala Val Lys Val Leu 65 90 95 31y Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp II; e Asn Sly slu 100 1C5 LlO Trp Ala He Ala Asn Asn Met Asp Val He Asn Met Ser Leu Gly Gly 113 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asr. Glu Sly Tnr Ser Gly 145 150 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val He Ale 155 170 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 1B0 " 185 150 Ly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser He Gln Ser Thr 153 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro Kis Val Al a Gly Al a Ala Ala Leu He Leu Se: Lys K a Pro Asn 225 ' 230 235 240 h ?MiÁ? ^tiMA^ii É i^^ ?^UéM?iit?? — — ' — «"*"• - -'• *• .^. .. L~J... .l !t.

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Tar Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr G.y Lys Gly Leu He Asn Val Gln Ala 260 " 265 270 Ala Ala Gin r-wflriiirtttMrifcÉTiitñ-fif *,«. <« * *.*.*-** I ? »*****.,

Claims (4)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un conjugado de proteasa caracterizado en tanto dicho conjugado comprende una porción proteasa y una o más porciones de adición en donde la porción proteasa comprende una primera región epítope, una segunda región epítope, y una tercera región epítope, donde cada porción adicional está covalentemente unida a una posición de protección del epítope de la porción proteasa, en donde: (a) las posiciones de protección del epítope para la primera región del epítope se seleccionan a partir de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41 , 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215, y 216 que corresponden a la subtilisina BPN'; (b) las posiciones de protección del epítope para la segunda región del epítope se seleccionan a partir de 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 91 , 99, 100, 101 , 102, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141 , 144, y 145 que corresponden a la subtilisina BPN'; y (c) las posiciones de protección del epítope para la tercera región del epítope se seleccionan a partir de 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 265, 269, 271 , 272, y 275 que corresponden a la subtilisina BPN'

2 - El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada porción de adición, independientemente, tiene la estructura:

3.- El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la porción proteasa tiene una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos parental, en donde la secuencia de aminoácidos modificada comprende una sustitución mediante un aminoácido de sustitución en una o más de las posiciones de protección del epítope y donde cada porción adicional está covalentemente unida a uno de los aminoácidos sustituyentes.

4.- El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el aminoácido sustituyente es cisteína. 5 - El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de subtilisina BPN', subtilisina Carisberg, subtilisina DY, subtilisina 309, proteinasa K, termitasa, Proteasa A, Proteasa B, Proteasa C, Proteasa D, y variantes de las mismas. 6 - El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque: a) las posiciones de 1j_J^j_j_^¿^_j¡j| |_ _^j£fc _____ _l__^ t f '1 — ' - --» < • • - .... -a. - ..^^..afc-. <¡. protección del epítope para la primera región del epítope se seleccionan a partir del grupo que consiste de 1 , 2, 3, 4, 5, 17, 40, 41 , 43, 67, 86, 87, y 214 que corresponden a la subtilisina BPN'. b) las posiciones de protección del epítope para la segunda región del epítope se seleccionan a partir del grupo 5 que consiste de 27, 47, 48, 50, 52, 102,127,128, 130, 131 , 132, 134, 138, y 141 que corresponden a la subtilisina BPN' c) las posiciones de protección del epítope para la tercera región del epítope se seleccionan a partir del grupo que consiste de 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 789, 197, 203, 204, 253, 254, » 265, y 275 que corresponden a la subtilisina BPN'. ? ío 7 - El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque Ri y R2 son cada uno cero. 8.- El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque Ri es el primer polipéptido que „ se selecciona a partir del grupo que consiste de subtilisina BPN', 1 15 9.- El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el primer polipéptido está covalentemente unido a la porción de unión de la porción de proteasa en una posición del primer polipéptido seleccionada a partir del grupo que consiste de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 17, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 36, 40, 41 , 43, 44, 45, 20 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 62, 63, 67, 86, 87, 89, 91 , 99, 100, 101 , 102, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141 , 143, 144, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215, 216, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271 , y 275 que corresponde a subtilisina BPN' 10.- El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque X es cero y donde la porción 5 proteasa y el primer polipéptido están covalentemente unidos a través de un puente disulfuro. 11.- El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque R2 es cero y el primer polímero *. ,: es un polietilenglicol. ? ío 12.- El conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque al menos una porción de adición está covalentemente unida a una posición de protección del epítope seleccionada a partir del grupo que consiste de la primera región del epítope, la segunda región del epítope, y la tercera región. 15 13.- Una composición de limpieza que comprende un conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo para composición de limpieza. 14.- Una composición para cuidado personal que comprende un conjugado de proteasa de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo 20 para cuidado personal. ^^^