MXPA02000755A

MXPA02000755A - Tratamiento de condiciones dependientes de angiogenesis con sulfato de dextrina.

Info

Publication number: MXPA02000755A
Application number: MXPA02000755A
Authority: MX
Inventors: Shaunak Sunil
Original assignee: Ml Lab Plc
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2002-07-22
Also published as: EP1196180A1; NO20020313L; US6689764B1; PL353860A1; ES2234635T3; GB9917092D0; HK1044112A1; AU6004300A; DE60017136D1; ATE285781T1; HK1044112B; NO20020313D0; JP2003505423A; EP1196180B1; DE60017136T2; WO2001007057A1; IL146828A0; CA2378395A1

Abstract

La invencion se refiere a los efectos inhibidores de sulfato de dextrina sobre la angiogenesis y en particular al tratamiento de enfermedades o trastornos que se beneficiarian de la administracion de sulfato de dextrina.

Description

/ TRATAMIENTO DE CONDICIONES DEPENDIENTES DE ANGIQGENESIS CON SULFATO DE DEXTRINA MEMORIA DESCRIPTIVA Esta invención se refiere al tratamiento de enfermedades o trastornos que dependen de angiogénesis. La angiogénesis, el desarrollo de vasos sanguíneos nuevos a partir de un lecho vascular existente, es un procedimiento complejo de pasos múltiples que implica la degradación de componentes de la matriz extracelular y después la migración, proliferación y diferenciación de células endoteliales para formar túbulos y finalmente nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis es importante en procesos fisiológicos normales, por ejemplo pero no a manera de limitación, implantación de embriones, embriogénesis y desarrollo; y cicatrización de heridas. Sin embargo, la angiogénesis es poco común en adultos sanos. La angiogénesis también está implicada en condiciones patológicas tales como: glaucoma neovascular ocular; retinopatía diabética; rachazo de injertos de córnea; deficiencia de vitamina A; enfermedad de Sjorgen; acné rosácea; infecciones por micobacterias; úlceras bacterianas y fúngales; infecciones por herpes simple; lupus sistémico; artitris reumatoide; osteoartritis; soriasis; enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, colitis &yj¡^¡^~¿2=2«Stíß¡ß¿^^M¡¡^^^a^^ß«^ ulcerativa, enfermedad de Crohn); enfermedades hereditarias tales como enfermedad de Osler-Weber y teleangiectasia hemorrágica. El endotelio vascular es normalmente quiescente. Sin embargo, bajo activación las, células endoteliales proliferan y migran para formar microtúbulos que finalmente formarán un lecho capilar para suministrar sangre a tejidos en desarrollo y, desde luego, a un tumor en crecimiento. Se han identificado numerosos factores de crecimiento que promueven/activan células endoteliales para que sufran angiogénesis. Estas ¡ncluyen, por ejemplo, pero no a manera de limitación: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); factor de crecimiento transformador (TGFb); factor de crecimiento de fibroblásticos ácido y básico (aFGF y bFGF); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Ahora se reconocerá que la angiogénesis es una característica de una variedad de enfermedades o trastornos y que dichas condiciones se pueden tratar administrando inhibidores de angiogénesis. Se han descubierto muchos de esos inhibidores. Se ha descubierto un número de inhibidores endógenos, ejemplos de los cuales son angioestatina y endoestatina, que se forman por la segmentación proteolítica de plasminógeno y colágeno XVIII respectivamente. Estos dos factores se ha mostrado que suprimen la actividad de factores de crecimiento pro-angiogénicos tales como VEGF y bFGF vascular. Estos dos factores suprimen respuestas de células endoteliales a VEGF y bFGF in vitro, y reducen la vascularización y el crecimiento de tumores experimentales en modelos animales.

La solicitud del PCT WO 98/24421 de los inventores de la presente invención se refiere al tratamiento de pacientes que padecen tumores altamente vasculares que consiste en administrar sulfato de dextrina a un paciente. El mecanismo de acción de sulfato de dextrina sobre tumores altamente vasculares no se conocía. Ahora los inventores de la presente invención han encontrado que el sulfato de dextrina es un inhibidor de angiogénesis. La formación de vasos sanguíneos nuevos es inhibida por un efecto de acción directa de sulfato de dextrina sobre células endoteliales. Su efecto es evitar que las células endoteliales se junten para formar vasos nuevos y después formando nuevos vasos sanguíneos. Ambos procesos son un pre-requisito para el progreso de una condición dependiente de angiogénesis, tal como el crecimiento continuo de un tumor vascular y de su lesión metastásica. La administración de sulfato de dextrina a un paciente puede por lo tanto proveer una forma de evitar angiogénesis y detener así el progreso de una condición dependiente de angiogénesis. Por consiguiente, la presente invención provee un método de tratamiento de una condición dependiente de angiogénesis, distinta a un tumor altamente vascular, que consiste en administrar sulfato de dextrina al paciente. Esfuerzos considerables se han dirigido hacia el desarrollo de fármacos que interfieren con la angiogénesis. Un grupo de este tipo es polisacáridos sulfatados. Su actividad antiangiogénica se demostró primero usando una combinación de heparina y cortisona. Esto fue seguido por reportes de algunos otros poliacáridos sulfatados que demostraron actividad angiogénica in vitro. El más notable de estos compuestos fue el polisacárido sulfatado-peptidoglican (SP-PG) que se presenta en forma natural, que es producido por la bacteria Arthrobacter sp (cepa AT-25). SP-PG inhibió el crecimiento de células fusiformes derivadas de arcoma de Kaposi asociadas con SIDA a concentraciones que no eran citotóxicas. Esto también bloqueó la angiogénesis que es inducida por células de sarcoma de Kaposi-SIDA en ratones sin pelo. Sin embargo, no se observó un beneficio clínico cuando se administró SP-PG por vía intravenosa a pacientes con sarcoma de Kaposi relacionada con SIDA. En una prueba clínica de fase I de 2-sulfato de dextrina en pacientes con SIDA en etapa tardía, se demostró que la administración directa de 2-sulfato de dextrina en la circulación linfática usando la vía intraperitoneal dio por resultado una caída significativa y sostenida en la carga viral de VIH-1. No se vio toxicidad clínica o bioquímica incluso después de la administración de varios gramos del fármaco. Durante el curso de la prueba clínica, se observó el progreso clínico de sarcoma de Kaposi en tres pacientes y esas observaciones fueron el tema de WO 98/24421. Aquí, se proveen datos in vitro e in vivo para un mecanismo de acción de la actividad antiangiogénica de dextrinas sulfatadas, que es independiente de su actividad anti-VIH.1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : gráfica que muestra el efecto de dextrinas sulfatadas sobre la proliferación de HUVEC inducidos por bFGF o VEGF se midió usando una prueba de incorporación de [^Hj-timidina. No hubo efecto significativo de D2S o D6S sobre la proliferación celular. En experimentos similares con la línea celular KSY-1 , bFGF y VEGF no incrementaron la proliferación celular y las dextrinas sulfatadas no tuvieron efecto (no mostrado). Figura 2: las fotomicrografías muestran formación de vasos sanguíneos nuevos el día 22 (amplificación de x 40). (a) vasos cultivados en medio 199 solo; puntuación = 3. (b) vasos cultivados en medio 199 y D2S (100 µg/ml); puntuación = 1. Figura 3: gráfica que muestra 2-sulfato de dextrina (O) y 6-sulfato de dextrina (V) redujo la velocidad de formación de vasos nuevos en un modelo de prueba de angiogénesis in vitro cuando se comparó con medio solo (D). Los compuestos se probaron a una concentración final de 100 µg/ml. El grado de formación de nuevos vasos se cuantificó a ciegas dos veces a la semana usando una escala análoga visual en la cual 0 = no crecimiento, 1 = formación mínima de vasos nuevos, 2 = formación importante de vasos nuevos, y 3 = formación densa de vasos nuevos. Una puntuación de angiogénesis se derivó de cada conteo dividiendo la puntuación total (es decir, la suma en todos los pozos) entre la puntuación posible máxima y después expresando el resultado como un porcentaje. Esta gráfica es representativa de 3 experimentos con u total de 20 pozos/placa/experimento para cada compuesto probado. Valores de p: ns: p>0.05. *: p<0.05. **: p<0.01. Figura 4: las fotomicrografías muestran formación de microtúbulos endoteliales en presencia de dextrinas sulfatadas (amplificación de x 49). Una escala análoga visual se uso para determinar el grado de formación de tubos y se calificó en una escala de 0 (todas las células siguen siendo individuales) a 4 (todas las células implicadas en estructuras tubulares) como se describió anteriormente (ref: 1 ,14). Barra de espacio = 100 mieras. (A) Pozo control en presencia de dextrina (100 µg/ml), (B) D2S presente a 200 µg/ml, (C) D6S presente a 100 µg/ml. Figura 5: una gráfica que muestra el efecto de un lote de sulfato de dextrina sobre el crecimiento in vitro de células ECV304 (experimento 1 ). Figura 6: una gráfica que muestra el efecto de un lote de sulfato de dextrina sobre el crecimiento in vitro de células ECV304 (experimento 2). Figura 7: una gráfica que muestra el efecto de un lote de sulfato de dextrina sobre el crecimiento in vitro de células SK-HEP-1 (experimento 1).

S3ÉÍ3S5Í ÍJi-?,?.d* .¡^»áA.,i.-A.3b¡m .. ^.-ad*.... ., ..i. ..-.- .i.. ta?^m ?.A d*á á¡k* *¡?¡?sJi?t?¿? iMit&I?t Figura 8: una gráfica que muestra el efecto de un lote de sulfato de dextrina sobre el crecimiento in vitro de células SK-HEP-1 (experimento 2). Figura 9: gráfica que muestra el efecto de sulfato de dextrina sobre el número de túbulos de HUVEC. Figura 10: gráfica que muestra el efecto de sulfato de dextrina sobre los puntos de ramificación de túbulos de HUVEC. Las figuras 11 (a) a 15(a) muestran imágenes microscópicas y representan el efecto de sulfato de dextrina sobre la formación de microtúbulos. Cada imagen microscópica es acompañada por una figura de número correspondiente marcado con un sufijo (b) que provee una indicación más clara de desarrollo de los túbulos. Figura 11a: muestra las imágenes microscópicas para los experimentos de control usando Sumarina d2 7 y VEGF d1 4. Figura 11 b: corresponde a la figura 15 y muestra el desarrollo de túbulos para experimentos de control usando Sumarina d27 y VEGF d1 4. Figura 12a: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a una concentración (0 µg d2 9 y 1 µg d1 5). Figura 12b: corresponde a la figura 16 y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a una concentración baja (0 µg d2 9 y 1 µg d1 5). Figura 13a: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a concentraciones de 5 µg di y 10 µg d1 2.

Figura 13b: corresponde a la figura 17 y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a concentraciones de 5 µg d1 1 y 10µg 1 2. Figura 14a: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a dosis medias (50 µg d1 1 y 100 µg d1 4). Figura 14b: corresponde a la figura 18 y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a dosis medias (50 µg d1 1 y 100 µg d1 4). Figura 15a: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a dosis altas (500µg d1 4 y 1000µg d2 1). Figura 15b: corresponde a la figura 15a y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a dosis altas (500µg d1 4 y 1000µg d2 1 ). Figura 16: gráfica que muestra los efectos de sulfato de dextrina sobre pesos de tumor individual. Figura 17: gráfica que muestra el efecto de sulfato de dextrina sobre peso de tumor final promed Jiio.

EJEMPLO 1 Trombina de plasma de bovino, fibrinógeno de plasma de bovino, ácido e-amino-n-caproico, anhídrido succíico, carbonildiimidazol, bionin hidrazida y sustrato de rojo resistente/naftol se compraron de Sigma (Poole, RU). Dimetilformamida y dimetilaminopiridino fueron de Adrich (Gillingham, RU) y éter dietílico de BDH Merck (Lutterworth, RU). 2-sulfato de dextrina de grado clínico, libre de endotoxina, 6-sulfato de dextrina, 2,6-sulfato de dextrina ? L)L¿J*¿- in?li.

(ML 95/50) y dextrina se obtuvieron de ML Laboratories (Wavertree, RU). Medio MCDB 131 , medio 199, solución de sal balanceada de Hanks, suero de ternera fetal, penicilina, estrptomicina y L-glutamina fueron de Life Technologies (Paisley, Escocia). Se ha mostrado anteriormente que el 2-sulfato de [^Hj-dextrina se une a células HPB-ALL de una manera específica y saturable con una constante de disociación (Kd) de 82 ± 14 nM y un Bmax de 4.8 ± 0.3 pmol/IO^ células. Células CEM, C8166 y H9 tuvieron valores de Kd similares para la unión de [3H]-D2S. También se ha mostrado que 2-sulfato de [^Hj-dextrina se une a células HeLa (una línea celular endotelial inmortalizada) con un Kd similar de 107 ± 12 nM y un Bmax de 4.1 ± 0.2 pmol/106 células; n=9, p<0.05. 2-sulfato de dextrina acumulado en los macrófagos perifonéales y células mesoteliales de pacientes tratados, pero no en ningún otro tipo encontrado en la cavidad peritoneal o en la sangre periférica de estos pacientes. En experimentos in vitro subsecuentes, diferentes tipos de células se cultivaron con 100 µg/ml de D2S libre de endotoxinas, 100 µg/ml de dextrina o 100 µg/ml de dextrina biotinilada, o 100 µg/ml de 6-sulfato de dextrina, hasta durante 4 semanas (Cuadro 1). Las células se tiñeron después con azul de 1 ,9-dimetilmetileno que detecta glucosaminoglicanos sulfatados (Blysan, Biocolor, Belfast), o estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, y rojo resistente/naftol que detecta dextrinas sulfatadas biotiniladas intracelulares. tÁJAJA-* .**&-» • • Células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) también se cosecharon a partir de cordones umbilicales mediante digestión con colagenasa tipo II y se cultivaron en matraces de cultivo de tejido revestidos con gelatina al 1 % en un medio 199 complementado con 20% de suero de bovino fetal, 100 lU/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina, 2mM de L-glutamina, 10 U/ml de heparina y 20 µg/ml de complemento de crecimiento de células endoteliales. La línea de células KS Y-1 que se estableció a partir de la efusión pleural de un paciente con sarcoma de Kaposi asociado con SIDA también se estudió. Fue CD34 y CD31 positivo confirmándolo como de origen endotelial. i st. Áitea. Jfai-í-it- CUADRO 1 Internalización de D2S v D6S por diferentes tipos de células Tipo de célula Sulfato de dextrina internalizado Macrófagos peritoneales Sí Macrófagos peritoneales de pacientes con SIDA Sí Células mononucleares de sangre periférica No Monocitos No Macrófagos derivados de monocitos No HPB-ALL No H9 No Jurkat No U1 No U937 No U38 No HUVEC No HeLa No C11STH No KSY-1 No RBE4 No U87 No Después de 3 semanas de cultivo continuo, D2S y D6S sólo se encontraron que se acumulaban en macrófagos peritoneales. Las células se mantuvieron en presencia de la dextrina sulfatada hasta durante 4 semanas. Como las dextrinas sulfatadas no se acumularon en las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) o en la línea de células de sarcoma de Kaposi, KSY-1 , se determinó si las dextrinas sulfatadas podrían interferir con el crecimiento de estas células mediante una acción al nivel de la superficie celular. Los estudio anteriores de los inventores de la presente invención de células mononucleares de sangre periférica y macrófagos derivados de monocitos han mostrado que D2S se une a la superficie celular de una manera específica y saturable con una constante de disociación de 82 ± 14 nM. Además, concentraciones hasta de 250 µg/ml no afectaron el conteo de células, la viabilidad de las células, proliferación de células o actividad metabólica cuando se compararon con células cultivadas en ausencia de cada compuesto. Ni la dextrina ni las dextrinas sulfatadas afectaron la velocidad de división celular de HUVEC o células KSY-1 en un periodo de 7 días como se determinó mediante conteo de células dos veces a la semana. La viabilidad de las células permaneció >95% todas las veces que se determinó por exclusión de azul de tripano. El efecto de dextrina sulfatada sobre el crecimiento de células HUVEC y KSY-1 que se cultivaron en presencia de factor de ím.ii-^.Á?i?J^iá: crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) también se determinó. Para estos experimentos, HUVEC (5 x 103/pozo) se suspendieron en medio M199 que contenía 10% de FCS, 2 mM de L- glutamina, 100 lU/ml de penicilina y 0.1 mg/ml de estreptomicina. Después de 24 horas, el medio se remplazó con medio fresco que contenía ya sea D2S (100 µg/ml) o D6S (100 µg/ml) durante 1 hora después de lo cual se añadió bFGF (10 ng/ml) o VEGF (20 ng/ml, Preprotech, Rocky Hill, NJ). Estas concentraciones de VEGF y bFGF se escogieron debido a que han mostrado hacer que proliferen HUVEC. [^Hj-timidina (1 mCi/ml, Amersham Pharmacia, Bucks, RU) se añadió 48 horas después y las células se cultivaron durante 16 horas adicionales. Las células se cosecharon usando un cosechador de 96 pozos Betaplate automatizado (Wallac Oy, Turku, Finlandia) y la radioactividad se contó usando un contador de escitilación de líquido Betaplate. Las dextrinas sulfatadas no alteraron la velocidad de proliferación de células HUVEC o KSY-1 según se determinó por los conteos de células de incorporaciones de [^Hj-timidina, aun cuando se añadió bFGF o VEGF exógeno (figura 1 ).

EJEMPLO 2 Vasos sanguíneos (aproximadamente 1-2 mm de diámetro) se cortaron de la superficie apical de placentas humanas dentro de 6 horas de un nacimiento por cesárea electivo. El uso de las placentas para estos estudios fue aprobado por Ethics Committee of Hammersmith Hospitals Trust, Londres. Los vasos sanguíneos se colocaron en solución de sal balanceada de Hank y se cortaron en fragmentos de 1-2 mm usando fórceps de disección y tijeras de iridectomía. Los coágulos residuales se removieron y los vasos sanguíneos se remojaron en solución de sal balanceada de Hank. El efecto de cada compuesto sobre la formación de vasos sanguíneos nuevos se determinó cultivando los vasos sanguíneos dentro de un coágulo de fibrina en placas de cultivo de tejido de 24 pozos, treinta µl de trombina de bovino (50 NIH U/ml en cloruro de sodio 0.15 M) se añadió a cada pozo seguido de 1 ml/pozo de 3 mg/ml de fribrinógeno de bovino en medio 199. La trombina y fibrinógeno se mezclaron rápidamente y el fragmento de vasos sanguíneos se colocó en el centro del pozo. La formación de gel de fibrina ocurrió rápidamente y dejó al vaso suspendido dentro del gel. Un ml/pozo de medio 199 complementado con 20% de suero de ternera fetal, 250 lU/ml de penicilina y 250 U/ml de estreptomicina se añadió después a cada pozo. También se añadió ácido e-amino-n-caproico (300 µg/ml) durante los primeros 4 días y dos veces a la semana posteriormente (50 µg/ml) para prevenir la disolución del coágulo de fibrina. Los vasos se cultivaron a 37°C en una incubadora humidificada durante 25 días siendo el medio cambiado dos veces a la semana. El grado de formación de vasos nuevos se cuantificó en un estudio a ciegas dos veces a la semana por tres observadores diferentes .A.. isatfea.»...«. i,,,!,,. usando una escala análoga visual en la cual 0 = sin crecimiento, 1 = muy poca formación de vasos nuevos, 2 = formación importante de vasos nuevos y 3 = formación densa de vasos nuevos. Una calificación de angiogénesis se derivó de los conteos tomados para cada pozo dividiendo la puntuación total entre la puntuación máxima posible y después expresando el resultado como porcentaje. En cada una de tres ocasiones separadas, cada compuesto se probó en 20 pozos replicados. Los experimentos en los cuales los vasos sanguíneos se cultivaron en MCDB 131 (es decir, medio libre de suero) mostraron que los factores del suero no fueron necesarios para la formación de nuevos vasos sanguíneos. Alguno de los coágulos de fibrina se fijaron durante la noche en 10% de formalina, parafina incrustada, se seccionaron para histología y después se tiñeron para el factor VIII y CD31 de marcadores de células endoteliales. Los resultados se expresaron como la media ± sem. Se usó una prueba de t de Student para determinar el nivel de importancia. Durante el curso de 3 semanas de la prueba, un grupo complejo de microvasos emergió de la sección cortada de los vasos sanguíneos incrustados dentro del coágulo de fibrina. Muy poco crecimiento de vasos nuevos se vio de aquellas áreas del vaso que no había sido seccionada. Los primeros vasos sanguíneos aparecieron el día 4 y generalmente fueron rasurados en los extremos. A los siguientes 18 días, se ramificaron y dieron origen a nuevos grupos de vasos. El crecimiento fue rápido durante las primeras 2 semanas y después se hizo más lento en forma considerable.

Estos nuevos vasos fueron revestidos por célula endoteliales como se demuestra por inmunohistoquímica positiva para factor VIII y CD31. Las figuras 2 y 3 muestran el efecto de 2-sulfato de dextrina y 6- sulfato de dextrina sobre la formación de vasos nuevos. No hubo diferencia 5 entre vasos cultivados en medio en comparación con vasos cultivados en medio que contenía dextrina (100 µg/ml); (40 pozos; 2 experimentos; p = 0.9 el día 18). Por el contrario, hubo una reducción significativa en el número de vasos nuevos que se formaron cuando estuvo presente 2-sulfato de dextrina (100 µg/ml). Esto se vio primero el día 13 (p = 0.02), y la diferencia estuvo aún 10 presente el día 22 (p = 0.03). El 6-sulfato de dextrina también causó disminución significativa en la formación de nuevos vasos. Esto se vio primero el día 13 (60 pozos; 3 experimentos; p = 0.004) y estuvo presente el día 22 (p= 0.002). 15 EJEMPLO 3 Kubota eí al reportaron que las células endoteliales de vena umbilical humana sufrieron diferenciación morfológica con formación de tubos cuando se cultivaron en un gel reconstituido compuesto de proteínas de 20 membrana basal (Matrigel; Beckton-Dickinson). Esto tiene paralelo con la situación in vivo en donde la línea de células endoteliales que revisten el lumen de vasos sanguíneos y están en contacto con la matriz extracelular de membranas básales que están compuestas de colágeno IV, sulfato de heparina-peptidoglican y las glicoproteínas laminina y nidogen/entactina. Debido a la capacidad de las membranas básales para estimular la diferenciación, las células colocadas sobre el gel se fijaron rápidamente. Dentro de una a dos horas, se observaron procesos alargados. Después de 8 horas, los cultivos de células endoteliales muestran redes abundantes de ramificación y anastomosis de cordones de células. Por microscopía óptica, la mayoría de estos cordones mostraron una estructura translúcida central a lo largo de su eje longitudinal sugiriendo la presencia de un lumen. Durante 18 hiras, las células endoteliales han formado una red interconectada de células anastomosantes que, por microscopio óptico de baja potencia, tienen una apariencia de panal. Las estructuras en forma de tubo formadas por células endoteliales sobre Matrigel persisten durante varios días. Con el tiempo, la red empieza a desprenderse del Matrigel con células endoteliales viables apareciendo en el medio de cultivo. La formación de las estructuras de tubo no depende de factores de crecimiento extracelular o la presencia de heparina en el medio de cultivo. La formación de tubos parece ser relativamente específica para células endoteliales debido a que ni los fibroblastos de la dermis humanos ni las células de músculo liso humanas forman tubos cuando se cultivan en Matrigel. Las células endoteliales cultivadas en Matrigel retienen la reactividad del factor VIII y son metabólicamente activas como lo indica su absorción de lipoproteínas de densidad baja acetilada. Además, después de más de una semana en cultivo, las células endoteliales de vena umbilical humana que crecen sobre Matrigel no muestran incremento en su número de células, en comparación con células que crecen sobre fibronectina que muestran un incremento de cuatro veces en número de células. Estudios de EM ultraestructural han confirmado que las extensiones citoplásmicas anastomosantes de las células endoteliales morfológicamente diferenciadas contienen un lumen que es completamente encirculado por una o dos células endoteliales en sección transversal. El lumen contiene varias cantidades de citoplasma degenerado, sugiriendo que tiene lugar una remodelación muy rápida de la célula durante la formación del tubo. Estudios de viabilidad de células endoteliales sobre Matrigel no indican que la muerte celular juega un papel importante en la formación de tubo. Además, estas células diferenciadas retienen los cuerpos de Weibel-Palade característicos de las células endoteliales. La prueba de formación de microtubos endoteliales se realizó aislando células endoteliales de vena umbilical humanas de cordones umbilicales con 6 horas de parto por sección cesárea. La vena umbilical se cauló y 0.1% de colagenasa en solución salina regulada en su pH en fosfato se introdujo y se incubó durante 20 minutos. Las células endoteliales liberadas por la colagenasa se obtuvieron lavando la vena umbilical con medio 199. Las células se lavaron tres veces con medio 199 y después se cultivaron en matraces de cultivo de tejido recubiertos con firbonectina. El medio de crecimiento consistió de medio 199 con 20% de suero de bovino fetal, 30 : ¿fcA í µg/ml de complemento de crecimiento de células epidermales, 10 I U/ml de heparina, 100 lU/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Las células endoteliales de vena umbilical humanas se hicieron pasar a confluencia después de tratamiento con tripsina-EDTA. Todas las células se usaron en pasajes 3 a 6. Alícuotas de Matrigel se surtieron en cajas de cultivo de tejido de 35 mm de diámetro sobre hielo y después se incubaron a 37°C durante 10 minutos para permitir que el gel fraguara. Las serie de dilución de D2S y D6S se prepararon en medio de crecimiento de HUVEC y se añadieron a las cajas. HUVEC en los pasajes 3 a 6 se cosecharon usando tripsina y se suspendieron en medio de crecimiento a una densidad de 2-3 x 10^ células/ml. Alícuotas de 1 ml de la suspensión de células se añadió a las placas que contenían las dextrinas sulfatadas y se incubaron a 37°C, 5% de CO2. En varios puntos en el tiempo de 8 a 24 horas, las placas se examinaron y se calificaron usando un esquema publicado de 0-4, en donde 0 = todas las células adherentes permanecen individuales, y 4 = todas las células adherentes implicadas en estructuras tubulares. La formación de nuevos vasos se cuantificó en un estudio a ciegas por tres diferentes observadores a las 18 horas. La variabilidad del observador-dentro y el observador-entre fue de <10%. n=3. Los resultados de 2-sulfato de dextrina y 6-sulfato de dextrina se muestran en el cuadro 2 y la figura 4.

CUADRO 2 formación de microtúbulos endoteliales en presencia de dextrinas sulfatadas Puntuación de Compuesto formación de tubos Dextrina D2S (µg/ml) 0 4 6.25 4 12 4 25 4 50 23 100 3 200 2 D6S (µg/ml) 0 4 6.25 4 12 3 25 2 50 1 100 0 200 0 Un sulfato de dextrina bisulfatado (es decir: 2,6-sulfato de dextrina libre de endotoxina; ML95/50) también se probó en este ensayo. La molécula consiste de un sulfato en la posición 2' en cada molécula de glucosa con aproximadamente 30% de las moléculas de glucosa también teniendo un sulfato en la posición 6'. Su actividad antiangiogénica fue más que aquella vista con D2S pero menos aquella vista con D6S. Esto mostró que el tener más de un sulfato con moléculas de glucano incrementa la actividad antiangiogénica de las dextrinas sulfatadas. El modelo in vitro de angiogénesis usado para probar dextrinas sulfatadas satisfizo las dos características de angiogénesis, es decir, proliferación de células endoteliales y surgimiento de capilares. Cuando se han usado pruebas in vitro similares para probar otros polisacáridos sulfatados, los datos han sido difíciles de interpretar debido a que los compuestos primero no sufrieron caracterización química detallada. Las observaciones in vitro de los inventores de la presente invención muestran que las dextrinas sulfatadas inhiben la formación de vasos nuevos por células endoteliales normales y que esto evita la formación de nuevos vasos sanguíneos; es decir, angiogénesis. A este respecto, es interesante revisar los estudios de Nakamura et al quienes mostraron que SP-PG inhibió la angiogénesis que se vio después de inoculación subcutánea de células de AIDS-KS en ratones sin pelo. Sin embargo, tuvieron que administrar 250 mg/kg/día a fin de eliminar la angiogénesis. Dicha dosis nuca se pudo haber logrado en pacientes y probablemente explica porqué una inhibición de la angiogénesis no se vio en pruebas clínicas subsecuentes cuando el fármaco se administró por vía intravenosa. Por el contrario, los inventores de la presente invención administraron una dosis de « 2 mg/kg/día y observaron un efecto clínico i ' tísé.iÍHMÁ' '- fftj-? -*'-ft.-i*Íff r - "tjtfT''*'-"'-'- - «*••' ' -*-»- • «>""afcfeiH?<i»?a?^m¿^^¿^,^^^^j^^^ significativo en lesiones de sarcoma de Kaposi tempranas sin ninguna toxicidad asociada. En un reporte reciente se mostró que las dextrinas sulfatadas no interfirieron con el crecimiento pero inhibieron la diferenciación morfológica de células epiteliales (Thornton et al, Anti-microbial Agents and Chemotherapy 43, 2528-2533, 1999). Los resultados de la prueba de angiogénesis placentaria muestra que el sulfato de dextrina inhibe la formación de nuevos vasos y la diferenciación de la línea de células HUVEC.

EJEMPLO 4 Se evaluó el efecto del sulfato de dextrina sobre la proliferación in vitro de 2 líneas de células endoteliales y formación de vasos de la línea de células endoteliales HUVEC. SK-HEP-1 es un adenocarcinoma de hígado humano con morfología endotelial y ECV304 es un carcinoma de vejiga urinaria humana con características similares a la endotelial. Ambas líneas de células se obtuvieron de ECACC. HUVEC se probó como un cultivo de crecimiento por TCS Biologicals. Las células se hicieron crecer y se prepararon en un medio RPMI que contenía 10% de FCS y 2mM de glutamina. Para las pruebas in vitro, las células se cosecharon con 0.025% de EDTA, se lavaron en el medio de cultivo y se colocaron en placas de 96 pozos a 5x103 y 1x104 células/pozo en un ¿..i.tiS á i volumen de 100µl. Después de 24 horas, para permitir adherencia de células, el medio fue remplazado por medio fresco que contenía sulfato de dextrina a concentraciones de 0, 1 , 5, 10, 50, 100, 500, 1000 µg/ml. Después de 48 horas, la proliferación se evaluó por absorción de metiltiazoltetrazolio (MTT) como sigue: MTT (Sigma) se añadió a los pozos en un volumen de 50 µl a una concentración de 1 mg/ml. Después de 4 horas de incubación los cristales de formazan insolubles se solubilizaron mediante la adición de 75 µl de DMSO/pozo y la absorbancia se midió a 550nm. La prueba de MTT había mostrado previamente correlacionarse con conteos de células directos para un número de líneas de células epiteliales Gl (Watson et al, Anti-cancer drugs, 1994; 5, p 591-597). El efecto de dextrina sulfatada sobre la formación de vasos de la línea de células HUVEC se realizó mediante el uso del modelo de angiogénesis humano de TCS Biologicals. La prueba se suministró como un cultivo de crecimiento de la línea de células HUVEC junto con matriz de cultivo y células humanas adicionales presentes (la naturaleza exacta de las células se desconoce) en las primeras etapas de la formación de túbulos en un formato de 24 pozos. El reactivo de control positivo fue una solución de abastecimiento estándar de VEGF y el control negativo fue Suramin. Después de remover los sellos de los pozos, los cultivos se examinaron para morfología de células a fin de confirmar su viabilidad. fcfa.*. fcJ*faimÍB> >-* *. *M*?..1. .. - aaJaalalalaaU*. . ??- • * > -« »» » n a?^<??**? *togaé?0 f?* ?** tiH*. **~?ßt?l ¡jujlil Se proveyó medio de crecimiento con el equipo y se uso para hacer la dextrina sulfatada a concentraciones que variaban de 0-1000 µg/ml.

El medio existente se aspiró de los pozos y fue remplazado por medio que contenía las concentraciones de sulfato de dextrina en un volumen de 0.5 ml. Este se colocó a 37°C en una atmósfera que contenía 5% de CO2. Esto se repitió los días 4, 7 y 9. Entre los días 7-11 los cultivos se fijaron mediante el fijador adjunto y se tiñeron con el anticuerpo anti-PECAM-1 monoclonal de ratón a una dilución de 1 :4000 (presente n regulador de pH bloqueador). 0.5 ml de anticuerpo diluido se añadieron por pozo y se incubaron durante 60 minutos a 37°C. El anticuerpo secundario (conjugado de fosfatasa alcalina-lgG antiratón de cabra) se diluyó 1 :500 en regulador de pH bloqueador y se añadió a los pozos después de lavarse durante 60 minutos a 37°C. Después de lavar la placa, el sustrato se preparó; tabletas de BCIP/NBT se disolvieron en agua destilada y se añadieron a los pozos. Después de incubarse durante 5-10 minutos los pozos se lavaron y se formaron imágenes de ellos usando el paquete de software de análisis de imagen Leica Qwin. Se evaluó sulfato de dextrina en dos experimentos separados. Todos los experimentos se realizaron con dos concentraciones de siembra de células diferentes. El sulfato de dextrina indujo niveles moderados de inhibición (véase figuras 5, 6, 7 y 8). Para comparar entre líneas de células y experimentos, el nivel de inhibición logrado a la concentración más alta t&áaagj a** *- anau^-i evaluada (1000 µg/ml) se calculó como la significancia a partir del control no tratado, (véase Cuadro 3).

CUADRO 3 Línea Experimento Concentración Inhibición a Valor de celular No. de células 1000 µg/ml (%) SK-HEP-1 1 1e4 64.3 p<0.0001 2e4 39.0 (500µg/ml) p<0.0001 2 1?4 63.6 p<0.0001 2e4 35.1 p<0.0001 ECV304 1 1ß4 21.5 p<0.0001 2e4 33.1 p<0.0001 2 1?4 11.9 p<0.01 2e4 12.8 p<0.0001 La línea de células SK-HEP-1 se inhibió a un mayor grado que la línea de células ECV304, con sulfato de dextrina induciendo ~ 65% de inhibición a la concentración de células más baja. La inhibición a la concentración de células más alta no fue tan grande. El nivel de inhibición que se mostró con la línea de células ECV304 estaba en el intervalo de 11-33%. No hubo diferencia entre el nivel de inhibición en las 2 concentraciones de células. Los resultados del efecto de sulfato de dextrina sobre la formación de túbulos se da en el Cuadro 4 y en las figuras 9 y 10. La distancia de túbulos no se representó gráficamente ya que no hubo discriminación dentro del experimento entre controles positivos y negativos. Con respecto al número de túbulos, Suramin indujo un efecto üti ii.i . . inhibidor significativo (51 %, p?.0001 , prueba de t de Student) cuando se comparó con el control de vehículo mientras VEGF indujo una elevación significativa (174%, p<0.0001). El efecto de sulfato de dextrina sobre el número de punto de ramificación fue dependiente de la concentración, y la estimulación significativa ocurrió a las concentraciones más bajas (1 y 5 µg/ml, 120% y 115% de control). Sin embargo, la inhibición se mostró a concentraciones mayores de 10 µg/ml (26%, 48%, 53% y 68% de inhibición, a concentraciones de 50, 100, 500 y 1000 µg/ml, respectivamente). Suramin inhibió significativamente los puntos de ramificación (98% de inhibición, 10 p<0.0001 ) mientras que VEGF apenas elevó significativamente los puntos de ramificación (131 %, p<0.05). Todas las concentraciones de sulfato de dextrina redujeron significativamente los puntos de ramificación de túbulos de 31 % con 1 µg/ml hasta 93% con 1000 µg/ml (significancia mostrada en el cuadro 4). Las imágenes microscópicas se muestran en las figuras 11 , 12, 13, 14 y 15. 15 CUADRO 4 Mediciones de anqiogénesis promedio (DE) No. de No. de Distancia puntos de Distancia puntos de Túbulo entre ramificación Túbulo entre túbulos ramificación 20 No. túbulos de túbulos No. de túbulos Suramin (n=80) 40.51 0.05 (0.23) 10µg de 86.31 (56.90) 1.62 (3.36) 40.5 (23.24) (20.30) p<0.0001 sulfato de p<0.01 p<0.001 dextrina (n=151 ) 76 (43.73) NS VEGF (n=286) 85.53 4.00 (5.64) 50µg de sulfato 87.04 0.85 (1.95) 143.5 (82.71) (53.41 ) p<0.05 de dextrina (58.57) p<0.0O01 p<0.0001 (n=121 ) 61 (35.07) p<0.0001 Oµg de sulfato de 89.25 3-05 (4.43) 100µg de sulfato 94.73 0.89 (1.43) dextrina (65.40) de dextrina (63.51 ) p<0.0O01 (n=164) (n=85) 82.5 (47.49) 43 (24.68) p<0.0001 1 µg de sulfato de 80.33 2.12 (3J6) 500µg de sulfato 77.30 0.33 (0.66) dextrina (56.36) p<0.05 de dextrina (44.27) p<0.0O01 (n=197) (n=77) 99 (57.01 ) 39 (22.37) p<0.0001 p<0.0001 5µg de sulfato de 72.38 1.39 (2J8) 1000µg de 69.47 0.24 (0.53 dextrina (50.42) p<0.0001 sulfato de (35.74) p?.001 (n=189) dextrina 95 (54.70) (n=52) p<0.05 26.5 (15.16) p<0.0001 El sulfato de dextrina inhibió el crecimiento basal de las líneas de células similares a endoteliales, SK-HEP-1 y EVC304 como se evaluó mediante la prueba de MTT. Los efectos inhibidores se vieron a concentraciones >100 µg/ml. La siembra de células a una concentración más alta no pareció incrementar la magnitud del efecto inhibidor, indicando que la acción es poco probable que sea sitostática más que citotóxica. SK-HEP-1 fue más sensible a los efectos inhibidores de crecimiento de la dextrina sulfatada. No se sabe que la proliferación de células HUVEC fuera inhibida directamente por sulfato de dextrina in vitro (Thornton et al, 1999). Sin embargo el efecto del sulfato de dextrina se evaluó sobre las características angiogénicas de células HUVEC en un cultivo de células mixto en presencia de ECM. VEGF y Suramin se usaron como controles positivo y negativo, ?pectivamente, y afectaron la formación de túbulos y puntos de ramificación en la dirección corresta. El sulfato de dextrina indujo estimulación baja pero significativa de número de túbulos a las concentraciones más bajas pero a la concentración más alta de 1000 µg/ml indujo 68% de inhibición. El nivel de inhibición de número de túbulos a 100 µg/ml (48%) fue comparaBle con el que se reportó en el estudio de Thornton et al. El sulfato de dextrina indujo un efecto inhibidor sobre el número de puntos de ramificación a todas las concentraciones evaluadas. La dextrina sulfatada inhibió el crecimiento de 2 líneas de células similares a endoteliales en una prueba in vitro e inhibió el número de túbulos y puntos de ramificación de la línea de células HUVEC en ua prueba de angiogénesis.

EJEMPLO 5 La capacidad del sulfato de dextrina para inhibir el crecimiento in vivo del xenoinjerto colorrectal humano bien vascularizado AP5LV fue investigado. Sulfato de dextrina, 10 mg/kg en 1 ml de icodextrina se administró cada segundo día a dos ratones SCDI machos. La dosificación se continuó durante 14 días. La línea de células evaluada, AP5LV, es una variante de una línea de células colorectales humanas establecidas, derivadas originalmente t i. • A?iA?A,tiit aÍA ¿átaat,. SJÜfc »:ár.; de un tumor primario del paciente. Las células AP5LV se han seleccionado por su capacidad para colonizar los pulmones después de inyección intravenosa y de metastatizarse espontáneamente a los pulmones después de inyección de las células en la pared muscular del peritoneo. Las células AP5LV se mantuvieron in vitro en un medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco, Paisley, RU) que contenía 10% (v/v) de suero de bovino fetal inactivado con calor (Sigma, Poole, RU) a 37°C en 5% de CO2 y condiciones humidificadas.

Las células de las monocapas semiconfluentes se cosecharon con 0.025% de EDTA, se lavaron dos veces en el medio de cultivo anteriormente descrito, se volvieron a suspender en 5 x 10^/50 µl en solución salina regulada en su pH con fosfato estéril, pH 7.4 (PBS). Los ratones fueron anestesiados usando Hypnorm (Roche)/Hyponovel (Janssen) y la suspensión de células se inyectó en la pared de músculo peritoneal de 20 ratones SCID machos. Los ratones fueron etiquetados electrónicamente para propósitos de identificación (RS Biotech, Tracker) y fueron distribuidos aleatoriamente a dos grupos experimentales (véase más adelante). El régimen de tratamiento se inició el día 1 y se continuó cada tercer día hasta terminar el día 38. En la terminación, los tumores de pared de músculo peritoneal fueron extirpados y pesados, la mitad se congelaron y la mitad se fijaron en formalina. Los pulmones también se removieron y se fijaron en formalina para evaluación de carga de tumores metastásicos. Los ratones se pesaron durante todo el estudio. *&*>.

Grupo 1 , n = 10 machos-4% de icodextrina, 1 ml i.p. cada dos días. Grupo 2, n = 10 machos-sulfato de dextrina 10 mg/kg en 4% de icodextrina, 1 ml i.p. cada dos días. Los pesos finales de los tumores se muestran en la figura 16 (pesos de tumores para ratones individuales) y figura 17 (pesos de tumores promedio para cada grupo experimental). El sulfato de dextrina indujo una reducción del 28% en el peso final del tumor que no alcanzó la significancia (p=0, prueba de Student). La dosis de sulfato de dextrina escogido para el estudio de terapia inicial no indujo un efecto significativo en los pesos finales del tumor del xenoinjerto colorrectal humano, PA5LV. Esto puede reflejar el hecho de que n=9/10 ratones por grupo fueron suficientemente altos para mostrar significancia a este nivel de inhibición. No hubo toxicidad con esta dosis.

EJEMPLO 6 Los sulfatos de dextrina son compuestos conocidos. Se producen por sulfatación de dextrinas, que son mezclas de polímeros de glucosa producidas por hidrólisis de almidón. Estos polímeros de glucosa tienen un amplio espectro de polimerización. El grado de polimerización (GP) varía de 1 (el monómero, glucosa) a valores muy altos, por ejemplo hasta de cien mil o más unidades de glucosa.

Típicamente, el resultado directo de hidrolizar un almidón es una dextrina que contiene una alta proporción de polímeros de peso molecular relativamente bajo y podría contener, por ejemplo, hasta 60% en peso de polímeros de glucosa de GP menor de 12. Los sulfatos de dextrina usados en la presente invención pueden tener una amplia gama de composición, pero son preferiblemente derivados de dextrinas que contienen por lo menos 50% en peso, preferiblemente más de 90%, de polímeros de glucosa de GP mayor que 12, y/o que contienen menos de 10%, preferiblemente menos de 5% en peso de polímeros de glucosa de GP menor que 12. El peso molecular promedio en peso de la dextrina puede ser, por ejemplo, de 10,000 a 35,000, preferiblemente de 15,000 a 25,000. (La técnica usada para determinar el peso molecular de la dextrina es cromatografía de líquidos de alta presión usando columnas cromatográficas calibradas con estándares de dextrina, como se designa por Asop et al., J. Chromatography 246, 227-240, 1989). Preferiblemente, la dextrina contiene no más de 10%, preferiblemente menos de 5% en peso de polímeros de peso molecular mayor que 40,000. El peso molecular promedio en peso y el perfil de polímero se logra sometiendo la dextrina a fraccionamiento, usando técnicas conocidas, incluyendo precipitación con solvente y fraccionamiento de membrana. Entre las dextrinas de las cuales se pueden derivar los sulfatos de dextrina adecuados para usarse en la presente invención están aquellas descritas en las especificaciones de patente europeas Nos. 115911 , 153164 y 207676. 11 i I ilétl , t-*i,.Má±±?í,.

Los sulfatos de dextrina se han usado previamente con fines farmacéuticos. Por ejemplo, la especificación de patente británica 871 ,590 describe el uso de ciertos sulfatos de dextrina como agentes antilipémicos, y la especificación de patente de E.U.A. 5,439,892 describe el uso de ciertos sulfatos de dextrina como agentes anti-VIH. Estas referencias también describen procedimientos para la producción de sulfatos de dextrina; sus descripciones se incorporan aquí por referencia. En el método de la invención, el sulfato de dextrina se puede administrar por cualquier vía, entérica o parenteral, a discreción del médico. La administración intraperitoneal es particularmente efectiva, pero el sulfato de dextrina también se puede dar, por ejemplo, por vía oral, intravenosa, o se puede inyectar directamente en lesiones sobre una base de lesión por lesión, o puede aplicarse por vía tópica. El nivel de dosis debe ser determinado por el médico. Las dextrinas se pueden sulfatar en las posiciones 2, 3 y 6, y una dextrina completamente sulfatada contiene tres grupos sulfato por unidad de glucosa. El sulfato de dextrina usado en la presente invención puede tener cualquier grado de sulfatación, pero preferiblemente contiene casi dos, muy preferiblemente de 0.5 a 1.5, grupos sulfato por unidad de glucosa. También, el sulfato de dextrina es preferiblemente 2-sulfato de dextrina, 6-sulfato de dextrina o una mezcla de los mismos.

Una composición para usarse en la administración de sulfato de dextrina por vía intraperitoneal se preparó en forma de una solución acuosa estéril que contenía: Sulfato de dextrina 100 microgramos/ml Mezcla de polímero de glucosa 10 gramos/litro Na 132 mmoles/litro Ca 1.75 mmoles/litro Mg 0.75 mmoles/litro Lactato 35 mmoles/litro El sulfato de dextrina fue 2-sulfato de dextrina, producido como se describe en el ejemplo 3 de la patente de E.U.A. 5,439,982. La mezcla de polímero de glucosa, presente en la solución como un agente osmótico, fue la mezcla de polímero de glucosa descrita en el ejemplo 2 de la especificación europea 153163; contenía 91.9% de polímeros de GP mayor que 12 y 7.9% de polímeros de GP de 2 a 10, y tenía un peso molecular promedio en peso de 23,700.

EJEMPLO 7 En el organismo adulto, las células endoteliales proliferan a una velocidad extremadamente baja con tiempos de recambio que se ha estimado que son de años. Bajo ciertas condiciones fisiológicas (v.gr., ovulación) y patológicas (v.gr., cicatrización de heridas, inflamación, crecimiento tumoral, artritis reumatoide, retinopatía diabética y enfermedad intestinal inflamatoria), los vasos sanguíneos nuevos crecen rápidamente a partir de capilares preexistentes por un procedimiento de brote que es similar a la angiogénesis embrionaria. La angiogénesis fisiológica es por lo tanto rara. Otras formas de angiogénesis en el adulto casi siempre están asociadas con un proceso de enfermedad patológico. a) Inflamación y anqioqénesis Aunque estos dos procesos son separados, distintos y separables, no obstante están estrechamente relacionados. La aparición histórica de inflamación crónica incluye la presencia de tejido similar a granulaciones del cual la neovascularización es una caracteística prominente. El incremento marcado en las demandas metabólicas de tejido que es proliferable, reparable o que sufre hipertrofia tiene que ser acompañado por un incremento en el suministro de sangre capilar. Este es un requerimiento absoluto y sugiere varias características de angiogénesis. Primero, el sistema vascular puede responder rápidamente a las necesidades incrementadas del tejido con un incremento en su microvasculatura. Segundo, el costo metabólico alto de la angiogénesis significa que el proceso debe ser estrechamente controlado bajo condiciones básales y que debe ocurrir sólo cuando es absolutamente necesario. Tercero, cuando se pierde dicho control estricto, se crea un ambiente anormal y éste conduce a enfermedad.

Por lo tanto, las células endoteliales que son normalmente quiescentes se activan como parte de la respuesta angiogénica. Cuando son estimuladas las células endoteliales de la microvasculatura, degradan su membrana basal y matriz extracelular proximal, migran direccionalmente, se dividen y se organizan en capilares funcionables que son revestidos por una lámina basal nueva. Estos pasos no son secuenciales. Más bien, representan una orquestación de eventos traslapables que son necesarios para intentar regresar el tejido dañado al estado homeostático normal. En cada uno de los pasos de la angiogénesis, quedan espacios sustanciales en nuestro conocimiento de los mecanismos exactos en cuestión. La señal que inicia la angiogénesis varía con la condición que activa la estimulación y la angiogénesis y se piensa que es específica de órganos. Por ejemplo, la desgranulación de plaquetas así como la digestión proteolítica de la matriz extracelular ha sido implicada porque ocurre rápidamente después de daño al tejido y no requieren nueva síntesis de proteína. Sin embargo, muchas células también pueden ser la fuente de señales angiogénicas e incluyen células tumorales, fibroblastos, células epiteliales y células endoteliales. Por lo tanto, la angiogénesis, como se define mediante el crecimiento de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes, es un proceso biológico fundamental que está en el meollo de muchos procesos fisiológicos y patológicos. En la inflamación crónica y en el crecimiento de tumores, la angiogénesis progresa desde un proceso fisiológico hasta un proceso patológico. Esto significa que un fármaco como 2-sulfato de dextrina o 6- sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina que reduce y/o previene la proliferación de células endoteliales y previene la angiogénesis durante las etapas tempranas de un proceso de enfermedad patológico podría abortar o incluso prevenir el daño al tejido que ocurriría como consecuencia de la respuesta inflamatoria crónica. La finalidad de un fármaco sería prevenir el lento progreso a la destrucción de tejido y fibrosis que es inducida por la respuesta angiogénica vista en la inflamación crónica. b) Crecimiento tumoral y metástasis Ha habido una investigación considerable acerca del papel de la angiogénesis en el crecimiento tumoral. En una etapa temprana de la patogénesis de un tumor, y antes de que un tumor se vuelva clínicamente importante, debe haber un cambio a un fenotipo angiogénico. Este cambio angiogénico puede ser mediado ya sea por un incremento en la expresión de factores angiogénicos, o bien por una disminución en la expresión de los factores angiogénicos, o ambos. Muchos factores han sido implicados en el control de actividad angiogénica asociada con tumor incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VRGF), factor de crecimiento de fíbroblásticos básico (bFGF) y las quimocinas CXC. Ya se ha mostrado que el 2-sulfato de dextrina y el 6-sulfato de dextrina no interfieren con la acción proliferativa del crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento de fibroblastos básico en las células endoteliales primarias o la línea células KSY-1. La diseminación y crecimiento de metástasis distales sólo lo puede lograr células individuales que han podido diseminarse a través del cuerpo y que pueden f 5 estimular una respuesta angiogénica. Por lo tanto, sólo cuando el depósito metastásico de células ha cambiado a un fenotipo angiogénico hará que la velocidad de proliferación de estas células sea suficientemente rápida para que el foco metastásico se vuelva clínicamente evidente. Un inhibidor efectivo de la proliferación mediada 10 por células endoteliales por lo tanto evitaría el crecimiento posterior del tumor primario y detendría el desarrollo de la metástasis. Puesto que el endotelio »* tumoral mismo no es genéticamente anormal, y por lo tanto no está sujeto a una alta tasa de mutación, es muy poco probable que desarrolle resistencia a fármacos para la terapia angiogénica. 15 Esto significa que un fármaco como el 2-sulfato de dextrina o 6- sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina que reduce o previene la proliferación de células endoteliales y previene la neo-angiogénesis durante las etapas tempranas del crecimiento de la metástasis podría abortar o incluso prevenir el desarrollo de la lesión metastásica. 20 c) Nefropatía y retinopatía diabéticas La enfermedad microvascular que se manifiesta como formación de vasos nuevos es una forma más severa de daño a tejido que ocurre en pacientes diabéticos. Su manifestación más severa es microangiopatía que conduce a nefropatía diabética y a enfermedad ocular retinal diabética. Los cambios microvasculares también se piensa que contribuyen a nefropatía diabética y a enfermedad diabética de los pies. Aunque el control de glucosa 5 deficiente es un factor que contribuye en forma importante, no es el único factor responsable de este proceso de enfermedad patológico. Tanto la nefropatía diabética como la retinopatía diabética tienen una patogénesis multifactorial. Hay cambios en las células enfoteliales, espesor de las membranas básales capilares, números disminuidos de 10 pericitos intramurales, hipoxia de tejido e incremento en al flujo sanguíneo retinal. En el caso de la retina, cambios en las arteriolas, capilares y venas ** conducen a la formación de vasos sanguíneos nuevos en los márgenes del i área isquémica. Se piensa que esto da como resultado la liberación de factores angiogénicos que promueven la formación de vasos sanguíneos 15 nuevos. Los factores angiogénicos con propiedades similares a aquellas aisladas de algunos tumores se han aislado de las retinas de varias especies. Este estímulo a neovascularización da como resultado una retinopatía proliferativa cuyas características son el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. La hemorragia de estos nuevos vasos a menudo conduce a 20 ceguera. Muchos pacientes con nefropatía diabética desarrollan insuficiencia renal crónica. A menudo se tratan usando diálisis peritoneal ambulatoria continua. Esto requiere el uso de soluciones de diálisis tales como glucosa o dextrina. Al añadir una dextrina sulfatada a una concentración apropiada a la solución de diálisis de dextrina, debe ser posible reducir el daño adicional al riñon inhibiendo la respuesta angiogénica que lo activa. Estudios realizados en animales han mostrado que cuando se administran dextrinas sulfatadas por vía intraperitoneal, se acumulan en el riñon. Al monitorear también las retinas de estos pacientes, será posible establecer si las dextrinas sulfatadas suministradas por vía intraperitoneal evitarán la formación de nuevos vasos sanguíneos (es decir, retinopatía diabética) en el ojo. d) Artritis reumatoide La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por una destrucción progresiva de las articulaciones. El sello característico de los cambios patológicos en el sinovio incluyen hiperplasia de células de revestimiento sinoviales y agregación en forma de folículos de los linfocitos y células plasmáticas. Esta inflamación del sinovio conduce a la formación de un pannus altamente vascularizado y a la desctrucción final de la articulación. La destrucción de tejido es parcialmente dependiente de proteasas y colagenasas que son liberadas durante la respuesta angiogénica. Aunque los estudios patológicos han identificado daño a los capilares, edema, congestión vascular e infiltrado celular como cambios patológicos tempranos, los factores que inician el proceso de enfermedad y Ht*t* u»Jt» *t.-.?M.&í*.-,....j. ?^tá¡»^?«? ?iwm?tb ?^áiá?a&m.%*?^íMi? conducen a esta inflamación crónica aún siguen siendo oscuros. Hirohata S & Sakakibara J, Lancet: angiogenesis as a possible elusive triggering factor in rheumatoid arthritis, 17 de abril de 1999, página 1331 , se notó que la neoangiogénesis precede a todas las otras características de artritis reumatoide tales como la proliferación de células de revestimiento e infiltración celular por uno o dos años. Aunque se ha mostrado que las células que revisten el sinovio producen factores de crecimiento angiogénico tales como factor de crecimiento de fibroblastos básico y factor de crecimiento endotelial en el sinovio de artritis reumatoide temprana, en sus etapas más tempranas, el sinovio muestra neoangiogénesis sin proliferación de células de revestimiento. Esto confirma que la angiogénesis es el evento patológico primario que es activado por un agente desconocido. Por lo tanto, la intervención con un fármaco como 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina que reduce o previene la proliferación de células endoteliales y neoangiogénesis durante las etapas tempranas podría ser benéfico tanto para el tratamiento de artritis reumatoide como para prevenir la artritis destructiva que finalmente se desarrolla. e) Enfermedad intestinal inflamatoria La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa son las formas importantes de enfermedad intestinal inflamatoria. Estos trastornos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal son activados por un patógeno desconocido. Su patología se caracteriza por un infiltrado de " leucocitos crónico en la pared intestinal que conduce a daño progresivo al tejido. La microvasculatura intestinal ha sido implicada como aquella que juega un papel importante en la patogénesis y la progresión de enfermedad intestinal inflamatoria. Estudios inmunohistoquímicos de tejido de pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria han mostrado que las células endoteliales microvasculares expresan niveles elevados de E-selección. Molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1 ) y CD31. Estas moléculas de adhesión son mediadoras de la unión y transmigración de leucocitos circulantes. De esta manera, la función de las células endoteliales alteradas está asociada con inflamación crónica persistente tanto en enfermedad de Crohn como en colitis ulcerativa. En el caso de estos dos trastornos, es posible que la administración intraperitoneal de 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina sería de beneficio terapéutico. La administración intraperitoneal de los fármacos da como resultado cantidades sustanciales de la acumulación de fármaco en todos los tejidos asociados con el intestino delgado y el intestino grueso. Esto podría dar como resultado una reducción en el número de células endoteliales proliferables, activadas, y evitaría la activación y proliferación de nuevas poblaciones de células endoteliales. Esto a su vez prevendría la neoangiogénesis y la continuación de la respuesta inflamatoria crónica que conduce al desarrollo de enfermedad clínica. f) Psoriasis Este es un trastorno de la piel que se caracteriza por infiltrado de células inflamatorias, proliferación anormal de queratinocitos y neovascularización dérmica. Aunque se reconoce que la angiogénesis asociada con psoriasis no es la causa principal de la patogénesis de esta enfermedad, la actividad angiogénica se debe sin embargo a una combinación de sobreproducción de IL-8 y una subproducción del inhibidor de angiogénesis, trombospondina-1. También hay una sobreexpresión de otros factores angiogénicos tales como el factor de crecimiento endotelial y factor-alfa de crecimiento transformante. El factor agiostático IP10 se expresa en placas psoriáticas en las que la expresión es reducida después del tratamiento exitoso de las lesiones activas. Esto sirve para resaltar la importancia de factores angiostáticos endógenos en trastornos dependientes de angiogénesis. De manera interesante, muchos tratamientos comúnmente usados para psoriasis tales como esteroides tópicos, ciclosporina y retinoides tienen actividad angiostática. Por lo tanto, la aplicación regular de una preparación tópica (es decir, la piel) de 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina a lesiones de placas activas de psoriasis podría dar como resultado la cicatrización de estas lesiones reduciendo o previniendo la proliferación de células endoteliales y la respuesta angiogénica que está impulsando el desarrollo de la lesión psoriática. ájtJ i*-.,. _.,. .«, ?.^ ,¡. ,. . ... ., .. . .. ..a^. j-a.» M...i.,.^<;^-.«.^a»!».^jtijMaÍh» tAeü

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de sulfato de dextrina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno dependiente de angiogénesis distinto a un tumor altamente vascular.

2.- El uso de sulfato de dextrina como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sulfato de dextrina es derivado de una dextrina que tiene por lo menos 50%, preferiblemente más de 90%, en peso de polímeros de glucosa de GP mayor que 12.

3.- El uso de sulfato de dextrina como se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde el sulfato de dextrina es derivado de una dextrina que contiene por lo menos 10%, preferiblemente menos de 5%, en peso de polímeros de glucosa de GP mayor que 12.

4.- El uso de sulfato de dextrina como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que tiene un peso molecular promedio en peso de 10,000 a 35,000, preferiblemente de 15,000 a 25,000.

5.- El uso de sulfato de dextrina como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que contiene menos de 10%, preferiblemente menos de 5% en peso de polímeros de glucosa de peso molecular mayor que 40,000. -s.l »«a¿J¿ ... .J ¿¡¡.¡jaSaA, jm**.a¿ft&n_____?__¡_£ i?Li&k&i

6.- El uso de sulfato de dextrina como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sulfato de dextrina contiene cuando mucho dos grupos sulfato por unidad de glucosa.

7.- El uso de sulfato de dextrina como se reclama en la reivindicación 6, en donde el sulfato de dextrina contiene entre 0.5 y 1.5 grupos sulfato por unidad de glucosa.

8.- El uso de sulfato de dextrina como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el sulfato de dextrina es 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o una mezcla de los mismos. J^tt¡*^*J' - •'-fr lf-a»t ..».• nMtt?..-»^¿^^., **i ¿? ?i¿i¡mt- t^^^^ ^- ? mt? ? iMim luirá r