MXPA02000021A - Metodos y composiciones para la sintesis de peptidos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona, primero con metodos para la sintesis de peptidos referidos como referidos como T-1249 y peptidos similares a T-1249. Tales metodos utilizan procedimientos de sintesis de fase solida y liquida para sintetizar y continuar grupos de fragmentos de peptido especifico para producir el peptido de interes. La presente invencion se relaciona ademas con fragmentos de peptido individuales que actuan como intermediarios en la sintesis de los peptidos de interes (por ejemplo. T-1249). La presente invencion todavia se relaciona ademas con grupos de tales fragmentos intermediarios de peptidos que pueden utilizarse juntos para producir T-1249 y peptidos similares a T-1249 de longitud completa.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS 1. INTPsODUCCIÓN La presente invención se relaciona, primero, con métodos para la síntesis de péptidos, en particular péptidos denominados en la presente como péptidos semejantes a T-1249 (SEQ ID NO : 1 ) y T-1249. Estos métodos utilizan procedimientos de síntesis de fase sólida y líquida para sintetizar y combinar grupos de fragmentos de póptido específicos para proporcionar el póptido de interés. La presente invención se relaciona además con fragmentos de páptido individuales que pueden actuar como intermediarios en la síntesis de los péptidos de interés (v.gr., T-1249 ) . La presente invención se relaciona todavía adicionalmente con grupos de dichos fragmentos de intermediario de póptido que se pueden utilizar juntos para producir póptidos T-1249 y semejantes a T-1249 de longitud completa. La presente invención se relaciona todavía adicionalmente con métodos para la purificación de póptidos. en particular póptidos T-1249 y semejantes a T-1249, y los fragmentos de póptido individuales que actúan como intermediarios en la síntesis de los péptidos sujeto.

ANTECEDENTES Recientemente, un gran número de péptidos se ha identificado que exhiben una capacidad de inhibir eventos asociados con fusión y, de manera importante, también exhiben actividad antiviral potente. Ver, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,454,933; 5,656,480; Publicación de PCT Nos, WO 94/28920; WO 36/19495, Ya que estos péptidos se han venido usando extensamente, por ejemplo, corno terapéuticos, se presenta la necesidad de una capacidad de sintetizarlos en cantidades a gran escala . Aún cuando existen técnicas para síntesis de péptido, (ver, v.gr., Mergler y col., 1988, Tetrahedron Letters 29:4009-4012; a ber y col, (eds), "Peptides, Chemistry and Eiology. ESCOM, Leiden, 1992, 525-526; y Riniker y col., 1993, Tetrahedron Letters 49 9307-9320), no existen actualmente técnicas que puedan utilizarse para producción económica, a gran escala, de póptidos fácilmente purificados tales como T-1249, 3, COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención so relaciona, primero, con métodos para la síntesis de p?ptidos, en particular péptidos denominados en la presente como póptidos T-1249 (SEQ ID NO.!) y semejantes a T-L249, Estos métodos utilizan procedimientos de síntesis de fase sólida y líquida para sintetizar y combinar grupos de fragmentos de póptido específicos para proporcionar el péptido de interés. Generalmente, los métodos de la invención comprenden sintetizar intermediarios de fragmento de péptido protegidos de cadena lateral específicos de póptido T-1249 o semejante a T-1249 en un soporte sólido, copular los fragmentos protegidos en solución para formar un póptido T-1249 o semejante a T-1249 protegido, seguido por desprotección de las cadenas laterales para proporcionar ei póptido T-1249 o semejante a T-1249 final. Una modalidad preferida de los métodos de la invención involucra la síntesis de un péptido T-1249 que tiene una secuencia de aminoácido como se ilustra en SEQ ID NO : 1. La presente invención se relaciona además con fragmentos de péptido individuales que actúan como intermediarios en la síntesis de los péptidos de interés (v.gr., T-1249). Los fragmentos de póptido de la invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos que tienen secuencias de aminoácido como se ilustran en el Cuadro 1 a continuación : CUADRO 1 No. de SECUENCIA DE AMINOÁCIDO SECUENCIA DE PÉPTIDO AMINOÁCIDO NUMERADA CORRESPONDIENTE DE T-1249 (SEQ. ID NO 1) 1 WQEWEQ ITALL (SEQ ID NO : 2 ) 1-12 2 EQAgiggE?NEYEL (SEQ ID NO : 3 ) 13-26 3 QKLDKWASLWEW ( SEQ ID NO : ) 27-38 4 QKLDKWASLKWEWF ( EQ ID NO : 5 ) 27-39 5 EQAQIQQE NEYELQKLDKWASLWEWF ( SEQ ID NO : 6 ) 13-39 6 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL ( SEQ ID NO : 7 ) 1-26 7 EQAQIQQEKNEYELQKLDK ASLWEW (SEQ ID NO: 8) 13-38 La presente invención se relaciona todavía adicionalmente con grupos particulares de fragmentos de póptido que actúan como intermediarios en la síntesis del péptido de interés. Los grupos de fragmentos de póptido de conformidad con la invención incluyen los Grupos 1-6, como se designan en el Cuadro 2 a continuación CUADRO 2 Grupo Secuencia de Aminoácido Secuencia de Aminoácido Numerada Correspondiente de T-1249 (SEQ. ID NO- 1 WQEWEQKITALL ( SEQ ID NO ' 2 ) 1-2 EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO 3) 13-26 QKLDKWASLWEW ( SEQ ID NO 4 ) 27-38 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO 2) 1-12 EQÁQigQEKNEYEL ( SEQ ID NO , 3 ) 13-26 Q LDKWASLWEWF (SEQ ID NO 5) 27-39 WQEWEQ ITAL ( SEQ ID NO .2 1-12 EQAQIQQEIENEYELQKLDKWASLWEWF ( SEQ ID NO : 6 ) 13-39 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO • 2 ) 1-12 EQAQIQQEfCENEYELQKLKKWASLWEW (SEQ ID NO 8) 13-38 QEWEQ ITALLEQAQIQQEKNEYEL ( SEQ ID NO ; 7 ) 1-26 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO : 4 ) 27-38 WQE WEQKI TALLEQAQ I QQEK ? YEL (SEQ ID NO: 7) 1-26 QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO 5) 27-39 Esta invención se basa, en parte, en el descubrimien o inesperado de los inventores de que ciertas comt insciones de reacciones sintéticas de fase sólida fase líquida permiten que se fabrican póptidos T-1249 y semejantes a T-1249 de pureza elevada por primera vez a escala grande con producción elevada y alto rendimiento. En particular, de conformidad con los métodos de la invención, los péptidos T-1249 y semejantes a T-1249 se pueden sintetizar a una escala de uno o más kilogramos. Se ha encontrado que seleccionando los fragmentos de péptido T-1249 específicos de la invención para síntesis de fase sólida, la copulaciór altamente eficiente de técnicas de fase sólida se pueden explotar sin tener que utilizar el exceso de 3-, 4- o aún 5 veces de aminoácidos y reactivos que se requieren normalmente en síntesis de fase sólida. Los métodos de la invención utilizan solo aproximadamente un exceso de 0.5 veces (alrededor de 1,5 equivalentes) de aminoácido en la síntesis de fase sólida de los fragmentos de péptido de la invención. Esta reducción en la cantidad de aminoácido y reactivos hace a los métodos de la invención apropiados para síntesis a gran escala de péptidos T-1249 y semejantes a T-1249. Además, los inventores han encontrado sorprendentemente que ciertos fragmentos de póptido se pueden sintetizar en la fase sólida a una carga de aproximadamente >0,5 mmol por gramo de resina de fase sólida. Esta carga mejora significativamente la producción a través de la escala de carga de 0.25 a 0,35 mmol por gramo de resina, típicamente logrado en síntesis de peptido de fase sólida. Además, los inventores han encontrado que sintetizando fragmentos de póptido seleccionados en la fase sólida utilizando resina sensible al super ácido produce fragmentos de póptido de pureza inusualmente elevada. Las técnicas cromatográficas no son necesarias para purificar los fragmentos de péptido producidos de conformidad con la invención; los fragmentos sencillamente ST ponen a través de pasos de precipitación ?/o trituración antes del uso, o se usan como se obtienen directamente de la resina. El uso de una resina sensible al super ácido permite que péptidos protegidos, sintetizados de la invención se lixivien de la resina sin la remoción concomitante de los grupos protectores de cadena lateral. Esto reduce impurezas, y permite que los péptidos que comprenden 10 aminoácidos o mayores para sintetizarse en pureza y rendimiento elevados. El perfil de impureza de péptidos T-1249 y semejantes a T-1249 que se sintetizan en la fase de solución de conformidad con los métodos de la invención copulando los fragmentos de póptido de alta pureza producidos de conformidad con la invención consiste en fragmentos que no se copularon. y contiene niveles significativamente inferiores de análogos de omisión estrechamente relacionados que los póptidos T-1249 y semejantes a T-1249 sintetizados de conformidad con técnicas convencionales , v.gr., únicamente síntesis de fase sólida. Consecuentemente, los póptidos T-1249 y semejantes a T-Í249 producidos de conformidad con la invención son mucho más fáciles de purificar que aquellos producidos de conformidad con técnicas convencionales. En particular, el T-1249 producido de conformidad con los métodos de la presente invención se pueden purificar fácilmente a pureza de >90% en cromatografía de un solo paso. Por ejemplo, de conformidad con los métodos de la invención, T-1249 se puede purificar en cantidades de 400 g o más utilizando una columna de 12.70 centímetros (5 pulgadas). En contraste, el T-1249 preparado utilizando síntesis de fase sólida convencional (SPPS) es muy difícil de purificar, que requiere cromatografía de múltiples pasos. Por vía de ejemplo, la purificación de T-1249 preparado mediante SPPS típicamente resulta en 10 gramos o menos de material purificado de una columna de 20,32 centímetros (8 pulgadas). Los Ejemplos presentados en la Sección 9 mas adelante, demuestran estas síntesis de comoinación de péptidos -T-1249 de longitud completa. Los póptidos T-1249 y semejantes a T-1249 e intermediarios se pueden producir a una escala de uno o más kilogramos mediante los métodos de la invención. Los presentes inventores también han encontrado inesperadamente que péptidos tales como T-1249 y otros péptidos semejantes a T-1249, así como ciertos fragmentos de péptido descritos en la presente se pueden purificar utilizando materiales de alta capacidad debido a la pureza elevada de T-1249 después de síntesis de fase en solución. De esta manera, la presente invención todavía adicionalmente se relaciona con métodos para la purificación de péptidos, en particular T-1243 y póptidos semejantes a T-1249, y los fragmentos de póptido individuales que actúan como intermediarios en la síntesis de los péptidos de interés. 3 , 1 DEFINICIONES Las anotaciones de aminoácido utilizadas en la presente son convencionales y son como sigue: Abreviaturas de Aminoácido Común Aminoácido Símbolo Abreviatura Una Letra Común Alanina A Ala Asparagina N Asn Ácido aspártico D Asp Glutamina Q Gln Ácido glutámico E Gl u Isoleucina I He Leucina L Leu Lisina K Lys Fenilalanina F Phe Serina S Ser Treonina Thr Triptofan Trp Tirosina Y Tyr 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Acercamiento de tres fragmentos de T-1249 Esta figura ilustra el esquema seguido en el Ejemplo presentado en las Secciones 8 y 9 más adelante, para la síntesis de T-1249 de longitud completa empezando con Grupo 1 de fragmento de póptido intermedio, como se muestra en el Cuadro 1, anterior, e ilustra una modalidad no limitativa de los métodos de la invención. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 5.1 PÉPTIDOS DE LONGITUD COMPLETA La presente invención se relaciona con métodos, fragmentos de péptido, grupos de fragmentos de péptido que se pueden utilizar para sintetizar el póptido conocido como T-1249. T-1249 es un polipéptido de residuo de 39 aminoácidos cuya secuencia se deriva de secuencias de polipéptido viral HIV-1, HIV-2 y SIV gp41 , T-1249 tiene la siguiente secuencia de aminoácido: NH2-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKENEYELQKLDKWASLW?WF-COOH Quedará entendido que los métodos, fragmentos y grupos de fragmentos y técnicas utilizadas para seleccionar los fragmentos y grupos de fragmentos de la presente invención ST pueden utilizar para sintetizar fragmentos semejantes a T-1249 además de T-1249 , El término "semejante a T-1249" como se usa en la presente significa cualquier péptido HIV o no-HIV enumerado en la Publicación Internacional No. , presentada el 20 de mayo de 1999, que se incorpora por la presente como referencia en su totalidad, Además de T-1249 y los péptidos semejantes a T-1249 arriba descritos, los métodos, fragmentos y grupos de fragmentos de la presente invención se pueden utilizar para sintetizar péptidos que tienen extremos terminales amino modificados y/o carboxilo. Tomando T-1249 como un ejemplo, estos póptidos pueden ser de la fórmula: X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z en donde X representa un grupo amino ; un grupo hidro f óbi co seleccionado a par t ir del grupo que consiste en carbobenzoxi lo , dansi io y T-butiloxicarbonilo ; un grupo acet ilo ; un grupo 9- f luoroeni 1-metoxi-carboni lo ( FMOC ) ; o un grupo portador macromolecu lar seleccionado a par t ir del grupo que consiste en conj ugados de lípido-ácido graso, políetilenglicol , y carbohidratos; y Z representa un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butiloxicarbonilo, un grupo de áster para-nitrobencilo ; o un grupo portador macromolecular seleccionado a partir del grupo que consiste en conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol, y carbohidratos. En una modalidad preferida, los métodos de la invención se utilizan para sintetizar el póptido que tiene la fórmula anterior en donde X es un grupo acetilo y Z es un grupo amida. Las técnicas para adición de dichos grupos "X" y "Z" son bien conocidas por aquellos de experiencia en el ramo . En un método preferido, T-1249 y péptidos semejantes a T-1249 e intermediarios se pueden purificar utilizando cualquier empaque de columna basada en no sílica (para llevar al máximo la capacidad de carga) incluyendo, pero no limitado a empaques a base de zirconio, poliestireno, poliacrí 1 ico u otrcs empaques basados en polímero que son estables a escalas de pH elevadas y bajas. Por ejemplo, entre los empaques de columna cargados con no sílice que exhiben una amplia escala de pH que incluye valores de pH mayores de siete se encuentran los vendidos por Tosohaas ( Montgomeryville , PA) . Las columnas empacadas con dicho material se pueden funcionar en cromatografía de presión baja, media o elevada de conformidad con técnicas, convencionales bien conocidas en el ramo. Los Ejemplos presentados en la Sección 9, más adelante, demuestran la síntesis exitosa de póptidos T-1249 a través de copulación de intermediarios de péptido descritos abajo, en la Sección 5.2. 5.2 INTERMEDIARIOS DE PEPTIDO La presente invención abarca, pero no está limitada a intermediarios de fragmento de póptido de T-1249 y póptidos semejantes a Tl-249 con secuencias de aminoácido específicas como se enumeran en el Cuadro 1 anterior, y los grupos de intermediarios de fragmento de péptido enumerados en el Cuadro 2. Estos intermediarios de póptido, especialmente en los grupos como se enumeran en el Cuadro 2, a continuación, se pueden utilizar para producir T-1249 y péptidos semejantes a T-1249. Cualquiera o más de las cadenas laterales de los residuos de aminoácido de fragmentos de póptido enumerados en el Cuadro 1 o 2 se pueden proteger con grupos protectores convencionales tales como T-butilo (t-Bu), tritilo (trt) y t-butiloxicarbonilo (Boc), El grupo t-Bu es el grupo protector de cadena lateral preferido para residuos de aminoácido Tyr(Y). Thr(T), Ser(S), Glu(E'l y Ásp(D); el grupo trt es el grupo protector de cadena lateral preferido para residuos de aminoácido, Gln(Q) y Asn(N); y el grupo Boc es el grupo protector de cadena lateral preferido para residuos de aminoácido Lys( ) y Trp(W). De preferencia, los residuos Gln(Q) de los fragmentos de péptido de la invención se protegen con grupos de tritilo (trt). Sin embargo, si se desea solubilidad inferior de cualquiera de los fragmentos de póptido de la invención en solventes orgánicos, los grupos protectores tritilo se pueden eliminar de cualquiera o más de los residuos de glutamina de los fragmentos De preferencia, los residuos Asn(M) de cada fragmento de péptido de la invención están protegidos, Además, se prefiere que los residuos Trp(W) se protejan con un grupo Boc. Los fragmentos de péptido protegidos de conformidad con las fórmulas de péptido 1-5 enumeradas en el Cuadro 1 anterior incluyen, pero no están limitadas a, los compuestos enumerados en el Cuadro 3 a continuación.

CUADRO 3 No . de Fórmula Secuencia de Fórmula Aminoácido de Numerado CoPóptido rrespondiente de T-1249 (SQ ID NO:l) Ac-WQEWEQKITALL-COOH ( SEQ ID NO : 2 ) 1-12 F140C-EQAQIQQEKN?YEL-COOH ( SEQ ID NO : 3 ) 13-26 FMOC-QKLDKWASLWEW-COOH ( SEQ ID NO : 4 ) 27-38 4a FMOC-QKLDKWASLWEWF-NH2 ( SEQ ID NO : 5 ) 27-39 4b NH2-QKLDKWASLWEWF-NH2 ( SEQ ID NO : 5 ) 27-39 5a FMOC-EQAQigQEKNEYELQKLDKWASLWEWF- NH2 (SEQ ID NO: 6) 13-39 5b NH.-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWEF-NH, (SEQ ID NO: 6) 13-39 Cualquiera o mas de las cadenas laterales de los residuos de aminoácido de los póptidos enumerados en el Cuadro 3 anterior se pueden proteger con grupos protectores de cadena lateral convencionales tales como tBu, trt y Boc, como se describe arriba. La síntesis representativa de péptidos del Cuadro 3 se presenta en las Secciones 7 y 8 abajo, que utilizan las técnicas generales discutidas en la Sección 5.3, a continuación. 5.3 SÍNTESIS DE PEPTIDO Como se discute anteriormente, algunos de los fragmentos de póptido individuales de la invención se hacen de preferencia utilizando técnicas de síntesis de fase sólida, mientras que otros péptidos de la invención se hacen de preferencia usando una combinación de técnicas de síntesis de fase sólida y fase en solución, las síntesis culminando en la producción de T-1249 o póptidos semejantes a T-1249 como se describe en la presente. Sin embargo, quedará entendido que los fragmentos de póptido de la invención se pueden sintetizar o preparar mediante técnicas bien conocidas en el ramo. Ver, por ejemplo, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman and Co . , NY, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Los póptidos de la invención se pueden sintetizar alternativamente de modo que uno o más de los enlaces que ligan los residuos de aminoácido de los péptidos sean enlaces de no péptido Estos enlaces de no póptido alternativos se pueden formar utilizando reacciones bien conocidos a aquellos en el ramo, y pueden incluir, pero no se limitan a enlaces imino, áster, hidrazida, semicarbazida y azoicos, para nombrar solo unos pocos. En todavía otra modalidad de la invención.

T-1249 y póptidos semejantes a T-1249 que comprenden las secuencias arriba descritas se pueden sintetizar con grupos químicos adicionales presentes en sus términos amino y/o carboxi, de modo que, por ejemplo, la estabilidad, reactividad y/o solubilidad de los póptidos se mejora. Por ejemplo, grupos hidrofóbicos tales como grupos carbobenzoxilo , dansilo, acetilo o t-butiloxicarbonilo , se pueden añadir a los términos amino de péptidos. Asimismo, un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo se puede colocar en los términos amino de póptidos. (Ver modificación "X" de T-1249. arriba descrita). Adicionalmente , el grupo hidrofóbico, t-butiloxicarbonilo, o un grupo amido se pueden añadir a los términos carboxi de póptidos. De manera similar, un áster de para-ni trobencilo o grupo de áster de bencilo se puede colocar en los términos carboxi de póptidos. (Ver la modificación "Z" de T-1249, descrita arriba). Las técnicas para introducir estas modificaciones son bien conocidas por aquellos de experiencia en el ramo, Además, T-1249 y péptidos semejantes a T-1249 se pueden sintetizar de modo que su configuración esférica se altere. Por ejemplo, el D-isómero de uno o más de los residuos de aminoácido del péptido se pueden utilizar, en lugar del L-isómero usual.

Todavía adicionalmente, cuando menos uno de los residuos de aminoácido de los péptidos de la invención se puede substituir por uno de los residuos de aminoácido que ocurren no naturalmente bien conocidos. Las alteraciones tales como estas pueden servir pera aumentar la estabilidad, reactividad y/o solubilidad de los póptidos de la invención. Cualquiera de los T-1249 o péptidos semejantes a T-1249 se pueden sintetizar para tener adí cionalmente un grupo portador macromolecular ligado covalentemente a sus términos amino y/o carboxi . Estos grupos portadores macromoleculares puede incluir, por ejemplo, conjugados d? lípido-ácido graso, polietilenglicol , carbohidratos o póptidos adicionales. La modificación "X" de T-1249 arriba descrita, por lo tanto. puede representar adicionalmente cualquiera de los grupos portadores macromoleculares anteriores ligados covalentemente al término amino de un péptida. con un grupo póptido adicional siendo preferido. Asimismo, la modificación "Z" de T-1249 arriba descrita puede representar adicionalmente cualquiera de los grupos portadores macromoleculares arriba descritos. De preferencia, los fragmentos de póptido de la presente invención se sintetizan mediante técnicas de síntesis de péptido de fase sólida (SPPS) utilizando protocolos FMOC convencionales. Ver, v.gr., Carpino y col., 1970, J. Am, Chem. Soc. 92 ( 19 ); 5748-574 ; Carpino y col., 1972, J. Org, Chem, 37 ( 22 ).3404-3409. En una modalidad preferida, la síntesis de fase sólida de los fragmentos de póptido de la presente invención se lleva a cabo en soportes sólidos sensibles a super ácido que incluyen, pero no están limitados a. resina de cloruro de 2-clorotritilo (ver, v.gr,. Barios y col., 1989, Tetrahedron Letters 30 ( 30 ).3943-3946 ) y resina de ácido 4-h droximet?l-3-metoxi fenoxibutirico (ver, v.gr , Seiber, 1987, Tetrahedron Letters 28 ( 49 ), 6147-6150 , y Richter y col., 1994, Tetrahedron Letters 35(27): 4705-4706) Ambas, las resinas de cloruro de 2-cloro-tritilo y ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenaxibutír?co se pueden adquirir de Calbiochem-Movabiachern Corp , San Diego, CA. Los procedimientos generales, no limitativos para producción y carga de resinas que se pueden utilizar en síntesis de póptido de fase sólida se describen en la presente. Además, los ejemplos presentes en la Sección 6, más adelante, describen preparaciones de resina de e emplo , La carga de resina se puede realizar, por ejemplo, a través de las siguientes técnicas: La resina, de preferencia una resina sensible al super ácido tal como resina de 2-clorotritilo. se carga a la cámara de reacción. La resina se lava con un solvente clorado tal como diclorometano (DCM) . El lecho se drena y una solución de 0,5 - 1.5 equivalentes de un aminoácido con un exceso de 0.2 a 0.5 de diisopropiletilamina (DIEA) en aproximadamente 8-10 volúmenes de dicloroetano (DCE) se añaden. El N-término del aminoácido se debe proteger, de preferencia con Fmoc, y la cadena lateral del aminoácido debe estar protegido cuando sea necesario o apropiado. La mezcla se agita con burbujeo de nitrógeno durante 2-24 horas . Debe observarse que el solvente clorado tal como DCM o DCE se desea para hinchamiento adecuado de la resina de 2-clorotritilo . Después de la agitación, el lecho se drena y se lava con DCM. Los sitios activos en la resina de tapan en extremo con una solución de 9:1 de MeOH: DIEA durante aproximadamente 20-30 minutos. El lecho se drena, se lava cuatro veces con DCM y se seca con una purga de nitrógeno para proporcionar la resina cargada. Fmoc es el grupo protector preferido para el N-término del aminoácido. Dependiendo en qué aminoácido se está cargando, su cadena lateral puede estar protegida o no. Por ejemplo, cuando se carga triptofan (Trp), su cadena lateral debe estar protegida con Boc. Sin embargo, no es necesario proteger la cadena lateral de Leucina (Leu). De preferencia, ácido glutámico (Glu), ácido aspártico (Asp), treonina (Thr) y serina (Ser) se protegen como éteres de t-butilo o ásteres de t-butilo, y triptofan (Trp) y lisina (lis) se protegen como carbamatos de t-bu toxicarbonilo (Boc). La cadena lateral de amida de asparagína (Asn) y glutamina (Gln) puede o no estar protegida con grupos tritilo. Los aminoácidos Fmoc-protegidos utilizados en la carga d? la resina y en la síntesis de péptido están disponibles, con o sin grupos protectores de cadena lateral, como se requiera, de múltiples vendedores, incluyendo Senn o Genzyme , Como una alternativa al procedimiento anterior, la resina se puede comprar ya cargada con el aminoácido apropiado. Los Ejemplos presentados en la Sección 6, más adelante, describen preparaciones de resina de ejemplo. La técnica de síntesis de póptido de fase sólida se puede realizar, por ejemplo de conformidad con las siguientes técnicas no limitativas. La resina cargada se añade a la cámara de reacción y se acondiciona con un solvente, de preferencia cloruro de metileno (DCM; a de preferencia aproximadamente 10 vol,) con agitación de nitrógeno o agitación durante alrededor de 15 minutos para hinchar las cuentas de resina. Se requiere DCM para el hinchamiento adecuado de la resina de 2-clorotritina . El volumen de resina aumentará 3-6 veces en la cámara de reacción a medida que las cuentas se hinchan y los sitios activos se desdoblan y se hacen accesibles a la reacción. Después de que la resina se hincha, el solvente se drena de la cámara de reacción . La remoción del grupo protector Fmoc (9-fluoro-enil-metiloxicarbonilo ) de la amina terminal o la resina se puede lograr tratando la resina con 2 alícuotas de una solución al 20% de piperidina en N-metil-2-p?rrolidinona (NMP) durante aproximadamente diez minutos cada una, El volumen de la solución al 20% de piperidina en NMP requerido para cada alícuota dependerá de la escala de la reacción que .se está efectuando, La resina luego se lava 5-7 veces con alícuotas de NMP (aproximadamente 10 vol , ) para eliminar los productos secundarios de Fmoc \ es decir, dibenzofulveno y su aducto de piperidina) y piperidina residual . Una prueba de cloranilo se puede utilizar para determinar si la remoción de la piridina residual es completa. La solución de prueba de cloranilo se prepara añadiendo una gota de una solución saturada de cloranilo en tolueno a aproximadamente 1 mL de acetona. Los lavados de NMP se pueden probar añadiendo una gota del lavado a la solución de prueba de cloranilo. Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de amina secundaria, indicando que la piperidína residual todavía está presente. El lavado de NMP se repite hasta que ya no se observa el color azul o violeta. Entre tanto, el aminoácido subsecuente en la secuencia que se va a añadir a la resina se activa para reacción en su término carboxi . El término amina de cada aminoácido se debe proteger con Fmoc. Dependiendo de cual aminoácido se está añadiendo, su cadena lateral puede estar protegida o no . De preferencia, las cadenas laterales de Tyr(Y), Thr(T), Ser(S), Glu(E) y Asp(P) se protegen con t-Bu, las cadenas laterales de Gln(Q) y Asn(N) se protegen con trt, y las cadenas de Lys(K) y Trp(W) se protegen con Bsc, No es necesario que las cadenas laterales de Leu o lie estén protegidas. El aminoácido se puede activar como sigue. El aminoácido protegido con Fmoc (1.5 eq), hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) (1,5 eq), y diisopropiletilamina (DIEA) (1.5 eq) se disuelven en un solvente aprótico polar. tal como N-metil pirrolidinona (NMP), dimetilformamida (DMF) o dimetil acetamida (DMAC) (aproximadamente 7.5 vol,) a temperatura ambiente. La solución se enfría a 0-5BC, y luego se añade hexaf luorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N, N-N1 ,N ' -tetrametiluronio (HBTU) o O-benzotriazol-1-il-tetrametil-tetrafluoroborato (TBTU) (1.5 eq) seguido por agitación durante 5-15 minutos para disolver. Es importante que la activación se lleve a cabo a 0-52C para reducir al mínimo la racemización del aminoácido. El HBTU es el último reactivo añadido a la solución fría puesto que la activación y racemización no pueden ocurrir en su ausencia , La solución de aminoácido activado se carga a la resina drenada, lavando con DCM (aproximadamente 2,5 vol) . Nótese que la activación del aminoácido se lleva a cabo en NMP debido a la insolubilidad de HBTU en DCM, Sin embargo, DCM se añade a la reacción en este punto para mantener el hinchamiento adecuado de las cuentas de resina. La reacción se agita con burbujeo de N2 durante aproximadamente 1 hora a 20-30EC. La terminación de copulación se puede supervisar con una prueba de ninhidrina cualitativa como se describe abajo. Para comprobar la terminación de la reacción utilizando la prueba de ninhidrina cualitativa, una muestra de 2-20 mg de la resina se puede retirar y limpiar por lavado con metanol. A la muestra se añaden 3 gotas de una solución al 76% de fenol en etanol, 4 o 5 gotas de una solución de KCN 0,2 mM en piridina. y 3 gotas de una solución 0.28 M de ninhidrina en etanol. La muestra se diluye con etanol a un volumen de aproximadamente 0.5 mL y se coloca en un bloque de calor a aproximadamente 75aC durante 5-10 minutos. Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de aminas libres, indicando- que la reacción todavía no está completa. La muestra se puede diluir adicionalmente a un volumen de aproximadamente 3 L para calibrar más fácilmente el grado de cambio de color en la muestra concentrada . Si se observa una prueba de ninhidrina positiva después de una hora, la reacción de copulación se continúa durante una hora adicional. Si la prueba de ninhidrina positiva persiste después de 3 horas, la resina se drena, se lava una vez en aproximadamente 10 volúmenes de NMP, y la reacción de copulación se repite utilizando 0.5-1 equivalente de aminoácido activado. Si la resina se va a almacenar durante la noche entre ciclos de copulación, el lecho de resina se puede drenar y cubrir con NMP bajo un manto de nitrógeno. Alternativamente, el lecho se puede drenar, almacenar bajo un manto de nitrógeno, luego acondicionarse con un lavado de DCM antes de proseguir con el siguiente ciclo de copulación. Si el fragmento completado se va a almacenar durante la noche antes de la lixiviación, el lecho de resina se debe lavar a quedar libre de NMP con IPA debido a que desprotección de Fmoc significativa puede ocurrir en NMP. Después de que la copulación se juzga completa, la resina se drena y se lava con 3 alícuotas (aproximadamente 10 vol.) de NMP. El ciclo se repite durante veces subsecuentes (es decir, aminoácidos) del fragmento de póptido. Siguiendo la reacción de copulación final, la resina se lava con 4 alícuotas (aproximadamente 10 vol.) de NMP, luego con 2 alícuotas (aproximadamente 10 vol.) de DCM y 2 de IPA , El póptido ligado a resina se puede secar con una purga de nitrógeno o en un horno . Los póptidos sintetizados a través de técnicas de síntesis de fase sólida se pueden lixiviar y aislar de conformidad con, por ejemplo, las siguientes técnicas no limitativas; El péptido se puede lixiviar de la resina usando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el ramo. Por ejemplo, soluciones de 1% o 2% de ácido tri fluoracótico (TFA) en DCM o una combinación de una solución de 1% y una de 2% de TFA en DCM se puede usar para lixiviar el péptido. El ácido acético (HOAC), ácido clorhídrico (HCl) o ácido fórmico también se pueden usar para lixiviar el póptido. El reactivo de lixiviación específico, solventes y tiempo requerido para lixiviación dependerán del póptido particular que se está lixiviando. Después de la lixiviación, las fracciones de lixiviación se someten a procedimientos de trabajo convencionales para aislar el póptido. De manera típica, las fracciones de lixiviación combinadas se concentran bajo vacío, seguido por reconstitución con aprótico polar o solventes aprótico polares tales como etanol (EtOH), metanol MeOH), alcohol de isopropilo (IPA), acetona, acetonitrilo (ACN), dimetilformamida (DMF), NMD, DMAC, DCM, etc., seguido por precipitación o cristalización con antisolvente tal como agua o hexanos, y recolección mediante filtración al vacío. Alternativamente, el producto se puede triturar con solventes orgánicos o agua después del aislamiento del póptido. Los Ejemplos presentados en las Secciones 7.1 -7.6 más adelante, presentan síntesis de fase sólida de intermediarios de póptido como se muestran en los Cuadros 1 , 2 y/o 3. Para síntesis de póptidos T-1249 de longitud completa, los intermediarios de póptido de L Cuadro 1, anterior, se pueden copular juntos para proporcionar el péptido T-1249. Por ejemplo, los grupos de intermediarios de péptido enumerados en ei Cuadro 2, anterior, se pueden copular juntos para producir póptido T-1249 de longitud completa. Los ejemplos representativos de la síntesis de T-1249 de longitud completa de fragmentos de póptido intermediario se presentan en la Sección 9, más adelante, y se ilustran esquemáticamente en la Figura 1. En ciertas modalidades, se puede seguir un acercamiento de tres fragmentos para síntesis de T-1249. Una síntesis de "acercamiento de tres fragmentos" se refiere a un esquema de síntesis de T-1249 que empieza con tres fragmentos de póptido intermediario de T-1249 que se sintetizan y copulan utilizando técnicas d? síntesis de fase sólida y líquida hacia un péptido T-1249 de longitud completa. Los grupos 1, 2, 3 y 4 de fragmento de péptido intermediario mostrados en el Cuadro 2, anterior, representan grupos preferidos. La Figura 1 ilustra un acercamiento de tres fragmentos de ejemplo que utiliza el Grupo 1 de intermediario de póptido del Cuadro 2 para sintetizar T-1249 de longitud completa. Para este grupo, se observa que el residuo de aminoácido 39 (el residuo de aminoácido T-1249 carboxi 1-terminal) se introduce individualmente durante el proceso de copulación de fragmento. La culminación del esquema de síntesis de T-1249 mostrado en la Figura 1 se muestra en el ejemplo presentado en la Sección 9,1. Las técnicas de síntesis de póptido de fase en solución bien conocidos por aquellos de experiencia en el ramo se pueden utilizar para síntesis de los fragmentos intermediarios de póptido de la invención. Los Ejemplos presentados en la Sección 8 describen síntesis de póptido de fase en solución de ejemplo de intermediarios de péptido enumerados en los Cuadros 1, 2 y/o 3. Por ejemplo, entre el empaque de columna cargada con no sílice que exhibe una amplia escala de pH que incluye valores de estabilidad de pH a pH elevado o bajo se venden por Tssohaas (Mon gomeryvi He , . PA) , 6. EJEMPLO: Síntesis de Resina. 6.1. Método de Ejemplo Preferido para Cargar Aminoácidos hacia Resina 2-CTC La resina de 2-clorotritilcloruro sensible al aire (Senn Chemicals, Lote A 3573. 1 eq, 12,0 mmol, 10.0 g) se añade a un matraz de fondo redondo de 250 mL y se trata inmediatamente con una solución preparada de FmocLeuOH (1,0 eq , , 12 mmol, 4 . 24 g) y Diisopropiletilamina (5 eq . , 60.0 mmol, 5,20 mL ) en DCM (10 vol, lOOmL), La suspensión de tapa y agita durante 3 horas. El solvente se elimina mediante filtración y la resina se lava con DCM (5 vol, 50 mL ) , Los sitios activos restantes en la resina se tapan en extremo tratando resina con 9:1 MeOH: DIEA (5 vol, 5.0 mL DIEA y 45 L MeOH) durante 30 minutos. El solvente se elimina y la resina se lava con 3 x 5 volúmenes de DCM. La resina se seca a peso constante proporcionando 13.2 g de resina cargada con una carga calculada a 0.98 mmol de FmocLeuOH por gramo. Este Método también se puede utilizar para Cargar FmocTrp (Box)OH en resina 2-CTC. Descritos en la presente, en las Secciones 6.2-6,3 , se encuentran ejemplos en los que resinas de cloruro de clorotritilo se substituyeron con aminoácidos que se pueden utilizar en conjunción con síntesis de fase sólida de los póptidos e intermediarios de péptido descritos en la presente. Todos los péptidos y fragmentos de páptido de la presente invención se pueden sintetizar mediante síntesis de póptido de fase sólida (SPPS) usando los procedimientos de carga descritos en las Secciones 6.2 y 6.3 más adelante. 6.2 Preparación de Resina de Fmoc-Trp (Boc) -2-Clorotriti- lo Materiales; PM eq mmoles gramos mL Resina de Cloruro de 2-clorotritilo 1.0 25 25 Fmoc-Trp (Boc) -OH 526 ,60 1.5 37.5 19.7 Diisopropiletil 129.25 1.7 42.5 5.5 7, 4 amina (DIEA) Dicloroetano (DCE) 250 Diclorometano (DCM) 6X 250 9:1 Metanol :DIEA 200 Procedimiento : La resina de cloruro de 2-clorotrit lo (25 g, 1 eq . ) se cargó a una cámara de péptido de 500 mL y se lavó con 250 mL de DCM, El lecho se drenó y una solución del Fmoc-Trp (Boc) -OH (1.5 eq) y el DIEA (1.7 eq) en 10 volúmenes de DCE se añadió. La mezcla se agitó con burbujeo de nitrógeno durante 2 horas. El lecho se drenó y lavó con 250 mL de DCM. Los sitios activos en la resina se taparon en extremo con 200 mL de una solución de 9:1 de MeOH:DIEA durante 20 minutos. El lecho se drenó, se lavó con 4 x 250 mL de DCM, y se secó con una purga de nitrógeno para proporcionar 34.3 g de resina cargada. Se realizó el análisis de HPLC cuantitativo mediante lixiviación del ácido Fmoc-amino de la resina y ensayo contra una norma. El ensayo de HPLC del material mostró una carga de la resina a 0.68 mmol/g. Columna: Phenomenox Júpiter C18; 300A, 5u Régimen de flujo. 1 mL/min Detección: UV a 260 nm Fase móvil: A: 0.1% TFA acuoso B: 0.1% de TFA en acetonitrilo 65% B ísocrático Tiempo de Retención: Aproximadamente 14 min. 6.3 Preparación de Resina de Fmoc-Leu-2-Corstritilo Materiales: PM eq mmoles gramos; mL Resina de cloruro de 2-clorotritilo — 1.0 250 250 FmocLeuOH 353.42 1.5 375 132.5 Diisopropiletil amina (DIEA) 129.25 1.7 425 55 75 Dicloroetano (DCE) — — — — 2000 Diclorometano (DCM) — — — — 6 X 1500 9:1 Metanol :DIEA — — — — 1500 Procedimiento : La resina se cargó a una cámara de póptido de 3 L y se lavó con 1.5 DCM. El lecho se drenó y se añadió una solución del FmocLeuOH (1.5 eq ) y el DIEA (1.7 eq ) en 8 volúmenes de DCE, La mezcla se agitó con burbujeo de nitrógeno durante 2 horas. El lecho se drenó y lavó con 1.5 L de DCM. Los sitios activos en la resina se taparon en extremo con 1.5 L de una solución de 9:1 de MeOH: DIEA durante 30 minutos. El lecho se drenó, se lavó con 4 x 1.5 L de DCM, y se secó con una purga de nitrógeno para proporcionar 345 g de resina cargada. Se realizó el análisis de HPLC cuantitativo lixiviando el Fmoc-aminoácido de la resina y ensayando contra una norma. El ensayo de HPLC del material mostró una carga de la resina a 0.72 mmol/g. Columna: Phenomenox Júpiter C18; 300A; 5 u Régimen de flujo: 1 mL/min Detección: UV a 260 nm Fase móvil: A: 0.1% TFA acuoso B: 0.1% TFA en acetonitrilo 75% B isocrático Tiempo de retención: Aproximadamente 8 min. 7. EJEMPLO: SÍNTESIS DE FASE SÓLIDA DE PÉPTIDOS Presentados a continuación, en las Secciones 7.1-7.6, se encuentran ejemplos de la síntesis de fase sólida de intermediarios de póptido como se enumeran en los Cuadros 1 , 2 , y/o 3. 7.1 Método Preferido para Síntesis de Póptido de Fase Sólida (SPPS); Procedimiento General Una cámara de SPPS se cargó con FmocLeu-resína (1 eq). La resina se acondiciona en 5% de piperidina DCM (7.5 vol) con una purga de nitrógeno durante 15-30 minutos, El solvente se drena y la resina se trata con 2 x 20% de piperidina en NMP (5 volúmenes) durante 30 minutos para eliminar el grupo protector Fmoc. Después del segundo tratamiento de 20% de pipepdina/NMP, la resina se lava con 5-7 x NMP (5 vol) a una prueba de cloranilo negativo. Entre tanto, el aminoácido subsecuente (1.5 eq), HOBT (1.5 eq ) y DIEA (1,5 eq) se combinan en 3:1 NMP/DCM (10 vol), y se deja disolver completamente a temperatura ambiente y se enfría a 0BC. Se añade HBTU, la solución se agita durante 10-15 minutos para disolver el sólido luego se añade a la resina. La suspensión se agita con movimiento bajo una atmósfera de nitrógeno durante 1-3 horas. La terminación de copulación se supervisa con una prueba de ninhidrina cualitativa. Si la reacción se incompleta después de 3 horas (la prueba de ninhidrina positiva persiste) el reactor se debe drenar y un reacoplamiento se debe realizar con una solución fresca de aminoácido activado (0.5 eq ) . Normalmente después de 30 min-1 hora de nueva copulación se obtiene una prueba de ninhidrina negativa. Este ciclo se repite para los aminoácidos restantes en el fragmento. A medida que el fragmento se forma, los volúmenes de solvente usados en las lavadas pueden necesitar aumentarse de 5 volúmenes. En el caso de AcAAl-120H el tapado de extremo con anhídrido Acético se llevó a cabo tratando de-Fmoced (HAAl-12-resina ) con piridina (5 eq . ) luego anhídrido acético (5 eq . ) en 3:1 NMP/DCM (10 vol). Siguiendo la copulación final, la resina se lava con 3 x 5-8 volúmenes de NMP luego 2 x 10 volúmenes de DCM y se seca a peso constante en un horno de vacío a 40aC. 7.2 Métodos Preferidos para Lixiviación del Póptido de Resina Los métodos abajo describen la lixiviación de péptido AcAAl-120H de la resina. Sin embargo, los mismos métodos se pueden utilizar para lixiviar otros fragmentos de péptido de la presente invención Método A: Uso de HOAc La resina (1 g, 0.370 mmol) se trató con mezcla de AcOH/MeOH/DCM (5:1:4, 20 vol, 20 mL ) con agitación de nitrógeno durante 1.5 h y la solución se transfirió a un matraz de fondo redondo, agitado, y tratado con agua (20 vol). La suspensión blanca resultante se concentró (rotavap, baño a 40BC) para eliminar el DCM y el producto se recogió mediante filtración. E secado a un peso constante proporciona 0.69 g (74%) de AcAAl-120H en 87A% de pureza. Un segundo tratamiento de la resina como se menciona arriba un 0,08 g (8,5%) adicional de AcAAl-120H de material menos puro (Área 83%) sugiriendo un tiempo de reacción deseado de ligeramente >1.5 horas.

Método B: Uso de TFA - 3< La resina (1 peso, 20 g) se lava con 1-6 x 1.7 volúmenes de 1% de TFA en DCM, 3-5 minutos cada una. Las lavadas de 1% de TFA/DCM se recogen en un matraz que contiene piridina (1:1 relación en volumen con el TFA en la lavada), Las lavadas que contienen producto se combinan (600 mL , 30 vol) y el DCM se elimina mediante destilación a un volumen de recipiente mínimo /-1/3 el volumen original). El vacio se ajusta para mantener una temperatura de recipiente de 15-25aC. Se añade etanol (6.5 vol) y la destilación se continúa hasta que el DCM se remueve (como se determina mediante un aumento en la temperatura del destilado). Nuevamente, el vacío se ajusta para mantener una temperatura de recipiente de 15-202C, El volumen de recipiente final debe ser -8-9 volúmenes. La solución se enfría a 5-10sC y se añade agua (6.5 vol) durante 30 minutos para precipitar el AcAAl-120H. El sólido se recoge mediante filtración al vacío y las lavadas con agua (2-3 vol). La suspensión se agita a 0-5sC durante 30 minutos, los sólidos se recogen mediante filtración al vacío y se secan a peso constante para proporcionar 16.80 g de AcAAl-120H en rendimiento de 90% y % de área de 84 pureza (A%) . 7.3 Método Preferido para Trabajar Nuevamente AcAAl-120H Se calienta AcAAl-120H (257-21-1, 3.00 g) en 70 mL de metanol (23,3 volúmenes) a 65aC con agitación durante 3 horas. Se enfría a temperatura ambiente y se agita durante la noche. La filtración por succión y el secado a peso constante a horno de vacío (40aC) proporcionaron 2,43 g (81%) en 90A%. Condiciones de HPLC: Vydac C8 , cat No. 208TP54, 5 u, 300 A, 0.9 mL/min, 280 nm . A: 0.1% TFA / agua, B; Una mezcla de 80% de I-PrOH/20% de Acetonitrilo y 0,1% de TFA. 60-80% B / 30 min, Preparación típica de muestra. Se disuelve 1 mg en 0.10 mL de NMP, se diluye con 1 mL de Acetonitrilo. Se inyecta 20 uL hacia un lazo de 20 uL . 7.4 SPPS de FmocAA13-260H y Lixiviación de la Resina SPPS de Fmoc.A13-26 se llevó a cabo como se describe arriba empezando con 6.5 g de FmocLeuResina cargada a 1.02 mmol/g. El método de lixiviación A o B es aceptable (169/137. rendimiento 60%, 85A%) . 7.5 Procedimiento de Nuevo Trabajo Preferido para FmocAA13-260H FmocAA13-260H (3.60 g, 85A%) se calentó en 15 mL (5 vol) de acetonitrilo a 78SC, La suspensión se trató con solvente adicional hasta que los sólidos se disolvieron (total 0.6 mL ) . La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y se agitó 7 h. La filtración por succión y secado a un peso constante proporcionaron 2,6 g (72%) de FmocAA13-260H en 95 A% . Condiciones de HPLC: Vydac C8 , cat. No. 208TP54, 5 u, 300 A, 0,9 L / min,, 280 nm . A: 0,1% de TFA / agua, B: Una mezcla de 80% I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0.1% de TFA. 60-80% B / 30 min. Preparación de muestra típica: Di,solver 1 mg en O.lOmL de NMP. diluir con 1 mL de Acetonitrilo, Inyectar 20 uL en un lazo de 20 uL 7.6 SPPS de FmocAA27-380H y Lixiviación de la Resina SPPS de FmocAA27-380H se llevó a cabo como se describe arriba empezando con 10 g de FmocTrp (Boc )OR cargado a 0.75. mmol/g. El método B de lixiviación se utilizó (169/120/1, 78% de rendimiento, 87.9A%). Condiciones de HPLC- Vydac C8 , cat, No. 208TP54, 5 u, 300 A, 0,9 mL /min., 280 nm . A: 0 , 1% de TFA / agua, B: Una mezcla de 80% de I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0.1% de TFA. 60-80% de B / 30 min. Preparación de muestra típica: Disolver 1 mg en 0.10 mL de NMP, diluir con 1 mL de Acetomtrilo, Inyectar 20 uL hacia un lazo de 20 uL , EJEMPLO: SÍNTESIS DE FASE EN SOLUCIÓN DE FRAGMENTOS DE PÉPTIDO A continuación se presentan, en las Secciones 8.1 - 8.4, ejemplos de la síntesis de fase en solución de intermediarios de póptido como se enumeran en los Cuadros 1 , 2 y/o 3. 8.1 Preparación de Fragmento Fmoc-AA27-39-NH2 mediante Copulación de Fase de Solución de HPheNH2 a Fmoc- AA27-380H FmocAA27-39NH2 se puede preparar convirtiendo el término carboxilo de FmocAA27-380H a un HOBT activado o éster de HOAT utilizando HBTU o TBTU y HOBT o HOAT, respectivamente, en presencia de DIEA y amida de fenilalanina . La reacción se lleva a cabo en un solvente aprótico polar tal como DMF o NMP a 0 a 25C. A la terminación de la reacción, se añaden alcohol o un solvente miscible en agua y/o agua para precipitar FmocAA27-39NH2.

Ejemplo ; FmocAA27-380H (169-120-1, 5.40 g, 1.98 mmol, 1.00 eq), HPheNH- (Bachem, 0,390 g, 2.38 mmol, 1,20 eq , = , HOBT H20 (0.330 g, 2,16 mmol, 1,10 eq) se disolvieron en NMP (54 mL, 10 vol), se trataron con DIEA (0.16 mL , 0,921 mmol, 1.10) y se agitaron a temperatura ambiente hasta que se disolvieron ( ca 30 min). La solución se enfrió utilizando un baño de hielo (interno T=2-3 QC) y HBTU (0.827 g, 2.18 miriol, 1.10 eq ) se añadió en una porción, se agitó 1 h, luego durante la noche. La reacción se puede supervisar mediante TLC (uv, 10% MeOH/DCM, SM mid Rf , producto anterior). La adición de metanol (54 mL , 10 vol) luego agua (54 mL , 10 vol) a gotas durante un período de 1 h formó un sólido que fluye libremente que se agitó 2 horas adicionales luego se recogió mediante filtración. La torta de filtro se lavó con l'l agua/metanol (2 x 25 mL ) . Se secó durante la noche en horno de vacío a 40aC proporcionando 5.30 g (93%) de FmocAA27-39NH2 en 81A%. El análisis de HPLC también mostró que < 0.2% de material de partida FmocAA27-380H estuvo presente. ES pos = 2871 (MH+), ES neg = 2869 (M-l), Promedio PM= 2870, Condiciones de HPLC: Vydac C8 , cat. No. 208TP54, 5 u, 300 A, 0.9 mL / min . , 280 nm. A: 0.1% TFA / agua, B: una mezcla de 80% de I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0,1% de TFA, 60-80% B / 30 min. Preparación de muestra típica: Disolver 1 mg en 0.10 mL de NMP, diluir con 1 mL de Acetonitrilo. Inyectar 20 uL en un lazo de 20 uL , 8.2 Preparación de Fragmento HA, 27-39NH2 mediante Remoción de Grupo FMOC El grupo protector Fmoc de Fmoc AA27-39NH2 se remueve utilizando una base tal como píperidina o carbonato de potasio en solventes orgánicos tales como DCM, DMF, NMP, éter de metilo t-butilo (MTBE), hexano, o mezclas de los mismos.

Ejemplo , FmocAA27-390H (257-25-1, 4.00 g, 1.39 mmol) se formó en suspensión en 40 mL (10 vol) de MTBE y 10 mL (2.5 vol) de heptano luego se trato con piperidina (0.75 mL, 8.34 mmol, 5.5 eq ) . La suspensión se agitó 12 horas en cuyo punto 0,5% de material de partida permaneció (HPLC) y 20 mL (5 vol) de heptano se añadieron. La suspensión que fluye libremente se agitó 1 hora, luego se aisló mediante filtración por succión y se lavó 3 x 7 mL (2 vol cada lavada) con 1:1 MTBE / Heptano y se secó en un horno de vacío a 40eC hasta un peso constante que proporciona 3 55 g (96%) de 257-40-1 en 83Á% de pureza.

Condiciones de HPLC: Vydac C8 , Cat. No, 208TP54, 5 u, 300 A, 0 , 9 mL / min., 280 nm . A: 0,1% de TFA / agua, B: Una mezcla de 80% de I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0.1% de TFA 60-80% B / 30 min. Preparación de muestra típica: Disolver 1 mg en 0 10 mL de NMP, diluir con 1 L de Acetoni tplo . Inyectar 20 uL en un lazo de 20 uL , 8.3 Preparación de Fragmento Fmoc-AA13-39-NH2 mediante Copulación en Fase en Solución de Fragmentos Fmoc-AA13-260H y H1127-39NH. FmocAj 13-39NH2 se prepara convírtiendo el término carboxilo de FmocAA13-26QH a un HOBT activado o áster de HOAT utilizando HBTU o TBTU y HCBT o HOAT, respectivamente, en presencia de DIEA y HAA27-39NH.. La reacción se efectúa en un solvente aprótico. polar tal como DMF o NMP a 0 a 25C, A la terminación de la reacción, se añaden alcohol o un solvente iscible en agua y/o agua para precipitar FmocAA13-39NH2.

Ejemplo : FmocAA13-260H (257-41-1, 3.00 g, 0.8417 mmol, 1 eq), HAA27-39NH; (2.23 g, 0,8417 mmol, 1 eq), hidrato de HOBT (0.135 g. 0.884 mmol, 1.05 eq ) se disolvieron en DMF (25 mL, 30 min,(, se enfriaron con un baño de hiero y se trataron con DIEA (0.23 mL, 1.33 mml, 1,50 eq) luego HBTU (0.335 g, 0.884 mmol, 1,05 eq) y se agitaron, Después de 1 hora la reacción estuvo 90% completa basada en perdida de materiales de partida (HPLC) y se calentó a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se agregó HBTU adicional (0,150 g, 0.395 mmol, 0.5 eq ) , y la reacción se agitó durante la noche. Se añadió metanol (50 mL ) , luego agua (50 mL ) a gotas ocasionando formación de goma que se solidificó a una suspensión después de agitarse 16 horas a temperatura ambiente. El sólido se recogió mediante filtración, se lavó con 2 x 20 mL 1:1 MeOH: agua y se secó a peso constante proporcionado 5.18 g (99%) de FmocAA13-39NH2 en 60A% de pureza. El sólido 5A% cada uno de materiales de partida de ácido y amina.

Condiciones de HPLC: Vydac C8 , cat No. 208TP54, 5 u, 300 A, 0.9 mL / min., 280 nm. A: 0.1% de TFA / agua. B: Una mezcla de 80% de I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0,1% de TFA, 60-80% B / 30 min. Preparación de muestra típica: Disolver 1 mg en 0,10 mL de NMP , diluir con 1 mL de Acetonitrilo. Inyectar 20 uL en un lazo de 20 uL . 8.4 Preparación de Fragmento HAA13-39NH2 mediante Remoción de Grupo Fmoc El grupo protector FMOC de FmocAA13-39NH2 se remueve utilizando una base tal -como piperidina o carbonato de potasio en solventes orgánicos tales como DCM, DMF, NMP, MTBE . hexano o mezclas de los mismos.

Ej emplo ; FmocAA13-390H (257-43-1. 0.500 g. 0.0810 mmol, 1 eq ) se formó en suspensión en 9 mL (18 vol) de 2:1 MTBE / Heptano durante 30 minutos y luego se trató con piperidina (40 uL, 0.404 mmol, 5 eq). La suspensión se agitó 2 horas en cuyo punto 40% de material de partida permanecía (HPLC), MTBE adicional (3 mL , 6 vol) y piperidina (20 uL , 2,5 eq ) se añadieron y la suspensión se agitó hasta que <1% de material de partida permaneció (26 h). La suspensión de reacción se filtró por succión, se lavó con 2 x 5 mL de 1 : 1 de MTBE/heptano y se secó a un peso constante que proporciona 0.40 g (90%) en ca 60-70A%.

Condiciones de HPLC: Vydac C8 , cat. No. 208TP54, 5 u7, 300 A, 0.9 mL / min., 280 nm . A: 0.1% de TFA / agua, B: Una mezcla de 80% de I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0.1% de TFA, 60-80% B /30 min. Preparación de muestra típica: Disolver 1 mg en 0.10 mL de NMP, diluir con 1 mL de Acetonitrilo. Inyectar 20 uL en un lazo de 20 uL . 9. EJEMPLO: Síntesis de póptidos T-1249 de Longitud Completa Se presenta en la presente, en las Secciones 9.1 - 9.2 a continuación, ejemplos de la utilización de los fragmentos de intermediario de péptido para producir péptidos T-1249 de longitud completa. El Ejemplo presentado en esta Sección demuestra la copulación satisfactoria de técnicas de síntesis de fase sólida y fase de solución para producir un póptido T-1249 de longitud completa a partir de fragmentos de intermediario de póptido. 9.1 Preparación de Fragmento AcAAl-39NH2 mediante Copulación de Fase en Solución de AcAAl-120H con HAA13-39NH. La ruta de síntesis descrita aquí representa la culminación de los acercamientos de tres fragmentos de T-1249 ilustrados esquemáticamente en la Figura 1, Ac-AA1-39NH2 se puede preparar convirtiendo del término carboxilo de .cAAl-120H a un HCBT o éster de HOAT activado utilizando HBTU o TBTU y HOBT o HOAT, respectivamente, en presencia de DIEA y HAA13-39NH2. A la terminación de la reacción, se añaden alcohol o un solvente miscible en agua y/o agua para precipitar AcAAl-39NH2.

Ejemplo . HAA13-39 (257-32-2, 0.409 g, 0.0685 mmol, 1 ?q), AcAAl-120H (257-21-1, 0.174 g, 0,0685 mol , 1 eq ) e hidrato de HOBT (0.013 g, 0.0822 mmol, 1,20 eq) se solución se disolvieron en DMF (6.0 mL , 12 vol, 30 min). La enfrió con un baño de hielo y DIEA (18 uL, 0.1028 mmol, 1.5 eq) seguido por HBTU (0.031 g, 0.0822 mmol, 1.20 eq ) . Después de agitar 4 h a 0aC, se añadió agua (6 mL ) a gotas. La suspensión resultante se agitó 1 h, luego se aisló mediante filtración por succión. Secando durante la noche en un horno de vacio a 402C proporcionó 0.545 g ( 94% ) de 257-33-1 en ca . 50A%.

Condiciones de HPLC: Vydac C8 , cat. No. 203TP54, 5 u, 300 A, 0.9 mL / min., 280 nm. A: 0.1% de TFA / agua, B: Una mezcla de 80% de I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0.1% de TFA. 60-80% B / 30 min. Preparación de muestra típica: Disolver 1 mg en 0.10 mL de NMP, diluir con 1 mL de Acetonitrilo. Inyectar 20 uL hacia un lazo de 20 uL . 9.2 Preparación de Lado de T-1249 mediante Desprotección de cadena Lateral de AcAAl-39NH2 El ejemplo presentado en esta Sección demuestra la copulación satisfactoria de técnicas de síntesis de fase sólida y líquida para producir un póptido T-1249 de fragmentos intermediarios de póptido. En particular, la ruta de síntesis aquí descrita representa el paso de desprotección final del acercamiento de tres fragmentos de T-1249 mostrado en la Figura 1. De preferencia, los grupos protectores de cadena lateral de AcAAl-39NH2 se remueven mediante acidolisis utilizando 95/5 de ácido tri f luoracético,'agua y hasta 5% peso/volumen de un barredor de carbocación tal como ditiotreitol , etano ditiol o sistina. El T-1249 crudo se precipita de la solución de deeprotección mediante adición de un éter tal como MTBE, éter de dietilo o éter de diisopropilo.

Ejemplo ; AcAAl-39NH2 (257-33-1, 0.120 g) se trató con 1 5 mL de una solución recientemente preparada de TFA :DTT: agua (95:5:5) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Se añadió MTBE (aproximadamente 3 mL) y el precipitado recogido mediante filtración al vacío. El polvo fino se secó en el horno de vacío durante la noche. Este material se disolvió en 3 mL de 50% de Acetonitrilo / agua que contiene 1% de HOAc y se dejó reposar durante 15 horas para permitir la descarboxilación de la cadena lateral de indol de los triptofanos. La solución se analizó directamente y se encontró que se coeluye con T-1249 auténtico. La pureza aproximada fue de 60% mediante HPLC.

Condiciones de HPLC: Vydac C8 , cat. No. 203TP54, 5 u, 300 A, 0. mL / min., 280 nm . A: 0.1% de TFA / agua, B: Una mezcla de 80% de I-PrOH / 20% de Acetonitrilo y 0.1% de TFA. 60-80% B / 30 min. Preparación de muestra típica: Disolver 1 mg en 0.10 mL de NMP, di.uir con lmL de Acetonitrilo . Inyectar 20 uL en un lazo de 20 uL ,

Claims (1)

1. - 4: REIVINDICACIONES 1.- Un método para sintetizar un péptido de la fórmula : X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO:l), que comprende: (a) hacer reaccionar un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula: EQAQIQQIKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO : 6 ) , en donde el término amino está desprotegido, con un póptido protegido por cadena lateral de la fórmula; X-WQEWEQKITALL-COOH (SEQ ' ID NO:2). para proporcionar un póptido protegido de cadena lateral de la fórmula : X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO:l), en donde X es un grupo protector, un grupo acetilo o un grupo portador macromolecular; y en donde Z es un grupo protector, un grupo amido, o un grupo portador macromolecular. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde Z es un grupo protector seleccionado a partir del grupo que consiste en 9-f luoroenilmetoxi-carbonilo (Fmoc), t-butilo (t-Bu), tritilo (trt). t-butiloxicarbonilo (Boc). carbobenzoxilo , dansilo y un grupo de óster de para-nitrobencilo . 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde Z es un grupo protector seleccionado a partir del grupo que consiste en 9-fluoroenilmetoxi-carbonilo (Fmoc), t-butilo (t-Bu), tritilo (trt), t-butiloxicarbonilo (Boc), carbobenzoxilo , dansilo y un grupo de óster de para-nitrobencilo. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde X es un grupo portador macromolecular seleccionado a partir del grupo que consiste en conjugados de lípido-ácido graso, polietileno glicol y carbohidratos. 5,- El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde Z es un grupo portador macromolecular seleccionado a partir del grupo que consiste en conjugados de lípido-ácido graso, polietileno glicol y carbohidratos. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además desproteger las cadenas laterales del péptido protegido por cadena lateral de la fórmula: X-WQEWEQKITALLEQAQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO.l). 7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o 6. en donde X es un grupo acetilo. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde Z es un grupo amido. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o 6, en donde X es un grupo protector y en donde el método comprende además el paso de modificar X hacia un grupo acetilo, 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde Z es un grupo amido 11.- El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el péptido protegido por cadena lateral de la fórmula: X-WQEWEQKITALL-COOH (SEQ ID NO .2 ) se sintetiza mediante síntesis de péptido de fase sólida. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el póptido protegido por cadena lateral de la fórmula: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z ( SEQ ID NO : 6 ) se sintetiza mediante un método que comprende: hacer reaccionar un péptido protegido por cadena lateral de la fórmula: QKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO : 5 ) , en donde el término amino está desprotegido ; con un péptido protegido por cadena lateral de la fórmula: EQAQIQQEKNEYL-COOH (SEQ ID NO : 3 ) para proporcionar el póptido protegido por cadena lateral de la fórmula: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z ( SEQ ID NO : 6 ) . 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde el péptido protegido por cadena lateral de la fórmula: QKLDKWASLWEWF-Z ( SEQ ID NO , 5 ) se sintetiza mediante un método que comprende: hacer reaccionar un péptido protegido por cadena lateral de la fórmula l? QKLDKWASLWEW-COOH (SEQ ID NO : 4 ) con amida de fenilalanina para proporcionar el póptido protegido por cadena lateral de la fórmula. QKLDKWASLWEWF-Z ( SEQ ID NO 5 ) . 14.- El método de conformidad con la XD reivindicación 12. en donde el póptido protegido con cadena lateral de la fórmula: EQAQIQQEKNEYEL-COOH (SEQ ID NO: 3) ST sintetiza mediante síntesis de póptido de fase sólida. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el póptido protegido por cadena lateral de la fórmula. QKLDKWASLWEW-COOH ( SEQ ID NO : 4 ) se sintetiza mediante síntesis de péptido de fase sólida, 16,- Un juego de fragmentos de póptido que comprende un juego seleccionado a partir del grupo que consiste de: ( a ) WQEWEQKITALL ( SEQ ID NO : 2 ) , EQAQIQQEKNEYEL ( SEQ ID NO : 3 ) , QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO : 4 ) ; (b) WQEWEQKITALL (SEQ ID NO: 2), EQAQIQQEKNEYEL ( SEQ ID NO : 3 ) , QKLDKWASLWEWF ( SEQ ID NO : 5 ) ; ( c ) EQEWEQKITALL ( SEQ ID NO : 2 ) , EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO : 6 ) : (d) WQEWEQKITALL (SEQ ID NO : 2 ) . EQAQIQQEKENEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO : 8 ) ; (e) WQEWEQKITALLEOQAQIIQQEKNEYL (SEQ ID NO : 7 ) . QKLDKWASLWEW ( SEQ ID NO : ) ; y ( f ) WQEWEQKITALLEQAQI IQQEKNEYEL ( SEQ ID NO : 7 ) , XD QKLDKWASLWEWF ( SEQ ID NO : 5 ) . 17,- Un juego de fragmentos de péptido de conformidad con la reivindicación 16, en donde una o más de las cadenas laterales de los fragmentos de póptido se protege con un grupo protector. 18.- Un juego de fragmentos de péptido de conformidad con la reivindicación 17, en donde el grupo protector se selecciona a partir del grupo que consiste en 9-f luoroenilmetoxi-carbonilo (Fmoc), t-butílo carbobenzoxilo . dansilo y un grupo de óster de ¿D para-nitrobencilo . 19.- El juego de fragmentos de póptido de conformidad con la reivindicación 16, en donde el juego comprende : WQEWEQKITALL (SEQ ID NO : 2 ) , EQAQIQQEKNEYEL ( SEQ ID NO : 3 ) , y QKLDKWASLWEW ( SEQ ID NO . ) . 20.- El juego de fragmentos de póptido de conformidad con la reivindicación 16, en donde el juego comprende : WQEWEQKITALL (SEQ ID NO . 2), EQAQIQQEKHEYEL (SEQ ID NO . 3 ) . y QKLDKWASLWEWF ( SEQ ID NO 5 ) . 21.- El juego de fragmentos de póptido de conformidad con la reivindicación 16, en donde el juego comprende : WQEWEQKITALL (SEQ ID NO : 2), y EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO: 6). 22.- El juego de fragmentos de póptido de conformidad con la reivindicación 16, en donde el juego comprende ; WQEWEQKITALL ( SEQ ID NO : 2 ) , y EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO : 8 ) . 23,- El juego de fragmentos de péptido de conformidad con la reivindicación 16, en donde el juego comprende: WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKHEYEL (SEQ ID NO : 7 ) , y QKLDKWASLWEW ( SEQ ID NO : ) . 24.- El juego de fragmentos de póptido de conformidad con la reivindicación 16, en donde el juego comprende : WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL (SEQ ID NO: 7), y QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO ; 5 ) . 25.- Un póptido seleccionado a partir del grupo que consiste en: WQEWEQKITALL (SEQ ID NO : 2 ) , EQAQIQQIKNEYEL (SEQ ID NO : 3 ) , QKLDKWASLWEW ( SEQ ID NO : 4 ) . QKLDKWASLWEWF ( SEQ ID NO : 5 ) , EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF ( SEQ ID NO : 6 ) . WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYL (SEQ ID NO ; 7 ) , y EQA IQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO : 8 ) . 26.- Un póptido de conformidad con la reivindicación 25, en donde una o más de las cadenas laterales del póptido están protegidas con un grupo protector , 27.- Un póptido de conformidad con la reivindicación 26, en donde el grupo protector se selecciona a partir del grupo que consiste en 9-f luoroenilmetoxi-carbonilo (Fmoc), t-butilo (t-Bu), tritilo (trt), t-butiloxicarbonilo (Boc), carbobenzoxilo , dansilo y un grupo de éster de para-nitrobencilo. 28.- El póptido de conformidad con la reivindicación 25, en donde el póptido es WQEWEQKITALL (SEQ ID NO: 2) 29,- El péptido de conformidad con la reivindicación 25, en donde el péptido es EQAQIQQ?KNEYL ( SEQ ID NO ; 3 ) 30.- El póptido de conformidad con la reivindicación 25, en donde el póptido es QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO : 4 ) , 31.- El póptido de conformidad con la reivindicación 25, en donde el péptido es QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO: 5) . 32.- El péptido de conformidad con la XD reivindicación 25, en donde el péptido es EQAQIQQEKNEYLQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO: 6). 33.- El póptido de conformidad con la reivindicación 25, en donde el péptido es WQEWEQKITÁLLEQAQIIQQEKNEYEL (SEQ ID NO : 7 ) , 34.- El póptido de conformidad con la reivindicación 25, en donde el péptido es EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW ( SEQ ID NO : 8 ) . ¿D