MXPA01010530A - Andamios de polimeros porosos para ingenieria de tejidos. - Google Patents

Abstract

Los andamios porosos biodegradables y biocompatibles se caracterizan por una fase de polimero sustancialmente continua que tiene una distribucion bimodal altamente interconectada de tamanos de poros abiertos con poros grandes redondeados de alrededor de 50 a aproximadamente 500 micras de diametro, y poros pequenos redondeados menores de 20 micras de diametro, en donde los poros pequenos estan alineados de manera ordenada y lineal dentro de las paredes de los poros grandes; tambien se describen metodos para preparar andamios de tejido polimerico.

Description

ANDAMIOS DE POLÍMEROS POROSOS PARA INGENIERÍA DE TEJIDOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a andamios de polímero porosos biodegradables útiles para ingeniería de tejidos y regeneración guiada en tejidos. En particular, la presente invención se refiere a andamios de polímero porosos biodegradables con una distribución bimodai de tamaño de poros abiertos que provee un alto grado de capacidad de interconexión, alta área de superficie interna y poros alineados a lo largo de las paredes de los poros más grandes. La presente invención se refiere además a métodos para preparar los andamios para obtener la distribución de poros ordenada y bimodal.

TÉCNICA ANTECEDENTE Los andamios de polímero degradables sintéticos se han propuesto como un nuevo medio para reconstruir y reparar tejidos. El andamio funciona como soporte físico y substrato adhesivo para células aisladas durante el cultivo in vitro y la implantación in vivo subsecuente. Los andamios se utilizan para liberar células hacia sitios deseados en el cuerpo para definir un espacio potencial para el tejido diseñado, y para guiar el procedimiento de desarrollo de tejidos. Se ha explorado el transplante de células en andamios para la regeneración de piel, nervio, hígado, páncreas, cartílago y tejido óseo usando varios materiales biológicos y sintéticos. En un procedimiento alternativo, se implantan andamios poliméricos degradables directamente en un paciente sin cultivar previamente las células in vitro. En este caso, es necesario diseñar el andamio inicialmente libre de células de tal forma que las células del tejido vivo circundante se puedan fijar al andamio y migrar en el mismo, formando tejido funcional en el interior del andamio. Se puede utilizar una variedad de polímeros biodegradables sintéticos para fabricar andamíos para ingeniería de tejidos. Los ácidos poli(glicólico) (PGA), poli(láctico) (PLA) y sus copolímeros, son los polímeros sintéticos que se usan más comúnmente en ingeniería de tejidos. Sin embargo, en principio, se puede usar cualquier polímero biodegradable que dé productos de degradación no tóxicos. La utilidad potencial de un polímero como un substrato para ingeniería de tejidos, depende principalmente de si se puede fabricar fácilmente en un andamio tridimensional. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de procesamiento para preparar andamios porosos con redes de poros altamente interconectadas, se ha vuelto un área de investigación importante. El vaciado de solvente es uno de los procedimientos que se usan más ampliamente para fabricar andamios de polímeros degradables (véase Mikos y otros, Polymer, 35, 1068-77 (1994); de Groot y otros, Colloid Polym. Sci., 268, 1073-81 (1991 ); Laurencin y otros, J. Biomed.. Mater. Res., 30, 133- 8 (1996)). La patente de E.U.A. No. 5,514,378 describe el procedimiento básico en el cual una solución de polímero se vierte sobre un lecho de cristales de sales. Los cristales de sales se disuelven subsecuentemente usando agua en un procedimiento de lixiviación. De Groot et al, describen una técnica de lixiviación modificada en la cual la adición de un cosolvente induce una separación de fases del sistema después de enfriamiento a través de demezclado de líquido-líquido. Aunque este mecanismo de separación lleva a la formación de poros redondos incluidos dentro de la matriz de polímero, la mayoría de los poros son de tamaño insuficiente para formar una red altamente interconectada entre los poros más grandes formados por lixiviación. Los métodos de procesamiento existentes producen andamios pobres con una baja capacidad de interconexión, especialmente cuando se usa un método de lixiviación básico, tal como el método descrito en la patente de E.U.A. No. 5,514,378. Las partículas, cuando se dispersan en una solución de polímero, son cubiertas totalmente por la solución, limitando la capacidad de interconexión de los poros dentro de los andamios. La patente de E.U.A. No. 5,686,091 describe un método en el cual se preparan andamios de polímero porosos biodegradables moldeando una solución de solvente del polímero bajo condiciones que permiten la descomposición espinodal, seguido de extinción de la solución de polímero en el molde y sublimación del solvente de la solución. Se describe una distribución de poros uniforme. Una distribución de poros bimodal aumentaría el grado de capacidad de interconexión de los poros creando canales adicionales entre los poros, aumentando de esta manera la porosidad total y el área de superficie. La patente de E.U.A. No. 5,723,508 describe un método en el cual se preparan andamios de polímero porosos biodegradables formando una emulsión del polímero, un primer solvente en el cual el polímero es soluble, y un segundo polímero que es inmiscible con el primer solvente, y entonces deshidratando por congelación la emulsión bajo condiciones que no separen la emulsión o saquen el polímero de la solución. Sin embargo, este procedimiento produce también una distribución de tamaño de poro más uniforme, en donde la mayoría de los poros varían de 9 a 35 mieras de diámetro. Existe la necesidad de andamios de polímero porosos biodegradables para ingeniería de tejidos que tengan una distribución de tamaño de poro bimodal, y que provean una red de poros altamente interconectada, así como también métodos mediante los cuales se puedan obtener dichos andamios. Con base en una razón fundamental científica más avanzada, andamios poliméricos con una distribución de tamaño de poro bimodal, pueden tener ventajas significativas. Los poros en la escala de tamaño de 50 a 500 mieras de diámetro proveen espacio suficientemente abierto para la formación de tejido funcional dentro del andamio, mientras que la presencia de un gran número de poros más pequeños que forman canales entre los poros más grandes, aumentaría el contacto entre las células, la difusión de nutrientes y oxígeno hacia las células, la remoción de desechos metabólicos de las células, y la configuración de superficie para guiar a las células. Este nuevo concepto de diseño para andamios poliméricos degradables, requiere la presencia de una distribución de tamaño de poro bimodal, en donde poros más grandes de 50 a 500 mieras de diámetro y poros más pequeños, crean canales entre los poros más grandes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta necesidad es cubierta por la presente invención. Se provee un procedimiento que permite la fabricación de andamios de polímero con arquitecturas novedosas para ingeniería de tejidos mediante una combinación de técnicas de lixiviación y de separación de fases. De conformidad con un aspecto de la presente invención, se provee un andamio poroso biodegradable y biocompatible que tiene una fase de polímero sustancialmente continua con una distribución bimodal altamente interconectada de tamaños de poros abiertos pequeños y grandes redondeados, en la cual los poros grandes tienen un diámetro entre alrededor de 50 y aproximadamente 500 mieras, y los poros pequeños tienen un diámetro menor de 20 mieras, en donde los poros pequeños están alineados en una forma ordenada y lineal dentro de las paredes de los poros grandes. La capacidad de interconexión de los poros se mejora ampliamente por la presencia de poros pequeños, los cuales forman canales entre los poros grandes. Esto da como resultado una porosidad mayor de alrededor de 90%, y una alta área de superficie de poros específica que excede 10 m2/g. La red de poros pequeños se crea en las paredes de los poros grandes, y está inesperadamente bien orientada en una disposición lineal. Esto provee configuración de superficie que guía el crecimiento de las células por todo el andamio. Esta arquitectura específica provee también grandes áreas de superficie y volumen interno que son ideales para la siembra de células, crecimiento de células, y la producción de matrices extracelulares. Además, la alta capacidad de interconexión de los poros permite la distribución de poros por todo el andamio, la transmisión de moléculas de señalización entre las células a través de los andamios, la difusión de nutrientes por toda la estructura, y la configuración de la superficie para guiar el crecimiento celular. El diámetro de los poros y la estructura de interconexión, son esenciales para la vascularización y el crecimiento tisular interior. La porosidad abierta de la estructura tridimensional aumenta al máximo la difusión, y permite el crecimiento vascular en el andamio implantado. En forma ideal, el polímero es completamente resorbido con el tiempo, dejando únicamente el tejido recién formado. Los andamios de polímero de la presente invención se preparan a partir de soluciones homogéneas de polímeros biodegradables en una mezcla de un primer solvente en el cual el polímero es soluble, y un segundo solvente en el cual el polímero es insoluble, pero el cual es miscible con el primer solvente. Las soluciones homogéneas se vacían sobre partículas solubles en agua que tienen entre alrededor de 50 y aproximadamente 500 mieras de diámetro, y entonces se separan sus fases mediante extinción a una baja temperatura y deshidratación por congelación, seguido de lixiviación. La distribución bimodal de los diámetros de poro resulta de los poros más grandes que se crean mediante lixiviación y los poros más pequeños que se crean mediante cristalización después de la separación de fases del solvente en el cual el polímero es soluble. Por lo tanto, de conformidad con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para la preparación de andamios de polímero porosos biodegradables y biocompatibles en los cuales un polímero biocompatible se disuelve en una mezcla de solventes miscibles de un primer solvente en el cual el polímero es soluble, y un segundo solvente en el cual el polímero es insoluble, en donde la relación de primer solvente: segundo solvente está en la escala dentro de la cual el polímero se disuelve para formar una solución homogénea, y el primer solvente tiene un punto de fusión entre alrededor de -40 y aproximadamente 20°C. La solución homogénea se coloca entonces en una forma que contiene partículas no tóxicas solubles en agua que son insolubles en solventes orgánicos y tienen un diámetro entre alrededor de 50 y aproximadamente 500 mieras. La solución se extingue entonces a una velocidad efectiva para producir la cristalización del primer solvente antes del inicio del demezclado de líquido-líquido de la solución de polímero. Los solventes se subliman entonces de la fase de polímero, después de lo cual las partículas se remueven mediante lixiviación con un solvente en el cual las partículas son solubles y el polímero es insoluble. Se piensa que la microestructura lineal resulta de la cristalización del primer solvente en presencia del segundo solvente en la superficie de las partículas. Esto produce espumas de andamio altamente porosas que tienen una gran área de superficie y un gran volumen interno. Lo anterior y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención, serán más fácilmente evidentes a partir de la descripción detallada de las modalidades preferidas descritas más adelante, tomadas en conjunto con el dibujo acompañante.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO La figura 1 es una micrografía de microscopía electrónica de barrido (SEM) de una espuma preparada mediante el método de la presente invención.

MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La presente invención utiliza separación de fases térmicamente inducida para fabricar andamios biodegradables altamente porosos con propiedades optimizadas para ingeniería de tejidos. Dependiendo de la termodinámica, la cinética y la velocidad de enfriamiento, la separación de fases ocurrirá mediante cristalización del solvente o demezclado de líquido-líquido. Esta invención utiliza solventes y condiciones de procesamiento bajo las cuales la cristalización del solvente predomina como el mecanismo de separación de fases para obtener un andamio de polímero poroso con una distribución de diámetros de poro bimodal que provee un alto grado de capacidad de interconexión de los poros y una arquitectura sumamente ordenada y lineal de poros pequeños dentro de las paredes de los poros más grandes. Para que la cristalización del solvente ocurra antes del demezclado de líquido-líquido, la selección de los solventes y las condiciones de procesamiento son críticas. Se utiliza una mezcla de dos solventes, uno en el cual el polímero sea soluble (referido en la presente para propósitos de claridad, como "primer solvente"), y uno en el cual el polímero sea ínsoluble (referido en la presente para propósitos de 'claridad, como el "segundo solvente"). El primer y segundo solventes deben ser miscibles, y deben formar mezclas en las cuales el polímero sea soluble, a pesar de su insolubilidad en el segundo solvente. Las cantidades de polímero, primer solvente y segundo solvente, se seleccionan para proveer una solución homogénea uniforme. El primer solvente debe tener un punto de fusión entre alrededor de -40 y aproximadamente 20°C. Dentro de esta escala, a una alta velocidad de enfriamiento, la cristalización es el mecanismo favorito de separación de fases. Se prefiere un punto de fusión entre alrededor de -20 y aproximadamente +20°C. Un solvente que satisface idealmente estos requisitos es 1 ,4-dioxano. Tiene un punto de fusión de 12°C y una baja energía de cristalización. Aunque sin ser limitado por alguna teoría en particular, se piensa que la cristalización es iniciada por el segundo solvente, el cual se piensa actúa como un agente de nucleación. Solventes en los cuales el polímero es insoluble que son adecuados para su uso como el segundo solvente, incluyen agua y alcoholes tales como, pero no limitados a, metanol, etanol, isopropanol, ter-butanol y 1 ,3-propanodiol. Es crítico que el polímero sea soluble en la mezcla de solventes. El par más preferido de primer y segundo solventes consiste de 1 ,4-dioxano y agua. Cuando la velocidad de enfriamiento es alta, se piensa que la cristalización de 1 ,4-dioxano se ve favorecida. Además, se piensa que la cristalización de 1 ,4-dioxano es iniciada por el agua, la cual se piensa actúa como un agente de nucleación para la cristalización. Los polímeros que se usan en andamios para ingeniería de tejidos deben ser biocompatibles y biodegradables además de funcionar como substratos adhesivos para las células, promoviendo el crecimiento celular y permitiendo la retención de la función de las células diferenciadas. Dichos materiales deben poseer características físicas que permitan grandes relaciones de superficie: volumen, resistencia mecánica y procesamiento fácil en formas complejas, tales como para sustitutos de hueso. El dispositivo polimérico resultante debe ser también bastante rígido para mantener la forma deseada bajo condiciones in vivo. Los polímeros que son adecuados para su uso en la presente invención son sustancialmente biodegradables, no tóxicos y fisiológicamente compatibles. El polímero se debe seleccionar por su biocompatibilidad al momento de hacer el implante, y los productos de su proceso de degradación deben ser biocompatibles. Otros parámetros que desempeñan una función importante, ¡ncluyen las propiedades mecánicas del material, especialmente su rigidez mecánica. Una rigidez relativamente alta es ventajosa, de modo que el andamio pueda soportar las fuerzas contráctiles ejercidas por las células que crecen dentro del mismo. También son importantes las propiedades térmicas, especialmente la temperatura de transición de vidrio, Tg, la cual debe ser bastante alta, de modo que la red de poros en el andamio no se aplaste después de la remoción del solvente. También es importante que la cinética de biodegradación del polímero iguale la velocidad del proceso de cicatrización. Ejemplos de polímeros adecuados incluyen ácidos a-hidroxicarboxílicos y copolímeros de los mismos, incluyendo PGA, PLA y copolímeros de los mismos; el copolímero de óxido de polietileno/tereftalato de polietileno descrito por Reed y otros, Trans. Am. Soc. Añil Intern. Organs, pág. 109 (1977); y los copolímeros de ácido láctico o glicólico, o combinaciones de los dos con cadenas flexibles terminadas en hidroxi, de preferencia poli(alquilenglicoles) de varios pesos moleculares, descritos por la patente de E.U.A. No. 4,826,945. Otros polímeros adecuados incluyen policaprolactonas, polihidroxibutiratos y copolímeros de poliésteres, policarbonatos, polianhídridos y poli(orto esteres) biodegradables y biocompatibles. Los polifosfoésteres basados en bisfenol-A, también se han sugerido para su uso en el diseño de andamios biodegradables. Dichos polímeros incluyen fenilfosfato de poli(bisfenol-A), etilfosfato de poli(bisfenol-A), etilfosfonato de poli(bisfenol-A), fenilfosfonato de poli(bisfenol-A), tereftalato poli[bis(2-etoxi)hidroxifosfónico], y copolímeros de poli(fosfoésteres) basados en bisfenol-A. Aunque estos polímeros se han sugerido en la patente de E.U.A. No. 5,686,091 , la citotoxicidad conocida del bisfenol-A los hace candidatos menos preferidos para implante. Por otra parte, otro sistema polimérico útil lo constituyen los copolímeros de óxido de polietileno/tereftalato de polietileno. Polímeros particularmente preferidos para la práctica de la presente invención, son los polímeros de compuestos de difenol derivados de tirosina. Métodos para preparar los monómeros de difenol derivados de tirosina se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,587,507 y 5,670,602, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. Los monómeros de difenol preferidos son esteres de des-aminotirosil-tirosina (DT). Estos monómeros tienen un grupo de ácido carboxílico libre que se puede usar para unir una cadena pendiente. Usualmente, se utilizan varias cadenas pendientes de éster de alquilo. Para los propósitos de la presente invención, el éster etílico es referido como DTE, el éster butílico como DTB, el éster hexílico como DTH, el éster octílico como DTO, el éster bencílico como DTBn, etc. Los compuestos de difenol derivados de tirosina se usan como materiales de partida monoméricos para policarbonatos, poliiminocarbonatos, poliarilatos, poliuretanos, poliéteres, y similares. Policarbonatos, poliiminocarbonatos, y métodos de preparación de los mismos, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,099,060 y 5,198,507, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. Polarilatos y métodos de preparación de los mismos, se describen en la patente de E.U.A. No. 5,216,115, cuya descripción se incorpora también en la presente como referencia. Copolímeros de bloque de policarbonatos y poliarilatos con óxidos de poli(alquileno), y métodos de preparación de los mismos, se describen en la patente de E.U.A. No. 5,658,995, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Copolímeros de éter de óxido de poli(alquileno) estrictamente alterno, y métodos de preparación de los mismos, se describen en la solicitud internacional No. PCT/US98/23737, presentada en noviembre 6, 1998, cuya descripción se incorpora también en la presente como referencia. Otros polímeros particularmente preferidos incluyen los policarbonatos, poliiminocarbonatos, poliarilatos, poliuretanos, éteres de óxido de poli(alquileno) estrictamente alterno, y copolímeros de bloque de óxido de poli(alquileno), polimerizados a partir de monómeros dihidroxi preparados a partir de a-, ß- y ?- hidroxiácidos y derivados de tirosina. La preparación de los monómeros dihidroxi y los métodos de polimerización de los mismos, se describen en la solicitud de patente internacional No. PCT/US98/036013, cuya descripción se incorpora también en la presente como referencia. Se pueden utilizar también policarbonatos, poliiminocarbonatos, poliarilatos, copolímeros de bloque de óxido de poli(alquileno) y poliéteres de los monómeros de difenol y dihidroxitirosina que contengan átomos de yodo, o que contengan cadenas pendientes de ácido carboxílico libre. Los polímeros que contienen yodo son radioopacos. Estos polímeros y métodos de preparación de los mismos, se describen en la solicitud de patente internacional No. PCT/US98/23777, presentada en noviembre 6, 1998. Polímeros que contienen cadenas pendientes de ácido carboxílico libre, y métodos de preparación de los mismos, se describen en la solicitud de patente de E.U.A. serie No. 09/56,050, presentada en abril 7, 1998. Las descripciones de ambas solicitudes se incorporan también en la presente como referencia. En el método para fabricar los andamios biodegradables para ingeniería de tejidos, el polímero se disuelve primero en la mezcla de solventes miscibles. La cantidad del segundo solvente debe ser aquella cantidad efectiva para inducir la separación de fases durante el enfriamiento, pero menor que la cantidad efectiva para inducir la separación de fases antes de iniciar el procedimiento. La relación de volumen del primer solvente: el volumen total del solvente, está de preferencia entre alrededor de 1 a aproximadamente 40% en v/v, y más preferiblemente entre alrededor de 5 y aproximadamente 15% en v/v. La concentración del polímero en la mezcla de solventes está de preferencia entre alrededor de 0.5 y aproximadamente 25% en peso, y más preferiblemente entre alrededor de 10 y aproximadamente 20% en peso. La concentración del polímero en el solvente se debe seleccionar para asegurar una difusión adecuada de la solución de polímero a través de las partículas para la formación de los poros grandes. Las partículas son esencialmente cualquier sustancia cristalina biocompatible no tóxica que sea rápidamente soluble en agua e insoluble en solventes orgánicos. Ejemplos de partículas adecuadas incluyen halogenuros de metal alcalino y de metal alcalino terreo biológicamente aceptables, fosfatos, sulfatos, y similares. También se pueden usar cristales de azúcares, así como también mícroesferas de polímeros solubles en agua, o proteínas tales como albúmina. El cloruro de sodio es una partícula particularmente preferida. Se deben seleccionar partículas que tengan el diámetro que se desee para los poros grandes de la distribución bimodal de tamaños de poro. Se prefieren partículas que tengan un diámetro de tamaño de partícula entre alrededor de 50 y aproximadamente 500 mieras, y se prefieren más los diámetros entre alrededor de 200 y aproximadamente 400 mieras. La solución de polímero y solvente se vierte sobre partículas tamizadas hasta el diámetro deseado entre alrededor de 50 y aproximadamente 500 mieras. Las partículas están en un molde apropiado, tal como un platillo. Después de la difusión de la solución de polímero a través de las partículas, los contenidos del platillo son rápidamente enfriados a una velocidad efectiva para inducir la cristalización del primer solvente antes del inicio del demezclado de líquido-líquido de la solución de polímero. Por ejemplo, el platillo se puede dejar caer en nitrógeno líquido o un líquido criogénico equivalente, y se puede mantener en el nitrógeno líquido para una extinción rápida y completa del sistema. El platillo se coloca entonces en un recipiente conectado a una bomba de vacío durante el tiempo necesario para la sublimación completa de los solventes. Este paso permite la remoción del solvente por sublimación de los materiales congelados, de modo que deja una estructura porosa. El sistema está aún congelado, y el polímero no se relaja durante la remoción del solvente. Por último, las partículas se lixivian con un solvente en el cual son solubles y en el cual el polímero es soluble, por ejemplo, el segundo solvente o, más preferiblemente agua, sin importar si se utiliza o no como el segundo solvente. El solvente de lixiviación se cambia varias veces para asegurar la remoción completa de las partículas. Los andamios resultantes se retiran del solvente de lixiviación, y se secan hasta peso constante. El método provee una distribución bimodal de tamaños de poro grandes y pequeños. Los poros grandes son las impresiones de las partículas sobre las cuales la solución de polímero se vierte. Como se describió anteriormente, los poros grandes tienen un diámetro de poro promedio entre alrededor de 50 y aproximadamente 500 mieras. Los poros pequeños se forman cuando la solución de polímero sufre separación de fases después del enfriamiento, y tienen un diámetro promedio menor de alrededor de 20 mieras. Métodos preferidos de conformidad con la presente invención proveen los poros pequeños que tienen un diámetro promedio menor de alrededor de 10 mieras. La forma de los poros más grandes se puede uniformar mediante la adición de agua a la solución de polímero si el agua no es el solvente. La porosidad de los andamios resultantes es mayor de alrededor de 90%. Los métodos preferidos de la presente invención proveen espumas de andamio que tienen una porosidad mayor de alrededor de 95%. Los andamios tienen un área de superficie de poro específica que excede 10 m2/g, y métodos preferidos dan como resultado la formación de áreas específicas de superficie de poro que exceden 20 m2/g. Los andamios se pueden modificar también adicionalmente después de su fabricación. Por ejemplo, los andamios pueden ser revestidos con sustancias bioactivas que funcionen como receptores o quimioatrayentes para una población deseada de células. El revestimiento se puede aplicar mediante absorción o unión química. Los andamios particularmente preferidos incorporan aditivos para liberación subsecuente en una forma controlada. El aditivo puede ser liberado por una bioerosión de la fase de polímero, o por difusión a partir de la fase de polímero. En forma alternativa, el aditivo puede migrar hacia la superficie del polímero de la estructura del andamio, en donde es activo. El polímero y el primer y segundo solventes pueden ser premezclados antes de que el aditivo sea disuelto en los mismos. En forma alternativa, el aditivo se puede disolver en el solvente en el cual sea más soluble, después de lo cual el primer y segundo solventes y el polímero se combinan. El aditivo se puede proveer en un vehículo, excipiente, estabilizador, etc. fisiológicamente aceptable, y se puede proveer en formulaciones de liberación sincronizada o de liberación sostenida. Los aditivos pueden incorporar también agentes para facilitar su liberación, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, factores de crecimiento, hormonas, u otras porciones de direccionamiento a los cuales los aditivos se acoplan. Vehículos farmacéuticos aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en el campo farmacéutico y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, Mac Publishing Co. (A. R. Gennaro edt. 1985). Dichos materiales son no tóxicos para en quienes se administran, a las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen diluyentes, solubilizadores, lubricantes, agentes de suspensión, materiales encapsulantes, solventes, espesantes, dispersantes, reguladores de pH tales como fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos, antioxidantes tales como ácido ascórbico, conservadores, péptidos de bajo peso molecular (menores de alrededor de 10 residuos) tales como poliarginina, proteínas tales como albúmina del suero, gelatina o inmunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tales como poli(vinilpirrolidinona), aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol, contraiones tales como sodio y/o agentes tensioactivos no ¡ónicos tales como Tween, Pluronics o PEG. El aditivo se puede unir covalentemente a polímeros que tengan grupos de ácido carboxílico libres pendientes. Se han descrito en la literatura procedimientos químicos detallados para la unión de varias porciones a grupos de ácido carboxílico libres unidos a polímeros. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,219,564 y 5,660,822; Nathan y otros, Bio. Cong. Chem., 4, 54-62 (1992) y Nathan, Macromolecules, 25, 4476 (1992). Las descripciones de ambas patentes y ambos artículos de revista se incorporan en la presente como referencia. Estas publicaciones describen procedimientos mediante los cuales polímeros que tienen grupos de ácido carboxílíco libres pendientes se hacen reaccionar con porciones que tienen grupos funcionales reactivos, o que se derivan para contener grupos funcionales activos, para formar un conjugado de polímeros. Se utilizan conjugados hidrolíticamente estables cuando el aditivo es activo en forma conjugada. Se utilizan conjugados hidrolizables cuando el aditivo es inactivo en forma conjugada.

Una cantidad de aditivo se incorpora en el andamio de polímero poroso que proveerá eficacia óptima al sujeto que necesita del tratamiento, típicamente un mamífero. La dosis y el método de administración variarán de un sujeto a otro, y dependerán de factores tales como el tipo de mamífero que está siendo tratado, su sexo, peso, dieta, medicación concurrente, condición clínica general, los compuestos particulares utilizados, el uso específico para el cual estos compuestos se utilizan, y otros factores que los expertos en la técnica reconocerán. Los andamios de polímero porosos se pueden utilizar in vivo como andamios en ingeniería de tejidos y en regeneración guiada en tejidos en mamíferos tales como primates, incluyendo humanos, ovejas, caballos, ganado vacuno, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in vitro. Las combinaciones de polímero-fármaco de esta invención se pueden preparar para almacenamiento bajo condiciones adecuadas para la preservación de la actividad de fármaco, así como también para mantener la integridad de los polímeros, y son típicamente adecuadas para almacenamiento a temperaturas ambiente y en refrigeración. Los andamios de polímero porosos que se usarán para ingeniería de tejidos y regeneración guiada en tejidos, deben ser también estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente mediante métodos convencionales tales como irradiación o tratamiento con gases o calor. Aditivos adecuados para su uso con la presente invención incluyen compuestos biológica o farmacéuticamente activos. Ejemplos de compuestos biológicamente activos ¡ncluyen mediadores de unión a células, tales como el péptido que contiene variaciones de las secuencias de unión a integrina "RGD" que se sabe afectan la unión celular, ligandos biológicamente activos, y sustancias que intensifican o excluyen variedades particulares de crecimiento celular o tisular interior. Dichas sustancias incluyen, por ejemplo, sustancias osteoinductoras tales como proteínas morfogénicas de hueso (BMP), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I y II), TGF-ß, y similares. Ejemplos de compuestos farmacéuticamente activos incluyen, por ejemplo, aciclovir, cefradina, malfalen, procaína, efedrina, adriomicina, daunomicina, plumbagina, atropina, quanina, digoxina, quinidina, péptidos biológicamente activos, clorina eß, cefalotina, prolina y análogos de prolina tales como cis-hidroxi-L-prolina, penicilina V, aspirina, ibuprofeno, esteroides, ácido nicotínico, ácido quimiodesoxicólico, clorambucil, y similares. Las dosificaciones terapéuticamente efectivas se pueden determinar mediante métodos in vitro o in vivo. Para cada aditivo particular, se pueden hacer determinaciones individuales para determinar la dosificación óptima requerida. La determinación de los niveles de dosificación efectivos, es decir, los niveles de dosificación necesarios para lograr el resultado deseado, estará dentro del ámbito del experto en la técnica. La velocidad de liberación de los aditivos se puede hacer también variar dentro de la aptitud de rutina en la técnica para determinar un perfil ventajoso, dependiendo de las condiciones terapéuticas que se van a tratar.

Una dosificación típica de aditivo podría variar de alrededor de 0.001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg, de preferencia de alrededor de 0.01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, y más preferiblemente de alrededor de 0.10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. Los aditivos se pueden usar solos o en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Los andamios de polímero porosos de la presente invención se caracterizan mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y porosimetría de mercurio. Ejemplos específicos se dan a continuación. Los andamios de polímero porosos se configuran en artículos para aplicaciones en ingeniería de . tejidos y regeneración guiada en tejidos, incluyendo cirugía reconstructiva. La estructura del andamio permite un crecimiento celular interior generoso, eliminando la necesidad de presiembra celular. Los andamios de polímero porosos se pueden moldear también para formar andamiajes externos para sustentar el cultivo de células in vitro para la creación de órganos de soporte externo. El andamio funciona simulando las matrices extracelulares (ECM) del cuerpo. El andamio funciona como un soporte físico y como un substrato adhesivo para células aisladas durante el cultivo in vitro e implante subsecuente. A medida que las poblaciones de células transplantadas crecen y las células funcionan normalmente, comienzan a secretar su propio soporte de ECM. El polímero del andamio se selecciona para degradarse conforme disminuye la necesidad de un soporte artificial.

En la reconstrucción de tejidos estructurales tales como cartílago y hueso, la forma del tejido es integral a la función, requiriendo el moldeo del andamio de polímero poroso en artículos de espesor y forma variables. Cualquier grieta, abertura o refinamiento deseado en la estructura tridimensional, se puede crear retirando porciones de la matriz con tijeras, un escalpelo, un haz de láser, o cualquier otro instrumento de corte. La aplicación de los andamios incluye la regeneración de tejidos tales como tejido nervioso, musculoesquelético, cartilaginoso, tendinoso, hepático, pancreático, ocular, integumentario, arteriovenoso, urinario, o cualquier otro tejido que forme órganos sólidos o huecos. El andamio se puede usar también en transplantes como una matriz de células disociadas tales como condrocitos o hepatocitos, para crear un tejido u órgano tridimensional. Cualquier tipo de célula se puede añadir al andamio para cultivo e implante posible, incluyendo células de los sistemas muscular y esquelético, tales como condrocitos, fibroblastos, células musculares y osteocitos, células de parénquima tales como hepatocitos, células pancreáticas (incluyendo células de los islotes), células de origen intestinal, y otras células tales como células nerviosas y células de la piel, obtenidas de donadores, de líneas de cultivo de células establecidas, o incluso antes o después de practicar ingeniería genética. También se pueden usar piezas de tejido, las cuales pueden proveer un número de diferentes tipos de células en la misma estructura.

Las células se obtienen de un donador adecuado, o del paciente en el cual van a ser implantadas, disociadas usando técnicas estándar, y sembradas sobre el andamio espumoso y en el mismo. El cultivo in vitro se puede llevar a cabo opcionalmente antes del implante. En forma alternativa, el andamio espumoso es implantado, se deja vascularizar, y entonces las células se inyectan en el mismo. Métodos y reactivos para el cultivo de células in vitro, y el implante de un andamio de tejidos, son conocidos por los expertos en la técnica.

APLICACIÓN INDUSTRIAL Los andamios de polímero porosos de la presente invención se pueden fabricar en artículos útiles para aplicaciones en ingeniería de tejidos y regeneración guiada en tejidos, incluyendo cirugía reconstructiva. Los andamios se pueden moldear también para formar andamiajes externos para sustentar el cultivo de células in vitro para la creación de órganos de soporte externos. Los andamios se pueden usar también en transplantes como una matriz para células disociadas. Los siguientes ejemplos no limitativos se describen a continuación para ilustrar ciertos aspectos de la invención. Todas las partes y los porcentajes son en peso, a menos que se indique otra cosa, y todas las temperaturas están en grados Celsius.

EJEMPLOS EJEMPLOS 1 A 6 Preparación de andamios a partir de diferentes polímeros Se prepararon andamios porosos a partir de los polímeros incluidos en el cuadro 1 : CUADRO 1 Peso molecular Concentración (daltons) de polímero g/l Policarbonato de DTE 206,000 60.6 Policarbonato de DTE 89,000 92.7 Policarbonato de DTE más 30% de 96,000 87.6 carbonato de DT Policarbonato de DTE más 5% de 88,000 74.5 carbonato de PEG 1 K Polisuccinato de DTB 108,000 90.7 Acido (poli-L-láctico) 93,000 91.5 EJEMPLO 1 Preparación de andamios de policarbonato de DTE Materiales Se preparó policarbonato de DTE (PM = 206,000) usando el método descrito en la patente de E.U.A. No. 5,099,060. Se adquirieron 1 ,4-dioxano (grado de ACS certificado) y cristales de cloruro de sodio (NaCI) de Fisher Scientific (Pittsburg, PA). Los cristales se tamizaron con cristales de prueba estándar de E.U.A. (ASTM-E11 , Tyler, Mentor, OH) con apertura de 212 µm (n¡ 70) y 425 µm (n¡ 40). El mercurio usado en el estudio de porosimetría fue triplemente destilado (Bethlehem Apparatus, Hellertown, PA).

Fabricación del andamio Se preparó el andamio mediante el siguiente método de procesamiento: Se disolvieron 0.2 g de policarbonato de DTE en la mezcla de 3 ml de 1 ,4-dioxano y 0.3 ml de agua bajo agitación magnética a temperatura ambiente. Después de la disolución del polímero, la solución clara se vertió en 7 g de sales de cloruro de sodio tamizadas (tamaño promedio: ~200 µm - -400 µm) en un platillo apropiado. Después de la difusión de la solución de polímero a través del lecho de sales, el platillo se sumergió en nitrógeno líquido y se mantuvo para una congelación completa del sistema. El platillo se colocó entonces en un recipiente conectado a una bomba de vacío durante el tiempo necesario para la sublimación completa del solvente, dejando una estructura porosa. El polímero no se relajó durante la remoción del solvente. Por último, la sal se lixivió en agua. El agua se cambió varias veces hasta que la prueba sensible a nitrato de plata no mostrara liberación alguna de iones cloruro en el agua. Los andamios resultantes se retiraron del agua y se secaron durante varios días hasta peso constante.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) Se llevó a cabo microscopía electrónica de barrido para evaluar la morfología de los andamios. Se prepararon muestras para SEM mediante criofractura de los andamios en nitrógeno líquido (-196°C). La criofractura se llevó a cabo en muestras húmedas. Los andamios se sometieron a una serie de presurización- despresurización para asegura el llenado de los poros con agua. Cuando dejaron de salir burbujas de los andamios, y las muestras se hundieron hasta el fondo del recipiente, se sumergieron en nitrógeno líquido. Entonces, las muestras se secaron completamente bajo vacío, y se montaron sobre trozos de metal usando tiras adhesivas. Se revistieron con plata usando un revestidor por chisporroteo Balzers SCD004 (BAL-TEC). La presión de gas se ajustó a 3-5.10-2 mbars, y la corriente fue de 30 mA durante un tiempo de revestimiento de 120 segundos. Para el examen, se usó un SEM Hitachi S450 a 15 kV.

Análisis de imágenes El tamaño de los poros de las imágenes digitales obtenidas con el SEM se analizó mediante el uso del programa NIH Image 1.6. El área del poro, perímetro, y el eje mayor y menor de la elipse, fueron los parámetros de imagen evaluados. Fue necesario el ajuste de las imágenes digitales antes de la evaluación de los poros. Para asegurar un ajuste equivalente para todas las imágenes, se escribió un macro Pascal de acuerdo con la escala de imagen usada para el tamaño de poro examinado.

Los poros enumerados se compararon con la imagen digital real para confirmar la ubicación de los mismos. Ciertos números de poros que no fueron adecuadamente representados, se excluyeron del análisis de datos estadísticos. Para cada andamio, se analizaron tres imágenes digitales diferentes a dos diferentes aumentos, bajo aumento (barra de escala de 200 µm), y alto aumento (barra de escala de 10 µm)), (n = 3).

Porosimetría de mercurio Los andamios secados eran muy blandos, y podían ser fácilmente deformados debido a la alta porosidad total y al módulo reducido del polímero. Además, los poros más grandes que se esperaba tuvieran un diámetro promedio de alrededor de 300 µm (impresiones finales de la sal), habrían sido subestimados mediante esta técnica. Por estas razones, los andamios se analizaron cuando la sal estaba aún dentro de la matriz de polímero. El volumen de poro y la distribución de tamaños de poro se determinaron registrando el volumen de intrusión de mercurio en los andamios a diferentes presiones con el porosímetro de mercurio modelo 9540 (Micrometrics, Norcross, GA). La presión de llenado se registró hasta 210.9 kg/cm2. Esta presión corresponde a la energía que se requiere para incluir el mercurio en los poros de 0.06 µm o más grandes. Los valores del diámetro de poro y de porosidad se refieren a poros cilindricos equivalentes con un diámetro menor de 310 µm.

Estos valores se determinaron a partir de la ecuación de Washburn: D = -(1/P) 4 ? cos f en donde D es el diámetro del poro en mieras; P es la presión aplicada (en kg/cm2); ? es la tensión superficial entre el mercurio y la superficie del andamio (dinas/cm); y f es el ángulo de contacto (grados). Los valores recomendados para la tensión superficial y los ángulos de contacto son: g = 485 dinas/cm f = 130° Los resultados se presentan como una curva del incremento de la intrusión de mercurio (ml/g) en función del diámetro de poro promedio calculado. Para cada andamio, se obtuvieron muestras por triplicado (n = 3).

Discusión de los resultados CUADRO II Resultados del análisis de imágenes de SEM para un andamio de policarbonato de DTE El andamio de policarbonato de DTE se caracteriza por una distribución bimodal de tamaños de poro abierto que resulta de diferentes procedimientos (figura 1 ). Los poros más grandes, con un diámetro de poro promedio entre 200 µm y 400 µm, son las impresiones de las sales sobre las cuales la solución se vierte. Los poros más pequeños con un tamaño promedio menor de 20 µm se forman cuando la solución de polímero sufre separación de fases después del enfriamiento. Los poros más pequeños aparecen en las paredes de los poros más grandes y en la fase del polímero entre los poros más grandes. La red de poros está altamente interconectada. Una observación interesante a partir de la porosimetría del mercurio, es que a través de ella, se observa que los poros más pequeños están altamente conectados entre sí. Incluso si los poros más grandes se llenan con las sales de NaCI para mediciones, parece ser posible llegar a la mayoría de los poros más pequeños cuando se aplican presiones más altas. Además, la capacidad de interconexión entre los poros más grandes mejora por la presencia de los poros más pequeños que forman canales entre los poros más grandes. La porosidad de los andamios resultantes es mayor de 90%. La red de los poros pequeños creada en las paredes de los poros más grandes, está asombrosamente bien orientada en una disposición lineal.

EJEMPLO 2 Preparación de andamios de policarbonato de DTE de bajo peso molecular Se preparó un andamio a partir de un policarbonato de DTE de peso molecular menor, para evaluar su área de superficie específica total y calcular su porosidad.

Materiales Se preparó el policarbonato de DTE (PM = 89,0000) como en el ejemplo 1.

Fabricación del andamio Se disolvieron 0.3 g del policarbonato de DTE de peso molecular menor en una solución de 1 ,4-dioxano y agua (91/9% en v/v). La solución se fabricó en un andamio como en el ejemplo 1.

Medición de BET: medición del área de superficie específica total Se midió el área de superficie específica usando la técnica de Brunauer-Emmet-Teller (BET) utilizando un Quantasorb (Quantachrome, Boynton Beach, FL). El aparato de BET determina el área de superficie específica total de la muestra calculando la cantidad de nitrógeno adsorbido sobre la superficie.

Cálculo de la porosidad Para andamios con tamaño de poro grande (como los que se usan en este estudio), la porosimetría de mercurio subestima la porosidad. Una determinación más precisa de la porosidad es posible midiendo el peso, altura y diámetro de cada muestra. Para estas mediciones, se puede calcular la densidad aparente del andamio (p*), y se puede determinar la porosidad (e) mediante la ecuación: e = 1 - P*/PPDTEC en donde PPDTEC es la densidad del polímero (1.2778).

Resultados El área de superficie total de los poros del andamio de policarbonato de DTE, fue de alrededor de 20 m2/g. Este valor es 10 veces mayor que el valor (obtenido mediante porosimetría de mercurio) reportado para andamios preparados asperjando soluciones de PLLA en naftaleno. Este valor está en la escala de los valores (16 a 99 m2/g) (obtenidos mediante porosimetría de mercurio) reportados para andamios preparados mediante una técnica de emulsión a partir de una solución de PLGA en cloruro de metileno, pero con un diámetro promedio menor de 50 µm. La porosidad calculada fue de 97%.

EJEMPLO 3 Preparación de andamios de policarbonato de DTE más 30% de DT En este ejemplo se usó la metodología ¡lustrada en el ejemplo 1 para preparar andamios a partir de un copolímero libre de ácido: policarbonato de DTE más 30% de DT.

Materiales Se preparó policarbonato de DTE más 30% de DT (PM = 96,0000) usando el método descrito en la solicitud de patente de E.U.A. serie No. 09/056,050 presentada en noviembre 7, 1997, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia.

Fabricación del andamio Se disolvieron 0.289 g de policarbonato de DTE más 30% de DT en 1 ,4-dioxano/agua (91/9% en v/v). La solución se fabricó en un andamio como en el ejemplo 1.

SEM, porosimetría de mercurio y análisis de imágenes Se comparó el andamio de policarbonato de DTE más 30% de DT con los andamios de policarbonato de DTE del ejemplo 1.

Resultados A partir del análisis de imágenes de SM y los resultados de la porosimetría de mercurio, se puede concluir que los andamios preparados a partir de policarbonato de DTE y policarbonato de DTE más 30% de DT presentan una distribución de tamaños de poro similar. No se observó diferencia significativa alguna entre los dos andamios. Desde el punto de vista de las técnicas usadas para caracterizar a los andamios, controlando la viscosidad de la solución de polímero, es posible preparar andamios con una distribución de tamaño de poro similar a partir de policarbonato de DTE y policarbonato de DTE más 30% de DT.

EJEMPLO 4 Preparación de andamios de policarbonato de DTE más 5% de PEG 1000 En este ejemplo, se usa la metodología ilustrada en el ejemplo 1 para preparar andamios a partir de un copolímero de PEG y policarbonato de DTE y policarbonato de DTE más 5% de PEG 1000.

Materiales Se preparó policarbonato de DTE más 5% de PEG 1000 (PM = 88,0000) usando el método descrito en la patente de E.U.A. No. 5,658,995.

Fabricación del andamio Se disolvieron 0.246 g de policarbonato de DTE más 5% de PEG 1000 en 3.3 ml de 1 ,4-dioxano/agua (91/9% en v/v). La solución se fabricó en un andamio como en el ejemplo 1.

SEM. porosimetría de mercurio y análisis de imágenes Se comparó el andamio de policarbonato de DTE más 5% de PEG 1000 con los andamios de policarbonato de DTE del ejemplo 1.

Resultados A partir del análisis de imágenes de SEM y los resultados de la porosimetría de mercurio, se puede concluir que los andamios preparados a partir de policarbonato de DTE y policarbonato de DTE más 5% de PEG 1000, presentan una distribución de tamaños de poro similar. No se observó diferencia significativa alguna entre los dos andamios. Desde el punto de vista de las técnicas usadas para caracterizar a los andamios, controlando la viscosidad de la solución de polímero, es posible preparar andamios con una distribución de tamaño de poro similar a partir de policarbonato de DTE y policarbonato de DTE más 5% de PEG 1000.

EJEMPLO 5 Preparación de andamios de polisuccinato de DTB En este ejemplo, se usa la metodología ilustrada en el ejemplo 1 para preparar andamios a partir de un poliarilato en lugar de un policarbonato. El polisuccinato de DTB se caracteriza por una Tg menor (65°C), comparativamente con el policarbonato de DTE (92°C) del ejemplo 1.

Materiales Se preparó polisuccinato de DTB (PM = 108,000) usando el método descrito en la patente de E.U.A. No. 5,216,115.

Fabricación del andamio Se disolvieron 0.3 g de polisuccinato de DTB en 3.3 ml de una solución de 1 ,4-dioxano y agua (91/9% en v/v). La solución se fabricó en un andamio como en el ejemplo 1.

SEM Se comparó el andamio de polisuccinato de DTB con el andamio de policarbonato de DTE del ejemplo 1.

Resultados A partir de la observación de SEM, el andamio de polisuccinato de DTB presenta las mismas características morfológicas del andamio de policarbonato de DTE del ejemplo 1 (véanse los resultados y la discusión del ejemplo 1).

EJEMPLO 6 Preparación de andamios de ácido poli L-iáctico (PLLA) En este ejemplo, se usa la metodología ilustrada en el ejemplo 1 para preparar andamios a partir de un PLLA en lugar de un policarbonato.

Fabricación del andamio Se disolvieron 0.3 g de PLLA (PM = 108,000) (Medisorb polymers, AIkermes, Inc., Cincinnati, OH) en 1 ,4-dioxano/agua (91/9% en v/v). La solución se fabricó en un andamio como en el ejemplo 1.

SEM Se comparó el andamio de PLLA con el andamio de policarbonato de DTE del ejemplo 1.

Resultados A partir de la observación de SEM, el andamio de PLLA presenta las mismas características morfológicas que el andamio de policarbonato de DTE del ejemplo 1 (véanse los resultados y la discusión del ejemplo 1 ).

EJEMPLO 7 Preparación de andamios a partir de soluciones con cantidades crecientes de aqua Se llevaron a cabo estudios usando el método de esta solicitud para optimizar la morfología de los andamios porosos mediante la adición de cantidades crecientes de agua en la solución de polímero.

Fabricación del andamio Se disolvieron 0.3 g del policarbonato de DTE del ejemplo 1 en 3.3 ml de 1 ,4-dioxano/agua (85/15% en v/v). La solución se fabricó en un andamio como en el ejemplo 1.

SEM Este andamio se comparó con el andamio preparado en el ejemplo 1.

Resultados El agua funciona como un agente de nucleación en el procedimiento de cristalización de 1 ,4-dioxano. El agua aumenta la densidad de nucleación en el paso inicial de la cristalización del solvente cuando la solución de polímero se extingue en el nitrógeno líquido. Puesto que la densidad de nucleación aumenta, el tamaño de los cristales resultantes es siempre más pequeño. Esto podría explicar la microestructura más fina que se observa entre los poros más grandes cuando la proporción de agua aumenta. La proporción en volumen de los poros muy pequeños (diámetro promedio menor de 5 µm) aumenta con la cantidad de agua en la solución. Se añade agua para favorecer la separación de fases de la solución de polímero bajo enfriamiento. Con cantidades crecientes de agua, la solubilidad del polímero en el solvente disminuye gradualmente. Cuando la solución se extingue, el demezclado de L-L de la solución de polímero se induce primero. Más núcleos se pueden formar y pueden crecer en la matriz de polímero antes de la congelación completa del sistema. De esta manera, muchos más poros redondos (que resultan del demezclado de L-L) están presentes en los andamios finales. La presencia de agua en la solución contribuye también a la disolución de las sales de NaCI en las cuales la solución se vierte. Se observa una evolución en la forma de los poros más grandes conforme aumenta la proporción de agua. Al parecer, las sales de NaCI han sido desgastadas por el procedimiento. Por esta razón, se observa un incremento significativo en la capacidad de interconexión entre los poros más grandes conforme el contenido de agua aumenta en la solución.

EJEMPLO 8 Crecimiento in vivo de células en los andamios Se evaluaron andamios altamente porosos en un modelo in vivo en animales. 32 conejos blancos machos de Nueva Zelanda esqueléticamente maduros, tenían andamios implantados bilateralmente en su cabeza ósea. Se prepararon andamios como en el ejemplo No. 2. Después de la preparación, los andamios fueron secados bajo vacío, sellados en bolsas de esterilización, y colocados entonces en un esterilizador ventilado automatizado Anprolene AN72C para esterilización mediante exposición a óxido de etileno. Después de la esterilización, se dejó que las muestras se equilibraran en aire ambiente durante por lo menos dos semanas para asegurar la remoción del óxido de etileno. Para cada cirugía, se preparó a los conejos usando técnica estéril completa. Se hicieron dos implantes por cada cirugía. Cada implante se colocó en uno de dos defectos de 8 mm de diámetro. Los andamios implantados tenían 8 mm de diámetro por 2 a 3 mm de espesor, que correspondía con las dimensiones de la cabeza ósea de los conejos. Los andamios no fueron presembrados con células. A 2, 4, 8 y 16 semanas, los andamios se cosecharon y se analizaron histológicamente. A la mitad del punto de tiempo (por ejemplo, 2 semanas para el punto de tiempo de 4 semanas), y antes de practicar la eutanasia, los conejos fueron inyectados con oxitetraciclina que marca el crecimiento óseo interior. Las muestras se deshidrataron en soluciones de agua/alcohol de etanol a 70%, 80%, 95% y 100%, se aclararon con un agente de aclaración histológico (Hemo-De from Fisher), y se fijaron entonces en una solución polimerizante de metacrilato de metilo (Fisher), de modo que la muestra quedara incluida en un bloque sólido de metacrilato de polimetilo. Las muestras se cortaron horizontalmente y verticalmente para dar una sección transversal horizontal y vertical. Las secciones se montaron, molieron y pulieron hasta capas de 1 a 3 células de espesor. Las muestras se observaron bajo luz ultravioleta y se analizaron para detectar el crecimiento interior. Las muestras se tiñeron entonces con azul de Stevenel y Picro-Fuschin de Van Geison. En dicha tinción, el hueso se tiñó de rojo, el tejido fibroso se tiñó de azul, y los cuerpos osteoides se tiñeron de verde. Para ambos colorantes, la muestra se fotografió para observación visual y análisis de imágenes. Se midió la profundidad del crecimiento óseo interior para reflejar el efecto de la arquitectura altamente porosa del andamio, y se comparó con un estudio previo. El estudio previo proveyó datos para andamios creados sin los poros de 1 a 10 mieras. Los primeros andamios se crearon del mismo polímero, pero se crearon usando un solvente diferente con una técnica de lixiviación sin un paso de enfriamiento rápido. En el punto de tiempo de 3 a 4 semanas, apareció una diferencia medible entre los dos tipos de esponja. Los andamios altamente porosos mostraron un nivel mayor de crecimiento óseo interior. Además, el alineamiento ordenado de los poros de 1 a 10 mieras produjo alineamiento celular. Se observó que las células se alinean en el patrón creado por los poros. Las células se mineralizaron también a lo largo del patrón. Los andamios altamente porosos fueron superiores a los andamios previos, porque fomentaron el crecimiento celular interior y guiaron la proliferación celular más allá de lo que se esperaría para los tipos de andamio previos.

EJEMPLO 9 Crecimiento in vivo de las células en los andamios: un estudio comparativo En un estudio de implante in vivo comparativo, usando el modelo del defecto de la cabeza ósea de conejos del ejemplo 8, se compararon dos arquitecturas de andamio diferentes en cuanto a su capacidad para sustentar el crecimiento de hueso nuevo en el andamio. Las dos arquitecturas de andamio fueron uniformes en tamaño de poro (200-500 mieras) contra una distribución de poros bimodal como se describe en esta invención. Aunque los andamios fueron idénticos en todos aspectos aparte de la distribución de los tamaños de poro, los andamios con distribuciones bimodales mostraron mayor cicatrización del hueso. Los ejemplos anteriores y la descripción de la modalidad preferida deben considerase como ilustrativos, más que como limitativos de la presente invención, según se define mediante las reivindicaciones. Como se apreciaría fácilmente, se pueden utilizar numerosas variaciones y combinaciones de las características expuestas anteriormente, sin apartarse de la presente invención como se describe en la reivindicaciones. Dichas variaciones no se consideran como un abandono del espíritu y el alcance de la invención, por lo que se pretende que dichas variaciones sean incluidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un andamio poroso biodegradable y biocompatible, caracterizado porque tiene una fase de polímero sustancialmente continua que tiene una distribución bimodal altamente interconectada de tamaños de poros abiertos que comprenden poros abiertos grandes redondeados de alrededor de 50 a aproximadamente 500 mieras de diámetro, y poros redondeados pequeños de tamaño menor de 20 mieras, en donde dichos poros pequeños están alineados en una forma ordenada y lineal dentro de las paredes de los poros grandes.

2.- El andamio de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además por una porosidad mayor de alrededor de 90%.

3.- El andamio de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además por un área de superficie de poro específica mayor de alrededor de 10 m2/g.

4.- El andamio de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polímero es insoluble en agua, pero soluble en un solvente miscible en agua.

5.- El andamio de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho polímero se selecciona del grupo que consiste de policarbonatos biocompatibles y biodegradables, poliarilatos, copolímeros de bloque de policarbonatos con óxidos de polialquileno, copolímeros de bloque de poliarilatos con óxidos de polialquileno, ácidos a-hidroxicarboxílicos, poli(caprolactonas), poli(hidroxibutiratos), polianhídridos, poli(ortoésteres), poliésteres y polifosfoésteres basados en bisfenol-A.

6.- El andamio de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polímero comprende una cantidad efectiva de una sustancia biológicamente activa que promueve o evita una variedad particular de crecimiento celular o tisular interior.

7.- El andamio de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polímero comprende una cantidad efectiva de un compuesto farmacéuticamente activo.

8.- El andamio de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho andamio comprende células seleccionadas del grupo que consiste de hepatocitos, células de los islotes pancreáticos, fibroblastos, condrocitos, osteoblastos, células exocrinas, células de origen intestinal, células del conducto biliar, células paratiroideas, células tiroideas, células del eje suprarrenal-hipotalámico-pituitario, células de músculo cardiaco, células epiteliales del riñon, células tubulares del riñon, células de la membrana basal del riñon, células nerviosas, células de vasos sanguíneos, células que forman hueso y cartílago, células del músculo liso, células del músculo esquelético, células oculares, células integumentarias, queratinocitos y células madre.

9.- El andamio de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dichas células son células de tejido cultivadas.

10.- Un método para regular la unión, migración y proliferación celular sobre un substrato polimérico, caracterizado por el paso de poner en contacto células vivas, tejidos o fluidos biológicos que contienen células vivas, con el andamio de conformidad con la reivindicación 1.

11.- Un método para la preparación de andamios de polímero porosos biodegradables y biocompatibles caracterizado por los pasos de: disolver de alrededor de 0.5 a aproximadamente 25% en peso de un polímero biocompatible en una mezcla de solventes miscibles de un primer, solvente en el cual dicho polímero es soluble, y un segundo solvente en el cual dicho polímero es insoluble, en donde la relación de dicho primer solvente: dicho segundo solvente, está en una escala dentro de la cual dicho polímero se disuelve para formar una solución homogénea, y el primer solvente tiene un punto de fusión entre alrededor de —40 y aproximadamente 20°C; colocar dicha solución de polímero en una forma que contenga partículas no tóxicas solubles en agua y también solubles en solventes orgánicos y que tienen un diámetro entre alrededor de 50 y aproximadamente 500 mieras; extinguir dicha solución a una velocidad efectiva para producir la cristalización de dicho primer solvente antes del inicio del demezclado de líquido-líquido de dicho primer y segundo solventes; sublimar dicho polímero para remover dicho primer y segundo solventes; lixiviar dicho polímero con un solvente en el cual dichas partículas sean solubles y dicho polímero sea insoluble para remover dichas partículas de dicho polímero; y secar dicho polímero.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la relación de dicho primer solvente: dicho volumen total de solvente, está entre alrededor de 1 % y aproximadamente 40% en v/v.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho primer solvente es 1 ,4-dioxano y dicho segundo solvente es agua.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho polímero se selecciona del grupo que consiste de policarbonatos biocompatibles y biodegradables, poliarilatos, copolímeros de bloque de policarbonatos con óxidos de polialquileno, copolímeros de bloque de poliarilatos con óxidos de polialquileno, ácidos -hidroxicarboxílicos, poli(caprolactonas), poli(hidroxibutiratos), polianhídridos, poli(ortoésteres), poliésteres y polifosfoésteres basados en bisfenol-A.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dichas partículas se seleccionan del grupo que consiste de halogenuros, fosfatos y sulfatos de metal alcalino y de metal alcalino terreo, cristales de azúcar, microesferas de polímeros solubles en agua y microesferas de proteína.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dichas partículas son cristales de cloruro de sodio.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho paso de extinción comprende sumergir dicha solución en nitrógeno líquido.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho polímero es lixiviado con agua.

19.- Un andamio de tejido polimérico preparado mediante el método de conformidad con la reivindicación 11.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho polímero comprende una cantidad efectiva de una sustancia biológicamente activa que promueve o evita una variedad particular de crecimiento celular o tisular interior.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho polímero comprende una cantidad efectiva de un compuesto farmacéuticamente activo.