MXPA01008913A - Vacuna multicomponente que comprende por lo menos tres antigenos para proteger contra la enfermedad producida por haemophilus influenzae. - Google Patents

Abstract

Se presenta una composicion inmunogenica multicomponente que confiere proteccion, a un hospedero inmunizado, contra la infeccion producida por Haemophilus influenzae. Esta composicion comprende por lo menos tres antigenos de Haemophilus influenzae diferentes, dos de los cuales son adhesinas. Los componentes de adhesina estan comprendidos de proteinas de alto peso molecular (HMW) y proteinas de adhesina de Haemophilus influenzae (Hia), de Haemophilus influenzae no tipificable, mientras que el otro antigeno es un analogo no proteolitico de la proteina Hin47. Ninguno de los componentes altera la inmunogenicidad de los otros. La vacuna de Haemophi1us influenzae puede combinarse con vacunas de componente DTP que pueden contener poliovirus inactivado, entre los que se incluyen el tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3, y/o un conjugado de un polisacarido capsular de Haemophi1us influenzae y toxoide tetanico o difterico, entre lo que se incluye PRP-T, para proporcionar una vacuna componente multivalente sin perjudicar las propiedades inmunogenicas de los otros antigenos.

Description

VACUNA MULTICOMPONENTE QUE COMPRENDE POR LO MENOS TRES ANTÍGENOS PARA PROTEGER CONTRA LA ENFERMEDAD PRODUCIDA POR HAEMOPHILUS INFLÜENZAE • CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la tecnología de vacunas y en especial con una vacuna multicomponente que comprende proteínas recombinantes de Haemophilus influenzae útiles para proteger contra la 10 enfermedad ocasionada por Haemophilus influenzae, que • incluye a la otitis media.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Haemophilus influenzae es la causa de varias enfermedades humanas graves, como la meningitis, epiglotitis, septicemia y otitis media. Existen seis serotipos de H. influenzae designados de la a a la f, que se identifican por su polisacárido capsular. El H. influenzae tipo b (Hib) fue la causa principal de meningitis bacteriana hasta la introducción de varias vacunas conjugadas Hib en la década de los 80 (ref.l. A lo largo de esta solicitud se mencionan varias referencias en paréntesis para describir en forma más completa el estado de la técnica a la que pertenece la invención. La información bibliográfica de cada cita se encuentra al Pl3 8 final de la especificación, inmediatamente antes de las reivindicaciones. Las exposiciones de estas referencias se incorporan a la presente, como referencia) . Las vacunas basadas en polisacárido capsular de H. influenzae tipo b conjugado con toxoide diftérico (ref.2), toxoide tetánico (ref.3 y Patente de los Estados Unidos 4,496,538) o la proteína de membrana externa de Neisseria meningi tidis (ref. ) han sido eficaces para reducir la meningitis inducida por H. influenzae tipo b. Los otros serotipos de H. influenzae están asociados con enfermedad invasiva en frecuencias bajas, aunque parece haber un aumento en la incidencia de enfermedad ocasionada por estas cepas a medida que la incidencia de la enfermedad de Hib disminuye (refs. 5, 6) . Los H. influenzae no encapsulados o no tipificables (NTHi) también son responsables de una amplia gama de enfermedades humanas incluidas la otitis media, epiglotitis, neumonía y traqueobronquitis . La incidencia de enfermedad inducida por NTHi no se ha modificado por la introducción de las vacunas Hib (ref. 7) . La otitis media es la enfermedad más común de la infancia, de 60 a 70% de los niños menores de 2 años padecen entre una y tres infecciones del oído (ref .8) . La otitis media crónica es responsable de daños auditivos, del lenguaje y cognitivos en niños. Las infecciones por H. influenzae son causa de aproximadamente 30% de los casos de otitis media aguda y de aproximadamente 60% de otitis crónica media. Sólo en los Estados Unidos, el tratamiento de la otitis media tiene costos entre 1 y 2 mil millones de • dólares por año en antibióticos y procedimientos 5 quirúrgicos, por ejemplo, amigdalectomías, adenoidectomías e inserción de tubos de timpanostomía . Se estima que se gastan $30 mil millones de dólares adicionales por año, en terapias adjuntas, por ejemplo, terapia del lenguaje y clases de educación especial. Además, muchos de los organismos causantes de la otitis media se están haciendo • resistentes al tratamiento con antibióticos. Así que es deseable que exista una vacuna profiláctica eficaz contra la otitis media. Durante la infección natural, las proteínas de membrana externa con superficie expuesta que estimulan una respuesta de anticuerpo son blancos potencialmente importantes para los anticuerpos bactericidas y/o protectores y, por lo tanto, candidatos a vacunas potenciales. Barenkamp y Bodor (ref.9) demostraron que los sueros de niños convalecientes que padecían de otitis media debida a NTHi, contenían anticuerpos para proteínas de alto peso molecular (HMW) . Aproximadamente de 70 a 75% de cepas de NTHi expresan las proteínas de HMW y la mayoría de estas cepas contienen dos grupos de genes denominados hmwlABC y hmw2ABC (refs. 10, 11). Se ha demostrado que las proteínas HMWA son adhesinas que median la unión a células epiteliales (ref.12). La inmunización con una mezcla de proteínas HMW1A y HMW2A nativas dio como resultado la protección parcial en el modelo de otitis media de estimulación intrabula en chinchilla (ref.13). La Patente de los Estados Unidos No. 5,603,938 (Barenkamp), cedida a la Universidad de St. Louis y a la Universidad de Washington, la cual se considera forma parte de la presente como referencia, describe la clonación, expresión y secuenciación de los genes que codifican las proteínas HMW1 y HMW2 provenientes de la cepa 12 de Haemophilus influenzae no tipificable. Las proteínas HMW son una familia de proteínas provenientes de Haemophilus influenzae no tipificable de peso molecular de aproximadamente entre 120 y 125 kDa, que están ausentes de las cepas encapsuladas de Haemophilus influenzae . La producción de proteínas HMW nativas provenientes de cepas H. influenzae es muy baja, se ha descrito un método para producir proteínas HMW recombinantes (rHMW) en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos copendiente No.09/167, 568 presentada el 7 de octubre de 1998 (WO 00/20609) , cedida a la cesionaria de la presente, la cual se considera forma parte de ésta como referencia. Se ha desarrollado un modelo de colonización nasofaríngea en chinchilla, específicamente para demostrar la eficacia de las adhesinas como vacunas (ref.14) y en este modelo las proteínas rHMW son protectoras según se describe en la anteriormente mencionada Solicitud de Patente copendiente de los Estados Unidos No. 09/167,568 (WO 00/20609) . Se demostró que las proteínas rHMWlA y rHMW2A logran niveles de protección equivalentes una con respecto a la otra y se seleccionó la proteína rHMWlA para estudios posteriores de vacunas. En esta solicitud, rHMW se refiere a la proteína HMW1A recombinante proveniente de la cepa NTHi 12, aunque se pueden emplear otras proteínas HMW1A recombinantes correspondiente proveniente de otras cepas de NHTi y las proteínas HMW2A correspondiente proveniente de otras cepas NHTi . También se pueden emplear las proteínas correspondientes que se encuentran en forma natural. Una segunda familia de proteínas de adhesión de alto peso molecular se ha identificado en aproximadamente 25% de NTHI y en cepas de H. influenzae encapsuladas (refs. 15, 16, 17) . El miembro NTHi de esta segunda familia se nombró adhesina de Haemophilus influenzae o Hia y la proteína homologa encontrada en cepas encapsuladas se nombró proteína de fibras superficiales de Haemophilus influenzae o Hsf . La patente de los Estados Unidos No. 5,646,259 (St. Geme, III et al.), cedida a la Universidad de St .

Louis y a la Universidad de Washington y cuya exposición se incorpora aquí como referencia, describe la clonación, expresión y secuencias de los genes que codifican las proteínas Hia y Hsf, que tienen homología limitada con las proteínas HMW1 y HMW2 de la Patente de los Estados Unidos 5,603,938. El gen hia se clonó originalmente de una biblioteca de expresión que utiliza sueros de convaleciente de un paciente con otitis media, lo que indica que es un inmunógeno importante durante la enfermedad. Las proteínas prototipo Hia y Hsf demuestran aproximadamente el 82% de similitud de secuencia, aunque la proteína Hsf es considerablemente más grande. Las proteínas están comprendidas de terminales amino y carboxi y diversos motivos de repetición, donde Hsf que contiene más secuencias repetidas que Hia. La solicitud de patente de los Estados Unidos No. 09/268,347 presentada el 16 de marzo de 1999 (WO 00/55191), cedida a la cesionaria de la presente y cuya exposición se incorpora aquí como referencia, describe la producción de las versiones truncadas de en el extremo N terminal y de longitud completa de la proteína Hia (rHia) en E. coli . Se ha demostrado que estas proteínas recombinantes protegen contra bacteremia causada por organismos de H. influenzae del tipo a y del tipo b, y para conferir protección parcial Pl3 8 contra colonización nasofaríngea por H. influenzae no tipificable. En esta solicitud, rHia se refiere a rHia V38 de la cepa 11 de NTHi, aunque pueden emplearse otras proteínas Hia recombinantes truncadas en el extremo N terminal y proteínas de longitud completa. Pueden emplearse las proteínas correspondientes que se presentan en la naturaleza. En condiciones de estrés provocado por condiciones ambientales, como temperatura elevada, los organismos producen una respuesta excesiva al estrés o producen proteínas de choque térmico (hsp) . Se ha demostrado que las hsp bacterianas son inmunógenos importantes, que estimulan tanto las células B como las células T (ref. 18) . Las proteínas de choque térmico HtrA o DegP bacterianas se expresan en condiciones de estrés y se ha demostrado que la proteína HtrA de H. influenzae es un antígeno parcialmente protector en el modelo de estimulación de intrabula de otitis media (ref. 19). Las proteínas HtrA son serina proteasas y su actividad proteolítica las hace inestables. Además, como componentes de una vacuna multicomponente, la proteína HtrA de tipo silvestre degrada los antígenos mezclados. La mutagénesis dirigida al sitio del gen htrA de H. influenzae (denominado hin47) y las propiedades de los mutantes se han descrito en forma muy completa en la Patente de los Estados Unidos No. ,506,159 (Loosmore et al.), cedida a la cesionaria de ésta y la cual se considera forma parte de la presente como referencia. La patente de los Estados Unidos No. 5,506,139 Loosmore et al . ) describe la preparación de análogos de proteína Hin47 de Haemophilus influenzae que tiene una actividad proteasa disminuida que es menor a aproximadamente el 10% de la de la proteína Hin47 natural y que tiene, de preferencia, prácticamente las mismas propiedades inmunogénicas de la proteína natural Hin47. La patente describe también el aislamiento, purificación y caracterización de moléculas de ácido nucleico que codifican para los análogos de Hin 47. La proteína Hin47 natural se conserva en forma inmunológica entre aislados del tipo b y no tipificables de H. influenzae . La secuencia de aminoácido de la proteína Hin47 natural y la secuencia de nucleótido del gen hin47 de codificación se describen en WO 94/00149 publicada el 6 de enero de 1994 y que se incorpora aquí como referencia. Los análogos Hin47 de la patente de los Estados Unidos No. 5,506,139 se preparan suprimiendo o sustituyendo, con un aminoácido distinto, por lo menos un aminoácido del Hin47 natural que contribuya a la actividad proteasa o insertando por lo menos un aminoácido en la proteína Hin47 natural, como se describe aquí de manera específica. El o los aminoácidos suprimidos o sustituidos pueden seleccionarse de los aminoácidos 195 a 201 de Hin47 y puede ser específicamente, Serina-197, que puede • suprimirse o sustituirse por alanina. Además, el 5 aminoácido suprimido o sustituido puede ser His-91 y puede suprimirse o sustituirse por alanina, lisina o arginina. Más aún, el o los aminoácidos suprimidos o sustituidos pueden ser Asp-121 y pueden suprimirse o sustituirse con alanina . 10 En la solicitud de patente copendiente de los • Estados Unidos No. 08/487,167 presentada el 7 de junio de 1995, cedida a la cesionaria de la misma y cuya exposición se incorpora aquí como referencia (WO 96/03506) , se describen múltiples mutaciones efectuadas en distintos aminoácidos de la proteína Hin47 natural para proporcionar el análogo Hin47 no proteolítico. En la presente invención, la mutación de histidina 91 a alanina (denominada aquí a veces como • "H91A") se emplea como ilustración de la proteína Hin47 mutante, aunque pueden utilizarse otras Hin47 mutantes con actividad proteasa reducida, como se describe en la patente y solicitud antes mencionadas. Se ha demostrado que el análogo HtrA no proteolítico, H91A Hin47, es un antígeno protector contra la bacteremia ocasionada por el H. influenzae tipo b y contra la otitis media causada por el H. influenzae no tipificable (ref. 19) . Se encontró HtrA en todas las cepas examinadas, incluidas todas las cepas encapsuladas de H. influenzae. El objetivo principal de una vacuna profiláctica contra la otitis media es impedir el establecimiento de la colonización nasofaríngea mediante la inclusión de adhesinas como inmunógenos. Las proteínas Hia y HMW de H. influenzae son adhesinas que, se ha mostrado, evitan la colonización. Sin embargo, ya que existe un pequeño porcentaje de cepas de H. influenzae que no contiene los genes hmw o hia y se desea un amplio espectro de protección contra la enfermedad, se ha añadido el antígeno H91A Hin 47 para proporcionar protección contra estas cepas, aunque pueden emplearse cualesquiera otros análogos no proteolíticos de Hin 47. La presente invención proporciona una vacuna multicomponente para proteger contra la colonización y enfermedad causadas por organismos de H. influenzae encapsulados o no encapsulados. Sería conveniente proporcionar vacunas combinadas eficaces constituidas por los componentes de H. influenzae que contengan cantidades relativas seleccionadas de antígenos seleccionados.

Pl3 8 SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida hacia el suministro de una vacuna multicomponente que comprenda por lo menos tres antígenos, para proteger contra la enfermedad ocasionada por infección con Haemophilus influenzae, incluida la otitis media. Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica que confiere protección en un hospedero, contra la enfermedad ocasionada 10 por infección por Haemophilus influenzae, incluida la • otitis media, que comprende por lo menos tres distintos antígenos de Haemophilus influenzae, por lo menos dos de estos antígenos son adhesinas. El antígeno que es una adhesina puede ser una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa no tipificable de Haemophilus, en particular una proteína HMW1 o HMW2 de la cepa no tipificable, que puede producirse en forma recombinante . • El otro de los antígenos que es una adhesina es una proteína de adhesina de Haemophilus influenzae (Hia) de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae o una proteína de fibras superficiales Haemophilus influenzae (Hsf) de una cepa tipificable de Haemophilus influenzae . El antígeno de Haemophilus influenzae, que no es una adhesiva, puede ser una proteína de choque térmico no Pl3 8 proteolítica de una cepa de Haemophilus influenzae . La proteína de choque térmico no proteolítica de una cepa de Haemophilus influenzae puede ser un análogo de la proteína • Hin47 de Haemophilus influenzae con una actividad de 5 proteasa disminuida que es inferior a aproximadamente 10% de la de la proteína Hin47 natural. Según una modalidad preferida de este aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que confiere protección en un hospedero contra la enfermedad ocasionada por Haemophilus influenzae, incluida • la otitis media, que comprende: (a) un análogo de proteína Hin47 de Haemophilus influenzae con una actividad de proteasa disminuida que es inferior a aproximadamente 10% de la de la proteína Hin47 natural, (b) una proteína de adhesina de Haemophilus influenzae (Hia) de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae, y • (c) una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae . El análogo de la proteína Hin47 puede ser aquél en el que se ha eliminado por lo menos un aminoácido de la proteína Hin47 natural que contribuye a la actividad de proteasa o bien se ha sustituido por un aminoácido diferente y que tiene prácticamente las misma propiedades Pl3 8 inmunogénicas que la proteína Hin47 natural. Ese por lo menos un aminoácido puede seleccionarse del grupo que consiste de los aminoácidos 91, • 121 y 195 a 207 de la proteína Hin47 natural. Los mutantes 5 específicos que pueden utilizarse incluyen serina-197 sustituida por alanina, Histidina-91 sustituida por alanina, lisina o arginina y Asp-121 sustituida por alanina. La proteína HMW de la cepa no tipificable de 10 Haemophilus influenzae puede ser una proteína HMWl o HMW2 y • se puede producir en forma recombinante. Las proteínas HMWl y HMW2 se derivan de las cepas respectivas de Haemophilus influenzae no tipificables y tienen pesos moleculares respectivos como los que se establecen en la Tabla I: 15 TABLA I Peso molecular (kDa) Cepa Haemophi lus influenzae no tipif icable 12 JoyC K21 LCDC2 P H1 15 Proteína madura : HMWl 125 125 . 9 104 . 4 114 . 0 102 . 4 103 . 5 • HMW2 120 100 . 9 111 . 7 103 . 9 121 . 9 La proteína Hia puede producirse de manera recombinante y puede comprender la proteína V38 de rHia , truncada en el extremo N terminal . 20 La composición inmunogénica de la invención adicionalmente puede formularse con un coadyuvante . Dicho coadyuvante que se utiliza en la presente invención puede Pl3 8 incluir (en forma no exclusiva) fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A, derivados y componentes de los mismos, matriz ISCOM, fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de cinc, un análogo de 5 glicolípido, un éster octadecílico de un aminoácido, un dipéptido de muramilo, polifosfazeno, ISCOPREP, DC-chol, DDBA y una lipoproteína y otros coadyuvantes. Las combinaciones ventajosas de adyuvantes se describen en las solicitudes de patente copendientes de los Estados Unidos No. 08/261,194 presentada el 16 de junio de 1994 y • 08/483,856 presentada el 7 de junio de 1995, cedidas a la cesionaria de la presente y cuyas exposiciones se consideran forma parte de esta, como referencia (WO 95/34308, publicada el 21 de noviembre de 1995) . El coadyuvante de preferencia comprende fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio (en general conocido como alumbre) . Los componentes de la composición inmunogénica pueden estar presentes en cantidades apropiadas para • proporcionar la respuesta inmunitaria deseada. Los componentes se pueden formular como una vacuna para administración in vivo en el hospedero. La composición de la vacuna puede contener: (a) aproximadamente entre 25 y 100 µg de la proteína Hin47, 25 (b) aproximadamente entre 25 y 100 µg de la Pl348 proteína Hia, y (c) aproximadamente entre 25 y 100 µg de la proteína HMW. • Las composiciones inmunogénicas pueden formularse 5 con otros componentes antigénicos para proporcionar una vacuna multivalente en la que los componentes antigénicos adicionales confieren protección contra la enfermedad ocasionada por otros patógenos. Esos antígenos adicionales deben ser tales y deben estar presentes en cantidades tales que la inmunogenicidad de los componentes individuales de la vacuna resultante no se dañe por otros componentes individuales de la composición. Estos antígenos adicionales de preferencia son antígenos purificados en cantidades definidas para producir una vacuna componente. 15 Esos antígenos adicionales pueden ser aquellos que se encuentran tradicionalmente en las vacunas protectoras multivalentes, por ejemplo, el toxoide diftérico, el toxoide tetánico y antígenos de pertusis incluido el toxoide de pertusis, hemaglutinina filamentosa, pertactina y/o aglutinógenos . La vacuna multivalente resultante también puede contener poliovirus no virulento, por ejemplo, el poliovirus inactivado, que puede ser poliovirus tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. La vacuna multicomponente además puede comprender un conjugado de toxoide tetánico o diftérico y Pl3 8 un polisacárido capsular de Haemophilus influenzae, de preferencia PRP-T. La invención se amplía a un método de • inmunización de un hospedero contra la enfermedad 5 ocasionada por Haemophilus influenzae, incluida la otitis media, que comprende administrar al hospedero una cantidad inmunoeficaz de la composición inmunogénica proporcionada aquí . Las ventajas de la presente invención incluyen una vacuna multicomponente que puede conferir protección • contra enfermedades ocasionadas por Haemophilus influenzae encapsulado y no encapsulado, de una manera segura y eficaz .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se comprenderá mejor a partir de la siguiente descripción con referencia a los dibujos, en los cuales: La Figura 1 contiene las gráficas de barras A y B, que ilustran las respuestas inmunitarias anti-H91A Hin47 para las vacunas combinadas H91A Hin47 + rHMW + rHia, en ratones. El panel A, 0.3 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW y cantidades cada vez mayores de rHia. El panel B, 3.0 µg de cada uno de H91A Hin 47 + rHMW y cantidades cada vez mayores de rHia.

Pl3 8 La Figura 2 contiene las gráfica de barras A y B que ilustran las respuestas inmunitarias anti-HMW para las vacunas combinadas H91A Hin47 + rHMW + rHia, en ratones. El panel A, 0.3 µg de cada uno de H91A Hin 47 + rHMW y 5 cantidades cada vez mayores de rHia. El panel B, 3.0 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW y cantidades cada vez mayores de rHia. Los asteriscos indican significado estadístico. La Figura 3 contiene las gráficas de barras A, B C y D que ilustran las respuestas inmunitarias anti-Hia 10 para las vacunas combinadas H91A Hin47 + rHMW + rHia, en • ratones. El panel A, 0.3 µg de rHia y cantidades cada vez mayores de H91A Hin 47 + rHMW. El panel B, 1.0 µg de rHia y cantidades cada vez mayores de H91A Hin47 + rHMW. El panel C, 3.0 µg de rHia y cantidades cada vez mayores de 15 H91A Hin 47 + rHMW. El panel D, 10 µg de rHia y cantidades cada vez mayores de H91A Hin47 + rHMW. Los asteriscos indican significado estadístico. La Figura 4 contiene las gráfica de barras A y B • que ilustran las respuestas inmunitarias anti-H91A Hin47 20 para las vacunas combinadas H91A Hin47 + rHMW + rHia, en cobayos. El panel A, 25 µg de cada uno de H91A Hin 47 + rHMW y cantidades cada vez mayores de rHia. El panel B, 50 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW y cantidades cada vez mayores de rHia. 25 La Figura 5 contiene las gráfica de barras A y B Pl3 8 que ilustran las respuestas inmunitarias anti-HMW para las vacunas combinadas H91A Hin47 + rHMW + rHia, en cobayos. El panel A, 25 µg de cada uno de H91A Hin 47 + rHMW y cantidades cada vez mayores de rHia. El panel B, 50 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW y cantidades cada vez mayores de rHia. La Figura 6 contiene las gráfica de barras A, B y C que ilustran las respuestas inmunitarias anti-Hia para las vacunas combinadas H91A Hin47 + rHMW + rHia, en cobayos. El panel A, 25 µg de rHia y cantidades cada vez mayores de H91A Hin 47 + rHMW. El panel B, 50 µg de rHia y cantidades cada vez mayores de H91A Hin47 + rHMW rHia. el Panel C, 100 µg de Hia y cantidades cada vez mayores de H91A + rHMW. Los asteriscos indican significado estadístico. La Figura 7 ilustra la protección de la vacuna combinada H91A Hin47 + rHMW + rHia en el modelo de chinchilla de colonización nasofaríngea en comparación con una vacuna HMW o monocomponente y una vacuna de dos componentes rHMW + H91A Hin 47 y controles convalecientes. La Figura 8 es una ilustración esquemática de un esquema de construcción para producir plásmido DS-2150-1 que contiene el gen que codifica el análogo H91 Hin47. La Figura 9 es una ilustración esquemática de un esquema de construcción para producir plásmido BK-76-1-1 P13 8 que contiene el agrupamiento de gen hmwl ABC de la cepa 12 de HTHi. La Figura 10 es una ilustración esquemática de un esquema de construcción para producir plásmido BK-96-2-11 que contiene el gen que codifica para la proteína V38 de Hia, truncada en el extremo N terminal, de la cepa 11 de HTHi. La Figura 11 muestra los oligonucleótidos utilizados para que PCR amplifique el gen hia de la cepa 11. homosentiido (5038. SL), SEQ ID NO: 2, aminoácidos codificados SEQ ID NO : 3 ; Antisentido (5039. SL), SEQ ID NO:4, complemento SEQ ID NO: 5, aminoácidos codificados SEQ ID NO: 6. La Figura 12 muestra los oligonucleótidos utilizados para que el PCR amplifique los fragmentos 5' para producir el gen truncado. V38 truncado : homosentiido (5526.SL) :SEQ ID NO : 7 , aminoácidos codificados SEQ ID NO : 8 ; Antisentido (5528. SL) SEQ ID NO: 9; complemento SEQ ID NO: 10, aminoácidos codificados SEQ ID NO: 11. La Figura 13 muestra la protección proporcionada por la vacuna combinada H91A Hin47 + rHMW rHia en el modelo de estimulación intrabula en chinchilla. La protección proporcionada por la vacuna de tres componentes se compara con la de una vacuna monocomponente H91A Hin47, una vacuna de dos componentes rHMW y H91A Hin47 son controles P13 8 convalecentes , DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN • La producción y purificación de los antígenos de 5 H. influsnzas recombinante, rHMW, rHia y H91A Hin47 se han descrito en su totalidad en las solicitudes de patente de los Estados Unidos antes mencionadas Nos. 09/167,568 (WO 00/20609), 09/268,347 (WO 00/55191) y la antes mencionada patente de los Estados Unidos No. 5,506,159, respectivamente. • La colonización de la nasofaringe es la primera etapa de desarrollo de la enfermedad para muchos patógenos bacterianos o virales y las vacunas que contengan las moléculas de adhesina deben proteger contra esta primera etapa en la progresión de la enfermedad. Las proteínas de alto peso molecular (HMW) , que se encuentran en aproximadamente 75% del H. influsnzas no tipificable, han mostrado que son adhesinas que son protectoras contra la • colonización cuando se administran en una composición de vacuna. Las proteínas HMW no están presentes en las cepas de H. influsnzas encapsuladas o en aproximadamente 25% de las cepas de H. influenzae no tipificables y por lo tanto solas no son suficientes, para una vacuna que tenga una amplia capacidad de protección por cepa. 25 También se ha mostrado que las proteínas Hia/Hsf Pl348 son adhesinas y están presentes en todas las cepas de H. influenzae y en la mayoría de las cepas de H. influenzae no tipificables que no producen proteínas HMW. La proteína rHia es protectora contra la colonización por NTHi y contra 5 bacteremia ocasionada por organismos de H. influenzae del tipo a y del tipo b. Hay un pequeño porcentaje de cepas de NTHi que no producen ni proteínas Hia ni HMW. La proteína HtrA de Hin47 se encuentra en todas las cepas encapsuladas y no tipificables de H. influenzae .

El Hin47, o su mutante no proteolítico H91A Hin47, es • protector contra la bacteremia ocasionada por el H. influenzae tipo b y la otitis media ocasionada por el H. influenzas no tipificable, pero por sí sola no impide la colonización. Se puede formular una vacuna combinada que comprende antígenos rHMW, rHia y H91A Hin4 para proteger contra una enfermedad ocasionada por H. influsnzas, incluida la otitis media. Esta combinación se proporciona en la presente. • La composición de las vacunas multicomponentes es crítica por máxima eficiencia. Los componentes de la vacuna deben ser compatibles y deben combinarse en proporciones adecuadas para evitar la interferencia antigénica y mejorar al máximo cualquiera de las posibles sinergias. Si se administra con otras vacunas establecidas, no deben interferir con la protección lograda por la vacuna contra Pl3 8 otras enfermedades . La preparación y las propiedades protectoras e inmunogénicas de una vacuna de dos componentes rHMW + H91A • Hin47 se han descrito en la solicitud de patente de los 5 Estados Unidos No. 097210,995 presentada el 15 de diciembre de 1998 (WO 00/35477) , cedida a la cesionaria de la misma y cuya exposición se incorpora aquí como referencia. Se compararon diversas proporciones de antígeno para la vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia, en dos especies animales. No se afectó la respuesta • anti-H91A Hin 47 con cantidades cada vez mayores de rHia. Se observó interferencia antigénica en ratones para la respuesta anti-rHMW, cuando se mezcló una dosis de cada uno de H91A Hin47 + rHMW con dosis cada vez mayores de rHia.

Sin embargo, a una dosis de 30 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW, no hubo supresión de la respuesta anti-rHMW con cantidades cada vez mayores de rHia. Aunque hubo una supresión transitoria de la respuesta anti-Hia el día 42 • cuando se combinó una dosis de 0.3 µg con 3 µg de cada uno de H91A + rHMW, este efecto no fue significativo para el día 56. En cobayos, las respuestas del anti-H91A Hin47 y anti-rHMW no fueron afectadas por la adición de rHia. Sin embargo, parecía haber un pequeño, pero estadístico efecto en la respuesta anti-Hia en la presencia de H91A Hin47 + rHMW para las inmunizaciones de refuerzo. Estos datos Pl348 indican que la composición de la vacuna de tres componentes es crítica para lograr una buena respuesta inmunitaria para todos los componentes. Haciendo referencia a la Figura 1, se ilustra la respuesta del anticuerpo en ratones para el antígeno H91A Hin47 de una vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia. Se lograron elevados títulos de anticuerpos con todas las combinaciones de vacunas en la sangría final . Con referencia a la Figura 2, se ilustra la respuesta del anticuerpo en ratones para el antígeno rHMW de una vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia. A la dosis de 3.0 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW, hay títulos elevados de anticuerpos rHMW encontrados en el suero de la sangría final independientemente de la cantidad de rHia en la composición de la vacuna. Sin embargo, en la dosis de 0.3 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW, los títulos de anti-rHMW se redujeron de manera importante con cantidades cada vez mayores de rHia añadido. Haciendo referencia a la Figura 3, en la dosis de 0.3 µg de rHia, hay un efecto supresor sobre la respuesta inmunitaria del anti -rHia en el día 42 con cantidades cada vez mayores de H91A Hin47 + rHMW. Sin embargo, este efecto se pierde por el día 56 y no se observa con dosis más elevadas en donde no hay consecuencias en la respuesta inmunitaria. Haciendo referencia a la Figura 4, se ilustra la Pl348 respuesta de anticuerpo en cobayos para el antígeno H91A Hin47 de una vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia. Se lograron elevados títulos de anticuerpo con todas • las combinaciones de vacuna en la sangría final y no se 5 observaron efectos sinérgicos o supresores. Haciendo referencia a la Figura 5, se ilustra la respuesta del anticuerpo en cobayos para el antígeno rHMW de una vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia. Se lograron títulos elevados de anticuerpo con todas las combinaciones de vacuna en la sangría final y no se observaron efectos sinérgicos o supresores. Haciendo referencia a la Figura 6, se ilustra la respuesta de anticuerpo en cobayos para el antígeno rHia de una vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia. Se lograron elevados títulos de anticuerpo con todas las combinaciones de vacuna en la sangría final. Haciendo referencia a la Figura 7, se ilustra la protección proporcionada por una vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia en el modelo de colonización nasofaríngea comparado con la protección proporcionada por la vacuna de un solo componente rHMW o por una vacuna de dos componentes H91A Hin47 + rHMW. La vacuna de tres componentes es altamente protectora, lo que indica que la adición de más antígenos no ha afectado la capacidad protectora del componentes rHMW. 25 Haciendo referencia a la Figura 13, se ilustra la P13 8 protección proporcionada por la vacuna de tres componentes H91A Hin47 + rHMW + rHia contra infección del oído medio en un modelo de chinchilla. La protección puede compararse a la proporcionada por una vacuna monocomponente H91A Hin47 y por una vacuna de dos componentes H91A Hin47 + rHMW.

DEPÓSITOS BIOLÓGICOS Ciertos vectores que contienen ácido nucleico que codifican para una proteína de alto peso molecular de una cepa no tipificable de Hasmophilus de las que se describen y mencionan en la presente, se han depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA, conforme al tratado de Budapest y antes de presentar esta solicitud. Las muestras de los vectores depositados estarán disponibles al público y se aceptarán todas las restricciones impuestas o el acceso a los depósitos tan pronto se otorgue una patente basada en esta Solicitud de Patente de los Estados Unidos. Además, el depósito se reemplazará si el Depositario no puede suministrar muestras viables. El alcance de la invención descrita y reclamada aquí no está limitado por los materiales biológicos depositados, ya que la modalidad depositada solamente tiene como propósito ilustrar la invención. Cualesquier vector equivalente o similar que contenga ácido nucleico y que P13 8 codifique para antígenos equivalentes o similares a los que se describen es esta solicitud queda dentro del alcance de la invención. • Resumen del depósito Plásmido ATCC Fecha de depósito BK-76-1-1 203261 25 de septiembre de 1998 BK-96-2-11 203771 11 de febrero de 1999 EJEMPLOS La exposición anterior describe en general la presente invención. Se puede obtener una interpretación más completa al considerar los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen solamente para fines de ilustración y no con el propósito de limitar el alcance de la invención. Los cambios en la forma y la sustitución de equivalentes se consideran como circunstancias que pueden sugerir o generar expediente. Aunque aquí se han empleado términos específicos, dichos términos se utilizan en un sentido descriptivo y no con fines limitativos. Se utilizan métodos de genética molecular, bioquímica de proteínas, inmunología y tecnología de fermentación, pero no se definen en forma explícita en esta exposición y en estos Ejemplos, los mismos están reportados en forma extensa en la literatura científica y quedan P13 8 dentro de la capacidad de los técnicos experimentados .

Ejemplo 1 • Este ejemplo describe la preparación del 5 componente H91A Hin47 de la vacuna. El mutante H91A Hin47 se preparó según se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,506,139 y como se muestra en forma esquemática en la Figura 8. Descrito en forma breve, se sintetizó un oligonucleótido 5' 10 ATCAATAACAGCATTATTGGT 3' (SEQ ID NO: 1) que cambiaría el • residuo de histidina en la posición 91 de la proteína Hin47 por una alanina (ref. 19) . El plásmido JB-1276-1-2 es un plásmido con base en pUC que contiene el gen T7/hin47 en un fragmento EcoR I 15 y se utilizó para clonar el gen hin47 a M13mpl8 por mutagénesis dirigida al sitio con el equipo In Vi tro Site- Directed Mutagenesis de Amersham. La preparación del plásmido JB-1276-1-2 se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,506,139. La mutación del codón His91 a 20 Ala91 se confirmó por secuenciación local. El gen hin47 mutante H91A se subclonó a pT7-7 para generar el plásmido DS-1277-19 (Figura 8) . El plásmido de expresión H91A Hin47 (DS-1277-19) utiliza selección de ampicilina. El gen T7/H91A Hin47 se clonó a pBR328 de manera que se pudo emplear selección de P1348 tetraciclina. Así, el vector DS-1312-12 fue un plásmido basado en pBR328 que contenía las secuencias del gen T7/H91A Hin47 entre los sitios EcoR I y Cla I, que tienen • genes de resistencia funcional a ampicilina y tetraciclina 5 y que contienen una repetición de las secuencias Hind III - BamH I que se encuentran tanto en pBR328 como en pEVvrf1. Se construyó un nuevo plásmido con base en DS- 1312-12 que utiliza selección de kanamicina. El esquema de construcción se muestra en la Figura 8. El ADN plásmido de DS-1312-12 se sometió a digestión con Hind III lo cual generó dos fragmentos . El fragmento mayor de 5.9 kb contenía un gen tefc sin promotor, el gen ampR y el gen T7/H91A Hin47 se enlazó nuevamente sobre sí y generó el vector DS-2140-3. El plásmido DS-2140-3 se sometió a digestión con Pst I y el gen kanR del plásmido pUC-4K (P-L Biochemicals) se insertó en el sitio Pst I y generó el plásmido DS-2150-I que es kanR y es sensible tanto a ampicilina como a tetraciclina. El ADN plásmido de DS-2150-1 se preparó a partir de un cultivo de 50 mL empleando un protocolo basado en el procedimiento de Holmes y Quigley (ref.21) e incluyendo extracciones con fenol y cloroformo. Las células E. Coli BL21(DE3) se hicieron electrocompetentes de la manera siguiente. Descrito en forma breve, 10 mL de cultivo formado durante la noche, se inocularon en 500 ml de medio P13 8 YT y las células se cultivaron a 37°C con agitación hasta que lograron una A26o=0.540. El cultivo se enfrió sobre hielo durante 30 minutos, se centrífugo a 5K rpm durante 15 minutos y el aglomerado celular se resuspendió en 500 ml de agua estéril helada. La suspensión celular se centrífugo según se mencionó antes y el aglomerado celular se resuspendió en 250 ml de agua estéril helada. La suspensión celular se volvió a centrifugar y las células se resuspendieron en 10 ml de glicerol al 10%. La suspensión de glicerol se centrífugo y las células se resuspendieron en 1.5 ml de glicerol al 10%, se tomaron muestras con alícuotas de 40 µl y se almacenaron a -70°C. Una alícuota de células BL21(DE3) electrocompetentes se descongeló sobre hielo y se adicionaron aproximadamente 9 ng de ADN de DS-2150-1. Las muestras se incubaron en hielo durante 3 minutos y luego se transfirieron a -20°C a una celda de electrodo BioRad Gene Pulser y se sometieron a un pulso eléctrico. Se adicionaron 900 µl de medio SOC y la mezcla se transfirió a una tubo de cultivo en donde se incubó a 37°C durante 1 hora antes de depositarse en una placa con agar YT que contenía 25 µg/ml de kanamicina. La placa se incubó durante la noche a 37°C y se utilizaron colonias solas para los estudios de expresión. Los clones individuales se cultivaron en medio Pl348 NZCYM a una ASOonm de aproximadamente 0.3 y se adicionó lactosa al 1% para inducir la expresión. Las células se cultivaron durante 4 horas, luego se cosecharon y se analizaron por SDS PAGE. El clon DS-2171-1-1 se eligió como clon representativo que expresó elevados niveles de H91A Hin47. La E. coli que contenía DS-2171-1-1 se cultivó en matraces de 2 x 2 L con 250 mL de ECGM (con un contenido de 8 g/L de glucosa, pH 6.5) y se incubó con agitación a 37°C durante aproximadamente 9 horas en la oscuridad a 250 rpm. El líquido de cultivo (2 x 250 mL) se inoculó en un fermentador de 10 L y el cultivo se dejó crecer a 37°C. Después de aproximadamente 10 horas de incubación, se adicionó lactosa al 1% (concentración final) para inducción y a continuación se sometió a 4 horas adicionales de incubación. El líquido de cultivo se recolectó en frascos de transferencia estériles y se concentró y filtró por diálisis mediante filtración de flujo cruzado contra amortiguador Tris/HCl 50 mM, pH 8.0. Las células en el concentrado se lisaron utilizando un homogeneizador de alta presión (2 ciclos a 15,000 psi) para liberar la proteína H91A Hin47. El desecho celular se eliminó por centrifugación a 15,000 rpm durante 1.5 horas. El sobrenadante adicionalmente se clarificó por centrifugación P1348 y se filtró a través de un filtro de extremo muerto de 0.22 µm. Los productos pueden almacenarse en refrigeración a -70 °C hasta su procesamiento posterior. Se adicionó cloruro de sodio (NaCl) a la muestra clarificada hasta una concentración final de 100 mM. La muestra se purificó entonces en una columna de cromatografía de intercambio iónico (TMAE-Fractogel) equilibrada con Tris 50 mM pH 8.0 que contenía NaCl 100 mM. La proteína H91A Hin47 se obtuvo en la corrida. La capa acuosa se cargó en una columna cerámica de hidroxiapatita tipo 1 (CHTP-1) , con amortiguador de fosfato de sodio 10 mM pH 8.0. La columna de lavó luego con amortiguador de fosfato de sodio 150 mM pH 8.0 y la H91A Hin47 se eluyó con amortiguador de fosfato de sodio 175 mM, pH 8.0 que contenía NaCl 1M. La proteína purificada H91A Hin47 se concentró utilizando una membrana de corte de peso molecular 10 kDa y a continuación diafiltración con aproximadamente 10 volúmenes de solución salina amortiguada de fosfato (PBS) , pH 7.5. La proteína purificada H91A Hin47 en PBS se pasó a través de una membrana adsorbente Q600 Sartobind. Después de pasar la solución, la membrana se regeneró utilizando KCl 1.0 M/NaOH 1.0 M seguido de un lavado con KCl 1M y luego equilibrando con PBS. El proceso se repitió dos P13 8 veces. La proteína H91A Hin47 diafiltrada y concentrada se filtró en medio estéril a través de un filtro de membrana de 0.22 µm. La proteína H91A Hin47 estéril se adicionó de • fosfato de aluminio como coadyuvante. El concentrado 5 purificado adsorbido se diluyó para llevar la masa adsorbida a 100 µg/ml. La concentración del componente para vacuna H91A Hin47 se ajustó a 400 µg ml"1 en PBS (pH 7.3) y se adyuvó con fosfato de aluminio hasta una concentración final de 3 mg ml"1. Se prepararon dosis distintas diluyendo el volumen • en existencia con 3 mg ml"1 de fosfato de aluminio en PBS.

Ejemplo 2 Este ejemplo describe la preparación del 15 componente rHMW de la vacuna. La producción y purificación de la proteína rHMW se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos copendiente No. 09/167,568 presentada el 7 de • octubre de 1998 (WO 00/20609) y se muestra de manera esquemática en la Figura 9. Descrito en breve, el plásmido pHMWl-15 (ref.13) contiene un sitio Xba I dentro de la secuencia promotora T7 y un sitio BamH I único dentro de la secuencia codificante de la proteína HMW1A madura de la cepa 12 de Haemophilus no tipificable. El fragmento Xba I -BamH I 1.8 kb de pHMWl-15 Pl3 8 se eliminó y se reemplazó por un fragmento Xba I -BamH I 114 bp generado a partir de oligonucleótidos. El plásmido 11.3 kb resultante, DS-1046-1-1, contiene así el promotor T7 unido en marco con el operón hmwlABC que codifica la proteína HMW1A 125 kDa madura (Figura 9) . El plásmido DS-1046-1-1 contiene el cásete genético T7 hmwlABC y tiene un sitio Bgl II único fuera de la región codificante del gen HMW1A maduro. El plásmido DS-2224-1-4 contiene el gen cer de E. coli localizado en un fragmento BamH I. Este fragmento se aisló y se ligó en el sitio Bgl II del plásmido DS-1046-1-1 para producir el plásmido BK-35-4 (Figura 9) . El cásete de resistencia a kanamicina se escindió a partir de pUC 4K por restricción de Sal I y se ligó al plásmido BK-35-4 restringido en Sal I para producir el plásmido BK-76-1-1. Los plásmidos se introdujeron en células BL21(DE3) de E. coli por electroporación utilizando un aparato BioRad. Las cepas se cultivaron a 37°C en medio NZCYM hasta una densidad óptica de A578=0.3, luego se indujeron mediante la adición de lactosa al 1.0% durante 4 horas. Las muestras se ajustaron a 0.2 DO/µl con lisis en SDS-PAGE + amortiguador de carga y se cargó la misma cantidad de muestra de proteína en geles de SDS-PAGE. La proteína HMW recombinante se expresó como cuerpos de inclusión en E. coli y se purificaron mediante el mismo procedimiento (Figura 12) . Los aglomerados celulares de E. coli provenientes de 500 ml de cultivo se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, que contenía NaCl 0.1M y se disgregaron por sonicación. El extracto se centrífugo a 20,000 g por 30 minutos y se desechó el sobrenadante resultante. El aglomerado se extrajo adicionalmente en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, que contenía Tritón* X-100 al 0.5% y EDTA 10 mM, luego se centrifugó a 20,000 g por 30 minutos y se desechó el sobrenadante. El aglomerado se extrajo adicionalmente en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, que contenía octilglucósido al 1%, luego se centrifugó a 20,000 g por 30 minutos y se desechó el sobrenadante. El aglomerado resultante, obtenido después de las extracciones anteriores, contiene los cuerpos de inclusión. El aglomerado se solubilizó en 6 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 que contenía guanidina 6M y DTT 5 mM. Se adicionaron a esta solución doce ml de Tris-HCl 50mM, pH 8.0 y la mezcla se centrifugó a 20,000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se precipitó con polietilenglicol (PEG) 4000 a una concentración final de 7%. El aglomerado resultante se eliminó por centrifugación a 20,000 g por 30 minutos y el sobrenadante se precipitó por medio de (NH4)2S04 a 50% de saturación. Después de la adición de (NH4)2S04, la solución se separó en fases y la proteína quedó en la fase superior, P1 48 la cual se sometió a centrifugación a 20,000 g por 30 minutos. El aglomerado resultante se disolvió en 2 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, que contenía clorhidrato de guanidina 6M y DTT 5 mM, la solución clara se purificó en una columna de filtración en gel Superdex 200 equilibrada en Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, que contenía clorhidrato de guanidina 2 M. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y las que contenían la rHMWl purificada se mezclaron y se dializaron durante la noche a 4°C contra PBS, luego se centrifugaron a 20,000 g por 30 minutos. La proteína permaneció soluble en estas condiciones y se adicionó glicerol a la preparación de rHMWl a una concentración final de 20% para almacenamiento a -20°C. La concentración del componente rHMW de la vacuna se ajustó a 400 µg ml"1 en PBS (pH 7.3) y se adicionó fosfato de aluminio como coadyuvante a una concentración final de 3 mg ml"1. Se prepararon diferentes dosis diluyendo la solución base con 3 mg ml"1 de fosfato de aluminio en PBS .

Ejemplo 3 Este ejemplo describe la preparación de un componente de la vacuna rHia. La producción y purificación de la proteína rHia se han descrito en la antes mencionada solicitud de patente copendiente de los Estados Unidos No. 09/268,347 presentada el 16 de marzo de 1999 (WO 00/55191) y se muestran en forma esquemática en la Figura 10. • De manera breve, el ADN cromosómico se purificó a 5 partir de la cepa 11 de NTHi y el gen hia de longitud completa se amplificó por PCR utilizando los oligonucleótidos (5038. SL y 5039. SL) (Figura 11). El producto PCR contenía un sitio Ndel en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3 ' . Este fragmento se clonó en el vector de expresión pT7-7 restringido de Ndel/BamHI • (ref. 20) que produce plásmido DS-2008-2-3 (Figura 10) . Se utilizaron cebadores (5526. SL y 5528. SL) (Figura 12) para amplificar un fragmento de gen hia truncado desde el sitio V38 hasta el sitio Sty I de DS- 15 2008-2-3 plásmido, el fragmento resultante se clonó TA in el plásmido pCRII (Invitrogen) para producir el plásmido DS-2153-3-5. El plásmido se restringió entonces con Nde I y Sty I y este fragmento se ligó al fragmento de vector aislado Nde I/Sty I 5.7kb de DS-2008-2-3 para producir el plásmido DS-2186-2-1. El plásmido DS-2186-2-1 que contiene el gen hia truncado en V38 se restringió con Bgl II y BamH I para liberar al gen rHia . Este fragmento se aisló y se clonó en el Bglll restringido, CAP tratado, plásmido BK-2-1-2, para producir el plásmido BK 96-2-11. Este plásmido posee ahora Pl3 8 un marcador de resistencia a la canamicina y el gen csr de E. coli así como el gen hia truncado en V38 de la cepa 11 . La concentración del componente de vacuna rHia se • ajustó a 400 µg ml"1 en PBS (pH 7.3) y se adyuvó con fosfato 5 de aluminio hasta una concentración final de 3 mg ml"1. Se prepararon dosis distintas diluyendo el volumen en existencia con 3 mg ml"1 de fosfato de aluminio en PBS.

Ejemplo 4 10 Este ejemplo describe la combinación de H91A • Hin47 + rHMW + rHia como una vacuna de tres componentes. La preparación de una vacuna de dos componentes que comprende H91A Hin 47 + rHMW se ha descrito en la antes mencionada solicitud de patente copendiente de los Estados Unidos No. 09/210,995 presentada el 15 de diciembre de 1998 (WO 00/35477) . Explicado en forma breve, se prepararon vacunas que comprendían la combinación de H91A Hin47 y rHMW combinando los componentes en el día 0, mezclando toda la noche a 4°C y se tomaron alícuotas en el día 1. Las 20 vacunas se almacenaron a 4°C durante todo el periodo de inmunización. Se prepararon vacunas que comprenden las siguientes combinaciones de rHia con la vacuna de dos componentes contenida en la Tabla II: 25 TABLA II P13 8 • Notas: Los 2 componentes se refieren a H91A Hin47 + rHMW. m indica que la vacuna se utilizó para inmunizar ratones . gp indica que la vacuna se utilizó para inmunizar cobayos . Los componentes de vacuna se combinaron en el día 0, se mezclaron durante la noche a 4°C y se tomaron alícuotas en el día 1. Las vacunas combinadas se almacenaron a 4°C a lo largo del período de inmunización.

Ejemplo 5 Este Ejemplo describe el análisis de la inmunogenicidad de las vacunas multicomponentes en animales . La inmunogenicidad de una vacuna de dos componentes que comprende H91A Hin47 + rHMW se ha descrito en la antes mencionada solicitud de patente copendiente de Pl348 los Estados Unidos No. 09/210,995 presentada el 15 de diciembre de 1998 (WO 00/35477) . Se inmunizaron grupos de cinco ratones BALB/c • (Charles River, Québec) por vía subcutánea (s.c.) en los días 1, 29 y 43 con una de las vacunas de ratón descritas en el Ejemplo 4. Se extrajeron muestras de sangre en los días 0, 14, 28, 42 y 56. Se inmunizaron grupos de 5 cobayos de cruce Hartley (Charles River, Quebec) por vía intramuscular (i.m.) en los días 1, 29 y 43 con una de las vacunas de • cobayo descritas en el Ejemplo 4. Se extrajeron muestras de sangre en los días 0, 14, 28, 42 y 56. Se determinaron los títulos de anticuerpos anti- H91A Hin47, anti-rHMW e IgG anti-rHMW mediante ensayos con inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) . Se recubrieron pozos de microtitulación (NuncMAXISORB* , Nunc, Dinamarca) con 50 µl de solución de proteína (0.4 µg ml"1 para H91A Hin47 ó 0.4 µg ml"1 para rHia). Los anticuerpos secundarios • utilizados fueron fragmentos F(ab')2 purificados por afinidad de anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón (Fe específicos) o anticuerpos anti-IgG de cobayo (Fe específicos) conjugados con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch Labs, Mississauga, Ontario) . Las reacciones se revelaron utilizando tetrametilbencidina (TMB/H202, ADI, Mississauga, Ontario) y las absorbancias se determinaron a P13 8 450 nm (utilizando 540 nm como longitud de onda de referencia) en un lector de microplaca Flow Multiskan MCC (ICN Biomedicals, Mississauga, Ontario) . El título reactivo • de un antisuero se definió como el recíproco de la dilución 5 que de manera consistente muestra un aumento al doble en la absorbancia con respecto a la que se obtiene con la muestra de suero previa al sangrado. Los resultados de los estudios de inmunogenicidad se ilustran en las Figuras 1 a 6. Tal como se muestra en la Figura 1, los sueros del sangrado final obtenidos a partir • de ratones inmunizados con 0.3 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW o con 3.0 µg cada uno de H91A Hin47 + rHMW y 0, 0.3, 1.0, 3.0 ó 10 µg de rHia tuvieron títulos elevados de anticuerpos frente a H91A Hin47. Estos datos muestran que no hay ni efecto sinérgico ni de interferencia sobre el título de anticuerpo anti-H91A Hin47 con rHia añadido. Como se muestra en la Figura 2, panel A, el suero de la sangría final obtenido de ratones inmunizados con 0.3 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW y O, 0.3, 1.0, 3.0 ó 10 µg de rHia tuvo títulos anti-HMW significativamente reducidos con cantidades cada vez mayores de rHia añadidas. Estos datos indican que a bajas concentraciones de H91A Hin47 + rHMW, hay supresión de la respuesta de anticuerpo anti-HMW ocasionada por la adición de rHia. Cuando se inmunizaron ratones con 3 µg de cada uno de H91A, Hin47 + P1348 rHMW y O, 0.3, 1.0, 3.0 ó 10 µg de rHia no se observó ningún efecto y se obtuvieron títulos elevados de anticuerpos anti-rHMW en el suero de la sangría final (Figura 2, panel B) . Como se muestra en la Figura 3, panel A, la adición de 3.0 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW a 0.3 µg de rHia tuvo un efecto supresor transitorio sobre la respuesta anti-Hia en el día 42, que desapareció por el día 56. Sin embargo, como se muestra en la Figura 3, paneles B a D, no hubo efecto supresor observado a dosis más elevadas de rHia . Como se muestra en la Figura 4, paneles A y B, los sueros de la sangría final de cobayos inmunizados con 25 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW y 0, 25, 50 ó 100 µg de rHia tuvieron todos elevados títulos de anticuerpos anti-H91A Hin 47. Estos datos indicaron que no hubo efecto sinérgico ni supresor sobre la respuesta de anticuerpo anti-H91A Hin47 en presencia de los tres antígenos. Como se muestra en la Figura 5, paneles A y B, los sueros de la sangría final de cobayos inmunizados con 25 µg de cada uno de H91A, Hin47 + rHMW ó 50 µg de cada uno de H91A Hin47 + rHMW y 0, 25, 50 ó 100 µg de rHia tuvieron todos elevados títulos de anticuerpos anti-rHMW. Estos datos indican que no hubo ni un efecto sinérgico ni supresor sobre la respuesta de anticuerpo anti-rHMW en P13 8 presencia de los tres antígenos. Como se muestra en la Figura 6, paneles A a C, los sueros de sangrado final obtenidos a partir de cobayos inmunizados con 25, 50 ó 100 µg de rHia con o sin H91A Hin47 + rHMW añadido, tuvieron todos anticuerpos anti-rHia de elevados títulos. Hubo, sin embargo, una ligera pero estadística inhibición de la respuesta anti -rHia después de dosis de refuerzo que contenían a los tres antígenos.

Ejemplo 6 Este Ejemplo describe la capacidad protectora de una vacuna multicomponente en modelos animales de enfermedad. En chinchillas jóvenes, se ha demostrado que la colonización nasofaríngea con H. influsnzas no tipificable da lugar a la otitis media (ref. 14) . La rHMW es parcialmente protectora en un modelo de estimulación de colonización nasofaríngea en chinchilla, tal como se describe en la anteriormente mencionada Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 09/167,568 (WO 00/20609) . En este modelo, los animales se inmunizaron por vía intramuscular en los días 0, 14 y 28 con 25, 50 ó 100 µg de rHMW adsorbido en alumbre y se estimularon el día 44 con 108 ufe de bacterias vivas suministradas intranasalmente (50 µl por fosa) .

Pl3 8 El lavado nasofaríngeo se realizó durante 4 días posteriores a la estimulación utilizando 1 ml de solución salina estéril. 25 µl de líquido de lavado se depositaron sobre agar chocolate en presencia de estreptomicina y las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas. (La cepa de estimulación se volvió resistente a estreptomicina mediante subcultivos en serie, a fin de facilitar la cuantificación de bacterias recuperadas en presencia de flora natural que son exterminadas por la estreptomicina) . Como controles, se utilizaron animales convalecientes o aquellos pseudoinmunizados con alumbre solo. Para el estudio de la vacuna multicomponente, se mezclaron 50 µg de cada uno de rHMW, rHia y H91A Hin47 de la forma que se describe en el Ejemplo 4 y las chinchillas se inmunizaron según se describe en lo anterior. Los resultados del estudio de protección se muestran en la Figura 7 que indica que todavía existe una excelente protección lograda en el modelo de estimulación la colonización nasofaríngea mediante la combinación de rHMW + rHia + H91A Hin47. Además, como se observa en la Figura 13, la vacuna de tres componentes proporcionó protección parcial en el modelo de estimulación intrabula. Este modelo se ha descrito previamente (ref. 19). Se inmunizaron chinchillas jóvenes por vía i.m. en los días 0, 14 y 20 con 50 µg de P13 8 cada uno de los antígenos probados, adsorbidos por alumbre. Las chinchillas se estimularon el día 44 con 350 ufe (unidades formadoras de colonia) de organismos vivos • suministrados en el espacio del oído medio vía la bula epitimpánica. Los animales se supervisaron entonces por medio de timpanometría y se recolectó fluido del oído medio 4 días posteriores a la estimulación, se mezcló con 200 µl de medio BHI y la dilución se colocó en placas de agar chocolate que se incuban por 24 horas a 37°C. Los animales convalecientes o los inmunizados con alumbre solo • se utilizan como controles. para el estudio de la vacuna multicomponente, se mezclaron 50 µl de cada uno de H91A Hin47, rHMW y rHia, como se describe en el Ejemplo 4.

SUMARIO DE LA EXPOSICIÓN En resumen, la presente invención proporciona una vacuna multicomponentes contra Haemophilus influenzae que tiene un amplio espectro de eficacia y que comprende tres antígenos diferentes de Haemophilus influenzae, dos de 20 estos antígenos es una adhesinas. Son posibles las modificaciones dentro del alcance de la invención.

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Claims (23)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Una composición inmunogénica que confiere protección en un hospedero contra la enfermedad ocasionada • por Haemophilus influenzae, caracterizada por: 5 al menos tres antígenos diferentes de Haemophilus influenzae, por lo menos dos de estos antígenos diferentes son una adhesina y el otro de estos antígenos no es una adhesina.
2. 2. La composición inmunogénica según la 10 reivindicación 1, caracterizada porque uno de los antígenos que es una adhesina es una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae .
3. 3. La composición inmunogénica según la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína HMW es 15 una proteína HMWl o HMW2 de la cepa no tipificable de Haemophilus influenzae.
4. 4. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque uno de los antígenos que es una adhesina es una proteína de 20 adhesina (Hia de Haemophilus influenzae de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae o una proteína de fibrilla superficial de Haemophilus influenzas (Hsf) de una cepa tipificable de Hasmophilus influsnzas .
5. 5. La composición inmunogénica según cualquiera 25 de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el Pl3 8 antígeno de Haemophilus influsnzas que no es una adhesina es una proteína de choque térmico no proteolítica de una cepa de Haemophilus influenzae .
6. 6. La composición inmunogénica según la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína de choque término no proteolítica de una cepa de Haemophilus influenzae es un análogo de proteína Hin47 de Haemophilus influenzae que tiene actividad proteasa disminuida que es menor de aproximadamente 10% de aquélla de la proteína Hin47 natural.
7. 7. La composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por: (a) un análogo de la proteína Hin47 de Haemophilus influenzae que tiene una actividad de proteasa disminuida, que es menor a aproximadamente 10% de aquélla de la proteína Hin47 natural, (b) una proteína de adhesina (Hia) de Haemophilus influsnzas de una cepa no tipificable de Hasmophilus influenzae, y (c) una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae .
8. 8. La composición según la reivindicación 7, caracterizada porque las proteínas Hin47, Hia y HMW están presentes en cantidades que no perjudican las inmunogenicidades de las proteínas.
9. 9. La composición según la reivindicación 7 u 8, caracterizada por: (a) 25 a 100 µg del análogo de proteína Hin47, (b) 25 a 100 µg de la proteína Hia y (c) 25 a 100 µg de la proteína HMW.
10. 10. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque el análogo de la proteína Hin47 es uno en donde por lo menos un aminoácido de la proteína Hin47 natural que contribuye a la actividad de la proteasa se ha suprimido o sustituido por un aminoácido y que tiene prácticamente las mismas propiedades inmunogénicas como proteína natural Hin47.
11. 11. La composición según la reivindicación 10, caracterizada porque el al menos un aminoácido se selecciona del grupo que consiste de los aminoácidos 91, 121 y 195 a 201 de la proteína Hin47 natural.
12. 12. La composición según la reivindicación 11, caracterizada porque la Serina- 197 se sustituye por alanina; la Histidina-91 se sustituye por alanina, lisina o arginina o la Asp- 121 se sustituye por alanina.
13. 13. La composición según la reivindicación 12, caracterizada porque la Histidina-91 se sustituye por alanina.
14. 14. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizada porque la proteína Pl3 8 Hia se produce de manera recombinante .
15. 15. La composición según la reivindicación 14, caracterizada porque esa proteína Hia producida de manera recombinante es una rHia con un truncado en V38 en el 5 extremo N terminal .
16. 16. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, caracterizada porque la proteína HMW es una proteína HMWl o HMW2 de una cepa no tipificable de Haemophilus influenzae. 10
17. 17. La composición según la reivindicación 16, • caracterizada porque las proteínas HMWl y HMW2 se producen en forma recombinante .
18. 18. La composición según la reivindicación 16 ó 17, caracterizada porque las proteínas HMWl y HMW2 se 15 derivan de la cepa respectiva de Haemophilus influenzae no tipificable y tienen los pesos moleculares respectivos según se presentan en la siguiente Tabla: Peso molecular (kDa) Cepa Haemophilus influenzae no tipificable • 12 JoyC K21 LCDC2 PMH1 15 Proteína madura: HMWl 125 125.9 104.4 114.0 102.4 103.5 HMW2 120 100.9 111.7 103.9 121.9
19. 19. La composición según cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 18, caracterizada por un adyuvante
20. 20. La composición según la reivindicación 19, caracterizada porque el adyuvante es hidróxido de aluminio P13 8 o fosfato de aluminio.
21. 21. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada además por al menos un componente antigénico adicional que confiere protección contra la infección ocasionada por otro patógeno.
22. 22. La composición según la reivindicación 21, caracterizada porque el componente antigénico adicional se selecciona del grupo que consiste de toxoide diftérico, toxoide tetánico, antígenos de pertussis, PRP-T y poliovirus no virulentos.
23. 23. La composición según la reivindicación 22, caracterizada porque los antígenos de pertussis se seleccionan del grupo que consiste de toxoide de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina y aglutinógenos . P1348