MXPA01007099A

MXPA01007099A - Metodo novedoso para disenar inhibidores de la proteina cinasa.

Info

Publication number: MXPA01007099A
Application number: MXPA01007099A
Authority: MX
Inventors: David G Hangauer Jr
Original assignee: Univ New York State Res Found
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-13
Publication date: 2002-03-27
Also published as: JP2002534132A; ATE494388T1; US7901894B2; EP1147214B1; DE60045474D1; BR0007532A; US20060089401A1; EP1147214A1; EP1147214A4; JP2010279363A; JP4865129B2; AU3208200A; CA2360581A1; WO2000042213A1

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para identificar inhibidores de proteinas- cinasas. Tambien se proporcionan los metodos para inhibir la actividad de la proteina- cinasa. Se proporcionan inhibidores especificos no peptidicos de la proteina tirosina-cinasa. Las proteinas-cinasas producidas utilizando el metodo de la presente invencion pueden ser utilizadas para tratar diversas condiciones en pacientes, incluyendo cancer, psoriasis, artroesclerosis, o actividad del sistema inmune.

Description

MÉTODO NOVEDOSO PARA DISEÑAR INHIBIDORES DE LA PROTEINA CINASA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las cinasas proteicas son una amplia clase de enzimas que catalizan la transferencia del ?- fosfato a partir de ATP al grupo hidroxilo sobre la cadena lateral de Ser/Thr o Tyr en proteínas y péptidos que están íntimamente involucrados en el control de diversas funciones celulares importantes, quizás más notablemente: transducción de señal, diferenciación y proliferación. Se estima que existen alrededor de 2,000 proteínas cinasas en el cuerpo humano (Hunter, 1987, 1994, Hanks & Hunter, 1995), y aunque cada uno de éstos fosforilan sustratos particulares de proteína/péptido, éstos se enlazan al mismo segundo sustrato ATP en un paquete altamente conservado. Los inhibidores de diversas proteínas cinasas conocidas podrían tener una variedad de aplicaciones terapéuticas que proporcionen selectividad suficiente, y propiedades farmacológicas in vivo aceptables, que pueden ser incorporadas en tales inhibidores (Levitzki, 1996a) . Quizás el uso terapéutico potencial más promisorio para los inhibidores de la proteína cinasa es como agentes anticancerosos. Esta aplicación potencial para los Ref: 131236 inhibidores de la proteína tirosina-cinasa ("PTK") ha sido destacado en muchas revistas recientes (por ejemplo Lawrence & Hiu, 1998, Kolibaba & Druker, 1997, Showalter & Kraker, 1997, Patrick & Heimbrook, 1996, Groundwater et al., 1996, Levitzki, 1995). El fundamento para esta aplicación está basado parcialmente en el hecho de que aproximadamente 50% de los productos oncogénicos conocidos son PTKs y se ha mostrado que su actividad de cinasa conduce a transformación celular (Yamamoto, 1993) . Los TPKs pueden ser clasificados en dos categorías (Courtneidge, 1994) , los PTKs receptores de membrana (por ejemplo PTKs del receptor del factor de crecimiento) y los PTKs no receptores (por ejemplo la familia src de los productos proto-oncogénicos) . Existen al menos 9 miembros de la familia src de PTK's no receptores con pp60c"src (de aquí en adelante denominado simplemente como "src") que son el prototipo PTK de la familia en donde aproximadamente 300 dominios catalíticos de aminoácido son altamente conservados (Rudd et al., 1993, Courtneidge, 1994) . La hiperactivación de src se ha reportado en diversos cánceres humanos, incluyendo aquellos del colon (Mao et al., 1997, Talamonti et al., 1993), de mama (Luttrell et al., 1994), de pulmón (Mazurenko et al., 1992), de vejiga (Fanning et al., 1992) y de piel (Barnekow et al., 1987) así como en cáncer gástrico (Takeshima et al., 1991), leucemia de células pilosas (Lynch et al., 1993) y neuroblastoma (Bjelfman et al., 1990). Las señales de la proliferación celular sobre-estimuladas provenientes de los receptores transmembranales (por ejemplo EGFR y pl85HER2/Neu) en el interior de las células también parece pasar a través de src (Mao et al., 1997, Parsons & Parsons, 1997, Bjorge et al., 1996, Taylor & Shalloway, 1996). En consecuencia, recientemente se ha propuesto que src es un objetivo universal para la terapia contra el cáncer (Levitzki, 1996) debido a que su hiperactivación (sin mutación) está involucrada en la iniciación, progresión y metástasis de tumores para diferentes tipos de tumores humanos importantes. En virtud del potencial amplio y cada vez mayor para los inhibidores de diversas proteínas cinasas, se necesita una variedad de procedimientos para obtener inhibidores útiles. El estado del descubrimiento de los inhibidores de PTK (Lawrence Y Niu, 1998, Showalter & Kraker, 1997, Patrick . Y Heimbrook, 1996, Groundwater et al., 1996, Budde et al., 1995, Levitzki & Gazit, 1995) se ha revisado extensamente. Los esfuerzos de selección aleatoria han sido exitosos en la identificación de inhibidores no peptídicos de la proteína-cinasa, pero la gran mayoría de éstos se enlazan en el sitio de enlace al ATP, altamente conservado. Un ejemplo reciente notable de tales inhibidores no peptídicos, competitivos de ATP, son las 4-anilinoquinazolinas, y análogos, los cuales se mostró que son efectivos contra la PTK del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRTK) (por ejemplo Rewcastle et al., 1996). Aunque esta clase de inhibidores se reportó que son selectivos para EGFR PTK versus otros seis PTKs (incluyendo src, Fry et al., 1994) es desconocido cuál de sus efectos está en la mayoría de las 2,000 proteínas cinasas remanentes que se enlazana todas al ATP, así como a un gran número de otros ATP, ADP, GTP, GDP, etc., utilizando proteínas en el cuerpo. Por lo tanto, los efectos colaterales potenciales provenientes de los fármacos inhibidores de PTK que imitan al ATP, que pueden ser sólo descubiertos después de estudios de toxicidad animal, caros, o de pruebas clínicas humanas, son todavía un serio problema. También, aunque esta clase de compuestos fue un buen descubrimiento y está experimentando exploración adicional, éstos no proporcionan una solución racional y general para obtener inhibidores no peptídicos para cualquier PTK deseado, por ejemplo en este caso src. El riesgo de especificidad insuficiente in vivo con los inhibidores de PTK competitivos al ATP también ha sido notado por otros, junto con la reducción inherente de tres órdenes de magnitud en la potencia que estos inhibidores muestran cuando compiten con los niveles rrtM de ATP intracelular en vez de los niveles µM utilizados en los ensayos enzimáticos aislados (por ejemplo ver Lawrence & Niu, 1998, Hanke et al., 1996, Kelloff et al., 1996). Una clase más antigua y más ampliamente estudiada de inhibidores no peptídicos de PTK es erbstatina y la tirfostinas relacionadas (ver revisiones) . Esta clase de inhibidores son activos contra los PTKs receptores y su modo de inhibición es complejo, pero no parece involucrar enlace en las regiones de sitio de especificidad del sustrato peptídico del sitio activo (Hsu et al., 1992, Posner et al., 1994). Además, éstos son inactivos contra el PTK aislado cuando el metal de ensayo Mn2+ no natural se reemplaza con el Mg2+ natural (Hsu et al., 1992) que son químicamente inestables (Budde et al., 1995, Ramdas et 1., 1995 & 1994) , y se sabe que son citotóxicos para las células neoplásicas y normales mediante proteínas de reticulación (Stanwell et al., 1995 y 1996) así como también inhiben el desarrollo celular mediante el rompimiento de las mitocondrias en vez de la inhibición de PTK (burger et al., 1995). Una contribución importante al campo de la proteína-cinasa ha sido el trabajo estructural por rayos X con la proteína-cinasa dependiente de cAMP, serina-cinasa ("PKA") enlazada al péptido de 20 residuos derivado de la proteína inhibidora termoestable, PKI (5-24) , y Mg2ATP (Taylor et al., 1993). Este trabajo estructural es particularmente valioso debido a que PKA se considera que es un prototipo para la familia completa de proteínas cinasas ya que éstas se han desarrollado a partir de una proteína-cinasa ancestral simple. Los alineamientos secuenciales de PKA con otras serinas y tirosina-cinasas han identificado un núcleo catalítico conservado de aproximadamente 260 residuos y 11 residuos altamente conservados dentro de este núcleo (Taylor et al., 1993). Dos residuos altamente conservados de característica particular para el trabajo propuesto en la presente son la base general Asp- 166 que se propone para interactuar con el sustrato OH y el residuo positivamente cargado, Lys-168 para serina-cinasas y un Arg para tirosina-cinasas (Knighton et al., 1993), que se propone para interactuar con el ?-fosfato de ATP para ayudar a catalizar la transferencia de este fosfato. Dos estructuras cristalinas adicionales, importantes, de PKA se han reportado (Madhusudan et al., 1994), una para el complejo ternario PKA:ADP:PKI (5-24) en donde la Ala 21 de PKI se ha reemplazado con Ser (con lo cual llega a ser un sustrato) , y uno para el complejo binario PKA:KI(5-24) en donde Ala 21 de PKI se ha reemplazado con fosfoserina (un inhibidor del producto final) . El complejo ternario muestra que el OH de serina dona un enlace H a Asp- 166 y acepta un enlace H de la cadena lateral de Lys 168. El complejo binario muestra que el grupo fosfato de fosfoserina forma un puente salino con la cadena lateral de Lys-168 y dentro de la distancia del enlace H del grupo carboxilo de Asp-166. Estas estructuras apoyan los papeles propuestos anteriormente para Asp-166 y Lys-168 en el mecanismo catalítico. Las estructuras de rayos X de PKA muestran que la enzima consiste de dos lóbulos, en donde el lóbulo más pequeño se enlaza a ATP y el lóbulo más grande al sustrato peptídico. La catálisis ocurre en la fisura entre los lóbulos. Los estudios estructurales cristalográficos y en solución con PKA han indicado que la enzima sufre cambios conformacionales mayores de una forma "abierta" a la forma catalíticamente activa "cerrada" como se enlaza a los sustratos (Cox et al., 1994) . Estos cambios conformacionales se presume que involucran el límite de la fisura entre los dos lóbulos conforme los sustratos se enlazan llevando ?- fosfato de ATP y la OH de Ser en la proximidad más cercana para la transferencia directa del fosfato. No obstante, los inhibidores de las proteínas cinasas todavía carecen de la especificidad y la potencia deseadas para uso terapéutico. Debido a los papeles clave que juegan por las proteínas cinasas en una variedad de diferentes enfermedades, incluyendo cáncer. Psoriasis, arterioesclerosis, y su papel en la regulación de la actividad del sistema inmune, se necesitan inhibidores de las proteínas cinasas específicas. La presente invención proporciona un novedoso procedimiento para diseñar inhibidores de proteína-cinasa, que son más potentes así como que son más específicos para las vías objetivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para la identificación de inhibidores de proteínas cinasas. Un primer módulo tiene uno o más grupos funcionales para enlazarse a residuos catalíticos de la proteína-cinasa, que se combina con un segundo módulo que proporciona una estructura no peptídica. Se seleccionan combinaciones del primero y segundo módulos que inhiben la actividad de la proteína-cinasa . La presente invención también proporciona un método de inhibición de una proteína-cinasa. La proteína-cinasa se pone en contacto con un compuesto que comprende un primer módulo que tiene una funcionalidad para enlazarse a residuos catalíticos de la proteína-cinasa y un segundo módulo que proporciona una estructura no peptídica. La combinación del primero y segundo módulos inhibe la actividad de la proteína-cinasa.

E3n una modalidad adicional, la invención proporciona un inhibidor no peptídico de la proteína-cinasa, que tiene la fórmula: en donde Ri es H o OH, R2 es H o OH, R3 es OH o H, y R4 es CH3, CH2(CH3)R o CH2(CH3)S, R5 es OCH3, H o OH, R6 es OCH3, F, H o OH, y R7 es OCH3, H, OH, C02H, C02CH3, CH2C02H o CH2C02CH3. La presente invención también proporciona un inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa que tiene la fórmula: en donde Ra. es OH o H, R2 es OH o H, R3 es OH o H, R4 es OH o H, R5 es OH, OMe o H, R6 es OH, OMe o H, R7 es OH, Ome, o H y X es 0 ó 1. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar una condición, que responde a un inhibidor de proteína-cinasa, en un paciente. Se administra un inhibidor de proteína-cinasa a un paciente. El inhibidor de proteína-cinasa tiene un primer módulo que comprende un grupo funcional para enlazarse a los residuos catalíticos de la proteína-cinasa y un segundo módulo que proporciona una estructura no peptídica. La combinación del primero y segundo módulos inhibe la actividad de la proteína-cinasa en el paciente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 describe la estrategia modular para el desarrollo de los inhibidores no peptídicos de la proteína-cinasa. El Paso 1 utiliza uno o más de los primeros módulos ("Mi's") para identificar las estructuras promisorias no peptídicas. El Paso 2 mejora la potencia mediante la adición de elementos de especificidad. Durante este paso, son validadas las estructuras. También puede determinarse si el inhibidor es competitivo para ATP o no. En el Paso 3, la potencia y la selectividad se mejoran además- utilizando bibliotecas de combinación para optimizar Mi y los elementos de especificidad. La Figura 2 proporciona una descripción de la estructura de rayos X de (PKA) :Mg2ATP : inhibidor de pseudosustrato. La Figura 3 proporciona un diseño Mi del módulo general que caracteriza el enlace a la región catalítica de la proteína-cinasa conservada. La Figura 4 muestra que los "inhibidores" de ácido borónico 2_1 y 22^ mostraron ser sustratos para PKA. La Figura 5 demuestra las interacciones de enlace del sustrato src, Ac-Ile-Tyr-Glu-Phe-NH2 en el sitio activo de src modelo. La Figura 6 muestra el diseño de las estructuras del inhibidor src basado en naftaleno. La Figura 7 muestra el diseño de las estructuras del inhibidor src basadas en indol e isoquinolina. La Figura 8 proporciona un ejemplo de la química utilizada para preparar los inhibidores de naftaleno, que se describe en Marsilje 2000. Un grupo funcional ácido borónico puede ser puesto en el lugar de los grupos hidroxilo Mx en los inhibidores src de la Tabla 5, que utilizan la metodología de reticulación catalizada por Pd(0), en donde un triflato de arilo (Ishiyama et al, 1997) o un haluro de arilo (Ishiyama, 1995) puede ser acoplado con el éster de diboro de pinacol comercialmente disponible. La Figura 9 muestra un esquema sintético que puede ser seguido, con el fin de acoplar los elementos de selectividad S2 hidrofóbicos a la estructura de naftaleno. La Figura 10 muestra reacciones modelo exitosas con la química del naftaleno, que puede ser convertido a la fase sólida en la preparación para sintetizar bibliotecas combinatorias de esta estructura en un formato de placa de 96 pozos. Ha sido llevada a cabo la química sobre el regioisómero de naftaleno menos activo representado por 4_4 debido a que este compuesto es fácilmente obtenido del ácido 3 , 5-dihidroxi-2-naftoico comercialmente disponible como se describe en Marsilje 2000. La Figura 11 proporciona una posible estrategia para modificar la estructura de naftaleno en bibliotecas combinatorias . La Figura 12 muestra la conversión del grupo funcional triflato formado en la reacción 2 a partir del intermediario 69 (Figura 11) a una amina (Wolfe et al., 1997) y luego una serie de amidas u otros derivados de amina . La Figura 13 sigue el procedimiento del modelo descrito anteriormente, una serie de análogos que contienen hidroxilo del grupo Mi del ácido borónico mostrado en la Figura 13, fueron modelados en el src y los sitios activos de IRTK (proteína tirosina-cinasa del receptor de insulina) y se encontraron los modos de interacciones/enlace ilustrados como algunas de las posibilidades interesantes. La Figura 14 muestra los resultados de la prueba del inhibidor 4_2 meta de src no peptídico (Tabla V) en las líneas celulares LA25 y NRK. La Figura 15A muestra una comparación de taxol y doxorrubicina (estos fueron más efectivos que el etopósido y cisplatino en este cultivo de células tumorales) con los tres inhibidores src mencionados anteriormente que utilizan células de tumor ovárico proveniente del tumor N015. La Figura 15B muestra los resultados de las pruebas de los inhibidores de src para la inhibición del desarrollo celular de fibroblastos humanos normales. No se encontró inhibición del desarrollo de las células normales (subconfluentes y confluentes; se observó en vez de esto cierto desarrollo mejorado) , indicando que estos inhibidores no son tóxicos para las células normales incluso a una concentración mayor de 10 veces. La Figura 15C proporciona las estructuras de los inhibidores de src, TOM 2-32, TOM 2-47 y KLM 2-31.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para identificar inhibidores de proteína-cinasas . La estrategia modular general para el desarrollo de los inhibidores no peptídicos de PTK se describe en la Figura 1. Básicamente, un primer módulo tiene uno o más grupos funcionales para enlazarse a residuos catalíticos de la proteína-cinasa que se combina con un segundo módulo, el cual proporciona una estructura no peptídica. Posteriormente se seleccionan combinaciones del primero y segundo módulos que inhiben la actividad de la proteína-cinasa. El Paso 1 comienza con la información del inhibidor de la proteína-cinasa que ya fue generado, por ejemplo las estructuras pentapeptídicas que se enlazan en los sitios de especificidad del sustrato de PKA o src que ya han sido utilizados para colocar diversos grupos funcionales diseñados racionalmente (por ejemplo módulo "Mi" o "primer módulo") para interactuar con los residuos catalíticos conservados, MgATP o MgADP . Ha sido identificada ahora una selección de grupos funcionales preferidos de esta manera, para servir como el módulo inicial Mi para el Paso 1. Estos grupos funcionales Mx han sido utilizados para identificar las estructuras promisorias no peptídicas para los inhibidores de src en el Paso 1. Se anticipó que estas estructuras no peptídicas desnudas, únicamente con un apéndice Mi, podrían tener baja afinidad de enlace y ser relativamente no selectivas entre los PTKs. Se observó una falta de selectividad a nivel del Paso 1 como una ventaja para el desarrollo de una estrategia general que pudiera ser reaplicada a PTKs adicionales. Por lo tanto, la serie de estructuras no peptídicas identificadas en el Paso 1 pueden ser recicladas para utilizarse contra PTKs adicionales mediante su reselección y llevando las mejores a los Pasos 2 y 3, utilizando todas el nuevo objetivo PTK. La potencia de estas estructuras desnudas del Paso 1 puede ser incrementada suficientemente por el acoplamiento de uno o dos elementos de especificidad iniciales (Sn) para permitir la validación de la estructura como no competitiva para ATP y capaz de sujetarse a mejoramientos de potencia adicionales utilizando química combinatoria de una manera guiada racionalmente. Las estructuras no peptídicas M2 promisorias para src (segundo módulo) identificadas en el Paso 1 se sujetaron al Paso 2 y mostraron un incremento en la potencia de dos órdenes de magnitud contra src así como enlace no competitivo con relación al ATP. La validación de las estructuras en el nivel del Paso 2 antes de emprender el recurso de la síntesis de biblioteca combinatoria intensiva y la prueba del Paso 3, es importante por tres razones: 1) Para desarrollar la química para anexar las cadenas laterales (Sn del elemento de especificidad. 2) Para determinar que estos inhibidores no son competitivos de ATP. 3) Para determinar que la potencia responde a las propiedades y acoplamiento de la cadena lateral Sn, se señala lo que podría esperarse con base en el modelo de trabajo para los complejos del inhibidor src (esto proporciona algún grado de confianza de que las elecciones guiadas racionalmente pueden ser realizadas para los intervalos de los elementos Sn de selectividad individual, para incluirse en las bibliotecas en cuestión del Paso 3) . En el Paso 3, se indica que la alta potencia y la especificidad para un PTK particular es anticipada debido a numerosas combinaciones de grupos funcionales Mi (y análogos cercanos a Mi1) con elementos de selectividad (Sn) serán evaluados experimentalmente por medio de química combinatoria y selección de alto rendimiento. La potencia y la selectividad pueden además incrementarse si es necesario por medio de la anexión de elementos de especificidad adicionales (ver Sn's opcionales en la Figura 1) . Una de las estructuras seleccionadas del inhibidor de src del Paso 2 ha sido ya acoplada a una resina de fase sólida y está actualmente siendo desarrollada en una genoteca combinatoria después del Paso 3.

En cada uno de los Pasos 1-3, estudios de modelación molecular con la estructura cristalina IRTK: péptido:AMP-PNP, el modelo del complejo src:péptido y los modelos para los complejos de src con las familias individuales de inhibidores basadas en una estructura particular, serán utilizados como guías cualitativas. Estos estudios de modelación han sido notablemente útiles hasta ahora al guiar los esfuerzos de diseño de inhibidores como se detalla más adelante. La combinación de diseño basado en estructura y tecnologías de química combinatoria de esta manera proporciona una sinergia en donde las deficiencias individuales mayores de estas tecnologías usadas aisladas, están dirigidas por las fortalezas de las otras. La deficiencia mayor del diseño basado en la estructura es la dificultad para predecir cuantitativamente afinidades de enlace al ligando, lo cual es particularmente un reto debido a los efectos complejos de solvatación y entropía (Ajay & Murcko, 1995) . La principal fuerza del diseño basado en estructura es su capacidad para predecir qué tipos de moléculas son similares a buenos ligandos. El diseño basado en la estructura puede determinar los límites aproximados (proteínas que tienen algo de flexibilidad que se necesita para ser tomadas en cuenta) para el tamaño y forma moleculares indicar dónde es probable que ocurran interacciones de enlace con hidrógeno hidrofóbicas y iónicas. Por otro lado, la mayor deficiencia de la química combinatoria es que "el espacio molecular" para las moléculas de tamaño de fármaco por ejemplo peso molecular de aproximadamente 500 o menor) es tan grande que no se podría esperar tomar muestras de todo este espacio molecular con una alta densidad de cobertura en una genoteca combinatoria de tamaño razonable. Un estimado reciente (Bohacek et al, 1996) del número de posibles compuestos que contienen hasta 30 átomos elegido únicamente de carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre (además de los hidrógenos) es 1060 compuestos. Esto está en el intervalo de peso molecular de las moléculas de fármacos típicas y todavía no incluye diversidad adicional proporcionada por otros átomos, por ejemplo halógenos. En consecuencia, constreñimientos adicionales necesitan ser utilizados para identificar regiones de espacio molecular en donde los candidatos particulares de fármacos sean probablemente localizados. El diseño basado en la estructura puede drásticamente reducir el volumen del espacio molecular a ser explorado por medio de la identificación de los tipos de moléculas que tienen una alta probabilidad de ser buenos ligandos. La incapacidad para predecir cuantitativamente cuáles de estos miembros de genoteca combinatoria "enfocados" serán de hecho los ligandos de enlace más apretado (por ejemplo el problema de cuantificación) es luego resuelta mediante el empleo de una síntesis combinatoria eficiente y prueba de alto rendimiento de la biblioteca. En los esfuerzos de diseño de inhibidor de serina y tirosina-cinasa basado en el péptido anterior, se utilizó PKA como un modelo cualitativo conveniente para diseñar el módulo Mi de inhibidor de la proteína-cinasa para la interacción con los residuos catalíticos conservados. Existe mucha más información estructural y cinética disponible para PKA que para cualquier otra proteína-cinasa. Ha sido resuelta la estructura cristalina cristalina de PKA en complejo con Mg2ATP y un inhibidor peptídico de pseudosustrato (por ejemplo OH reemplazado con H) (PKI 5-24 amida) (Zheng et al., 1993) y las interacciones del sitio activo cercanas a P 0 Ala de este inhibidor se muestran en la Figura 2. Esta estructura cristalina muestra que Mg2ATP se enlaza al lóbulo más pequeño de PKA y a un inhibidor peptídico de pseudosustrato de 20 residuos que se enlaza al lóbulo grande con la conformación total de la enzima en el estado activado y cerrado (por ejemplo los dos lóbulos se tocan) . Las distancias entre el carbono de cadena lateral P 0 Ala y los átomos pesados próximos en el complejo se muestran en Á en la Figura 1. Estas distancias muestran que la cadena lateral Ala está dentro de la distancia de contacto de van der Waals de los átomos circunvecinos e indican que existe un pequeño espacio para anexar grupos funcionales Mi voluminosos a la cadena lateral Ala. No obstante, PKA es una enzima flexible con conformaciones abierta, cerrada e intermedia (Cox et al., 1994) y estas conformaciones más abiertas podrían dar como resultado una retracción del ?- fosfato de ATP a partir del inhibidor Ala, con lo cual se crea una cavidad de enlace para anexar grupos funcionales Mi . Además, PKA se enlaza a MgADP con la misma afinidad que MgATP (Whitehouse et al., 1983) y la proporción de ATP/ADP en células es típicamente de 10/1 (Alberts, et al., 1994) . Por lo tanto, en el equilibrio, aproximadamente 10% de la proteína-cinasa celular está en el estado enlazado al MgADP y esta forma de la enzima puede también ser dirigida con un inhibidor para drenar toda la enzima a partir del ciclo catalítico en un complejo inactivo PKA :MgADP : inhibidor . Ya que los residuos catalíticos de PKA Asp-166 y Lys-168 son completamente conservados en todas las serinas-cinasas y las tirosinas-cinasas únicamente difieren por la sustitución de Arg por Lys-168 (Taylor et al., 1993), esta región del sitio activo fue elegida, junto con las de MgATP o MgADP anexas, para dirigir una selección de grupos funcionales inhibidores que pudieran servir como Mi y ser ampliamente útiles para desarrollar inhibidores para la familia completa de la proteína-cinasa. Al dirigir Mi a la región del sitio activo adyacente al nucleótido, se proporciona un punto de orientación para los inhibidores no peptídicos que pueden extenderse en los sitios de especificidad de enlace del péptido, sin competir siempre con el enlace ATP/ADP. Una selección de grupos funcionales que podrían ser utilizados como Mi fue identificada primero porque, aunque esta región del sitio activo es muy altamente conservada, se esperaba que cada proteína-cinasa particular todavía mostrara algunas preferencias de diferenciación a través de esta selección, debido a pequeñas variaciones en las conformaciones de sitio activo y los residuos anexos. Además, la preferencia del orden de rango entre esta selección de Mx ' s puede cambiar un poco conforme el módulo Mi se anexa a diferentes estructuras no peptídicas. Esta expectativa está basada en el potencial para cada estructura no peptídica de enlazarse en cierto grado a orientaciones diferentes con cada proteína-cinasa individual y con cada grupo particular de cadenas laterales (Sn) de elementos de selectividad. Las estructuras pentapeptídicas fueron elegidas para la selección inicial de grupos funcionales para Mx debido a que la orientación de enlace de estas estructuras de péptidos grandes es probable que sea muy consistente y predecible (por ejemplo casi semejante a la que se observó mediante rayos X) a todo lo largo de la serie y podría ser asumida más confianza a la posición de cada funcionalidad Mi probada, adyacente a los residuos catalíticos conservados como se pretende. En consecuencia, la meta de este trabajo previo basado en péptido fue identificar una colección de grupos funcionales Mi que pudieran ser utilizados, no solamente para la selección inicial de las estructuras no peptídicas (Paso 1) , sino también como un grupo inicial de cadenas laterales de Mi que pudieran ser adicionalmente expandidas vía análogos cercanos y con lo cual ser optimizados simultáneamente con las otras cadenas laterales en las bibliotecas combinatorias finales no peptídicas (Paso 3). Con el fin de modelar los grupos funcionales Mi candidatos en esta región catalítica conservada del sitio activo de PKA, éstos fueron constituidos sobre la posición P 0 Ala en la estructura ternaria PKA utilizando el paquete de modelación molecular SYBYL (Tripos) sobre una estación de trabajo Silicone Graphics como se indica en la Figura 3. Una estructura cristalina de PKA con MgATP y un inhibidor enlazado en una conformación más "abierta" no estuvo disponible, de modo que los estudios de modelación inicial se llevaron a cabo sobre la forma enlazada a MgADP de PKA derivado de complejos ternarios ilustrados en la Figura 2, simplemente al suprimir el ?-fosfato de ATP. Estudios de modelación inicial fueron utilizados para proporcionar guía cualitativa para identificar grupos funcionales Mi potencialmente interesantes para la familia de proteína-cinasa antes de la síntesis y la prueba. Los algoritmos computacionales más avanzados para predecir cuantitativamente la energía libre de enlace, tales como métodos de Perturbación de Energía Libre, son métodos computacionalmente intensos que no son prácticos actualmente para utilizarse en forma rutinaria por los no especialistas. Incluso los métodos más avanzados pueden ser inadecuados debido a las dificultades para tomar las muestras, problemas en los campos/parámetros de fuerza mecánica molecular, y una comprensión incompleta de la electrostática en agua (Ajay & Murcko, 1995) . Los métodos computacionales menos rigurosos (y más fáciles de utilizar) tienden a ser de poca confianza en la elaboración de predicciones cuantitativas de afinidades de enlace, especialmente cuando tratan con interacciones polares y iónicas múltiples tales como aquellas involucradas en el enlace de Mi. Con el fin de permitir que sean realizados cálculos mecánicos moleculares con la estación de trabajo Silicone Graphics en un tiempo razonable, se separaron dos capas de residuo de la estructura ternaria PKA, los cuales están rodeando el sitio activo PKA, junto con el inhibidor peptídico y MgADP. Los grupos funcionales Mi fueron luego anexados a la cadena lateral P 0 Ala y al complejo inhibidor completo de sitio activo PKA :Mg2ADP: péptido modificado fue sujeto posteriormente a 300 repeticiones de minimización mecánica molecular utilizando el campo de fuerza Tripos con una constante dieléctrica dependiente de la distancia, después de asignar las cargas formales apropiadas y calcular las cargas del punto Gasteiger Marsili utilizando SYBYL. Ajustando el número máximo de iteraciones a 300 fue suficiente para eliminar cualquier cepa verdadera en los complejos y más aún no permitir que la estructura completa se desplace significativamente de la estructura inicial de rayos X si no se alcanza la convergencia. Estos complejos minimizados fueron luego visualmente evaluados para determinar si los grupos funcionales Mi individuales anexos eran capaces de acoplarse en interacciones favorables con los residuos catalíticos conservados y/o Mg2ADP. Esta evaluación visual involucró, entre otras evaluaciones de interacción estándares, la medición de las distancias átomo-átomo para determinar si los enlaces de hidrógeno y las interacciones iónicas estaban siendo formadas favorablemente.

Las interacciones intermoleculares favorables entre una funcionalidad Mx individual y los residuos catalíticos conservados o Mg2ADP no significa necesariamente que será observada afinidad de enlace mejorada para el nuevo inhibidor. En este análisis no se incluyen la desolvatación desfavorable de la funcionalidad polar Mi y los residuos del sitio activo PKA polares (así como los efectos de entropía de los complejos) , y se puede reducir la afinidad de enlace neta hasta el punto en que el inhibidor modificado puede incluso ser menos potente que el inhibidor P 0 Ala correspondiente, aun cuando la funcionalidad Mi anexa esté interactuando con los residuos catalíticos conservados y/o MgADP (o MgATP) como se pretende. Aún en los casos donde esta penalidad por desolvatación no dé como resultado incremento en la afinidad de enlace, estos grupos funcionales Mi todavía son útiles como grupos de orientación para colocar correctamente los análogos inhibidores no peptídicos en el sitio activo de la proteína-cinasa. La colocación de estos grupos funcionales polares donde sea dentro del sitio activo (asumiendo que éstos están trabados como para no ser capaces de extenderse dentro del solvente a granel mientras que la estructura se enlaza favorablemente en el sitio activo) es similar al resultado en una afinidad de enlace reducida debido a que éstos fueron específicamente diseñados y seleccionados con base en su habilidad demostrada (mientras se enlazan apropiadamente a las estructuras pentapeptídicas) para ser aceptados adyacentes a los residuos catalíticos conservados y MgADP/MgATP. Si una • funcionalidad Mi particular no coloca correctamente una estructura no peptídica en el Paso 1, entonces los intentos para mejorar la potencia mediante la anexión racionalmente de los elementos de especificidad inicial en el Paso 2, podrían probablemente fallar. Ninguno de los procedimientos de la literatura de ensayos de la proteína-cinasa contiene ADP agregado. Un procedimiento de ensayo en la literatura de PKA típico (Glass et al., 1989) fue modificado mediante la adición de 10% a lo máximo de ADP como la concentración de ATP utilizada para reflejar la proporción 1/10 natural en la célula. Este ensayo de la proteína-cinasa se denomina en la presente como al ensayo de "Imitación de la Literatura". Este ha sido utilizado para PKA así como para src. Un examen de la literatura, y ensayos comercialmente disponibles de la proteína-cinasa, mostraron que existe deficiente consistencia de laboratorio a laboratorio y de compañía a compañía, y que todos estos ensayos utilizan condiciones fisicoquímicas que difieren considerablemente de aquellas conocidas que existen dentro de las células. Ya que la inhibición de las proteínas-cinasas intracelulares es la última meta para el descubrimiento de fármacos, han sido desarrollados nuevos ensayos de la proteína-cinasa los cuales se acercan cada vez más para imitar las condiciones fisicoquímicas citosólicas totales conocidas, que existen dentro de las células. El desarrollo de estos ensayos de la proteína-cinasa "Miméticos Celulares", se describen en la presente, junto con un novedoso método para determinar cuál forma de una proteína-cinasa se enlaza mejor a un inhibidor dado (el método STAIRe) . Los datos se recolectaron correlacionando la actividad de los nuevos inhibidores no peptídicos src en los ensayos Miméticos Celulares con aquella obtenida en la línea celular transformada de src, LA25 (ver más adelante) . Cuando fueron aplicadas estas dos condiciones de ensayo a algunos de los inhibidores de PKA basados en pentapéptidos, las cuales fueron diseñadas como se ilustra en la Figura 3, fueron obtenidos los resultados que se muestran en la Tabla 1. Las mismas condiciones de ensayo también fueron aplicadas a los inhibidores de src basados en pentapéptidos similarmente diseñados y los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2. La secuencia de pentapéptido estándar elegida para la mayoría de los inhibidores de PKA en la Tabla 1, se derivó de la secuencia pseudosustrato del inhibidor peptídico que se enlazó a PKA, cuando la estructura cristalina ilustrada en la Figura 1 fue resuelta. La secuencia pentapeptídica estándar utilizada para src en la Tabla 2. Ac-Ile-AA-Gly-Glu-Phe-NH2, se describe en Nair, Kim et al., 1995. Un poco de la química utilizada para preparar los inhibidores de PKA se describe en Nair, Lee & Hangauer 1995. La metodología sintética utilizada para desarrollar un número de los inhibidores de src se describe en Lai et al . , 1998. Los resultados colectivos en las Tablas 1 y 2 muestran que PKA de la serina cinasa y el src de PTK pueden acomodar una variedad de grupos funcionales Mx polares grandes en la posición de fosforilación P 0. Además, utilizando la metodología STAIRe (ver Choi et al., 1996), el inhibidor 8^ de ácido sulfónico y los inhibidores relacionados, se mostró que actualmentese enlazan mejor cuando se enlaza también MgATP (no MgADP ni otro nucleótido) . Este resultado fue algo sorpendente, ya que estos inhibidores son análogos de los "inhibidores de producto final" 1 y lj2, los que se deben enlazarse simultáneamente con MgADP justo después de la transferencia de fosfato en el mecanismo de reacción generalmente aceptado para las proteínas-cinasas. Estos resultados también demuestran que PKA y src pueden mostrar una gran diferencia en la afinidad de enlace para inhibidores estructuralmente muy similares. Por ejemplo, el inhibidor 8 de PKA de ácido sulfámico (Tabla I) tiene un K;L de 0.16 µM bajo condiciones de ensayo Miméticas de la Literatura (L) mientras que la sulfonamida 7 isostérica es 1,875 veces menos potente (K?=300 µM) . El inhibidor 8 de ácido sulfámico también es isostérico con el inhibidor 1 de fosfato de producto final que todavía se enlaza mucho más estrechamente bajo condiciones de ensayo de Mimético de la Literatura (31 X) y condiciones de ensayo de Mimético Celular (C) (108 X) . El efecto benéfico de un átomo de oxígeno colocado de manera similar a aquella en el sustrato Ser se ilustra por comparación del fosfonato 2 al fosfonato 1 y también del éter 6 al fosfato 1_. Este átomo de oxígeno también puede ser colocado como una cadena lateral OH similar a serina y mejorar el enlace (comparar 2 a 3A y a 4A) en donde el 4A mimético más cercano a la serina es el más activo. La diferencia en la actividad de los inhibidores 3A o B diastereoisoméricos y 4A o B sugiere una interacción específica con el residuo catalítico del sitio activo Asp- 166 puede de hecho aparecer como se pretende en el diseño de Mi (Figura 3) .

Tabla 1 RESULTADOS DE SELECCIÓN DE Mi INICIAL MIENTRAS SE ANEXA A LA ESTRUCTURA PENTAPEPTIDICA PKA M, H02C.

Los resultados de inhibición de src (Tabla II) muestran que el inhibidor 12 de producto final desciende en actividad después de ir de las condiciones de ensayo Mimético de la Literatura a las condiciones de ensayo Mimético Celular de fuerza iónica más alta, análoga a las de inhibidor 1_ de producto final PKA. No obstante, mientras que todos los inhibidores de PKA con grupos funcionales Mi polares fueron menos activos bajo condiciones de ensayo Mimético Celular, tres de los inhibidores src 14_, 1_5 y 1_7 mantuvieron su actividad bajo estas condiciones de ensayo de fuerza iónica más alta. También, el inhibidor 13_ de src de hidroxifosfonato (una mezcla de los diastereoisómeros R y S) es análogo al inhibidor 3A de PKA y ambos son aproximadamente del mismo intervalo de actividad que sus inhibidores 2_ y 1 de producto final correspondientes, respectivamente, bajo condiciones de ensayo Mimético de la Literatura. Acortando la longitud de la cadena lateral en el inhibidor 13 de src fosfonato mediante un átomo de carbono (y eliminando necesariamente el OH acoplado al mismo tiempo) para dar 14, mejoró la actividad (análoga a la comparación 3 a 4 del inhibidor de PKA) y, de manera más importante, dio como resultado actividad equivalente bajo condiciones de ensayo Mimético Celular. Los resultados de src con 16-19 (particularmente 17, ver más adelante para un análogo de ácido a-tricarbonílico Mi análogo anexo a los inhibidores de src no peptídicos) también sugiere que las amidas similares pueden ser grupos funcionales Mi útiles para explorar con inhibidores no peptídicos. Los inhibidores de src no peptídicos son preferidos a los compuestos basados en estructura peptídica, parcialmente debido a que estos inhibidores tienen un efecto doble sobre src. Por ejemplo, el inhibidor 4 de fosfonato no solamente inhibe src mediante enlace competitivo en el sitio activo sino que también activa src mediante el enlace al sitio SH2, con lo cual se libera el mecanismo de autoinhibición intramolecular (Xu et al., 1997) . Este efecto opuesto da una curva de IC50 inusual para 14_, en donde se estimula src a concentraciones bajas del inhibidor (hasta un máximo de 70%) de una manera leve dosis-respuesta (debido al enlace a SH2 más estrecho inicial) seguido por una curva de inhibición de IC50 típica a concentraciones de inhibidor superiores (debido al bloqueo de afinidad inferior del sitio activo) . Este efecto de activación opuesto de los inhibidores pentapeptídicos los hace parecer inhibidores menos potentes del sitio activo que lo que en realidad son, y hace difícil calificar de manera precisa los grupos Mi mientras se anexa a esta estructura pentapeptídica . No obstante, los mejores grupos Mi identificados con la estructura pentapeptídica de src deben todavía ser acomodados en la región catalítica del sitio activo y por lo tanto son útiles grupos de orientación para el progreso de los estudios del inhibidor de src no peptídicos como se pretende. Ya que PKA no tiene un dominio de SH2, esta complicación no es un factor para interpretar los datos de la preuba de Mx inhibidor pentapeptídico de PKA.

Tabla II RESULTADOS DE SELECCIÓN DE Mx INICIAL AL TIEMPO QUE SE ANEXA A LA ESTRUCTURA PENTAPEPTIDICA DE SRC % de inhibición de la fosforilación de AC-lle-NH _ay-Giu-pr-e-NHa RR-src 2 mM Por src- o Condiciones de ensayo Inhibidor (1 mM) Mimético de Mimético Celular Literatura O W OH 36 0 12 Mi = O- P? OH O ^ OH 51 13 Mi = HC—P^ / \ OH OH OH OH 0 \. OH 83 88 14 Mi P \ OH 15 Mi = C 68 59 \ OH 0 17 Mi = NH- ^ 0 20 28 0 18 Mi = NH— '( 0 64 HO OH 0 19 Mi = NU- 0 24 \ H,N OH Los resultados en las Tablas 1 y 2 también muestran qué tanto efecto pueden tener las condiciones de ensayo sobre las potencias del inhibidor y el orden de rango de la actividad. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1, cambiando las condiciones de ensayo Mimético de la Literatura (L) a las condiciones de ensayo Mimético Celular (C) se puede cambiar la potencia tan baja de tres veces (inhibidor 1_0) a tan alta como 108 veces (inhibidor 1) . También, puesto que el inhibidor lfJ es menos potente que el 1 bajo las condiciones de Mimético de la Literatura, éste es más potente bajo condiciones Miméticas Celulares. Los datos del inhibidor src, presentados en la Tabla 2 muestran que muchos de los inhibidores pierden su potencia después del progreso de las condiciones de ensayo Mimético de la Literatura a condiciones de ensayo Mimético Celular. El orden de clasificación de la potencia contra src es también sensible a las condiciones del ensayo. Puesto que el inhibidor 18 es más potente que el inhibidor 17 bajo condiciones Miméticas de la Literatura, lo opuesto es verdad bajo condiciones Mimético Celulares. Ya que la actividad dentro de las células es la meta, los ensayos de src Mimético Celular se seleccionaron como el ensayo estándar para probar los inhibidores src no peptídicos potenciales. La actividad dentro del ensayo Mimético Celular es una condición necesaria, pero no suficiente, para la actividad dentro de las células. Como se describirá más adelante, el ensayo de src Mimético Celular será seguido por los ensayos de cultivo celular en donde la penetración celular, el metabolismo y el enlace a otros componentes celulares, también son factores en la potencia medida. La siguiente clase de funcionalidad Mi que fue explorada, fue el grupo de ácido borónico. Este grupo funcional es un candidato interesante para Mi, por diversas razones: 1) Este puede existir en un estado no iónico, de modo que no debería prevenir la absorción pasiva de los inhibidores no peptídicos a través de las membranas celulares. 2) Los ácidos borónicos trigonales, planos, pueden formar complejos de borato covalente tetraédrico reversible (una buena propiedad conocida de los ácidos borónicos, ver Loomis & Durst . , 1992) a través de sus orbitales 2p vacantes con aniones presentes en el sitio activo de la proteína-cinasa tales como el grupo carboxilo Asp catalítico o los oxígenos del fosfato terminal de ATP/ADP. Esta habilidad para formar complejos de borato con nucleótidos del sitio activo ha sido extensamente utilizada para desarrollar inhibidores de enlace lento de serina-proteasa (ver por ejemplo Kettner & Shenvi, 1984), en donde el OH de la serina nucleotídica forma un enlace covalente con el orbital 2p vacante en el ácido borónico, dando como resultado complejo de borato tetraédrico (por ejemplo ver Skordalakes et al., 1997). También, un complejo intramolecular de un ácido borónico con un NH2 de la urea fue utilizado para preparar los inhibidores de análogos de estado de transición de dihidroorotasa (Kinder et al., 1990) . 3) . Los ácidos borónicos actúan como los ácidos de Lewis y son convertidos a hidratos tetraédricos en agua, mediante la formación de complejos de borato con agua o iones hidróxido. Por lo tanto, también es posible que estos hidratos de ácido borónico puedan funcionar como imitaciones de fosfato y Mx modula como se propone en la Figura 2. Esta propiedad de hidratación fue utilizada por Baggio et al. (1977) en donde un ácido borónico hidratado funcionó como una funcionalidad de inhibidor análogo de estado de transición para la arginasa. Estos hallazgos evaluaron el complejo inhibido mediante rayos X y mostraron que la funcionalidad de ácido borónico hidratado formó dos enlaces hidrógeno con la cadena lateral carboxilo de Glu-277 catalítica del sitio activo y uno de los otros OH de ácido borónico hidratado interactuó con dos Mn2+ catalíticos en el sitio activo. Estas interacciones de enlace son muy similares a aquellas propuestas en los sitios activos de la proteína-cinasa, por ejemplo los enlaces H al grupo carboxilo de cadena lateral de Asp catalítico y las interacciones con los Mg2 ' s del sitio activo (ver Figura 2) , y 4) . El uso de los ácidos borónicos para inhibidores de la proteína-cinasa no se ha explorado previamente. En el área de los inhibidores de PKA basados en pentapéptido, el grupo funcional ácido borónico ha sido preparado y probado como un módulo Mi potencial utilizando los cuatro inhibidores 2_l-2_4 mostrados en la Tabla III (ver Hsiao & Hcingauer, 1998, para algo de la química utilizada para preparar estos compuestos) .

Tabla III 24 1000 µM 1000 µM 44% 2000 µM 6% 1734 µM 33% inh inh sti * Curva de IC50 distorsionada: Sugiere que el Inhibidor es también un sustrato. L = Condiciones de Ensayo de Mimético de Literatura C = Condiciones de Ensayo de Mimético Celular Inh = Inhibición Sti = Estimulación Al tiempo que se prueban estos inhibidores de PKA que contienen ácido borónico, el inhibidor 2_0 de pseudosustrato pentapeptídico correspondiente, fue incluido como un control interno mientras se investigaba la inhibición dependiente del tiempo como se muestra en la Tabla 3. Bajo condiciones de ensayo Mimético de la Literatura, y sin preincubación, los resultados iniciales sugieren que el L-aminoácido 2 _ de cadena más corta se enlazó con la misma afinidad que el inhibidor 2_0 de pseudosustrato (por ejemplo, Ki aproximadamente 9 µM) . Conforme esta cadena lateral se incrementó en su longitud (a 2_3 y luego a 24) la afinidad de enlace pareció disminuir. Cuando la estereoquímica del aminoácido no natural se invirtió de L en 2\_ a D en 22^, la afinidad de enlace pareció incrementarse 3 veces. Este mejoramiento en el enlace puede ocurrir como resultado de que el OH del ácido borónico en 2_1 está colocado en la misma longitud de la cadena como L-homoserina mientras que el sustrato natural, L-serina, tiene una cadena lateral de carbono más corta. Los resultados del modelo con la estructura ternaria PKA indicaron que el OH de ácido borónico puede ser retraído un poco mediante la inversión de la estereoquímica del a-carbono a partir de L en 2_1 hasta D en 22 , y luego volviendo a colocar la cadena lateral para imitar más estrechamente la posición del OH de L-serina sustrato natural, adyacente a los residuos catalíticos (Asp- 166 y Arg- 168) . Los resultados de la modelación fueron subsecuentemente soportados por el hallazgo de que, después de la incubación de PKA con estos inhibidores por hasta 4 horas sin adición del sustrato peptídico competente (Kemptamide: LRRASLG-NH2) , 21 y 22 funcionan como sustratos con el d-diastereoisómero 2_2 que es fosforilado más rápido. El hecho de que estos inhibidores de ácido borónico son también sustratos, vino a ser más obvio por las curvas de IC50 grandemente distorsionadas bajo las condiciones Miméticas Celulares, con y sin preincubación (PKA y src son enzimas más activas bajo las condiciones Mimético Celulares que bajo las condiciones Miméticas de la Literatura) . En el ensayo utilizado para obtener estos resultados, el producto de Kemptamida fosforilado P32 (25 generado a partir de ?-P32 ATP) fue aislado al final del periodo de incubación del sustrato mediante el enlace a papel filtro de fosfocelulosa por medio de los tres grupos catiónicos (dos Arg'2 y el extremo N) y el nivel del producto fosforilado aislado sobre el papel se midió luego mediante conteo de cintilación líquida (cpm's). Los inhibidores 21 - A_ de ácido borónico que tienen dos Arg ' s en su secuencia también y por lo tanto se enlazarán al papel de fosfocelulosa además de a la Kemptamida (aunque no tan consistente o completamente, debido a una menor carga positiva) . En consecuencia, cuando se analicen como inhibidores, la cantidad de kemptamida fosforilada producida fue no solamente contada, sino también la cantidad de inhibidor fosforilado simultáneamente producido (por ejemplo ver 2_6 más adelante) . El siguiente resultado es que se obtienen las curvas IC50 distorsionadas, las cuales muestran "estimulación" neta a concentraciones de inhibidor más altas en algunos casos. El diastereoisómero 22 D da la "estimulación" aparente más grande (71%) cuando se preincuba con PKA por 4 horas bajo condiciones de Mimético Celular seguidas por el diastereoisómero 21 (19%) y luego con un homólogo de carbono 23_ (5%) indicando los tres sustratos para PKA (Tabla III) . El comportamiento del sustrato subyacente de estos "inhibidores" hace imposible una medición precisa de su potencia de inhibición con el ensayo actual. No obstante, esto surge de los datos de que homologando el grupo funcional ácido borónico únicamente con los grupos CH2 (también se pueden llevar a cabo homologaciones con inhibidores src no peptídicos de ácido borónico) disminuye la afinidad de enlace y la habilidad para funcionar como un sustrato.

Kemptamida fosforilada Comparar con 26 Fosforilada 22 Los "inhibidores" 271 y 22^ de ácido borónico mostraron ser sustratos para PKA al correr el mismo ensayo, pero sin agregar kemptamida, y deteniendo la reacción en diversos puntos de tiempo como se muestra en la Figura 4. las gráficas muestran sus respectivas velocidades y niveles de fosforilación con la pérdida típica de las cinéticas de velocidad inicial con el tiempo (debido a la supresión del sustrato y a la inhibición del producto final) , de manera análoga a un sustrato L-Ser estándar tal como Kemptamida. La comparación de 2_1 a 2 mostrada se realizó en la misma corrida de ensayo, a idénticas concentraciones del sustrato de ácido borónico y con soluciones idénticas del ensayo Mimético Celular, de modo que las cpm's podrían compararse directamente. Las gráficas muestran que las condiciones de velocidad inicial se perdieron dentro de una hora para el D- isómero 22^ mientras que la linearidad pareció haberse perdido algo más lento con el L-isómero 271 , sugiriendo un consumo más lento del material inicial . Fue sorprendente que- la porción de ácido borónico pudo ser fosforilada por PKA, pero fue aún más sorprendente que el anhídrido mixto de ácido fosfónico-borónico producido (por ejemplo 2_6) , fue estable lo suficiente para sobrevivir la incubación del ensayo a pH 7.2/37°C y luego fue aislada mediante el enlace a papel de fosfocelulosa después de apagar con ácido la reacción con TCA al 10% y lavar el papel de fosfocelulosa con ácido fosfórico 25 mM (3X) . Un examen de la subestructura STN se corrió sobre anhídridos mixtos de ácidos fosfórico y borónico y se encontraron únicamente tres referencias a los experimentos para el anhídrido putativo análogo (pero no probado) , formado a partir de ácido fosfórico y bórico como un catalizador impregnado a la superficie sólida para la oxidación parcial de etano a acetaldehído a 823 °K (Zhanpeisov S Otsuka, 1992, Otsuka et al., 1992,, Murakami et al., 1990). Sin embargo, este anhídrido altamente inusual nunca ha sido antes sintetizado libre de una superficie sólida, aislado o caracterizado. De este modo, ésta es una novedosa reacción enzimática y entidad química con interesantes posibilidades para diseños de inhibidor de proteína-cinasa.

Las evaluaciones de Mx trabado a la estructura pentapeptídica de PKA y src, descritas anteriormente, han dado como resultado la identificación de una variedad de grupos Mi de orientación que podrían ser utilizados para estructuras no peptídicas potenciales de selección, como se indica en el Paso 1 (Figura 1) . El ácido borónico (proveniente de 227) , el fosfonato (proveniente de 1^) , y el ácido sulfámico (proveniente de 8 ) fueron inicialmente elegidos del menú como Mx ' s potenciales para la selección de la estructura no peptídica de src. Entre estas selecciones, el grupo Mi de ácido borónico ha probado ser efectivo para la selección en el Paso 1 de las estructuras no peptídicas. Las estructuras cristalinas más útiles, disponibles para el diseño de los inhibidores de src no peptídicos, que no compiten con ATP, son la estructura nativa src y la estructura ternaria IRTK: péptido:AMP-PNP. Para todos los estudios de modelación discutidos más adelante, el paquete de software de modelación molecular SYBYL se utiliza sobre una estación de trabajo Silicone Graphics . Ya que las estructuras IRTK y src se utilizan únicamente como guías cualitativas en el diseño de las bibliotecas combinatorias y de estructuras no peptídicas, los sitios activos junto con las dos capas de residuos circunvecinos fueron separados de las estructuras ternarias IRTK y src nativo, de manera análoga a los estudios de modelación de PKA previos. La región del sitio activo de la estructura ternaria IRTK:péptido :AMP-PNP, se utilizó como una estructura plantilla para guiar la construcción de la secuencia de residuos de src 424-428 detrás de la estructura src utilizando la técnica de modelación de homología comparativa (ver Hutchins & Greer, 1991) . Estos residuos fueron desordenados en la estructura cristalina nativa de src y por lo tanto no fueron visibles mediante rayos X. Estos fueron reintroducidos debido a que ayudan a formar los sitios de enlace P+l a P+3 para los sustratos peptídicos que son importantes para algunos de los estudios de modelación. Los residuos análogos en la estructura ternaria IRTK se observan mediante rayos X y directamente interactúan con el sustrato peptídico enlazado. De hecho, es probable que la presencia del sustrato peptídico enlazado induzca orden en la colocación de esta secuencia de modo que sea visible mediante rayos X. El sustrato pentapeptídico src, Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2 (Nair et al., 1995) fue luego acoplado en el sitio activo de src nuevamente utilizando la estructura ternaria IRTK como una plantilla. Ajustes pequeños fueron realizados manualmente para limpiar parcialmente este complejo, fueron agregados todos los átomos de hidrógeno, fueron agregadas cargas formales y parciales apropiadas (calculadas por medio del método Gasteiger Marsili) , y luego el complejo completo se sujetó a 300 iteraciones de minimización mecánica molecular utilizando el campo de fuerza Tripos, análogo al procedimiento, de modelación previo de PKA. Una representación esquemática de este complejo modelado se da en la Figura 5. Cualesquiera imprecisiones en estos modelos de src:péptido y src : inhibidor son ajustadas al evaluar experimentalmente un rango de cadenas laterales, el número y diversidad de los cuales se lleva a escala aproximadamente al nivel de incertidumbre para la estructura de su región de enlace particular en el sitio activo de modelo src (ver más adelante) , de una manera combinatoria. Como se muestra en la Figura 5, los residuos 424- 418 construidos en el src, interactúan con los residuos de sustratos P+l a P+3, Gly-Glu-Phe-NH2 respectivamente, a través de las interacciones de enlace tipo hidrógeno de lámina beta con la cadena principal del sustrato (análoga al sustrato peptídico IRTK) . Lys 423 se acopla en dos interacciones importantes: 1) La ß y ? CH2 ' s plegados sobre la parte superior del anillo de fenilo P O Tyr, que se acopla en dos interacciones de enlace hidrofóbico y luego 2) el CH2-CH2-NH3+ remanente de esta cadena lateral se extiende para formar un puente salino con la cadena lateral P+2 Glu, como se indica. El resto del paquete de enlace hidrofóbico P 0 Tyr se forma por Pro 425 bajo el anillo de fenilo y parte de la cadena lateral Cys 277 por arriba del anillo de fenilo. Utilizando una biblioteca de sustrato src peptídico combinatoria amplia, Songyang et al. (1995) encontraron que la cadena lateral más comúnmente elegida para la posición P+l fue Gly seguido por Glu. El presente modelo indica que una cadena lateral P+l Glu puede formar un puente salino con el Arg 469 cercano como se indica en la Figura 5. Previamente, los investigadores encontraron que únicamente Glu se elige para la posición P+2 y el presente modelo indica que esta cadena lateral forma un puete salino con la cadena lateral Lys 423. En la posición P+3, Phe fue muy fuertemente preferido y el modelo indica que esta cadena lateral forma una interacción de apilamiento con la cadena lateral Phe 424. En la posición P-l Songyang et al. encontraron que lie fue el residuo más preferido, seguido por Val y luego por Leu. El modelo muestra un paquete hidrofóbico para el enlace de la cadena lateral P-l formada principalmente por Trp 428, Ala 390 y Leu 347. Alguien podría esperar que la cadena principal lateral P 0 Tyr interactúe fuertemente (a través del enlace de hidrógeno) con el sitio activo en un complejo catalíticamente competente debido a que las enzimas frecuentemente forman más interacciones críticas en esta región cercana a donde la reacción esté ocurriendo. El complejo ternario IRTK no muestra un buen enlace de hidrógeno al P 0 Tyr OH o al carbonilo. El residuo candidato más cercano para esta interacción en la estructura IRTK es Asn 1215, en donde la cadena lateral NH2 está a 3.71 Á del oxígeno carbonílico de Tyr. Cuando la estructura, ternaria IRTK se traslapa sobre la estructura nativa src, utilizando los cuatro residuos mencionados en la sección de Antecedentes y Significancia, Asn 468 proveniente de la estructura src se encontró que estaba colocado muy cerca al análogo IRTK Asn 1215. Esto sugiere que este residuo conservado está realizando un importante papel y puede moverse un poco más cerca (por ejemplo aproximadamente 1 Á) al sustrato P 0 NH y al carbonilo en un complejo catalíticamente activo, y formar las interacciones de enlace de hidrógeno indicadas en la Figura 5. Finalmente, el Arg 388 catalítico y Asp 386 están correctamente colocados en el modelo src para catalizar la transferencia del ?- fosfato proveniente de ATP al Tyr OH. El complejo sustrato src: péptido puede ahora ser utilizado para modelar las estructuras no peptídicas potenciales, y determinar las posiciones de sustitución preferidas para los elementos de especificidad, toda con una funcionalidad Mi apropiadamente acoplada, antes de elegir nuevas estructuras para evaluar experimentalmente.

La estructura ternaria IRTK:péptido:AMP-PNP puede también ser utilizada para modelar estas estructuras potenciales y las posiciones de sustitución preferidas. Estas estructuras tienen amplia utilidad para el desarrollo de inhibidores de PTK selectivos, al desarrollarlas además con elementos de especificidad apropiados siguiendo la estrategia descrita en la Figura 1. La primera estructura no peptídica evaluada con este modelo de sustrato src:péptido fue la estructura de naftaleno. Este es el primer uso de estructuras aromáticas bicíclicas para inhibidores no peptídicos de PTK, las cuales no compiten con ATP. La utilidad de las estructuras de naftaleno para este propósito fue demostrada mediante el desarrollo de un inhibidor no peptídico del receptor PTK de IRTK y EGF (Saperstein et al., 1989). Los complejos ternarios IRTK fueron subsecuentemente utilizados para adaptar esta estructura para la inhibición de src (ver Marsilje et al., 2000). La estructura de naftaleno fue acoplada en el sitio activo de src llevando a cabo primeramente un ajuste de mínimos cuadrados de átomos a-d sobre el sustrato peptídico como se indica en la Figura 6. De esta manera, la estructura de naftaleno se relaciona al sustrato peptídico por la ciclización mostrada mediante la flecha de la Figura 6 y un OH anexado como un sustituto para el sustrato Tyr NH. Este es esencialmente el mismo proceso utilizado para acoplar esta estructura en la estructura IRTK como se describe en Marsilje 2000. El sustrato peptídico fue posteriormente suprimido del sitio activo, varios grupos funcionales Mi y elementos de especificidad S2 y S3 fueron luego agregados a la estructura como se indica y los complejos fueron luego individualmente minimizados para 300 repeticiones. Este mismo proceso también fue utilizado para diseñar las estructuras de isoquinolina e indol, cuyos modos de enlace se indican en la Figura 7. En todos estos complejos modelados, el elemento de selectividad S2 consiste de diversas cadenas laterales hidrofóbicas que pueden enlazarse en el mismo paquete que en la cadena lateral del sustrato P-Ile y selectivamente el elemento S3 consiste de varios fragmentos moleculares que pueden enlazarse en la región P+l a P+3 de los sitios de enlace del sustrato peptídico (Figura 5) . Ya que la región del sitio activo donde Mi se enlaza, es altamente conservadci entre todas las proteínas-cinasas, el pequeño menú de los grupos funcionales Mi previamente identificados utilizando estructuras peptídicas, sirvió como los grupos iniciales Mx para el acoplamiento en las estructuras en las posiciones indicadas. De los dos sitios de enlace de los elementos de selectividad, la estructura de la cavidad de enlace hidrofóbica para S2 es conocida con mayor confianza en el modelo src que lo que es la región de enlace del P+l al P+3 para S3. Esto se debe a que el sitio de enlace S3 fue construido parcialmente mediante la modelación de homología comparativa, mientras que el sitio S2 permanece ampliamente sin cambio proveniente de la estructura determinada por rayos X para src nativo. En vista de estos niveles variados de confianza en los sitios de enlace modelados para Mi, S y S3, la diversidad de la biblioteca combinatoria se sujeta a escala de tal modo que la mayor variedad y número de cadenas laterales en las bibliotecas combinatorias están en sitio S3 seguidas por el sitio S2 y luego Mi . Los resultados de src utilizando grupos funcionales Mi para identificar experimentalmente estructuras promisorias no peptídicas, se listan en la Tabla 4. Los datos en la Tabla 4 permiten un número de conclusiones que se redactan enseguida: 1) Potencia de inhibición baja, pero medible que puede ser obtenida con un grupo apropiado Mx acoplado a una estructura (por ejemplo 2_7 y 38) . 2) Concentraciones del inhibidor 1 mM para este tipo de selección es mayor que lo deseable, pero 100 µM es demasiado baja. La selección de estructuras que llevan un grupo Ml podría ser óptimamente conducida a 500 µM. 3) Los grupos funcionales Mx de ácido borónico, ácido sulfámico y ácido fosfónico, los cuales han sido identificados utilizando 1 estructura pentapeptídica PKA (22^, Tabla 3 y 8 Tabla 1) o la estructura pentapeptídica src (14, Tabla 2) , respectivamente, dieron actividad mensurable cuando se colocaron en la posición 2 del anillo de naftaleno (2_7, 23 y 3_0, respectivamente) , la posición preferida para Mi identificado en el inhibidor de naftaleno modelo: complejo src (Figura 6) . Moviendo los grupos Mi de ácido borónico o ácido fosfónico a la posición 1 (3_2 ó 3^3) , se redujo la actividad. 4) La funcionalidad sulfonamida Mi relacionada, la cual fue pobre en la estructura pentapeptídica TKA (7 y 9, Tabla 1) también es pobre cuando se anexa a la posición 2 (3_1) ó 1 (3_4) de la estructura de naftaleno. El análogo de ácido sulfónico en la posición 2 del naftaleno (29) es completamente inactivo, incluso a 1 mM. 5) La estructura de naftaleno puede ser reemplazada con una estructura de benzofurano (35) o un benzotiofeno (36) , sin una reducción notable en la actividad cuando el grupo Mi de ácido borónico está colocado en forma análoga a la posición 2 sobre un naftaleno. 6) El grupo Mx de ácido borónico también proporciona compuestos activos cuando se anexa a las estructuras de isoquinolina (37) o indol (3_8) en las posiciones indicadas por los resultados del modelo (Figura 7) . Sin embargo, la estructura de indol es claramente favorecida sobre la estructura de isoquinolina, lo que sugiere que una habilidad donadora de enlace hidrógeno para Asn 468 (ver Figura 7) es importante para mayor actividad (esto podría requerir la isoquinolina protonada que es desfavorecida por el electrón adyacente retirando grupo éster) . Esta conclusión también es apoyada al considerar que un sustrato peptídico puede colocar un enlace hidrógeno donando NH enlazado al péptido en una posición similar (Figura 6) y mediante el hallazgo de que un OH fenólico equivalentemente colocado (Figura 6) mejora la potencia (los OH fenólicos son mucho mejores donadores de enlace que aceptores) . 8) Cuando se compara directamente a otros grupos Mi( el grupo de ácido borónico es superior (por ejemplo 27 versus 2J3-31, 3_8 versus 39) . 9) Una estructura de bifenilo se modeló en el src y los sitios activos IRTK y se encontraron modos de enlace promisorios para esta estructura. Las bibliotecas combinatorias fueron desarrolladas con la estructura de bifenilo (ver Pavia et al., 1996), y los resultados del modelo fueron fomentados. Por lo tanto, los isómeros para (4_0) y meta (4_1) fueron evaluados con el grupo Mi de ácido borónico. Los compuestos de bifenilo mostraron potencia equivalente al mejor ácido naftalen-borónico (27) y por lo tanto proporcionaron otra geometría de estructura (los dos anillos fenilo no son planos) para evaluación y desarrollo posterior.

Ya que las estructuras desnudas, únicamente con un grupo anexo Mi, frecuentemente tienen baja afinidad de enlace, se determinaron los IC50 y Ki para los inhibidores de ácido 2-naftalenborónico y ácido sulfámico, para asegurar que se obtuviera una curva típica dosis/respuesta IC50. Este análisis proporcionó las curvas de forma típica dosis/respuesta observadas con inhibidores más potentes. Los IC50 de Ki de estos inhibidores simples también confirmaron que el inhibidor 2_7 de ácido borónico es e más potente que el análogo 2Í3 de ácido sulfámico y tiene un Ki de aproximadamente 554 µM. El siguiente problema enfrentado con estos inhibidores simples antes de proceder a su elaboración posterior fue su modo de inhibición, específicamente si éstos eran inhibidores competitivos para ATP o no. en el caso de los inhibidores 27 y 2_8 de naftaleno, sus IC50 fueron verificados periódicamente como la concentración de ATP que se incrementó en tres pasos hasta un mM. Como una comparación, el IC50 del inhibidor de src de ácido fosfónico pentapeptídico 14^ (Taba II) también fue verificado periódicamente. Si cualquiera de estos inhibidores era competente con ATP, entonces sus IC50 podrían haberse incrementado proporcionalmente con la concentración de ATP (por ejemplo la línea punteada) . Como se muestra, los IC50 para los tres inhibidores permanecieron esencialmente constantes conforme la concentración de ATP se incrementaba, demostrando que éstos no son inhibidores competitivos para ATP. Un análisis muy similar, pero mucho menos costoso (src comercial es caro) , fue conducido con el inhibidor 3_8 de ácido indol-borónico . En este caso, el porcentaje de inhibición fue verificado periódicamente con 38 a una concentración constante de inhibidor de 500 µM, pero sin incrementar las concentraciones de ATP de 200, 500 y 1000 µM. Una vez más, la potencia del inhibidor no fue reducida al incrementar la concentración de ATP, demostrando que 3_8 tampoco es competitivo para ATP. Los resultados iniciales obtenidos en el Paso sugieren que es posible identificar estructuras promisorias para elaboración posterior con este procedimiento. La mayor incertidurnbre con el Paso 1 es que algunas de las estructuras identificadas de esta manera no pueden ser enlazadas en la manera sugerida por las evaluaciones de modelación anteriores. Esto es esencialmente un problema de "falso positivo". Estos "falsos positivos" probablemente fallarán en el Paso 2, cuando éstos se evalúen para el enlace mejorado, utilizando los complejos modelados como una guía. Algunos resultados falsos positivos pueden ser aceptados en el Paso 1, debido a que las estructuras desnudas únicamente con el grupo Mi acoplado, son fácilmente obtenidas. Para el desarrollo de inhibidores adicionales, se puede regresar al Paso 1, cada vez que se necesiten nuevas estructuras para realizar los Pasos 2 y 3. El mejor M-¡_ generado puede ser utilizado cada vez que se repita el Paso 1. Actualmente, el grupo Mi de ácido borónico es preferido, ya que éste tiene una habilidad probada para dar actividad mensurable con estructuras desnudas. También, el grupo Mi de ácido borónico ofrece posibilidades múltiples interesantes para interacciones covalentes y no covalentes con los residuos catalíticos conservados ya que éste puede: 1) hidratar, 2) formar complejos de borato con los átomos del sitio activo rico en electrones, y/o 3) ser fosforilado y luego reaccionar con nucleófilos de sitio activo o acoplarse en interacciones adicionales no covalentes. A partir de los datos en la Tabla 4, las estructuras de naftaleno e indol fueron elegidas como M2 para los primeros esfuerzos en el Paso 2 (la estructura de bifenilo es también una estructura preferida) , También es digno de mencionarse que la naftilalanina y análogos pueden ser exitosamente sustituidos por la P 0 tirosina en los sustratos peptídicos src (por ejemplo ver Alfaro-Lopez et al., 1998) apoyando además la noción de que el naftaleno y estructuras relacionadas pueden enlazarse en el sitio P 0.

Tabla IV RESULTADOS INICIALES DEL PASO 1 % DE INHIBICIÓN DE SRC EN EL ENSAYO MIMÉTICO CELULAR Inhibidor % de inhibición de RR-src 2 mM a la Concentración del inhibidor ( ) = Enlace de acoplamiento M, ) COMPETITIVO IC50=950 µM NO ATP K?=554 µM TIVO NH2 0 (100 µM) O OH . HO' 0 (100 µM) NH2 O=S. 0 (100 µM) O X 10 (100 µM) 12 (100 µM) M M, COMPETITIVO NO ATP 62 (500 µM) OH HO—P. 39 / /// v> 11 (500 µM) O En la comparación del naftaleno versus estructura de indol resultó que el grupo Mi de ácido borónico (por ejemplo 2_7 versus 3_8, Tabla 4) , el NH donador de enlace hidrógeno a indol y/o el grupo éster adyacente, parecieron ser la razón para la potencia mejorada. En consecuencia, para el Paso 2 uno de los primeros intentos fue agregar un grupo hidroxilo y una amida (con s2) a la estructura del naftaleno en las posiciones adyacentes sugeridas por los resultados de modelación (Figura 6) . Para la estructura de indol una prioridad fue preparar algunos análogos de amida, para observar si la potencia podría ser incrementada con el elemento de especificidad S2 (Figura 7) . Con el fin de facilitar la síntesis de estos análogos iniciales, un OH fue temporalmente sustituido por el grupo Mi de ácido borónico. El grupo OH también es conocido para interactuar con los residuos catalíticos, como es requerido por un grupo Mi, debido a que éste es el Mx sustrato natural cuya velocidad de fosforilación es acelerada por las interacciones con los residuos catalíticos. Los resultados obtenidos para algunos análogos iniciales se dan en la Tabla 5, junto con una comparación lado por lado, en el ensayo src Mimético Celular, para dos inhibidores src de la literatura, _50 y 51, los cuales se reportan que son no competitivos para ATP. Algunos de estos resultados y análogos adicionales se describen en Marsilje 2000. El inhibidor 50, y análogos (Huang et al., 1995), fueron de particular interés debido a que la estructura de iminocromeno está estrechamente relacionada a la estructura de naftaleno y su modo de enlace se podría esperar que es muy similar con base en el modelo (Figura 6) . Debido en parte a esta analogía estrecha, las amidas de hidroxianilina con las estructuras de naftaleno e indol fueron examinadas como se muestra en la Tabla 5. También, los estudios de modelación con estos derivados de amidas de hidroxianilina en el sitio activo src indicaron que el grupo hidroxilo puede ser capaz de acoplarse en interacciones de enlace a hidrógeno con los enlaces peptídicos de cadena principal de src, Phe 424 -Ala 422, análogos a los sustratos peptídicos (ver Figua 5) . Estos estudios de modelación también indican que las hidroxibencilamidas homologas podrían ser activas y, de manera más importante, proporcionar una posición de sustitución (por ejemplo el carbón bencílico) para anexar cadenas laterales a enlazarse en el paquete de cadena lateral P-l (por ejemplo a Arg 469, Figura 5) . Los datos en la Tabla 5 permiten redactar las siguientes conclusiones: 1) Agregando una extensión amida sobre las estructuras de naftaleno e indol se puede incrementar la potencia como se predice por los modelos para estas estructuras que se enlazan en el sitio activo src (aproximadamente 5 veces en los casos de 4J2 versus 43-meta y 47 versus 4_8) . 2) Agregando un grupo hidroxilo a la estructura de naftaleno adyacente a la amida, se incrementa la potencia (aproximadamente 5 veces, 4_3-meta versus 44) como se predice por el modelo de src, y también sugiere que Asn 468 realiza enlaces hidrógeno con este OH. 3) Moviendo el grupo OH de Mx de la posición predicha para estar mejor en el modelo src a la posición adyacente, reduce la potencia por un orden de magnitud ( 3 -meta a 45) . 4) La estructura de indol es menos sensible que la estructura de naftaleno a la regioquímica de la extensión de hidroxianilina (4_8 versus 3) . 5) Las estructuras de naftaleno y de indol aceptan la homologación de un carbono proporcionada por el uso de hidroxibencilamida (4_6 versus 43 y 49 versus 4¡8) . 6) Los dos regioisómeros hidroxilo de i, de la estructura del naftaleno son no competitivos para ATP (ver Marsilje 2000) . 7) Todos los inhibidores de metil-hidroxianilina e hidroxibencilamida se encontró que son menos activos, sugiriendo que el grupo hidroxilo en la extensión amida está funcionando como un donador de enlace hidrógeno. A este respecto, es digno de mencionarse que en otro estudio de biblioteca combinatoria de sustrato peptídico src, Ser y Thr fueron identificados como dos de los residuos más preferidos en la posición P+2 (alfaro-Lopez et al., 1998) sugiriendo que existen otras oportunidades de enlace para un OH de extensión de amida diferente de los enlaces peptídicos Phe 424-Ala 422 sugeridos por los estudios de modelación. 8) El inhibidor src, no peptídico, no competitivo para ATP, más potente, previamente descrito en la literatura (50) no es casi tan potente como se reporta cuando se probó bajo las condiciones de ensayo Mimético Celular (IC50=118 nM reportado por Huang et al., 1995 versus únicamente 30% de inhibición a 100 µM) y es menos potente que un número de inhibidores actuales (especialmente 4_3-meta) incluyendo el inhibidor más parecido (50 versus 45^) . La relación estructura-actividad (SAR) reportada para regioisómeros hidroxilo de 5_f en su ensayo (Huang et al., 1995) tampoco corresponde con el SAR que se obtuvo para los inhibidores de naftaleno relacionados. Por ejemplo, su análogo de iminocromeno del inhibidor 4_3-meta de naftaleno más potente es 230 veces menos potente que 5/J en su ensayo de src. Una ventaja importante de la estructura de naftaleno sobre la estructural de iminocromeno es que éste permite un elemento de especi icidad S2 altamente deseable a ser agregado para tener acceso al sitio hidrofóbico P-l (ver Figura 6) mientras que la posición análoga no puede ser sustituida sobre la estructura de iminocromeno, debido a que ésta está ocupada por el átomo de oxígeno en el anillo.

Tabla V RESULTADOS INICIALES DEL PASO 2 % DE INHIBICIÓN DE SRC EN EL ENSAYO MIMÉTICO CELULAR Inhibidor % de inhibición de RR- src 2 mM a la Concentración del inhibidor ( ) O-ATP Orto: 42 (100 µM) 46 Meta : En progreso Para: 42 (100 µM) Orto: 43 (100 µM) Meta: 30 (100 µM) Para: 45 (100 µM) Orto: 24 (100 µM) (Mi) Meta: En progreso Para: 54 (100 µM) 30 ( 100 µM) Huamg etal Piceatanol Las potencias del inhibidor en el ensayo Mimético Celular de src pueden además ser calibradas contra otros inhibidores de src no peptídicos, no ATP, de la literatura. Dos ejemplos adicionales son 51 (ST 638, Shiraishi et al., 1989) el cual es un miembro de la familia "tirfostina" de análogos de erbstatina (ver Lawrence & Niu, 1998) y el piceatanol 52 inhibidor de PTK, producto natural (Thakkar et al., 1993). En el ensayo Mimético Celular, todos estos inhibidores conocidos son menos potentes que los que se reportaron, sugiriendo que el ensayo es particularmente demandante., en términos de lograr alta potencia. La prueba inicial de los inhibidores src se llevó a cabo utilizando una concentración simple (por triplicado) debido a que src comercial es muy caro para realizar las curvas completas de IC50 sobre cada inhibidor. Se debe mencionar, no obstante, que una curva IC50 dosis-respuesta no es lineal y la diferencia entre aproximadamente 50% de inhibición a 100 µM y una inhibición de aproximadamente 90% a 100 µM es efectivamente un factor de 10 y no un factor de 2 (por ejemplo 45 versus 43_-meta) . En consecuencia, los inhibidores de src de la literatura 50-52 son mayores que un orden de magnitud menos activo, que el inhibidor 43-meta actualmente más potente. Las discrepancias encontradas en la literatura que reportan la potencia de estos inhibidores, la sensibilidad a las condiciones de ensayo descritas anteriormente con los inhibidores de PKA, y la falta de consistencia entre numerosos laboratorios y los equipos de ensayo comerciales de la proteína-cinasa destacan este problema no tan notorio, pero crucial en el campo. Aunque los inhibidores producidos por la presente invención pueden ser más potentes bajo otras condiciones de ensayo, el ensayo Mimético Celular podría ser utilizado, el cual imita las condiciones fisicoquímicas intracelulares tan cercanamente como es posible, conforme la potencia primaria y la guía del orden de rango para evaluar los inhibidores antes de elegir los compuestos para proceder a los ensayos celulares o tisuiares totales. Como se describirá con más detalle posteriormente, los inhibidores basados en naftaleno más potentes, al contrario del ensayo Mimético Celular (por ejemplo 43_-meta, IC50=18 µM y Ki=10 µM) también es efectivo para bloquear específicamente la proliferación celular estimulada por pp60v"src con un IC50 similar de aproximadamente 25 µM. Esto sugiere que no solamente el ensayo de src Mimético Celular es predictivo, sino también que esta clase de inhibidores basados en naftaleno pueden fácilmente pasar a través de las membranas celulares e inhibir src intracelular. Los análogos de un número de los inhibidores de naftaleno e indol anteriores pueden ser preparados con el grupo Mi de ácido borónico en lugar del OH de Mx y/o con un elemento de especificidad hidrofóbico de S2 acoplado para el enlace en el sitio P-l de src como se ilustra en las Figuras 6 y 7. Las estructuras de naftaleno e indol pueden ser tomadas al Paso 3 como se describe más adelante. Cada vez que se repite el Paso 2 con nuevas estrucutras del Paso 1, los mejores elementos de selectividad S2 y/o S3 que han sido descubiertos con estructuras previas, pueden utilizarse en las bibliotecas combinatorias del Paso 3. Aunque la combinación óptima de Mi, S2 y S3 es probable que sea diferente para cada estructura, aquellos encontrados óptimos con la estructura relacionada previa (por ejemplo yendo desde el naftaleno hasta la estructura del indol) deben ser adecuados para la utilización como mejores elementos de especificidad inicial en el Paso 2 con la nueva estructura. El mismo proceso será repetido cada vez que exista una necesidad para intentar otra estructura hasta que se logren la potencia, selectividad y propiedades farmacéuticas adecuadas, suficientes, para los inhibidores de src o, consecuentemente, para los inhibidores de los PTK adicionales, terapéuticamente importantes. Algo de la química utilizada para preparar los inhibidores de naftaleno se describe en Marsilje 2000. Para el enlace de un grupo funcional ácido borónico en lugar de los grupos hidroxilo de Mi en los inhibidores de src de la Tabla 5, se utilizó la metodología de reticulación catalizada por Pd(0) en donde ya sea un triflato de arilo (Ishiyama et al., 1997) o un haluro de arilo (Ishiyama, 1995) pueden ser acoplados con el éster de pinacol del diboro, comercialmente disponible. Un ejemplo ilustrativo fue recientemente completado y se da en la Figura 8.

El ejemplo mostrado en la Figura 8 demuestra que es posible triflar selectivamente el OH menos impedido en la posición Mx y haber probado esto por su eliminación a 5_6 con la verificación subsecuente por RMN 1H del patrón de sustitución. El monotriflato 5_3 fue luego tomado sobre el acido borónico 55 deseado, como se indica. La misma secuencia de reacción también funciona perfectamente para el regioisomero de 42 el cual corresponde al inhibidor 45 de la Tabla 5. El esquema sintético mostrado en la Figura 9 puede ser seguido, con el fin de acoplar los elementos de selectividad S2 hidrofóbicos a la estructura de naftaleno. La química del naftaleno puede ser convertida a la fase sólida en la preparación para la síntesis de bibliotecas de combinación de esta estructura en un formato de placa de 96 pozos. Hasta ahora, la química de modelos ha sido llevada a cabo sobre el regioisómero de naftaleno menos activo representado por AA , debido a que este compuesto es fácilmente obtenido del ácido 3 , 5-dihidroxi-2-naftoico comercialmente disponible como se describe en Marsilje 2000. Las reacciones modelo exitosas a la fecha son mostradas en la Figura 10. Estas reacciones modelo demuestran que es posible acoplar la estructura de naftaleno a la resina de Wang (63) y luego llevar a cabo la química sobre el triflato [en este caso la reticulación catalizada por Pd (0) al éster borónico 64] seguido por escisión bajo condiciones leves (65) . El éster en 63 puede también ser saponificado para las reacciones de acoplamiento subsecuentes para formar las amidas que contienen los elementos de selectividad S3. La estructura de naftaleno actualmente proporciona tres sitios de diversidad para ser explorados en las bibliotecas de combinación, Mi, S2 y S3. La química de combinación en fase sólida con los reactores en placa de 96 pozos similares a aquellos utilizados en estudios previos (Pavia et al., 1996). El mayor número y diversidad de cadenas laterales será utilizado para S3 seguido por S2 y luego Mi por las razones discutidas al principio. Una posible estrategia sintética completa, basada en los estudios de modelos sintéticos anteriores, para preparar estas bibliotecas, se muestra en la Figura 11. Por supuesto, si surgen problemas con esta ruta existen muchas otras posibilidades. Por ejemplo, si el acoplamiento de Mitsunobu para dar §J_ procede con un rendimiento demasiado bajo (debido a la congestión estérica incrementada del grupo alilo adyacente, agregado, pero quizás no un problema dada la carga de 92% obtenida en la Figura 10) entonces la estructura podría ser trabada a una resina a través del grupo carboxilo, en vez del OH, utilizando el ligador de "atrapamiento de seguridad" acilsulfonamida (Backes et al., 1996) y formar las amidas últimas (las aminas en exceso pueden ser removidas después de la escisión mediante filtración a través de una resina acida) . De igual modo, otros ligadores y/o resinas pueden ser utilizados si la reducción del alqueno en presencia de éteres bencílicos {61_ a 6j3) es deseada pero problemática. El primer uso de la química propuesta en la Figura 11 será simplemente preparar una biblioteca de 96 amidas, que contienen el grupo Mi de ácido borónico, sin tener la cadena lateral de alilo en su sitio de modo que estas dos complicaciones potenciales no serán un problema inicialmente y los elementos S3 más promisorios pueden ser fácilmente identificados. Al menos 14 cadenas laterales hidrofóbicas S2 (incluyendo lineales, ramificadas y cíclicas) son identificadas para el estudio posterior (28 si son también explorados los alquenos correspondientes) con base en la modelación de las cadenas laterales candidatas dentro del sitio P-l del modelo src (Figura 6) y sobre la disponibilidad comercial de los haluros necesarios para preparar los reactivos de Wittig correspondientes. Al menos 96 aminas comercialmente disponibles están disponibles, las cuales proporcionarán los elementos de especificidad de S3 potenciales incluyendo: 1) los hidrocarburos (4) , 2) los grupos alquilo que contienen aceptores de enlace de hidrógeno (4) , 3) los grupos alquilo que contienen aceptores y donadores de enlace de hidrógeno (19) , 4) grupos alquilo/arilo que contienen aceptores y donadores del enlace de hidrógeno (25) , 5) aceptores y donadores del enlace de hidrógeno de arilo (10) , 6) los aceptores y donadores del enlace de hidrógeno heterocíclico (20) , 7) cadenas laterales que contienen grupos catiónicos (4) , 8) cadenas laterales que contienen grupos aniónicos (9) , y la cadena lateral de 3-amino-fenol proveniente del inhibidor 4J3-meta como un control interno para la actividad de src. Una amplia gama de aminas fueron incluidas para S3, con el fin de no desviar demasiado la biblioteca aquí debido al alto nivel de incertidumbre para este sitio de enlace en el modelo de src. La estructura de indol puede ser desarrollada en una biblioteca en combinación con mucho de la misma manera.

En este caso, el NH del indol podría ser utilizado como el punto de anclaje para el acoplamiento a la resina de Wang (u otra) ya que la reacción de Minsunobu análoga es conocida (Bhagwat & Gude, 1994) . Una gran cantidad de metodología sintética ha sido desarrollada para la síntesis de los índoles sustituidos y han diseñado una ruta para incluir la cadena lateral hidrofóbica S2 (ver Figura 7) (Ezquerra et al., 1996). El grupo funcional triflato formado en la reacción 2 a partir del intermediario 69 (Figura 11) puede ser convertido a una amina (Wolfe et al., 1997) y luego a una serie de amidas u otros derivados de amina después de la secuencia de reacción mostrada en la Figura 12. De hecho, el triflato es un asa sintética versátil y podría ser convertida también a otros grupos funcionales. Cuando la amina 12. es disponible, los Mi ' s conocidos (por ejemplo el ácido sulfámico proveniente del inhibidor de src 28^ Tabla 5 y la amida-ácido 17 Tabla 3) pueden ser evaluados con esta estructura más desarrollada y evaluar algunos nuevos derivados de amina como potenciales Mi's. Por ejemplo el grupo Mi de tricarbonil-amida hidratada mostrada en la estructura 73_ (y su precursor no hidratado) es accesible por medio de la metodología sintética (ver Lai et al., 1996) y podría formar una variedad de interesantes interacciones con los residuos catalíticos conservados. Después del procedimiento de modelación descrito anteriormente, fueron modelados una serie de análogos que contienen hidroxilo del grupo Mi del ácido borónico, mostrado en la Figura 13, en los sitios activos src e IRTK y se encontraron los modos de interacciones/enlace ilustrados, como algunas de las posibilidades interesantes. Mediante la fosforilación del ácido borónico son disponibles posibilidades adicionales interesantes (por ejemplo, inhibición tipo suicida vía la reacción del anhídrido mixto resultante con un nucleófilo de sitio activo) . La presencia de los grupos hidroxilo adicionales sobre el anillo de fenilo mimético con Tyr es necesario y común entre muchos inhibidores de PTK (por ejemplo Piceatannol 52, Tabla 5) y se mostró que son benéficos sobre la cadena lateral con los inhibidores de fosfonato de PKA (por ejemplo 2 versus 3 y 4, Tabla I) . En consecuencia, la adición de uno o más OH's al diseño Mi de inhibidor de ácido borónico como se ilustra en la Figura 13, puede aumentar considerablemente la potencia. Estos grupos OH podrían también extender la cadena lateral de ácido borónico más allá de los residuos catalíticos Asp y Arg sin sufrir una penalidad para cubrirlos con hidrocarburo, como era probablemente el caso con los homólogos de ácido borónico de PICA (2 y 24, Tabla 3) . Una ruta posible a los ácidos hidroxiborónicos 76. Y ZZ utiliza la metodología de homologación de éster borónico quiral de Matteson (por ejemplo, ver Matteson et al., 1987, 1988 y 1990) . En una modalidad preferida de la invención, el primer módulo es producido mediante el acoplamiento del primer módulo a una estructura peptídica. Uno o más grupos funcionales son identificados, los cuales preferentemente se enlazan a los residuos catalíticos de la proteína-cinasa. Además, el primer módulo es combinado con el segundo módulo de modo que el segundo módulo sustituye la estructura peptídica. Los primeros módulos preferidos tienen un grupo funcional tal como ácido borónico, un grupo hidroxilo, ácido fosfónico, ácido sulfámico, un grupo guanidino, ácido carboxílico, un aldehido, una amida, y ácido hidroximetilfosfónico. Los compuestos de la presente invención pueden tener dos o más grupos funcionales dentro del primer módulo. Más módulos más preferidos son los grupos ácido borónico, un grupo hidroxilo, o un grupo amida. Un grupo amida aún más preferido, es una tricarbonil-amida vecina. Los segundos módulos preferidos incluyen indol , naftaleno,, bifenilo, isoquinolina, benzofurano, y benzotiofeno. Los segundos módulos más preferidos son un indol o naftaleno. En algunas modalidades de la invención, más de un primer módulo puede ser enlazado al segundo módulo. Además, el primer módulo puede tener una cadena lineal que comprende entre uno y tres átomos de carbono, que enlaza el primer módulo al segundo módulo. En modalidadeís alternativas, uno de los átomos de carbono en la cadena lineal está sustituido con un nitrógeno, oxígeno o átomo de azufre . Los métodos y compuestos de la invención son ampliamente aplicables a cualquier proteína-cinasa. Las proteínas-cinasas preferidas son las tirosinas-cinasas proteicas y las serinas-cinasas proteicas. Las tirosinas-cinasas proteicas preferidas son pp60c"src, p56lc , la cinasa ZAP, la tirosina-cinasa del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, Bcr-Abl, tirosina-cinasa del receptor VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) , y la tirosina-cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, y las tirosinas-cinasas similares al receptor del factor de crecimiento epidérmico. Una tirosina-cinasa proteica más preferida es pp60c"src. Las cinasas proteicas de serina preferidas incluyen la cinasa MAP (proteína activada por mitógeno) , la cinasa proteica C, y CDK (proteína-cinasa dependiente de ciclina) . El método de la presente invención puede además consistir en agregar uno o más elementos de cadena lateral de especificidad a la combinación del primero y segundo módulos. Las cadenas laterales de especificidad pueden incrementar la potencia y la especificidad del inhibidor. Una vez que ha sido identificado un segundo módulo promisorio, no es necesario repetir todos los pasos del método. Más bien, las cadenas laterales de especificidad, del primer módulo, o una combinación de las dos, pueden ser modificadas para mejorar el inhibidor original, por ejemplo un inhibidor que tenga una habilidad incrementada para inhibir la actividad de la proteína-cinasa cuando se compara al primer inhibidor no modificado. El presente método está diseñado para proporcionar preferentemente los inhibidores de proteína-cinasa que no actúan por la inhibición del enlace de ATP a la proteína-cinasa. Los inhibidores de las proteínas-cinasas pueden ser potentes pero frecuentemente carecen de especificidad y son por lo tanto frecuentemente no buenos fármacos candidatos. Por lo tanto, los inhibidores de proteína-cinasa que inhiben la actividad de la proteína-cinasa pero no inhiben o solo inhiben débilmente el enlace de ATP a la proteína-cinasa, son preferidos. La presente invención también proporciona un método para probar los compuestos para una habilidad para inhibir la actividad de la proteína-cinasa. Los compuestos son producidos de acuerdo a la reivindicación 1. La actividad de la proteína-cinasa es medida en presencia del inhibidor a la misma temperatura, pH, fuerza iónica, osmolaridad, y concentración de magnesio libre, como se encuentra en una célula que expresa la proteína-cinasa. El nivel de actividad de proteína-cinasa es comparado al nivel de actividad de la proteína-cinasa sin la presencia del inhibidor. Tal sistema de ensayo, el cual imita las condiciones fisiológicas, proporciona los datos de inhibición más relevantes. El ensayo puede ser conducido en un sistema de ensayo automatizado. Además, el ensayo puede ser combinado con un método de química en combinación para seleccionar rápidamente numerosos candidatos. El método de ensayo de ELISA PTK no radioactivo, en placa de 96 pozos de Pierce puede ser adaptado a las condiciones de ensayo Miméticas Celulares para la selección inicial de src de las bibliotecas en combinación en la placa de 96 pozos. Este ensayo de alto rendimiento utiliza el mismo sustrato peptídico RR-SRC, excepto que éste está biotinilado, de modo que puede ser acoplado a los pozos recubiertos con NeutrAvidina en sus placas comerciales de 96 pozos. Este ensayo de inhibición de alto rendimiento puede ser corrido mediante la incubación de src con el sustrato RR-SRC pre-enlazado a los pozos, seguido por la adición de su conjugado anticuerpo anti-fosfotirosina (PY20) -peroxidasa de rábano (HRP) y su sustrato de HRP para cuantificar el nivel de fosfo-RR-SRC producido por medio de la medición del nivel del producto HRP con un lector de UV de placa de 96 pozos. Han sido utilizados ensayos radioactivos de P3 -ATP de bajo rendimiento, estándares, pero es preferido un formato de placa de 96 pozos, especialmente con un ensayo no radioactivo si es posible. Ya que son desarrollados inhibidores de src muy potentes, un panel de ensayos de proteína-cinasa pudo ser establecido con hasta aproximadamente 6 cinasas proteicas comercialmente disponibles (principalmente PTKs) , utilizando las condiciones de ensayo de proteína-cinasa Mimética Celular, y se prueban estos inhibidores a través del panel para obtener una evaluación inicial de la especificidad. Una evaluación de especificidad más completa, que involucra las "aproximadamente 2,000 proteínas-cinasas, será necesariamente conducido en el cultivo celular e in vivo a través de colaboraciones adicionales al tiempo apropiado. Los inhibidores de src activos pueden ser estudiados en un grupo de ensayos basados en células, lado por lado, utilizando las células de riñon de rata normal (NRK) y un transformante pp6v"src sensible a la temperatura, de esta línea celular (LA25) . El transformante LA25 se acopla en crecimiento independiente del anclaje y el suero a la temperatura "permisiva" de 33 °C debido a la activación de pp60v"src pero no a la temperatura "no permisiva" de 40°C a la cual pp60v"src no es activada (Li et al., 1996). El uso de este par de líneas celulares estrechamente relacionadas para probar los inhibidores de src a las temperaturas permisiva y no permisiva, permite que alguien determine si un inhibidor de src dado está bloqueando el desarrollo celular debido al bloqueo específico de la vía de señalización de src, mediante un mecanismo diferente o mediante efecto citotóxico general. Los resultados provenientes de la prueba inicial del inhibidor de src no peptídico, 43_-meta (Tabla V) en este par de líneas celulares, se muestran en la Figura 14. Como se muestra en esta gráfica, el desarrollo de las células LA25 a la temperatura permisiva de 33°C es inhibido por aproximadamente 50% a una concentración de 25 µM de 3-meta con relación al crecimiento celular de LA25 a la temperatura no permisiva de 40°C, como un control. La falta de toxicidad celular de J3-meta es puesta en evidencia por el hecho de que conforme se incrementa su concentración hasta 400 µM, el desarrollo base de las células no transformadas NRK, las células LA25 a la temperatura no permisiva de 40°C y las células LA20 a la temperatura permisiva de 33 °C (pero con pp60v"src completamente inhibido por 43 -meta) no solamente disminuye sino que se incrementa efectivamente en cierta medida (presumiblemente debido a una actividad no relacionada a src de este compuesto) . Ya que fueron preparadas soluciones de 43_-meta con una baja concentración de DMSO para la solubilización, fue también corrido un control de DMSO a la misma concentración. Una curva de dosis/respuesta más completa, centrada alrededor de 25 µM será corrida. En otra modalidad más, la presente invención proporciona un método para inhibir una proteína-cinasa. La proteína-cinasa es puesta en contacto con un compuesto que tiene un primer módulo que tiene un grupo funcional para el enlace a residuos catalíticos de la proteína-cinasa, y un segundo módulo que proporciona una estructura no peptídica. La combinación del primero y segundo módulos inhibe la actividad de la proteína-cinasa. Un inhibidor de tirosina-cinasa proteica, no peptídica, preferida proporcionada por la presente invención tiene la siguiente fórmula: en donde Ri es hidrógeno u OH, R2 es hidrógeno u OH, R3 es OH o H y R4 es CH3, CH2(CH3)R, o CH2(CH3)S, R5 es OCH3, H, o OH, R6 es OCH3, F, H, o OH, y R7 es OCH3, H, OH, C02H, C02CH3, CH2C02H, o CH2C02CH3. En una modalidad más preferida, el inhibidor de la tirosina-cinasa proteica, no peptídica inhibe la actividad de la tirosina-cinasa pp60c~src. Otro inhibidor de tirosina-cinasa proteica, no peptídico, preferido tiene la siguiente fórmula: donde Rx es OH o H, R2 es OH o H, R3 es OH o H, R4 es OH o H, R5 es OH, OMe, o H, Rs es OH, OMe, o H, R7 es OH, OMe, o H, y X es 0 ó 1. En una modalidad más preferida, el inhibidor de la tirosina-cinasa proteica no peptídico, tiene la estructura anterior y Ri es OH, R2 es OH, R3 es H, R es H, R5 es OMe, R6 es H, R7 es H, y X es 1. Otra tirosina-cinasa proteica, no peptídica, preferida tiene la fórmula: La presente invención proporciona además un método para tratar una condición que responde a un inhibidor de proteína-cinasa, en un paciente. Una dosis efectiva de un inhibidor de proteína-cinasa es administrada a un paciente. El inhibidor de proteína-cinasa tiene un primer módulo que tiene un grupo funcional para enlazarse a los residuos catalíticos de la proteína-cinasa y un segundo módulo que proporciona una estructura no peptídica, donde la combinación del primero y segundo módulos inhibe la actividad de la proteína-cinasa. Finalmente, pueden ser seleccionados inhibidores de src promisorios en ensayos de tejido tumoral humano, primarios, particularmente para buscar la sinergia con otros fármacos anticancerosos conocidos.

EJEMPLOS Ejemplo 1.- Diseño, Síntesis y Actividad de los Inhibidores Derivados de Hidroxinaftaleno, No Competitivos con ATP de la Tirosina- Cinasa pp60°"Src La estructura cristalina del dominio catalítico de IRTK humano, autoinhibido (Hubbard et al., 1994) fue utilizada para llevar a cabo los estudios de modelación molecular cualitativa (SYBYL"11, 6.4, Tripos ' Inc., Saint Louis) en donde un anillo de naftaleno fue superpuesto sobre el IRTK Tyr 1,162. La región IRTK que contiene Tyr 1,162 se pliega hacia atrás en el sitio activo, con la Tyr 1,162 colocada análoga a una Tyr fosforilable en un sustrato peptídico, con lo cual autoinhibe la tirosina-cinasa. Esta superposición indicó que debe ser colocado un carbonilo de amida en la posición 2 (Esquema de Reacción 1) del anillo de naftaleno para imitar el carbonilo de Tyr 1,162 y un grupo hidroxilo debe ser colocado en la posición 6 para imitar el grupo hidroxilo de Tyr 1,162.

Esquema de Reacción 1 Estos estudios de modelación también indicaron que un grupo hidroxilo en la posición 3 podría imitar el NH de Tyr 1,162. Con el fin de probar estos conceptos de diseño experimentalmente, el grupo carbonilo en la posición 2 fue anexado ya sea como un éster metílico o como una serie de amidas (Tabla 6) . Las hidroxi-N-fenil- (X=0) y N-bencil-(X=l) -amidas fueron elegidas con base en el incremento en la potencia del inhibidor de pp60c"src, observado con los análogos de iminocromeno que contienen cadenas laterales de N-fenil-amida con hidroxilo anexado (Huang et al., 1995). Los análogos en donde el grupo 6-hidroxilo fue ya sea suprimido o movido, fueron también preparados para determinar si ocurre una caída en la potencia, como es predicho a partir de los estudios de modelación. La serie de inhibidores de 2 -carbonil-3, 5-dihidroxinaftaleno (la, 2a-2d, 2i-dl, 2o-2p) y los inhibidores de 2-carbonil-3 , 7-dihidroxi-naftaleno (lc, 2t-2u) fueron sintetizados a partir de ácido 3, 5-dihidroxi-2-naftoico (Aldrich) y ácido 3 , 7-dihidroxi-2-naftoico comercialmente disponibles, respectivamente. Los esteres de metilo la y lc fueron obtenidos mediante el calentamiento a reflujo de los materiales iniciales de ácido respectivos por 48 horas en metanol pre-saturado con gas HCl. Las amidas (2a-2d, 2i-2l, 2o-2p, 2t-2u) fueron sintetizadas mediante el acoplamiento del ácido carboxílico respectivo con las aminas comercialmente disponibles (Aldrich o Lancaster) utilizando uno de los métodos. El primer método utilizó la metodología de NBS/PPh3 como se describe por Froyen (Froyen, 1997) . El segundo método utilizó IIDQ (Aldrich) como el reactivo de acoplamiento. El ácido carboxílico se hizo reaccionar primeramente con 1 equivalente de IIDQ en DMF anhidra a temperatura ambiente por 24 horas. La amina respectiva (2.0 equivalentes) fue luego agregada pura y la reacción fue calentada a 80°C por 2-6 horas. Después del tratamiento acuoso, se logró la purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice y precipitación a partir de cloruro de metileño/hexano, seguido por la RP-HPLC preparativa en columna C-18 (CH3CN/H20) , si es necesario. Las bencilaminas fueron comercialmente disponibles únicamente como sus correspondientes éteres de metilo protegidos en el grupo hidroxilo. En consecuencia, después de la formación de la amida, los grupos hidroxilo fueron desprotegidos mediante tratamiento con 6 equivalentes de BBr3 en DCM por 1 minuto a -78°C seguido por 1 hora a temperatura ambiente.

Tabla 6: actividad inhibitoria de pp60c"src de derivados de hidroxinaftaleno e inhibidores publicados, selectos. iiMJhádctces p±dicados a t? c Compuesto Rj R2 R-, R Rß X % de Inhibición a 100 µM IC50 µM) (desv. est.) la OH OH H H N/A N/A N/A N/A 5(+/-2) n.t lb OH H OH H N/A N/A N/A N/A 47(+/3) n.t. lc OH OH N/A N/A N/A N/A 19(+/-6) n.t.

Id NH2 H H H N/A N/A N/A N/A inactivo n.t. 2a OH OH H H OH H H 0 12(+/-4) n.t. 2b OH OH H H H OH H 0 51Í+/-1) 150 2c OH OH H H . H H OH 0 60(+/-7) n.t. 2d OH OH H H OH H OH Q 14(+/-2) n.t. 2e OH H OH H OH H H 0 39(+/-5) n.t. 2f OH H OH H H OH H 0 89(+/-l) 16 2g OH H OH H H H OH 0 23(+/-5) n.t. 2h OH H OH H OH H OH 0 56(+/-l) n.t. 2i OH OH H H H OMe H 0 33(+/-5) n.t. 2) OH OH H H H H OMe 0 35(+/-8) n.t. 2k OH OH H H OMe H H 13(+/-3) n.t. 21 OH OH H H H H OMe 14(+/-2) n.t. 2m OH H OH H OMe H H inactivo n.t. 2n OH H OH H H H OMe 4(+/-7) n.t. 2o OH OH H H OH H H 41(+/-2) n.t. 2p OH OH H H H H OH 49(+/-4) n.t. 2q OH H OH H OH H H 42(+/-2) n.t. 2r OH H OH H H OH H 55(+/-3) n.t. 2s OH H OH H H H OH 42(+/-3) n.t. 2t OH H H OH H OH H 0 68(+/-5) n.t. 2u OH H H OH H OH H 1 40(+/-3) n.t. 2v H H OH H H OH H 0 45(+/-5) n.t. Iminocromeno 9TA 30(+/-15) Lit8: 0.118 Piceatannol 41(+/-2) Lit13: 66 (lck) ST-638 37(+/-5) Emod?nd 22(+/-3) Lit'5 38 Tyrophostm A47 43(+/-3) Notas a la Tabla 6 a El procedimiento de ensayo previamente descrito (Lai et al . , 1998) fue utilizado con los siguientes componentes de ensayo, concentraciones finales y condiciones: MOPS 50.0 mM, cloruro de magnesio 4.02 mM, citrato de potasio 6.00 mM (utilizado como un amortiguador de Mg2+ para estabilizar el Mg2+ libre a 0.5 mM) , cloruro de potasio 99.0 mM, 2-mercaptoetanol 10.0 mM, ATP 198 µM, ADP 19.8 µM, pp60c"src recombinante, purificado, humano, de longitud completa, 10 U (Upstate Biotechnology Inc.), RR-SRC 2.00 mM, 4.0% de DMSO, pH 7.2, 37°C. Estas condiciones de ensayo completas han mostrado que (Choi, 1999) reproducen las condiciones intracelulares de pH, temperatura, Mg+ libre (0.5 mM) , fuerza iónica, osmolalidad, ATP/ADP y potencial de reducción. b Todos los nuevos compuestos fueron caracterizados por RMN de protones, El o Espectrometría de Masa FAB(+) y son puros mediante cromatografía en capa delgada. c N/A = No aplicable, n.t. = No probado. d ATP-competítiva.

La serie de los inhibidores de 2-carbonil-3, 6-dihidroxi-naftaleno (lb, 2e-2h, 2m-2n, 2q-2s) fueron sintetizados a partir del ácido 3 , 6-dihidroxi-2 -naftoico 6 utilizando los métodos anteriormente descritos. La síntesis del intermediario 6 que fue desarrollado es mostrada en el Esquema de Reacción 2 comenzando con el 2,7-dihidroxinaftaleno 3 comercialmente disponible (Aldrich) . 32 % TBDMS-Cl (l.l eq.) DMAP (5 mol %) DIEA (1.1 eq) DMF Anh. 0°C a ta. 4 h El compuesto Id fue sintetizado a partir del ácido 3-amino-2-naftoico (Aldrich) mediante la reacción con TMS-diazometano en DCM a temperatura ambiente. El compuesto 2v fue sintetizado a partir del ácido 6-hidroxi-2 -naftoico (Aldrich) utilizando el método de la amidación descrito por Froyen (Froyen, 1997) . Las condiciones del ensayo de cinasa han mostrado que influyen la actividad inhibitoria medida (Lawrence et al., 1998). En consecuencia, con el fin de determinar de manera precisa la potencia relativa de la clase recién diseñada de inhibidores de pp60c"src, la actividad inhibitoria de cuatro inhibidores de PTK no competititivos con ATP, previamente publicados, fue también probada. Piceatannol, ST-638, y Tyrphostin A47 fueron elegidos debido a que son comercialmente disponibles (Sigma o Calbiochem) , y son representativos del espectro de los inhibidores de PTK no competitivos de ATP, conocidos. Emodin (Calbiochem) es competitivo con ATP cuando se analiza con la tirosina-cinasa p56lck. Previamente, el iminocromeno 9TA fue el inhibidor pp60c"src no competitivo con ATP más potente, reportado (Huang et al., 1995). Ya que el iminocromeno 9TA no fue comercialmente disponible, éste fue sintetizado utilizando una novedosa ruta mediante la conversión del 3-aminofenol al éter de TBDMS correspondiente (1.1 eq. De TBDMS-Cl, 1.1 eq. de DIEA, 5% mol de DMAP, DMF, 24 horas, temperatura ambiente, 71%) . La anilina resultante fue acoplada utilizando 2.0 eq. Del ácido cianoacético (1.1 eq. de EDCI, 1.1 eq. De TEA, DMF, 18 horas, 75°C, 70%) . La condensación de la amida resultante con 1.2 eq. de 2 , 3-dihidroxibenzaldehído (piperidina catalítica, etanol absoluto, 2 horas, 60°C) seguido por desprotección (1.1 eq. de TBAF, THF, 15 min., 43% total) dio el iminocromeno 9TA con FAB(+)MS elemental satisfactoria, y análisis de RMN 1U, después de la purificación mediante cromatografía instantánea (DCM.-MeOH 10:1) . Las actividades inhibitorias mostradas en la Tabla 6 para los compuestos la-d y 2a-2v fueron determinadas utilizando pp60c"src recombinante humano, de longitud completa, purificado. Debido al número de compuestos probados, y al costo asociado, sus potencias en orden de rango fueron primeramente determinadas a una concentración constante de inhibidor (100 µM) . Como es predicho por los estudios de modelación, con base en la analogía al grupo hidroxilo de Tyr 1,162 de IRTK, fue observada una preferencia para la colocación del grupo hidroxilo de naftaleno sobre el carbono 6 versus 5 ó 7, en el éster (lb, 47% versus la, 5% y lc, 19%) y la amida (por ejemplo 2f , 89% versus 2b, 51% y 2t, 68%) . La predicción de que el acoplamiento de un grupo hidroxilo en el carbono 3 del naftaleno (imitando el NH del Tyr 1,162) podría mejorar la potencia, fue también confirmada (2f, 89% versus 2v, 45%) . Finalmente, la predicción de que la extensión del inhibidor como una amida en la posición 2 (imitando el enlace peptídico) podría mejorar adicionalmente la potencia, fue confirmada también (por ejemplo 2f, 89% versus lb, 47%) .

Los datos proporcionados en la Tabla 6 demuestran que al mover el grupo hidroxilo de la posición 6 óptima al carbono 5 de naftaleno adyacente, da como resultado un perfil de actividad de estructura diferente con respecto a la posición concurrente óptima del grupo o grupos hídroxilo en la cadena lateral amida (por ejemplo 2f/2g versus 2b/2c) . También es de importancia el reemplazo del grupo hidroxilo de la cadena lateral amida con un grupo metoxi correspondiente en los compuestos 2i-2n. En el caso de las N-fenil-amidas (2i-2j), su actividad, con relación a las hidroxi-amidas correspondientes '(2b-2c) , no fue reducida tan significativamente como en el caso de las N-bencil-amidas (2k-2n versus 2o-2q, 2s). Esto sugiere que en los derivados de bencilo, los grupos hidroxilo de la cadena lateral amida interactúan con la enzima como donadores de enlace hidrógeno, o los grupos metoxi también son grandes para ajustarse en el sitio del enlace. Un análisis más cuantitativo de la selectividad para colocar un grupo hidroxilo sobre el carbono 6 versus 5 se proporciona al comparar los IC50 de 2f (16 µM) versus 2b (15 µM) , respectivamente. Estos resultados también confirman que una caída de porcentaje de inhibición de aproximadamente 90% hasta aproximadamente 50% representa un orden de diferencia de magnitud en potencia, como se esperaba. De manera similar, una caída en el porcentaje de inhibición de aproximadamente 50% a 10%, podría representar otro orden de diferencia de magnitud en potencia. Una comparación directa del inhibidor más potente de esta serie, el compuesto 2f, con los 5 inhibidores de 5 PTK previamente mostrados en la Tabla 6, demuestra que, bajo éstas condiciones de ensayo, 2f es más potente por uno a dos órdenes de magnitud. De manera notable, el iminocromeno 9TA fue previamente reportado (Huang et al., 1995) para tener un IC50 de 118 nM contra pp60c~src, y fue el 10 más potente inhibidor pp60c~src competitivo no ATP conocido, pero bajo las condiciones del ensayo actual únicamente se observó una inhibición de 30% a 100 µM. Estos resultados vuelven a enfatizar (Lawrence et al., 1998) la importancia de comparar los inhibidores de proteína-cinasa bajo 15 condiciones idénticas de ensayo. Una meta de estos estudios fue la obtención de los inhibidores no peptídicos pp60c_src que no compiten con ATP. En consecuencia, el porcentaje de inhibición de pp60c_src por 2f y 2b a concentraciones constantes de 20 inhibidor fue verificado periódicamente como una función de incrementar [ATP] hasta un nivel de 1 mM del mimético celular. Ya que [ATP] tuvo poco efecto sobre el porcentaje de inhibición, 2f y 2b son inhibidores no competitivos con respecto ai ATP. El porcentaje de inhibición fue medido 25 utilizando concentraciones de ATP de 200, 500 y 1000 µM, —"-——»---"• - mientras que se mantuvo la concentración del inhibidor constante. Si el inhibidor es directamente competente con ATP, entonces este incremento total de 5 veces en [ATP] es equivalente a la disminución de la concentración del inhibidor 5 veces en términos del efecto sobre la inhibición porcentual. En consecuencia, la inhibición porcentual podría disminuir al valor observado en la curva de dosis respuesta de IC50 (obtenido con 200 µM de ATP) para 1/5 de la concentración del inhibidor de ajuste utilizado en este experimento si ocurre competencia directa con ATP. Para el inhibidor 2f (ajustado a 25 µM) se obtuvo una inhibición de 62% (±5), 54% (±3) y 50% (±1) a 200 µM, 500 µM y 1000 µM de ATP, respectivamente mientras que el nivel de inhibición podría haber caído aproximadamente 205 a 1,000 µM de ATP dsi ocurriera la competencia directa con ATP. Similarmente, para el inhibidor 2b (ajustado a 300 µM) se obtuvo una inhibición de 84% (±1), 81% (±1) y 77% (±2) a 200 µM, 500 µM y 1,000 µM de ATP, respectivamente.

El alto costo de muchas cinasas ha estimulado a otros investigadores para verificar periódicamente la potencia de inhibición como una función del incremento de [ATP] para el mismo objetivo (Saperstein et al., 1989; Burke et al., 1993; Davis et al., 1989; Davis et al., 1992; Faltynek et al., 1995; y Sawutz et al., 1996).

En resumen, el diseño basado en la estructura ha producido una serie de inhibidores no peptídicos pp60c_src de hidroxinaftaleno que no compiten con ATP. Los resultados con los compuestos de esta serie en ensayos basados en células así como estudios cinéticos detallados bajo diversas condiciones de ensayo, se reportarán en el curso debido. Una extensión de estos conceptos de diseño de la estructura de naftaleno hacia una estructura de indol se reporta en el documento siguiente.

Ejemplo 2. Diseño, Sintesis y Actividad de Inhibidores Derivados de Hidroxiindol Competitivos No ATP, de Tirosina-Cinasa pp60c_src En el ejemplo precedente, se describe el diseño basado en la estructura de una serie de inhibidores pp60c"src que utilizan una estructura de naftaleno. Estos compuestos fueron diseñados para enlazarse en el sitio del sustrato peptídico debido al potencial para la mayor selectividad y eficacia en un ambiente celular relacionado al sitio del sustrato de ATP alternativo.

Esquema de Reacción 1 Este ejemplo presenta una extensión de estos conceptos de diseño para una serie de inhibidores pp60c"src basados en una estructura de indol. Una vez más la estructura cristalina del PTK (IRTK) receptor de insulina autoinhibido, se utilizó para llevar a cabo estudios de modelación molecular cualitativa, excepto en este caso que se superpuso un anillo de indol sobre IRTK Tyr 1,162. Esta superposición indica que el NH de indol puede imitar el NH de Tyr 1,162, que un carbonilo debería reemplazar en la posición 2, y un grupo hidroxilo en la posición 5 para imitar el carbonilo de Tyr 1,162 y OH, respectivamente (Esquema 1). La ciclización conceptual de Tyr 1,162 al anillo más pequeño de 5 miembros de un indol ilustrado en el Esquema 1, con relación a un anillo de 6 miembros en el caso de la estructura del naftaleno (Karni et al., 1999), da como resultado un movimiento de la colocación óptima de OH proveniente del carbono 6 en la estructura del naftaleno hacia el carbono 5 en la estructura del indol. -i- .. .

Los derivados de amida de indol gue contienen cadenas laterales hidroxi-fenil/bencilo 2d-f, 2j-l (Tabla 7), respectivamente, fueron seleccionados con base en el incremento en la potencia del inhibidor pp60c~src observada para las hidroxifenilamidas basadas en naftaleno análogo reportadas en el ejemplo previo. Los esteres de metilo correspondientes 2a-c, g-i, v son precursores en la síntesis. Los análogos adicionales mostrados en la Tabla 7 fueron preparados para iniciar la expansión del intervalo de cadenas laterales más allá de los grupos hidroxi/metoxi que habían sido ahora extensamente probadas con las estructuras de indol y naftaleno. Las amidas de indol que contienen únicamente cadenas laterales hidroxi y metoxi fueron sintetizadas como se ilustra: Esquema de Reacción 2 El derivado de ácido 2-indolcarboxílico, la metoxifenilamina (1.1 eq. Adrich, Lancaster o Fluka), y el agente de acoplamiento PyBOP (benzotriazol-1-iloxi) tripirrolidino-fosfonio-hexafluorofosfato) (1 eq., Fluka) se disolvieron en dimetilformamida anhidra. La solución se enfrió a 0°C bajo atmósfera de argón y luego se agregó diisopropiletilamina (DIEA, 3 eq. ) . La reacción se agitó a 0°C por 1 minuto seguido por una hora a temperatura ambiente. Después de recoger el residuo, se purificó mediante cromatografía en gel- de sílice. Los esteres de metilo se escindieron con tribromuro de boro (1 M en DCM, Aldrich) cuando se consideró. El éter metílico de indol-amida se suspendió en DCM anhidro y se enfrió a -78°C bajo atmósfera de argón. Se agregó un equivalente de BBr3 para cada heteroátomo en el material inicial más un equivalente en exceso. La solución rojo oscuro resultante se agitó a -78°C por 30 minutos y luego a temperatura ambiente por 1-2 horas. La reacción se apagó con agua (10 minutos) antes de la recolección.

Tabla 7: actividad inhibitoria de pp60c_src de derivados de hidroxiindol. a-b'c Compuesto R2 R3 Rs % de Inhibición a 100 µM (desv. est. ) la OH CH3 N/A N/A N/A 40.+/-5) [a 500 µM] lb H OH OH CH2CH3 N/A N/A N/A 28(+/-3) 2a OH H — OCH3 H H 3(+/-l) 2b H OH H — H OCH3 H 2K +/-2) 2c H OH H — H H OCH3 39(+/-9) 2d OH H — OH H OH 43(+/-l) e OH H — OH 30.+/-6) f OH H — OH 45(+/-3) g OH H CH2 OCH3 H H 2K+/-5) h OH H CH2 H OCH3 H 7(+/-6) i OH H CH2 H H OCH3 18(+/-4) j OH H CH2 OH H H 24 (+/-3) k OH H CH2 H OH 74 ( +/-2) [IC5o=38 µM] 21 H OH H CH2 H H OH 54(+/-2) 2m H OH H CH2CH2 H H OH 2K + /-7) 2n H OH H CH2 H H C02H No activo 2o H OH H CH2 H H C02CH3 1K + /-4) 2p H OH H — H H CH2CO2H 7(+/-6) 2q H OH H — H H CH2C02CH3 32(+/-7) 2r H OH H -- H F H 2K + /-7) 2s H OH H CH2 H F H 57(+/-6) 2t H OH OH CH2 H OH H 26(+/-2) 2u H H OH CH2 H OH H 56(+/-63) 2v H H H CH2 H H OCH3 (+/-4) 2 H H H CH2 H H OH 36(+/-4) 2x OH H H CH2 H OH H 60(+/-3) 2y H OH H CH(CH3 )R H OH H 15.+/-3) 2z H OH H CH(CH3 )S H OH H 13(+/-7) a Todos los compuestos fueron probados como se describe en el documento precedente.5 b Todos los compuestos se caracterizaron mediante RMN de protones, FAB(+) MS y se purificaron mediante TLC. c N/A == No aplicable.

Utilizando esta ruta sintética, las series de inhibidores 2a-m, y, z de 5-hidroxiindolamida se prepararon a partir del ácido 5-hidroxi-2-indolcarboxílico. Las amidas 4- y 6-hidroxiindol (2x, u, respectivamente) se sintetizaron a partir de 4-metoxi-2-indolcarboxilato de metilo y 6-metoxi-2-indolcarboxilato de metilo, respectivamente. La amida 2t de 5, 6-dihidroxiindol se preparó a partir de 5, 6-dimetoxiindol-2-carboxilato de etilo. La sonicación de los esteres en NaOH 1 N por 1 hora, proporcionó los ácidos carboxílicos correspondientes para el acoplamiento. Las amidas 2v, w des-hidroxiindol se sintetizaron a partir de ácido indol-2-carboxílico . Todos los materiales iniciales de indol fueron comercialmente disponibles (Aldrich o Lancaster) . Los inhibidores 2r, s de fluoro, fueron preparados de igual modo a partir de las fluorofenilaminas correspondientes (Aldrich) . Los inhibidores que contienen esteres o ácidos carboxílicos sobre la cadena lateral de amida, 2n-q, se prepararon a partir de los ácidos aminocarboxílicos correspondientes (Aldrich) . El ácido carboxílico de la cadena lateral fue primeramente protegido como un éster metílico (MeOH anhidro pre-saturado con HCl, reflujo, 1 d) , seguido por acoplamiento de PyBOP (como se mencionó anteriormente) , luego saponificación al ácido carboxílico cuando se desee. El éster metílico la se preparó mediante el reflujo de una solución del ácido carboxílico toda la noche en metanol anhidro pre-saturado con gas HCl. El éster etílico lb se preparó mediante desprotección con BBr3 de 5,6-dimetoxiindol-2-carboxilato de etilo como se mencionó anteriormente. Todos los inhibidores listados en la Tabla 7 se purificaron mediante cromatografía en gel de sílice. Como en Marsilje 2000, la actividad de orden de 5 clasificación de esta serie de inhibidores de pp60c_src, se determinó primeramente a una concentración de inhibidor constante (Tabla 7). Se utilizó la misma concentración de inhibidor (100 µM) para la serie de inhibidores de indol actuales, la serie de inhibidores de naftaleno previos, y 10 cinco inhibidores PTK de la literatura no competitivos para ATP (ver documento precedente) . Esto permitió una comparación del orden de clasificación eficiente de 59 compuestos en total, bajo condiciones de ensayo idénticas. Los estudios de modelación predijeron que un 15 grupo hidroxilo en el carbono 5 de la estructura de indol podría ser óptima. La comparación del inhibidor de 5- hidroxi-indol 2k (74%) con el inhibidor 2u de 6-hidroxi- indol análogo (56%) y el inhibidor 2x (60%) de 4-hidroxi- indol confirma esta predicción, aunque la preferencia no es 20 fuerte. La predicción de que un grupo hidroxilo en el carbono 5 mejorará la actividad (con relación a un grupo no hidroxilo) se confirmó al comparar el inhibidor 21 (54%) de 5-hidroxi-indol con el inhibidor 2w (36%) deshidroxi correspondiente. -s'""»"~ -• Extendiendo los inhibidores de indol como aril- amidas en el carbono 2, se mejoró la potencia, como se esperaba con base en los inhibidores de naftaleno previos. Por ejemplo, el meta-hidroxibencilamida-indol 2k da 74% de inhibición a 100 µM, mientras que el éster metílico la análogo da únicamente 40% de inhibición a 500 µM. De manera interesante, la comparación del éster 5,6- dihidroxietílico lb (28%) a la arilamida 2t correspondiente (26%) mostró que la presencia simultánea del segundo hidroxilo en el carbono 6 previene el aumento de la potencia normalmente proporcionada por la cadena lateral de la meta-hidroxibencil-amida preferida de otro modo. Esta cadena lateral de amida fue la mejor de la serie actual cuando el grupo 5-hidroxilo está presente solo (2k, 74%) y todavía dio buena inhibición cuando un grupo 6-hidroxilo estuvo presente solo (2u, 56%) . También, la presencia simultánea de dos grupos hidroxilo en los carbonos 5 y 6 parece ser bien tolerada en ausencia de una cadena lateral amida (lb versus la y 2e) . Estos datos sugieren que un cambio en la orientación de enlace de la estructura de indol puede haber ocurrido debido a la presencia del segundo grupo hidroxilo y que una cadena lateral diferente de amida puede ahora ser preferida. La combinación óptima de las cadenas laterales en los carbonos 4-7 (incluyendo los reemplazos del grupo funcional por grupos hidroxilo (Lai et al., 1999)) y las cadenas laterales de amida está actualmente bajo investigación. En general, las relaciones de estructura de indol-actividad- ("SARs") se revelaron por los datos en la Tabla 7 paralelos a los que se reportan en el documento precedente para la estructura de naftaleno. En ambos casos, la colocación de un grupo hidroxilo sobre la estructura análoga al OH de Tyr 1,162, como se identificó por los estudios de modelación, proporcionó la más alta potencia. Al mover este grupo hidroxilo a uno de los carbonos adyacentes, se redujo la potencia, pero no dramáticamente en ambos casos. Extendiendo ambas estructuras con arilamidas en la posición identificada por los estudios de modelación para imitar el enlace peptídico Tyr 1,162, mejoró la potencia. Con ambas estructuras, la sustitución de un grupo metoxi por los grupos hidroxilo sobre la cadena lateral amida, usualmente redujo la potencia, y lo hizo a un grado mayor con la cadena lateral más grande de bencilamida (por ejemplo 2k, 74% versus 2h, 7% comparado a 2e, 30% versus 2b, 21%). La mayor diferencia en los SARs para estas dos estructuras es que la estructura de 5-hidroxiindol prefiere la cadena lateral más larga de m-hidroxibencilamida (2k, 74% versus 2e, 30%) mientras que la estructura de 3, 6-dihidroxinaftaleno análoga prefiere la cadena lateral más corta de amida derivada a partir de m-hidroxianilina . La estructura de 5-hidroxiindol no mostró esencialmente preferencia por la posición del grupo hidroxilo sobre la cadena lateral amida más corta (2d-f) mientras que con la cadena lateral más larga de hidroxibencilamida se observó una preferencia significativa por la posición meta (2j-l) . En el caso de la estructura 3, 6-dihidroxinaftaleno se observó lo contrario . Estudios de modelación molecular adicionales se llevaron a cabo para investigar adicionalmente la preferencia por una cadena lateral de amida más grande con la estructura de indol. El inhibidor de naftaleno más activo proveniente del reporte previo se utilizó como una plantilla después de que el inhibidor 2e de indol análogo y el inhibidor 2k de indol homologado se superpusieron. Los tres grupos funcionales de cadena lateral más importantes en el inhibidor de naftaleno 3 se consideraron que son el grupo 6-hidroxilo (donador y aceptor enlazados al H ) , el hidrógeno del grupo 3 hidroxilo (donador de enlace al H) , y el grupo hidroxilo de cadena lateral (aceptor de enlace al H) con base en el diseño racional y SAR para ambas series de inhibidores. Este modelo farmacóforo de tres puntos se identifica en ambas series por asteriscos en el Esquema de Reacción 3.

Esquema de Reacción 3 Los medios de SYBYLMR de "multiajuste", minimización de energía y "átomos de ajuste" (6.4, Tripos, Saint Louis) se utilizaron en secuencia para superponer 2e y 2k sobre 3. Este proceso de ajuste total se lleva a cabo con constantes de rebote (multiajuste) y pesos (átomos de ajuste) elegidos de modo tal que el énfasis más alto estuvo sobre la superposición óptima de los O's y H's farmacóforos (100) de la estructura, seguido por los O's de la cadena lateral (10) y luego por el enlace amida de intervención (1) . El proceso de "multiajuste" se ajustó a las conformaciones para el ajuste de farmacóforo máximo, la minimización subsecuente produjo las conformaciones de energía mínima local más cercana y finalmente el proceso de "átomos de ajuste" produjo la mejor superposición de farmacóforo de estas conformaciones minimizadas. Como se esperaba, los farmacóforos de estructura O's y H's de 2e y 2k, se superpusieron estrechamente y de manera similar sobre los átomos correspondientes en 3 (todos dentro de aproximadamente 0.50 Á). No obstante, los farmacóforos de cadena lateral O's de 2e y 2k difirieron significativamente en su superposición sobre el correspondiente O de 3, con desplazamientos de 1.8 Á versus únicamente 0.08 Á respectivamente. Este ajuste estrecho de los tres sitios clave de farmacóforo entre 2k y 3 proporciona una racionalización para su potencia que difiere únicamente por un factor de 2.4 (IC50's 38 µM versus 16 µM, respectivamente) . Al extender la cadena lateral de amida por otro átomo de carbono se redujo la actividad (2m, 21% versus 21, 54%). Agregando un grupo metilo al carbono bencílico de 2k, en la esteroquímica, redujo grandemente la actividad (2y, 15% y 2z, 13% versus 2k, 74%) . Reemplazando el grupo hidroxilo de cadena lateral (en la posición para) con un anión carboxilato (2, 0% versus 21, 54% y 2p, 7% versus 2f, 45%) redujo la actividad, mientras que los esteres metílicos correspondientes (2o, 11% y 2q, 32%, respectivamente) mostró una pérdida más pequeña de potencia. De manera importante, reemplazando el grupo hidroxilo de cadena lateral con un flúor mantuvo bastante de la potencia (2s, 57% versus 2k, 74% y 2r, 21% versus 2e, 30%) . En consecuencia, el análogo 2s fluorado únicamente dejó un grupo hidroxilo para el metabolismo potencial de Fase II (por ejemplo formación de glucurónido), y este grupo hidroxilo remanente es un objetivo actual para el reemplazo (Lai et al., 1998). Utilizando el mismo método como en el ejemplo precedente (Marsilje 2000), el inhibidor más potente proveniente de la serie actual de indol (2k) se analizó para la competencia con ATP mediante la verificación periódica del porcentaje de inhibición al incrementar [ATP] mientras se mantenía la concentración del inhibidor constante. Ya que el [ATP] tuvo poco efecto sobre el porcentaje de inhibición (el % de inhibición fue de 46% y 41% con 2k a 45 µM y [ATP] a 200 µM o 1,000 µM, respectivamente) , 2k no es competitivo con respecto a ATP bajo estas condiciones de ensayo. En resumen, se diseñó una estructura de indol y se llevó a cabo SAR inicial, para el desarrollo de inhibidores pp60c~src no competitivos para ATP. La potencia del mejor inhibidor basado en indol proveniente de la serie actual se encontró que era más cercana a aquella del mejor inhibidor basado en naftaleno. El % de inhibición fue 46% y 41% con 2k a 45 µM y [ATP] a 200 µM ó 1,000 µM, respectivamente .

Ejemplo 3 Sintesis de Inhibidores de Proteina-cinasa Derivados de Indol Los siguientes resultados muestran la síntesis y la prueba de los inhibidores de proteína-cinasa derivados de indol. Cuatro esquemas de reacción se proporcionan y separadamente seguido por detalles experimentales para la preparación del producto final de cada uno de estos esquemas de reacción. Estos productos finales son ejemplos de inhibidores de tirosina-cinasa basados en indol, en donde se ilustra la síntesis con grupos R preferidos (ácido borónico, Esquema l:OH, Esquema 2; una extensión de amina alifática, Esquema 3; y un ácido fosfónico, Esquema 4).

Esquema de Reacción 1 MeOH - HCl reflujo die anolaprina 5-hidroxi-2-indolcarboxilato de metilo (1) Se disuelven 3.50 g de ácido 5-hidroxi-2- indolcarboxílico en metanol anhidro pre-saturado con gas HCl. Se sometió a reflujo por 48 horas. Se concentró a vacío y se trituró con AcCN x3 para eliminar el ácido residual. Se filtró a través de una almoadilla de sílice con EtOAc para eliminar la contaminación de línea base. Se recuperaron 4.32 g (rendimiento cuantitativo) TLC Rf=.78 (EtOAc) RMN XH (DMSO-d6): 3.82 (s, 3H) , 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.88 (s, 1H) , 6.93 (s, 1H) , 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 8.90 (s, 1H), 11.62 (s, 1H) FAB(+) MS m/e 191.9 (m+1). 5- [ (trifluorometil) sulfoniloxi] indol-2-carboxilato de metilo (2) Se agregaron 150 ml de DCM anhidro a 3.24 g (17 mmol) 5-h?droxi-2-indolcarboxilato de metilo (1)= y 6.67 g (18.7 mm) de n-fenil-trifluorometan-sulfonamida a 0°C. Se agregaron 2.6 ml de trietilamina gota a gota, punto en el cual se formó una solución color amarillo claro. Se agitó a 0°C por 1 hora. Se calentó a temperatura ambiente y se agitó por 2 horas. Se concentró a vacío y se purificó a través ' de una columna de gel de sílice (1/1 EtOAc/hexanos). Se recuperaron 4.69 g (86%). TLC Rf=20.879 RMN :H (DMSO-de): 3.87 (s, 3H), 7.25 (s, 1H) , 7.31 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.55 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.80 (s, 1H) , 12.34 (s, 1H) , FAB(+) MS m/e 323.1 (M+l). 5-metilindol-2-carboxilato de metilo, 4, 4 ,5, 5-te rame il-1 , 3,2-dioxaborolanometilo (3) 500 mg, 1.55 mmol de 5- [ (trifluorometil) sulfoniloxi] indol-2-carboxilato de metilo (2), 37.9 mg (0.05 mmol) de PdCl2 (dppf), 432 mg (1.7 mmol) de bispinacolatodiboro, 454.8 mg (4.65 mmol) de acetato de potasio, y 25.7 mg (0.05 mmol) de dppf se agregaron a un matraz y se secaron a vacío a 40°C por 2 horas. Se agregaron 20 ml de dioxano anhidro y se calentaron a 80°C toda la noche. La reacción se volvió negra conforme precipitada el negro de Pd. Se filtró el catalizador y se corrió el amortiguador de sílice para eliminar las impurezas de línea base. TLC Rf=.51 (1/4 EtOAc/hexano).

Se recogió el producto crudo a través de la siguiente reacción. 5-boronil-indol-2-carboxilato de metilo (4) 391.2 mg (1.3 mmol) de 5-metilindol-2-carboxilato de metilo, 4, 4, 5, 5-tetrametil-l, 3, 2-dioxaborolanometilo (3) se disolvieron en EtOAc. 0.25 ml (2.6 mmol) de dietanolamina se agregaron y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. El ppt blanco que se formó se filtró y se sónico en HCl 1 N. El ppt blanco resulante se filtró, se disolvió en metanol, y se concentró a vacío. Se recuperaron 36.6 mg (13%). HPLC Rf=13.912, RMN XH (DMS0-d6) : 3.85 (s, 3H) , 7.15 (s, 1H) , 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.67 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.87 (s, 1H) , 8.14 (s, 1H), 11.91 (s, 1H) .

Esquema de Reacción 2 BBr, DCM Reemplazar con F luego HO. Inhibición de pp60c-src: 57% a lOOµM Reemplazar con B(OH)2 luego Inhibición de pp60c-src: A L -56% a l00µM Inhibición de pp60c-src: 74% a lOOµM IC50 = 38 µM (Incluido en Manuscrito) (5-hidroxiindol-2-il) -N- [ (3-metoxifenil)metil] carboxiamida (5) Se disolvieron 2 q (11.3 mmol) de ácido 5-hidroxi-2-indolcarboxílico, 1.6 ml (12.4 mmol) de 3-metoxibencilamina, y 5.87 g (11.3 mmol) de PyBOP en 10 ml de DMF anhidra. Se enfrió a 0°C y se agregaron 5.9 ml (33.9 mmol) de DIEA. Se agitó por 5 minutos a 0°C y se dejó calentar a temperatura ambiente por 1 hora. Se recuperaron 2.83 g (85% de rendimiento) TLC Rf=.34 (1/1 EtoAc/hexanos) RMN XH (DMSO-d6) : 3.70 (s, 3H) , 4.43 (d, J = 4.4 Hz, 2H) , 6.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 6.78 (d, J = 7.7 Hz, 1H) , 6.83 (s, 1H), 6.86 (s, 1H) , 6.94 (s, 1H) , 7.20 (m, 3H), 8.92 (t, J = 4.4 Hz, 1H) , 11.36 (s, 1H) , FAB(+) MS m/e 297.3 (M+l). (5-hidroxiindol-2-il) -N[ (3-hidroxifenil)metil] carboxiamida (6) Se agregaron 20 ml de DCM anhidro a 200 mg (0.67 mmol) de (5-hidroxiindol-2-il) -N [ (3-metoxifenil) metil] carboxiamida (5) y se enfrió a -78 °C bajo atmósfera de argón. Se agregaron 4.0 ml (4.0 mmol, 6 eq. ) de BBr3. Se mantuvo a -78 °C por 5 minutos y se calentó a temperatura ambiente. Después de 90 minutos a temperatura ambiente, se apagó con agua y se agitó por 10 minutos. Se diluyó mezcla de rxn con acetato de etilo y se lavó con NaHC03 y salmuera. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de magnesio y se concentró a vacío. Se corrió a través de amortiguador de sílice para eliminar la contaminación de línea base. Se recuperaron X mg (80% de rendimeinto) TLC Rf=0.21 (1/1 EtOAc/hexanos). RMN XH (DMSO-d6) : 4.38 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 6.59 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 6.71 (m, 3H) , 6.83 (d, J = 1.8 Hz, 1H) , 6.94' (s, 1H) , 7.08 (dd, J = 7.7 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 8.84 (t, J = 5.9 Hz) , 11.2í (s, 1H) . FAB(+) MS m/e 283.2 (M+l) .

Esquema de Reacción 3 Inhibición de ppóOc-src: 39%al00µM N. (l-carbamoil-2-metilbutil) (5-hidroxiindol-2-il) carboxiamida (7) 100 mg (0.56 mmol) de ácido 5-hidroxi-2-indolecarboxílico, 103.4 mg (0.62 mmol, 1.1 eq. ) de L-isoluecinamida, y 291 mg (0.56 mmol, 1 eq. ) de PyBOP se disolvieron en 1 ml de dimetilformamida anhidra. La solución se enfrió a 0°C y se agregaron 0.3 ml (1.68 mmol, 3 eq. ) de DIEA. La mezcla de reacción se agitó por 1 minuto a 0°C y a temperatura ambiente por 1 hora. La reacción se diluyó luego con acetato de etilo y se lavó con ácido clorhídrico ÍN x 3 y NaHC03 x 3 saturado. La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró a vacío para dar 166.7 mg (91% de rendimiento) TLC Rf=0.08 (1/1 EtOAc/hexanos). RMN XH (DMS0-d6): 0.83 (m, 6H) , 1.15 (m, 2H) , 1.68 (m, 1H) , 1.83 (m, 1H) , 4.29 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 6.83 (s, 1H) , 7.01 (s, 1H, 7.06 (s, 1H), 7.19 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.48 (s, 1H) , 8.00 (d, 9.2 Hz, 1H), 8.76 (s, 1H) , 11.3 (s, 1H) . FAB(+) MS m/e 290.1 (M+l).

Esquema de Reacción 4 Inhibición de PP60c-src 11 % at 500 µM 5-dibencilfosforilindol-2-carboxilato de metilo (8) 200 mg (0.62 mmol) 5- [ (trifluorometil) sulfoniloxi] indol-2-carboxilato de metilo (2), 195.8 mg (0.74 mmol, 1.2 eq. ) de dibencilfosfito, 0.14 ml (0.81 mmol, 1.3 eq. ) de DIEA, y 35.7 mg (0.03 mmol, 55 mol) de Pd(PPh3)4 se disolvieron en AcCN anhidro bajo atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó a 80°C toda la noche. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y el compuesto del título se aisló mediante cromatografía sobre gel de sílice, se obtuvieron 130 mg (50% de rendimiento. TLC Rf= 0.28 (1/1 EtOAc/hexanos) RMN XH (DMSO-de): 3.85 (s, 3H) , 4.98-5.01 (m, 4H) , 7.28-7.32 (m, 11H), 7.53-7. ,55 (m, 2H) , 8.17 (d, J = 14.6 Hz, 1H) RMN 31P (DMSO-de) : 23.89. 5-fosfonolindol-2-carboxilato de metilo Se disolvieron 125 mg de 5-dibencilfosforilindol-2-carboxilato de metilo (8) en 10 ml de metanol. Se agregaron 20 mg de Pd-C y la mezcla se hidrogenó en un aparato Parr toda la noche. Se filtró el catalizador y se eliminó el solvente bajo presión reducida. Se obtuvieron 72.5 mg (73% de rendimiento). TLC Rf=línea base en EtOAc. RMN XH (DMSO.-d6): 3.84 (s, 3H) , 7.24 (s, 1H) , 7.44-7.49 (m, 2H) , 8.01 (d, J = 14.3 Hz, 1H) , 12.11 (s, 1H) . RMN 31P (DMSO-de): 17.22.

Los compuestos éster en este ejemplo podrían incrementar su potencia al convertir el éster a una amida y/o agregar elementos de especificidad adicionales.

Ejemplo 4 Síntesis de Inhibidores de Proteina-Cinasa Derivados de Indol Se ilustra enseguida la síntesis de algunos inhibidores de indol elaborados. Estas síntesis podrían dar como resultado compuestos con mayor potencia contra pp60c_src y otras tirosinas-cinasas. El grupo éster metílico puede ser subsecuentemente convertido en diversos derivados de amida para incrementar la potencia.

Esquema de Reacción 1 o NaN, O BN A OCH MeOH reflujo OCH, xilenos reflujo N OCH3 Esquema de Reacción 2 H3c H HO OH H0'B H3CO^^N OCH3 H Esquema de Reacción 3: Ejemplo 5 Toxicidad de Inhibidores de src Existe considerable apoyo en la literatura reciente para dirigir pp60c"src (Src) como un procedimiento ampliamente útil para la terapia contra el cáncer, sin toxicidad seria resultante. Por ejemplo, tumores que muestran señalización de PTK del receptor de EGF, mejorada, o que sobreexpresan el receptor Her-2/neu relacionado, han activado constitutivamente src y mejoraron la invasividad del tumor. La inhibición de Src en estas células induce la detención del crecimiento, dispara la apoptosis, y revierte el fenotipo transformado (Karni et al., 1999) . Se sabe que la actividad de Src elevada en forma anormal, permite a las células transformadas desarrollarse de una manera independiente del anclaje. Esto es aparentemente provocado por el hecho de que la señalización de matriz extracelular eleva la actividad de Src en la vía FAK/Src, de una manera coordinada con la señalización mitogénica, y por lo tanto bloquea un mecanismo apoptótico que pudiera normalmente haber sido activado. En consecuencia, la inhibición de FAC/Src en células tumorales puede inducir apoptosis debido a que el mecanismo apoptótico que podría haberse activado normalmente después de que se pudo haber inducido el rompimiento libre de la matriz extracelular (Hisano et al., 1997) . Además, la expresión reducida de ARNm de VEGF se notó después de la inhibición de Src y los tumores derivados provenientes de estas líneas celulares inhibidas por Src mostraron desarrollo reducido angiogénico (Ellis et al., 1998) . El surgimiento de toxicidad potencial de la inhibición de Src ha sido dirigido con resultados muy promisorios. Por ejemplo, una supresión del gen Src en ratones produjo únicamente un defecto, a saber, los osteoclastos que fallaron para formar límites ondulados y en consecuencia no resorbieron hueso. No obstante, la función de resorción ósea por osteoclastos fue rescatada en estos ratones al insertar un gen Src defectuoso de cinasa (Schwartzberg et al., 1997). Esto sugirió que la actividad de cinasa de Src puede ser inhibida in vivo sin disparar la toxicidad únicamente conocida debido a la presencia de la proteína Src es aparente suficiente para enganchar y activar otros PTKs (que son esenciales para mantener la función de osteoclastos) en un complejo de señalización esencial de osteoclastos. Src ha sido propuesto como un objetivo "universal" para terapia contra el cáncer, ya que se ha encontrado que éste es sobreactivado en un número cada vez mayor de tumores humanos, además de aquellos anteriormente observados (Levitzki, 1996) . Los beneficios potenciales de la inhibición de Src para terapia contra el cáncer, parecen ser de cuádruples con base en lo citado anteriormente, y la literatura adicional. Estos son: 1) Inhibición del desarrollo celular descontrolado, provocado por los efectos de bucle del factor de desarrollo autocpno, etc. 2) Inhibición de metástasis debida al disparo de la apoptosis después del rompimiento libre a partir de la matriz celular. 3) Inhibición de la angiogénesis tumoral por medio de niveles reducidos de VEGF. 4) Baja toxicidad. Los inhibidores de Src no peptídicos iniciales también han mostrado resultados muy alentadores en cuatro diferentes series de ensayos de cultivo celular. 1) En el ensayo de panel de células tumorales NIH 60 , se observó amplia actividad (como podría esperarse para un inhibidor Src) contra las líneas celulares tumorales, incluyendo las líneas de próstata. Por ejemplo, tres de los inhibidores dieron los siguientes IC50 de inhibición de desarrollo contra las líneas celulares de cáncer de próstata NIH: TOM 2-32 (PC-3, 15 µM,; DU-145, 38 µM) , TOM 2-47 (PC-3, 19 µM) , KLM 2-31 (PC-3, 39 µM; DU-145, >100 µM) . 2) En la línea celular de riñon de rata normal transformada con v-Src (LA25) TOM 2-47 y TOM 2-32 específicamente bloquearon el desarrollo celular inducido por v-Src sin inhibir el desarrollo normal de las células progenitoras no transformadas. Este resultado mostró que los inhibidores no afectan las células normales pero que son efectivos bloqueando la transformación celular inducida por Src. 3) Los inhibidores de Src para fármacos contra el cáncer, etopósido, taxol, doxorrubicina y cisplatino en tumores de ovario provenientes de tres pacientes diferentes y un carcinoma abdominal de otro paciente. En todos los casos, los inhibidores de Src fueron al menos tan efectivos, y típicamente más efectivos, que los fármacos conocidos contra el cáncer , con eficacia total observada a las dosis probadas más bajas (3 µM) . Como un ejemplo representativo, se muestra en la Figura 15A una comparación del taxol y doxorrubicina (éstos fueron más efectivos que el etopósido yel cisplatino en este cultivo de células tumorales particulares) con los tres inhibidores de Src mencionados anteriormente que utilizan células de tumor de ovario del tumor N015. 4) Los inhibidores de Src también fueron probados para la inhibición del desarrollo de células de fibroblastos humanas normales y no se encontró inhibición del crecimiento celular normal (subconfluente y confluente; se observó en vez de esto algún desarrollo aumentado) , indicando que estos inhibidores no son tóxicos para las células normales incluso a una concentración más alta de 10 veces. Un ejemplo de estos datos se da en la Figura 15 B. En su conjunto, los datos de las células obtenidos hasta ahora, muestran que se podría esperar para los inhibidores de Src por ejemplo actividad amplia contra muchas líneas celulares de cáncer con poca o ninguna toxicidad para las células normales. Los inhibidores de Src preliminares son estructuras guía a partir de las cuales es posible diseñar inhibidores más potentes y selectivos. Además, al utilizar las estructuras cristalinas de tirosina-cinasa, pueden ser llevados a cabo estudios de modelación molecular con el producto natural damnacantal inhibidor de tirosina-cinasa (Faltyne et al., 1995) para investigar su modo de enlace competitivo para el péptido. Estos estudios de modelación adicionales son capaces de diseñar análogos adicionales de inhibidores de Src en donde los elementos farmacóforos claves de damnacantal son incorporados en los nuevos inhibidores. Sus síntesis se emprenderán y la prueba de Src aislado se realizará como se reporta (Marsilje 2000) . Aunque han sido descritas modalidades preferidas con detalle en la presente, será aparente para aquellos expertos en la técnica relevante que pueden ser realizadas diversas modificaciones, adiciones, sustituciones, y similares, sin apartarse del espíritu de la invención y éstas por lo tanto están consideradas dentro del alcance de la invención, como se define en las reivindicaciones siguientes .

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para la identificación de inhibidores de proteínas-cinasas , caracterizado porque comprende: la provisión de un primer módulo que tiene uno o más grupos funcionales para el enlace a residuos catalíticos de la proteína-cinasa; la combinación del primer módulo con un segundo módulo que proporciona una estructura no peptídica; y la selección de combinaciones del primero y segundo módulos que inhiben la actividad proteína-cinasa.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque proporciona un primer módulo que comprende : el acoplamiento del primer módulo a una estructura peptídica; la identificación de uro o más grupos funcionales que se enlazan preferentemente a residuos catalíticos de la proteína-cinasa; y en donde la combinación del primer módulo con el segundo módulo comprende: la sustitución del segundo módulo por la estructura peptídica.

3. el método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste del ácido borónico, un grupo hidroxilo, ácido fosfónico, ácido sulfámico, un grupo guanidino, ácido carboxílico, un aldehido, una amida, y ácido hidroximetilfosfónico.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el primer módulo comprende dos o más grupos funcionales.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo ácido borónico.

6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo hidroxilo.

7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo amida.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el grupo amida es una tricarbonilamida vecina.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo módulo comprende un grupo seleccionado del grupo que consiste de indol, naftaleno, bifenilo, isoquinolina, benzofurano y benzotiofeno.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el segundo módulo comprende un indol.

11. El método de conformidad con la 5 reivindicación 9, caracterizado porque el segundo módulo comprende naftaleno.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque más de un primer módulo se enlaza al segundo módulo. 10

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer módulo comprende además una cadena lineal que comprende entre uno y tres átomos de carbono que enlazan el primer módulo al segundo módulo. 15

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque uno de los átomos de carbono en la cadena lineal está sustituido con un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre.

15. El método de conformidad con la 20 reivindicación 1, caracterizado porque la proteína-cinasa es una proteína tirosina-cinasa.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína tirosina-cinasa se selecciona del grupo que consiste de 25 pp60c_src, p56lck, ZAP-cinasa, tirosina-cinasa del receptor de Jt_a*¡awl??¡£h factor de crecimiento derivado de plaquetas, Bcr-Abl, tirosina-cinasa del receptor de VEGF, y tirosina-cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, y tirosina- cinasas similares al receptor del factor de crecimiento epidérmico.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la proteína tirosina-cinasa es pp60c_src.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína-cinasa es una proteína serina-cinasa.

19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína serina-cinasa se selecciona del grupo que consiste de MPA-cinasa, proteína-cinasa C, y CDK-cinasa.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además: agregar uno o más elementos de cadena lateral de especificidad a la combinación del primero y segundo módulos.

21. Un método para la identificación de inhibidores de proteína-cinasa mejorados, caracterizado porque comprende: la provisión de un primer inhibidor producido de conformidad con el método de la reivindicación 1, la modificación del primer módulo, cadenas laterales de especificidad, o una combinación de los mismos del primer inhibidor; y la identificación de inhibidores modificados que tienen una habilidad incrementada para inhibir la actividad de la proteína-cinasa cuando se comparan al primer inhibidor no modificado.

22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de la proteína-cinasa inhibe la actividad de la proteína-cinasa pero no inhibe que el ATP se enlace a la proteína-cinasa.

23. Un método para probar compuestos para una habilidad para inhibir la actividad de la proteína-cinasa, caracterizado el método porque comprende: la provisión de un inhibidor de proteína-cinasa de conformidad con el método de la reivindicación 1, la medición de la actividad de la proteína-cinasa en presencia del inhibidor a la misma temperatura, pH, fuerza iónica, osmolaridad, y concentración de magnesio libre como se encuentra en una célula, que expresa la proteína-cinasa; y la comparación del nivel de la actividad de la proteína-cinasa al nivel de actividad de la proteína-cinasa sin la presencia del inhibidor.

24. Un método para inhibir una proteína-cinasa, caracterizado porque comprende: poner en contacto la proteína-cinasa con un compuesto que comprende un primer módulo que tiene una funcionalidad para enlazarse a residuos catalíticos de la proteína-cinasa y un segundo módulo que proporciona una estructura no peptídica, en donde la combinación del primero y segundo módulos inhibe la actividad de la proteína-cinasa.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de ácido borónico, hidroxilo, ácido fosfónico, ácido sulfámico, un grupo guanidino, ácido carboxílico, un aldehido, una amida, y ácido hidroximetilfosfónico.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo ácido borónico.

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo hidroxilo.

28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el segundo módulo comprende un grupo seleccionado del grupo que consiste de indol, naftaleno, bifenilo, isoquinolina, benzofurano y benzotiofeno.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el segundo módulo comprende un indol.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el segundo módulo comprende naftaleno.

31. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque más de un primer módulo se enlaza al segundo módulo.

32. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque una cadena lineal que comprende entre uno y tres átomos de carbono, enlaza el primer módulo al segundo módulo.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque uno de los átomos de carbono en la cadena lineal está sustituido con un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre.

34. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína-cinasa es una proteína tirosina-cinasa.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína tirosina-cinasa se selecciona del grupo que consiste de pp60c~src, p56lck, ZAP-cinasa, tirosina-cinasa del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas, Bcr-Abl, tirosina-cinasa del receptor de VEGF, y tirosina-cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, y tirosina-cinasas similares al receptor del factor de crecimiento epidérmico.

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína tirosina-cinasa es pp60c_src.

37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el compuesto tiene la siguiente fórmula: en donde Ri es H o OH, R2 es H o OH, R3 es OH o H, y R4 es CH3, CH2(CH3)R o CH2(CH3)S, R5 es OCH3, H o OH, R6 es OCH3, F, H o OH, y R es OCH3, H, OH, C02H, C02CH3, CH2C02H o CH2C02CH3. — -* i-

38. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el compuesto tiene la siguiente fórmula: en donde Ri eS OH o H, R2 es OH o H, R3 es OH o H, R4 es OH o H, R5 es OH, OMe, o H, R6 es OH, OMe, o H, R7 es OH, OMe o H, y X es 0 ó 1.

39. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el compuesto tiene un grupo de especificidad que es una amida alifática.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el compuesto tiene la siguiente estructura:

41. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína-cinasa es una proteína serina-cinasa.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la proteína serina-cinasa se selecciona del grupo que consiste de MPA-cinasa, proteína-cinasa C, y CDK-cinasa.

43. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el compuesto comprende además uno o más elementos de cadena lateral de especificidad acoplados a la combinación del primero y segundo módulo.

44. Un inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa, caracterizado porque tiene la fórmula: en donde Ri es H o OH, R2 es H o OH, R3 es OH o H, y R4 es CH3, CH2 (CH3) R, o CH2 (CH3) S , R5 es OCH3, H o OH, R6 es OCH3 , F, H o OH, y R7 es OCH3, H, OH, C02H, C02CH3, CH2C02H o CH2C02CH3„

45. El inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el inhibidor no peptídico de proteína tirosina-cinasa inhibe la actividad de tirosina-cinasa pP60c-src .

46. Un inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa, caracterizado porque tiene la fórmula: en donde R: es OH o H, R2 es OH o H, R3 es OH o H, R4 es OH o H, R5 es OH, OMe, o H, R6 es OH, OMe, o H, R7 es OH, OMe o H, y X es 0 ó 1.

47. El inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque Rx es OH, R2 es OH, R3 es H, R4 es H, R5 es OMe, R6 es H, R es H, y X es 1.

48. El inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa inhibe la actividad de la tirosina-cinasa pp60c_src.

49. Un inhibidor no peptídico de la proteína tirosina-cinasa, caracterizado porque tiene la fórmula:

50. Un método para el tratamiento de una condición, que responde a un inhibidor de la proteína-cinasa, en un paciente, caracterizado el método porque comprende: la administración de una dosis efectiva de un inhibidor de la proteína-cinasa a un paciente, en donde el inhibidor de la proteína-cinasa comprende un primer módulo que tiene una grupo funcional para enlazarse a los residuos catalíticos de la proteína-cinasa y un segundo módulo que proporicona una estructura no peptídica, en donde la combinación del primero y segundo módulos inhibe la actividad de la proteína-cinasa.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la condición se selecciona del grupo que consiste de cáncer, psoriasis, artroesclerosis, o actividad del sistema inmune.

52. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de ácido borónico, hidroxilo, ácido fosfónico, ácido sulfámico, un grupo guanidino, ácido carboxílico, un aldehido, una amida y ácido hidroximetilfosfónico.

53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo ácido borónico.

54. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el primer módulo comprende un grupo hidroxilo.

55. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el segundo módulo comprende un grupo seleccionado del grupo que consiste de indol, naftaleno, bifenilo, isoquinolina, benzofurano y benzotiofeno.

56. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el segundo módulo comprende indol .

57. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el segundo módulo comprende naftaleno.

58. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque más de un primer módulo se enlaza al segundo módulo.

59. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque una cadena lineal que comprende entre uno y tres átomos de carbono, enlaza el primer módulo al segundo módulo.

60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque uno de los átomos de carbono en la cadena lineal está sustituido con un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre.

61. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la proteína-cinasa es una proteína tirosina-cinasa.

62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la proteína tirosina-cinasa se selecciona del grupo que consiste de pp60c"src, p56lck, ZAP-cinasa, tirosina-cinasa del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, Bcr-Abl, tirosina-cinasa del receptor de VEGF, y tirosina-cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, y tirosina-cinasas similares al receptor del factor de crecimiento epidérmico .

63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la proteína tirosina-cinasa es pp60c~src.

64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el compuesto tiene la siguiente fórmula: en donde Ri es H o OH, R2 es H o OH, R3 es OH o H, y R4 es CH3, CH2(CH3)R, o CH2(CH3)S, R5 es OCH3, H o OH, R6 es OCH3, F, H o OH, y R7 es OCH3, H, OH, C02H, C02CH3, CH2C02H o CH2C02CH3.

65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el compuesto tiene la siguiente fórmula: en donde R? es OH o H, R2 es OH o H, R3 es OH o H, R4 es OH o H, R5 es OH, OMe, o H, R6 es OH, OMe, o H, R7 es OH, OMe o H, y X es 0 ó 1.

66. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el compuesto tiene la siguiente fórmula:

67. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la proteína-cinása es una proteína serina-cinasa.

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la proteína serina-cinasa se selecciona del grupo que consiste de MPA-cinasa, proteína-cinasa C, y CDK-cinasa.

69. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el compuesto comprende además uno o más elementos de cadena lateral de especificidad acoplados a la combinación del primero y segundo módulo.