MXPA01005510A

MXPA01005510A - Novedosos metodos para proteger plantas de patogenos

Info

Publication number: MXPA01005510A
Application number: MXPA/A/2001/005510A
Authority: MX
Inventors: Darin J Moon; Anne J Anderson
Original assignee: Anne J Anderson; Darin J Moon; Redox Chemicals Inc
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2003-11-07

Abstract

Esta invención proporciona novedosos métodos para mejorar la calidad y rendimiento de la planta en la presencia de patógenos. El método aumenta los niveles de proteínas relacionadas con la patogénesis, tales como PR1, fenilalanina amoníaco liasa o proteínas de paredes celulares de la planta, tales como, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, en una planta, al poner en contacto la planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de la especie de oxígeno reactivo es suficiente para incrementar la cantidad de la proteína relacionada con la patogénesis por encima del nivel inducido por el inductor sistémico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo. Una especie de oxígeno reactivo preferida esácido peracético;un inductor sistémico de planta preferido esácido salicílico.

Description

NOVEDOSOS MÉTODOS PARA PROTEGER PLANTAS DE PATÓGENOS REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Este caso es una continuación en parte de solicitud de patente provisional serial no. 60/1 1 0, 835, presentada el 3 de diciembre de 1 998, cuyo contenido se incorpora por referencia.

DECLARACIÓN EN CUANTO A LOS DERECHOS A I NVENCIONES HECHAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO PATROCINADOS FEDERALM ENTE No aplicable.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCIÓN 1. Campo de la invención Esta invención se refiere a métodos para incrementar la resistencia de plantas a patógenos de plantas. De manera más específica , esta invención se refiere al sorprendente descubrim iento de q ue la aplicación a plantas de una o más especies de oxígeno reactivo y de uno o más inductores sistémicos de plantas, ya sea de manera simultánea o dentro de un corto tiempo entre uno y otro, resulta en un incremento en el nivel de proteínas relacionadas con patogénesis y de resistencia sistémica adquirida en las plantas sobre el efecto de cualq uiera solo. 2. Antecedentes El cultivo comercial de plantas es una parte principal de la econom ía, abarcando no solo cosechas cultivadas para alimento humano y alimento animal , sino también aquéllas, como algodón , cultivado para fibra, y otros , tales como flores, cultivadas por belleza. La importancia de las plantas para la gente y para la econom ía difícilmente puede exagerarse. Sin em bargo, las plantas también son sometidas al constante ataque de insectos, hongos, bacterias, virus, nemátodos y otros patógenos. Cuando los patógenos encuentran plantas susceptibles, estos ataques pueden resultar en la pérdida de rendimiento y calidad, y pueden resultar en la pérdida de cosechas enteras. Estas pérdidas resultan en daño económico substancial para los cultivadores y, en algunas áreas del mundo, contribuyen a la hambruna . Excepto por aquéllos granjeros que practican el cultivo orgánico, m uchos intentos para controlar los patógenos involucran el uso de pesticidas , tales como fungicidas e insecticidas. S in embargo , muchos pesticidas han sido retirados del mercado debido a q ue tienen impactos am bientales indeseables, y muchos actualmente en el mercado están siendo escudriñados por su impacto ambiental y pueden ser retirados en el futuro. Además , pocos pesticidas, si acaso, son efectivos contra el rango com pleto de plagas, las cuales pueden atacar una cosecha dada desde el sembrado hasta la cosecha hasta almacenamiento post-cosecha. Así, puede necesita rse aplicar u na variedad de diferentes pesticidas con diferentes organismos objetivo. Cada uno debe ser a pl icado al tiem po correcto en el creci miento de las plantas para proporcion ar el control efectivo de l org anismo objetivo , cada uno tiene sus propios req uerimientos para manejo y aplicación, y cada uno puede requerir diferente equipo especializado. Más aún, muchos pesticidas son tóxicos o tienen residuos tóxicos, y su uso es, en consecuencia, restringido frecuentemente a ciertas ventanas de tiempo antes de la cosecha, después de lo cual no pueden ser usados debido al peligro potencial al consumidor. Durante esta ventana, la cosecha puede estar esencialmente desprotegida, o incluso puede necesitarse otro agente, más seguro para usarse cerca de la cosecha. El uso de agentes químicos tradicionales requiere, por lo tanto, planeación complicada, habilidad para escoger el tiempo oportuno y un esfuerzo considerable. Aunque los pesticidas forman el volumen de intentos por granjeros para proteger las plantas del ataque patogénico, no toda la protección de las plantas contra patógenos viene de la aplicación de pesticidas. Durante décadas, se ha sabido que las plantas también tienen una amplia variedad de defensas estructurales y bioquímicas contra el ataque por patógenos. Ver, por ejemplo, Agrios, G., Plant Pathology, Academic Press, San Diego CA (3a ed., 1988). Una de las defensas bioquímicas producidas por plantas en respuesta al ataque es la resistencia inducida, en la cual las plantas que han sido inoculadas con agentes biológicos, o pretratadas con varios químicos, desarrollan resistencia no específica no solo al agente inicial por sí mismo, sino también a una variedad de agentes patogénicos, tales como virus, hongos, bacterias y algunos insectos. La resistencia inducida normalmente comienza en el área alrededor de la inoculación inicial, pero sobre el curso de unos cuantos días, puede esparcirse a porciones de la planta no inoculadas , un fenómeno conocido como resistencia sistémica inducida, o como resistencia sistémica adqu irida ("SAR"). Una variedad de compuestos, tales como ácido salicílico, puede inducir resistencia. Ver, por ejemplo, Klessig , D. Y Malamy, J . , Plant Mol. Biol . , 26: 1 439- 1458 ( 1 994); Raskin , I . , Annu . Rev. Plant Physiol . Plant Mol. Biol. 43:439-463 (1992). Pueden usarse para inducir resistencia local, mediante inyección o atomización, o para inducir SAR cuando se absorbe, por ejemplo, a través de las raíces. Ver, de manera general, Agrios, supra, en Capítulos 5 y 9. La SAR se desarrolla unos 7 días o más después de la exposición al inoculante o agente qu ímico y normalmente dura durante unas 3 a 5 semanas. Id . Debido a que la SAAR protege plantas contra muchas plagas diferentes , aumentar la SAR en las cosechas podría disminuir potencialmente o incluso eliminar la necesidad de aplicar pesticidas tóxicos . Además, debido a que la SAR protege contra una multitud de patógenos, inducir SAR puede elim inar la necesidad de una variedad de agentes por separado, los cuales serían necesarios de otra manera para proteger una cosecha, o reducir la cantidad de los agentes por separado, los cuales serían requeridos de otra manera. Y, debido a que la inducción de SAR puede realizarse esencialmente mediante acción repetitiva, el uso de esta técn ica demandaría mucho menos esfuerzo para el granjero q ue el rég imen actualmente requerido de aplicar múltiples agentes , cada uno con sus propias direcciones de manejo, momento oportu no, cantidades, concentraciones , métodos de aplicación y posibles interacciones adversas.

Una de las compañías farmacéuticas más grandes del mundo ha hecho un esfuerzo para desarrollar el uso de inductores sistémicos para proteger las cosechas en el campo. Para este fin, está llevando al mercado un inductor sistémico, benzotiadiazol, bajo el nombre comercial ActigardMR. Pero, el fabricante recomienda ahora que ActigardMR sea usado en combinación con agentes químicos convencionales para proporcionar protección a las cosechas. De esta manera, incluso un inductor sistémico seleccionado de manera específica, desarrollado y probado para la protección de cosechas no ha eliminado la necesidad de pesticidas convencionales incluso durante el momento en que se está aplicando el inductor sistémico. La patente estadounidense no. 5,607,856, muestra composiciones y métodos para esterilizar tierra usando radicales de oxígeno. El método involucra contactar la tierra con una solución de una especie de oxígeno activado, un complejo fenólico soluble en agua extraído de un material, tal como material húmico, un catión divalente, y un agente de reducción redox de cationes. Lo que se necesita en la técnica es un medio para proteger una variedad de cosechas, flores, plantas decorativas y otras en el campo de patógenos de manera más efectiva, a menor costo y con menos esfuerzo que mediante el uso de pesticidas y otros agentes químicos tradicionales. Más aún, lo que se necesita es un medio para proporcionar esta protección con un daño menor y menos duradero para el ambiente, que el provocado por tales agentes convencionales. Lo que se necesita además es un medio para incrementar la protección de cosechas de patógenos a niveles por encima de los niveles obtenibles mediante el uso de inductores sistémicos solos, a más cosechas que puedan ser protegidas por el uso de inductores sistém icos solos y contra un rango más am plio de patógenos. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LA I NVE NCI ÓN Esta invención proporciona novedosos métodos para proteger plantas de patógenos. En un grupo de modalidades, los métodos involucran contactar el follaje de una planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, donde la cantidad de la especie de oxígeno reactivo es suficiente para incrementar la expresión de fenilalanina amoníaco liasa, glutationa S-transferasa, glicoproteína rica en hidroxi prolina, calcona sintasa o proteínas relacionadas con la patogénesis, en la planta por encima del nivel al cual sería inducida por el inductor sistém ico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo. La i nvención proporciona además un método para contactar una planta con un inductor sistém ico de planta y una especie de oxígeno reactivo, donde la cantidad del inductor sistémico de planta es suficiente para incrementar la expresión de fenilalanina amon íaco l iasa , glutationa s-transferasa, glicoproteína rica en hidroxiprolina, calcona sintasa o proteínas relacionadas con patogénesis en la planta por encima del nivel q ue sería ind ucido por la espeice de oxígeno reactivo en la ausencia del inductor sistém ico de planta. El incremento en las proteínas relacionadas con la patogénesi s, fenilalanina amon íaco liasa, g lutation a S-transferasa o glicoprote ína rica e n h idroxi prol ina provocada al contacta r un a planta ta nto con un inductor sistémico de planta como una especie de oxígeno reactivo, puede ser aditivo comparado con el nivel inducido ya sea por el inductor sistémico en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo o .por la especie de oxígeno reactivo en la ausencia del inductor sistémico, o pueden ser mayores que una cantidad que sería aditiva. La planta puede ser comestible para humanos o para animales, puede cultivarse para contenido de fibra, tal como algodón , puede usarse para o procesarse para volverse una medicina o medicamento, o puede ser para uso decorativo, ornamental o recreativo, tal como césped, plantas caseras, flores o árboles de Navidad. La especie de oxígeno reactivo ("ROS") puede ser ácido peracético, peróxido de hidrógeno, un hidroperóxido, u n peróxido o un hidroperóxido fenólico; el ozono no es preferido como una ROS. El inductor sistémico de planta puede ser ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido isonicotínico, ácido dicloroisonicotínico, benzotiadiazol , ácido fosforoso, ácido araq uidónico o ácido cinámico, puede ser derivado de kelp u otras algas marinas, o puede ser un microbio benéfico. El inductor sistémico puede ser ácido húm ico, o puede ser usado en com binación con ácido húmico. La ROS e inductor microbiano sistémico de planta, pueden administrarse aproximadamente 24 horas uno de otro, mientras que una ROS y un inductor qu ímico sistémico de planta son administrados de preferencia dentro de una hora uno de otro, e incluso más preferiblemente se adm in istran j untos en una mezcla, ya sea como, por ejem plo, un polvo o, más preferiblemente, una so l ución . La proteína relacionada con la patogénes is puede ser un producto de cua lquiera de los genes de P R teniendo o que se piensa que tiene un papel en la protección de plantas de patógenos, tal como los genes PR-1 , PR-2 , PR-3, PR-4 y PR-5. Las proteínas inducidas también pueden ser fenilalanina amon íaco liasa , calcona sintasa o una glicoproteína rica en hidroxiprolina u otras proteínas relacionadas con el fortalecimiento de las paredes celulares o defensas de la planta. La invención proporciona además una composición para la aplicación foliar a las plantas, que comprende un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de especie de oxígeno reactivo es suficiente para incrementar el nivel de un producto de planta natural seleccionado del grupo que consiste de: fenilalanina amon íaco liasa; glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, glutationa S-transferasa, calcona sintasa y proteínas relacionadas con patogénesis hasta un nivel por encima del nivel inducido por el inductor sistémico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo. La com posición puede comprender además una solución acuosa y detergentes , agentes quelantes o agentes secuestrantes. En otro grupo de modalidades, la invención proporciona métodos para proteger una planta , al contactar una o más ra íces de una planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, donde la cantidad de la especie de oxígeno reactivo (ROS) es suficiente para incrementar la expresión de fenilalanina amoníaco liasa, glutationa S-transferasa, glicoproteína rica en hidroxiprolina, calcona sintasa o prote ínas relacionadas con patogénesis , en la planta por encim a del nivel que sería inducido por el ind uctor sistémico de planta en la ausencia de l a especie de oxígeno reactivo, siempre que la composición no comprenda un agente exógeno seleccionado del grupo que comprende un agente reductor redox de cationes y un catión divalente teniendo potencial redox en cantidades suficientes para reducir los niveles de microorganismos en tierra alrededor de las raíces por 40% o más. La invención proporciona además un método para contactar una o más ra íces de una planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, donde la cantidad del inductor de sistémico de planta es suficiente para incrementar la expresión de fenilalanina amon íaco liasa, glutationa S-transferasa, glicoproteína rica en hidroxiprolina, calcona sintasa o proteínas relacionadas con patogénesis en la planta, por encima del nivel que sería inducido por la especie de oxígeno reactivo en la ausencia del inductor sistém ico de planta, siempre que la composición no comprenda un agente seleccionado del grupo que comprende un agente reductor redox de cationes y un catión divalente teniendo potencial redox en cantidades suficientes para reducir los niveles de microorganismos en la tierra alrededor de las raíces por 40% o más. El inductor sistém ico puede ser, o puede estar mezclado con, ácido húmico. La invención proporciona además composiciones para aplicación de tierra a plantas que comprenden un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de especie de oxígeno reactivo es suficiente para incrementar el nivel de un producto de planta natural seleccionado del g ru po que consiste de: fenilala nina amoníaco liasa, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, glutationa S-transferasa y prote ínas relacionadas con la patogénesis hasta un nivel por encim a del nivel inducido por el inductor sistémico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo, siempre que las composiciones no comprendan un agente seleccionado del grupo que comprende un agente reductor redox de cationes y un catión divalente teniendo potencial redox en cantidades suficientes para reducir los niveles de microorganismos en tierra alrededor de las raíces por 40% o más. El inductor sistémico puede ser, o puede estar mezclado con, ácido húm ico.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LOS DI BUJOS La Figura 1 es una northern blot de RNA sondeado para expresión de proteína PR- 1 a. El RNA se extrajo de plantas de frijol colorado de 14 días de edad 24 horas después de que se atomizaron las hojas de la planta hasta que estaban mojadas con uno de cinco tratamientos: Carril 1 : tratamiento con 3, 500 ppm de ácido peracético ("PAA"). Carril 2: tratamiento con 1 0, 000 ppm de PAA. Carril 3: tratamiento con 3, 500 ppm de PAA más 200 ppm de mezcla de ácido salicílico/ácido húmico (ver Ejemplo 1 ; de aq u í en adelante "mezcla de inductor") . Carril 4: tratam iento con 1 0, 000 ppm de PAA y 200 ppm de mezcla de inductor. Carril 5: tratamiento con 200 ppm de mezcla de inductor, sin PAA. La Figura 2 es un northern blot de RNA sondeado para expresión de fenílalanina amon íaco liasa ("PAL") . Se extrajo RNA de plantas de frijol colorado de 14 d ías de edad 24 horas después de que las hojas de las plantas se atomizaron hasta que estaban mojadas con uno de cuatro tratamientos. Carril 1 : control de ag ua sola . Carril 2 trata m iento con 3,500 ppm de PAA. Carril 3: tratam iento con 1 0, 000 ppm de PAA. Carril 4: tratamiento con 3, 500 ppm de PAA más 200 ppm de mezcla de inductor. La Figura 3 es un northern blot de RNA sondeado para expresión de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina ("HPRG" o "HYP") . El RNA se extrajo de plantas de frijol colorado de 14 días de edad 24 horas después de que las hojas de las plantas se atomizaron hasta que estaban mojadas con uno de cinco tratamientos: Carril 1 : control de agua sola. Carril 2: tratamiento con 3, 500 ppm de PAA. Carril 3: tratamiento con 1 0, 000 ppm de PAA. Carril 4: tratamiento con 3, 500 ppm de PAA más 200 ppm de mezcla de inductor. Carril 5: tratamiento con 1 0,000 ppm de PAA más 200 ppm de mezcla de inductor. Carril 6: tratam iento con 200 ppm de mezcla de inductor, sin la presencia de PAA. La Figura 4 es una g ráfica que expone los resultados de un ensayo de campo del efecto de aplicar una mezcla de ROS/inductor en niveles de infección de moho pulverulento de uvas de mesa sin semilla. Las plantas se atomizaron con un atomizador de chorro de aire con 757 litros de agua a una velocidad de 0.9072 kg por acre. El atomizador conten ía una mezcla de PAA a una concentración de 1 250 ppm y una mezcla de inductor a una concentración de 1 25 ppm . Cada réplica contenía 88 plantas y se trató un total de 1 6 replicados. El moho nivel 1 indica q ue menos de. 3 uvas jóvenes (llamadas "bayas") por planta son infectados con moho. Rombos: porcentaje de plantas en cada répl ica con moho n ivel 1 antes del tratamiento. Cuadrados: porcentaje de plantas en cada réplica con moho nivel 1 sig uiendo el tratam iento.

DESCRI PCIÓN DETALLADA I. Introducción Esta invención surge del sorprendente descubrimiento de que la aplicación a plantas de una o más especies de oxígeno reactivo ("ROS") y de uno o más inductores sistémicos, tales como ácido salicílico, ya sea de manera simultánea o dentro de un corto tiempo uno de otro, resulta en un incremento en el nivel de transcripción de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina ("H RGP"), fenilalanina amon íaco liasa ("PAL") , calcona sintasa, peroxidasa (PAL, calcona sintasa y peroxidasa son referidas algunas veces como "defensas fenólicas" de la planta) , glutationa s-transferasa o proteínas relacionadas con la patogénesis ("proteínas PR"), y de SAR en las plantas sobre el efecto de cualquiera sola . El incremento es aditivo de los efectos de ROS o de un inductor sistémico solo y, aún m ás sorprendentemente, puede ser sinerg ístico. Este resultado no podría haberse predicho. Lo que se sabía era que ROS y los inductores sistémicos provocan cada uno, que se exprese un conj unto de genes, pero algunos de los genes fueron los mismos y algunos fueron diferentes para cada clase de agente. Debido a que los mecanismos de señalización dentro de la célula de planta relacionada con SAR todavía no se han d ilucidado, no había manera de predecir si aplicar ambos agentes a o alrededor del mismo tiempo resultaría simplemente en la m isma cantidad de ind ucción de SAR que aplicar uno de los agentes, o si la cantidad inducida sería mayor que o menor que aplicar u no de estos agentes solos.

Hemos descubierto, por ejemplo, que contactar plantas con ambos agentes resulta en incrementos en niveles de transcripción de proteínas PR sobre lo esperado. "La expresión de muchos de los genes de PR bien caracterizados (por ejemplo, PR-1 a PR-5) en tabaco se ha correlacionado con la resistencia a una gran variedad de patógenos virales, bacterianos y fúngales. Como resultado, la expresión de genes PR es usada frecuentemente como un marcador para la inducción de la resistencia a la enfermedad." Klessig y Malamy, supra, en 1441. Ver además, por ejemplo, Bo les, D., Annu Rev. Biochem 59:873-907 (1990); Carr, J. y Klessig, D., The pathogenesis-related proteins of plantas (Las proteínas relacionadas con ta patogénesis de plantas). En Setlow, J. (ed.) Genetic Engineering Principies and Methods (Métodos y principios de ingeniería genética), vol. 11, páginas 65-109. Plenum Press, Nueva York (1989); Dixon, R., et al., Adv Genet. 28:165-234 (1990); Ward, E., et al., Plan Cell 3.1085-1094 (1991); Ye, X., et al., Plant Sci., 84:1-9 (1992); Woloshuk, C, et al., Plant Cell 3:619-628 (1991); Alexander, D., et al, Proc Nati Acad Sci USA 90:7327-7331 (1993); Bol, J. et al., Annu Rev Phytopath 28.113-138 (1990); Ward, et al., Plan Cell 3:1085-1094 (1991); Niederman, et al., Plant Physiol 108:17-21 (1995); Lawton, et al , Plant J. 10:71-82 (1996); y Friedpch, L., et al., Plant J. 10:61-70 (1996). Hemos mostrado que, además de las proteínas de PR, tales como PR-1a, la transcripción de otras enzimas y proteínas, tales como PAL, calcona sintasa y HRGP, aumenta en respuesta a contactar plantas con ROS y aumentan aún más en respuesta a contactar plantas tanto con inductores sistémicos de planta como ROS Los aumentos son mayores que los inducidos por cualquier clase de agente solo y pueden , en realidad, ser sinerg ísticos. Y, aunque se considera que la SAR toma una semana o más para desarrollarse, hemos demostrado que los genes que codifican las enzimas notadas antes, son inducidos dentro de 24 horas del contacto de las plantas con estas composiciones. Se reconoce en la técnica que la transcripción de estos genes es un marcador para SAR. Además de estos descubrimientos, un com plejo fenólico soluble en agua conocido como ácido húmico comercialmente vendido como un fertilizante, también actúa como un inductor sistémico. Contactar plantas con ácido húmico induce cambios en muchas de las mismas enzimas conforme aquéllas aumentaron en respuesta a inductores sistémicos de planta previamente conocidos y que los niveles de estas enzimas aumentan aún más cuando las plantas son contactadas tanto con ácido húm ico como ROS. Como con los i nductores sistémicos previamente conocidos, los aumentos son mayores que aq uéllos inducidos por cualquier clase de agente solo y pueden ser, en realidad , sinerg ísticos. Más aún, adicionar ácido húmico a una mezcla de un inductor sistémico previamente conocido, tal como ácido salícílico, y una ROS, resulta todavía en una mejora adicional en el nivel de enzimas consideradas por ser parte de los mecanismos de defensa de la planta . Los incrementos que hemos mostrado en los niveles de PAL, HRGP, calcona sintasa, proteínas PR u otras proteínas marcados y enzi mas sobre la apl icación de los dos tipos de agentes , también se ve en el campo por los niveles de protección contra patógenos comparables a o mayores que la protección proporcionada por agentes qu ímicos convencionales dirigidos contra tipos específicos de patógenos. Como se muestra en los Ejemplos, por ejemplo, la aplicación de una mezcla de ROS y de una mezcla de ind uctor sistémico ácido salicílico y ácido húmico (de aqu í en adelante "mezcla de ROS/inductor") a cosechas tales como uvas, lechuga, tomates, zanahorias y frutas cítricas en ensayos de campo, resultaron en proporciones de infestación y cantidades de daño de hongos, ¡nsectos y nemátodos comparables con o menores que las proporciones de infestación y cantidades de daño de las mismas plagas a cosechas protegidas por agentes convencionales dirigidos contra esos tipos específicos de patógenos. Más aún, este efecto incrementado, y posiblemente sinergístico, permite que la ROS y los inductores sístémícos sean aplicados en proporciones que los hacen comercialmente viables comparados con los pesticidas , fungicidas u otros agentes que de otra manera serían necesarios. Además , debido a que ROS y los inductores sistémicos son mucho menos tóxicos de manejar y aplicar que la mayoría de los pestícidas convencionales, el uso de la invención reduce la exposición de granjeros y otros trabajadores agrícolas a químicos tóxicos que pueden estar pobremente entrenados o eq uipados para el uso. Y, debido a que la SAR puede ser elevada a niveles protectores mediante tratamientos (tales como, mediante la moda lidad preferida de una mezcla de una ROS y uno o más ind uctores de SAR) , los cuales son tanto relativamente no tóxicos por prod ucir y m ucho men os am bientalmente dañinos en el uso que muchos pesticidas convencionales y otros agentes químicos, la ¡nvención proporciona cosechas con protección sig nificativa de patógenos, al tiempo que reduce de manera pronunciada el costo al ambiente de esa protección . Finalmente, como se nota antes, la protección ha sido demostrada con respecto a una variedad de plantas divergentes y contra un rango de patógenos. Por lo tanto, la invención es una mejora significativa y substancial sobre la aplicación de un inductor sistémico solo. Se debería notar que los incrementos en SAR en algunos casos pueden aumentar una susceptibilidad de la planta a ciertos patógenos. Pero predijimos que este efecto sería excedido por mucho por el incremento en la protección contra un rango de patógenos mucho más amplio que aq uéllos a los cuales pudiera volverse más susceptible la planta, y que este efecto resultaría en rendimiento y calidad de cosecha mejorados. Esta predicción ha sido confirmada por los i ncrementos en el rendimiento y calidad de cosecha demostrados en los ensayos de campo reportados en la presente. De acuerdo con esto , se ha mostrado que la aplicación de un inductor sistémico y una ROS tiene un efecto positivo en la protección de cosechas en el campo.

II. DEFI NICIONES El término "combinar" como se usa en la presente, se refiere al mezclado de dos o más componentes líquidos, sólidos o aerosilizados antes, durante o después del contacto con las plantas. La frase "incrementar el nivel por encima del nivel i nducido por el inductor sistémico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo" , especifica un nivel de producto de planta n atural . El nivel a partir del cual se mide el cam bio, es el nivel del producto de planta natural de interés que es inducido en una planta mediante el contacto con un ind uctor sistémico de planta cuando está ausente una especie de oxígeno reactivo. Por lo tanto, la frase mencionada antes se refiere a cualquier concentración de un producto de planta natural que esté por arriba de este nivel . De manera similar, la frase "incrementar el nivel por encima del nivel inducido por la especie de oxígeno reactivo en la ausencia del inductor sistémico de planta" especifica un nivel de producto de planta natural. El nivel a partir del cual se mide el cambio , es el nivel del producto de planta natural de interés que es inducido en una planta mediante el contacto con una especie de oxígeno reactivo cuando está ausente un inductor sistémico de planta. Por lo tanto, la frase anotada antes se refiere a cualquier concentración de un producto de planta natural q ue está por arriba de este nivel . Los términos "administrar" y "contactar" plantas con u n qu ímico o compuesto, como se usa en la presente, generalmente comprenden provocar que la planta entre en proximidad con una forma exógena l íquida o sólida (tal como un polvo) del químico o compuesto. No comprenden la inyección de compuestos o qu ímicos en hojas individuales o en plantas individuales. Los términos "glicoproteínas ricas en hidroxiprolina" o "HRGPs", como se usan en la presente, se refiere a proteínas glicosiladas encontradas en paredes celulares de plantas y asociados con el fortalecimiento de las paredes celulares. Las H RG Ps está n caracterizadas por la presenci a del motivo: Ser-(Hyp)4-Tyr, en donde " Hyp" es h idroxiprolina .

Los términos "proteína relacionada con la patogénesis" o "proteínas PR" , como se usan en la presente, se refieren a cualquiera de una variedad de familias de proteínas cuya s íntesis es considerada en la técnica por ser inducida en respuesta a, contacto con, o infección por, un patógeno. Se considera que son codificadas por, por ejemplo, los genes PR- 1 a PR-5. La expresión de las proteínas relacionadas con la patogénesis también puede ser inducida o incrementada en una planta al contactar la planta con inductores sistémicos de planta, tales como, ácido salicílico. Se conocen las funciones de muchas proteínas PR. Por ejemplo, los genes PR-2 codifican ß-1 ,3-glucanasas hidrol íticas, mientras que la familia de PR-3 codifica las quitanasas. Sin embargo, otras proteínas relacionadas con la patogénesis, tales como aquéllas expresadas por el grupo de gene PR-1 , tienen funciones q ue todavía tienen que ser definidas. Sin embargo, la expresión de PR-1 a es considerada por aquéllos expertos en la técnica, que está asociada con , y un marcador para, la resistencia sistémíca adquirida. El término "producto de planta natural" , como se usa en la presente, se refiere a una enzima o proteína estructural producida de manera endógena por una planta . Ejem plos de tales com ponentes incluyen fenilalanina amon íaco liasa, glicoprote ínas ricas en hidroxiprolina y proteínas relacionadas con la patogénesis. Como se usa en la presente, el término "resistencia a patógenos" se refiere a la capacidad de una planta a d isminu ir el desarro l lo de síntomas de enfermedad después de la exposición a u na pla nta , insecto o m icrobio .

El término "fenilalanina amoníaco liasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de fenilalanina hacia ácido cinámico. La enzima, EC número 4.3.1.5., es involucrada en la formación de muchas clases de compuestos fenólicos involucrados en la defensa de la planta. El término "glutationa S-transferasa" se refiere a cualquiera de una familia de enzimas, las cuales transfieren glutationa en el curso de cualquiera de varias funciones, incluyendo muchas involucradas en respuestas de tensión en células de planta. Las enzimas juegan un papel en la tensión oxidativa, resistencia a herbicida y tolerancia a metales pesados. Ver, por ejemplo, Neufield T, et al., J. Biol. Chem. 378:199-205 (1997); Chen W, et al., Plant Journal 10:955-966 (1996); Levine, A., et al., Cell 79:583-593 (1994). El término "calcona sintasa" se refiere a una enzima, la cual es involucrada en la síntesis de estructuras fenólicas más complejas de calconas esenciales para síntesis de flavonoides. Los flavonoides representan una mayor clase de metabolitos secundarios de planta que son importantes en la supervivencia de la planta. Se sabe que juegan un papel en un amplio rango de funciones de la planta, incluyendo la protección de patógenos. La enzima, EC número 2.3.1.74, cataliza la condensación de tres moléculas de malonil-CoA con una molécula de 4-coumaroil-CoA para producir calcona. Ver, por ejemplo, Hahlbrock K, Flavonoids (Flavonoides), En Stumpf PK, Conn EE, eds, Biochemistry of Plants (Bioquímica de plantas), Academic Press, Nueva York (1981), pp 425-456; Niesbach-Klosgen U Et al., J Mol Evol 26.213-225 (1987).

Los términos "inductor sistémico de planta" , "inductor sistémico de resistencia" y "inductor sistémico" se usan en la presente, como sinónimos y como se usó en la presente, se refieren a agentes químicos o biológicos que inducen resistencia a los patógenos después de una planta es contactada con un inductor sistémico de planta. Ejemplos de inductores químicos sistém icos de planta incluyen , inter alia , ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido isonicotíníco, ácido dicloroisonicotínico, ácido fosforoso y ácido cinámico, quitosán, ácido húmico y beta-1 , 3 glucanos y otros glucanos mezclados. U n experto en la técnica reconocerá que los inductores biológicos sistém icos de planta incluyen, inter alia, bacterias, virus, hongos y nemátodos. Kelp, una forma de alga marina, y algunas de otras algas marinas, son ricas fuentes de beta glucanos y pueden usarse como inductores sistém icos en las composiciones y métodos de la ¡nvención . A diferencia de las bacterias, virus y la mayoría de otros agentes microbiológicos , kelp y otras algas marinas se venden comercialmente como fertilizantes y están disponibles como extractos l íquidos o como polvos secos. A este respecto, se asemejan más a qu ímicos agrícolas y para facil idad de discusión , serán tratados por lo tanto como inductores q uím icos en la presente a menos que se indique de otra manera. Finalmente, como se nota en la I ntroducción , el ácido húmico, un componente encontrado en la porción de hum us de algunas tierras, además actúa como un inductor sistémico. De esta manera, el término "ind uctor sistém ico" puede incluir, donde sea apropiado, ácido húm ico. En modal idades preferidas, hemos encontrado buenos resultados al i ncluir ácido húmico junto con otros inductores sistémicos en las composiciones y métodos de la invención . De acuerdo con esto, la adición de ácido húmico a otros inductores sistémicos generalmente serán denotados de manera específica en la presente. La frase "especie de oxígeno reactivo" (abreviada en la presente como "ROS") describe com puestos oxigenados, los cuales sirven como una fuente de radicales oxigenados. El término es considerado como sinónimo con "especie de oxígeno activado". Estos com puestos incluyen , ínter alia, ácido peracético, peróxido de sodio, óxido de potasio , peróxido de potasio, peróxido de calcio, peróxido de mag nesio, peróxido de urea , peróxido de hidrógeno (H2O2), hidroperóxidos (ROOH), peróxidos (ROOR) y superóxidos, donde R es un alcano, alq ueno o alq uino , ram ificado o no ram ificado, y de entre 1 y 1 2 carbonos y Ar es un anillo aromático , usualmente de 6 carbonos, o una combinación de tales anillos. Como se usa en la presente, el término "especie de oxígeno reactivo" excluye el gas ozono. El humus es el mayor componente orgánico de la tierra. "Acido húmico" es un complejo fenólico, el cual es u n componente de humus. Comercialmente, el ácido húm ico es extraído generalmente de lo que se describe como un depósito libre de sales de carbono altamente oxidado, conocido como " Leonardita'J La extracción de ácido húm ico de Leonardita se describe en detalle en la patente estadounidense no. 5 , 607 , 856. El "ácido peracético" es una especie de oxígeno reactivo , la cual se hace a l reaccionar ácid o acético g lacial con peróxido de hidrógeno. Debido a q ue esta reacció n no se va a l a term i naci ón , sino q ue en su lugar resulta en un equilibrio siendo alcanzado, existirán en cualquier momento las tres especies químicas, ácido peracético, ácido acético y peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, el uso del término "ácido peracético" en la presente, abarca mezclas de estas tres especies químicas. La frase "capacidad de campo" se refiere al porcentaje de agua que permanece en la tierra dos a tres d ías después de haber sido saturada y después de que ha cesado prácticamente el drenaje libre. El término "aplicación foliar" se refiere a la aplicación de substancias al follaje, o porciones por arriba del suelo, de plantas, y especialmente la apl icación a las hojas de las plantas. Se entiende en la técnica que las cantidades incidentales de substancias usadas en aplicaciones foliares pueden filtrarse a, o contactar, la tierra, pero no en cantidades que permitirán la penetración de la tierra y contacto significativo de las raíces de la planta en comparación con la cantidad que tienen contacto con las hoj as y otras estructuras por arriba del suelo. El término "aplicación a la tierra" se refiere a la aplicación de una substancia a la tierra alrededor de una planta, donde la intención es ya sea afectar la tierra directamente o colocar las raíces de la planta en contacto con la substancia. De manera general , las substancias aplicadas a través de la aplicación a la tierra no contactarán el follaje, pero es posible que cantidades incidentales de las substancias usadas en las apl icaciones a la tierra puedan contactar el follaje en cantidades que no serán significativas en com paración con la cantidad que tiene contacto con las ra íces y otras estructu ras debajo del suelo.

El término "cosecha" , como se usa en la presente, normalmente se refiere a plantas cultivadas en campos en ambientes agrícolas, e incluye, junto con tomates, uvas y otras plantas pretendidas para consumo humano o animal, plantas que pretenden usarse como fibras, plantas que serán usadas como, o procesadas en , medicamentos, plantas que se cultivan para fragancia , flores, hierbas y plantas decorativas, recreativas y ornamentales. En este contexto, el término también abarca plantas cultivas en i nvernaderos. Referencias a una "mezcla de ROS/inductor" significan una mezcla de una o más especies de oxígeno reactivo (tal como, ácido peracético) y uno o más inductores sistém icos de planta. A menos q ue se especifique de otra manera , las referencias en la presente a "partes por millón" (o "ppm") usadas en relación a una mezcla de u na ROS (la cual normalmente está en una solución con otros ing red ientes, tales como agentes secuestrantes y surfactantes) y un ind uctor sistém ico (el cual también usualmente está en una solución con agentes quelantes, surfactantes u otros ingredientes, que en modalidades preferidas contendrán ácido húmico), se refieren a la concentración de la sol ución conten iendo el componente de ROS , como se volverá más claro en la discusión más adelante. El térmi no también es usado en la presente en referencia a una mezcla de una ROS (que tam bién normalmente está en una sol ución con agentes quelantes, surfactantes u otros i ng redientes, que en moda lidades preferidas contendrá un inductor sistém ico) y ácido h ú m ico .

A menos que se especifique de otra manera , la referencia en la presente a una concentración particular de una mezcla de ROS/inductor o de una mezcla de ROS/ácido húmico, es de la concentración de la porción de ROS de la mezcla (incluyendo cualquier aditivo) , pero implica la presencia de un inductor sistémico (incluyendo cualquier aditivo) o de ácido húmico (incluyendo cualquier aditivo) , respectivamente, a una concentración de aproximadamente un décimo de la declarada para la porción de ROS de la mezcla. Esto es, si se declara que una mezcla de ROS/inductor será aplicada a 2500 ppm , la porción de ROS de la mezcla (incluyendo cantidades relativamente pequeñas de cualquier aditivo, tal como, surfactantes, agentes quelantes u otros ingredientes notados en la presente) es 2500 ppm y un inductor sistémico está presente a aproximadamente 250 ppm (incluyen cantidades relativamente pequeñas de cualquier surfactante, agente quelante u otro ingrediente que pudieran ser adicionadas al inductor). Normalmente, la mezcla de ROS/inductor estará en una solución acuosa, pero en algunas formulaciones, puede aplicarse como una mezcla de ingredientes secos, los cuales serán humectados después de la aplicación. La frase "agente reductor redox de cationes" es cualq uier agente reductor que dona electrones a un catión que ha participado en la generación de un radical oxigenado. En ciertos casos, el catión es oxidado nuevamente a su especie activa, actuando as í como una "bomba de radical libre", capaz de generar nuevamente especies de radicales oxigenados.

La frase "catión divalente teniendo potencial redox" es cualquier catión divalente que puede aceptar electrones adicionales. Como se usa en la presente, la frase "reducir el nivel de microorganismos por 40%" significa que hay al menos 40% menos microorganismos presentes en una muestra de tierra contactada con una com posición , que los que hay en una muestra de control que no ha sido contactada con la misma composición. El número de microorganismos presente puede ser determinado por cualquiera de una variedad de ensayos conocidos en la técnica, tal como, al platinar muestras en placas de agar y cuantificar las colon ias resultantes. El término "exógeno" , con respecto a la presencia de un agente reductor redox de cationes o catión divalente teniendo potencial redox, significa que el agente o catión divalente es adicionado a una composición para elevar su concentración sobre la cual está presente de manera normal o natural . No incluye cantidades en trazas, que pud ieran estar presentes de manera natural en tierra o composiciones fabricadas (tales como, ácido húm ico, que normalmente se extrae de Leonardita) , o que pudieran ser adicionadas con un efecto incidental del procesamiento normal . Por ejem plo, cantidades menores de los cationes divalente de manganeso o cobre pudieran lixiviar en una composición almacenada en un recipiente hecho de esos materiales, pero tales contami nantes no serían considerados la adición de u n catión divalente exógeno para fines de esta invención . lll . Mezclas de ROS/inductor a. Especie de oxígeno reactivo y métodos de uso Como se nota, el método de la ¡nvención involucra el uso de una especie de oxígeno reactivo ("ROS") y uno o más inductores sistémicos. Puede usarse una variedad de ROS en los métodos de la invención. Muchos compuestos de ROS están comercialmente disponibles. En general, se prefieren ROS con cocientes de oxígeno activo mayores. Las ROS preferidas para usarse en la invención incluyen , por ejemplo, ácido peracético, peróxido de hidrógeno, peróxido de calcio, percarbonato de sodio y peróxido de urea. Se prefieren menos peróxido de sodio e hidróxido de magnesio. El ácido peracético es la ROS particularmente preferida para usarse en la invención. Es mucho más estable que el peróxido de hidrógeno y tiene un cociente de oxígeno activo mayor. También está comercialmente dispon ible de una variedad de fuentes, incluyendo la FMC Corporation (Chemical Products Group, Filadelfia, PA) , Solvay I nterox (Warrington, Reino Unido) y Degussa Corporation (Ridgefield Park, NJ). Es deseable que el ácido peracético usado sea estable en el almacenamiento, aunque puede usarse ácido no estable en el almacenamiento si será usado antes de que ocurra de la pérd ida substancial de oxígeno activo . La forma más com ún mente dispon ible del ácido peracético se hace usando ácido sulfúrico. N o se prefiere el uso de ácido peracético hecho en esta manera, debido a que cualquier residuo de ácido sulfúrico que pudiera permanecer en el ácido peracético, será fitotóxico. De acuerdo con esto, esta forma de ácido peracético no debería ser usada a menos que cua lq uier resid uo de ácido sulfúrico haya sido reducida a niveles que no sean fitotóxicos. Se prefiere el ácido peracético hecho mediante otros métodos. El ácido peracético debería ser manejado en acero inoxidable o plástico aprobado para el propósito de reducir la contaminación y la descomposición. Normalmente, el ácido peracético se mezcla a una concentración de 5% (p/v). U n problema significativa para usar ROS es la contaminación de metales pesados, la cual provoca la descomposición prematura de la ROS y, de ah í, una reducción en su efectividad . Para reducir la cantidad de contaminación por metales pesados, pueden adicionarse pequeñas cantidades de agentes quelantes o secuestrantes, tales como pirofosfato de tetrapotasio, para secuestrar los iones de metales pesados. Debido a que puede soplarse polvo hacia la mezcla conforme se está preparando, incluso en aplicaciones donde no aparecería q ue fuera un problema la contaminación de metales pesados, es deseable que la ORS usada en la invención tenga una pequeña cantidad (0.05% en peso) , de pirofosfato de tetrapotasio u otro agente q uelante o secuestrante presente como una precaución . El uso de polietileno, tanques de plástico, tanques de acero inoxidable y l íneas de polietileno, plástico o acero inoxidable, se prefiere en el manejo de ácido peracético. La cantidad de contaminación de metales pesados también puede variar por el medio de aplicación , debido a que puede esperarse que algún equipo de granja, por ejemplo, tal como aspersores metá l icos y eq uipo de irrigación , teng a un mayor nivel de contam inación de meta l es pesados que, por ejemplo , una manguera de hule U n m ayor nivel de agente q uelante o secuestrante debería ser usado en situaciones donde el equipo de aplicación puede tener por s í mismo contaminación de metales pesados. De manera adversa, mucha ROS comienza a descomponerse sí el nivel de un agente quelante o secuestrante alcanza un nivel demasiado alto. Para reducir este problema, mayores niveles de agente quelante o secuestrante se adicionan al inductor sistém ico, el cual no se mezcla con la ROS hasta poco antes o j usto antes de usarse, de manera que no habrá suficiente tiempo antes de la aplicación a las plantas para que ocurra una cantidad substancial de descomposición , mientras que el agente quelante o secuestrante esté todavía presente para proteger la ROS, aunque esté expuesta a la posible contaminación . De manera conveniente, donde la ROS y el inductor sistémico se preparan bien por adelantado del uso, se empacan en recipientes separados, uno conteniendo la ROS y el otro inductor sistémico y el agente secuestrante. El ácido peracético es normalmente usado en una solución acuosa de una concentración deseada. De manera conveniente, se hace en una solución al 5% , a la cual pueden ad icionarse agentes secuestrantes, surfactantes y otros agentes. Los cálculos en la presente concernientes a concentraciones de ROS o de mezcla de ROS/ind uctor se h icieron usando una solución al 5% de solución de ácido peracético, con los agentes secuestrantes y otros aditivos notados antes. Se consideró q ue la solución representa el 1 00% para fines de calcular partes por m il lón . Otras conce ntraciones de ácido peracético u otra ROS pueden usarse , por supuesto, con el aj uste apropiado en los cálcu los para determ inar l as partes por m il lón resultantes de cua lq uier dilución . Por ejem plo, si se usa una solución al 1 5% de ácido peracético, q ue solo un tercio de la cantidad de ácido peracético sería necesaria para suministrar el mismo número de partes por millón . Está bien dentro de la capacidad del practicante, calcular la ROS presente en las partes por millón para cualquier concentración inicial dada. Aunque se usa ácido peracético en una solución acuosa , existen otras composiciones que forman especies de oxígeno reactivo sobre la adición de agua. Estas composiciones pueden ser usadas, por ejemplo, para reducir los costos de transportación y manejo asociados con la ROS . Los com puestos útiles a este respecto incluyen hidróxido de calcio, percarbonato de sodio y permanganato de potasio, con percarbonato de sodio y permanganato de potasio siendo menos preferidos. Normalmente , la composición se aplica a un campo y entonces se riega el campo. Estos com puestos son apl icados a proporciones que producen después del riego, concentraciones eq uivalentes a aquéllas discutidas en la presente para las soluciones acuosas de ácido peracético. b. I nductores sistém icos y método de uso Puede usarse una variedad de inductores sistém icos con la ROS. De preferencia , el inductor sistém ico de planta usado será ya sea un ind uctor biológico, tal como un microbio benéfico, o un inductor qu ímico sistém ico. Los componentes biológicos, tales como glicoproteínas, pueden ser fabricados ahora de manera rutinaria a través de técnicas recombinantes .

Aunque pueden usarse inductores biológicos, tales como microbios, usua lmente es más conveniente usar inductores qu ímicos sistémicos, los cuales pueden ser sintetizados a granel a costo razonable. Los inductores sistémicos preferidos son ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido isonicotínico, q uitosán, beta-1 ,3-g lucano, otros glucanos mezclados, ácido dicloroisonicotínico, Messenger R (EDÉN Bioscience Corp. , Bothell, WA) y ActigardMR. En algunas modalidades, el inductor sistémico puede ser un kelp conteniendo glucano, tal como Ascophyllum nodosum y Laminaria digitata u otras algas marinas. Tales kelps y otras algas marinas están comercialmente disponibles como fertilizante o com plementos de nutrientes de planta de una variedad de fuentes, tales como, North American Kelp (Waldoboro, ME) , Thorvin, I nc. (New Castle, VA), American Kelp Corp. (San Diego, CA), Ag rikelp (Coulburne, Ontario, Canadá) y Maxícrop USA, I nc. (Elk Grove Village, I L) . El ácido húm ico también puede ser usado como un inductor sistémico, o como un componente de una mezcla conten iendo al menos otro inductor sistémico. U n inductor sistémico particularmente preferido es ácido salicílico. Este compuesto está comercialmente disponible en forma sólida. Norm almente, la forma sólida se mezcla con una base para crear una sal, la cual es solubilizada fácilmente. Aunq ue pueden usarse sosa cáustica u otras substancias de pH alto, se prefiere la potasa cáustica como la base debido a q ue el potasio en la potasa cáustica es u n nutriente de planta y por lo tanto, es compatible con el uso de la mezcla resu ltante como un producto ag rícola. Después de formar la sal , se adicion a una peq ueña cantidad (- 1 %) de ácido fosfórico al 80% para amortig uar la solución , debido a que tiende a tener todavía un pH alto. El ácido fosfórico debería ser adicionado hasta que el pH sea reducido hasta aproximadamente 8 (otros inductores pueden tener actividad óptima a otros pHs, lo cual puede ser determinado fácilmente al aplicar simplemente las mezclas a diferentes pHs a las plantas y entonces ensayar por expresión de genes relacionados con SAR como se muestra en los Ejemplos. También pueden adicionarse pequeñas cantidades (2.5%) de surfactantes para ayudar a la absorción de la mezcla mediante ra íces, hojas de plantas y otras superficies de la planta . Los surfactantes son comúnmente usados como agentes humectantes; los agentes comercialmente disponibles adecuados para usarse en la invención incluyen Tritón H-66 R y Tergitol 1 5SM R. En una modalidad preferida , se adiciona 2.5% de cada u no de estos surfactantes a la mezcla de inductor sistémico. Pueden usarse otros surfactantes. Los surfactantes deberían ser seleccionados por compati bi l idad con ácido peracético o la ROS particu lar q ue será empleada . Por ejemplo , uno puede determ i nar el cociente de oxígeno activo de la ROS mediante métodos industriales estándares, proceder a mezclar la ROS con el surfactante deseado y volver a probar el cociente de oxígeno activo. De manera general , se considera que una pérd ida de más de 1 % significa que los dos agentes son incompatibles. En alg unas modalidades , pueden adm inistrarse dos o más i nductores sistém icos para i ncrementar la robustez de la respuesta Normalmente, la concentración total de la porción de i nductor de la mezcla de ROS/inductor permanecerá ig ual , pero será dividida entre o en medio de los i nductores seleccionados para la apl icación en cuesti ón .

En las modalidades preferidas, se adiciona ácido húmico para ser 0.1% hasta 50% del inductor sistémico total presente, aunque el ácido húmico también puede ser usado como la principal especie de inductor presente, constituyendo más del 50% del inductor sistémico total presente, y puede ser, si se desea, el único inductor sistémico usado. Hemos encontrado resultados particularmente buenos mezclando ácido salicílico y ácido húmico en una proporción 1:1 y adicionando esta mezcla a la ROS para formar la mezcla de ROS/inductor sistémico. Se debería notar que el grado estándar de ácido húmico tiene una solubilidad de 12%, pero pueden ser posibles porcentajes mayores de solubilidad para algunas formulaciones. Los porcentajes declarados para ácido húmico como un componente de una mezcla de inductor sístémico son para una solución al 12% y los porcentajes pueden ser ajustados según sea apropiado si la solución usada es de un porcentaje mayor o menor. En la modalidad más preferida, el inductor sistémico es administrado a aproximadamente un décimo de la concentración de la ROS. Convenientemente, el inductor sistémíco es mezclado en una solución al 10%. La ROS y el inductor químico pueden ser aplicados entonces a volúmenes iguales para mantener la proporción 10 a 1 deseada. Por ejemplo, 3.785 I de la solución de ROS (tal como la solución al 5% de ácido peracético notada en la sección precedente como se considera que es una solución al 100% para fines de estos cálculos), pueden mezclarse en un tanque con 3.785 I de la solución de inductor sistémico al 10%. La mezcla resultante puede ser diluida entonces a cualquier nivel deseado de partes por millón. Se debería notar nuevamente que, para fines de calcular las partes por m illón , consideramos solo el componente de solución de ROS. Las partes por millón de la porción de inductor sistémico están implicadas a aproximadamente 1 0% de la concentración de la ROS , pero no se calculan o se consideran por separado en el cálculo de las ppm . De esta manera, un cálculo de "2500 ppm" se refiere solo al componente de ROS (con todos sus surfactantes y similares) , sin incluir las 250 ppm de inductor sistémico, las cuales serían adicionadas a la porción de inductor sistémico de la mezcla de ROS/inductor sistémico. También pueden usarse microbios benéficos como inductores sistém icos . Se sabe que una variedad de m icrobios actúan como inductores sistém icos, y normalmente , el microbio elegido no es patogénico para la planta a la cual va a ser aplicado; por ejemplo, puede ser avirulento o un microbio al cual la planta en cuestión es resistente, o de manera preferible, un saprofito. Por ejemplo, Klessig y Malamy, supra, en 1 440. De preferencia , el microbio debería ser no patogénico para la planta y uno que mejore el crecimiento, rendimiento y calidad de la planta. Por ejemplo, especies de bacterias, tales como Bacillus, Serratia y Pseudomonas y hongos, tales como Trichoderma, son conocidos por actuar como inductores sistém icos . Sin embargo, se debería notar que los efectos de cualquier especie bacteriana particula r puede variar por el tipo de tierra , la época del año y la cosecha particular a la cual se va a aplicar el orga n ismo . De acuerdo con esto, el practica nte normalmente probará primero el organismo en la cosecha en un campo peq ueño para i ndagar si el m icrobio particu lar es benéfico para la cosecha en cuesti ón y exam inará el creci miento , rendim iento y cal idad contra u n a cosech a no tratada o tratada de manera simulada, hasta que ha identificado organismos benéficos en sus campos, sobre la cosecha en cuestión . Los inductores microbianos son aplicados normalmente vivos entre aproximadamente 1 03 y 1010 unidades formadoras de colonias (CFU) por mililitro. Los inductores microbianos pueden ser aplicados por atomización o por irrigación . Normalmente, entre aproximadamente 0.94 I y 283.8 litros de inductor microbiano a esta concentración , se aplican por acre. El inductor microbiano puede ser aplicado en cualquier cantidad conveniente de agua, siempre y cuando se aplique la cantidad deseada de inductor microbiano (por ejemplo, 1 8.92 I de cultivo i nductor m icrobiano de entre aproximadamente 103 y 101 0 CFU por ml). En una modalidad más preferida, se aplica aproximadamente 1 .89 litros hasta aproximadamente 1 89.25 litros por acre, y en una modalidad todavía más preferida, se aplican 2.83 litros hasta aproximadamente 94.62 litros por acre. Se prefiere aún más, q ue se apliquen aproximadamente 2.83 litros hasta aproximadamente 37.85 litros por acre. En la modalidad más preferida, se aplican aproximadamente 3.78 litros hasta aproximadamente 1 8.92 litros por acre. c. Ad m i n istraci ón de ROS e i nd uctores Normalmente, la ROS y un inductor sistémico químico serán administrados dentro de 36 horas uno de otro. De manera más preferible, la ROS será administrada dentro de 24 horas de ad ministración del inductor sistémico. Aún m ás preferiblemente, la ROS será administrada dentro de 1 2 horas o menos de la admi nistración del ind uctor sistémico .

Todavía más preferiblemente, la ROS y un inductor sistémico químico serán adm inistrados dentro de aproximadamente una hora uno de otro. M uy preferiblemente, los dos agentes serán aplicados juntos como una mezcla en una solución acuosa. Los métodos de la invención no contemplan la inyección de la ROS o del inductor sistémico en plantas u hojas individuales, ni la administración de ozono gaseoso. Si se va a usar un inductor microbiano, el método es practicado al administrar una o más ROS dentro de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 36 horas (de preferencia, aproximadamente 1 2-24 horas) de administración del ind uctor microbiano de SAR. Los microbios no son aplicados a o aproximadamente el mismo tiempo que la ROS, debido a que una ROS, tal como peróxido de hidrógeno, tendería a matar los microbios y podría disminuir el efecto deseado. Se debería notar q ue debido a que kelp y otras algas marinas son usadas en la forma seca o como extractos l íquidos, no hay preocupación de que la ROS los pudiera matar. De acuerdo con esto, generalmente se usan siguiendo las l íneas guía para ind uctores qu ím icos sistém icos aún cuando son plantas. Una mezcla de ROS-inductor qu ímico puede hacerse hasta una semana antes de usarse, de preferencia dentro de 24 horas del uso pretendido y más preferiblemente, dentro de 4 horas de uso pretendido. M uy preferiblemente, la mezcla se hace inmediatamente antes de usarse, debido a q ue la ROS tiende a descomponerse una vez mezclada . Normalmente , la ROS y el inductor serán mezclados a concentraciones donde cada uno puede estar de manera independiente en un rango entre 1 ppm y a proximadamente 1 00, 000 ppm M ás preferibleme nte, el rango es aproximadamente 50 ppm hasta aproximadamente 50, 000 ppm . (Las aplicaciones por debajo de 1 00 ppm normalmente serán usadas solo donde se contemplan periodos de aplicación más largos) . Todavía más preferiblemente, el rango es aproximadamente 1 00 hasta aproximadamente 25, 000 ppm . Aún más preferiblemente, el rango es aproximadamente 1 00 y aproximadamente 10, 000 ppm . Aunque el rango de cualquier componente puede variar, en general, se prefiere que el inductor sistémico sea aplicado en un rango desde aproximadamente igual hasta aproximadamente un vigésimo la concentración de la ROS. En modalidades más preferidas, el inductor sistém ico es aplicado a concentraciones menores que la ROS . En una modalidad más preferida, el inductor sistémico está presente a aproximadamente un décimo la concentración de ROS en ppm . En la modalidad más preferida, la concentración de ROS está entre aproximadamente 500 y 5,000 ppm, y la concentración de inductor sistémico es aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 ppm , esto es, el inductor es aplicado a aproximadamente un décimo la concentración de la ROS . Como se nota en la sección previa , debido a que el inductor se mezcla normalmente en una solución al 1 0% , una solución acuosa del inductor puede mezclarse convenientemente en volúmenes ig uales con una mezcla acuosa de la ROS para alcanzar la proporción deseada entre las dos. En general, anticipamos que el costo y otras consideraciones conducirán al practicante a apl icar los q u ím icos a concentraciones dentro de este rango En algunos casos , si n embargo, el practicante puede desear aplicar los compuestos a una concentración mayor Existe un límite su perior de la concentración de ROS que puede ser aplicada a una planta sin toxicidad , y el l ímite superior varía para diferentes tipos de plantas. Las plantas de cítricos, por ejem plo, pueden tolerar niveles de ROS relativamente altos. El límite superior de la concentración de la ROS para cualquier tipo de planta particular puede ser determ inado de manera rutinaria mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, tal como, exponer muestras de plantas del tipo en cuestión a varias concentraciones de ROS y examinar las plantas por señales de tensión, tal como, que las puntas de las hojas se pongan de color café, indicando que la concentración a la cual ocurrieron las señales de tensión es demasiado alta para ese tipo de planta . Límites superiores de la concentración de inductor sistémico puede determinarse en la misma manera Se debería notar que con respecto a las aplicaciones de tierra, las composiciones y métodos de la invención preferiblemente son preparados, aplicados o ambos, sin adicionar de manera exógena cationes divalentes. Adicionalmente, en aplicaciones a la tierra, las composiciones y métodos de la invención de preferencia son preparadas, aplicadas o ambas, sin adicionar de manera exógena agentes reductores redox de cationes. Para aplicaciones foliares, la presencia de cationes divalentes o de agentes reductores redox de cationes es permisible, pero las composiciones y métodos pueden prepararse o aplicarse sin estos agentes, si se desea.

IV. Ap l icac ión de los agentes d e la i nven c i ón a. Ap l icac i ó n fo l ia r La aplicación de substancias al fol laje, o porciones de planta por arriba del suelo, es conocida como aplicación foliar. La aplicación foliar ha sido realizada en granjas, en invernaderos, en flores y en otros ambientes agrícolas durante décadas, y se realiza en cualq uiera de una variedad de maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los granjeros aplican de manera rutinaria pesticidas y otros agentes a sus cosechas por medio de aspersores montados en tractor, mediante espolvoreado de cosechas, a través de rociadores presurizados y a través de sistemas, tales como mangueras elevadas usadas para rociar viñedos . Normalmente, la mezcla de ROS/inductor se disuelve o diluye en agua, seg ún sea apropiado, antes de usarse. Para la aplicación foliar, se prefiere aplicar la mezcla de ROS/inductor a una concentración entre 1 ppm y a proximadamente 1 00, 000 ppm . Se prefiere más un rango de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 50,000 ppm . Se prefiere aún más un rango de concentración entre aproximadamente 1 000 y aproximadamente 7000 ppm . Se prefiere en particular un rango entre aproximadamente 1 , 750 ppm y aproximadamente 5, 000 ppm . En una modal idad más preferida , la concentración es aproximadamente 3, 500 ppm . Se prefiere más una concentración de aproximadamente 2, 500 ppm . (Como se nota antes , todas estas concentraciones se refieren al componente de ROS solamente, con el contenido de inductor sistémico, de preferencia a aproximadamente 10% de aquél de la ROS, siendo implicado. De esta manera, la concentración más preferida expuesta en este párrafo es la concentración del componente de ROS , con la presencia de aproxim adamente 250 ppm de inductor sistém ico siendo i m plicada) .

Hemos encontrado que una concentración de aproximadamente 2,500 ppm es suficientemente alta para ser efectiva, pero proporciona un margen de seguridad para errores matemáticos al aplicar la invención en práctica. Debido a que los granjeros han sido acostumbrados por años a mezclar pesticidas, fertilizantes y otros químicos agrícolas para usarse en sus campos, el mezclado y aplicación de una mezcla de ROS/inductor está bien dentro de la habilidad del granjero. No obstante, pueden ocurrir errores. La concentración preferida de 2,500 ppm es tal, que si el granjero accidentalmente parte por la mitad la concentración (a 1,250 ppm) todavía será suficientemente alta para ser efectiva, aunque si se dobla accidentalmente (a 5,000 ppm), no será suficientemente alta para ser tóxica a las plantas. Concentraciones menores o mayores pueden ser empleadas, por supuesto, en la opinión del usuario, dentro de los límites notados en las secciones precedentes. La cantidad de la mezcla a ser aplicada a los campos dependerá de varias variables. En la aplicación foliar, el objetivo es humedecer el follaje Cuanta agua es necesaria para lograr esto dependerá enormemente en la cantidad de follaje a ser cubierto y la precisión del método de aplicación para dirigir la mezcla al follaje sin también mojar el área circundante. La cantidad de follaje dependerá, por ejemplo, de la edad de las plantas (las plantas jóvenes normalmente tienen hojas más pequeñas que las plantas maduras), el tipo de planta (diferentes tipos de plantas difieren en la cantidad y densidad de su follaje) y la salud de las plantas. Los granjeros han aplicado, por supuesto, varios químicos a sus cosechas durante años, y son muy familiares con juzgar la cantidad de líquido necesaria para aplicación foliar en cosechas de diferentes edades y tipos. Una vez que la cantidad de l íquido a ser usada es determinada, se determina fácilmente la cantidad de mezcla de ROS/inductor a ser adicionada para alcanzar cualquier concentración deseada en partes por millón . Se debería notar que algunos sistemas, tales como sistemas de rociadores, rocían la planta completa mientras que riegan la tierra. En la técnica , y como se usa en la presente, tales métodos son considerados aplicaciones de tierra debido a que su propósito es empapar la tierra y no meramente mojar las hojas u otras porciones por arriba del suelo. Como una g u ía para el practicante, la tabla a continuación expone aplicaciones foliares, las cuales fueron encontradas particularmente útiles para ciertas cosechas en ensayos de campo conducidos en México. Se anticipa que la optimización de proporciones de aplicación y volúmenes de ag ua rociada será necesaria para cosechas cultivadas bajo diferentes cond iciones de tem peratura y humedad .

Tabla 1 . Aplicaciones foliares preferidas para diferentes cosechas Leyenda para la Tabla 1 . */ La aplicación de rocío depende de la cantidad de área de superficie de la hoja. El primer número expuesto para cada tipo de cosecha o grupo de tipos de cosechas es para plantas jóvenes, el segundo es para plantas más maduras con áreas de hojas más grandes. El practicante puede determinar cuando cambiar a un volumen de agua mayor al determinar cuando el volumen menor se vuelve insuficiente para mojar la superficie completa de la hoja de la planta. **/ Las "condiciones" son el grado de presión de patógeno sobre las cosechas. Por ejemplo, si se ve moho aterciopelado en una cosecha de lechuga , el intervalo antes de la sig uiente aplicación será disminuido por un d ía . Si todavía se observa moho aterciopelado, el intervalo para la siguiente aplicación será disminuido por un día y así sucesivamente. b. Aplicación a la tierra En la aplicación a la tierra, la tierra es saturada primero preferiblemente para mojar las partículas de la tierra, de manera que la mezcla de ROS/inductor pueda moverse libremente en la tierra y alcanzar las ra íces de las plantas. Por lo tanto , de preferencia la tierra es saturada a una capacidad de campo de 70-80% con agua ordinaria antes de la aplicación de ROS/inductor. La mezcla de ROS/inductor es aplicada entonces a una concentración de entre 1 y aproximadamente 1 00, 000 ppm . Normalmente, la concentración estará entre aproximadamente 500 ppm y aproximadamente 1 0, 000 ppm , de preferencia a una concentración de a proxim adamente 750 ppm hasta aproximadamente 7 , 500 ppm , y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 800 ppm hasta aproximadamente 5,000 ppm. La concentración particular a ser elegida varía principalmente de acuerdo con la velocidad de flujo de agua permitida por el método de aplicación. Los métodos que tienen una mayor velocidad de flujo, generalmente requieren una menor concentración de mezcla de ROS/inductor, quizás porque más agua conteniendo la mezcla alcanza las raíces de la planta. De manera adversa, menores velocidad de flujo generalmente requerirán mayores concentraciones de mezcla de ROS/inductor. De manera alternativa, el tiempo de la aplicación de la mezcla puede ser alterado. Así, el uso de una baja velocidad de flujo y baja concentración de mezcla puede balancearse al incrementar el tiempo en el cual se aplica el agua conteniendo la mezcla. De esta manera, partir a la mitad la velocidad de flujo o concentración de la mezcla puede compensarse al doblar el tiempo de aplicación de la solución de agua-mezcla. Aunque la velocidad de flujo es una variable particularmente importante, la cosecha a la cual se está aplicando la mezcla también puede ayudar a determinar la concentración de mezcla a ser aplicada. Normalmente, las perennes toman concentraciones más altas que las anuales. Se debería notar que el granjero normalmente está atento de la velocidad de flujo por acre de la irrigación u otro sistema de aplicación a la tierra en el lugar en su propiedad, como lo es el área a ser cubierta. El granjero puede calcular la cantidad de agua que será usada para regar la tierra por cualquier cantidad particular de tiempo (por ejemplo, 1135.5 litros por minuto por 50 acres por 30 minutos, da 1,703,250 litros de agua).

El granjero puede calcular entonces cuanta mezcla de ROS/inductor es necesaria para resultar en una aplicación de la concentración deseada de la mezcla. La mezcla de ROS/inductor se aplica dura nte un periodo, que normalmente varía desde aproximadamente dos minutos hasta aproximadamente una hora. En algunos casos, el practicante puede desear aplicar la mezcla a una menor concentración, pero durante un periodo más largo, tal como durante la noche o sobre varios días. Tales aplicaciones están dentro de la competencia de la invención , siempre y cuando resulten en aumentos en prote ínas PR, PAL o H PRG, o de resistencia a la enfermedad. El tiempo de la aplicación también variará de acuerdo con el método particular empleado. Para sistemas de goteo, la mezcla se aplica durante aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 45 minutos. Más preferiblemente, la mezcla se aplica durante aproximadamente 9 m inutos hasta aproximadamente 30 minutos. Aún más preferiblemente, la mezcla se aplica durante aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 25 minutos. Resultados consistentemente buenos han sido alcanzados en nuestras pruebas cuando la mezcla se apl ica durante aproximadamente 20 m inutos. De acuerdo con esto, ese periodo de aplicación es el más preferido. El practicante apreciará que los diferentes sistemas de aplicación tienen diferentes velocidades de flujo. Por ejem plo , rociadores superior general mente tienen velocidades de flujo relativamente mayores q ue los sistemas de goteo, y el tiempo de aplicación preferido es correspondientemente menor: desde aproximadamente 4 m inutos hasta aproximadamente 1 0 minutos. Los sistemas de micro-rociadores, tales como Fan JetM R normalmente tienen velocidades de flujo entre aquéllas de sistemas de goteo y aquéllas de rociadores, y de acuerdo con esto, tienen tiempos de aplicación un tanto mayores que aquéllos de los rociadores, prefiriéndose aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 1 5 minutos. Las mezclas de ROS/inductor normalmente se aplican a la tierra al ser corridas a través de una manguera, tubería, goteo, rociador, canal de irrigación u otro mecanismo. En la práctica, los dispositivos usados no son necesariamente equipo de precisión. De acuerdo con esto, cuando el flujo de ag ua es apagado, el agua normalmente continúa goteando o corriendo de la manguera o a través del canal de irrigación u otro aplicador durante algún tiempo. Por lo tanto, se entenderá que los tiempos de aplicación generalmente serán una aproximación y serán medidos desde el inicio del flujo de la mezcla hasta cuando el flujo de la mezcla es apagado, ya sea que algo de la mezcla continúe o no goteando o corriendo desde el aplicador. Sig uiendo la aplicación de la mezcla de ROS/inductor como se expone antes, la mezcla normalmente estará en la parte superior unos cuantos centímetros de la tierra. Para muchas plantas, el sistema de raíces está más profundo en la tierra . Por lo tanto, es deseable ayudar a mover la mezcla 1 5.24 a 30.48 centímetros en la tierra para alcanzar las estructuras de ra íces involucradas en la captación activa . Para lograr esto, es deseable usar un "empuje de agua" para crear un gradiente de concentración después de la aplicación de la mezcla de ROS/inductor. Esto se log ra al seg uir la aplicación de la mezcla de ROS/inductor con una aplicación de agua. La aplicación de agua puede ser tan corta como unos cuantos minutos o tan larga como varias horas. Sin embargo, de preferencia, la aplicación de agua está entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente una hora y media, y más preferiblemente es aproximadamente una hora. Tales "empujes de agua" para crear gradientes de concentración son usados comúnmente por granjeros al aplicar químicos agrícolas y son bien conocidos, de acuerdo con esto, en la técnica. En aplicaciones en la tierra, la mezcla de ROS/inductor es usada sin agentes reductores redox de cationes o cationes divalentes teniendo potencial redox en cantidades suficientes para reducir los niveles de microorganismos vivos en la tierra alrededor de las raíces de las plantas (en combinación con la mezcla de ROS e inductor) por 40% o más. Los niveles de microorganismos en la tierra pueden ser determinados fácilmente por técnicas bien conocidas en el área. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de platinado de dilución de tierra al tomar un gramo de tierra, suspenderlo en 10 ml de agua estéril, hacer una dilución serial y platinar cada dilución sobre un medio de crecimiento adecuado. Esto determinará las cuentas de colonias cultivables en la muestra de tierra. En este caso, uno realizaría este ensayo en dos muestras de tierra con microorganismos similares y niveles de esos microorganismos, y comparar el nivel de los microorganismos vivos que permanecen en la muestra tratada contra el nivel de los microorganismos vivos en la muestra sin tratar (control).

V. Usos de la invención La invención puede ser usada para proteger casi cualquier planta capaz de responder el ataque patogénico con resistencia sistémica adquirida. Los ensayos para determinar si un tipo particular de planta puede beneficiarse de la inducción de resistencia sistém ica adquirida por medio de la invención , son bien conocidos en la técnica . Por ejemplo, pueden realizarse northern blots para determinar si la transcripción de genes para PAL, HRGPs, calcona sintasa, peroxidasa o proteínas relacionadas con la patogénesis han sido sobre-reguladas en respuesta al tratamiento con una mezcla de ROS/ínductor. Ensayos ejemplares son mostrados en los Ejemplos. Las plantas a ser protegidas por medio de la ¡nvención pueden ser dicotiledones, tales como zanahorias, lechuga , tomates , uvas, frutas cítricas y frijoles, o monocotiledones, tales como ma íz. Las plantas pueden hacerse crecer para consumo humano o animal , tales granos, vegetales y frutas, pueden pretenderse para uso decorativo, tal como flores, o pueden pretenderse para uso ornamental , tales como árboles cultivados para usarse como árboles de Navidad o plantas pretendidas para usarse como plantas caseras. Además, pueden ser plantas cultivadas para fibra, tales como plantas de algodón, para usarse como césped, por ejemplo, en campos de golf, prados o campos de pelota, o para usarse como, o en , medicamentos. Muy comúnmente, la invención será usada para proteger plantas cultivadas en campos como cosechas o en otras condiciones abiertas , tales como, granjas de árboles o césped ; sin embargo, la invención también puede ser usada para proteger plantas cultivadas en am bientas tales como invernaderos e invernáculos. La invención puede ser usada para proteger plantas contra cualquier patógeno contra el cual pueda generarse resistencia sistémica adquirida. Los patógenos contra los cuales puede producirse SAR incluyen una variedad de bacterias y virus, una variedad de hongos, nemátodos, Phylloxera e incluso áfidos. Los Ejemplos demuestran el uso de la invención para proteger cosechas en el campo contra varios patógenos, incluyendo insectos, hongos y nemátodos. Debido a que la invención protege cosechas contra al menos una porción del daño que sería provocado de otra manera por estas plagas, un mayor porcentaje de las cosechas cultivadas para consumo humano pueden venderse como cosechas de primera calidad. Más aún , debido a q ue menos cosecha no es comercialízable, la ¡nvención resulta en un mayor rendimiento por acre. Estos factores se combinan para resultar en mayores ing resos por acre para el granjero.

VI. Métodos para determinar si PAL, H PRG, peroxidasa, calcona sintasa, proteínas relacionadas con la patogénesis o sus transcriptos son i ncrementados U na variedad de métodos está disponible para determ inar si PAL, H P RG , peroxidasa, calcona si ntasa, proteínas relacionadas con la patogénesis o sus transcriptos u otras enzimas o proteínas de interés son incrementadas . Uno puede , por ejemplo , detectar u n i ncremento en los niveles de R NA en respuesta a una mezcla de ROS/inductor en comparación con un control por medio de ensayos tales como northern blots. Ensayos de northern blot ejemplares se discuten en los Ejemplos más adelante. De manera alternativa, una proteína , tal como una HRGP, puede ser usada para producir anticuerpos contra la proteína al inyectarla en ratones o conejos siguiendo protocolos estándares, tales como aquéllos mostrados en Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (Anticuerpos, un manual de laboratorio) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1 988). Los anticuerpos así producidos pueden ser usados entonces para detectar la presencia y cantidad de la proteína en una variedad de ensayos inmunológicos, tales como E LI SAs, inmunoensayos fluorescentes y Western blots.

EJEMPLOS Los sig uientes ejemplos son proporcionados a manera de ilustración solamente y no a manera de limitación . Aquéllos expertos reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos, los cuales podrían cambiarse o modificarse para producir resu ltados esencialmente similares.

Ejem plo 1 . Preparación de ROS e inductor sistémico y creación de u na mezcla de ROS/ind uctor Este ejemplo demuestra la elaboración de formas preferidas de ROS e inductor sistémico para formar composiciones de la invención y para usarse en los métodos de la invención. En los procedimientos expuestos, protocolos normales para preparar la ROS y el inductor sistémico han sido alterados para i ncluir cantidades de agentes q uela ntes , agentes secuestrantes y surfactantes que nuestro trabajo ha ind icado que hacen más efectiva la mezcla final de ROS/inductor. Hacer ácido peracético ("PAA") para usarse en la invención comienza con una decisión en cuanto a la cantidad de PAA deseada, por ejemplo, 3.78 o 378.5 litros. El PAA se hace entonces al mezclar los siguientes ingredientes en el orden mostrado. Preferimos usar una solución al 5% de PAA. A una solución al 5%, PAA pesa 1 .12 kg/l, y por lo tanto es posible calcular el peso de cualquier cantidad deseada de PAA (por ejemplo, 37.85 litros serían igual a 42.63 kilogramos). Los porcentajes abajo denotan el peso del ingrediente a adicionar, en porcentaje del peso final de la cantidad final de PAA deseada. Siguiendo la receta más adelante, por ejemplo, para mezclar 37.85 litros de PAA, uno usaría 21 .31 kilogramos (50% de 94) de peróxido de hidrógeno al 50%. La receta es como sig ue: 25% de agua deionizada 50% de peróxido de hidrógeno al 50% 1 1 % de ácido acético glacial .05% de pírofosfato de tetrapotasio .05% de Versonex 80 R (un agente quelante; otros agentes q uelantes comercialmente disponibles pueden ser su bstituidos) Esta mezcla es llevada entonces a un peso final con 1 3.9% de agua deionizada. Pueden hacerse cálcu los similares para mezclar soluciones de PAA a diferentes concentraciones, si se desea . Para hacer una solución de ácido salicílico, un inductor preferido de resistencia sistém ica, se prefiere el sig uiente medio . Como en el método anterior, uno decide primero la cantidad total del producto deseado y calcula el peso de esta cantidad. Para hacer la solución al 10% de ácido salicílico y ácido húmico, que es la modalidad preferida (una solución al 10% de ácido salicílico pesa 1.13 kilogramos por litro), los ingredientes se mezclan de acuerdo con la siguiente receta, en porcentaje del peso final de la mezcla: 30% de agua deionizada 10% de ácido salicílíco 10% de ácido húmico (en la forma de una solución acuosa al 12%) 10% de potasa cáustica 1% de ácido fosfórico al 80% 2.5% de Tergitol 15 S 9MR 2.5% de Tritón H-66 R 1% de Versonex 80 R 12% de pirofosfato de tetrapotasio Esta mezcla se lleva entonces a un peso final con 21% de agua deionizada. Como se nota, la receta resulta en una solución al 10% de inductor sistémico. La solución puede mezclarse entonces en un volumen igual con una ROS, tal como la mezcla de peracético al 5% descrita antes, para obtener una mezcla con concentraciones en la proporción preferida de 10:1 de ROS a inductor sistémico. En los Ejemplos más adelante, el ácido húmico en una solución acuosa fue substituida por un cuarto del agua deíonizada, de manera que se constituyó 10% del peso final de la solución de ácido salicílico.

Los Ejemplos más adelante incluyen ensayos de laboratorio y campo de la invención . En los ensayos de laboratorio, algunas plantas fueron contactadas con una , mezcla de ROS sin también ser contactadas con la mezcla de inductor sistémico. Donde se adiciona la mezcla de inductor sistémico se adiciona a 200 ppm. Las referencias a concentraciones del inductor se refieren a la concentración de la mezcla, con los surfactantes y otros agentes notados antes. En los ensayos de campo, las concentraciones declaradas son la porción de ROS de la mezcla . En cada ensayo de cam po, se adicionó un vol umen igual de la mezcla de inductor sistém ico, de manera que la mezcla de inductor estuvo presente a aproximadamente u n décimo la concentración de la mezcla de ROS.

Ejem plo 2. Inducción de la expresión del gene PR-1 a Este ejemplo muestra que las plantas rociadas con una mezcla de ROS/inductor en un laboratorio mostró mayor expresión del gene que codificando la proteína relacionada con la patogénesis PR-1 a q ue a las plantas rociadas ya sea con una ROS sola o con un inductor sistémico solo. Se rociaron pl a ntas de frijol colorad o de catorce d ías (Phaseolus vulgaris) desde un botalón superior hasta q ue las hojas estaban mojadas y el rociado comenzó a derramarse. Las plantas fueron tratadas con uno de los sig uientes tratam ientos: agua, la ROS, ácido peracético , a una concentración de 3 , 500 ppm , ácido peracético a una concentración de 1 0, 000 ppm , una mezcla de ROS/inductor, a 3 , 500 ppm de la ROS y 200 ppm de la mezcla de inductor (ácido salicílico), de la misma mezcla a 10,000 ppm para la ROS y 200 ppm del inductor y de solo el inductor a 200 ppm. Las plantas se dejaron entonces durante 24 horas, después de lo cual las hojas se sometieron a extracción de su RNA total mediante el procedimiento descrito en Logemann, J., et al, "Improved method for the isolation of RNA from plant tissues" (Métodos mejorado para el aislamiento de RNA de tejidos de plantas), Anal. Biochem. 163:16-20 (1987). Entonces se prepararon geles de formaldehído, se cargaron con 10 µg del RNA total y se corrieron para separar RNA por tamaño, de acuerdo con métodos estándares (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clonación molecular, un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2a ed. 1989)). Los geles se mancharon entonces (como se describe en Sambrook, supra) y se hibridaron a una sonda para PR-1a preparada de acuerdo con el método descrito en Zedor, R., y A.J. Anderson, "Influence of root colonizing pseudomonads on defense mechanisms of bean" (Influencia de pseudomonas colonizadoras de raíces sobre los mecanismos de defensa del frijol). Plant and Soil. 140:99-107 (1992) Se preparó la sonda no radioactiva vía iniciación aleatoria de solo la inserción clonada. La hibridación se observó y analizó mediante detección quimioluminiscente de las sondas unidas usando el "Genius System" (Boehpnger Mannheim Corporation, Indianapolis, IN), siguiendo las direcciones del fabricante. La igual carga del RNA se juzgó mediante manchado con bromuro de etidio de las bandas de RNA ribosomal.

Los resultados se muestran en la Figura 1, la cual es una northern blot de RNA sondeado para PR-1a. Aunque no se corrió un control de agua sola en este northern, nuestro trabajo previo ha demostrado que no es detectable mensaje de RNA alguno para plantas tratadas solo con agua. La expresión de RNA de gene PR-1a aumentó sobre el tratamiento con 3,500 ppm de ácido peracético (carril 1) y se ven cantidades mayores a tratamiento con 10,000 ppm de ácido peracético (carril 2). La mezcla de inductor sistémico, a 200 ppm, también mostró aumentos de acumulación de RNA (carril 5). El tratamiento de mezcla de ROS/inductor, tanto a 3,500 ppm de ROS como 200 ppm de ácido salicílico (carril 3) y de 10,000 ppm de ROS y 200 ppm de mezcla de inductor (carril 4), mostró un efecto dramático, sinergístico, reflejando un efecto claramente mayor que un efecto aditivo simple del incremento en la acumulación de transcripto de RNA provocada por cualquiera de los dos agentes solos.

Ejemplo 3. Inducción del gene que codifica fenilalanina amoníaco liasa Este ejemplo muestra que el uso de una mezcla de ROS/inductor provoca un aumento en la transcripción de un gene que codifica fenilalanina amoníaco liasa ("PAL"), otro marcador para resistencia de la planta. Las plantas de frijol se cultivaron y trataron en la misma manera que en el Ejemplo previo, excepto que se corrió un control de agua sola, pero no una prueba de inductor sistémico sin PAA. El RNA total se extrajo y se cargaron geles, se corrieron y analizaron siguiendo los procedimientos discutidos en el Ejemplo previo, con la excepción e que no se corrió carril alguno conteniendo RNA de plantas rociadas con un inductor sistémico sin una ROS presente. La sonda para transcriptos de mRNA de PAL se preparó siguiendo los procedimientos expuestos en Blee, K.A. y Anderson, A.J . "Defense-related transcript accumulation in Phaeolus vulgaris L. colon ized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices Schenck & Smith" (Acumulación de transcripto relacionada con la defensa en Phaeolus vulgaris L. colonizada por el hongo micorrizal arbuscular Glomus intraradices Schenck & Smith), Plant Physiol. 1 1 0: 675-688 ( 1 996). El northern blot resultando de este estudio se expone como Figura 2.

No se puede ver RNA de hibridación en el carril para el RNA de los controles tratados con agua (carril 1 ) . Los carriles para tratamiento con ácido peracético a 3, 500 ppm (carril 2) y a 1 0,000 ppm (carril 3) muestran un aumento en mRNA para genes PAL sobre aquél del control de agua, con el carril para 1 0, 000 ppm de tratamiento mostrando un incremento substancial en la cantidad de RNA comparado con el carril para tratam iento con 3, 500 ppm de PAA. El cuarto carril muestra ese tratam iento con 3, 500 ppm de la ROS ácido peracétíco, en combinación con una mezcla de ind uctor (a 200 ppm) resultó en niveles de ind ucción de PAL al menos iguales a aquéllos de la aplicación de 1 0, 000 ppm de ácido peracético en la ausencia de un inductor.

Ejem plo 4. I nducción del o los genes q ue codifican g licoproteína rica en h id roxi prol i na por u na mezcla de ROS/ind uctor Se sabe que las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina ("HPRG" o "HYP") son depositadas en cantidades crecientes en las paredes celulares de la planta cuando las plantas son retadas por patógenos, y se piensa que fortalecen las paredes celulares. Este Ejemplo muestra que existe un incremento en el nivel de RNA para HYP sobre tratamiento con una mezcla de ROS/inductor, y que el incremento fue mayor que aquél visto sobre el tratamiento con una ROS sola o con un inductor sistémico solo. Plantas de frijol se cultivaron y trataron como en el Ejemplo 2. El RNA total se extrajo y se cargaron geles, se corrieron y analizaron siguiendo los procedimientos discutidos en el Ejemplo 2. Las sondas para HYP se prepararon siguiendo los procedimientos expuestos en Blee y Anderson, supra. El northern blot resultante de este estudio se expone como Figura 3. Los carriles para tratamiento con ácido peracético a 3,500 ppm (carril 2) y 10,000 ppm (carril 3), muestran un incremento en los niveles de RNA de genes HYP sobre aquéllos del control de agua (carril 1), con el carril para tratamiento con 10,000 pppm mostrando RNA substancialmente más hibridante que el carril para tratamiento con 3,500 ppm (comparar el carril 3 y el carril 2). El carril 6, que muestra sondeo de RNA de plantas tratadas con un inductor sistémico (ácido salicílico, a 200 ppm) pero sin una ROS presente, muestra un nivel de inducción de HYP un tanto mayor que aquél del carril que refleja el tratamiento con una ROS a 3,500 (carril 2), pero menor que aquél del carril que refleja el tratamiento con una ROS a 10,000 ppm y una mezcla de inductor sistémico (de acuerdo con la receta expuesta en el Ejemplo 1) a 200 ppm, muestra un nivel mucho mayor de inducción de RNA que es cierto para plantas tratadas solo con 3,500 ppm de la ROS (carril 2) y en realidad es mayor que la inducción vista para 1 0,000 ppm de ROS sola (carril 3) . El carril 5, que refleja el tratam iento con una ROS a 1 0, 000 y la mezcla de inductor sistémico (a 200 ppm) también muestra una inducción muy fuerte de mRNA de HYP en comparación con los carriles que reflejan la aplicación de una ROS a la misma concentración (carril 5) o de la mezcla de inductor sistémico (a 200 ppm) sola (carril 6).

Ejemplo 5. Ensayo de cam po de la mezcla de ROS/i nductor para tratar infestación con nemátodos en uvas de mesa Se diseñaron ensayos de campo por agentes de extensión de la Un iversidad de California, quienes fueron instruidos para diseñarlos con los m ismos estándares como para los experimentos de la Universidad de California. Este ensayo muestra el uso de la invención para tratar la infestación por nemátodos en uvas de mesa . Los nemátodos presentes en altas concentraciones fueron Ring , Citrus ( Tylenchulus) , Dagger (Xiphinemma) , Stubby Root ( Trichodorus) y Lesión (Pratylenchus) . Una mezcla de ROS/inductor de ácido peracético y ácido salicílíco, con surfactanes, agentes secuestrantes y potasa cáustica presentes en pequeñas cantidades (en este y en los ejemplos restantes referida como una "mezcla de PAA/inductor") , como se describe antes, se aplicó a una cosech a de uvas de mesa. Se hicieron tres aplicaciones, iniciando tem prano en la estación de crecim iento. Para la primera aplicación , se aplicaron 3.78 I por acre de PAA y 3 78 I por acre de la mezcla de inductor al 10%, seguido por una segunda aplicación 21 días después de una proporción de 1.89 litros de cada uno por acre, seguido por la tercera aplicación 21 días después de esa, a la misma proporción que la segunda. La aplicación se hizo en agua, hecha por irrigación por goteo durante 30 minutos, a una velocidad de flujo de 34.06 litros por acre por minuto, a una concentración final de 1900 ppm, seguida por un "empuje de agua". El ensayo se hizo aleatorio, con seis réplicas por tratamiento y se tomaron 140 muestras para cada réplica. El control fue tratamiento con agua sola. Resultados: De los campos tratados con agua sola, el rendimiento (en el número de cajas de frutas de 9.52 kg) fue: 373 cajas de uvas de calidad no. 1 y 282 cajas de uvas de calidad no. 2, para un rendimiento total de 656 cajas. Los campos tratados con la mezcla de ROS/inductor produjeron 414 cajas de fruta no. 1 y 373 cajas de fruta no.2, para un total de 787 cajas. A $10 por caja, la diferencia en el rendimiento aumentó el ingreso por $1310 por acre Ejemplo 6. Ensayo de campo de la capacidad de prueba de la invención para reducir el moho pulverulento en uvas de mesa Este Ejemplo muestra la capacidad de la invención para reducir el porcentaje de uvas de mesa infectadas con moho pulverulento, una infección fungal. En este Ejemplo, las plantas se examinaron para determinar el número con moho nivel 1 (menos de 3 uvas por planta con el moho activo) antes y después del tratamiento con una mezcla de PAA/inductor. Se dividió un viñedo de 50 acres en 16 réplicas de 88 viñas cada uno, para un total de 1408 viñas en el ensayo. Las viñas en cada réplica se examinaron y se determinó el porcentaje de moho pulverulento nivel 1 . El campo se trató entonces a medio verano cpn una aplicación foliar simple de mezcla de PAA/inductor mediante un rociador de chorro de aire a una concentración de 1 250 ppm, aplicada como 1 cuarto de mezcla en 757 litros de agua. Las réplicas se examinaron entonces después de 1 semana y se determinó el porcentaje con moho nivel 1 . Los resultados se muestran en la Figura 4. Para cada réplica, el porcentaje de plantas con moho nivel 1 fue notablemente menor que el porcentaje de plantas con moho para la misma réplica antes del tratam iento.

Ejemplo 7. Dos ensayos de campo de la capacidad de prueba de la invención para reduci r el daño por Pythium y nemátodo a zanahorias Este Ejemplo expone dos ensayos de campo, los cuales muestran juntos la capacidad del método de la invención para i ncrementar el rendim iento de zanahorias y para reducir la cantidad de daño por nemátodos y Pythium a zanahorias comparado con uno de los agentes convencionales más ampliamente usados. El Phytium, un hongo que ataq ue a través del sistema de ra íces, y nemátodos, q ue atacan en la punta en crecimiento de la zanahoria durante los primeros 20 d ías de crecim iento, provocan que la zanahoria se d ivida en forma de tenedor alrededor del tej ido dañado. Las zanahorias así dañadas no pueden ser vend idas como de primera cal idad , es decir, las zanahorias frescas para comerse, por las cuales el g ranjero recibe el precio más alto a. Ensayo de campo A Este ensayo se condujo para determinar la información de rendimiento. Las pruebas fueron de comparaciones lado a lado de dos lotes de 50 acres, con seis réplicas cada uno. A las zanahorias siendo tratadas con la mezcla de PAA/inductor se les dio una aplicación de "agua de germen" (en la cual a una semilla plantada en terrero bastante seco se le da su primer riego, para alentar su germinación , con el agua tratada) mediante irrigación con un sistema de rociadores presurizados a una proporción de aplicación de 4.73 litros de mezcla por acre, para una concentración de 1 1 00 ppm . Las zanahorias fueron tratadas entonces con dos aplicaciones adicionales, una de diez días después de la primera aplicación y otra d iez d ías después de esa, a una velocidad de 3.78 litros por acre. Para probar la eficacia de la invención contra agentes convencionales actualmente usados, se cultivó un segundo grupo de zanahorias usando un fumigante de tierra ampliamente usado, Vapam R (genéricamente, metam-sodio) , para controlar las plagas . Este agente es aplicado a la tierra como un l íquido, el cual emite entonces gas de disulfuro de carbono. Debido a que el gas mata a la mayoría de las cosas vivientes con las cuales entra en contacto a altas concentraciones, incluyendo plantas en crecimiento, se aplica antes de que se plante el campo. Se aplicó de acuerdo con las direcciones de la etiq ueta. Res u ltados: De las zanahorias tratadas con la mezcla de ROS/inductor, 98.2% de las zanahorias tratadas con la mezcla de ROS/inductor fueron comercializables, como se com para con 96% de las zanahorias cultivadas después del tratamiento con VapamM R. La mezcla de ROS/inductor también resultó en un rendimiento de zanahorias comercializables, 29. 1 toneladas/acre, casi una tonelada por acre más que los cam pos tratados con VapamMR, los cuales produjeron 28.2 toneladas/acre. Así, el método de la invención resultó en una calidad ligeramente mejor y un rendimiento incrementado, comparado con un pesticida convencional ampliamente usado, pero altamente tóxico. b. Ensayo de campo B Este ensayo pretendió medir el rendimiento de "cello packs" de zanahorias, bolsas de plástico de 22.68 kg de zanahorias con sus partes superiores removidas. Las zanahorias de "cello pack" imponen uno de los precios más altos que el granjero puede recibir por zanahorias; es ventajoso tener zanahorias con un buen peso y diámetro, de manera que menos zanahorias se necesiten para llenar cada bolsa de 22.68 kg . El ensayo se fijó y se condujo como para el Ensayo de campo A anterior, incluyendo el tamaño de los campos, las fechas de aplicación y las concentraciones de los agentes aplicados. Sin em bargo, las zanahorias pretendidas para cello pack permanecen en el suelo durante unos 1 0 d ías adicionales para permitirles que ganen más grosor y peso; esto se hizo para cada grupo en este ensayo. Resultados : El Pythium dañó 1 2.7% de la cosecha en cam pos tratados con VapamM R comparado con casi cero (0. 1 %) en cam pos tratados con la mezcla de ROS/inductor. Los nemátodos da ñaron 1 1 .9% de la cosecha en campos tratados con VapamM R comparados con 2.9% en campos tratados con la mezcla de ROS/ind uctor. De acuerdo con esto, en lotes de réplica , la mezcla de ROS/inductor redujo notablemente el daño de Pythium y nemátodos comparado con este pesticida convencional ampliamente usado, pero altamente tóxico. El tamaño de las zanahorias también difirió entre los dos grupos de tratamiento. Nueve porciento más de las zanahorias cultivadas en los campos tratados con la mezcla de ROS/inductor tuvieron un diámetro en el rango de 1 .27 a 2.54 centímetros en comparación con las zanahorias tratadas con VapamMR (81 % a 74%), mientras que el porcentaje con diámetros más pequeños que 1 .27 centímetros en el grupo tratado de ROS/ínductor fue 4% menor que aquél de la cosecha tratada con VapamMR (1 9% a 23%). La cosecha tratada con ROS/inductor tuvo un menor porcentaje de zanahorias con diámetros por arriba de 2.54 cm en comparación con la cosecha tratada con VapamMR (0% a 3%). De manera más importante, el rendimiento difirió entre los dos grupos de tratam iento. Los campos tratados con la mezcla de ROS/inductor produjeron 29 toneladas/acre, en comparación con 22.7 toneladas/acre producidas por los campos tratados con VapamM R, u na diferencia de casi 29% . Aún de manera más importante, esta diferencia en el rendimiento por acre se reflejó casi en 48% la diferencia en el número de cello packs de zanahorias empacadas por acre, con un promedio de 1 77 bolsas por acre para los cam pos tratados con la mezcla de ROS/inductor, y un promedio de 1 20 bolsas por acre para los cam pos tratados con Vapam R. De esta manera , el método de la invención resultó en u na producción notablemente incrementada de cosecha de alto valor, en comparación con un pesticida convencional am pl iamente usado, pero altamente tóxico.

Ejemplo 8. Ensayo de campo de la invención para determinar la capacidad para reducir el daño viral a tomates Este ensayo muestra el efecto en el método de la invención sobre la reducción al daño a tomates de infecciones virales. El lote de ensayo comprendió 7803.6 metros cuadrados divididos en 24 réplicas de lado a lado de plantas tratadas y no tratadas. Se involucraron 1 7400 plantas en el ensayo. Los virus presentes en el campo fueron identificados como: mosaico de pepi no, mosaico de alfalfa y parte superior ondulada. Además, las plantas mostraron tres diferentes conjuntos de síntomas q ue parecieron deberse a virus, pero los cuales no pudieron ser atribuidos a un virus específico. Resultados: Las plantas tratadas mostraron un promed io de una reducción al 60.4% en la incidencia de síntomas de virus en comparación con répl icas no tratadas.

Ejem plo 9. Ensayo de cam po de la i nvención para determinar la ca pacidad para red uci r daño de hongo aterciopelado a lech uga Este ensayo muestra el efecto en el método de la invención para reducir daño a lechuga a partir de moho aterciopel ado. El moho aterciopelado es una i nfección fungal , la cual provoca q ue la lechuga se pudra después de la cosech a y es el mayor problem a en la producción agrícola de la lechuga. Se requiere tratamiento frecuente para mantenerlo bajo control . A las plantas tratadas con la mezcla de PAA/inductor se les dieron aplicaciones foliares mediante rociador superior cada una a una proporción de 0.4536 kg en 1 89.25 litros de agua por acre, en cinco aplicaciones, cada una de las cuales se espació diez d ías. A las plantas de control se les dio u na combinación de dos fungicidas convencionales , AllietteMR y mancozeb, actualmente en amplio uso para controlar el moho aterciopelado en la lechuga. Los fungicidas también son aplicados cada diez días, siguiendo las direcciones de la etiqueta. Las plantas se compararon entonces con el número de hojas infectadas con moho aterciopelado. Los resultados para un total de seis réplicas mostraron que , para los campos tratados con la mezcla de PAA/inductor, se infectaron un total de 45 plantas con moho aterciopelado y 704 no, para u na proporción de infección promedio de 6.1 %. Para las plantas tratadas con los fung icidas convencionales , se encontró que un total de 1 1 7 plantas se infectaron de 842 examinadas, para una proporción de infección promed io de 1 2.2% . De esta manera , en esta prueba, el tratamiento con una mezcla de PAA/inductor resultó en disminuir a la mitad la infección de las plantas por moho aterciopelado.

Ejemplo 1 0. Dos ensayos de campo de la i nven ción pa ra determinar su capaci dad para reduci r los i nsectos de escamas roj as en frutas cítricas Estos ensayos muestran el efecto en el método de la invención sobre la red ucción del daño a naranjas de la plaga de insectos de escama roja. La presencia de escama roja en la fruta la hace no comercializable para venta como fruta fresca y req uiere que la cosecha sea vendida a menor precio para usarse en jugo. Los ¡nsectos también provocan daño significativo a los árboles por sí mismos. La evaluación del número de insectos en las hojas es una medida para determinar el nivel de infestación en los árboles antes de que los insectos alcancen la fruta . a. Ensayo de campo A Un huerto de naranjas se dividió en dos grupos de árboles, uno a ser tratado con PAA/inductor y uno para recibir solo una aplicación equivalente de agua simple. A los árboles a ser tratados con la mezcla de PAA/inductor se les dio u na aplicación foliar mediante rociador, a una concentración de 2500 ppm , en 757 litros de agua por acre, unas cuantas semanas antes de la cosecha; y las muestras se tomaron para evaluación dos semanas después. Se trataron cinco acres. Se tomaron tres réplicas de cada grupo de árboles . Cada réplica estaba hecha de 1 0 hojas m uestras de 5 árboles, para un total de 50 hojas. Las hojas seleccionadas para la muestra se ja laron tanto del interior como del exterior de la bóveda de los árboles . Los ¡nsectos presentes además de la escama roja fueron áfitos, ácaros predadores y crisopas; sin embargo, los números más adelante representan los n úmeros de insectos de escama roja solamente. Res u ltados : entre los árboles tratados se contaron 1 1 73 insectos de escam a roja vivos y se contaron 4833 i nsectos de escama roja m uertos, para u na proporción de 20% a 80% (o 1 "4) de insectos vivos a muertos . La mortalidad fue especialmente alta entre las etapas más tem pranas del ciclo de vida del insecto: por ejemplo, solo 5% de las orugas estaban vivas. Entre los árboles de control , tratados solamente con agua , se contaron 1637 insectos de escama roja vivos y se contaron 275 ¡nsectos de escama roja m uertos, para una proporción de 86% a 14% . Noventa y seis porciento de las orugas estaban vivas. De esta manera , la aplicación de la mezcla de PAA/inductor invirtió el porcentaje de insectos vivos a muertos comparados con los controles. La Tabla 2 m uestra los porcentajes de insectos muertos por etapa de vida para árboles tratados en comparación con árboles no tratados.

TABLA 2 b. Ensayo de campo B Se corrió un segundo ensayo con los mismos datos de apl icación , concentraciones, controles y criterios de m uestreo y eval uación como se reporta para el Ensayo de Cam po A anterior Resultados: como se muestra en la Tabla 3, un alto porcentaje de ¡nsectos encontrados en las plantas tratadas estaban muertos en cada etapa de vida, con mayor mortalidad entre las etapas de vida más tem pranas. Los árboles sin tratar tuvieron un menor porcentaje de insectos muertos (y de ah í, un mayor porcentaje de insectos vivos) en cada etapa de vida, con , por ejemplo, menos de una cuarta parte del porcentaje de ¡nsectos muertos en la etapa de chupador/2a muda, en com paración con los árboles tratados.

Tabla 3 Ejem plo 1 1 : Dos ensayos de campo de la invención para determi nar la capacidad para reducir la infestación de nemátodos y Phylloxera de uvas de vi no Estos ensayos m uestran el efecto del método de la invención para reducir el daño a dos variedades diferentes de uvas de vino de phylloxera y de nem átodos La Phylloxera es un piojo de ra íz que deposita huevos en la tierra ; cuando se i ncu ban , la progenie se vuelve parásito de las plantas . a. Ensayo de cam po A Este ensayo fue un ensayo de phylloxera en uvas de la variedad Chardonnay. Se dividió un viñedo de 1 00 acres de esta variedad de uva en 2 lotes de cincuenta acres. Una porción del viñedo se trató entonces con la mezcla de PAA/inductor un total de cuatro veces , por aplicaciones de tierra separadas 28 d ías. Cada aplicación fue a una proporción de 1 .89 litros de mezcla por acre, para proporcionar una concentración de 1 900 ppm durante 30 minutos. La otra porción del viñedo se trató con EnzoneM R, u n pesticida com únmente usado para tratar la i nfestación de phylloxera, siguiendo las direcciones de la etiqueta . Resu ltados: Los acres tratados con mezcla de PAA/inductor produjeron un promedio de 5.4 toneladas de uvas por acre. Los acres tratados con nematicida produjeron un promedio de 4.2 toneladas por acre. De esta manera, los acres tratados de acuerdo con la invención produjeron aproximadamente 28.5% m ás de uvas por acres (en peso) que los acres com parables tratados con un agente convencional . b. Ensayo de prueba B Este ensayo fue u n ensayo de control de nemátodos en uvas de la variedad Zinfandel . Los lotes fueron seleccion ados y divid idos como en el Ensayo de cam po A, anterior. Los lotes tratados con la mezcla de PAA/inductor recibieron el mismo tratamiento (es decir, las mismas cantidades y concentración de la mezcla , en las mismas fechas) como los lotes descritos en el Ensayo de cam po a de este Ejem plo , arriba . Los lotes de control se trataron con u n nem aticida convenciona l , DiTeraM R .

Resultados: Los acres tratados con PAA/inductor produjeron un promedio de 4.52 toneladas de uvas por acre. Los acres tratados con nematicidas produjeron un promedio de 3.49 toneladas por acre. De esta manera, los acres tratados de acuerdo con la invención produjeron aproximadamente 29.5% más uvas por acres (en peso) que los acres comparables tratados con un nematicida convencional .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia como si cada publicación , patente o solicitud de patente individual fuera indicada de manera específica e individual para ser incorporada por referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita con algún detalle a manera de ilustración y ejem plos para fines de claridad en el entendimiento, será fácilmente evidente para aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica , a la luz de las enseñanzas de esta invención , que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar, en una planta, la transcripción de un gene que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de: proteínas relacionadas con la patogénesis, fenilalanina amoníaco liasa, calcona sintasa y glícoproteínas ricas en hidroxiprolina, comprendiendo el paso de contactar follaje de la planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de especie de oxígeno reactivo es suficiente para incrementar el nivel de transcripción de las proteínas relacionadas con la patogénesis, fenilalanina amoníaco liasa, calcona sintasa o glicoproteínas ricas en hidroxiprolína por encima del nivel inducido por el inductor sistémico de plana en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo.

2. Un método de la reivindicación 1, en donde la proteína es una proteína relacionada con la patogénesis.

3 Un método de la reivindicación 2, en donde la proteína relacionada con la patogénesis es el producto de un gene PR-1.

4. Un método de la reivindicación 1, en donde la proteína es fenilalanina amoníaco liasa.

5. Un método de la reivindicación 1, en donde la proteína es una glicoproteína rica en hidroxiprolina.

6. Un método de la reivindicación 1, en donde la proteína es calcona sintasa.

7. Un método de la reivindicación 1, en donde además la planta es contactada con ácido húmico

8. Un método de la reivindicación 1 , en donde el inductor sistémico es derivado de kelp u otra alga marina.

9. Un método de la reivindicación 1 , en donde el incremento en la transcripción de las proteínas relacionadas con la patogénesis, fenilalanina amon íaco liasa, calcona sintasa o glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, al contactar la planta tanto con un inductor sistémico de planta como una especie de oxígeno reactivo, es aditivo comparado con el nivel de la transcripción de las proteínas relacionadas con la patogénesis, fenilalanina amon íaco liasa, calcona sintasa o glicoproteínas ricas en hidroxiprolina inducidas ya sea por el inductor sistémico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo o por la especie de oxígeno reactivo en la ausencia del inductor sistémico de planta.

1 0. Un método de la reivindicación 1 , en donde la especie de oxígeno reactivo es seleccionada del grupo que consiste de: ácido peracético, peróxido de hidrógeno, hidroperóxidos, peróxidos, peróxido de calcio , percarbonato de potasio y peróxido de urea.

1 1 . Un método de la reivindicación 1 , en donde el ind uctor sistémico de planta es seleccionado del grupo que consiste de: ácido salicílico, ácido jasmónico , ácido isonicotínico, ácido araquidón ico, ácido fosforoso, ácido dicloroisonicotínico y benzotriadiazol .

1 2. Un método de la reivi ndicación 1 , en donde el inductor sistémico de planta es un microbio no patogénico para la planta.

1 3. U n método de la reivi ndicación l , en donde el ind uctor sistémico de planta es un microbio seleccionado del g rupo que cons iste de : Bacillus, Serratia, Pseudomonas y Trichoderma.

14. Un método de la reivindicación 1, en donde el inductor sistémico de planta es ácido salicílico.

15. Un método de la reivindicación 1, en donde el inductor sistémico de planta es ácido húmico.

16. Un método de la reividicación 1, en donde la especie de oxígeno reactivo es ácido peracético.

17. Un método de la reivindicación 1, en donde la especie de inductor sistémico de planta y la especie de oxígeno reactivo se mezclan juntas antes de que entren en contacto con la planta.

18. Un método de la reivindicación 1, en donde la planta es un dicotiledón.

19. Un método de la reivindicación 1, en donde la planta es una especie comestible por humanos.

20. Un método de la reivindicación 19, en donde la planta es seleccionada del grupo que consiste de: lechuga, tomate, papa, maíz, uva, zanahoria, legumbres, frijol, fresa, espárrago y frutas cítricas.

21. Un método de la reivindicación 1, en donde la planta es seleccionada del grupo que consiste de: césped, algodón, rosa, tulipán, clavel, peonía, begonia, azucena amarilla, azucena, dalia, hibisco, azalea, cornejo, rododendro y lirio.

22. Un método para incrementar, en una planta, la transcripción de una proteína seleccionada del grupo que consiste de: proteínas relacionadas con la patogénesis, fenilalanina amoníaco liasa y glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, comprendiendo el paso de contactar el follaje de la planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de i nductor sistémico es suficiente para incrementar el nivel de transcripción de proteínas relacionadas con la patogénesis, fenilalanina amon íaco liasa o glicoproteínas ricas en hidroxiprol ina por encima del nivel inducido por la especie de oxígeno reactivo en la ausencia del inductor sistém ico de planta.

23. Un método de la reivindicación 22, en donde la prote ína es una proteína relacionada con la patogénesis.

24. Un método de la reivindicación 22 , en donde la proteína relacionada con la patogénesis es el producto de un gene P R- 1 .

25. Un método de la reivindicación 22 , en donde la proteína es fenilalanina amon íaco liasa.

26. Un método de la reivindicación 22 , en donde la proteína es una glicoproteína rica en hidroxiprolina.

27. Un método de la reivi ndicación 22, en donde la planta es una especie comestible por humanos.

28. U n método de la reivindicación 22, en donde la planta es seleccionada del grupo que consiste de: lechuga , tomate, uva , papa, maíz, zanahoria, leg umbres, frijol , fresa, espárrago y frutas cítricas.

29. Un método de la reivindicación 22, en donde la especie de oxígeno reactivo es seleccionado del g rupo que consiste de: ácido peracético, peróxido de hidrógeno , hidroperóxidos , peróxidos , peróxido de calcio, percarbonato de sodio y peróxido de urea.

30. U n método de la reivind icación 22 , en donde el ind uctor sistémico de planta es seleccionado del grupo que consiste de' ácid o sa l icílico, ácido jasmónico, ácido ison icotíníco, ácido araq uidón ico , ácido dicloroisonicotínico y benzotiadiazol .

31 . Un método de la reivindicación 22, en donde el inductor sistémico de planta es derivado de kelp u otra alga marina .

32. Un método de la reivindicación 22, en donde la planta es contactada con ácido húmico.

33. Un método para incrementar la resistencia a enfermedad en una planta al contactar la planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde el incremento en la resistencia a la enfermedad es mayor que aquélla provocada ya sea por el inductor sistém ico de planta o la especie de oxígeno reactiva en la ausencia del otro.

34. Un método de la reivindicación 33, en donde el incremento en la resistencia a enfermedad es aditivo comparado con el incremento en la resistencia a enfermedad provocado por el inductor sistém ico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo o por la especie de oxíg eno reactivo en la ausencia del inductor sistémico de planta.

35. Un método para incrementar, en una planta, la transcripción de una prote ína seleccionada del grupo que consiste de: proteínas relacionadas con patogénesis, fenilalanina amon íaco liasa y glicoprote ínas ricas en hidroxiprolina , comprendiendo el paso de contactar ra íces de la planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de inductor sistém ico es suficiente para incrementar el nivel de transcripción de prote ínas relacionadas con la patogénesis, fenilalanina amon íaco Masa , o glicoprote ínas ricas e n h id roxi prolina , por encima del nivel inducido por la especie de oxígeno reactivo en la ausencia del inductor sistémico de planta, siempre que la composición no comprenda un agente seleccionado del grupo que comprende un agente reductor redox de cationes y un catión divalente teniendo un potencial redox en cantidades suficiente para reducir los niveles de microorganismos en la tierra alrededor de las raíces por 40% o más.

36. Un método de la reivindicación 35, en donde la proteína es una proteína relacionada con la patogénesis.

37. Un método de la reivindicación 35, en donde la proteína relacionada con la patogénesis es el producto de un gene PR-1.

38. Un método de la reivindicación 35, en donde la proteína es fenilalanina amoníaco liasa.

39. Un método de la reivindicación 35, en donde la proteína es una glicoproteína rica en hidroxiprolina.

40. Un método de la reivindicación 35, en donde la planta es una especie comestible por humanos.

41. Un método de la reivindicación 35, en donde la planta es seleccionada del grupo que consiste de: lechuga, tomate, uva, papa, maíz, zanahoria, legumbres, frijol, fresa, espárrago y frutas cítricas.

42. Un método de la reivindicación 35, en donde la especie de oxígeno reactivo es seleccionada del grupo que consiste de: ácido peracético, peróxido de hidrógeno, hidroperóxidos, peróxidos, peróxido de calcio, percarbonato de potasio y peróxido de urea

43. Un método de la reivindicación 35, en donde el inductor sistémico de planta es seleccionado del grupo que consiste de: ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido isonicotínico, ácido araquidónico, ácido dicloroisonicotínico y benzotiadiazol.

44. Un método de la reivindicación 35, en donde el inductor sistémico de planta es derivado de kelp u otra alga marina.

45. Un método de la reivindicación 35, en donde la planta es contactada con ácido húmico.

46. Una composición para aplicación para follaje de plantas comprendiendo un inductor sistémico de plana y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de especie de oxígeno reactivo es suficiente para aumentar la transcripción de un gene que codifica un producto de planta natural seleccionado del grupo que consiste de: fenilalanina amoníaco liasa, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, calcona sintasa y proteínas relacionadas con la patogénesis a un nivel de concentración por encima del nivel de la inducida por el inductor sistémico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo.

47. Una composición de la reivindicación 46, que comprende además una solución acuosa y un agente secuestrante.

48. Una composición de la reivindicación 46, que comprende además un surfactante.

49. Una composición de la reivindicación 46, que comprende además ácido húmico.

50. Una composición de la reivindicación 46, en donde la proporción de la concentración de especie de oxígeno reactivo a la concentración de inductor sistémico de planta está entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:10

51. Una composición de la reivindicación 46, en donde la proporción de la concentración de especie de oxígeno reactivo a lal concentración de inductor sistémico de planta está en o aproximadamente 10:1.

52. Una composición de la reivindicación 46, en donde la concentración de ROS e inductor sistémico está entre aproximadamente 100 y 10,000 ppm.

53. La composición de la reivindicación 46, en donde la concentración total de ROS e inductor sistémico está entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5,000 ppm.

54. La composición de la reivindicación 46, en donde la concentración total de ROS e inductor sistémico está entre aproximadamente 2,500 y aproximadamente 3,500 ppm.

55. Una composición de la reivindicación 46, en donde la solución tiene un pH por encima de 7.0.

56. Una composición de la reivindicación 46, en donde la solución comprende potasa cáustica.

57. Un método de la reivindicación 1, en donde dicho contacto de la planta con un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo ocurre durante más de seis horas en un periodo de noventa y seis horas.

58. Una composición para la aplicación a raíces de plantas, que comprende un inductor sistémico de planta y una especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de especie de oxígeno reactivo es suficiente para incrementar la transcripción de un gene que codifica un producto de planta natural seleccionado del grupo que consiste de: fenilalanina amoníaco liasa, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, calcona sintasa y proteínas relacionadas con la patogénesis a un nivel de concentración por arriba del nivel de transcripción inducido por el inductor sistémico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo, siempre que la composición no comprenda un agente seleccionado del grupo que comprende un agente reductor redox de cationes y un catión divalente teniendo potencial redox en una cantidad para reducir niveles de microorganismos en la tierra alrededor de las raíces por 40% o más.

59. Una composición de la reivindicación 58, la cual comprende además una solución acuosa y un agente secuestrante.

60. Una composición de la reivindicación 58, la cual comprende además un surfactante.

61. Una composición de la reivindicación 58, la cual comprende ácido húmico.

62. Una composición de la reivindicación 58, en donde la proporción de la concentración de especie de oxígeno reactivo a la concentración de inductor sistémico de planta está entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:10.

63. Una composición de la reivindicación 58, en donde la proporción de la concentración de especie de oxígeno reactivo a la concentración de inductor sistémico de planta está en o aproximadamente 10.1.

64. Una composición de la reivindicación 58, en donde la concentración de ROS e inductor sistémico está entre aproximadamente 100 y 10,000 ppm

65. La composición de la reivindicación 58, en donde la concentración total de ROS e inductor sistémico está entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5, 000 ppm .

66. La composición de la reivindicación 58, en donde la concentración total de ROS e inductor sístémico está entre aproximadamente 2,500 y aproximadamente 3, 500 ppm .

67. Una composición de la reivindicación 58, en donde la solución tiene un pH por encima de 7.0. f?,Al*°° ° RESUMEN Esta invención proporciona novedosos métodos para mejorar la calidad y rendim iento de la planta en la presencia de patógenos. El método au menta los niveles de proteínas relacionadas con la patogénesis, tales como PR1 , fenilalan ina amoníaco liasa o proteínas de paredes celulares de la planta, tales como, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, en una planta, al poner en contacto la planta con un inductor sistémico de planta y u na especie de oxígeno reactivo, en donde la cantidad de la especie de oxígeno reactivo es suficiente para incrementar la cantidad de la proteína relacionada con la patogénesis por encima del nivel inducido por el inductor sistém ico de planta en la ausencia de la especie de oxígeno reactivo. Una especie de oxígeno reactivo preferida es ácido peracético; un inductor sistém ico de planta preferido es ácido salicílico .