MXPA01004544A

MXPA01004544A - Metodo para mejorar la proliferacion de las celulas pilosas del oido interno utilizando ligandos para los receptores her2 y/o her3.

Info

Publication number: MXPA01004544A
Application number: MXPA01004544A
Authority: MX
Inventors: Wei-Qiang Gao
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-11-07
Filing date: 1999-10-28
Publication date: 2002-07-30
Also published as: CA2345899A1; AU1337400A; IL142684A0; WO2000027426A1; US20020081299A1; NZ511019A; AU764037B2; JP2002529425A; KR100627754B1; EP1126873A1; KR20010081104A

Abstract

Los ligandos que se enlazan a los receptores HER2 y/o HER3 son utiles como factores del crecimiento de las celulas de soporte del oido interno para mejorar la generacion mediada por la proliferacion de nuevas celulas pilosas.

Description

MÉTODO PARA MEJORAR LA PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS PILOSAS DEL OÍDO INTERNO UTILIZANDO LIGANDOS PARA LOS RECEPTORES HER2 Y/O HER3 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención Esta solicitud se refiere a la inducción, promoción o mejoramiento del crecimiento, proliferación, preparación, generación o regeneración del tejido del oido interno, particularmente las células pilosas epiteliales del oido interno y las células de soporte. Más particularmente, esta invención se refiere a la proliferación mediante estimulación potencial de las células de soporte y al mejoramiento de la generación mediada por la proliferación de nuevas células pilosas. Además, esta solicitud proporciona métodos, composiciones y dispositivos para el tratamiento profiláctico y terapéutico de las condiciones y padecimientos del oido interno, particularmente padecimientos del equilibrio y del oido sensorinoeural . Esta invención se refiere al uso de los ligandos HER2, en particular a los polipéptidos de heregulina, como factores del crecimiento de las células de soporte del oido interno. Antecedentes de la invención Los padecimientos del oido y del equilibrio son PEF: 128668 problemas serios que afectan a millones de personas. Los padecimientos del oido se pueden atribuir a una amplia variedad de causas, que incluyen infecciones, daño mecánico, sonidos fuertes, envejecimiento y a la ototoxicidad inducida por químicos que dañan las neuronas y/o las células pilosas del sistema auditivo periférico. El sistema auditivo periférico . consiste de receptores auditivos, células pilosas en el órgano de Corti y neuronas auditivas primarias principales, las neuronas de los ganglios espirales en la coplea. Las neuronas de los ganglios espirales ("SNG") son neuronas auditivas aferentes primarias que suministran señales desde los receptores auditivos periféricos, las células pilosas en el órgano de Corti, al cerebro a través del cerebro coclear. Los 8 nervios se conectan a las neuronas auditivas primarias en los ganglios espirales hacia la base del cerebro. Los 8 nervios también se conectan alas neuronas de los ganglios vestibulares ("VGN") , las cuales son neuronas sensoras o detectoras aferentes primarias responsables del equilibrio y que suministran señales desde el articulo, sáculo y ámpulas del oido interno responsable del oido interno hacia el cerebro, a la base del cerebro. La destrucción de las neuronas aferentes primarias en los ganglios espirales y las células pilosas se le ha atribuido como una causa principal de daños auditivos. El daño del sistema auditivo periférico es responsable de la mayoria de los déficit auditivos (Dublin, 1976; Ryba , 1986; Lim, 1986; Pryor, 1994) . La pérdida o el daño auditivo es un padecimiento frecuente en los mamíferos. El daño en cualquier lugar a lo largo de la via auditiva desde el canal auditivo externo hasta el sistema nervioso central puede dar como resultado una perdida del oido o un daño en el equilibrio. El aparato auditivo se puede dividir en el oido externo y medio, el oido interno y el nervio auditivo y las vias auditivas centrales. Mientras que se tienen algunas variaciones de especies a especie, la caracterización general es común en todos los mamífero. Los estímulos auditivos se trasmiten mecánicamente a través del canal auditivo externo, la membrana timpánica y la cadena oscicular al oído interno. El oído medio y el proceso mastoide normalmente están llenos con aire. Los padecimientos del oído externo y medio usualmente producen una perdida auditiva conductiva por la interferencia con esta transmisión mecánica. Las causas comunes de una perdida del oído conductiva incluye la obstrucción del canal auditivo externo, como puede ser causado por la atresia aural o cerumen; engrosamiento o perforación de la membrana timpánica, como puede ser causada por el trauma o infección; fijación o resorción de los componentes de la cadena ocicular; y obstrucción del tubo de Eustaquio, dando como resultado un espacio del oído medio lleno de fluido. La información auditiva es transducida desde una señal mecánica a un impulso eléctrico conducido neuralmente por la acción de las células neuropiteliales (células pilosas) y SGN en el oído interno. Todas las fibras centrales de la SGN forman la sinapsis en el núcleo coclear de la base del cerebro pontina. Las proyecciones auditivas desde el núcleo coclear son bilaterales, con núcleos principales colocados en el colículo inferior, cuerpo geniculado medio del tálamo y corteza auditiva del lóbulo temporal. El número de neuronas implicadas en la audición se incrementa dramáticamente desde la cóclea hasta la base del cerebro auditiva y la corteza auditiva. Toda la información auditiva es transducida por un número limitado de células pilosas, las cuales son receptoras sensoriales del oído interno, de las cuales las llamadas células pilosas internas, que tienen un número comparativamente poco, son críticamente importantes puesto que forman la sinapsis con aproximadamente el 90% de las neuronas auditivas primarias. En comparación, en el nivel del núcleo coclear, el número de elementos neurales implicados se mide en cientos de miles. Así, el daño a relativamente pocas células en la periferia auditiva puede llevar a una perdida sustancial del oído o a un daño en el equilibrio. De aquí, muchas causas de la perdida sensorinoeural se pueden deber a las lesiones en el oído interno. La perdida del oído y el daño en el equilibrio pueden ser progresivos. Además, la audición se vuelve significativamente menos aguda debido a los cambios en la anatomía del oído conforme el animal envejece. Durante la embriogénesis, los ganglios vestibulares, los ganglios espirales y la vesícula ótica se derivan del mismo ectodermo neurogénico, la placoda ótica. Los sistemas vestibulares y auditivos comparten así muchas características que incluyen las inervaciones neuronales periféricas de las células pilosas y las proyecciones centrales hacia los núcleos de la base del cerebro. Ambos sistemas son sensibles a las ototoxinas que incluyen fármacos terapéuticos, agentes antineoplásticos contaminantes en los alimentos o medicinas y contaminantes ambientales e industriales. Los fármacos ototóxicos incluyen el agente quimioterapéutico ampliamente utilizado cisplatina y sus análogos (Fleischman et al., 1975; Stadnicki et al;, 1975; Nakai et al., 1982; Berggren et al., 1990; Dublín, 1976; Hood and Berlín, 1986) , los antibióticos de aminoglicosido comúnmente utilizados, por ejemplo, gentamicina para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias gran-negativas, (Sera et al., 1987; Hinojosa y Lerner, 1987; Bareggi et al., 1990), la quinina y sus análogos, el salicilato y sus análogos y los diuréticos de circuito. Los efectos tóxicos de estos fármacos en las células auditivas y en las neuronas de los ganglios espirales a menudo son un factor limitante para su utilización terapéutica. Por ejemplo, los aminoglicósidos antibacterianos tales como las gentamicinas, estreptomicinas, canamicinas, tobramicinas y similares se conocen que tienen una seria ototoxicidad, particularmente ototoxicidad y nefrotoxicidad, lo cual reduce la utilidad de tales agentes antimicrobianos (ver Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, ßth ed., A. Goodman Gilman et al., eds; Macmillan Publishing Co., Inc., New York, pp. 1169-71 (1980) o la edición más reciente) . los Antibióticos de aminoglicósido por lo general se utilizan como antimicrobianos de amplio espectro efectivos contra, por ejemplo, bacterias gram positivas, gram negativas y rápidamente acidas. Los microorganismos susceptibles incluyen Escherichia spp., Hemophilus spp., Listeria spp., Pseudomonas spp., Nocardia spp., Yersinia spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Mycobacteria spp., Shigella spp., y Serratia spp. A pesar de esto, los aminoglicosidos se utilizan principalmente para tratar infecciones causadas por las bacterias gram negativas y, por ejemplo, en combinación con penicilinas para los efectos sinergísticos . Como está implicado por el nombre genérico de la familia, todos los antibióticos de aminoglicosidos contienen aminoazucares en el enlace glicosidico. La otitis media es un termino utilizado para describir las infecciones en el oído medio, las cuales infecciones son muy comunes, particularmente en niños. Típicamente los antibióticos se administran sistémicamente para las infecciones en el oído medio, por ejemplo, de una manera responsiva o profiláctica. La administración sistémica de antibióticos para combatir la infección en el oído medio por lo general da como resultado un tiempo de retraso prolongado para lograr los niveles terapéuticos en el oído medio y requiere altas dosis iniciales para lograr tales niveles. Estas desventajas complican la capacidad de obtener niveles terapéuticos y pueden eliminar el uso de algunos antibióticos igualmente.

La administración sistémica es mas a menudo efectiva cuando la infección ha alcanzado etapas avanzadas, pero en este punto ya se pudo haber hecho un daño permanente a la estructura del oído medio y oído interno. Claramente, la ototoxicidad es un efecto colateral limitante de la dosis de la administración de antibióticos. Por ejemplo, cerca del 75% de los pacientes a los que se les da 2 gramos de estreptomicina diariamente durante 60 a 120 días muestran algún daño vestibular, mientras que a un gramo por día, la incidencia disminuye al 25% (Patente Norteamericana 5,059,591) . Se observó un daño auditivo: de 4 a 15% de los pacientes que recibían un gramo por día durante más de una semana, los cuales desarrollaron una perdida auditiva medible, la cual lentamente se volvió peor y pudo llevar a una sordera permanente completa si el tratamiento continúa .

La ototoxicidad es también un efecto colateral limitante de la dosis, serio, para la cisplatina, un complejo de coordinación de platino, que ha probado ser efectivo en una variedad de cánceres humanos incluyendo el testicular, el de ovario, de la vejiga, de la cabeza y cáncer del cuello. La cisplatina daña los sistemas auditivos y vestibular (Fleischman et al., 1975; Stadniki et al., Nakai et al., 1982; Carenza et al., 1986; Sera et al., 1987, Bareggi et al., 1990). Los salicilatos, tales como la aspirina, son los fármacos terapéuticas más comúnmente utilizados debido a sus efectos anti-inflamatorios, analgésicos, antipiréticos y anti-tromboticos . Desafortunadamente, tienen efectos colaterales ototóxicos. A menudo conducen al tinitus ("campanilleo en los oídos") y a la perdida temporal de la audición (Myers y Bernstein, 1965) . Sin embargo, si el fármaco se utiliza en dosis altas durante un tiempo prolongado, el daño auditivo se vuelve persistente e irreversible, como se reportó clínicamente (Jarvis, 1966) . De conformidad con esto, existe una necesidad de medios para prevenir, reducir o tratar la incidencia y o severidad de los padecimientos del oído interno y el daño auditivo que implica el tejido del oído interno, particularmente las células pilosas del oído interno, y opcionalmente, los nervios auditivos asociados. De particular interés son aquellas condiciones que surgen de un efecto colateral no deseado de fármacos terapéuticos ototóxicos que incluyen las cisplatina y sus análogos, los antibióticos de aminoglicosidos, salicilatos y sus análogos o los diuréticos de circuito. Además, existe una necesidad de métodos que permitan una dosificación más alta y más efectiva por lo tanto, con estas drogas farmacéuticas que inducen la ototoxicidad, mientras que se prevenga o reduzca de manera concomitante los efectos ototóxicos provocados por estos fármacos. Lo que se necesita es un método que proporcione un medio seguro, efectivo y prolongado para el tratamiento profiláctico o curativo de los daños al oído relacionados con el daño al tejido dei oido interno, la perdida o regeneración, particularmente los daños inducidos por la ototoxina, y particularmente que involucre a las células pilosas del oído interno. La presente invención proporciona composiciones y métodos para lograr estos objetivos y otros también. Existe una necesidad continua para un método de tratamiento de los daños al oído y al equilibrio y a otras condiciones asociadas con los daños a las células pilosas o sus células de soporte. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En general un objeto de la invención es proporcionar un método para inducir, promover o mejorar el -crecimiento, proliferación, reparación o regeneración del tejido del oído interno, particularmente las células pilosas del oído interno y sus células de soporte con el propósito de promover la reparación y curación de los daños o padecimientos del tejido interno. De conformidad con esto, un objetivo de la invención es proporcionar un método para tratar los padecimientos y condiciones del oído interno en pacientes, principalmente pacientes humanos, en necesidad de tal tratamiento. Un objetivo adicional es proporcionar un método para inducir el crecimiento, generación y desarrollo de las células que apoyan o soportan el oído interno, lo cual lleva a la generación de nuevas células pilosas. Un aspecto de esta invención, se ha descubierto que estos objetivos y el objetivo más amplio para tratar las condiciones asociadas con el daño y los padecimientos de las células pilosas o las células que soportan el oído interno se logran administrando a un paciente en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un ligando de heregulina, preferiblemente un polipéptido o fragmento del mismo. Estos polipéptidos de heregulina, que incluyen HRG-a, HRG-ßl, HRG-ß2, HRG-ß3 y otros polipéptidos de heregulina, los cuales tienen una reacción cruzada con los anticuerpos dirigidos contra estos miembros de la familia y/o los cuales son substancialmente homólogos como se define más adelante y que incluye las variantes de heregulina tales como los fragmentos C-terminales y N-terminales del mismo.

Una heregulina preferida es el ligando descrito en la figura 1A-1D y designada además HRG-a. Otras heregulinas preferidas son los ligandos descritos en la figura 2A-2E, y designados HRG-ßl; descritos en la figura 3A-3E designados HRG-ß2; y descritos en la figura 4A-4C designados HRG-ß3. En otro aspecto, la invención proporciona un método en el cual los anticuerpos agonistas de heregulina se administran para lograr los objetivos de la invención. En esta modalidad, los HER2/HER3 o fragmentos de los mismos ( los cuales también se pueden sintetizar mediante métodos xn v±tro) se fusionan ( mediante expresión recombinante o un enlace de peptidilo ip vitro) a un polipéptido immunogénico y este polipéptido de fusión, a su vez, se utiliza para generar anticuerpos contra un epítope HER2/HER3. Los anticuerpos agonistas se recuperan del suero de los animales immunizados. Alternativamente, se preparan los anticuerpos monoclonales a partir de células ±xx v±tro o animales immunizados in vivo de una manera convencional. Si se desea, los anticuerpos agonistas se pueden obtener mediante una selección de muestra o despliegue del fago a partir de una biblioteca de fagos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos preferidos identificados mediante selección de rutina se enlazaran al receptor, pero no solamente reaccionaran de manera cruzada substancialmente con ningún otro ligando conocido tal como EGF, y activaran los receptores de HER, HER2 o HER3, preferiblemente HER2. Además se pueden seleccionar anticuerpos que sean capaces de enlazarse específicamente a los miembros individuales de la familia, de la familia de la heregulina, por ejemplo copiar el listado y los cuales son agonistas de la misma. En general, la invención es un método para regenerar y/o reparar células pilosas o el daño de células de soporte del oído interno mediante la estimulación del crecimiento y proliferación de las células que soportan el oído interno para mejorar la generación de nuevas células pilosas. Las células pilosas pueden ser dañadas por varios tipos de situaciones, por ejemplo el daño debido a la incisión quirúrgica o resección, la inhalación o aspiración de químicos o humo, la ulceración química o bioquímica, el daño celular debido a infecciones viales o bacterianas, etc. Las células que soportan el oído interno las cuales se pueden afectar por el método de la invención incluyen cualquier célula de soporte del oído interno los cuales expresan la HER2 o HER3, preferiblemente HER3. El método de la invención estimula el crecimiento y la proliferación de las células de soporte del oído interno que llevan a la generación de nuevas células pilosas para reparar y reestablecer los contactos sensorineurales en el oído interno para permitir que los tejidos afectados desarrollen funciones fisiológicas normales más rápidamente. En conformidad con esto, una modalidad de la invención es un método para inducir el crecimiento de las células que soportan el oído interno poniendo en contacto una célula que soporta el oído interno la cual exprese al receptor HER2 con una cantidad efectiva de un ligando de activación de HER2. Una modalidad adicional es un método para tratar el daño de las células pilosas del oído interno, provocado por ototoxinas o daño acústico por ejemplo, administrando un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando que activa el HER2. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A-1D muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No.l) para las secuencias de ADNc (SEQ ID No. 2) contenidas en un clon obtenido a partir de la Patente Norteamericana 5,367,060. La methionina de iniciación (Met) del HRG-a está en la posición 45. La figura 2A-2E muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No. 3) y la secuencia de ADNc (SEQ ID No. 4) de una secuencia de codificación potencial de un clon obtenido de acuerdo a la Patente Norteamericana 5,367,060 para la HRG-ßl. La Met de iniciación está en M31. La figura 3A-3E muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No. 5 ) y la secuencia de ADNc (SEQ ID No. 6) de una secuencia de nucleotidos con un clon obtenido a partir de la Patente Norteamericana 5,367,060 para HRG-ß2. La figura 4A-4C muestra la secuencia de aminoácidos deducida ( SEQ ID No. 7) y la secuencia de ADNc (SEQ ID No. 8) de una secuencia de nucleotidos de un clon obtenido a partir de la Patente Norteamericana 5,367,060 para HRG-ß3. La figura 5A-5D muestra la secuencia de aminoácidos deducida ( SEQ ID No. 9) y la secuencia de ADNc (SEQ ID No. 10) de una secuencia de nucleotidos de un clon obtenido a partir de la Patente Norteamericana 5,367,060 para la proteína similar a la HRG-ß2. La figura 6A-6C muestra una comparación de las homologías de aminoácidos de varias heregulinas conocidas a, ßl, ß2, y similar a ß2 y ß3 en orden descendente e ilustra las inserciones y sustituciones de aminoácidos que caracterizan éstas formas de heregulina (SEQ ID números: 1,3,5,9 y 7) . La figura 7A-7C muestra la secuencia de aminoácidos deducida ( SEQ ID No.11) y la secuencia de ADNc (SEQ ID No. 12) de -HRG. La región hidrofóbica esta subrayada. El dominio es similar a EGF esta sombreado, los residuos de cisteina en el dominio similar al EGF están dentro de un circulo. Los sitios de glicosilación enlazados al nitrógeno están marcados arriba de la secuencia de ácido nucleico con un () . La figura 8 muestra la secuencia de ADNc (SEQ ID No. 13) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 14) de la SMDF. Un dominio similar a EGF y los dominios apolares y no cargados (es decir "apolar I" que consiste en residuos aproximadamente 48-62 y "apolar II" que consiste de residuos de aproximadamente de 76-100) están subrayados. Las cisteínas en el dominio similar a EGF y en los "nudos de cisteína" en el dominio N-terminal único (nudo de NTD-cys) esta indicado en un cuadro. El codón de detención esta denotado por la letra "0". La figura 9 muestra el efecto de varios factores del crecimiento de polipéptidos sobre la proliferación de células en la capa de células pilosas laminares utriculares de ratas, como se indica por el número de células positivas BrdU por lámina comparada con el control. La figura 10 muestra el efecto de proliferación dependiente de la dosis de la heregulina en células en la capa de células pilosas de lámina utricular de rata, como se indica por el número de células positivas de BrdU por lámina comparada al control. La figura 11A-D muestra la autoradiografía de células etiquetadas con timidina y tritiadas en células de soporte y la capa de células pilosas en los utrículos tratados con gentamicina en respuesta al tratamiento con heregulina. Las figuras A-D son vistas de montajes completos utriculares de rata, organotípicos, tratados de manera similar. La figura 12 muestra el conteo de células de las células etiquetadas con timidina tritiadas en las células de soporte y la capa de células pilosas en utrículos tratados con gentamicina (mostrar unas figuras 11A-D) en respuesta al tratamiento con heregulina comparado con el control. La figura 13 muestra la concentración de ARN de heregulina y los receptores Her2, Her3 y Her4 en ARN aislado de la capa del epitelio sensorial del oído interno. La figura 14 muestra la localización de Her2, un receptor de heregulina, en el epitelio sensorial del oído interno, como se indica mediante el immunoteñido de la cóclea PO y el utrículo de adulto con el anticuerpo monocloneal etiquetado para Her2. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los ligandos de heregulina, en particular los polipéptidos y anticuerpos agonistas de los mismos, tienen afinidad para y estimulan la HER2 y menos preferiblemente la HER3, los receptores o combinaciones de las mismas en la autofosforilación. Incluidos dentro de la definición de ligandos de la heregulina, además de HRG-oc, HRG-ßl, HRG-ß2, HRG-ß3 y similares a HRG-ß2, están los otros polipéptidos que se enlazan al receptor HER2, los cuales tienen una homología de secuencia de aminoácidos substancial a las HRG-a o HRG-ßl. Tales polipéptidos adicionales caen dentro de la definición de heregulina como una familia de ligandos de polipéptidos que se enlazan a los receptores HER2. Los polipéptidos de heregulina se enlazan con afinidades variantes a los receptores variantes HER2. También se conoce que la heterodimerización de HER2 con HER3 ocurre con una fosforilación cruzada del receptor subsecuente como se describió arriba. En la presente invención, el crecimiento y/o proliferación de células de soporte del oído interno se induce cuando una proteína heregulina interactúa y se enlaza con una molécula receptora individual o un dímero receptor tal que el receptor induzca la fosforilación. El enlace y la activación HER2 ó Her3 o combinaciones de los mismos, por lo tanto pretende incluir la activación de cualquier forma de los receptores necesarios para la activación del receptor y la función biológica que incluye el receptor monomérico y las formas de receptor dimérico. Las formas del receptor dimérico pueden ser referidas en lo que sigue, por ejemplo, como HER2/HER3. La familia HER (ErbB) pertenece a la superfamilia de la tirosina cinasa del receptor subclase I y consiste de tres receptores distintos HER2, HER3, y HER4. Un ligando para esta familia ErbB es la proteína heregulina (HRG) , una proteína que contiene multidominio con al menos 15 distintas isoformas. La transducción de la señal que regula el crecimiento de las células y la diferenciación se regula en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosinas cinasas son enzimas que catalizan este proceso. Se cree que el receptor de las proteínas tirosinas cinasas dirige el crecimiento celular vía la fosforilación de la tirosina estimulada por el ligando de los substratos intracelulares. Las proteínas tirosinas cinasas del receptor del factor de crecimiento de la subfamilia de clase I incluyen el receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR) de 170 kDa codificada por el gen ßrbBl. El erJBl ha sido implicado causalmente en las malignidades humanas. En particular, la expresión incrementada de este gen se ha observado en carcinomas más agresivos del seno, vejiga, pulmón y estomago. El segundo miembro de esta subfamilia de la clase I, el pl85neu, se identificó originalmente como el producto del gen de transformación de los neuroblastomas de las ratas tratadas químicamente. El gen neu (también llamado erbB2 y HER2) codifica una proteína tirosina cinasa del receptor de 185 kDa. La amplificación y/o sobreexpresión del gen HER2 humano se correlaciona con una prognosis pobre en los canceres del seno y del ovario (Slamon et al . , Science 235:177-182 (1987); y Slamon et al . , Science 244:707-712 (1989)). La sobreexpresión del HER2 se ha correlacionado con otros carcinomas incluyendo los carcinomas del estomago, endometrio, glándulas salivales, pulmón, riñon, colón y vejiga. De conformidad con esto, Slamon et al . en la Patente Norteamericana No. 4,968,603 describe y reivindica varios ensayos de diagnósticos para determinar la amplificación o expresión del gen HER2 en las células tumorales. Slamon et al descubrió que la presencia de copias múltiples del gen del oncogen HER2 en las células tumorales indica que el padecimiento es más probable que se extienda más allá del sitio del tumor primario y que el padecimiento puede por lo tanto requerir un tratamiento más agresivo que de otra manera podría ser indicado por otros factores de diagnóstico. Slamon et al concluye que la prueba de amplificación del gen HER2, junto con la determinación del estatus de los nodos linfáticos, proporciona una utilidad de pronostico grandemente mejorada. Un gen adicional relacionado, llamado erbB3 o HER3, también ha sido descrito. Ver Patente Norteamericana No. 5,183,884; Kraus et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:9193-9197 (1989); Solic. De Pat. Europea No. 444,961A1; y Kraus et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 90:2900-2904 (1993). Kraus et al (1989) descubrió que los niveles elevadamente marcados del ARNm del erbB3, estaban presentes en ciertas líneas celulares de tumores mamarios de humanos indicando que el erbB3, como el erbBl y erbB2, pueden jugar un papel en las malignidades de humano. También, Kraus et al 1993 mostró que la activación dependiente de la EGF del dominio catalítico del ErbB3 de un receptor quimérico EGFR/ErbB3 resultó en una respuesta proliferativa en las células transfectadas NIH-3T3. Se cree ahora que este es el resultado del ErbBl o ErbB2 endógenos en NIH-3T3. Además, estos investigadores demostraron que algunas líneas celulares de tumores mamarios de humano muestran una elevación significativa de la fosforilación de la tirosina de ErbB3 en estado estable indicando adicionalmente que este receptor puede jugar un papel en las malignidades de humanos. El papel de ErbB3 en el cáncer se ha explorado por otros. Se ha encontrado que esta sobreexpresado en el cáncer del seno (Lemoine et al., Br. J. Cáncer 66:1116-1121 (1992)), gastrointestinal (Poller et al., J. Pathol. 168:275-280 (1992), Rajkumer et al., J. Pathol. 170:271-278 (1993), and Sanidas et al., Int. J. Cáncer 54:935-940 (1993)), y el pancreático (Lemoine et al., J. Pathol. 168:269-273 (1992), and Friess et al., Clinical Cáncer Research 1:1413-1420 (1995)). La subfamilia de la clase I de las proteínas tirosinas cinasas del receptor del factor de crecimiento se han extendido adicionalmente para incluir al receptor HER4/Erb4. Ver la solicitud de Patente Europea No. EP 599,274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature 366:473-475 (1993). Plowman et al encontraron que la expresión incrementada de HER4 estaba cercanamente correlacionada con ciertos carcinomas de origen epitelial, incluyendo los adenocarcinomas del seno. Los métodos de diagnóstico para la detección de las condiciones neoplásticas humanas (especialmente canceres del seno) las cuales evalúan la expresión de HER4 se describen en la solicitud de patente Europea No. 599,274. La búsqueda del activador del oncogen HER2 ha llevado al descubrimiento de una familia de polipéptidos de heregulina. Estas proteínas parecen resultar del empalme alternativo de un solo gen que se conforman en un mapa en el brazo corto del cromosoma 8 humano por Orr-Urtreger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1867-1871(1993). Ver también Lee y Wood, Genomics, 16:790-791(1993). Hol es et al, aislaron y clonaron una familia de activadores de polipéptidos para el receptor HER2 el cual llamaron heregulina-a (HRG-a) , heregulina-ßl (HRG-ßl), heregulina-ß2 (HRG-ß2) , similar a la heregulina-ß2 (similar a la HRG-ß2), y heregulina-ß3 (HRG-ß3) . Ver Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992); WO 92/20798; and U.S. Patent 5,367,060. El polipéptido de 45 kDa, HRG-a se purifico a partir de un medio condicionado de las líneas celulares del cáncer del seno humano MDA-MB-231. Estos investigadores demostraron la capacidad de los polipéptidos de heregulina purificados de activar la fosforilación de la tirosina del receptor HER2 en las células tumorales del seno MCF7. Además, la actividad mitogénica de los polipéptidos de la heregulina en las células SK-BR-3 (que expresa altos niveles del receptor HER2) fue ilustrado. Como otros factores del crecimiento que pertenecen a la familia EGF, los polipéptidos HRG solubles parecen estar derivados de un precursor enlazado a la membrana (llamado pro-HGR) el cual se procesa proteolíticamente para liberar la forma soluble de 45kDa. Estos pro-HRGs carecen de un péptido de señal N-terminal. Aunque las heregulinas son substancialmente idénticas en los primeros 213 residuos de aminoácidos, se clasifican en dos tipos principales, a y ß, en base a dos dominios similares a EGF, variantes, los cuales difieren en sus porciones de carbono terminales. Sin embargo, estos dominios similares a EGF son idénticos en el espaciamiento de 6 residuos de cisteína contenidos ahí. En base a una comparación de secuencia de aminoácidos, Holmes et al encontraron que entre la primera y la sexta cisteínas del dominio similar a EGF, las HRGs fueron 45 % similar al factor de crecimiento similar a EGF que se enlaza a la heparina (HB-EGF) , 35% idéntico a la anf irregulina (AR) , 32 % idéntico al TGF-a, y 27 % idéntico al EGF. El factor de diferenciación neu de 44 kDa (NDF) , el cual es el equivalente de la rata del HRG humano, fue descrito primero por Peles et al., Cell, 69:205-216 (1992); y Wen et al., Cell, 69:559-572(1992). Como los polipéptidos HRG, el NDF tiene un dominio de homología a la inmunoglobulina (Ig) seguido por un dominio similar a EGF y carece de un péptido de señal N-terminal. Subsecuentemente, Wen et al., Mol. Cell. Biol., 1 (3) : 1909-1919 (1994) realizó "una clonación exhaustiva" para extender la familia de NDFs. Este trabajo reveló 6 pro-NDFs f ibroblásticos distintos. Adoptando la nomenclatura de Holmes et al., los NDFs se clasifican ya sea como polipéptidos a o ß basados en la secuencias de los dominios similares a EGF. Las isoformas 1 a 4 están caracterizadas en base a la extensión de la justamembrana variable (entre 'el dominio similar a EGF y el dominio de transmembrana) . También, se describen las isoformas a, b y c las cuales tienen dominio citoplásmico de longitud variable. Estos investigadores concluyeron que las isoformas NDF diferentes están generadas por la división alternativa y realizan funciones especificas del tejido distintas. Ver también EP 505 148; WO 93/22424; y WO 94/28133 en relación a NDF. Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993). Describe otro miembro de la familia de la heregulina la cual llamaron el receptor de acetilcolina que induce la actividad del polipéptido (ARIA) . El polipéptido ARIA derivado del pollo estimula la síntesis de los receptores de acetilcolina de los músculos. Ver también WO 94/08007. ARIA es una heregulina tipo ß que carece de la región espadadora entera rica en sitios de glicosilación entre el dominio similar a la Ig y el dominio similar a la EGF del HRGa, y HRGßl-ß3. Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993) identificó varias proteínas derivadas del bovino que llamo factores del crecimiento gliales (GGFs) . Estos GGFs comparten el dominio similar Ig y el dominio similar EGF con las otras proteínas de heregulina descritas arriba, pero también tienen un dominio kringle amino terminal. Las GGFs generalmente no tienen la región espaciadora glicosilada completa entre el dominio similar a Ig y el dominio similar a EGF. Solamente uno de los GGFs, GGFII, posee un péptido de señal N-terminal. Ver también WO 92/18627; WO 94/00140; WO 94/04560; WO 94/26298; y WO 95/32724 los cuales se refieren a GGFs y a los usos de los mismos. Ho et al. in J. Biol.. chem. 270 (4) : 14523-14532 (1995) describe otro miembro de la familia heregulina llamado factor derivado de las neuronas motores y sensoriales ( SMDF) esta proteína tiene un dominio similar a EGF característico de todos los otros polipéptidos de heregulina pero un dominio N-terminal distinto. La diferencia estructural principal entre SMDF y los otros polipéptidos de heregulina es la carencia de SMDF del dominio similar a Ig y la característica separadora "glyco" de todos los otros polipéptidos de heregulina. otra característica del SMDF es la presencia de dos espaciamientos o extensiones de aminoácidos hidrofóbicos cerca del N-terminal. Aunque los polipéptidos de heregulina fueran primero identificados en base a su capacidad de activar el receptor HER2 ( Ver Holmes et al., supra) se descubrió que ciertas células del ovario expresan el neu y los fibroblastos transfectados con neu no se enlazaron o se recticularon al DNF, ni respondieron al DNF para sufrir o realizar la fosforilación de la tirosina (Peles et al., EMBO J. 12:961-971 (1993) ) . Esto indicó que otro componente celular fue necesario para conferir una capacidad de respuesta completa de la heregulina. Carraway et al subsecuentemente demostró que copiar el nombre se enlazo a los fibroblastos de NIH-3T3 establemente transfectado con un erbB3 de bovino pero no a las células originales no transfectadas. De conformidad con esto, concluye que el erB3 es un receptor para el HRG y media la fosforilación de los residuos intrínsicos de tirosina así como la fosforilación del receptor ErbB2 en las células que expresan ambos receptores. Carraway et al., J. Chem. 269 (19) : 14303-14306 (1994) . Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269 (20) : 14661-14665 (1994) se encontró que las células transfectadas con HER3 solo muestran bajas afinidades para la heregulina, mientras que las células transfectadas con ambos HER2 y HER3 muestran altas afinidades. Esta observación se correlaciona con en "receptor de cruzamiento" descrito previamente por Kokai et al., Cell 58:287-292 (1989); Stern et al., EMBO J. 7:995-1001 (1988); and King et al., 4:13-18 (1989). Estos investigadores encontraron que el enlace de EGF al EGFR resultó en la activación del dominio del EGFR cinasa y la fosforilación cruzada del pl85HER2. Esto se cree que es el resultado de la heterodimerización del receptor inducido por ligandos y la fosforilación cruzada concomitantes de los receptores dentro de lo heterodímero (Wada et al., Cell 61:1339-1347 (1990)). Plowman y sus colegas estudiaron similarmente la activación de pl85HER4/P185HERJ Expresaron pl85HER2 solo, pl85HER4 solo, o los dos receptores conjuntamente los linfocitos T humanos y demostraron que la heregulina es capas de estimular la fosforilación de la tirosina pl85HER4, pero no solamente estimular la fosforilación de pl85H R2 en las células que expresan ambos receptores. Plowman et al., Nature 336:473-475 (1993). El papel biológico de la heregulina ha sido investigado por varios grupos. Por ejemplo, Fall et al., (discutido arriba) encontraron que el ARIA juega un papel en la diferenciación de los miotubulos, es decir que afecta la síntesis y la concentración de los receptores de los neurotrasmisores en las células de los músculos postsinápticos de las neuronas motoras. Corfas y Fischbach demostraron que ARIA también incrementa también el numero de canales de sodio en los músculos de los pollos. Corfas y Fischbach, J. Neuroscience, 13 (5) : 2118-2125 (1993). También se ha demostrado que el GGFII es mitogénico para los mioblastos humanos quiescentes subconfluentes y que la diferenciación de los mioblastos humanos clónales en la presencia continua de GGFII da como resultado un gran número de miotubos después de seis días de diferenciación ( Sklar et al., J. Cell Biochem., Abst. W462, 18D, 540 (1994)). Ver también WO 94/26298 publicado el 24 de noviembre de 1994. Holmes et al., supra, encontraron que el HRG ejerció un efecto mitogénico sobre las líneas celulares de mamíferos (tales como SK-BR-3 Y mcf-7) la actividad mitogenica de GGFs en las células de Schwann también se ha reportado. Ver por ejemplo Brockers et al J. Biol. Chem. 255(18): 8374-8377 (1980); Lemke and Brokes, J. Neurosci. 4:75-83 (1984); Brockes et al., J. Neurocience 4 (1) : 75-83 (1984") ; Brokes et 'al., Ann. Neurol. 20 (3) : 317-322 (1986) ; Brokes, J., Methods in Enzim., 147:217-225(1987) y Marchionni et al., supra. Las células de Schwann constituyen las células gliales importantes que proporcionan el revestimiento de la mielina alrededor de los axonas de las neuronas, formando así fibras nerviosas individuales. Así, es aparente que las células de Schwann juegan un importante en el desarrollo, generación y regeneración de los nervios periféricos. Las implicaciones de esto a partir de un punto de vista terapéutico han sido estudiadas por Levi et al., Neurocience 14(3) : 1309- 1319(1994). Levi et al. discuten el potencial para la construcción de una prótesis celular que comprenda células de Shawnn humanas que se podrían transplantar hacia áreas de la espina dorsal dañadas. Los métodos para cultivar las células de Shwann ex vivo se han descrito. Ver WO 94/00140 y Li et al., J. Neurocience 16 (6) : 2012-2019 (1996) . Pinkas-Kramarski et al. encontraron que NDF parece ser expresado en las neuronas y las células gliales en cerebros de ratas embriónicas y adultas y los cultivos primarios de las células de cerebro de rata, y sugirieron que puede actuar como un factor de sobrevivencia y maduración para los astrositos (Pinkas-Kramarski et al., PNAS, USA 91:9387-9391(1994)). Meyer y Birchmeier, PNAS, USA 91:1064-1068(1994) analizaron la expresión de la heregulina durante la embriogénesis del ratón y el animal perinatal utilizando hibridación in situ y los experimentos de protección RNasa. Ver también Meyer et al., Development 124 (18) :3575-3586 (1997) . Estos autores concluyen que, en base en la expresión de esta molécula, la heregulina juega un papel in vivo como un factor mesinquimal y neuronal. De manera similar, Danilenko et al., Abstract 3101, FASEB 8(4-5) :A535 (1994); Danilenko et al., Journal of Clinical Investigation 95(2): 842-851(1995), encontraron que la interacción de NDF y el receptor HER2 es importante en dirigir la migración y la diferenciación epidérmica durante la reparación de las heridas. Ram et al . , Journal of Cellular Physiology 163:589-596 (1995) evaluó la actividad mitogénica de NDF sobre la línea celular epitelial de mamíferos humanos, inmortalizada MCF-10A. Danilenko et al . , J. Clin . Invest . 95:842-851 (1995) investiga sí el NDF influiría sobre la migración epidérmica en un modelo in vivo en reparar las heridas de espesor parcial, profundas, excisionales. Se reporta que no hubo diferencias significativas estadísticamente en la proliferación de queratinocitos superbasales y básales en control de las heridas contra las heridas tratadas con rhNDF-a2. Marikovsky et al . , Oncogene 10:1403-1411 (1995), estudia las respuestas proliferativas de una línea celular de queratinocitos continuos BALB/MK aneuploides y evaluaron los efectos de las isoformas a y ß del NDF sobre los queratinocitos epidérmicos. La relación entre la estructura y función de las nuevas proteínas se puede investigar utilizando cualquiera de una variedad de las técnicas de análisis mutacionales disponibles. Los ejemplos de tales técnicas incluyen la mutagénesis por exploración de alanina y la muestra o despliegue de fagémido. La exploración de alanina se puede identificar para utilizar los residuos activos (es decir, que tiene un efecto significativo sobre la función de la proteína) en una proteína o dominio de proteína. Por ejemplo, Cunningham y Wells utilizaron la exploración con alanina para identificar los residuos en la hormona del crecimiento humana que fueron importantes para enlazar su receptor. Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989).

En la exploración de alanina, un gen que codifica la proteína o el dominio que se va a explorar se inserta en un vector de expresión, y la mutagénesis se lleva a cabo para generar una serie de vectores que codifican las proteínas o dominios en las cuales los residuos secuenciales se convierten a alanina. Las proteínas o dominios codificados se expresan en estos vectores, y las actividades de las variantes substituidas de alanina se prueban entonces para identificar aquéllas con actividad alterada. Una alteración en la actividad indica que el residuo en la posición substituida con alanina es un residuo activo. La muestra o el despliegue del fagémido se desarrolló para permitir la selección de un gran número de polipéptidos variantes para una actividad de enlace particular. Smith y Parmley demostraron que los péptidos extraños se pueden "desplegar" eficientemente sobre la superficie de fagos filamentosos insertando fragmentos cortos de gen en el gen III del fago fd. Smith, Science 228:1315-1317 (1985); Parmley y Smith, Gene 73:305-318 (1985). La proteína de revestimiento del gen III está presente en aproximadamente cinco copias en un extremo de la partícula del fago. El fago modificado se llamó "fago de fusión" debido a que mostró los péptidos extraños fusionados a la proteína de revestimiento del gen III. Como cada partícula del fago de fusión mostró aproximadamente cinco copias de la proteína de fusión, este modo de despliegue del fago se llamó "despliegue polivalente". Scott et al . , y Cwirla et al . , mostraron que las bibliotecas del fago de fusión se podrían seleccionar por selecciones de afinidad secuencia conocidas como "tribado". Scott et al . , Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al . , PNAS USA 87:6378-6382 (1990). Sin embargo, los esfuerzos anteriores para seleccionar el fago de fusión de alta afinidad fallaron, presumiblemente debido a la polivalencia de las partículas del fago. Este problema se resolvió con el desarrollo de un sistema de despliegue de fago "monovalente" en el cual la proteína de fusión se expresó a un nivel bajo a partir de un fagémido y un fago ayudante proporciona un gran exceso de la proteína de revestimiento de tipo nativo. Bass et al . , Proteins 8:309-314 (1990); Lowman et al . , Biochem . 30:10832-10838 (1991). El despliegue del fago monovalente se puede utilizar para generar y seleccionar un gran número de polipéptidos variantes para aislar aquéllos que se enlazan con gran afinidad a un objetivo de interés. I . Definiciones En general, las siguientes palabras o frases tienen el definición indicada cuando se utilizan en la siguiente descripción, ejemplos, y reivindicaciones. El ligando "heregulina" se define aquí para ser cualquier ligando aislado, preferiblemente una secuencia de polipéptidos que posee una propiedad biológica de un polipéptido de heregulina que se presenta de manera natural que se enlaza y activa al Her2. Los ligandos dentro del alcance de la invención incluyen los polipéptidos de heregulina descritos con detalle aquí. La heregulina incluye los polipéptidos mostrados en las Figuras 1A-1D, 2A-2E, 3A-3E, 4A-4C, 5A-5D, 6A-6C y 7A-7C y los análogos de mamíferos de los mismos. Las variantes se pueden preparar mediante los métodos descritos anteriormente, opcionalmente junto con exploración de alanina y técnicas de despliegue del fago conocidos en el arte. Cunningham y Wells, Science 244:1081-85 (1989); Bass et al., Proteins 8:309-14 (J 990 ) ; Lowman et al., Biochem. 30:10832-38 (1991). El término una célula pilosa "normal" o célula de soporte del oído interno significa una célula pilosa o célula de soporte del oído interno, la cual no está transformada, es decir, es no cancerosa y/o no inmortalizada. Además, la células pilosas normales o las' células de soporte del oído interno son preferiblemente no aneuploides. La aneuploida existe cuando el núcleo de una célula no contiene un múltiple exacto del número haploide de cromosomas, uno o más cromosomas están presentes en mayor o menor número que el resto. Las propiedades típicas de las células transformadas que caen fuera del alcance de esta invención incluyen la capacidad de formar los tumores cuando se implantan en el ratón con inmunidad deprimida (ratones desnudos) , la capacidad de crecer en suspensión o en un medio semi-sólido tal como agar, una pérdida de la inhibición del contacto que permite el apilamiento de células en colonias o focos, una pérdida de la dependencia de los factores de crecimiento o suero, la muerte celular si las células tienen un crecimiento inhibido, y la desorganización de filamentos de actina. Especialmente incluidas dentro de la invención están las células normales que no formarán tumores en ratones, que crecen unidas al plástico o al vidrio (son dependientes del anclaje), que muestran una inhibición del contacto, que requieren las hormonas que contienen suero y factores del crecimiento, que permanecen viables si el crecimiento se detiene mediante la carencia del suero, y que contienen filamentos de actina bien organizados. Aunque las células que soportan el oído interno, normales, son preferiblemente células no cultivadas, también adecuadas para la invención son las células epiteliales no inmortalizadas, no trasformadas, aisladas del tejido de mamíferos. Estas células aisladas pueden estar cultivadas para varias generaciones (hasta aproximadamente 10 o aún 50 generaciones) en la presencia de una heregulina para inducir el crecimiento y/o la proliferación de la muestra de células de soporte del oído interno, esto es, para expandir la muestra. La muestra expandida puede se puede reintroducir entonces en el mamífero con el propósito de repoblar los tejidos de células pilosas o de células que soportan el oído interno (re-epitelialización) . Esto es particularmente útil para reparar el daño al tejido. La "propiedad biológica" para los propósitos de aquí significan una función biológica o antigénica in vivo o la actividad que se . realiza directa o indirectamente por una secuencia de heregulina (cuando está en su conformación nativa o desnaturalizada) , o mediante cualquier subsecuencia de la misma. Las funciones biológicas incluyen el enlace del receptor, cualquier actividad de la enzima o la actividad modulatoria de la enzima, cualquier actividad de enlace del portador, cualquier actividad hormonal, cualquier actividad en la promoción e inhibición de la adhesión de las células para la matriz extracelular o moléculas de superficie celular, o cualquier papel estructural. Sin embargo, las funciones biológicas no incluyen funciones antigénicas, es decir, la posesión de un epítope o el sitio antigénico que sea capaz de reaccionar de manera cruzada con anticuerpos generados contra un polipéptido de heregulina que se presenta de manera natural. La heregulina "biológicamente activa" se define aquí como un polipéptido que comparte una función biológica de una secuencia de heregulina la cual puede (pero no necesariamente) además poseer una función antigénica. Un efecto conocido principal o función de la heregulina es como un polipéptido de ligando que tiene una actividad biológica de enlace al HER2 que (resulta en la activación del receptor tirosina cinasa (un "ligando de activación") . Una prueba para los ligandos de activación es el ensayo de autofosforilación de la tirosina de heregulina descrito anteriormente. Incluido dentro del alcance de la heregulina o el ámbito de la heregulina como ese término se utiliza aquí están las secuencia de aminoácidos maduras traducidas de la heregulina humana completa como se establece aquí; los derivados desglicosilados o no glicosilados de la heregulina, las variantes de la secuencia de aminoácidos y los derivados de heregulina, los cuales son capaces de mostrar una propiedad biológica en común con la heregulina. Mientras que la heregulina nativa es un polipéptido enlazado a la membrana, las formas solubles, tales como aquellas formas que carecen de un dominio de transmembrana funcional, están incluidos dentro de esta definición. En particular, están incluidos los fragmentos de polipéptidos de la secuencia de heregulina que tiene un N-terminal en cualquier residuo de aproximadamente S216 hasta aproximadamente A227, y su C-terminal en cualquier residuo de aproximadamente K268 hasta aproximadamente R286, y las secuencias homologas mostradas en la Fig. 6A-C, de aquí en adelante referidos colectivamente para todas las heregulinas como el dominio del factor de crecimiento (GFD) . La heregulina "antigénicamente activa" se define como un polipéptido que posee una función antigénica de una heregulina y que puede (pero no necesariamente) además poseer una función biológica. En las modalidades preferidas, la heregulina antigénicamente activa es un polipéptido que se enlaza con una afinidad de al menos aproximadamente 10~9 I/moles para un anticuerpo generado contra una secuencia de heregulina que se presenta de manera natural. De manera ordinaria el polipéptido se enlaza con una afinidad de al menos aproximadamente 10"8 I/moles. Más preferiblemente, la heregulina activa antigénicamente es un polipéptido que se enlaza a un anticuerpo generado contra una de las heregulinas en su conformación nativa. La heregulina en su conformación nativa en general es una heregulina que se encuentra en la naturaleza la cual no se ha desnaturalizado mediante agentes caotrópicos, calor u otro tratamiento que modifique substancialmente la estructura tridimensional de heregulina como se determina, por ejemplo, mediante la migración en no reducir, los geles de clasificación de tamaño no desnaturalizantes. El anticuerpo utilizado en esta determinación puede ser un anticuerpo policlonal de conejo generado mediante la formulación de la heregulina nativa de una especie que no es de conejo en el adyuvante completo de Freund, inyectando subcutáneamente la formulación, y activando la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta que el título de anticuerpos anti-heregulina se mantenga constante. De manera ordinaria, la heregulina activa biológica o antigénicamente tendrá una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una identidad de secuencia de aminoácidos al 75% con una secuencia de heregulina dada, más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95%. La identidad u homología con respecto a una secuencia de heregulina se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que es idéntica con los residuos de heregulina en la heregulina de la Fig. 6A-6C, después de alinear las secuencias e introducir los intervalos, si es necesario, para lograr el porcentaje de homología máximo, y no considerar cualquier substitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, eliminaciones, o inserciones internas o C-terminales, dentro de la secuencia de heregulina serán construida para que afectan la homología. Así, los polipéptidos de heregulina biológicamente activos y antigénicamente activos son los sujetos de esta invención incluyendo cada uno la secuencia de heregulina; los fragmentos de los mismos que tienen una secuencia consecutiva de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30 ó 40 residuos de aminoácidos a partir de la secuencia de heregulina; las variantes de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de heregulina en donde el residuo de aminoácidos ha sido insertados N- o C-terminales a, o dentro, de la secuencia de heregulina o su fragmento como se definió arriba; las variantes de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de heregulina o su fragmento como se definió arriba han sido substituidos por otro residuo, los polipéptidos de heregulina incluyen aquéllos que contienen las mutaciones predeterminadas mediante, por ejemplo, la mutagénesis PCR o dirigida al sitio, y otras especies animales de polipéptidos de heregulina tales como heregulina de conejos, ratas, porcinos, primates no humanos, equinos, murinos, y alelos u otras variantes que se presentan de manera natural de lo anterior y de las secuencias humanas; los derivados de heregulina o sus fragmentos como se definieron anteriormente en donde la heregulina o sus fragmentos han sido modificados covalentemente mediante la substitución, medios químicos, enzimáticos, u otros medios apropiados con una porción diferente de un aminoácidos que se presenta de manera natural (por ejemplo una porción detectable tal como una enzima o radioisótopo) ; las variantes de glicosilación de la heregulina (inserción de un sitio de glicosilación o eliminación de cualquier sitio de glicosilación mediante la eliminación, inserción o substitución de aminoácidos apropiados) ; y las formas solubles de heregulina, tales como HRG-GFD o aquéllos que carecen de un dominio de transmembrana funcional.

"Aislado" significa un ligando, tal como una heregulina, el cual ha sido identificado y separado y/o recuperado de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con el diagnóstico o usos terapéuticos para la heregulina, y puede incluir proteínas, hormonas, y otras substancias. En las modalidades preferidas, la heregulina estará purificada (1) mayor que el 95% por peso de la proteína como se determina por el método de Lowry u otro método de determinación de la proteína validada y más preferiblemente más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso del mejor secuenciador de aminoácidos comercialmente disponible, que se encuentra en el marcado en la fecha de presentación de la misma, ó (-3) hasta obtener homogeneidad mediante SDS-PAGE utilizando teñido con azul de Coomassie o, preferiblemente, de plata. La heregulina aislada incluye la heregulina in situ dentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del medio ambiente natural de heregulina no estará presente. La heregulina aislada incluye la heregulina de una especie en un cultivo de células recombinantes de otra especie de heregulina en tales circunstancias carecerá de los polipéptidos de la fuente. De manera ordinaria, sin embargo, la heregulina aislada se preparará mediante l menos una etapa de purificación. De conformidad con esta invención, el ácido nucleico de heregulina es el ARN o ADN que contienen más de diez bases que codifica una heregulina biológica o antigénicamente activa, es complementaria a la secuencia de ácido nucleico que codifica tal heregulina, o hibridiza a la secuencia de ácido nucleico que codifica tal heregulina y permanece enlazada establemente a la misma bajo condiciones severas . Preferiblemente, el ácido nucleico de la heregulina codifica un polipéptido que comparte al menos 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente 95%, con una secuencia de heregulina. Preferiblemente, el ácido nucleico de la heregulina que se hibridiza contiene al menos 20, más preferiblemente al menos aproximadamente 40, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90 bases. El ácido nucleico de heregulina aislado incluye un ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un ácido nucleico contaminante con el cual está ordinariamente asociado en la fuente natural del ácido nucleico de heregulina. El ácido nucleico de heregulina aislado está presente en otra forma diferente de aquélla establecida la cual se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, el ácido nucleico que codifica la heregulina, aislado, incluye el ácido nucleico de heregulina en células que expresan ordinariamente la heregulina donde el ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de aquélla de las células naturales o de otra manera está flanqueada por una secuencia de ADN diferente de aquélla encontrada en la naturaleza. El ácido nucleico que codifica la heregulina puede ser utilizado en los ensayos de hibridización específicos, particularmente aquellas porciones de la secuencia de codificación de la heregulina que no se hibridizan con otras secuencias de ADN conocidas. Las "condiciones severas" son aquéllas que (1) emplean baja concentración iónica y altas temperaturas par lavar, por ejemplo, NACÍ 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/NaDodS04 al 1% a 50°C; (2) el empleo durante la hibridación de un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero de bovino al 0.1%, Ficoll al 0.1%, polivinilpirrolidina al 0.1%, amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplear formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0.15, y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en SSC 0.2x y SDS al 0.1%. El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operablemente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de enlace al ribosoma, y posiblemente, otros como secuencias que no se han podido entender. Se conoce que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y mejoradores. El ácido nucleico está "enlazado operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o guía secretoria se enlaza operablemente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace al ribosoma se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si se coloca de manera que facilite la traducción. De manera general, "operablemente enlazada" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas y, en el caso de una guía secretoria, están contiguas y en una fase de lectura. Sin embargo los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se complementa mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, entonces los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o enlazadores son utilizados de acuerdo con la práctica convencional . Un elemento "exógeno" se define aquí para indicar la secuencia de ácido nucleico que es extraña a la célula, u homologa a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedera en la cual no se ordinariamente el elemento. Como se utiliza aquí, la expresión "célula", "línea celular", y "cultivo celular", son utilizados intercambiablemente, y todas de tales designaciones incluyen la progenie. Así, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objetivo principal y cultivos derivados de las mismas sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberada o inadvertidas. Está incluida la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se selecciona en la célula transformada original. Será claro del contexto donde están indicadas las distintas designaciones. Los "plásmidos" están designados por una "p" minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de inicio de la presente están disponibles comercialmente, están disponibles al público en una base no restringida, o se pueden construir de tales plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Además, se conocen otros plásmidos equivalentes en la técnica y será aparente para alguien con habilidades en la técnica. La "digestión de la enzima de restricción" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima que actúa solamente en ciertas localizaciones en el ADN. Tales enzimas son llamadas endonucleasas de restricción, y los sitios para los cuales cada una es específica se llama un sitio de restricción. Las diversas enzimas de restricción utilizadas aquí están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, se utilizan cofactores, y otros requerimientos según se establezca por los proveedores de la enzima. Las enzimas de restricción comúnmente están designadas por abreviaciones compuestas de una letra mayúscula seguida por otras letras que representan el microorganismo del cual se obtuvo cada enzima de restricción originalmente, y luego un número que designe la enzima particular. En general, aproximadamente 1 mg del plásmido o fragmentos de ADN se utiliza con aproximadamente 1-2 unidades de enzima en aproximadamente 20 mL de una solución amortiguadora. Los amortiguadores apropiados y las cantidades del substrato para las enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. La incubación de aproximadamente 1 hora a 37 °C se utiliza ordinariamente, pero puede variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la incubación, la proteína o polipéptido se remueve por extracción con fenol y cloroformo, se recupera y el ácido nucleico digerido de la fracción acuosa mediante la precipitación con etanol. La digestión con una enzima de restricción puede ser seguida con la hidrólisis de la fosfatasa alcalina bacteriana de los fosfatos 5' terminales para evitar que dos extremos escindidos de restricción de un fragmento de ADN "circularicen" o formen un ciclo o lazo cerrado que podría impedir la inserción' de otro fragmento de ADN en el sitio de restricción. A menos que se establezca de otra forma, la digestión de plásmidos no es seguida por la desfosforilación 5' terminal. Los procedimientos y reactivos para la desfosforilación son convencionales como se describe en las secciones 1.56-1.61 de Sambrook et al . , (Molecular Cloning: A Labora tory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . La "recuperación" o "aislamiento" de un fragmento dado de ADN de un producto de digestión de restricción significa la separación del producto de digestión sobre la poliacrilamida o gel de agarosa mediante electrofóresis, la identificación del fragmento de interés mediante la comparación de su movilidad contra aquélla de los fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, la eliminación de la sección del gel que contiene el fragmento deseado, y la separación del gel del ADN. Este procedimiento es conocido general. Por ejemplo, ver Lawn et al . , Nucleic Acids Res . 9:6103-6114 (1981), y Goeddel et al . , Nucleic Acids Res . 8:4057 1980). El "análisis Northern" es un método utilizado para identificar las secuencias de ARN que hibridizan con una sonda conocida tal como un oligonucleótido, el fragmento de ADN, el ADNc o fragmento del mismo, o fragmento de ARN. Las sondas se etiquetan con un radioisótopo tal como 32P, o mediante biotinilación, o con una enzima. El ARN a ser analizado se separa usualmente electroforéticamente sobre agarosa o gel de poliacrilamida, se transfiere a la nitrocelulosa, nailon, u otra membrana adecuada, y se hibridiza con la sonda, utilizando las técnicas estándar bien conocidas en el arte tal como aquéllas descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al . , supra . La "ligación" se refiere al proceso de formar enlaces de fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico. Para ligar los fragmentos de ADN conjuntamente, los extremos de los fragmentos de ADN deben ser compatibles entre sí. En algunos casos, los extremos serán directamente compatibles después de la digestión con endonucleasa. Sin embargo, puede ser necesario primero convertir los extremos de manera escalonada después de la digestión con endonucleasa hacia los extremos romos para hacerlos compatibles para la ligación. Para hacer romos los extremos, el ADN se trata en un amortiguador adecuado durante al menos 15 minutos a 15 °C con aproximadamente 10 unidades del fragmento de Klenow del a polimerasa I de ADN o la polimerasa de ADN T4 en la presencia de cuatro trifosfatos de desoxiribonucleótido. Entonces se purifica el ADN mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Los fragmentos de ADN que se van a ligar conjuntamente se ponen en una solución en aproximadamente cantidades equimolares. La solución también contendrá ATP, amortiguador de ligasa, y una ligasa tal como ligasa de ADN T4 a aproximadamente 10 unidades por 0.5 mg de ADN. Si el ADN va a ser ligado en un vector, el vector primero se lineariza mediante la digestión con la(s) endonucleasa (s) de restricción apropiadas. El fragmento linearizado se trata entonces con fosfatasa alcalina bacteriana, o de ternera para evitar la auto-ligación durante la etapa de ligación. La "preparación" del ADN de las células significa aislar el plásmido de ADN a partir de un cultivo de las células hospederas. Los métodos comúnmente utilizados para la preparación del ADN son las preparaciones de plásmidos a gran escala y pequeña escala, descritos en las secciones 1.25-1.33 de Sambrook et al . , supra . Después de la preparación del ADN, se puede purificar mediante métodos bien conocidos en la técnica tales como aquéllos descritos en la sección 1.40 de Sambrook et al . , supra .

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucléotidos de doble hebra o de una sola hebra, de longitud completa, que se sintetizan químicamente mediante métodos conocidos (tales como química fosfotriéster, fosfito, o fósforamidita, utilizando técnicas de fase sólida tales como las descrita en EP 266,032, publicada el 4 de mayo de 1988, o vía los intermediarios H-fosfonato de desoxinucleótido como se describe por Froehler et al . , Nucí . Acids Res . 14:5399-5407, 1986. Se purifican sobre geles de poliacrilamida. La técnica de "reacción en cadena de la polimerasa", o "PCR" como se utiliza aquí en general se refiere a un procedimiento en donde pequeñas cantidades de una pieza específica del ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe en la Patente Norteamericana No. 4,683,195, expedida el 28 de Julio de 1987. En general, la información de la secuencia a partir de los extremos de la región de interés o más allá, necesita estar disponible, tales cebadores de oligonucleótidos se pueden diseñar, estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las hebras opuestas de las plantillas o patrones a ser amplificados. Los nucléotidos de la terminal 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede utilizar para amplificar las secuencias de ARN, las secuencias de ADN específicas a partir del ADN genómico y el ADNc transcrito del ARN celular, total, bacteriófagos o secuencias de plásmidos, etc. Ver en general Mulls et al . , Cold Spring Harbor Symp . Quan t . Biol . 51:283 (1987); Erich, ed., PCR Technology, (Stocklon Press, NY, 1989) . Como se utiliza aquí, la PCR se considera que es una, pero no la única, el ejemplo de un método de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra prueba del ácido nucleico, que comprende el uso de un ácido nucleico conocido (ADN o ARN) como un cebador, y utiliza una polimerasa de ácido nucleico para generar o amplificar una pieza específica del ácido nucleico o para generar o amplificar una pieza específica del ácido nucleico que es complementaria a un ácido nucleico particular. El "ensayo de autofosforilación de tirosina de heregulina para detectar la presencia o bioactividad de los ligandos de heregulina se puede utilizar para monitorear la purificación de un ligando para los receptores HER2. Este ensayo se basa en la suposición de que un ligando específico para el receptor estimulará la autofosforilación del receptor, en analogía con el EGF y su estimulación de la autofosforilación del receptor EGF. Ver Sadich et al . , Anal .

Biochem . 235:207214 (1996). Las células MDA-MB-453 o las células MCF7 que contienen altos niveles de los receptores, pero niveles mínimos de los receptores EGF humanos, se obtuvieron de la Colección del Cultivo Tipo Americano, Rockville, Md. (ATCC No. HTB-131) y se mantuvieron en el cultivo de tejido con suero de ternera fetal al 10% en el medio DMEM/Hams F12 (1:1). Para el ensayo, las células se tripsinizaron y se colocaron a 150,000 células/pozo en placas de 26 pozos (Costar) . Después de la incubación con suero que contiene el medio durante la noche, las células se colocaron en un medio libre de suero durante 2-18 horas antes del ensayo. Las muestras de prueba de 100 alícuotas de 100 uL se agregaron a cada pozo. Las células se incubaron durante 5-30 minutos (típicamente 30 min.) a 37°C y se removió el medio. Las células en cada pozo se trataron con 100 uL de amortiguador de gel de SDS desnaturalizante (SEPROSOL, Enpotech, Inc.) y las placas se calentaron a 100°C durante 5 minutos para disolver las células y desnaturalizar las proteínas. Las alícuotas de cada pozo se sometieron a electrofóresis en geles de SDS con un gradiente del 5-20% (NOVEX, Encinitas, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de que la parte frontal del tinte la parte inferior del gel, se terminó la electrofóresis y se colocó una hoja de la membrana PVDF (PROBLOTT, ABl) en el gel y las proteínas se transfirieron desde el gel hacia la membrana en una cámara de transferencia o manchado (BioRad) a 200 mAmps durante 30-60 min. Después del manchado o trasferencia, las membranas se incubaron con solución salina amortiguada con TRIS que contiene amortiguador de detergente TWEEN 20 al 0.1% con BSA al 5% durante 2-18 horas para bloquear el enlace no específico, y luego se trató con un anticuerpo de anti-fosfotirosina de ratón (Upstate Biological Inc., N.Y.). Subsecuentemente, las manchas de la membrana se tratan con el anticuerpo de anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. Los geles se desarrollaron utilizando el Sistema PROTOBLOT de Promega. Después de secar las membranas, la densidad de las bandas que corresponden a pl85HER2 en cada carril de muestra con un Explorador SCANJET Plus de Hewlett Packard unido a una computadora Macintosh. El número de receptores por célula en las células MDA-MB-453 es tal que bajo estas condiciones experimentales la proteína del receptor pl85HER2 es la proteína principal que es etiquetada.

La "microsecuenciación de la proteínas" se complementó en base a los procedimientos siguientes. Las proteínas de la etapa final de HPLC ya sea se secuenciaron directamente por una degradación automatizada de Edman con un secuenciador de fase gaseosa de Applied Biosystems modelo 470A equipado con un analizador de aminoácidos 120A PTH o se secuenciaron después de la digestión con varios agentes químicos o enzimas. Los aminoácidos PTH se integraron utilizando el sistema de datos CHROMPERFECT (Justice Innovations, Palo Alto, CA) . La interpretación de secuencias se realizó en un equipo de computadora de Digital Equipment Corporation VAX 11/785 como se describió (Henzel et al . , J. Chroma tography 404:41-52 (1987)). En algunos casos, las alícuotas de las fracciones de HPLC se sometieron a electrofóresis en geles de poliacrilamida SDS al 5-20% se electrofóresis, se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (PROBLOTT, ABl, Foster City, CA) y se mancharon con Azul Brillante Coomassie (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987). La proteína específica se escindió de la mancha para la secuenciación del N-terminal. Para determinar las secuencias internas de la proteína, se secaron las fracciones de HPLC bajo vacío (SPEEDVAC) , se resuspendieron en amortiguadores apropiados, y se digirieron con bromuro de cianógeno, la enzima Lys-C específica de lisina (Wako Chemicals, Richmond, VA) o Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind. ) . Después de la digestión, los péptidos resultantes se secuenciaron como una mezcla o se resolvieron mediante HPLC sobre una columna C4 desarrollada con el gradiente de propanol en la TFA al 0.1% antes de la secuenciación Como se describió anteriormente. Los "anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras los anticuerpos exhiben especificidad del enlace a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares al anticuerpo que carecen de especificidad a los antígenos. Los polipéptidos de la última clase son, por ejemplo, producidos a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles incrementados por los mielomas . La digestión de la papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de enlace a los antígenos, idénticos, cada uno con un solo sitio de enlace al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyos nombres reflejan su capacidad de cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación del antígeno y es aún capaz de formar un antígeno con reticulación. El "Fv" es el fragmento del anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace o reconocimiento del antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente, hermética. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace del antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confiere el enlace del antígeno específicamente al anticuerpo. Sin embargo, aunque un solo dominio de variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de enlace completo. v El fragmento Fab también contiene el dominio constante del dominio de constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. También se incluyen los fragmentos Fab que tienen la adición de pocos residuos del carboxilo terminal del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. El Fab'-SH es la designación aquí para el Fab' en el cual los residuos de cisteína de los dominios constantes mantienen un grupo tiol libre. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de los fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulaciones entre ellas. También son conocidos otros acoplamientos químicos de los fragmentos del anticuerpo. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se puede asignar a uno o dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (?) , en base a la secuencia de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, a las inmunoglobulinas se les pueden asignar diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. El término "anticuerpo" se usa aquí en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos de manera que muestren la actividad biológica deseada. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, en general el enlace al antígeno o dominio variable del mismo. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena; y los anticuerpos multiespecíficos formados de los fragmentos de anticuerpos . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneo, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se presentan de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra determinantes diferentes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como cuando es obtenido a partir de una población homogénea de anticuerpos, y no está construido como requiriendo producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden hacer mediante el método de híbridoma descrito primero por Kohier et al . , Na ture 256:495 (1975), o se pueden hacer mediante los métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar a partir de las bibliotecas de anticuerpos del fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al . , Na ture 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), como referencia. Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las cuales una porción de cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homólogo a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivadas de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica con un homólogo para las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otras clases o subclases de anticuerpo, así como los fragmentos de tales anticuerpos, que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567, y Morrison et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 81:6854-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en los cuales los residuos de la región hipervariable del recipiente se reemplazan por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, ratón, conejo o primate no humano que tiene la especificidad deseada, afinidad y capacidad. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos correspondiente no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos no se encuentran en el anticuerpo del recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios de variable en los cuales todos o substancialmente todos del as regiones hipervariables corresponde a aquéllos de inmunoglobulina no humana y todos o substancialmente todos de los FRs son aquéllas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente aquélla de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al . , Na ture 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992). Los fragmentos de anticuerpo de "Fv de una sola cadena" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. En general, el polipéptido Fv además comprende un enlazador del polipéptido entre los dominios VH y VL lo cual permite al sFv formar la estructura deseada para el enlace del antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace al antígeno, los cuales fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena del polipéptido (VH - VL) . Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se forzan a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 90:6444-6448 (1993) . La expresión "anticuerpos lineales" cuando se utiliza a través de esta solicitud, se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al . Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995). De manera breve, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CHX) que forman un par de regiones de enlace al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos . II. USO Y PREPARACIÓN DE LAS SECUENCIAS DE Heregulina H. PREPARACIÓN DE LAS SECUENCIAS DE Heregulina, QUE INCLUYEN VARIANTES El sistema que se va a emplear para preparar la secuencia de heregulina dependerá de la secuencia de heregulina particular seleccionada. Si la secuencia es suficientemente pequeña, la heregulina se puede preparar mediante los métodos sintéticos del polipéptido in vi tro. Más comúnmente, sin embargo, la heregulina se preparará en sistemas de cultivo recombinantes utilizando los sistemas de hospedero-vector descritos anteriormente. La heregulina adecuada incluye cualquier heregulina activa biológicamente y activa antigenéticamente. En general, las células hospederas de mamíferos podrán ser empleadas, y tales hospederos pueden o no contener los sistemas post-traduccionales para procesar las preprosecuencias de heregulina de una manera normal. Si la célula hospedera contiene tales sistemas entonces será posible recuperar los fragmentos del subdominio natural de los cultivos. Si no, entonces se puede realizar el procesamiento adecuado transformando los hospederos con la(s) enzima (s) requerida (s) o suministrándolos en un método in vi tro . Sin embargo, no es necesario transformar las células con los genes estructurales o prepro completos para la heregulina seleccionada cuando se desee para producir solamente los fragmentos de las secuencias de heregulina. Por ejemplo, un codon de inicio está ligado al extremo 5' del ADN que codifica un HRG-GFD, este ADN se utiliza para transformar las células hospederas y el producto expresado directamente como la forma Met N-terminal (si se desea, el Met extraño se puede remover in vi tro o mediante las desmetionilasas N-termínales endógenas) . Alternativamente, el HRG-GFD se expresa como una fusión con una secuencia de señal reconocida por la células hospederas, la cual procesará y secretará el HRG-GFD maduro como se describe más adelante. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de las secuencias nativas de HRG-GFD se producen de la misma manera . Las secuencias de heregulina localizadas entre el primer residuo maduro N-terminal y el primer residuo N-terminal de la secuencia HRG-GFD, llamado HRG-NTD, puede funcionar al menos en parte como una secuencia de señal no convencional o .como un portador/precursor que circula normalmente para el HRG-GFD que tiene una sola actividad biológica. El HRG-NTD se produce de la misma manera que la molécula de longitud completa pero de la expresión del ADN en el cual un codon de detención se localiza en el C-terminal de HRG-NTD. Además, las variantes de heregulina se expresan a partir del ADN que codifica la proteína en el cual tanto los dominios GFD como NTD están en su orientación apropiada pero que contienen una inserción, eliminación o substitución de aminoácidos en el sitio de escisión GFD-NTD (localizado dentro de la secuencia VKC) que inhibe o previene la escisión proteolítica del NTD-GFD que se une al sitio in vivo, y en donde un codon de detención está colocado en un extremo 3' de la secuencia de codificación GFD. En un ejemplo de este grupo de variantes (llamado HRG-NTDXGFD) , (1) el residuo de lisina encontrado en la secuencia de unión de NTD-GFD del VKC se elimina o (preferiblemente) se substituye por otro residuo diferente del arginilo tal como histidilo, alanilo, treonilo o serilo y (2) un codon de detención se introduce en la secuencia RCT o RCQ en lugar de cisteinilo, o treonilo (para HRG-a) o glutamilo (para HRG-ß) . Un ligando HRG-a preferido con la afinidad de enlace para pl85HER2 comprende los aminoácidos 226-265 de la figura 1A-D. Este ligando HRG-a además comprende hasta 1-20 aminoácidos adicionales que preceden al aminoácido 226 y 1-20 aminoácidos que siguen después del aminoácido 265. Un ligando HRG-ß preferido con la afinidad de enlace para pl85HR2 comprende los aminoácidos 226-65 de la figura 2A-E. Este ligando HRG-ß además comprende hasta 1-20 aminoácidos adicionales que preceden al aminoácido 226 y 1-20 aminoácidos que siguen después del aminoácido 265. Como se notó arriba, otras secuencias de heregulina que se van a preparar de acuerdo con esta invención son aquéllas del GFD. Estas se sintetizan in vi tro o se producen en cultivos celulares recombinantes. Estas se producen de la manera menos cara en levaduras o en E. Coli mediante la secreción bajo el control de una señal heteróloga de la heregulina como se describe más adelante, aunque la preparación en células de mamíferos también está contemplada utilizando una señal de la proteína de mamíferos tal como la tPA, UK o una proteína viral secretada. El GFD puede ser la secuencia de una heregulina nativa o puede ser una variante de la misma como se describe más adelante. Las secuencias de GFD incluyen aquéllas en donde uno o más residuos de un miembro de la familia EGF están substituidos en o dentro de la secuencia de GFD. Una heregulina adicional es una que contiene el GFD y la secuencia entre el C-terminal del GFD y el N-terminal del dominio de transmembrana (el último se llama el dominio C-terminal de escisión o CTC) . En esta variante (HRG-GFD-CTC) el codon de iniciación del ADN está presente en el extremo 5' de la secuencia de señal heteróloga de la heregulina o adyacente al extremo 5' de la región que codifica al GFD, y un codon de detención se encuentra en lugar de uno del primero de aproximadamente 1 a 3 residuos del dominio extra-celular (ECD) o el primero de aproximadamente 1-2 residuos de la región de transmembrana. Además, en algunas variantes de HRG-GFD-CTC los codones se modifican en el sitio de proteólisis de GFD-CTC mediante substitución, inserción o eliminación. El sitio de la proteólisis GFD-CTC es el dominio que contiene el residuo C-terminal de GFD y aproximadamente 5 residuos C-terminales y 5 residuos N-terminales de este residuo. Es conocido que el HRG-a-GFD del Val-229 terminal y Met-227 terminal son activos biológicamente. El C-terminal para el HRG-a-GFD puede ser Met-227, Lys-228, Val-229, Gln-230, Asn-231 ó Gln-232, y para HRG-ß-GFD puede ser Met-226, Ala-227, Ser-228, Phe-229, Trp-230, o Lys231/Ser231. El C-terminal se determina fácilmente mediante una secuenciación C-terminal, aunque no es crítico que el HRG-GFD tenga el termino nativo en tanto que la secuencia GFD posea la actividad deseada. En algunas modalidades de las variantes HRG-GFD-CTC, el (los) cambio (s) en el CTC se seleccionan por su capacidad de resistir la proteólisis in vitro e inhiben la proteasa responsable de la generación de HRG-GFD.

Las variantes de HRG-ECD se hacen proporcionando un codon de detención en la misma localización que para las variantes HRG-GFD-CTC. El HRG-ECD puede comprender cualquiera de uno o más de las variantes descritas arriba en conexión con sus subfragmentos, por ejemplo, las variantes GFD-CTC que contiene las modificaciones del sitio de la proteólisis CTC. Si se desea preparar los polipéptidos de heregulina más largos y los extremos 5' ó 3' de la heregulina dados no se describen aquí, puede ser necesario preparar los ácidos nucleicos en los cuales los dominios faltantes se suministran mediante regiones homologas de más ácidos nucleicos de heregulina completos. Alternativamente, los dominios faltantes se pueden obtener mediante bibliotecas formadoras de sondas utilizando los ADN descritos en las Figuras o fragmentos de las mismas. A. Aislamiento del ADN que codifica la Heregulina El ADN que codifica la heregulina se puede obtener mediante cualquier biblioteca de ADNc que se prepara a partir del tejido que se cree posee el ARNm de la heregulina y expresarlo a un nivel detectable. El gen HRG-a puede así obtenerse a partir de una biblioteca genómica. Los procedimientos similares se pueden utilizar para el aislamiento de otra heregulina, tales como los genes que codifican HRG-ßl, HRG-ß2 ó HRG-ß3. Las bibliotecas se seleccionan con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. Las bibliotecas para la expresión del ADNc, las sondas adecuadas incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen y se enlazan específicamente al HRG-a; los oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases de longitud que codifican porciones conocidas o que se supone que están relacionadas al ADNc del HRG-a de la misma o de diferente especie; y/o ADNc complementarios u homólogos o fragmentos de los mismos que codifican el mismo o un gen similar. Las sondas apropiadas para la selección de las bibliotecas de ADN genómico, pero no está limitado a, oligonucleótidos; ADNcs o fragmentos del mismo que codifican al mismo o un gen similar; y/o ADNs genómicos homólogos o fragmentos del mismo. La selección del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede conducir utilizando procedimientos estándar como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook et al . , supra . Un medio alternativo para aislar el gen que codifica la HRG-a utiliza la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describió en la sección 14 de Sambrook et al . , supra . Este método requiere el uso de sondas de oligonucleótidos que hibridizan al HRG-a. Las estrategias para la selección de oligonucleótidos se describen abajo. Otro método alternativo para obtener el gen de interés es sintetizarlo químicamente utilizando uno de los métodos descritos en Engels et al . (Agnew. Chem . In t . Ed. Engl . 28: 716-734, 1989), incorporado específicamente para referencia. Estos métodos incluyen los métodos del triéster, fosfito, fosforamidita y H-Fosfonato, PCR y otros métodos autocebadores, y la síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos. Estos métodos se pueden utilizar si la secuencia de ácido nucleico completa del gen es conocida, o la secuencia del ácido nucleico complementaria a la hebra codificante está- disponible, o alternativamente, si la secuencia del aminoácido objetivo es conocida, alguien puede inferir las secuencias del ácido nucleico potencial utilizando los residuos de codificación conocidos y preferidos para cada residuo de aminoácido. Un método preferido para practicar esta invención es utilizar cuidadosamente las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas para seleccionar las bibliotecas de ADNc a partir de varios tejidos, preferiblemente líneas celulares del seno, colon, glándulas salivales, de placenta, fetales, del cerebro, y carcinoma, humanos. Otras fuentes biológicas del ADN que codifica un ligando similar a la heregulina incluye otros mamíferos y aves. Entre los mamíferos preferidos están los miembros de los siguientes ordenes: bovino, ovino, equino, murino, y roedores. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberán ser de longitud suficiente y lo suficientemente no ambiguas para que se minimicen los positivos falsos. La(s) secuencia (s) de nucleótidos reales pueden, por ejemplo, estar basadas en secuencias de nucleótidos altamente homólogos o regiones de HRG-a. Los oligonucleótidos se pueden degenerar en una o más posiciones. El uso de oligonucleótidos degenerados puede ser de particular importancia en donde una biblioteca se selecciona de una especie en la cual el uso de un codon preferencial en el que la especie no es conocida. El oligonucleótido debe estar etiquetado de tal manera que el mismo se puede eliminar luego de la hibridización al ADN en la biblioteca que está siendo seleccionada. El método preferido de etiquetado es utilizar ATP etiquetado con 32P con cinasa de polinucleótido, como es bien conocido en la técnica, para etiquetar el oligonucleótido. Sin embargo, se pueden utilizar otros métodos para etiquetar el oligonucleótido, incluyen, pero no limitado a, la biotinilación o etiquetado con enzimas. De particular interés es el ácido nucleico de HRG-a que codifica un polipéptido de longitud completa. En algunas modalidades preferida, la secuencia de ácido nucleico incluye la secuencia de señal del HRG-a nativa. El ácido nucleico que tiene toda la secuencia de codificación de la proteína se obtiene seleccionando el ADNc selecto o las bibliotecas genómicas, y, si es necesario, utilizando procedimientos de extensión del cebador convencional como se describe en la sección 7.79 de Sambrook et al . , supra , para detectar oros precursores y procesar los intermediarios del ARNm que puede no haberse transcritos de manera inversa en el ADNc. El HRG-a que codifica el ADN de las Figuras 1A-1D se puede utilizar para aislar el AND que codifica los ligandos análogos de otras especies animales vía la hibridización empleando los métodos descritos anteriormente. Los animales preferidos son mamíferos, particularmente bovinos, ovinos, equinos, felinos, caninos y roedores, y más específicamente ratas, ratones y conejos.

El fragmento HRG-ßl 177-244 del dominio similar al EGF se amplificó del vector pHL89 (el cual se describe en Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992)) mediante PCR con los cebadores que tienen las salientes que contienen Nsil/Xbal. El fragmento se insertó dentro del vector de despliegue del fagémido pam-g3 mediante la ligación por restricción en los mismos sitios para generar el constructo pHRG2-g3 (177-244) . El pam-g3 fue un derivado de phGHam-g3, el cual se designa para el despliegue del fago de la hormona del crecimiento humana (hGH) y se describe en Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991). El pam-g3 se produce removiendo el gen hGH presente en el phGHam-g3 y reemplazando este gen con un fragmento rellenador, que proporciona espacio para la escisión en los sitios de restricción para la clonación. El fragmento HRG-ßl se une al residuo 247 de pIII. El dominio similar a EGF de HRG-ßl expresado desde el constructo descrito arriba se diseñó eliminando la "p" y la "-g3" que aparecen en el nombre del constructo. Así, el dominio similar a EGF de HRG-ßl expresado del constructo phGH2-g3 está designado "HRG2". El dominio se desplegó monovalentemente sobre el fago como una proteína de fusión pIII, como se describe por Bass et al . , Proteins 8:309-314 (1990) . De manera similar, las variantes HRG-ßl?7-227, HRG-ßl?47_24 , y HRG-ßl?77-227 se prepararon y expresaron como se describió arriba. B. Variantes de la Secuencia de Aminoácidos de la Heregulina Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la heregulina se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de heregulina, o mediante síntesis in vitro del polipéptido de heregulina in vi tro . Tales variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones desde, o inserciones o substituciones de, los residuos dentro de la secuencia de aminoácidos mostrada para las secuencias de heregulina. Cualquier combinación de eliminación, inserción y substitución se puede hacer para llegar al constructo final, con la condición de que el constructo final posea las características deseadas. Se excluyen del alcance de esta invención las variantes de heregulina o las secuencias de polipéptidos que no son novedosas y no obvias sobre la técnica previa. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del HRG-a, tal como el cambio en el número o posición de los sitios de glicosilación, la alteración las características de anclaje de la membrana, la alteración la localización intra-celular mediante la inserción, eliminación, o que de otra manera afecte la secuencia guía de la heregulina nativa, o modificando su susceptibilidad a la escisión proteolítica. La secuencia de heregulina se puede procesar proteolíticamente para crear un número de fragmentos de heregulina. Las secuencias de HRG-GFD de la HRG-a todas contienen la secuencia de aminoácidos entre la cisteína 226 y la cisteína 265 de la HRG-a. El amino terminal del fragmento HRG-a puede resultar de la escisión de cualquier enlace de péptido entre la alanina 1 y la cisteína 226, preferiblemente adyacente para una arginina, lisina, valina, o metionina, y más preferiblemente entre la metionina 45 y la serina 46. El carboxi terminal del fragmento HRG-a puede dar como resultado la escisión de cualquier péptido entre la cisteína 265, preferiblemente adyacente para una arginina, lisina, valina, o metionina, y más preferiblemente entre la lisina 272 y la valina 273, entre la lisina 278 y la alanina 279, o entre la lisina 285 y arginina 286. Los ligandos HRG-a resultantes que resultan de tal proceso proteolítico son los ligandos preferidos. El HRG-ß-GFD son análogos de aquéllos discutidos arriba para HRG-a-GFD. Cada HRG-ß-GFD contiene el segmento del polipéptido desde la cisteína 212 a la cisteína 251 de la figura 2A-E. El amino terminal del fragmento HRG-ß puede resultar de la escisión de cualquier enlace de péptido entre la alanina 1 y la cisteína 212, preferiblemente adyacente para una arginina, lisina, valina, o metionina, y más preferiblemente entre la metionina 31 y la serina 32. El carboxi terminal del fragmento HRG-a puede resultar de la escisión de cualquier péptido entre la cisteína 251 de la Figura 2A-2E, preferiblemente adyacente a una arginina, lisina, valina, o metionina, y más preferiblemente entre la valina 255 y la metionina 256, entre la lisina 261 y la histidina 262, entre la lisina 276 y la alanina 277, o entre la lisina 301 y la trionina 302. Los ligandos HRG-ßl resultantes que resultan de tal proceso proteolítico son los ligandos preferidos. De manera similar, el proceso para producir los ligandos del fragmento preferido de HRG-ß2 en base a la Fig. 3A-3E y el HRG-ß3 se basa en la Fig. 4A-4C se pueden complementar mediante las secuencias de escisión de la heregulina de las Figs. 3A-3E y 4A-4C preferiblemente adyacente a una arginina, lisina, valina o metionina. En el diseño de las variantes de la secuencia de aminoácidos de la heregulina, la localización del sitio y la naturaleza de la mutación dependerá de las características de la heregulina que va a ser modificada. Los sitios para la mutación se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo, (1) substituyendo primero con elecciones de aminoácidos conservativos y luego con más selecciones radicales que dependen de los resultados obtenidos, (2) eliminando el residuo objetivo, o (3) insertando los residuos de otros ligandos receptores adyacentes al sitio localizado. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido de heregulina que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se llaman "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Wells ( Science, 244: 1081-1085, 1989). Aquí, un residuo o grupo de los residuos objetivo están identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido cargado negativamente o neutro (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el medio ambiente acuoso de los alrededores o fuera de la célula. Aquellos dominios que demuestran la sensibilidad funcional para las substituciones se refinan entonces mediante la introducción adicional u otras variantes en o para los sitios de substitución. Así, mientras que el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos, la naturaleza de la mutación per se no va a ser predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, la exploración de alanina (ala) o mutagénesis aleatoria se puede conducir en el codon o región objetivo y las variantes de heregulina expresadas se seleccionan para la combinación óptima de la actividad deseada. Estas son dos variables principales en la construcción de las variantes de secuencia de aminoácidos: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Estas son variantes de la secuencia de heregulina y pueden representar alelos que se presentan de manera natural (que no requerirán manipulación del ADN de la heregulina) o formas mutantes predeterminadas hechas mediante la mutación de ADN, ya sea para llegar a un alelo o a una variante no encontrada en la naturaleza. En general, la localización y naturaleza de la mutación elegida dependerá de la característica de heregulina que se van a modificar. De manera obvia, tales variaciones que, por ejemplo, convierten la heregulina en un ligando del receptor conocido, no están incluidas dentro del alcance de esta invención, ni lo están en ninguna otra variante de heregulina o secuencias de polipéptidos que no sean novedosas y no obvias sobre la técnica anterior. Las eliminaciones de la secuencia de aminoácidos por lo general varían desde aproximadamente 1 hasta 30 residuos, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 residuos, y típicamente de aproximadamente 1 a 5 son contiguos. Las eliminaciones se pueden introducir dentro de las regiones de baja homología con otros precursores de la familia EGF para modificar la actividad de la heregulina. Las eliminaciones de la heregulina en áreas de homología substancial con otras secuencias de la familia EGF serán más probables de modificar la actividad biológica de la heregulina más significativamente. El número de eliminaciones consecutivas se seleccionará para preservar la estructura de la heregulina en el dominio afectado, por ejemplo, reticulación de cisteína, hélice alfa o lámina beta-plisada, Las inserciones de la secuencia de aminoácidos incluyen las fusiones amino- y/o carboxi terminales que varían en la longitud de un residuo hasta polipéptidos que contienen un ciento o más residuos, así como las inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Las inserciones de intrasecuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia de heregulina) pueden variar -por lo general desde aproximadamente 1 hasta 10 residuos, más preferiblemente 1 a 5, y más preferiblemente 1 a 3. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen heregulina con un residuo de metionilo N-terminal (un artefacto de la expresión directa de la heregulina en el cultivo celular recombinante bacteriano) , y la fusión de una secuencia de señal N-terminal heteróloga al N-terminal de la heregulina para facilitar la secreción de heregulina madura a partir de células hospederas recombinantes. Tales secuencias de señal en general se obtendrán de, y así serán homologas a, las especies de células hospederas pretendidas.- Las secuencias adecuadas incluyen STII, tPA ó Ipp para E. Coli, el factor alfa para la levadura, y las señales virales tales como herpes gD para las células de mamíferos. Otras variantes insercionales de la heregulina incluyen la fusión del N- o C-terminal de la heregulina de un polipéptido inmunogénico, por ejemplo, polipéptidos "" bacterianos tales como beta-lactamasa o una enzima codificada por el lugar trp de E. coli o proteína de levadura, albúmina de suero de bovino, y polipéptidos quimiotácticos . Las fusiones en el C-terminal de la heregulina-ECD con las proteínas que tienen una vida media larga tales como las regiones constantes de inmunoglobulina (u otras regiones de inmunoglobulina) , albúmina, o ferritina, como se describe en WO 89/02922, publicada el 6 de Abril de 1989 están contempladas. Otro grupo de variantes son las variantes de substitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de heregulina eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de substitución incluyen los sitios identificados como el (los) sitio (s) activo (s) de la heregulina, y los sitios en donde los aminoácidos encontrados en los ligandos de heregulina de varias especies son substancialmente diferentes en términos del volumen de la cadena lateral, la carga, y/o la hibrofobicidad. Un sub-dominio probable del HRG-GFD que tienen actividad biológica como un factor de crecimiento es el segmento C-terminal, en particular dentro de la secuencia de aproximadamente desde glicina 218 a valina 226 (HRG-a) , y glicina 218 hasta lisina 228/serina 228 (HRG-ß) en base a la analogía de la sub-secuencia EGF encontrada que tiene la actividad EGF. Otros sitios de interés son aquéllos en los cuales los residuos particulares de varias especies son idénticos.

Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica de la heregulina. Estos sitios, especialmente aquéllos que caen dentro de al menos tres de otros sitios idénticamente conservados, son substituidos de una manera relativamente conservativa , Tales substituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabeza de "substituciones preferidas". Si tales substituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces los cambios más substanciales, denominadas substituciones ejemplares en la Tabla 1, o como se describen adicionalmente abajo en referencia a las clases de aminoácidos, se introducen y los productos se seleccionan.

TABLA 1 Residuo Substituciones Substituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg He (I) leu; val; met; ala; phe; leu norleucina norleucina; ile; val; met; ile ala; phe Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; leu norleucina Las modificaciones substanciales en la función o identidad inmunológica de la heregulina se complementan mediante la selección de substituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura principal de la estructura del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hibrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el tamaño de la cadena lateral. Los residuos que se presentan de manera natural se dividen en grupos en base a las propiedades de la cadena lateral común. 1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; 2) hidrofílicos neutrales: cys, ser, thr; 3) acídicos: asp, glu; 4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; 5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro; y 6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las substituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro. Tales residuos substituidos se pueden introducir en las regiones de la heregulina que son homologas con otros ligandos receptores, o, más preferiblemente, dentro de regiones no homologas de la molécula. En una modalidad de la invención, es deseable inactivar uno o más sitios de escisión de la proteasa que estén presentes en la molécula. Estos sitios se identifican mediante inspección de la secuencia de aminoácidos codificada. Donde los sitios de escisión de la proteasa, se pueden volver inactivos con respecto a la escisión proteolítica mediante la substitución del residuo objetivo con otro residuo, preferiblemente, un residuo básico tal como glutamina o un residuo hidrofílico tal como serina; eliminando el residuo; o insertando un residuo de prolilo inmediatamente después del residuo.

En otra modalidad, cualquier residuo de metionilo diferente del residuo de metionilo de inicio de la secuencia de señal, o cualquier residuo localizado dentro de aproximadamente tres residuos N- o C-terminales a cada uno de los residuos de metionilo, se substituye por otro residuo (preferiblemente de acuerdo con la Tabla 1) o se elimina. Alternativamente, se insertan aproximadamente 1-3 residuos adyacentes a tales sitios. Cualquier residuo de cisteína no involucrado en mantener la conformación adecuada de la heregulina también se puede substituir, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. Los sitios particularmente adecuados para las substituciones, eliminaciones o inserciones, o su uso como fragmentos, incluyen, numerados del N-terminal de HRG-a de la Figura 1A-1D: 1) los sitios de adición del glicosaminoglicano potenciales en los dipéptidos de serina-glicina en 42-43, 64-65, 151-152; 2) la glicosilación enlazada a la asparagina potencial en las posiciones 164, 170, 208 y 437, los sitios (NDS) 164-166, (NIT) 170-172, (NTS) 208-210, y NTS (609-611); 3) la O-glicosilación potencial en un amontonamiento de serina y treonina en 209-218; 4) la cisteínas a 226, 234, 240, 254, 256 y 265; 5) el dominio de transmembrana en 287-309; 6) bucle o circuito 1 delineado por las cisteínas 226 y 240; 7) bucle o circuito 2 delineado por las cisteínas 234 y 254; 8) bucle o circuito 3 delineado por las cisteínas 256 y 265; 9) sitios de procesamiento de la proteasa, potenciales, en 2-3, 8-9, 23-24, 33-34, 36-37, 45-46, 48-49, 62-63, 66-67, 86-87, 110-111, 123-124, 134-135, 142-143, 272-273, 278-279 y 285-286; Las regiones análogas en la HRG-ßl se pueden determinar por referencia a su secuencia. Los aminoácidos de HRG-ßl análogos se pueden mutar o modificar como se discutió arriba para HRG-a. Las regiones análogas de HRG-ß2 se pueden determinar mediante referencia a su secuencia. Los aminoácidos de HRG-ß2 análogos se pueden mutar o modificar como se discutió arriba para HRG-a ó HRG-ßl. Las regiones análogas en HRG-ß3 se pueden determinar mediante referencia a su secuencia. Además, los aminoácidos HRG-ß3 análogos se pueden mutar o modificar como se discutió arriba para HRG-a, HRG-ßl, o HRG-ß2. Otra variante de heregulina es la gamma-heregulina, ?-HRG es cualquier secuencia de polipéptidos que posea al menos una propiedad biológica de la ?-HRG de secuencia nativa que tiene la SEC. ID NO: 11. La propiedad biológica de esta variante es la misma como para la heregulina observada anteriormente. Esta variante engloba no solamente el polipéptido aislado de una fuente de ?-HRG nativa tal como las células MDA-MB-175 humanas o de otra fuente, tal como otra especie animal, sino también el polipéptido preparado por los métodos recombinantes o sintéticos. También incluye las formas variantes que incluyen los derivados funcionales, las variantes alélicas, las isoformas que se presentan de manera natural y análogos de las mismas. Algunas veces la ?-HRG es la "?-HRG nativa" que se refiere al polipéptido de ?-HRG endógeno que ha sido aislado a partir de un mamífero. La ?-HRG también puede ser una "?-HRG de secuencia nativa" en tanto que tenga la misma secuencia de aminoácidos como una ?- HRG nativa (por ejemplo, ?-HRG humana mostradas en la Fig. 7A-7C) . Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la secuencia nativa se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de secuencia nativa, o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Tales variantes incluyen, por ejemplo, las eliminaciones de, o, inserciones o substituidos de, residuos dentro de la secuencia de aminoácidos mostrada para la proteína humana en la Fig. 7A-7C como se describen de manera general arriba para otra heregulina. Cualquier combinación de eliminación, inserción, y substitución se hace para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de los aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales de la secuencia nativa, tal que el cambio de número o posición de los sitios de glicosilación enlazados al oxígeno. Las variantes adicionales incluyen los polipéptidos en los cuales la variante tiene una substitución de aminoácidos en un residuo seleccionado que corresponde a un residuo de heregülina-ßl humana de 645 aminoácidos, nativa, seleccionada de: S177, H178, L179, V180, K181, E184, E186, K187, T188, V191, N192, G193, G194, E195, M198, V199, K200, D201, N204, P205, S206, R207, Y208, L209, K211, P213, N214, E215, T217, G218, D219, Q222, N223, Y224, S228, y F229. En una variación de esta modalidad, la substitución de aminoácidos no es un reemplazo del residuo seleccionado con un residuo del factor de crecimiento epidérmico (EGF) que corresponde al residuo seleccionado. Otras variantes de la heregulina-ßl incluye una substitución de aminoácidos seleccionada de: S177W; H178S, E, R, o A; V180Q, I o E; K181P o A; A183G, E184V, W, K, R, G, o N; K185, S, Q, o G; E186R; K187E o A; T188Q E195Q; F197Y; M198R o K; K200R; D201T o I; P205T o Y; S206K, H, G, P, o R; R207Y; Y208R o L; L209M o G; K211R; P213S, T, N, o K; N214L, K S, o E; F216M; N223H o W; y M226I. En una variación de esta modalidad, la variante de heregulina incluye conjuntos de substituciones de aminoácidos seleccionados de este grupo. Además de incluir una o más de las substituciones de aminoácidos descrita aquí, la variante de heregulina puede tener una o más modificaciones, tales como una substitución de aminoácidos, una inserción de al menos un aminoácido, una eliminación de al menos un aminoácido, o una modificación química. Por ejemplo, la invención proporciona una variante heregulina que es un fragmento. En una variación de esta modalidad, el fragmento incluye los residuos que corresponden a una porción de la heregulina-ßl que se extiende desde aproximadamente el residuo 175 hasta aproximadamente el residuo 320 (es decir el dominio similar al EGF) . Por ejemplo, el fragmento se puede extender desde el residuo 177 hasta el residuo 244 y se puede preparar mediante técnicas recombinantes (rHRGßl-177-244 ) . El ADN que codifica las variantes de la secuencia de aminoácidos de la heregulina, se prepara mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de las variantes de la secuencia de aminoácidos que se presentan de manera natural) o la preparación de mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR, y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante de la heregulina. Estas técnicas pueden utilizar el ácido nucleico de la heregulina (ADN o ARN) , o el ácido nucleico complementaria para el ácido nucleico de la heregulina . El método preferido para la preparación de las variantes de substitución, eliminación, e inserción del ADN de la heregulina, es la mutagénesis mediada por oligonucleótidos. Esta técnica es bien conocida en el arte como se describe por Adelman et al . , DNA, 2: 183 (1983). De manera breve, el ADN de la heregulina se altera hibridizando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada a una plantilla de ADN, en donde el patrón es la forma de una sola hebra de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN nativa o no alterada de la heregulina. Después de la hibridización, la polimerasa del ADN se utiliza para sintetizar una segunda hebra complementaria completa de la plantilla o patrón que incorporará así el cebador del oligonucleótido, y codificará la alteración seleccionada en el ADN de heregulina. De manera general, se utilizan los oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios a la plantilla en cualquier lado del (los) oligonucleótido (s) que codifican para la mutación. Esto asegura que los oligonucleótido se hibridizarán adecuadamente a la molécula de la plantilla de ADN de una sola hebra. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas conocidas en el arte tal como aquélla descrita por Crea et al . (Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 75: 5765, 1978). La plantilla o patrón de ADN de una sola hebra también se puede generar mediante desnaturalización del ADN del plásmido de doble hebra (u otro) utilizando las técnicas estándar. Para la alteración de la secuencia de ADN nativa (para generar las variantes de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo), el oligonucleótido se hibridiza con la plantilla de una sola hebra bajo condiciones de hibridización adecuadas. Una enzima de polimerización del ADN, usualmente el fragmento Klenow de la polimerasa I del ADN, se agrega entonces para sintetizar la hebra complementaria de la plantilla o patrón utilizando el oligonucleótido como un cebador para la síntesis. Se forma así una molécula heterodúplex de tal manera que una hebra de ADN codifique la forma mutada de la heregulina, y la otra hebra (la plantilla original) codifica la secuencia no alterada, nativa, de la heregulina. Esta molécula heterodúplex se transforma entonces en una célula hospedera adecuada, usualmente un procariote tal como E. coli JM101. Después de que las células se hacen crecer se colocan en placas sobre placas de agarosa y se seleccionan utilizando el cebador del oligonucleótido radioetiquetado con 32p-fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado. Se remueve entonces la región mutada y se coloca en un vector apropiado para la producción de proteína, en general un vector de expresión del tipo empleado típicamente para la transformación de un hospedero apropiado. El método descrito inmediatamente arriba se puede modificar de manera tal que se cree una molécula homodúplex en donde ambas hebras del plásmido contenga la(s) mutación (es) . Las modificaciones son como sigue: el oligonucleótido de una sola hebra se somete a hibridación mediante la aplicación de color y luego enfriamiento a la plantilla o patrón de una sola hebra como se describió arriba. Una mezcla de tres desoxiribonucléotidos, desoxiriboadenosina (dATP) , desoxiriboguanosina (dGTP) , y desoxiribotimidina (dTTP) , se combinan con una tio-desoxiribocitosina modificada llamada dCTP-(aS) (que se puede obtener de Amersham Corporation) . Esta mezcla se agrega al complejo de plantilla-oligonucleótido . Luego de la adición de la polimerasa del ADN a esta mezcla, se genera una hebra de ADN idéntica a la plantilla excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva hebra de ADN contendrá el dCTP-(aS) en lugar del dCTP, el cual sirve para protegerla de la digestión de la endonucleasa de restricción. Después de la hebra de plantilla del heterodúplex de doble hebra se corta con una enzima de restricción apropiada, la hebra de la plantilla se puede digerir con nucleasa de ExoI II u otra nucleasa apropiada pasando la región que contiene los sitios que van a ser mutagenizados. La región se detiene entonces para dejar que una molécula sea parcialmente de una sola hebra. El homodúplex del ADN de doble hebra, completo, se forma entonces utilizando la polimerasa de ADN en la presencia de todos los cuatro trifosfatos de desoxiribonucleótidos, ATP, y ligasa de ADN. Esta molécula homodúplex se puede transformar entonces en una célula hospedera adecuada tal como E. coli JM101, como se describe arriba. El ADN que codifica los mutantes de heregulina con más de un aminoácido a ser substituido se puede generar de una o varias formas. Si los aminoácidos están localizados cerca en la cadena del polipéptido, se pueden mutar simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifique para todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Si, sin embargo, los aminoácidos están localizados a una distancia entre sí (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos) , es más difícil generar un solo oligonucleótido que codifica todos los cambios deseados. En lugar de esto, se pueden emplear uno de dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido a ser substituido. Los oligonucleótidos se hibridizan entonces por la aplicación de calor y enfriamiento al ADN de la plantilla de una sola hebra, simultáneamente, y la segunda hebra del ADN que se sintetiza de la plantilla codificará para todas las substituciones de aminoácidos deseadas. El método alternativo involucra dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se describe para los mutantes únicos: el ADN tipo salvaje se utiliza para la plantilla, un oligonucleótido que codifica la primera substitución o substituciones de aminoácidos deseadas se hibridiza mediante calentamiento y enfriamiento para esta plantilla, y se genera entonces la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como la plantilla o patrón. Así, esta plantilla contiene ya sea una o más de las mutaciones. El oligonucleótido que codifica la(s) substitución (es) de aminoácidos deseada (s) adicional (es) se hibridiza mediante enfriamiento y calentamiento a esta plantilla o patrón, y la hebra resultante del ADN codifica ahora las mutaciones tanto de la primera como de la segunda ronda de mutagénesis. Este ADN resultante se puede utilizar como una plantilla en una tercera ronda de mutagénesis, y así sucesivamente. La mutagénesis de PCR también es adecuada para hacer las variantes de aminoácidos de heregulina. Mientras que la siguiente discusión se refiere al ADN, se entiende que la técnica también encuentra aplicación con el ARN. La técnica del PCR generalmente se refiere al siguiente procedimiento (ver Erlich, supra, el capítulo por R. Higuchi, p. 61-70) . Cuando se utilizan pequeñas cantidades del ADN de plantilla como material de inicio en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en un ADN de plantilla se pueden utilizar para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia de la plantilla solamente en las posiciones en donde los cebadores difieren de la plantilla. Para la introducción de una mutación en un ADN del plásmido, uno de los cebadores está diseñado para traslapar la posición de la mutación y contener la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a una extensión de la secuencia de la hebra opuesta del plásmido, pero esta secuencia se puede localizar en cualquier parte a lo largo del ADN del plásmido. Sin embargo, se prefiere, que la secuencia del segundo cebador esté localizado dentro de los 200 nucleótidos desde aquél del primero, de tal manera que en el extremo de la región amplificada completa del ADN enlazada por los cebadores se pueda secuenciar fácilmente. La amplificación por PCR utilizando un par de cebadores como el que se describió recientemente da como resultado una población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la mutación especificada por el cebador, y posiblemente, en otras posiciones, puesto que la copia de la plantilla es algo propensa al error. Si la proporción de la plantilla al material del producto es extremadamente baja, la vasta mayoría de los fragmentos de ADN del producto incorpora la(s) mutación (es) deseada (s). Este material del producto se utiliza para reemplazar la región correspondiente en el plásmido que sirve como plantilla del PCR utilizando la tecnología del ADN estándar. Las mutaciones en las posiciones separadas se pueden introducir simultáneamente ya sea utilizando un segundo mutante cebador o realizando una segunda PCR con diferentes cebadores del mutante y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes, simultáneamente al fragmento del vector en una ligación de tres partes (o más) . En un ejemplo específico de la mutagénesis por PCR, el ADN del plásmido de la plantilla o patrón (1 mg) se linealiza mediante digestión con una endonucleasa de restricción que tiene un sitio de reconocimiento único en el ADN del plásmido fuera de la región que va a ser amplificada. De este material, 100 ng se agregan a la mezcla de PCR que contiene el amortiguador de PCR, que contiene los cuatro tri-fosfatos de desoxinucleótidos y se incluye en los equipos GENEAMP (obtenidos de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA) , y 25 pmoles de cada cebador del oligonucleótido, hasta un volumen final de 50 ml . La mezcla de reacción se recubre con 35 mL de aceite mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100°C, se coloca brevemente en hielo, y entonces se agrega 1 mL de polimerasa de ADN de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/ml, comprada de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emerville, CA) se agrega debajo de la capa de aceite mineral. La mezcla de reacción se inserta entonces en un Formador de Ciclos Térmicos de ADN (comprado de Perkin-Elmer Cetus) programado como sigue: 2 min. 55°C 30 seg. 72°C, luego 19 ciclos de lo siguiente: 30 seg. 94°C, 30 seg. 55°C, y 30 seg. 72°C. Al final del programa, la ampolleta de reacción se remueve del formador de ciclos térmico y la fase acuosa transferida a un nueva inyección, extraído con fenol/cloroformo (50: 50: vol), y el etanol se precipitó, y el ADN se recuperó mediante procedimientos estándares. Este material se somete subsecuentemente a los tratamientos apropiados para la inserción dentro de un vector. Otro método para preparar variantes, mutagénesis de cásete, se basa en la técnica descrita por Wells et al .

( Gene, 34: 315, 1985). El material de inicio es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN de la heregulina que se va a mutar. Se identifica el codon o codones en el ADN de heregulina que se va a mutar. Debe haber un solo sitio de endonucleasa de restricción en cada lado del (los) sitio (s) de mutación identificado (s) . Si tales sitios de restricción existen, se pueden generar utilizando el método de mutagénesis mediado con oligonucleótidos descrito arriba para introducirlos en localizaciones apropiadas en el ADN de heregulina. Después de que se han introducir los sitios de restricción en el plásmido, el plásmido se corta en estos sitios para linealizarlo. Un oligonucleótido de doble hebra que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene la(s) mutación (es) deseada (s) se sintetizan utilizando los procedimientos estándar. Las dos hebras se sintetizan separadamente y luego se hibridizan conjuntamente utilizando técnicas estándar. Este oligonucleótido de doble hebra está referido como el cásete. Este cásete se diseña para tener los extremos 3' y 5' que son compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de tal manera que se pueda ligar directamente al plásmido. Este plásmido ahora contiene la secuencia de ADN de heregulina mutada. C. Inserción del ADN en un Vehículo de Clonación El ADNc o ADN genómico que codifica una heregulina nativa o variante se inserta dentro de un vector replicable para la clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. Muchos vectores están disponibles, y la selección del vector apropiado dependerá de 1) sí se va a utilizar para la amplificación del ADN o para la expresión del ADN, 2) el tamaño del ADN que se va a insertar en el vector, y 3) la célula hospedera que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes que dependen de su función (amplificación del ADN o expresión del ADN) y la célula hospedera para la cual es compatible. Los componentes del vector en general incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal. Un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente de la Secuencia de Señal En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de heregulina que se inserta en el vector. Se cree que el ADN de heregulina nativa codifica una secuencia de señal en el amino terminal (extremo 5' del ADN que codifica la heregulina) del polipéptido que es escindido durante el procesamiento post-traduccional del polipéptido para formar el ligando del polipéptido de heregulina maduro que se enlazada al receptor HER2/HER3, aunque no es aparente una estructura de señal convencional. La heregulina nativa, se secreta de las células pero permanece cargada en la membrana debido a que contiene un dominio de transmembrana y una región citoplásmica en la región del carboxilo terminal del polipéptido. Así, en una versión soluble, secretada de la heregulina, el dominio del carboxilo terminal de la molécula, que incluye el dominio de transmembrana, ordinariamente se elimina. Este polipéptido de heregulina de variante truncada se puede secretar de la célula, siempre que el ADN que codifica la variante truncada codifique una secuencia de señal reconocida por el hospedero. La heregulina de esta invención se puede expresar no sólo de manera directa, sino también como una fusión con un polipéptido heterólogo, preferiblemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el N- y/o C-terminal de la proteína madura o el polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN de heregulina que se inserta en el vector. Incluido dentro del alcance de esta invención están las heregulina con la secuencia de señal nativa eliminada y reemplazada con una secuencia de señal heteróloga. La secuencia de señal heteróloga seleccionada, deberá ser una que sea reconocida y procesada, es decir, escindida por una peptidasa de señal, por la célula hospedera. Para las células hospederas proteolíticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal de heregulina nativa, la secuencia de señal es substituida por una secuencia de señal proteolítica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o guías de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción de levaduras, la secuencia de señal heregulina nativa se puede substituir por la invertasa de las levaduras, el factor alfa, o las guías de fosfatasa acida. En la expresión en células de mamífero, la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamíferos. (ii) origen del componente de replicación Tanto los vectores de expresión como los de clonación por lo general contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células hospederas seleccionadas. De manera general, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente de ADN cromosómico hospedero, o incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas por una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación a partir de plásmido Pbr322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativa, el origen del plásmido 2m es adecuado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV, +o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos. De manera general, el origen del componente de replicación, no se necesita para los vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 puede usarse típicamente solamente debido a que contiene el promotor temprano) . La mayoría de los vectores de expresión son vectores "bifuncionales" (que se pueden replicar en más de un organismo) , es decir que son capaces de la replicación en al menos una clase de organismo pero que se pueden transfectar en otra clase de organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. Coli y luego el mismo vector se transfecta en levaduras o células de mamíferos de la expresión aunque no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula hospedera. El ADN también se puede amplificar mediante la inserción en el genoma hospedero. Esto se puede realizar fácilmente usando especies bacillus como hospederos, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que sea complementaria a una secuencia encontrada en el ADN genómico de Bacill us. La transfección del Bacillus con este vector da como resultado la recombinación homologa con el genoma "y la inserción del ADN de heregulina. Sin embargo, la recuperación del ADN genómico que codifica la heregulina es más complejo que aquella de un vector replicado exógenamente, debido a que se requiere la digestión de la enzima de restricción para escindir o cortar el ADN de la heregulina. El ADN se puede amplificar mediante PCR y transfectarse directamente a la célula hospedera sin ningún componente de replicación. (iii) componente del gen de selección Los vectores de clonación y expresión deberán contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células hospederas transformadas que se hacen crecer en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contienen el gen de selección no sobrevivían en el medio de cultivo. Típicamente los genes de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antobióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas complementarias, o (c) proveen nutrientes críticos no disponibles para el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedera. Aquellas células que se transforman de manera exitosa con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia al fármaco y de esta manera sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern et al., Molec, Appl. Genet 1: 327,1982), ácido micofenólico (Mulligan et al Science 209: 1422,1980) o higromicina (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413, 1985). Los tres ejemplos dados anteriormente emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para conferir resistencia a un fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina) , xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamíferos, son aquellos que permiten la identificación de componentes celulares para absorber el ácido nucleico de la heregulina, tal como la reductasa de dihidrofolato (DHFR) o timidina cinasa. Los transformantes de las células de mamíferos se colocan bajo presión de selección, bajo la cual solamente los transformantes están adaptados únicamente para sobrevivir en virtud de haber absorbido el marcador. La presión de selección se impone mediante el cultivo de los transformantes bajo condiciones en las cuales, la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, llevando así a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica la heregulina. La amplificación es el' proceso mediante cual, los genes en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento, se reiteran o reproducen en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Las cantidades incrementadas de heregulina se sintetizan a partir del ADN amplificado. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR primero se identifican mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contenga metrotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedera apropiada cuando se emplea el DHFR tipo salvaje, es la línea celular de ovarios de hámster chino (CHO) en actividad de DHFR preparadas y propagadas como se describen por Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216, 1980. Las células transformadas se exponen entonces a niveles incrementados de metotrexato. Esto lleva a la síntesis de copias múltiples del gen de DHFR, y, concomitantemente, copias múltiples de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tal como el ADN que codifica la heregulina. Esta técnica de amplificación se puede utilizar con hospederos adecuados de otra forma, por ejemplo, CHO-K1 ATCC No. CCL61, a pesar de la presencia del DHFR endógeno si, por ejemplo, se emplea un gen DHFR mutante que es altamente resistente al Mtx (EP 117, 060) . Alternativamente, las células hospederas (particularmente las hospederas tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican la heregulina, la proteína DHFR tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicosido 3' fosfotránsferasa (APH) se pueden seleccionar mediante crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como el antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418 (ver patente norteamericana No. 4,965,199) . Un gen de selección adecuado para usarse en levaduras es el gen tpr 1 presente en el plásmido YRp7 de la levadura (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, 1979; Kingsman et al., Gene, 7: 141, 1979; ó Tschemper et al., Gene, 10:157, 1980). El gen tpr 1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 ó PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12, 1997). La presencia de la lesión trp 1 en el genoma celular hospedero de la levadura, proporciona entonces un medio ambiente efectivo para detectar la transformación mediante el crecimiento en la ausencia de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en eu2 (ATCC 20,622 ó 38,626) se complementan mediante plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2. (iv) Componente del promotor Los vectores de clonación y expresión usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y se enlaza operablemente al ácido nucleico de la heregulina. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas en la dirección (5' ) hacia el codon de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controlan la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, tal como la heregulina a la cual se enlazan operablemente. Tales promotores caen dentro de dos clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician los niveles incrementados de transcripción a partir del ADN bajo su control en respuesta a algunos cambios en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este tiempo son conocidos un gran número de promotores que se reconocen por una variedad de células hospederas potenciales. Estos promotores se enlazan operablemente al ADN que codifica la heregulina removiendo al promotor del ADN de fuente, mediante la digestión de la enzima de restricción e insertando la secuencia de promotor aislado en el vector. Tanto la secuencia del promotor de heregulina nativa como muchos promotores heterólogos se pueden usar para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN de la heregulina. Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos, puesto que generalmente permiten una transcripción mayor y altos rendimiento de la heregulina expresada comparada con el promotor de heregulina nativo. Los promotores adecuados para utilizarse con hospederos procarióticos incluyen los sistemas promotores de lactosa y b-lactamasa (Chang et al., Nature, 275: 615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nuclei - Acids Res . , 8: 4057, 1980 y EP 36,776), tPA (patente norteamericana No. 5,641,655) y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 21-25, 1983) . Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo así a un trabajador con habilidades en la técnica ligarlos operablemente al ADN que codifica la heregulina (Siebenlist et al . , Cell 20:269, 1980) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para usarse en sistemas bacterianos también contienen por lo general una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operablemente al ADN que codifica la heregulina. Las secuencias promotoras adecuadas para usarse con los hospederos de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al,. J. Biol.. Chem., 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al . , J. Adv. Enzyme Reg 1 : 149, 1968; y Holland, Biochemistry 17: 4900, 1978) tales como la enolasa, el gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, descarboxilasa de piruvato, fosfofructocinasa, isomerasa de glucosa-6-fosfato, mutasa de 3-fosfoglicerato, piruvato cinasa, isomerasa de triosefosfato, isomerasa de fosfoglucosa y glucosinasa. Otros promotores de levaduras, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para el alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metallotioneina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables para la utilización de la maltosa y la galactosa. Los promotores y vectores adecuados para utilizarse en la expresión de levadura adicionalmente se describen en Hitzeman et al., patente europea 73, 657A. Los mejoradores de levadura también se usan ventajosamente con los promotores de levaduras. Las secuencias promotoras son conocidas para los eucariotes. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT, localizada aproximadamente de 25 a 30 bases en la dirección 5' desde el sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en la dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes, es una región CXCAAT en donde X puede ser cualquier nucleoide. En la dirección 3' de la mayoría de los genes eucarióticos, está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente dentro de los vectores de expresión de mamíferos. La transcripción del gen de heregulina de los vectores en las células hospederas de mamíferos, se puede controlar mediante los promotores obtenidos de genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela de pollo (patente británica 2,211,504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma de las aves, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferiblemente el virus 40 de simio (SV40), a partir de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobina, a partir de promotores de choque por calor, y a partir del promotor asociado normalmente con la secuencia de heregulina, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas celulares hospederos. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40. que también contiene el origen viral de replicación SV40 (Fier et al., Nature, 273:113 (1978); Mulligan and Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)). El promotor temprano intermedio del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción Hindll l (Greenaway et al . , Gene, 18:355-360 (1982)). Un sistema para expresar el ADN en los hospederos mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la patente norteamericana No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la patente norteamericana No. 4,601,978. Ver también Gray et al., Nature, 295:503-508 (1982) sobre la expresión del ADNc que codifica al interferón inmune en células de mono; Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del b-interferón humano, en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simplex; Canaani and Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 79: 5166-5170 (1982) sobre la expresión gen bl del interferón humano en células cultivadas ratones y conejos; y Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de las secuencias CAT bacterianas en células de riñon de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células NIH-3T3 de ratón utilizando la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous como promotor. (v) componente del elemento mejorador La transcripción de un ADN que codifica la heregulina de esta invención mediante eucariotes superiores, a menudo se incrementa insertando una secuencia mejoradora en el vector. Los mejoradores son elementos cis-actuantes del ADN, usualmente desde aproximadamente 10-300 bp, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los mejoradores son independientes relativamente de la orientación y la posición que se han encontrado en la dirección 5' (Laimins et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78: 993, 1981) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108, 1983) a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell, 33: 729, 1983) así como dentro de la secuencia de codificación misma (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4: 1293, 1984). Muchas secuencias son ahora conocidas a partir de genes de mamíferos (globina lastasa, alúmina, a-fetoproteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se utilizará un mejorador a partir de un virus de las célula eucarióticas. Los ejemplos incluyen al mejorador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270), el mejorador del promotor temprano del citomegalovirus, el mejorador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los mejoradores de adenovirus (ver también Yaniv, Nature, 297:17-18(1982)) sobre los elementos mejoradores para la activación de los promotores eucarióticos . El mejorador puede empalmarse en el vector en la posición 5' ó 3' al ADN de la heregulina, pero preferiblemente estará localizado en el sitio 5' del promotor. (vi) componente de terminación de transcripción Los vectores de expresión utilizados en las células hospederas eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas a partir de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' , de los ADNs viral o eucariótico o los ADNc. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritas como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica la heregulina. Las regiones no traducidas 3' también incluyen los sitios de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contiene uno o más de los componentes listados arriba, la codificación deseada y las secuencias de control, emplea las técnicas de ligación estándar. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, se ajustan y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se usan para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC, 31,446) y los transformantes exitosamente seleccionados mediante ampicilina o tetraciclina según sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes se preparan se analizan mediante la digestión mediante endonucleasa de restricción y/o se secuencian mediante el método de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o por el método de Maxam et al., Methods in Enzimology 65: 499 (1980). Particularmente útiles en la práctica de esta invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transciente en las células de mamíferos del ADN que codifica la heregulina. En general, la expresión transciente involucra el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula hospedera, tal que la célula hospedera acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de un polipéptido deseado codificado mediante el vector de expresión. Los sistemas de expresión transciente, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula hospedera, permiten la identificación positiva conveniente de los polipéptidos codificados por los ADNs clonados, así como la selección rápida de tales polipéptidos para las propiedades biológicas y fisiológicas deseadas. Así, los sistemas de expresión transciendes son particularmente útiles en la invención para propósitos de identificar los análogos y variantes de la heregulina que tienen una actividad similar a la heregulina. Tal sistema de expresión transiente se describe en la patente norteamericana No. 5,024, 939. Otros métodos, vectores, y células hospederas adecuadas para la adaptación a la síntesis de la heregulina en cultivos de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281: 40-46, 1979; Levinson et al., patentes europeas No. 117,060 y 117,058. Un plásmido de expresión particularmente útil para la expresión de cultivo celulares de mamíferos de la heregulina es el pRK5 (publicación europea No. 307,247) o el pSV16B (solicitud de patente norteamericana No. 07/441,574, presentada el 22 de noviembre de 1989, cuya descripción se incorpora aquí para referencia) .

D. Selección y transformación de las células hospederas Las células hospederas adecuadas para la clonación y expresión de los vectores de la presente son las células procariotas, de levaduras, o células eucariotas superiores como se describió arriba. Los procariotes adecuados incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, E. coli, Bacilli tales como B. Subtilis, especies Pseudomonas tales como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, ó Serratia marcescans. Un hospedero de clonación preferido de E. Coli es el E. Coli 294 (ATCC 31, 446), aunque otras cepas como E. coli B, E. coli ?l776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) son adecuadas. Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. Preferiblemente las células hospederas deberán secretar cantidades. mínimas de enzimas proteolíticas. Alternativamente, son adecuados otros métodos in vitro para la clonación, por ejemplo, el PCR u otras reacciones de polimeresa del ácido nucleico. Además de los procariotes, son adecuados los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o levaduras como hospederos que codifican la heregulina El Saccharomytes cerevisiae, una levadura común para el horneado, es el más comúnmente usado entre los organismos hospederos eucarióticos inferiores. Sin embargo, están disponibles un número de otros géneros, especies y cepas comúnmente y son útiles en la presente, tales como Schizosaccharomytes pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); la patente europea 139,383, publicada el 2 de mayo de 1985), Kluyveromyces hos (U.S.SN. No. 4,943,529) tales como por ejemplo K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983); K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, y K. marxianus, yarrowia (patente norteamericana, 402,226); Pichia pastoris (patente norteamericana 183,070), Screekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988); Candida, Trichoderma recia (patente europea 244, 234); Neurospora crasa (Case et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979), y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357, publicado el 10 de enero de 1991) , y hospederos Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984) y A. niger (Kelly and Inés, EMBO J. , 4:475-479 (1985) ) .

Las células hospederas adecuadas para la expresión del polipéptido de heregulina glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Tales células hospederas son capaces de procesar complejos y de actividades de glicosilación. En principio, cualquier cultivo celular eucariótico superior puede trabajarse, ya sea a partir de cultivos de vertebrados o de invertebrados. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y células hospederas de insectos permisivos a partir de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (caterpillar) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila malanogaster (mosca de la fruta) , y células hospederas de Bombix mori (ver, por ejemplo Luckow et al., Bio/Technology, 6: 47-55 (1988); Miller et al., en Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985)). Una variedad de tales cepas virales están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombix mori NPV, y tales virus se pueden usar como los virus de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos de células de plantas, de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, y tabaco se pueden utilizar como hospederas. Típicamente, las células de plantas se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que ha sido previamente manipulada para contener el ADN de la heregulina. Durante la incubación del cultivo de las células de las plantas con A. tumefaciens, el ADN que codifica la heregulina se transfiere al hospedero celular de la planta tal que se transfecte, y bajo condiciones apropiadas se exprese el ADN de la heregulina. Además, las secuencias reguladoras y de señal compatibles con las células de la planta están disponibles, tales como el promotor de nopalina sintasa y las secuencias de señal de poliadenilación (Depicker et al., J. Mol. Appln. Gen., 1: 561 (1982)). Además, los segmentos aislados de AND de la región en la dirección 5' del gen T-DNA 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de los genes expresables por las plantas en un tejido de plantas que contiene ADN recombinante (ver patente europea No. 321,196, publicada el 21 de junio de 1989). Sin embargo, ha habido mayor interés en las células de vertebrados, y la propagación de las células de vertebrados en cultivos (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina en años recientes ( Tissue Cul ture, Academic Press, Kruse y Patterson, editors (1973)). Los ejemplos de líneas células de mamíferos son CV1 de riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de las células de riñon embriónico humano (293 ó células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al . , J. Gen . Virol . , 36: 59, 1977); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 11 : 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1, ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono africano, verde (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRl (Mather et al . , Annals N. Y. Acad. Sci . 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células hospederas preferidas son las células de ovario de hámster chino y las células 293 de riñon embriónico humano.

Las células hospederas se transfectan y se transforman preferiblemente con la expresión descrita arriba o los vectores de clonación de esta invención y se cultivan en un medio nutriente convencional según sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. La transfección se refiere a la absorción de un vector de expresión por una célula hospedera ya sea que las secuencias codificantes se expresen de hecho. Numerosos métodos de transfección son conocidos para el técnico con habilidades ordinarias, por ejemplo, el CaP0 y la electroporación. La transfección exitosa se reconoce en general cuando cualquier indicación de la operación de este vector ocurre dentro de la célula hospedera. La transformación significa introducir el ADN dentro de un organismo de manera que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o por la integración cromosómica. Dependiendo de la célula hospedera utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de sodio, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al . , supra , se utiliza por lo general para los procariotes u otras células que contienen barreras de pared celular substanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw et al . , Gene, 23: 315 (1993) y WO 89/05859, publicada el 29 de Junio de 1989. Para las células de mamíferos sin tales paredes celulares, se prefiere el método de precipitación con fosfato de calcio descrito en las secciones 16.30-16.37 de Sambrook et al . , supra . Se han descrito los aspectos generales para las transformaciones de los sistemas hospederos de células de mamíferos por Axel en la Patente Norteamericana No. 4,399,216, expedida el 16 de Agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se realizan típicamente de acuerdo con el método de Von Solingen et al . J. Bact . 130: 946 (1977) y Hsiao et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 76: 3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir el ADN en las células tales como inyección nuclear, electroporación, o fusión de protoplastos también se pueden utilizar. E. Cultivo de las Células Hospederas Las células procarióticas utilizadas para producir el polipéptido de heregulina de esta invención se cultivan en medios adecuados como describe de manera general en Sambrook et al . , supra .

Las células hospederas de mamíferos utilizadas para producir la heregulina de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como FIO de Ham (Sigma) , Medio Esencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y el Medio de Eagle Modificado con Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth . Enz . , 58: 44 (1979), Barnes y Sato, Anal . Biochem . , 102: 255 (1980), Patente Norteamericana No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; o 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; Patente Norteamericana Re. 30,985; Patente Norteamericana No. 5,122,469 o USSN 07/592,141, presentada el 3 de Octubre de 1990, las descripciones de las cuales están incorporadas aquí para referencia, se pueden utilizar como un medio de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios se pueden suplementar según sea necesario con hormonas y/o otros factores del crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor del crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleósidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como fármacos de GENTAMICINA) , elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentados a concentraciones finales en un rango micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serán conocidos por aquellos hábiles en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, y similares, son aquéllas utilizadas previamente con las células hospederas seleccionadas para la expresión, y serán aparentes para un artesano hábil ordinariamente. Las células hospederas referidas en esta descripción engloban las células en un cultivo in vi tro así como las células que están dentro de un animal hospedero. También se considera que la heregulina de esta invención se puede producir mediante recombinación homologa o con métodos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contienen el ADN que codifica la heregulina presente en el uso en el campo. Por ejemplo, un elemento promotor de la potencia/mej orador, supresor, o un elemento modulador de la transcripción exógena se insertan en el genoma de la célula hospedera pretendida en proximidad y orientación suficiente para influir la transcripción de 1 ADN que codifica la heregulina deseada. El elemento de control no codifica la heregulina de esta invención, pero el ADN está presente en el genoma de la célula hospedera. Uno puede enseguida seleccionar las células haciendo la heregulina de esta invención, o los incrementados o disminuidos de expresión, según se desee. F. Amplificación/Expresión del Gen de Detección La amplificación y/o expresión del gen se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante manchado o transferencia Southern convencional, manchado Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 11 : 5201-5205 (1980)), manchado por puntos (análisis de AD?) , o hibridización in si tu, utilizando una sonda etiquetada apropiadamente en base a las secuencias proporcionadas aquí. Varias etiquetas, se pueden emplear, más comúnmente radioisótopos, particularmente 32P. sin embargo, también se pueden emplear otras técnicas, tales como los nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para enlazarse a la avidina o anticuerpos los cuales se pueden etiquetar con una amplia variedad de etiquetas, tales como radionúclidos, generadores de fluorescencia, enzimas, o similares. Alternativamente, se pueden emplear los anticuerpos que puedan reconocer los dúplex específicos, incluyendo los dúplex de ADN, y dúplex de ARN, dúplex de híbridos ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína . Los anticuerpos a su vez se pueden etiquetar y el ensayo se puede realizar donde el dúplex se una a una superficie, de manera que luego de la formación del dúplex en la superficie, se pueda detectar la presencia del anticuerpo enlazado al dúplex. La expresión del gen, alternativamente, se puede medir mediante métodos inmunológicos, tales como teñido inmunohistoquímico de las secciones de tejidos y el ensayo del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Con las técnicas de teñido inmunohistoquímico, se prepara una muestra celular, típicamente por deshidratación y fijación, seguida por la reacción con anticuerpos etiquetados específicos para el producto del gen acoplados en donde las etiquetas sean detectables de manera visual tales como etiquetas enzimáticas, etiquetas fluorescentes, etiquetas luminiscentes y similares. Una técnica de manchado sensible particularmente adecuada para su uso en la presente invención se describe por Hsu et al . , Am. J. Clin . Pa th. 75: 734-738 (1980) .

Los anticuerpos útiles para el manchado inmunohistoquímico y/o ensayo de los fluidos de muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido de heregulina nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN provistas en la presente como se describe adicionalmente más adelante. G. Purificación de los Polipéptidos de Heregulina Se recupera la heregulina de una fracción de membrana celular. Alternativamente, un fragmento o subdominio de heregulina soluble, expresado, truncado, o escindido proteolíticamente, se recuperan del medio de cultivo como un polipéptido soluble. Una heregulina se recupera de los lisados celulares hospederos cuando se expresan directamente sin una señal secretoria. Cuando la heregulina se expresa en una célula recombinante diferente de una de origen humano, la heregulina está libre complemente de proteínas o polipéptido de origen humano. Sin embargo, es deseable purificar la heregulina de las proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que sean homogéneas substancialmente para la heregulina. Como una etapa final, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar los restos de células particulados. La membrana y las fracciones de la proteína soluble se separan entonces. La heregulina se purifica entonces a partir tanto de la fracción de la proteína soluble (que requiere la presencia de una proteasa) como de la fracción de la membrana del lisado del cultivo, dependiendo de sí la heregulina está enlazada a la membrana. Los siguientes procedimientos son ejemplares de los procedimientos de purificación adecuados: fraccionación sobre columnas de intercambio iónico o inmunoafinidad; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre gel de sílice, heparina SEPHAROSE o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatografía con enfocamiento; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; y filtración del gel utilizando, por ejemplo, SEPHADEX. G-75. Las variantes de heregulina en las cuales los residuos se han eliminado, insertado o substituido se recuperan de la misma manera que para la heregulina nativa, teniendo en cuenta cualquier cambio substancial en las propiedades ocasionadas por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión de heregulina con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, un antígeno bacteriano o viral, facilita la purificación; una columna de inmunoafinidad que contiene el anticuerpo al antígeno se puede utilizar para absorber la fusión. Las columnas de inmunoafinidad tales como una columna de anti-heregulina policlonal de conejo, se pueden emplear par absorber la variante de heregulina mediante el enlace de la misma a al menos un epítope inmune remanente. También se puede utilizar un inhibidor de proteasa tal como el fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y se pueden incluir los antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes indeseados. Alguien con habilidades en la técnica apreciará que los métodos de purificación adecuados para la heregulina nativa pueden requerir la modificación para contabilizar los cambios en el carácter de las variantes de heregulina o luego de la expresión en el cultivo de las células recombinantes. H . Modificaciones Covalentes de la Heregulina Las modificaciones covalentes de los polipéptidos de heregulina se incluyen dentro del alcance de esta invención. Tanto la heregulina nativa como las variantes de la secuencia de aminoácidos de la heregulina opcionalmente se modifican covalentemente. Un tipo de modificación covalente incluida dentro del alcance de esta invención es un fragmento del polipéptido de heregulina. Los fragmentos de heregulina, tales como HRG-GDF, que tienen hasta aproximadamente 40 residuos de aminoácidos se preparan convenientemente mediante síntesis química, o por escisión enzimática o química del polipéptido de heregulina de longitud completa o polipéptido variante de heregulina. Otros tipos de modificaciones covalentes de heregulina o fragmentos de la misma se introducen dentro de la molécula mediante la reacción que tiene como objetivo los residuos de aminoácidos de la heregulina o fragmentos de la misma con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales . Los residuos de cisteinilo más comúnmente son los que se hacen reaccionar con los a-haloacetatos (y aminas correspondientes) tales como ácido cloroacético y cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivan por la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-ß- (5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol .

Los residuos de histidilo se derivan mediante la reacción con dietilpirocarbonato a pH 5.5-7.0 a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se realiza preferiblemente en un cacodilato de sodio 0.1M a pH ß.O. Los residuos amino-terminales y lisinilos se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de reducir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar un residuo que contiene a-amino incluye los imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal, cloroborohidruro; ácido trinitrobencensulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y la reacción catalizada con transaminasa con glioxilato. Se modifican los residuos de arginilo mediante la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2, 3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivación de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo épsilon-amino de arginina. La modificación específica de los residuos de tirosilo se puede hacer, con interés particular para introducir las etiquetas espectrales en residuos de tirosina mediante la reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utiliza N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar las especies de O-acetil tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan utilizando 125I ó 131I para preparar las proteínas etiquetadas para utilizarse en los radioinmunoensayos, el método T de cloramina descrito arriba es adecuado. Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R' -N=C=N-R' ) , donde R y R' son grupos alquilo diferentes tales como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia- , 4-dimetilpentil) carbodiimida . Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten a residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones de amonio, La derivación con agentes bifuncionales es útil para la entrecruzar la heregulina a una matriz de soporte insoluble en agua o a una superficie para usarse en un método para purificar los anticuerpos anti-heregulina, y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen esteres de disuccinimidilo tales como 3, 3' -ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano. Los agentes de derivación tales como metil-3- ( (p-azidofenil) ditio) propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en la presencia de luz. Alternativamente, se emplean las matrices insolubles en agua, reactivas, tales como carbohidratos activados con cianógeno y los substratos reactivos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 para la inmovilización de proteínas. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente para los residuos de aspartilo y glutamilo correspondientes, respectivamente.

Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones levemente acidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención. Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos de hidroxilo, de residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983) ) , la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Opcionalmente la heregulina se fusiona con un polipéptido heterólogo para la heregulina. El polipéptido heterólogo opcionalmente es una secuencia de anclaje tal como se encuentra en una proteína de revestimiento de fago tales como las proteínas del gen III o gen VIII de M13. Estos polipéptidos heterólogos se pueden acoplar covalentemente al polipéptido de heregulina a través de cadenas laterales o a través de los residuos terminales. La heregulina también se puede modificar covalentemente alterando su patrón de glicosilación nativo. Uno o más substituyentes de carbohidrato en estas modalidades se modifica la adición, remoción o variación de los componentes de monosacáridos en un sitio dato, o mediante la modificación de los residuos en la heregulina conforme esos sitios de glicosilación se agregan o se eliminan. La glicosilación de los polipéptidos típicamente es ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de las porciones de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tri-péptidos de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquier de estas secuencias de tri-péptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalatosamina, galactosa, o xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . Los sitios de glicosilación se agregan a la heregulina alterando su secuencia de aminoácidos para contener una o más de las secuencias de tri-péptidos descritas arriba (para los sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración se puede realizar mediante la adición de, o la substitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la heregulina (para los sitios de glicosilación O-enlazados) . Para facilidad, la heregulina se altera preferiblemente a través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica la heregulina en bases preseleccionadas tales como los codones que son generados y que se traducirán dentro los aminoácidos deseados . El acoplamiento químico o enzimático de la heregulina incrementa el número de substituyentes de carbohidrato. Estos procedimientos son ventajosos en que no requieren una producción del polipéptido en un célula hospedera que sea capaz de glicosilación N- y O-enlazada. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar o azúcares se pueden unir a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo tales como aquéllos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquéllos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquéllos de fenilalanina, tirosina, o triptofano, o (f) grupos amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO 87/05330, publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston ( CRC Cri t . Rev. Biochem . pp. 259-306 (1981)) . Las porciones de carbohidrato presentes en un heregulina también se eliminan química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría de todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras que deja al polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al . (Arch . Biochem . Biophys . 259:52 (1987)) y por Edge et al . ( Anal . Biochem . 118:131 (1981)). Las porciones de carbohidrato se remueven de la heregulina mediante una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al . (Meth . Enzymol . 138:350 (1987) ) . La glicosilación también se suprime por tunicamicina como se describe por Duskin et al . (J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)). La tunicamicina bloque la formación de enlaces proteína-N-glicósido. La heregulina también se puede modificar mediante el enlace de la heregulina a varios polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol o polioxialquilenos, en la manera establecida en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. Una forma preferida para incrementar la vida media circulante in vivo de la heregulina no enlazada a la membrana es conjugarla a un polímero que confiere vida media extendida, tal como polietilenglicol (PEG) . (Maxfield, et al . Polymer 16, 505-509 (1975); Bailey, F.E., et al , en Noionic Surfa ctants (Schick, M. J. , ed. ) pp 794-821, 1967); (Abuchowski, A. et al . , J. Biol . Chem . 252, 3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et al . , Cáncer Biochem . Biophys . 1 , 175-186, 1984); (Katre, N.V. et a l . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 84, 1487-1491, 1987; Goodson, R. et al . Bio Technology 8, 343-346, 1990) . La conjugación de PEG también se ha reportado que tiene inmunogenicidad y toxicidad reducidas (Abuchowski, A. et al . , J. Biol . Chem . 252, 3578-3581, 1977). La heregulina también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en los sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) , o én microemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., Ed., (1980). Aquellos hábiles en la técnica serán capaces de seleccionar las variantes óptimas con el propósito pretendido. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de la heregulina, tal como un cambio en la afinidad para un antígeno dado o para el receptor HER2, se mide mediante un inmunoensayo tipo competitivo, utilizando un estándar o control tal como una heregulina nativa (en particular, la heregulina nativa GFD) . Otras modificaciones potenciales de las propiedades de la proteína o polipéptido tales como estabilidad redox o térmica, hidrofobicidad, susceptibilidad a la degradación proteolítica, estabilidad en los cultivos celulares recombinantes o en el plasma, o la tendencia de agregarse con portadores o en multímeros, se ensayan mediante métodos bien conocidos en la técnica. I. Preparación del Anticuerpo de la Heregulina Los anticuerpos de esta invención se obtienen mediante selección de rutina e incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos policlonales preferiblemente se generan en animales mediante inyecciones subcutáneas múltiples (sc) o inyecciones intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. El mismo puede sr útil para conjugar el antígeno relevante que es inmunogénica en la especie que va a ser inmunizada, por ejemplo, la hemocianina de limpet clave, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de sulfosuccinimida de melimidobenzoilo (conjugación a través de los residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos de alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados mediante la combinación, por ejemplo, de 100 ug o 5 ug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund y se inyecta a la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde los animales se potencializan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De 7 a 14 días más tarde, los animales se sangran y el suero se ensaya para la titulación del anticuerpo. Los animales se potencializan hasta que se alcanza un valor constante de titulación. Preferiblemente, el animal se potencializa con el conjugado del mismo antígeno, pero el conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden fabricar de cultivos de células recombinantes como fusiones de proteína. También, los agentes de agregación tales como alum se utilizan adecuadamente para mejorar la respuesta inmune. Los anticuerpos monoclonales se pueden fabricar utlizando el método de híbridoma descrito por Kohier et al . , Na ture, 256-495 (1975), o se pueden hacer mediante los métodos de ADN recombinantes (Patentes Norteamericanas Nos. 4,816,567) . En el método de híbridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se describió arriba para generar los linfocitos que producen o son capaces de producir los anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro. Los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de híbridoma (Goding, Monoclonal An tibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de híbridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más substancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células de mieloma parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células del mieloma parental carecen de la enzima hidroxixantina guanina o fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los híbridomas típicamente incluirán la hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , cuyas substancias evitan el crecimiento de las células deficientes de HGPRT. Las células del mieloma preferidas que se fusionan eficientemente, que soportan la producción de altos niveles estables del anticuerpo mediante las células que producen el anticuerpo, y que son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mielomas preferidos son las líneas de mieloma de murino, tales como aquéllas derivadas de los tumores de ratón MOP-21 y M.C. -11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección de Cultivos Tipo Americano, Rockville, Maryland USA. Las líneas células del mieloma humano y el heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applica tions, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) . El medio de cultivo en el cual las células de híbridoma se hacen crecer se ensayan para la producción de anticuerpos dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad del enlace de los anticuerpos monoclonales producidos preferiblemente las células del híbridoma se determina por la inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vi tro, tal como un radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard de Munson et al . , Anal . Biochem . , 107:220 (1980). Después de que se identifican las células de híbridoma de la especificidad deseada, afinidad, y/o actividad, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos y haciéndolos crecer mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1965) ) . Los medios de cultivos adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de híbridoma se pueden hacer crecer in vivo como tumores de ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan subsecuentemente del medio de cultivo, el fluido de los ascitos o el suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, la prot'eína A-SEPHAROSE, cromatografía de hidroxilapatita, electrofóresis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y se secuencia fácilmente utilizando los procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando las sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales) . Las células de híbridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, los cuales se transfectan dentro de las células hospederas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células' de mieloma que no producen de otra forma la proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá con más detalle a continuación. Las líneas celulares de híbridoma que producen los anticuerpos se identifican mediante la selección de los sobrenadantes del cultivo para el anticuerpo que se enlaza a los receptores HER2 y/o HER3. Esto se complementa rutinariamente mediante los inmunoensayos convencionales utilizando preparaciones de receptores solubles o por FACS utilizando el receptor enlazado a las células y el anticuerpo candidato etiquetado. Los anticuerpos agonistas son preferiblemente anticuerpos que estimulan la autofosforilación en el ensayo de autofosforilación de la heregulina tirosina como se describió arriba. Las líneas células híbridas se puede mantener el cultivo in vi tro en el medio de cultivo celular. Las líneas celulares de esta invención se pueden seleccionar y/o mantener en una composición que comprende la línea celular continua en un medio de hipoxantina-aminopterina timidina (HAT) . De hecho, una vez que la línea celular de híbridoma se establece, se pude mantener en una variedad de medios adecuados nutricionalmente . Además, las líneas celulares híbridas se pueden almacenar y conservar en cualquier número de maneras convencionales, incluyendo la congelación y almacenamiento bajo nitrógeno líquido. Las líneas celulares congeladas se pueden revivir y cultivar indefinidamente con la síntesis y secreción resumida de anticuerpos monoclonales. El anticuerpo secretado se recupera a partir del sobrenadante del cultivo de tejido mediante métodos convencionales tales como la precipitación, la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad, o similares. Los anticuerpos descritos aquí también se recuperan a partir de cultivos de células de híbridoma mediante métodos convencionales para la producción de IgG o IgM según el caso que hasta ahora se han utilizado para purificar estas inmunogiobulinas a partir de plasma conjuntado, por ejemplo, procedimientos de precipitación con etanol o polietilenglicol. Los anticuerpos humanos se pueden utilizar y son preferibles. Tales anticuerpos se pueden obtener utilizando los híbridomas de humano (Cote et al . , Monoclonal An tibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)). Los anticuerpos químicos, Cabilly et al., Patente Norteamericana No. 4,816,567 (Morrison et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . 81:6851 (1984); Takeda et al . , Na ture 314:452 (1985)) que contiene una región variable anti-HER2/HER3 murina y una región constante de humano de actividad biológica apropiada (tal como una capacidad para activar el complemento humano y mediar el ADCC) están dentro del alcance de esta invención, como son los anticuerpos humanizados producidos por los métodos de injerto-CDR convencionales (Riechmann et al., Nature 332:333-327 (1988); EP 0328404 Al; EP 02394000 A2) . Las técnicas para crear las versiones del ADN recombinante de las regiones antígeno-enlace de las moléculas del anticuerpo (Fab o fragmentos de regiones variables) que evitan la generación de anticuerpos monoclonales también están englobados dentro de la práctica de esta invención. Uno extrae las moléculas de ARN mensajeras específicas del anticuerpo de las células del sistema inmune tomadas de un sujeto inmunizado, transcribe estas en un ADN complementario (ADNc) , y clona el ADNc en un sistema de expresión bacteriano y selecciona las características de enlace deseadas. El método Scripps/Stratagene utiliza un sistema vector lambda del bacteriófago que contiene una secuencia líder que provoca la proteína Fab expresada migre al espacio periplásmico (entre la membrana celular bacteriana y la pared celular) o que va a ser secretada. Se puede generar rápidamente y seleccionar grandes números de fragmentos Fab funcionales para identificar aquéllos que se enlazan a los receptores con las características deseadas. Alternativamente, los anticuerpos se pueden preparar por las técnicas de despliegue del fago descritas en Hoogenboom, Tibtech Febrero de 1997 (vol 15) ; Neri et al . , Cell Biophysi cs 27:47-61 (1995); Winter et al . , Annu . Rev. Immunol . 12:433-55 (1994); y Soderlind et al . , Immunol . Rev. 130:109-124 (1992) y las referencias descritas aquí así como la técnica de despliegue del fago monovalente descrita por Lowman et al . , Biochem . 30:10832-10838 (1991). 2. Composiciones Terapéuticas, Administración y Uso de las Heregulinas y Anticuerpos de Agonistas Las heregulinas se utilizan en la presente invención para inducir la proliferación de células de soporte del oído interno para mejorar la nueva generación de células pilosas. Estos efectos permiten el tratamiento de estados de padecimientos de daño del tejido, por ejemplo, o daño al otóxico, daño acústico, pérdida degenerativa del oído o daños en equilibrio o daños asociados con lesiones quirúrgicas o físicas. El campo de la implantación coclear también ha proporcionado visiones tanto para efectos a corto como a largo plazo para la fenestración coclear en la función del oído interno. La administración de factores del crecimiento en los oídos internos de animales es posible ahora con el uso de catéteres implantados y bombas de infusión en miniatura. La aplicación localizada de la heregulina al oído interno humano se puede realizar para tratar los padecimientos del oído interno relacionados a la disfunción de las células pilosas. Las formulaciones terapéuticas de la heregulina o el anticuerpo agonista se preparan para el almacenamiento mezclando la proteína heregulina que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables fisiológicamente, opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra ) , en la forma de una torta liofilizada o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o excipientes aceptables son no tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen los amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, los antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mannosa, o dextrinas; los agentes quelantes tales como EDTA; los alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol (PEG) . La heregulina o el anticuerpo agonista que se va a usar para administración in vivo debe ser estéril. Esto se obtiene fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estéril, antes a o después de la siguiente liofilización y reconstitución. La heregulina o los anticuerpos ordinariamente se almacenarán en forma liofilizada o en solución. Las composiciones de heregulina o anticuerpos terapéuticos en general se colocarán en recipientes que tienen un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o una ampolleta que tenga un extremo horadable por una aguja de inyección hipodérmica. La ruta de administración de la heregulina o de los anticuerpos es de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, la administración por inyección o infusión al oído interno, o las rutas intralesionales, o mediante sistemas de liberación sostenida como se observa más adelante. El ligando de heregulina se puede administrar continuamente mediante infusión o por inyección de bolo. Un anticuerpo agonista se administra preferiblemente de la misma manera. La heregulina, la variante de heregulina o fragmento y anticuerpos aognistas se pueden secar por rocío o secar por congelación y rocío utilizando las técnicas conocidas (Yeo et al. Biotech, and Bioeng., 41:341-346 (1993); Gombotz et al, PCT/US90/02451) . Los ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos que contienen la proteína, cuyas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxieti-l-metacrilato) como se describe por Langer et al . , J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982) o poli (vinilalcohol) , poliláctidas (Patente Norteamericana No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al . , Biopolymers, 22: 547-556 (1983) ) , etilenvinilacetato no degradable (Langer et al . , supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable tales como LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (Patente Europea 133,988). Aunque tales polímeros como acetato de etilenvinilo y el ácido ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de las moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización de la proteína dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es una formación intramolecular de enlaces S-S a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando las soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando los aditivos apropiados, y desarrollando las composiciones de matrices poliméricas específicas. Las composiciones de anticuerpo o heregulina de liberación sostenida también incluyen heregulina o anticuerpos atrapados liposómicamente . Los liposomas que contienen heregulina o anticuerpos se preparan por los métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein et al . , Proc. Na f 1 Acad. Sci . USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 11 : 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Solicitud de patente japonesa 83-118008; Patente Norteamericana No. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. De manera ordinaria los liposomas son de un tipo unilaminar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en los cuales el contenido de lípidos es mayor que aproximadamente 30% mol. de colesterol, la proporción seleccionada se ajusta para una terapia de heregulina óptima. Los liposomas con el tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente Norteamericana No. 5,0131,556. De acuerdo con esto, los métodos y composiciones de la invención encuentran uso para la prevención y tratamiento de las infecciones oportunísticas en animales y en el hombre las cuales están inmunosuprimidas como resultado de ya se al inmunodeficiencia congénita o adquirida o como un efecto colateral del tratamiento quimioterapéutico. De acuerdo con una modalidad alternativa de la presente invención, una composición de la invención se utiliza ventajosamente en combinación con un agente antimicrobiano para proporcionar los métodos y composiciones mejorados para evitar y/o padecimientos inducidos por la bacteria gram positiva que incluyen, pero no están limitadas a Escherichia coli, Bacterium enteritis, Francisella tularensis; bacterias rápidas acidas que incluyen pero no están limitadas a Mycobacterium tuberculosis, y Mycobacterium leprae. El uso de una combinación de un agente antimicrobiano junto con una composición de la invención es ventajosa con las aminoglicosidasa antibacterianas tales como gentamicina, estreptomicina, y similares los cuales se conocen por tener una otoxicidad seria; que reducen el uso de tales agentes microbianos. El uso de una composición de la invención en combinación con tales agentes permite una dosificación inferior de los agentes antimicrobianos tóxicos mientras que se logra una efectividad terapéutica (antibacteriana) . En algunas modalidades la composición de la invención se co-administra con ototoxinas. Por ejemplo, se proporciona un método mejorado para el tratamiento de la infección de un mamífero mediante la administración de un antibiótico de aminoglicosida, la mejora comprende administra una cantidad terapéuticamente efectiva de heregulina o agonista, al paciente en necesidad de tal tratamiento para reducir o prevenir el daño al oído inducido por ototoxinas asociado con los antibióticos. En otra modalidad se proporciona un método mejorado para el tratamiento del cáncer en un mamífero mediante la administración de un compuesto quimioterapéutico, la mejora comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención al paciente en necesidad de tal tratamiento para reducir o prevenir el daño al oído inducido por las ototoxinas, asociado con el fármaco quimioterapéutico. También se proporcionan aquí los métodos para promover las nuevas células pilosas del oído interno induciendo la proliferación, regeneración, o crecimiento de las células de soporte del oído interno durante, antes, o después de la exposición a un agente o efecto que es capaz de inducir un daño o padecimiento auditivo o del equilibrio. Tales agentes y efectos son aquéllas descritas aquí. El método incluye la etapa de administrar a las células pilosas del oído interno una cantidad efectiva de heregulina o agonista o factor descrito aquí que es útil. Preferiblemente, el método utilizado durante, previo a, o después de la exposición a una ototoxina que daña la audición. En una modalidad, los métodos de tratamiento se aplican a los daños auditivos que resultan de la administración de un agente quimioterapéutico para tratar su efecto colateral ototóxico. Los agentes quimioterapéuticos ototóxicos que se pueden tratar por los métodos de la invención incluyen, pero no están limitados aun agente antineoplástico, que incluye los compuestos de cisplatina o similares a cisplatina, los compuestos de taxol o compuestos similares a taxol, y otros agentes quimioterapéuticos que se cree que causan daños auditivos inducidos por ototoxinas, por ejemplo, vincristina, un fármaco antineoplástico utilizado para tratar las malignidades hematológicas y sarcomas . En una modalidad los métodos de la invención se aplican a los daños auditivos que resultan de la administración de quinina y sus substitutos sintéticos, típicamente utilizados en el tratamiento de malaria, para tratar sus efectos colaterales ototóxicos. En otra modalidad los métodos de la invención se aplican a daños auditivos que resultan de la administración de un efecto diurético para tratar sus efectos colaterales ototóxicos. Los diuréticos, particularmente los diuréticos "de circuito" es decir, aquéllos que actúan primero en el Circuito de Henle, son ototoxinas candidatas. Los ejemplos ilustrativos, no limitantes del método de la invención, incluyen furosemida, ácido etacrínico, y compuestos de mercurio. Los diuréticos se utilizan típicamente para prevenir o eliminar edemas. Los diuréticos también se utilizan en estados no edematosos tales como hipertensión, hipercalcemia, hipercalciuria idiopática y diabetes nefrogénica insípida. En otra modalidad, las composiciones de la invención se administran con un agente que promueve el crecimiento, proliferación, o regeneración de las células neuronales. Como se conoce en la técnica, las bajas concentraciones de gentamicina, preferencialmente matan las células pilosas mientras que el daño de las neuronas de ganglios no es significativa. Sin embargo, altas concentraciones de gentamicina inducen la degeneración de las neuronas de los ganglios así como de las células pilosas. De acuerdo con esto, esta toxicidad dual de los aminoglicósidos se pueden tratar por los métodos de la invención, preferiblemente con composiciones de la invención. La heregulina o los agonistas se administran directamente al paciente mediante cualquier técnica adecuada, que incluyen el método parenteral, intranasal, intrapulmonar, oral o de absorción a través de la piel. Si se administran conjuntamente, no necesitan ser administrados mediante la misma ruta. Se pueden administrar local o sistémicamente. Los ejemplos de administración parenteral incluyen administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, e intraperitoneal, e intracoclear . Se pueden administrar por inyección subcutánea diariamente. Se pueden administrar por implantes. Se pueden administrar en gotas líquidas al canal del oído, suministradas en la cámara del tímpano escalar del oído interno, o proporcionar como un miembro difusible de un implante auditivo coclear. La heregulina o agonista del anticuerpo, se puede combinar y administrarse directamente al mamífero mediante cualquier técnica adecuada, que incluyen la infusión y la inyección. La ruta específica de administración, dependerá, por ejemplo, de la historia médica del paciente, que incluye cualquier efecto colateral percibido o anticipado utilizando la heregulina sola, y el padecimiento particular que va a ser corregido. Los ejemplos de administración parenteral incluyen la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, e intraperitoneal. Más preferiblemente, la administración es mediante infusión continua (utilizando, por ejemplo, dispositivos o minibombas tales como bombas osmóticas o parches en la piel) , o mediante inyección (utilizando, por ejemplo, medios intravenosos o subcutáneos) . La administración también puede ser como un bolo simple o por la formulación de depósito de liberación lenta. Los agonistas se administran en una forma aguda o crónica, como se puede requerir, para aplicaciones profilácticas y terapéuticas, mediante un número de rutas que incluyen: inyección o infusión mediante administración intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraarterial, subcutánea, o rutas intralesionales, la administración tópica, oralmente si se emplea una molécula pequeña activa, utilizando los sistemas de liberación sostenida como se nota más adelante, o mediante un catéter implantando una administración continua tales como una bomba, mediante un parche, o por sistemas de implante, por ejemplo, la implantación de un vehículo de liberación sostenida o células inmuno-aisladas que secretan los factores de crecimiento y/o las neurotrofinas . Los agonistas se administran continuamente mediante infusión o por una inyección de bolo periódico si la velocidad de eliminación es suficientemente lenta, o mediante la administración en la corriente sanguínea, linfa, CNS o fluido espinal. Un modo de administración preferido es directamente a la porción afectada del oído o vestíbulo, tópicamente como por medio de un implante por ejemplo, y, preferiblemente a las células pilosas afectadas, sus células de soporte, y (opcionalmente a) neuronas asociadas, a manera de dirigir la molécula a la fuente y minimizar los efectos laterales de los agonistas. Como se nota las composiciones se pueden inyectar a través de cánulas implantadas crónicamente o infusiones crónicas con la ayuda de minibombas osmóticas. Están disponibles las bombas subcutáneas que suministran las proteínas a través de una tubería pequeña al área apropiada. Las bombas altamente sofisticadas se pueden volver a llenar a través de la piel y su proporción de suministro se puede ajustar sin intervención quirúrgica. Los ejemplos de protocolos de administración adecuados y sistemas de suministro que implican un dispositivo de bomba subcutánea o infusión continua a través de un sistema de suministro de fármacos implantados son aquéllos utilizados para la administración de dopamina, agonistas de dopamina, y agonistas colinérgicos a los pacientes de Alzheimer y modelos animales para el padecimiento de Parkinson descrito por Harbaugh, J. Neural Transm . Suppl . , 24: 271-277 (1987) y DeYebenes et al . , Mov. Disord. , 2: 143-158 (1987), las descripciones de las cuales se incorporan aquí para referencia. Se ha considerado que es posible introducir células que produzcan activamente el agonista dentro de las áreas que necesiten de concentraciones incrementadas de agonista. Una cantidad efectiva de la heregulina o de los anticuerpo se que se va a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración y la condición del paciente. También, la cantidad del polipéptido de heregulina será por lo general mayor que la cantidad de un anticuerpo del agonista. De acuerdo con esto, será necesario para el terapista titular la dosis y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una rango de dosificación típicamente diario desde aproximadamente 1 µg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente, típicamente, el médico clínico administrará la heregulina o anticuerpo hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante pruebas clínicas de diagnóstico para el mejoramiento de la audición o del equilibrio.

En una modalidad adicional, las células que soportan el oído interno se pueden obtener o aislar de un tejido de mamífero para obtener una muestra de célula de soporte del oído interno utilizando las técnicas bien conocidas en el arte (biopsia, etc.). Esta muestra se puede tratar entonces con una proteína de heregulina para inducir el crecimiento y/o proliferación de las células pilosas o células de soporte del oído interno en la muestra expandiendo así la población de células que soportan el oído interno. Típicamente, la heregulina se agregará al cultivo de células de soporte del oído interno in vi tro a una concentración de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 nM preferiblemente 1-50 mM. Si se desea, las células primarias de soporte del oído interno se pueden cultivar in vi tro para varias generaciones para expandir suficientemente las células pilosas o la población de células de soporte del oído interno. Las células pilosas o las células de soporte del oído interno se cultiva bajo condiciones adecuadas para el cultivo celular de mamíferos como se discutió arriba. Después de la expansión, la muestra expandida se reintroduce en el mamífero con el propósito de re-epitelializar el tejido de mamífero. Los métodos y procedimientos descritos aquí con respecto al HRG-a o heregulina en general se pueden aplicar de manera similar a otras heregulina tales como HRG-ßl, y HRG-ß2 y HRG-ß3 y a variantes de los mismos, así como los anticuerpos. Todas las referencias citadas en esta especificación se incorporan expresamente como referencia. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no como en forma de limitación. EJEMPLOS Ejemplo 1 Caracterización de los Cultivos de Células de Soporte del Oído Interno Se determinó que las células epiteliales utriculares no disociadas expresan las características de las células epiteliales, pero no aquéllas del fibroblasto, células gliales o neuronales. Las láminas utriculares se prepararon mediante el método de Zheng et al. (Journal of Neuroscience, 17 (21) :8270-82 (1997)) y Zheng et al. (Journal of Neuroscience, 17 (1) : 216-226 (1997)). Los cultivos de láminas utriculares principalmente células de soporte y células pilosas. Las láminas epiteliales utriculares se separaron de ratas Wistar de 3 días después de nacidas (P3) o de 4-5 días utilizando 0.5 g de termolisina (Sigma; en solución salina equilibra libre de magnesio y calcio de Hank) durante 30 min. a 30°C, en base el método reportado previamente (Corwin et al., 1995). Las láminas epiteliales se incubarán entonces en una mezcla de tripsina al 0.125% y colagenasa al 0.125% durante 8 min. a 37 °C. La actividad de la enzima se inactivo con una mezcla de inhibidor de tripsina de soya al 0.005% (Sigma) y DNasa al 0.005% (Worthington) antes de ser pipeteadas hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 mL 10 veces en DNasa al 0.05% en BME. Se utilizó un medio suplementado con suero de' bovino fetal al 5%. La suspensión de células se colocó en placas finalmente en placas de 96 pozos revestidas con polilisina (500 µg/ml) (para ensayos de timidina tritiada) o portaobjetos LabTek de 16 pozos (para un etiquetado con BrdU y otra inmunocitoquímica) en 200 µl de medio que contiene suero (DMEM más suero de bovino fetal, 4.5 mg/ml de glucosa, glutamina 2 mM, 25 ng/mL de fungizona y 10 unidades/mL de penicilina) a una densidad de aproximadamente 70 células/mm . Típicamente, las células preparadas de 4 litros de las crías (40 ratas P3 o P4-5) se igualaron con alícuotas en 80 pozos. Mientras que la mayoría de las células únicas aisladas murieron después de 2 días en el cultivo, los amontonamientos de células que contenían aproximadamente 10-80 células sobrevivieron bien y crecieron en parches en el medio suplementado con suero. El manchado inmunocitoquímico con diferentes tipos de marcadores de células revelaron que estas células cultivadas expresaron los antígenos de células epiteliales que incluyen la proteína ZOl de unión estrecha, F-actina, y citoqueratina. No expresan antígenos para otros tipos de células, tales como la proteína del filamento glial (GFAP) , el antígeno del oligodendrocito (mielina) , la proteína de neurofilamentos o los antígenos de fibroblastos, vimentina, y Thyl.l. Debido a que las láminas epiteliales utriculares contenía principalmente las células de soporte y las células pilosas, la vasta mayoría de la células mitóticas sobrevivientes en los cultivos representan una población de células de soporte utriculares. Ejemplo II Estimulación de la Proliferación de las Células de Soporte y la Generación de Células Pilosas Para examinar sí alguno de los factores de crecimiento conocidos en el presente, estimula la proliferación de las células de soporte utricular y estimula un incremento en el número de células que se dividen, se realizó la inmunocitoquímica con bromo-desoxiuridina (BrdU) como se describe por Zheng et al. (Journal of Neuroscience, 11 ( 1 ) -. 216-226 (1997)). De manera breve, después de 1 día de cultivo, el BrdU (1:400; equipo de proliferación de células de Amersham) se agregó al medio de cultivo durante 24 horas. Los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4% (30 min.), se trataron con HCl 1 N (40 min.), y se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU (Becton-Dickinson, 1:40 en solución salina amortiguada con fosfato que contenía Triton-X100 al 0.1%) durante toda la noche a 4°C. Los cultivos se procesaron entonces con un equipo Vector ABC. Después de la reacción con diaminobenzidina-peroxidasa, las células- de deshidrataron con etanol, se limpiaron en Histoclear (American Histology) y se montaron en Permount (Fisher). Se contabilizaron las células positivas con BrdU a partir de las áreas completas de 10 ó más pozos de cultivo para cada uno de los grupos experimentales. Los datos se expresaron como uña media ± s.e.m. Se utilizó la prueba t desapareada para el análisis estático. Un número mucho más grande de células positivas BrdU se observan en los cultivos que contienen heregulina (HRB-ßl-177-244) que en' cualquier otro de los factores conocidos que activan los receptores Her. Los conteos Cell realizadas de los cultivos de control y los que contienen cultivos confirmaron que la heregulina significativamente mejora la proliferación de las células de soporte utricular (p <0.0001, Figura 9). La IGF-1 a 100 mM, la TGF-a a 100 mM (R & D Systems), EGF 100 mM (Collaborative Research), SMDF a 100 M, celulina ß a 100 mM, neuregulina 3 a 20 mM, HB-EGF a 100 mM (Elenius et al., EMBO Journal 16 (6) : 1268-78 (1997)), y la proteína enlazada a la IGF-1 a 100 mM fueron mitógenos más débiles, si en todas, comparados con la heregulina, se preparan los polipéptidos SMDF como se describe en WO 96/15244. La neuregulina-3, una proteína enriquecida con tejido neural que se enlaza y activa la erbB4, se prepara como se describe en Zhang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 94 (18) : 9562-7 (1997). La celulina ß se preparó como se describe en Daly et al., Cáncer Research 57 (17) : 3804-11 (1997). El dominio similar al EGF de HRGßl(?77-2 ) se expresó en E. coli , se purificó y se radioyodó como se describe previamente (Sliwkowski et al . J. Biol . Chem . 269:14661-14665 (1994)). Todos los factores se agregaron a los cultivos al tiempo que las células se colocaron en placas. Para determinar sí el efecto de la heregulina fue dependiente de la dosis, se realizo un estudio dependiente de la dosis en los cultivos de las láminas epiteliales utriculares en un rango de heregulina 0.03 mM a 10 mM (Figura 10) . Se observó el incremento dependiente de la dosis de heregulina en el número de células positivas con BrdU. El efecto máximo de la heregulina se observó a 3 mM. Ejemplo III Estimulación de la Proliferación de las Células de Soporte y la Generación de Células Pilosas en los Cultivos de Fragmentos Escindidos del Tejido del Utrículo Un cultivo del fragmento escindido del utrículo de organotipo que utiliza la matriz de colágeno 3-D se cultiva y se mantiene en su condición normal, la arquitectura in vivo se prepara como se describe en Zheng et al. (Journal of Neuroscience, 17 (21) : 8270-82 (1997)). Este sistema proporciona un medio excelente para probar el efecto de la heregulina en la proliferación de las células de soporte en un sistema significativamente fisiológico que imita el estado in vivo. En particular, se examinaron los efectos de la heregulina después del daño inducido ototóxico (por ejemplo gentamicina antibiótica) . El utrículo se disectó con el ganglio vestibular unido de las ratas Wistar P3 y se cultivo en gel de colágeno tri-dimensional ("3-D") en un medio libre de suero. En una modalidad una gota (20 µl) de gel de colágeno preparado recientemente que se colocó en el fondo de un plato de cultivos de tejido Nunc de 35 mm, se modificó a partir de aquélla previamente descrita (Gao et al . Neuron 6:705-715 (1991)) como sigue. Se mezcló el colágeno de la cola de la rata (tipo I, Collaborative Research) con el medio BME lOx y carbonato de sodio al 2% en una proporción de 10:1:1 y se colocó en hielo justo antes de su uso. La matriz de colágeno que contiene el fragmento escindido del utrículo se incubó a 37 °C durante 5-10 minutos hasta gelificación. Entonces se cultivo la matriz en un medio libre de suero, definido, utilizando un medio suficiente para cubrir el fragmento escindido (2 mL del medio libre de suero (BME más suplemento libre de suero (Sigma 1-884), BSA al 1%, glutamina 2 mM, y 5 mg/mL de glucosa; que no contiene antibióticos) . El medio de cultivo se cambió un día si y un día no, posteriormente. La impregnación de los fragmentos escindidos del utrículo en el colágeno 3-D fue lo mejor para mantener su arquitectura normal en lugar de haciendo flotar los fragmentos escindidos o colocar los fragmentos escindidos en un substrato de monocapa, puesto que el tejido de los fragmentos escindidos podría mantener sin doblez la migración celular fuera del tejido se podría limitar. El fragmento escindido del utrículo completo montado en cultivos se mantuvo en una arquitectura normal en el gel de colágeno 3-D como se observa por las fotografías de Normarski del tejido del utrículo disectado de las ratas P3 y se hizo crecer durante 2 días in vi tro con aumentos bajos y altos. Las células pilosas en los fragmentos escindidos de tejido crecieron bien y mantuvieron su conectividad normal. Las células pilosas permanecen en sus localizaciones normales. No ocurrió una muerte de las células más grandes de las células pilosas bajo estas condiciones de cultivo. Los cultivos de órganos del montaje complejo se cultivaron 1-2 días después de obtener el fragmento escindido, luego se trataron con heregulina (3 nM) durante 11 días en la presencia de timidina tritiada. Para determinar el número de células etiquetadas se fijo el tejido, se seccionó y se proceso para autoradiografía. En respuesta a la inmunoglobulina, los cultivos se compararon a los cultivos de control, se observó un incremento en el número de células etiquetadas con 3H-timidina en tanto la capa de las células de soporte (SC) y la capa de células pilosas (HC) se observó como se muestra en las Figura 11A-D, la cual representa muestras tratadas de manera similar. El conteo de las células etiquetadas con 3H-timidina tanto en la capa de células de soporte como en la capa de células pilosas incrementó significativamente comparada con los cultivos de control que carecen de heregulina como se muestra en la Figura 12. Los datos son consistentes con los datos obtenidos en los cultivos de lámina utriculares. Y los datos indican que la heregulina puede actuar para incrementar la proliferación de las células de soporte del oído interno, lo cual lleva a la generación de células pilosas, en casos después del daño o heridas de las células pilosas . EJEMPLO IV La Heregulina Actúa a través del Receptor Her2 Para proporcionar evidencia adicional de que la heregulina es un factor relevante fisiológicamente y que actúa a través de un receptor relevante fisiológicamente, los niveles de expresión del ARNm de la heregulina y sus receptores Her2, Her3 y Her4 en las capas de células pilosas y células de soporte del epitelio sensorial utricular de la rata. Se extrajo el ARN a partir de cultivos de láminas del utrículo P3 y también de las células UEC4 (una línea de las células de soporte del oído interno) . Utilizando el análisis de PCR TaqMan con cebadores específicos del gen apropiados (Heid et al., Genome Research. 6(10): 986-94 (1996)). Se observó que los cuatro se expresaron en el oído interno, sin embargo, la heregulina y la Her2 se expresaron en un nivel más alto que la Her3 ó la Her4 (ver la Figura 13) . La Her4 no se expresó en la línea de células de soporte del oído interno. Para determinar que la Her2 se expresó efectivamente en el nivel de proteínas y para confirmar su localización, se localizó el anticuerpo monoclonal anti-Her2 etiquetado fluorescentemente para inmunoteñir la cóclea de la rata P9 (día cero) y el utrículo del adulto. La Her2 se localizó en las células pilosas y en las capas del epitelio sensorial de las células de soporte en el oído interno (ver la Figura 14 A (cóclea) y la Figura 14B (utrículo) ) . Los anticuerpos monoclonales anti-HER2 2C4 y 4D5 han sido descritos en otra parte (Fendly et al . Cáncer Research 50:1550-1558 (1990)). Consistente con esta observación es que el inmunoteñido con un anticuerpo de heregulina sugiere que la heregulina se expresa mediante las células pilosas del oído interno. Además de los anticuerpos monoclonales neutralizantes contra Her2, pero sin la adición de la inmunoadhesina Her4-IgG, en las cantidades de saturación para los cultivos utriculares, se bloquearon los efectos de la heregulina. Así, la heregulina estimula la proliferación de las células de soporte y de aquí la generación de nuevas células pilosas activando una vía de señalización mediada por Her2, pero no una vía mediada por Her4. Además, los experimentos preliminares en cultivos de fragmentos escindidos de tejido de la oído de la rata muestran que la heregulina afecta la diferenciación de las células pilosas mejorando la proliferación de los progenitores de las células pilosas. Los cultivos de otocistos E14 de rata tratados con heregulina responden con un incremento en el número de células progenitoras de las células pilosas comparados a los cultivos no tratados. Esto es consiste con los estudios de tejido, que indican que la heregulina estimula la proliferación de células que se diferencian en células pilosas. Ejemplo V La Heregulina Actúa In vivo para Mejorar la Proliferación de las Células de Soporte del Oído Interno y la Generación de Células Pilosas Después de las Heridas Ototóxicas y el Daño Acústico Las chinchillas son un modelo aceptado para probar los efectos de los factores y agentes contra o después del daño o heridas de células pilosas. Las chinchillas se pueden tratar con la gentamicina, caboplatina o trauma acústico '. Preferiblemente, al menos cinco chinchillas están en cada una de las pruebas y los grupos de control. El grupo de control se trata con el agente ototóxico o con el daño acústico y se les deja recuperar. Típicamente, de cuatro a seis semanas es suficiente para la recuperación. El grupo de prueba se trata con heregulina además de las heridas. Todos los animales reciben BrdU, preferiblemente infusión subcutánea utilizando minibombas, para etiquetar las células que se dividen durante el periodo de tratamiento. La heregulina, o uno de los factores de heregulina como se enseña aquí, se administrarán al oído interno. Se pueden utilizar minibombas. La heregulina se puede administrar por infusión en la cóclea. Después del periodo de tratamiento se disectan la cóclea y la mácula utricular fuera de los animales. El tejido se fija y se hace la etiquetación inmunohistoquímica con BrdU. Se contabilizan las células etiquetadas con BrdU en el epitelio sensorial del oído interno. Los conteos celulares de los dos grupos se comparan y se analizan estadísticamente para determinar la cantidad de mejoramiento de la proliferación de las células de soporte y la generación de nuevas células pilosas inducidas por el tratamiento de heregulina.

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Hear. Res. 65:69-78. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención co o antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- Un método para inducir la generación de las células pilosas o el crecimiento, regeneración, y/o proliferación de células de soporte del oído interno, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula de soporte del oído interno que expresa los receptores HER2 y/o HER3 con una cantidad efectiva de un ligando aislado que activa los receptor HER2 y/o HER3 o una combinación de los mismos .
2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando activante es un polipéptido de lieregulina, una variante de heregulina, un anticuerpo agonista de heregulina o un fragmento del mismo capaz de enlazarse al receptor HER2 o HER3.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ligando activante es heregulina humana o un fragmento de la misma.
4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ligando activante se selecciona del grupo que consiste de HRG-a, -ßl, ß2, similar a ß2 y -ß3 y fragmentos de los mismos.
5.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ligando activante es ?-HRG o un fragmento del mismo.
6.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ligando activante es heregulina humana recombinante o un fragmento del mismo.
7.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula de soporte es un implante de coclear.
8. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando activante se administra en una dosis diaria de aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ligando activante es un implante de coclear.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el contacto es mediante la administración a un paciente en necesidad del mismo.
11.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la heregulina es rHRG-ßl-177-244.
12.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula de soporte del oído interno es el utrículo o la cóclea.
13.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula de soporte del oído interno expresa HER2, HER3, ó ambos.
14.- Un método para incrementar el número de células de soporte del oído interno, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ligando activante HER2 y/o HER3.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando activante es un polipéptido de hereguliná, una variante de heregulina, un anticuerpo agonista de heregulina o un fragmento del mismo capaz de enlazarse al receptor HER2 y/o HER3.
16.- Un método para tratar un padecimiento auditivo relacionado con las células pilosas, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo a un paciente del mismo una cantidad efectiva de un ligando activante de HER2 y/o HER3.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ligando activante es un polipéptido de heregulina, variante de heregulina, anticuerpo del agonista de heregulina o fragmento del mismo capaz de enlazarse al enlace del receptor HER2 y/o HER3.
18.- Un método, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de células de soporte del oído interno de un mamífero; (b) poner en contacto la muestra con'- un ligando que activa al HER2 o HER3 o una combinación de los mismos para inducir el crecimiento y/o proliferación de las células de soporte del oído interno en la muestra y obtener una muestra expandida; y (c) volver a introducir la muestra expandida en el mamífero.