MXPA01003840A - Vectores virales selectivamente replicantes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a virus recombinantes que replican el genoma viral selectivamente en respuesta a las condiciones intracelulares de la célula objetivo a través del uso de un promotor de respuesta a la vía que inhibe substancialmente la replicación viral en la célula huésped con base en el fenotipo o genotipo de la célula infectada;en la célula objetivo, el elemento promotor del promotor de respuesta a la vía es inactivo y por lo tanto el virus puede replicarse;esto da como resultado:(1) la muerte de las células debido a la naturaleza lítica natural del virus, y/o (2) provee una dosis terapéutica de un producto transgénico (amplificado en comparación con los vectores de replicación incompetente) para la célula objetivo, y (3) produce una concentración localizada del virus lo cual facilita la infección de las células circundantes para el virus recombinante;la invención provee además métodos terapéuticos y de diagnóstico de uso de los vectores, formulaciones farmacéuticas que comprenden los vectores, métodos para hacer los vectores y las células transformadas que comprenden los vectores.

Description

VECTORES VIRALES SELECTIVAMENTE REPLICANTES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los adenovirus recombinantes se usan actualmente para la administración de transgenes terapéuticos en una variedad de regímenes terapéuticos. Sin embargo, el amplio rango de infectividad de estos sistemas vectores ha creado preocupación en el sentido de que la expresión de los virus en células no tumorales podría causar daños colaterales en las células no neoplásticas. Por consiguiente, se ha desarrollado un amplio rango de sistemas "targeting" (objetivo) para expresar preferencialmente el transgen en un tipo de célula determinado. Los promotores específicos de tejidos y específicos de tumores han sido empleados para replicar preferiblemente el vector en ciertos tipos de células. Por ejemplo la solicitud de patente internacional No. PCT/US96/10838 publicada el 16 de enero de 1997 (Publicación Internacional No. WO97/01358 describe el uso de vectores que se replican en una célula huésped específica mediante el uso de elementos promotores específicos de próstata que impulsan las funciones E1 , E2 o E4, que contienen opcionalmente un cassette de expresión transgénica citotóxica. En particular esta publicación describe una construcción en la cual el mejorador específico de próstata controla la expresión de E1 y tiene el cassette de expresión que comprende el promotor CMV que dirige la expresión del gen de citosina desaminasa que es insertado en la región E3.

Estos vectores son competentes para la réplica y son capaces de cargarse en viriones intactos en un tipo de célula particular. Una realización alternativa para el uso de promotores específicos de tumores para dirigir la réplica viral consiste en emplear deleciones específicas en la proteína E1b 55K adenoviral que codifica la secuencia. Los adenovirus recombinantes que contienen defectos en la secuencia nucleotídica que codifica E1 b 55K han sido descritos en la patente norteamericana No. 5,677,178, concedida el 14 de octubre de 1997. Sin embargo, estos elementos de control específicos de tumores o de tejidos han demostrado que son "permeables", es decir permiten la réplica en tipos de células distintos de las células objetivo preferidas. Una alternativa para este tipo de vector selectivamente replicante es el empleo de un vector adenoviral deficiente de réplica que contiene una extensiva eliminación de la función E1. En particular los vectores que contienen la eliminación de E1 , E2, E3 y deleciones E4 parciales han sido empleadas para liberar transgenes exógenos. Dichos vectores han sido empleados para liberar el gen p53 a las células objetivo. Se ha demostrado que la expresión de un p53 de tipo silvestre exógenamente administrado en una célula tumoral p53 deficiente (p53 mutado o p53 nulo), es capaz de inducir apoptosis intermediada por p53 en la célula tumoral. Dichos vectores virales para la administración de p53 son actualmente desarrollados por Schering Corporation e Introgen Corporation. Nuevamente estos vectores han demostrado que tienen perfiles toxicológicos aceptables y eficacia terapéutica para aplicaciones terapéuticas humanas y que están en las pruebas clínicas de Fase II para el tratamiento de tumores malignos relacionados con p53. Los vectores selectivamente replicantes y deficientes de réplica tienen, por lo menos en teoría, inconvenientes de diseño que constituyen a menudo un inconveniente para los clínicos. Debido a que los vectores deficientes de réplica no se propagarán en forma descontrolada en el paciente, teóricamente tienen un perfil de seguridad más atractivo. Sin embargo, debido a que una eficaz eliminación de tumores requiere la infección de la substancial mayoría de células tumorales que están infectadas, se usa comúnmente un exceso molar substancial de vector para asegurar eficacia terapéutica. Se observó que los vectores selectivamente replicantes constituyen más de una solución de una perspectiva de seguridad debido a su capacidad para replicarse y para mutar potencialmente para formar vectores competentes totalmente replicantes en el paciente. Sin embargo manteniendo la natural capacidad de propagación del virus bajo condiciones particulares se permite que estos vectores se diseminen en las células tumorales circundantes. Debido a que los vectores por sí mismos son capaces de replicarse, se requiere una dosis inicial inferior de dichos vectores. Esto es favorable desde una perspectiva inmunológica así como también por razones económicas en la manufactura de dichos agentes. Por lo tanto existe la necesidad en la técnica de replicar selectivamente un vector que resuelva los problemas de seguridad percibidos y que al mismo tiempo provea un aumento del índice terapéutico.

La presente invención resuelve estos problemas al proveer un vector adenoviral selectivamente replicante que contiene un promotor de vía que responde a la vía objetivo que dirige la expresión de un represor de réplica viral de modo que el vector se replica preferiblemente en células defectuosas en la vía. La presente invención provee también formulaciones farmacéuticas que comprenden dichos vectores. La presente invención provee también métodos para eliminar células defectuosas de vía de una población de células normales mediante el uso de dichos vectores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende virus recombinantes que replican el genoma viral selectivamente en respuesta a las condiciones intracelulares de la célula objetivo a través del uso de un promotor que responde a la vía que dirige la expresión de un inhibidor de réplica virar que inhibe substancialmente la réplica viral en la célula huésped basándose en el fenotipo o genotipo de la célula infectada. En la célula objetivo, el elemento promotor del promotor que responde a la vía es inactivo y por lo tanto se permite que el virus se replique. Esto da como resultado: (1 ) la muerte de las células mediante la naturaleza lítica natural del virus, y/o (2) provee una dosis terapéutica de un producto transgénico (amplificado en comparación con los vectores de réplica incompetente) para la célula objetivo y (3) produce una concentración localizada del virus que facilita la infección de las células circundantes al virus recombinante. La invención provee además métodos terapéuticos y de diagnóstico del uso de vectores, formulaciones farmacéuticas que comprenden los vectores, métodos para preparar los vectores y las células transformadas que comprenden los vectores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Se generaron resultados del ensayo de CPE para determinar el efecto citopático de los vectores adenovirus recombinantes que codifican la secuencia codificadora de fusión E2F-Rb bajo el control de cualquiera del promotor que responde a la vía TGF-ß (PAI o SRE) o el promotor que responde a la vía p53 (RGC o p53CON). Además, el yen que codifica la proteína fluorescente verde fue también incorporado a los vectcres como informante. El panel A representa las células MRC-9, el panel B representa las células Hep3B, y el panel C representa las células WIDR. Franja 1 : adenovirus recombinante deficiente de réplica (E1 delecionado) que expresa la proteína fluorescente verde (GFP); Franja 2: PAI-Ad; Franja 3: SRE-Ad; Franja 4: RGC-Ad; Franja 5: p53CON-Ad. Las concentraciones de partículas son tal como se han indicado a la derecha de la figura. Figura 2: Resultados de microscopía de fluorescencia (paneles superiores) que ilustran la expresión de GFP con vectores dirigidos a la vía. El panel A representa el vector de control GFCB, el panel B representa el vector SRE-Ad y el panel C representa el vector p53CON-Ad. La infección era a razón de 5 x 105 partículas por mililitro. Figura 3: Resultados de la infección de las células epiteliales bronquiales normales (Panel A) y células C33A (Panel B) con los virus recombinantes U3EE (cuadros), T1 LT (círculos) y L9IU (triángulos). Los ejes verticales representan el porcentaje de controles no infectados y los ejes horizontales representan la dosis viral en partículas por mililitro. Los experimentos se llevaron a cabo exponiendo un cultivo de cada célula a seis concentraciones diferentes de virus de 105 a 109 de partículas virales por mililitro. Las células se expusieron al virus por un período de una hora, se lavó el exceso de virus y el porcentaje de células viables a los 6 días deepués de la infección se determinó mediante el ensayo MTS (Promega, Madison Wl) en substancial acuerdo con las instrucciones del fabricante. La línea horizontal representa el nivel al cual permanecieron viables el 50% de las células. La intersección de las curvas generadas por los datos y las líneas de puntos horizontales constituyen una medida de la ED50 del virus.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un virus recombinante selectivamente replicante que comprende un promotor que responde a una vía ligado operativamente a un represor de réplica viral.

El término "selectivamente replicante" se refiere a un vector que es capaz de réplica preferencial en una célula en un estado fenotípico en relación con otro estado fenotípico. Ejemplos de diferentes estados fenotípicos incluirían una célula defectuosa de vía versus una célula normal de un tipo de célula determinado. Un virus que exhibe réplica preferencial indica que el virus se replica por lo menos cinco veces tan eficientemente en el tipo de célula objetivo con relación a la célula normal (de control) del mismo tipo a un nivel de dosis determinado. Para determinar si un virus es verdaderamente selectivo, es necesario evaluar la capacidad del virus para replicarse en las células objetivo en comparación con células normales del mismo tipo de célula con respecto a una variedad de factores. Se prefiere comparar la capacidad de un vector determinado para replicarse en una célula objetivo que contenga la condición que pueda ser empleada como objetivo y una célula normal del mismo tipo que no posea esta condición. Por ejemplo, la primera etapa después de la infección viral consiste en inducir a la célula para que entre al ciclo celular debido a que los factores esenciales para una máxima eficiencia de réplica viral están presentes únicamente en la fase S. Sin embargo, si se intentara evaluar la selectividad de un vector para su selectividad en células tumorales, la evaluación de la capacidad para replicarse en una célula tumoral con relación a otra célula que ya ha entrado en el ciclo celular (tal como una línea de célula inmortalizada o transformada), la selectividad del virus para las células tumorales quedará en cierto grado oscurecida. Adicionalmente se ha observado que diferentes tipos de células poseen infectilidades que difieren ampliamente de un virus determinado. Aunque algunos virus tales como adenovirus poseen un amplio tropismo tisular, otros virus están más restringidos al tipo de células que infectan. Mediante el intento de evaluar el rendimiento de un vector determinado en células de infectilidades que difieren ampliamente, será difícil verificar si se debe la falta de efecto al comportamiento del vector dentro de la célula o simplemente falla totalmente el virus en infectar la célula. Mediante la evaluación de la selectividad en las células objetivo y las normales de un tipo determinado, se minimiza este efecto de infectilidad. La naturaleza temporal del ciclo de vida viral también debe ser tenida en cuenta. Por ejemplo, incluso un vector de tipo silvestre puede aparentar poseer selectividad en células tumoraíes con relación a células normales tempranamente después de la infección debido que la célula está en el ciclo. Sin embargo esta aparente selectividad disminuye a lo largo del tiempo una vez que el virus ha estimulado el ciclo celular. Por consiguiente el tiempo en el cual se evalúa la selectividad después de la infección debe ser suficiente para evitar este retardo de réplica inicial en células normales. Aunque esto variará según el tipo de virus que se emplee, este retardo inicial puede ser fácilmente determinado por un experto en la técnica. El efecto de la dosis debe considerarse también en la determinación de si un adenovirus recombinantes determinado demuestra un efecto selectivo en el tipo de célula objetivo. Por ejemplo, si el objetivo es la eliminación de las células tumorales y la medición del efecto mediante la citotoxicidad, puede aparentar que un virus tiene citotoxicidad selectiva en diferentes dosis. Se ha observado que con una dosis suficientemente alta casi cualquier virus independientemente del grado en que ha sido modificado su genoma será citotóxico debido simplemente a los efectos de la presencia de las proteínas virales (tal como hexon en el caso de adenovirus), que se sabe que es citotóxico, de manera similar, aún a pesar de que la literatura científica puede referirse a un virus como "defectuoso de réplica" (lo cual sugiere que el virus es absolutamente incapaz de replicarse en ausencia de una línea celular capaz de complementar el defecto viral), dichos virus se describirían en forma más exacta como "de replica atenuada". Por ejemplo, los adenovirus que contienen una deleción de la región e entera que se define frecuentemente como "deficiente de réplica" o "defectivo de réplica" se replicará hasta cierto grado particularmente en células que se dividen en ciclos o rápidamente. Tal como observó Mulligan (1990, Science 260:926-932): Aunque la expresión de la región E1 ha demostrado que afecta la expresión de otros productos génicos virales necesarios para la réplica (citando Horwitz, m, in Virology, B.N. Fields Ed. (Raven, Nueva York, 1990= Capítulo 60), la expresión génica E1 requerida para réplica viral no parece ser absoluta. La precoz caracterización de los virus E1 deficientes demuestra que a elevadas multiplicidades de infección, la región E1 fue dispensable por réplica (citando Jones y Shenk (1979) PNAS (EUA) 76 (8):3665-3669).

Por consiguiente el efecto de la dosis viral no puede ser ignorado cuando se determina si un virus es o no replicante de manera selectiva. Un medio para evaluar la selectividad de réplica de un virus para las células objetivo consiste en evaluar el "índice de selectividad" del virus de la manera siguiente. El parámetro ED50 comúnmente usado (que se define como la dosis suficiente para inducir la muerte de las células en 50% de las células) provee una base de comparación apropiada la ED o de un virus puede ser fácilmente determinada mediante experimentos de escalación de dosis in vitro típicos. Para asegurar una base más consistente de comparación, la ED50 se expresa más apropiadamente en relación con un control viral para minimizar los efectos de las variaciones de infectilidad ente los tipos de células que se comparan y cualquier variación del ensayo. Por consiguiente, la relación sin unidad: ED5o(virus)/ED5o(control) se usa para expresar la toxicidad relativa del virus en las células, y se denominará, como índice de "toxicidad relativa" o "RTI". El "índice de selectividad" de un virus determinado se expresa mediante la relación: RTI(células objetivo)/RTI(células normales). Los vectores que se replican selectivamente poseen un índice de selectividad de por lo menos 10 peor preferiblemente 50, 100 o más. Por ejemplo la selectividad de los vectores adenovirales replicantes U3EE y T1 LT está diseñada para lograr réplica selectiva y para matar las células tumorales que tienen los defectos de vía p53. El U3EE se prepara substancial con las enseñanzas con los ejemplos presentes.

Resumiendo el virus U3EE contiene un primer cassette de expresión que comprende un elemento de respuesta p53 (p53 CON) que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb. La proteína de fusión E2F-Rb es un potente inhibidor de la actividad promotora adenoviral E2 y su presencia en la célula suprime en forma eficaz la réplica viral. El elemento de respuesta p53 es activo en respuesta a la presencia de una vía p53. Por consiguiente en células normales donde la vía p53 es intacta, el virus U3EE expresará la proteína E2F-Rb y el virus no se replicará. Sin embargo, en células que tienen el defecto de vía p53 (que son la mayoría de las células tumorales), el elemento de respuesta p53CON no es activo y por lo tanto no hay ninguna represión de réplica viral. El vector U3EE contiene también un cassette de expresión que comprende el motor MLP que dirige la expresión del gen pro-apoptótico Ad5 E3-10.5K. El uso de los promotores temporales (tales como el promotor MLP) se prefiere cuando se emplean genes pro-apoptóticos debido a que se desea facilitar la réplica del ADN viral dentro de la célula objetivo antes de activar la señal pro-apoptótica. El promotor MLP es activado aproximadamente 7 horas después de la infección a continuación de la iniciación si la réplica del genoma U3EE induce de este modo la actividad de la proteína E3-10.5K. El vector adenoviral TILT es esencialmente el mismo que el vector U3EE excepto que contiene una deleción adicional en la región E1a para eliminar los aminoácidos 4-25 de las proteínas E1a adenovirales 243R y 289R. Esta deleción interrumpe la capacidad de la proteína p300 para unirse a estas proteínas E1a.

Los virus U3EE y T1LT fueron evaluados para determinar la capacidad de replicarse y matar células epiteliales bronquiales humanas (NHBE) y C33A (una línea de célula tumoral epitelial que tiene una vía defectuosa p53) usando el vector L91 U como control. El resultado de estos experimentos se presenta en la figura 3 de los dibujos que se acompañan. El siguiente cuadro resume los datos presentados: CUADRO 1 Resumen de RTI e índices de Selectividad de los Virus Tal como puede observarse por los datos presentados, los virus U3EE y T1LT poseen alta selectividad para las células tumorales. Tal como se discutió previamente, el virus L9IU posee una leve ventaja de réplica en las células tumorales del ciclo en relación a las células normales quiescentes. Comparando las relaciones de ED50(virus)/ED5o(control) en cada uno de los tipos de células antes de calcular el índice de selectividad, se minimizan los efectos de dichas variaciones. El término "recombinante" se refiere a un genoma que ha sido modificado a través de técnicas de ADN recombinante convencionales.

El término "virus" se refiere a cualquiera de los parásitos ¡ntracelulares obligados que no tienen un mecanismo sintetizador de proteína o generador de energía. El genoma viral puede ser un ARN o ADN contenido con una estructura recubierta de proteína de una membrana de lípidos. Ejemplos de los virus que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen baculovirídiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herepesviridiae, poxviridíae, adenoviridiae, picotrnaviridiae. El término virus recombinante incluye virus quiméricos (o incluso multiméricos, es decir vectores construidos usando secuencias codificadoras complementarias de más de un subtipo viral). Ver, por ejemplo Feng y otros, Nature Biotechnology 15:866-870. El término "adenovirus" es sinónimo del término "vector ade.ioviral" y se refiere a los virus de los géneros adenoviridiae. El término adenoviridiae se refiere colectivamente a adenovirus animales del género mastadenovirus que incluyen pero no están limitados a subgéneros de adenovirus humanos, ovinos, bovinos, equinos, caninos, porcinos, murinos y de simios. En particular los adenovirus humanos incluyen los subgéneros A-F así como también los serotipos individuales de los mismos incluyendo los serotipos individuales y los subgéneros A-F pero sin limitar los tipos de adenovirus humanos 1 , 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , (Ad11A y Ad 11 P), 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 19a, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 91. El término adenovirus bovinos incluye pero no está limitado a los tipos de adenovirus 1 , 2, 3, 4, 7 y 10. El término adenovirus canino incluye pero no está limitado a los tipos caninos 1 (cepas CLL, Glaxo, RI261 , Utrect, Toronto 26-61 ) y 2. El término adenovirus equino incluye pero no está limitado a los tipos 1 y 2 equino. El término adenovirus porcinos incluye pero no está limitado a los tipos porcinos 3 y 4. En la práctica preferida de la invención el adenovirus deriva de los serotipos de adenovirus humanos 2 o 5. El término "promotor que responde a la vía" se refiere a las secuencias de ADN que se adhieren a ciertas proteínas y que hacen que los genes vecinos respondan transcripcionalmente a la adhesión de la proteína en las células normales. Dichos promotores pueden generarse mediante la incorporación de elementos de respuestas que son secuencias a las cuales se adhieren los factores de transcripción. Dichas respuestas son generalmente inductivas aunque existen varios casos en los que los niveles de proteína crecientes disminuyen la transcripción. Los promotores de respuesta a la vía pueden ser naturales o sintéticos. Los promotores de respuesta a la vía están típicamente construidos con referencia a la vía o una proteína funcional que está dirigida. Por ejemplo un promotor que responde a la vía p53 natural incluiría elementos de control transcripcional activados por la presencia de p53 funciona tal como el promotor bax o p21. Alternativamente, los promotores sintéticos que contienen sitios de adhesión p53 cadena arriba de un promotor mínimo (por ejemplo la región de caja SV40 TATA), pueden emplearse para crear un promotor que responde a la vía de síntesis. Los promotores que responden a la vía de síntesis generalmente están construidos a partir de uno o más copias de una secuencia que se aparea con un motivo de adhesión de consenso. Dichos motivos de adhesión de ADN de consenso pueden ser fácilmente determinados. Dicha secuencia de consenso generalmente están dispuestas como repetición directa de cabeza a cola separadas con unos pocos pares de base. Los elementos que incluyen las repeticiones de cabeza a cabeza (por ejemplo AGGTCATGACCT) se denominan palíndromos o repeticiones invertidas y aquellos con repeticiones de cola a cola se denominan repeticiones invertidas. Ejemplos de promotores de respuesta a las vías que son útiles en la práctica de la presente invención incluye promotores de respuesta a vías de insulina sintéticos que contienen las secuencias de adhesión de insulina de consenso (Jacob y otros, (1995). J. Biol. Chem. 270:27773-27779), el promotor que responde a la vía de citoquina, el promotor que responde a la vía glucocorticoide (Lange y otros (1992) J. Biol Chem 267:1555673-80), IL1 e IL6 (Won K-A y Baumann H. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3965-3978), promotores que responden a la vía T3, promotores que responden a la vía de hormona tiroides que contienen el motivo de consenso: 5' AGGTCA 3', promotores que responden a la vía TPA (TREs), promotores que responden a la vía TGF-ß (tal como fue descrito en Grotendorst, y otros, (1996) Cell Growth and Differentiation 7: 469-480). Ejemplos de otros promotores que responden a vías son bien conocidos en la técnica y pueden identificarse en Bases de Datos de las Regiones Reguladoras de Transcripciones de los Genomas Eucarióticos accesibles a través de Internet http://www.eimb.rssi.ru/TRRD.

En la práctica preferida de la invención ejemplificada aquí, el vector comprende un promotor activo que responde a la vía TGF-ß sintético en presencia de una vía TGF-ß funcional tal como el promotor que contiene los elementos de respuesta SRE y PAI-RE. PAI-RE se refiere a un elemento de respuesta TGF-ß sintético que responde a la señal TGF-ß aislada a partir de una región promotora 1 de activador plasminógeno. La construcción de PAI-RE ha sido descrita aquí en el ejemplo 3. El promotor que responde a la vía PAI-RE puede ser aislado como un fragmento de 749 pares de bases aislable a partir de plásmido pdOOluc (descrito en Zonneveld, y otros (1988) PNAS 85:5525-5529 y obtenible en GenBank bajo el número de acceso JO3836). SRE se refiere a un elemento de respuesta TGF-ß sintético que comprende una repetición de 4 de las secuencias de adhesión Smad-4 (GTCTAGAC descritas en Zawel, y otros (1988) Mol. Cell 1 :611-617. La construcción de SRE ha sido descrita en el presente ejemplo 3. El elemento de respuesta SRE puede generarse mediante acoplamiento de oligonucleótidos complementarios que codifican la secuencia de adhesión Smad-4 y clonando en el vector de luciferasa promotor pGL#3 plásmido (comercialmente obtenible en ProMega). De manera similar, "un promotor que responde a la vía p53" se refiere a un elemento de control transcripcional en presencia de una vía p53 funcional. El promotor que responde a la vía p53 puede ser una región de control transcripcional natural activa en presencia de una vía p53 funcional tal como el promotor p21 o mdm2. Alternativamente, el promotor que responde a la vía p53 puede ser una región de control transcripcional de síntesis activa en presencia de una vía p53 funcional tal como los promotores que responden a la vía SRE y PAI-RE. P53-CON describe un promotor que responde a la vía p53 que contiene un elemento de respuesta p53 de síntesis construido mediante la inserción de dos secuencias de adhesión de ADN de consenso p53 de síntesis (tal como se describió en Funk, y otros (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2866-2871 ) cadena arriba de la caja SV40 TATA. La construcción del promotor que responde a la vía p53-CON ha sido descrita aquí en el ejemplo 3. RGC se refiere a un promotor que responde a la vía p53 de síntesis usando un solo dominio de adhesión p53 identificado en el cúmulo génico ribosomal Kern, y otros, (1991 ) Science 252:1708-1711 y Park y otros (1996) Molecular Carcinogenesis 16:101-108. Los elementos de respuesta p53CON y RGC pueden construrise acoplando oligonucíeótidos complementarios y los promotores que responden a p53 pueden construirse (tal como se describió en forma más completa en el ejemplo 3) clonando en el vector de luciferasa promotor Pgl-3 plásmido (comercialmente obtenible en ProMega). El término "célula objetivo" se refiere a una célula de un estado genotípico determinado que se desea tratar mediante la administración de un transgen terapéutico. Mediante el uso de varios elementos promotores que responde a la vía, puede dirigirse la expresión del virus a cualquier célula determinada con una vía intacta. Por ejemplo el represor de réplica viral puede expresarse en una célula objetivo neoplástica a través del uso de TGF-beta o promotores que responde a la vía p53. De manera similar, el represor de técnica viral puede expresarse en una célula objetivo artrítica a través de un promotor de respuesta inflamatoria donde el vector codifica opcionalmente IL-10. El término "ligado operativamente" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Una secuencia de ácido nucleico está "ligado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo un promotor o mejorador está ligado operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia codificadora. Ligado operativamente se refiere a que las secuencias nucleotídicas que están ligadas son típicamente contiguas. Sin embargo, debido a que los mejoradores generalmente funcionan cuando están separados del promotor por varios kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar ligados operativamente pero no estar directamente flanqueados e incluso pueden funcionar en trans desde un alelo o cromosoma diferente. El término "represor de réplica viral" se refiere a una proteína, si se expresa en una célula determinada, que substancialmente reprime la réplica viral. Tal como podrán apreciar los expertos en la técnica el represor de réplica viral dependerá de la naturaleza del vector adenoviral principal a partir del cual deriva el vector recombinante de la presente invención. Por ejemplo en el caso de los vectores adenovirales o de otros virus tumorales de ADN, puede emplearse la construcción de fusión de E2F-Rb descrita en la solicitud de patente europea No. 94108445.1 publicada el 6 de diciembre de 1995 (publicación número 0 685 493 A1 ). La proteína de fusión E2F-Rb consiste en la adhesión del ADN y los dominios de heterodimerizaciones DP1 de la proteína de factor de transcripción E2F humana (aminoácidos 95-286 de tipo silvestre E2F) fusionados con el dominio de supresión de desarrollo Rb (aminoácidos 379-928 de la proteína Rb de tipo silvestre). La proteína de fusión E2F-Rb es un potente represor de la transcripción que depende de E2F y detiene las células en G1. El dominio de adhesión ADN está situado en los aminoácidos 128-193 y el dominio de dimerización está situado en 194-289. La secuencia de la proteína E2F1 humana está disponible en GenBank bajo el número de acceso M96577 depositado el 10 de agosto de 1992. Las secuencias de E2F y otros miembros de la familia E2F de especies diferentes pueden emplearse cuando se construya un vector para ser usado en otras especies. En la situación en la cual el virus recombinante está basado en los virus adeno-asociados (AAV), la proteína rep y sus derivados constituyen un represor eficaz de réplica viral en ausencia de la infección de adenovirus. En la situación en la cual el virus deriva del virus herpes simplex, el ICPO-NX, que es una forma deleccionada de la proteína precoz inmediata ICPO (Liun y otros (1998) J. Viral 72:7786-7795), dicha proteína puede usarse como represor eficaz de réplica vrial. De manera similar, cualquier proteína con actividad negativa dominante puede ser usada como represor de réplica viral. La TGF-ß y proteínas relacionadas inlcuyendo activina, inhibinas y BMP son potentes agentes antiproliferativos naturales y se cree que juegan un importante rol en la supresión en la tumorigenicidad. En su forma bioactiva, la TGF-ß es un homodimero ligado al disulfuro de 25-kDa y se expresa virtualmente en todos los tejidos humanos. Es interesante recordar que cualquiera de los tipos de células malignas han retenido los patrones de expresión que se observan en las células normales. TGF-ß se señala a través de los complejos receptores heteroméricos de los receptores de serina-tronina quinasa de tipo I y tipo II. Entre las dos quinasas receptoras, el receptor de tipo II posee una actividad de quinasa intrínseca, y mediante adhesión al ligando TGF-ß, el receptor de tipo II se heteromeriza, y transfosforila el receptor de tipo I. La fosforilación del receptor de tipo I activa su actividad de quinasa lo cual da a su vez como resultado la fosforilación de Smads, que son efectores intracelulares. El receptor I de tipo fosforilado transporta señales desde el interior de la célula lo cual da como resultado una inhibición del desarrollo como respuesta celular. Una vez en el interior del núcleo, se sabe que los complejos de Smads, activan la transcripción de los genes objetivo ya sea por sí mismos actuando como factores de transcripción o regulando la actividad de otros factores de transcripción. Los factores de transcripción que se cree que son regulados por las señales TGF-ß incluyen CTF/NF-1 , FAST-1 , Sp1 , Jun, SRF TRF, Oct y CREB. El resultado neto de estas interacciones conduce a varios efectos pleitrópicos conocidos de TGF-ß. El factor-ß (TGF-ß) de desarrollo transformante y las proteínas relacionadas son potentes inhibidores de la proliferación de muchos tipos de célula. La progresión maligna de varios tumores de origen epitelial y hematopoyético está correlacionada con la pérdida de la acción anti-proliferativa y anti-invasiva de TGF-ß. Las fallas de señalización de TGF-ß han demostrado que involucran mutaciones o deleciones o faltas de expresión de los receptores y/o efectores intracelulares de la vía de transducción de señales. Muchos tumores malignos que son resistentes a TGF-ß son también multiplicadores de defectos para otros genes supresores de tumores lo cual limita la utilidad del reemplazo del gen supresor de tumores para una terapia eficaz. Los promotores que responden a la vía TGF-ß se construyeron mediante !a incorporación de las secuencias del plasminogeno activador inhibidor- 1 (promotor PAI) o los sitios de adhesión para Smad4/DPC4 (promotor SRE) cadena arriba de la caja SV40 TATA. Las actividades de estos promotores fueron evaluadas en ensayos de transfección transitorios usando luciferasa como el informante. Los resultados se presentan en el cuadro 2: CUADRO 2 Actividad de Luciferasa Relativa* (plegada) * La actividad de luciferasa se expresa en relación a la actividad obtenida con una construcción sin promotor. Estos resultados demuestran que ambos promotores son activos únicamente en células con una transducción de señal TGF-ß funcional. En un línea de célula defectuosa de vía TGF-ß tal como MDA-MB468, que es defectuosa para la transducción de señales de TGF-ß debido a la deleción homocigota Smad4/DPC4, transfección del promotor PAI o promotor SRE ligados operativamente a la luciferasa o infección o adenovirus recombinante que codifica Smad4 restauró la actividad de ambos elementos de respuestas precedentes, lo cual confirma adicionalmente la especificidad de estos promotores que contienen un elemento de respuesta para la vía TGF-ß según fue demostrado por los datos que se demuestran en el cuadro 3 siguiente.

CUADRO 3 Restauración de TGF-ß. Actividad promotora de respuesta en células MDA-MB-468 mediante Infección con un adenovirus recombinante que codifica Smad4/DPC4 (Actividad de Luciferasa Relativa* (plegado)) * La actividad de luciferasa se expresa en relación a la actividad obtenida con una construcción con BGCA en ausencia de adición de TGF-ß. BGCA es un adenovirus recombinante que expresa el gen ß-gal. DCCA es un adenovirus recombinante que codifica Smad4/DPC4. Un promotor PAI que contiene un plásmido ligado operativamente a E2F-Rb fue a continuación construido y sometido a ensayo para determinar su capacidad para reprimir selectivamente el promotor E2 en células con la vía TGF-ß intacta. El ensayo de transfección transitoria, la cotransfección del promotor E2 ligado a la lucifersasa en el promotor PA1 ligado operativamente a E2F-Rb mostró una represión selectiva de la actividad promotora E2 en 293 células (con la vía TGF-ß normal), y no en las células MDA-MB 468 (con una vía TGF-ß defectuosa) tal como se muestra en el cuadro 4, debido a la expresión selectiva de E2F-Rb en 293 células. Tal como se esperaba la cotransfección con CMV-E2F-Rb que expresa E2F-Rb en ambas líneas de células inhibió la actividad del promotor E2 en ambas líneas de células.

CUADRO 4 Represión selectiva de la actividad promotora E2 mediante PAI-E2F-Rb en 293 Células v. Células MDA-MB -468 (actividad de luciferasa relativa* 12611 * La actividad de luciferasa se expresa como porcentaje en relación a la actividad obtenida con una construcción sin promotor. Los promotores que responden a la vía p53 se construyeron incorporando sitios de adhesión p53 conocidos a partir de cualquiera del cúmulo génico ribosomal (promotor RGC) o sitios de adhesión p53 de alta afinidad (promotor p53CON). Las actividades de estos promotores fueron evaluadas en ensayos de transfección transitoria usando luciferasa como informante. Los resultados de estos experimentos se presentan en el cuadro 5 siguiente.

CUADRO 5 Actividades de p53 que responden a los promotores en varias líneas de células (actividad de luciferasa relativa*) * La actividad de luciferasa se expresa en relación a la actividad obtenida con una construcción sin promotor. Los resultados indican que ambos elementos de respuesta son activos en células con p53 funcional. Para confirmar que la actividad promotora de respuesta p53 se debe al p53 funcional, dos líneas de células WIDR y U87 fueron cotransfectadas con el promotor RGC que dirige la expresión del gen de luciferasa y un vector de adenovirus de control de cassette vacío (ZZCB) o un adenovirus recombinante que produce constitutivamene p53 bajo el control del promotor CMV (FTCB). Los resultados de estos experimentos se presentan en el cuadro 6.

CUADRO 6 Restauración/mejora de la actividad promotora de respuesta p53 en células WIDR y U87 mediante infección con un adenovirus recombinante que codifica p53 (actividad de luciferasa relativa*) * La actividad luciferasa es expresada en relación a la actividad obtenida con infección de ZZCB. Tal como puede observarse por los datos presentados, la actividad del promotor que responde a p53 aumenta de una manera que depende de la dosis, incrementándose la actividad de p53. Se generaron vectores de adenovirus recombinantes que codifican la secuencia codificadora de fusión E2F-Rb bajo el control de cualquiera del promotor que responde a la vía TGF-ß (PAI o SRE) o promotor que responde a la vía p53 (RGC o p53CON). Además, el gen que codifica la proteína fluorescente verde se incorporó también a los vectores como informante. Los virus resultantes fueron sometidos a ensayo para determinar su capacidad para replicarse selectivamente y para matar las células con cualquiera de las vías defectuosas p53 o TGF-ß en ensayos de efectos citopáticos (CPE). Los resultados se muestran en la figura 1 de los dibujos anexos. En MRC9 (vía p53 vía positiva y TGF-ß vía positiva), el adenovirus de tipo silvestre fue capaz de replicarse e inducirse CPE incluso en bajas concentraciones (1 x 106 partículas/ml), mientras que la vía TGF-ß o p53 dirigió los vectores que fallaron en inducir CPE en esa concentración. Únicamente en la dosis más alta ensayada (1 x 108 partículas/ml), los vectores objetivo de vía mostraron cierto CPE. En contraste en la línea celular tal como WIDR (defectuosa en ambas vía la p53 y la TGF-ß), y Hep3B (p53 nulo y vía TGF-ß defectuosa en ausencia de TGF-ß exxógeno), los vectores objeíivo de vía fueron eficaces para inducir un CPE similar al del virus de tipo silvestre incluso en bajas concentraciones (1 x 106 partículas/ml). La microscopía de fluorescencia de células Hep3B infectadas con los vectores dirigidos a la vía (SRE-Ad y p53Con-Ad) revelaron un alto nivel de expresión del transgen y la diseminación del virus dentro del cultivo incluso cuando se infectó en una baja concentración de partículas (1 x 105 partículas/ml expuestas durante dos horas). En contraste las células Hep3B infectadas con el adenovirus codificador de GFP (E1A-delecionado) defectuoso de réplica (GFCB) en la misma concentración (1 x 105 partículas/ml), no mostró ninguna expresión de GFP.

Tal como se indicó previamente los vectores de la presente invención son capaces de replicarse selectivamente y de lisis de la célula objetivo bajo condiciones selectivas. Sin embargo, esto no significa que implique que las capas adicionales de selectividad o toxicidad no puedan ser manipuladas por ingeniería genética dentro de estos vectores. La presente invención provee también adenovirus recombinantes que contienen modificaciones adicionales del genoma viral tal como modificaciones objetivo, cassettes de expresión transgénica o modificaciones del genoma viral para facilitar la réplica selectiva en un estado fenotípico o tipo de célula determinado. El término "modificación objetivo" se refiere a las modificaciones del genoma viral diseñadas para dar como resultado una infectividad preferencial de un tipo de célula particular. La especificidad de tipo celular o el objetivo de tipo celular puede lograrse también en vectores derivados de virus que tienen característicamente amplias infectividades tales como los adenovirus mediante modificación de las proteínas de envoltura viral. Por ejemplo, se ha logrado el objetivo de células con vectores de adenovirus mediante modificación selectiva de las secuencias codificadoras de fibra y nudo de genoma viral para lograr la expresión de los dominios de fibra y nudo modificados que tienen interacción específica con receptores de superficies de células únicos. Ejemplos de dichas modificaciones han sido descritas en Wickham, y otros (1997) J. Virol 71 (11 ):8221-8229 (incorporación de péptidos RGD en proteínas de fibras adenovirales); Arnberg y otros (1997) Virology 227:239-244 (modificación de genes de fibras adenovirales para lograr tropismo para el ojo y el tracto genital); Harris y Lemoine (1996) TIG 12 (10); 400-405; Stevenson y otros (1997) J. Virol 71 (6); 4782-4790; Michael y otros (1995) terapia génica 2:660-668 (que incorpora el fragmento peptídico de liberación de gastrina en la proteína de fibra de adenovirus); y Ohno y otros (1997) Nature Biotechnology 15:763-767 (incorporación del dominio de adhesión de proteína A-lgC en el virus Sindbis). Otros métodos de objetivo específico de células se han logrado mediante la conjugación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para las proteínas de envoltura (ver, por ejemplo Michael y otros (1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869, Watkins, y otros (1997) Gene Therapy, 4:1004-1012; Douglas y otros (1996) Nature Biotechnology 14; 1574-1578. Alternativamente, pueden conjugarse porciones particulares con la superficie viral para lograr el objetivo (ver, por ejemplo Nilson y otros (1995) Gene Therapy 3:280-286 (conjugación de EGF con proteínas retrovirales). Estos vectores recombinantemente modificados pueden producirse de acuerdo con la práctica de la presente invención. El término "cassette de expresión transgénica" se refiere a un promotor que es funcional en la célula objetivo ligado operativamente a un transgen terapéutico. El término promotor se refiere a las secuencias nucleotídicas que afectan la transcripción de otra secuencia nucleotídica. Ejemplos de promotores incluyen promotores constitutivos débiles, promotores virales temporales o promotores regulables.

El término "promotores temporales" se refieren a los promotores que dirigen la transcripción del transgen terapéutico en un punto posterior en el ciclo viral en relación al promotor que controla la expresión del promotor que responde a la vía. Ejemplos de dichos promotores temporalmente regulados ¡ncluyen el promotor tardío principal de adenovirus (MLP), otros promotores tales como E3. En la práctica preferida de la invención, se emplea el promotor MLP. Para los virus de herpes simplex, pueden usarse los Promotores Activados Latentes. El término "promotores regulables" se refiere a los promotores inducibles, a los promotores específicos de tumores o específicos de tejidos. El término "promotor inducible" se refiere a los promotores que facilitan la transcripción del transgen terapéutico (preferiblemente o únicamente bajo ciertas condiciones y/o en respuesta a estímulos externos químicos o a otros estímulos. Ejemplos de promotores inducibles son conocidos en la literatura científica (ver por ejemplo Yoshida y Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Lida, y otros (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, y otros (1997) J. Virol 71 (9): 7128-7131 ; Lee y otros (1997) Mol. Cell Biol. 17 (9)5097-5105; y Dreher y otros (1997) J. Biol. Chem. 272(46); 29364-29371. Ejemplos de promotores inducibles por radiación han sido descritos en Manóme y otros (1998) Human Gene Therapy 9:1409-1417). Un nivel adicional de selectividad puede ser impartido a través del uso de tejido específico de promotores específicos de tumores. Los promotores específicos de tumores y específicos de tejidos son bien conocidos en la técnica e incluyen promotores activos preferiblemente del músculo liso (promotor a- actina), específico de páncreas (Palmiter y otros (1987) Cell 50:435), específico de hígado Rovet, y otros (1992) J. Biol. Chem. 267:20765; Lemaigne y otros (1993) J. Biol. Chem. 268:19896; Nitsch y otros (1993) Mol. Cell. Biol. 13:4494), específico de estómago (Kovarik y otros (1993) J. Biol. Chem. 268:9917, específico de pituitaria (Rhodes y otros (1993) Genes Dev. 7:913, específico de próstata, etc. El término "transgen terapéutico" se refiere a una secuencia nucleotídica cuya expresión en la célula objetivo produce un efecto terapéutico. El término transgen terapéutico incluye pero no está limitado a los genes suspresores de tumores, los genes antigénicos, genes citotóxicos, genes citostáticos, genes activadores de pro-fármacos, genes apoptóticos, genes farmacéuticos o genes anti-angiogénicos. Los vectores de la presente invención pueden usarse para producir uno o más transgenes terapéuticos y hacer en tándem a través del uso de los elementos íRES o a través de promotores independientemente regulados. El término "gen supresor de tumores" se refiere a una secuencia nucleotídica cuya expresión en la célula objetivo es capaz de suprimir el fenotipo neoplástico y/o inducir apoptosis. Ejemplos de genes supresores de tumores que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen el gen p53, el gen APC, el gen DPC-4/Smad4, el gen BRCA-1 , el gen BRCA-2, el gen WT-1 , el gen de retinoblastoma (Lee y otros (1987) Nature 329:642), el gen MMAC-1 , la proteína coli de adenomatous polyposis (Albertsen y otros, patente norteamericana 5,783,666 concedida el 21 de julio de 1998), el gen delecionado en carcinoma de colon (DCC), el gen MMSC-2, el gen NF-1 , el gen supresor de tumor de carcinoma nasofaríngeo que mapea en el cromosoma 3p21.3 (Cheng y otros, 1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047), el gen MTSI, el gen CDK4, el gen NF-1 , el gen NF2 y el gen VHL. El término "genes antigénicos" se refiere a una secuencia nucleotídica cuya expresión en las células objetivo da como resultado la producción de una proteína antigénica de superficie celular que es capaz de reconocimiento por el sistema inmune. Ejemplos de genes antigénicos incluyen el antígeno carcinoembriónico (CEA), p53 (descrito en Levine, A. Publicación Internacional de PCT No. WO94/02167 publicada el 3 de febrero de 1994). Para facilitar el reconocimiento de inmunidad, el gen antigénico puede fusionarse con el antígeno de clase I MHC. El término "gen citotóxico" se refiere a la secuencia nucleotídica cuya expresión en una célula produce un efects tóxico. Ejemplos de dichos genes citotóxicos incluyen secuencias nucleotídicas que codifican la exotoxina de las pseudomonas, la toxina de risina, toxina de difteria y similares. El término "gen citostático" se refiere a secuencias nucleotídicas, la expresión de las cuales en una célula produce una detención del ciclo celular. Ejemplos de dichos genes citostáticos incluyen p21 , el gen de retinoblastoma, el gen de proteína de fusión E2F-Rb, genes que codifican los inhibidores de quinasa que dependen de ciclina tales como p16, p15, p18 y p19, el gen homeobox (GAX) específico de detención de crecimiento tal como se describe en Branellec, y otros (PCT Publicación WO97/16459 publicada el 9 de mayo de 1997, y PCT publicación WO96/30385 publicada el 3 de octubre de 1996). El término "gen citoquina" se refiere a una secuencia nucleotídica, cuya expresión en una célula produce una citoquina. Ejemplos de dichas citoquinas incluyen GM-CSF, las interleucinas especialmente IL-1 , IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferones de los tipos a, ß y ? especialmente el interferón a-2b y las fusiones tales como el interferón a-2a-1. El término "gen de quemoquina" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce una citoquina. El término quemoquina se refiere a un grupo de factores de peso de citoquinas de bajo peso molecular estructuralmente relacionadas que son secretadas por células que están estructuralmente relacionadas que tienen actividades mitogénicas, quemotácticas o inflamatorias. Son principalmente proteínas catiónicas de 70 a 100 residuos aminoácidos que comparten cuatro residuos cisteína conservados. Estas proteínas pueden clasificarse en dos grupos con base en el espaciamiento de las dos cisteínas amino-terminales. En el primer grupo, las dos cisteínas están separadas por un solo residuo (C-x-C), mientras que en el segundo grupo, son adyacentes (C-C). Ejemplos de miembros de las quemoquinas 'C-x-C incluyen pero no están limitadas al factor de plaquetas cuatro (PF4), proteína básica de plaqueta (PBP), interleucina-8 (IL-8), proteína de actividad estimuladora del desarrollo de melanomas (MGSA), proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-2), Mig de ratón (m119), de pollo 9E3 (o pCEF-4), factores quemotácticos de macrófagos alveolares de cerdo I y II (AMCF-I y -II), factor estimulador del desarrollo de células pre-B (PBSF), e IP10. Ejemplos de miembros del grupo 'C-C incluyen pero no están limitados a la proteína 1 quemotáctica monocítica (MCP-1 ), proteína 2 quemotáctica monocítica (MCP-2), proteína 3 quemotáctica monocítica (MCP-3), proteína 4 quemotáctica monocítica (MCP-4), proteína inflamatoria de macrófagos 1a (MIP-1-a), proteína 1 ß inflamatoria de macrófagos (MIP-1-ß), proteína 1? (MIP-1-?) inflamatoria de macrófagos, proteína 3 a inflamatoria de macrófagos (MIP-3-a), proteína inflamatoria de macrófagos 3 ß (MIP-3-ß), quemoquina (ELC), proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4), proteína 5 inflamatoria de macrófagos (MIP-5), LD78 ß, RANTES, SIS-epsilon (p500), quemoquina del timo y de activación regulada (TARC), eotaxina, 1-309, proteína humana HCC-1/NCC-2, proteína humana HCC-3, proteína de ratón C10. El término "gen de proteína farmacéutica" se refiere a la secuencia nucleotídica cuya expresión da como resultado la producción de proteínas que tienen un efecto farmacéutico en la célula objetivo. Ejemplos dedichos genes farmacéuticos incluyen el gen de pro-insulina y sus análogos (tal como se describió en la solicitud de patente internacional PCT No. WO98/31397, gen de la hormona del crecimiento, dopamina, serotonina, factor de crecimiento epidérmico, GABA, ACTH, NGF, VEGF, (para aumentar la perfusión sanguínea en el tejido que constituye el objetivo, para inducir angiogénesis, publicación PCT W098/32859 publicada el 30 de julio de 1998), trombospondina, etc. El término "gen pro-apoptótico" se refiere a una secuencia nucleotídica, cuya expresión da como resultado la muerte celular programada de la célula. Ejemplos de genes pro-apoptóticos incluyen p53, adenovirus E3- 11.6K (derivado de Ad2) o adenovirus E3-10.5K (derivado de Ad), el gen de adenovirus E4orf4, los genes de vía p53 y los genes que codifican las caspasas. El término "genes activadores de profármacos" se refiere a las secuencias nucleotídicas, la expresión de las cuales da como resultado la producción de proteínas que son capaces de convertir un compuesto no terapéutico en un compuesto terapéutico, que convierte a la célula susceptible a sufir muerte causada por factores externos o que produce una condición tóxica en la célula. Un ejemplo de un gen activador de profármaco es el gen de citosina desaminasa. La citosina desaminasa convierte la 5-fluorocitosina (5-FC) a 5-fluorouracilo (5-FU), que es un potente agente antitumoral. La lisis de la célula tumoral provee una expresión localizada de citosina desaminasa que es capaz de convertir 5FC a 5FU en el punto localizado del tumor lo cual da como resultado la muerte de muchas células tumorales circundantes. Esto resulta en la muerte de una gran número de células tumorales sin necesidad de infectar estas células con un adenovirus (el denominado efecto circunstante). Adicionalmente, el gen de timidina quinasa (TK) (ver, por ejemplo Woo y otros, patente norteamericana No. 5,631 ,236 concedida el 20 de mayo de 1997 y Freeman y otros, patente norteamericana No. 5,601 ,818, concedida el 11 de febrero de 1997) donde las células que expresan el producto génico TK son susceptibles de muerte selectiva mediante la administración de ganciclovir, también puede emplearse. El término genes "anti-angiogénicos" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual da como resultado la secreción extracelular de factores anti-angiogénicos. Los factores anti-angiogénicos incluyen angiostatina, inhibidores del factor de desarrollo endotelial vascular (VEFG) tal como Tie 2 (descrito en PNAS (EUA) (1998) 95:8795-8800), endostatina. Resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica que las modificaciones y/o deleciones de los genes previamente referenciados para codificar sus fragmentos funcionales de la proteína de tipo silvestre pueden ser rápidamente adaptados para ser usados en la práctica de la presente invención. Por ejemplo la referencia al gen p53 incluye no sólo la proteína de tipo silvestre sino también las proteínas p53 modificadas. Ejemplos de dichas proteínas p53 modificadas incluyen modificaciones para p53 de modo de incrementar la retención nuclear, deleciones tales como los aminoácidos ?13-19 capaces de eliminar el sitio de división de consenso de calpaína, modificaciones para los dominios de oligomerización (tal como los descritos en Braceo y otros, PCT solicitud publicada WO97/0492 o la patente norteamericana No. 5,573,925).

Resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica que los genes terapéuticos precedentes pueden ser secretados en el medio o pueden localizarse en ubicaciones intracelulares particulares mediante la inclusión de una porción objetivo tal como un péptido de señal o una señal de localización nuclear (NLS). Asimismo se incluyen en la definición de transgen terapéutico las proteínas de fusión del transgen terapéutico con la proteína estructural del virus de herpes simplex de tipo 1 (HSV-1 ), VP22. Las proteínas de fusión que contienen la señal VP22, cuando son sintetizadas en una célula infectada, son exportadas fuera de la célula infectada y entran eficientemente en las células no infectadas circundantes hasta un diámetro de aproximadamente 16 células de ancho. Este sistema es particularmente útil conjuntamente con proteínas transcripcionalmente activas (por ejemplo p53), debido a que las proteínas de fusión son eficientemente transportadas a los núcleos de las células circundantes. Ver, por ejemplo Elliot, G & O'Hare, P. Cell 88:223-233:1997; Marshal, A. & Castellino, A. Research News Briefs, Nature Biotechnology, 15:205:1997; O?are y otros PCT publicación WO97/05265 publicada el 13 de febrero de 1997. Una porción objetivo similar derivada de la proteína HIV Tat ha sido descrita también en Vives y otros (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017. Adicionalmente las modificaciones para aumentar la potencia de los vectores de la presente invención incluyen pero no están limitadas a alteraciones dentro de E1 , introducción de mutaciones en E4 para aumentar la citotoxicidad (Muller y otros (1992) J. Virol 66:5867-5878), sobre regulación de las proteínas de muerte viral tal como las proteínas E4orf4 o E3 11.6K. En la práctica preferida de la invención ejemplificada aquí, el vector de la presente invención comprende un adenovirus condicionalmente replicante que contiene un promotor que responde a la vía p53 o TGF-ß que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb, que comprende adicionalmente el gen de citosina desaminasa bajo el control del promotor temporal E3. En tales casos, la citosina desaminasa se produce únicamente en las células tumorales después de la replicación viral. En la práctica preferida de la invención, el gen conversor de profármaco está bajo el control de un promotor relativamente débil específico de tumor o específico de tejido. En otra modalidad de la invención, el vector comprende un adenovirus recombinante con un promotor que responde a la vía p53 o TGF-ß que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb y un cassette de expresión transgénica que expresa la citosina desaminasa sola o en un cassette de expresión bi-cistrónica que contiene citosina desaminasa, y el elemento IRES y la MIP-3-alfa proteína. Debido a que la citosina desaminasa es expresada, se logra la muerte de las células tumorales mediante la administración de un profármaco tal como 5-fluorocitosina. El bajo nivel de expresión de MIP-3-alfa ayudará en el desarrollo de la inmunidad antitumoral. Aquí se usa intercambiablemente una cascada de multinivel, multifuncional o de respuesta de vía múltiple para referirse a la construcción de elementos que responden a una vía a manera de producir un efecto terapéutico donde más de una vía puede ser sondeada simultáneamente. Resultará aparente para los expertos en la técnica que los elementos de control de vector descritos más arriba pueden combinarse para proveer capas múltiples de selectividad para los vectores de la presente invención. Como ejemplo del control de multinivel, sería posible diseñar un adenovirus condicionalmente replicante que puede replicarse y matar células que tienen defectos en cualquiera de las vías Rb, p53 o TGF-ß. Dicho vector incluiría la expresión de un inhibidor negativo dominante de réplica viral controlado por un promotor que responde a p53 como nivel de control primario. Como resultado, en cualquier célula (tal como en todas las células normales) con p53 funcional, pero no en las células con p53 inactivo, se expresará el inhibidor negativo dominante y se bloqueará la réplica viral. Sin embargo, este vector puede replicarse en células tumorales con p53 funcional pero con defectos en otras vías tales como las vías TGF-ß y Rb. Por lo tanto, pueden insertarse niveles de control adicionales que esencialmente inactivarían el p53 funcional en las células tumorales, lo cual permitiría la réplica viral, cuando otras vías son defectuosas. Como segundo nivel de control, el mismo vector consistiría también en un cassette de expresión que contiene la proteína de adenovirus EIB-55K, que puede inactivar funcionalmente p53, bajo el control de un promotor que es solamente activo en las células defectuosas de la vía TGF-ß. Puede contruirse un promotor que solamente es activo en las células defectuosas de la vía TGF-ß mediante la inserción de los sitios de adhesión represores dentro de un promotor de manera que la expresión del represor usando un promotor que responde a TGF-ß en cualquier otra parte del vector conducirá al bloqueo de la actividad promotora en las" células con señalización TGF-ß intacta. Por otra parte, en las células en las cuales la vía TGF-ß es defectuosa, el represor no es sintetizado y por consiguiente el promotor será activo. Debido a que la expresión de E1 B-55K del promotor que es activo solamente en células en las cuales la vía TGF-ß es defectuosa, se inactiva la p53 endógena. Alternativamente, puede usarse cualquier promotor natural que está subregulado debido a la señalización de TGF-ß. La inclusión de los dos cassettes de expresión precedentes asegurará que el inhibidor dominante negativo se exprese solamente cuando ambas vías, la vía p53 y TGF-ß son normales (conduce al bloqueo de la replicación), pero no cuando una o las dos son defectuosas (conduce a replicación viral). Como tercer nivel de control, la expresión de una proteína tal como Smad7 o cualquier otra forma negativa dominante de Smad, que es capaz de inactivar la vía TGF-ß (Nakao y otros, Nature 9 de octubre de 1997, 389 (6651 ): 631-635) controlada por un promotor que responde a E2F se logra en el mismo vector. Un promotor que responde a E2F (tal como el promotor E2F1 , promotor E2 o un promotor sintético con múltiples sitios de adhesión de E2F cadena arriba de un promotor mínimo tal como la caja SV40 TATA) es activo cuando la vía Rb es defectuosa. Debido a este tercer nivel de control, en células con la vía Rb defectuosa, se expresa el Smad7, el cual a su vez inactiva el Smad4 y bloquea la transducción de señal TGF-ß. Por lo tanto, se logra el EIB-55K y se inactiva el p53 que conduce a la falta de expresión del inhibidor negativo dominante. Por lo tanto, la replicación viral puede proseguir en forma no impedida. Por otra parte, si la vía Rb es normal, no se sintetiza el Smad7, y por lo tanto la transducción de señal TGF-ß prosigue normalmente. Por lo tanto, no se efectúa EIB-55K, lo cual da como resultado un p53 funcional capaz de expresar el inhibidor negativo dominante para bloquear la replicación viral. Con los precedentes tres niveles de control, un defecto en cualquiera o dos o todas las tres vías (Rb, TGF-ß y p53) conduciría finalmente a la replicación viral y la lisis celular. La replicación viral no ocurrirá solamente cuando las tres vías son funcionales tal como en las células normales. Como podrán apreciar los expertos en la técnica, los vectores de la presente invención pueden usarse en muchas variaciones para la detección y tratamiento de una amplia variedad de defectos de la vía usando una variedad de promotores que responden a la vía. Sin embargo, en la práctica preferida de la invención aquí ejemplificada, el vector adenoviral recombinante se deriva del género adenoviridiae. Particularmente los virus preferidos derivan del adenovirus humano de tipo 2 o de tipo 5. Cuando se usa un vector adenoviral como vector principal, los inhibidores preferidos de replicación viral consisten en la proteína de fusión E2F-RB. En la práctica preferida de la invención cuando se usan los vectores de la presente invención para tratar enfermedades que están asociadas con una proliferación celular descontrolada, se prefiere emplear un vector adenoviral que contenga deleciones específicas en la región E1A para eliminar la capacidad del producto génico E1a para adherirse a las proteínas p300 y Rb reteniendo al mismo tiempo la función transactivadora del dominio E1a CR3. Los vectores de la presente contienen deleciones en la secuencia codificadora E1a para eliminar los sitios de adhesión p300 y p105-Rb en la secuencia codificadora 13S. En la práctica preferida de la presente invención, las deleciones de adhesión p300 están representadas por deleciones de aminoácidos de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 25 o desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 49. Las deleciones en la secuencia codificadora E1a 289R necesarias para lograr !a eliminación de la adhesión p300 y pRb son preferiblemente lo más mínimas posible para evitar una importante fractura de la estructura secundaria y terciaria de la proteína E1a 289R. Con el propósito de eliminar la adhesión p300 se prefiere introducir una mutación en la secuencia de ADN que codifica los dominios de adhesión p300 de 289R. Las deleciones de menos de aproximadamente 30 aminoácidos en la región C-terminal para eliminar la adhesión p300 son las que se prefieren, aunque son aún más preferibles modificaciones más pequeñas. Por ejemplo una deleción de los aminoácidos 4 a 25 (dl1101 ), desde aproximadamente el aminoácido 30 hasta el aminoácido 49 (dll 103) y más particularmente 36 a 49 son alternativamente preferidos para eliminar la adhesión p300. Se prefieren en particular mutaciones puntuales suficientes para interrumpir la adhesión p300. Por ejemplo, una mutación puntual del segundo aminoácido desde arginina a glicina (Arg2?Gly2) en la proteína 289R se ha demostrado que interrumpe la adhesión p300 (ver por ejemplo, pm563, Whyte y otros (1989) Cell 56:67-75). De manera similar con respecto a la eliminación de la adhesión pRb105, se prefieren modificaciones mínimas. Se prefiere la eliminación de los aminoácidos selectivos en el dominio de adhesión pRb105 tal como el aminoácido 111-123 (dh 107) y los aminoácidos 124-127 (dll 108). La deleción de los aminoácidos 111-123 (dll 107) es particularmente preferida porque retiene la actividad de adhesión de p107 de la proteína 289R. Adicionalmente puede introducirse la eliminación de los aminoácidos desde aproximadamente 219 a 289 de la proteína E1a 289R y 173 a 243 de la proteína E1A 243R. Por ejemplo, mediante la introducción de una mutación puntual en la posición que corresponde a la posición 1131 del genoma humano Ad5 (es decir, cambiando la citosina 1131 a una guanina) se crea un codón de interrupción. Esta mutación da como resultado la eliminación de los aminoácidos 219 a 289 de la proteína E1a 289R y 173 a 243 de la proteína E1A 243R. Esta mutación se efectúa opcionalmente además de las deleciones en la adhesión Rb y p300 descrita más arriba. Ejemplos adicionales de dichos vectoes se han definido en las solicitudes de patente norteamericanas copendientes números 60/104,317 y 08/09/172,684 presentada el 15 de octubre de 1998. En la práctica preferida de la invención ejemplificada aquí, los promotores preferidos que responden a la vía p53 son p53-CON y RGC. Los promotores preferidos que responden a la vía TGF-ß están seleccionados del grupo que consiste en PAI-RE y SRE. En la práctica preferida de la invención, el gen terapéutico es un activador de profármaco por ejemplo, la citosina desaminasa. En la práctica preferida de la invención para inducir la inmunidad antitumoral, el vector de la presente invención codifica MIP-3-alfa. Los promotores preferidos para la expresión del gen terapéutico son los promotores temporales tales como MLP y E3. En las construcciones adenovirales, se logra la eliminación o demora en la acción de la proteína Ad E3-11.6K para minimizar la lisis celular inducida por adenovirus hasta la réplica. En particular, sería preferible la eliminación del gen E3-11.6K/10.5K natural. Esto minimizaría la respuesta de inmunidad hasta después de que ocurra la vuelta inicial de diseminación localizada. En este tiempo posterior, una vez lograda la apoptosis de las células ¡nicialmente infectadas y una vez permitida la diseminación del virus localizado, resultaría ventajosa la respuesta inmune. La proteína de 11.6K (o la correspondiente proteína de E3-10.5K de Ad5) es un gen proapoptótico y puede usarse para lograr la muerte celular de las células tumorales. Sin embargo, debido a que se desea demorar la lisis precoz de la célula objetivo para maximizar la replicación viral, se prefiere que el gen de 11.6K/10.5K esté colocado bajo el control de un promotor temporal tal como el promotor MLP para demorar el comienzo de su efecto apoptótico.

Formulaciones farmacéuticas La presente invención provee además una formulación farmcéuticamente aceptable de los virus recombinantes en combinación con un portador. Los vectores de la presente invención puede formularse en la práctica para la administración de las dosis de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional con adición de portadores y excipientes. Las dosis de las formulaciones pueden incluir administración intravenosa, ¡ntratumoral, intramuscular, ¡ntraperitoneal, tópica, de matriz o en aerosol. El término "portador" se refiere a compuestos comúnmente usados en la formulación de los compuestos farmacéuticos usados para mejorar la estabilidad, esterilidad y capacidad de liberación del compuesto terapéutico. Cuando el virus es formulado como solución o suspensión, el sistema de liberación se efectúa en un portador aceptable, preferiblemente en un portador acuoso. Pueden usarse una variedad de portadores acuosos por ejemplo agua, agua de pH regulado, 0.8% salina, 0.3% de glicina, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales que son bien conocidas, o pueden filtrarse en forma estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso o pueden liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como ajuste de pH y de los agentes reguladores de pH, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorción, oleato de trietanolamina, etc. La presente invención provee además formulaciones farmacéuticas de los virus de la presente invención con un portador y un agente o agentes mejoradores de la liberación. Los términos "mejoradores de la liberación" o "agentes mejoradores de liberación" se usan intercambiablemente aquí e incluyen uno más agentes que facilitan la absorción del virus en la célula objetivo. Ejemplos de mejoradores de liberación se han descrito en las solicitudes de patente norteamericanas copendientes actas No. 09/112,074 presentada el 8 de julio de 1998 y 08/938,089 presentada el 26 de septiembre de 1997. Ejemplos de dichos agentes mejoradores de la liberación incluyen detergentes, alcoholes, glicoles, agentes tensoactivos, sales biliares, antagonistas de heparina, inhibidores de - ciclooxigenasa, soluciones de sales hipertónicas y acetatos. Los alcoholes incluyen por ejemplo, los alcoholes alifáticos tales como etanol, N-propanol, isopropanol, alcohol butílico, alcohol acetílico. Los glicoles ¡ncluyen glicerina, propilenglicol, polietilenglicol y otros glicoles de bajo peso molecular tales como glicerol o tioglicerol. Los acetatos tales como ácido acético, ácido glucónico, y acetato de sodio son ejemplos adicionales de agentes mejoradores de liberación. Las soluciones de sales hipertónicas tales como NaCI 1 M también son ejemplos de agentes mejoradores de liberación. Ejemplos de agentes tensioactivos son dodeciisulfato de sodio (SDS) y lisolecitina, polisorbato 80, nonilfenoxi polioxietileno, isofosfatidilcolina, polietilenglicol 400, polisorbato 80, éteres de polioxietileno, agentes tensioactivos de éter de poliglicol y DMSO. Pueden usarse sales biliares tales como taurocolato, taurodesoxicolato de sodio, desoxicolato, cenodesoxicolato, ácido glicólico, ácido glicoceno desoxicólico y otros astringentes tales como nitrato de plata. También pueden usarse antagonistas de heparina tales como aminas cuaternarias tales como sulfatos de protamina. Pueden usarse inhibidores de ciclooxigenasa tales como salicilato de sodio, ácido salicílico, y fármacos no esteroidales antiinflamatorios (NSAIDS) tales como indometacina, naproxen, diclofenac. Los agentes mejoradores de liberación incluyen los compuestos que tienen la fórmula I: donde X1 y X2 están seleccionados del grupo que consiste en un grupo de ácido cólico, un grupo de ácido desoxicólico y un grupo sacárido, m es un número de 2 a 8 y preferiblemente 2 o 3, n es un número de 2 a 8 y preferiblemente 2 o 3, y R es un grupo catiónico, un grupo sacárido o una estructura -CO-X3 donde X3 es un grupo sacárido. El grupo sacárido puede seleccionarse del grupo que consiste en grupos monosacáridos de pentosa, grupos monosacáridos de hexosa, grupos disacáridos de pentosa-pentosa, grupos disacáridos de hexosa-hexosa, grupos disacáridos de pentosa-hexosa y grupos disacáridos de hexosa-pentosa. El término "detergente" incluye detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos y no iónicos. Ejemplos de detergentes incluyen pero no están limitados a taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloruro de benalconio, Zwittergent 3-14 detergente, CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propansulfonato hidratado), Big CHAP, Desoxi Big CHAP, detergente Triton-x-100, C12E8, octil-B-D-glucopiranosida, detergente PLURONIC-F68, detergente Tween 20, y detergente TWEEN 80 (CalBiochem Biochemicals). Las formulaciones de dosificación unitaria de la presente invención pueden incluirse en un equipo de productos que contienen el virus recombinante de la reivindicación 1 en forma liofilizada y una solución para la reconstitución del producto liofilizado. Los virus recombinantes de la presente invención pueden liofilizarse mediante procedimientos convencionales y pueden reconstituirse. Los vectores de la presente invención pueden administrarse también en combinación con inhibidores de calpaína. El "inhibidor de calpaína" (abreviado como "CI") se refiere a un compuesto que inhibe la acción proteolítica de la calpaína-l, por ejemplo de las µ-calpaínas. El término inhibidores de calpaína tal como se usa aquí incluye aquellos compuestos que tiene actividad inhibidora de calpaína I además de o independientemente de sus otras actividades biológicas. Una amplia variedad de compuestos han demostrado que tienen actividad para inhibir la acción proteolítica de las calpaínas. Ejemplos de inhibidores de calpaína que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen N-acetil-leu-leu-norleucina conocido también como "inhibidor de calpaína 1". Se ha observado que los inhibidores de calpaína aumentan la infectividad de las células con respecto a los vectores virales, mejorando la transcripción de los promotores, al incrementar los niveles de los factores de transcripción de NF-kappa B y AP-1 y disminuyendo la respuesta CTL a los vectores adenovirales. Por consiguiente, las formulaciones y los métodos de la presente invención pueden incluir opcionalmente inhibidores de calpaína. Los inhibidores de calpaína y sus aplicaciones han sido descritos en la solicitud de patente norteamericana copendiente acta No. 60/140,321 y 09/073,076 presentada el 15 de octubre de 1998 de Atencio y otros.

Métodos de uso La presente invención provee un método para matar una célula con un defecto de vía reguladora mediante el contacto de la célula objetivo con un vector selectivamente replicante de la presente invención. En una modalidad de la invención ejemplificada aquí, la célula que contiene un defecto de vía es una célula neoplástica. El término "célula neoplástica" significa una célula que exhibe un fenotipo de desarrollo aberrante caracterizado por la independencia de los controles de desarrollo celular normal. Como las células neoplásticas no son necesariamente replicantes en ningún punto de tiempo determinado, el término células neoplásticas compende células que pueden ser activamente replicantes o que están en un estado de reposo no replicante temporal (G1 o GO). Las poblaciones localizadas de células neoplásticas se definen como neoplasmas. Los neoplasmas pueden ser malignos o benignos. Los neoplasmas malignos se definen también como cánceres. El término cáncer se usa intercambiablemente aquí con el termino tumor. Transformación neoplástica se refiere a la conversión de una célula normal en una célula neoplástica, a menudo una célula tumoral. La presente invención provee un método de ablación de células neoplásticas en un organismo de mamífero in vivo mediante la administración de una formulación farmacéutiamente aceptable del adenovirus recombinante de la presente invención. El término "ablación" se refiere a la reducción substancial de la población de células neoplásticas viables para aliviar los malestares fisiológicos causados por la presencia de células neoplásticas. El término "substancial" significa una reducción de la población de células neoplásticas viables en el organismo de un mamífero, en más de aproximadamente un 20% de la población de pretratamiento. El término "viable" significa que tiene el crecimiento descontrolado y las características reguladoras del ciclo celular de una célula neoplástica. El término "célula neoplástica viable" se usa aquí para distinguir dichas células de las células neoplásticas que no son ya capaces de replicación. Por ejemplo, una masa tumoral puede permanecer después del tratamiento, sin embargo la población de células que está comprendida en la masa tumoral puede estar muerta. Estas células muertas han sido sometidas a ablación y carecen de la capacidad de replicarse, incluso a pesar de que pueda permanecer alguna masa tumoral. El término "organismo de mamífero" incluye, pero no está limitado a seres humanos, cerdos, caballos, ganado, perros, gatos. Preferiblemente se emplea un vector adenoviral endógeno para el tipo de mamífero que se está tratando. Aunque generalmente se favorece el empleo de un virus de las especies que deben tratarse, en algunos casos puede ser ventajoso usar vectores derivados de diferentes especies que poseen favorables características patogénicas. Por ejemplo se ha informado (WO 97/06826 publicada el 10 de abril de 1997) que los vectores adenovirales ovinos pueden usarse en terapia génica humana para minimizar la respuesta inmunitaria característica de los vectores adenovirales humanos. Al minimizar la respuesta inmune, se evita una rápida desaparición sistémica del vector lo cual da como resultado una mayor duración de la acción del vector. Los vectores de la presente invención son particularmente aplicables al tratamiento de los tumores que están asociados con una falta de acción antiproliferativa de TGF-ß incluyendo pero sin limitarlo a los carcinomas de mama, hepatomas, tumores gástricos, de colon y de la piel, así como también los linfomas B y T (Markowitz y Roberts, 1996). Mutaciones del tipo II del receptor TGF-ß han sido identificadas en carcinomas escamosos del colon, gástrico, cabeza y cuello. Las mutaciones o deleciones de los receptores de tipo I también se han hallado en el sarcoma de Kaposi, y tumores de mama, ovarios y colorectales. Entre los efectores intracelulares de los Smads de la señalización de TGF-ß, el Smad4/DPC4 se identificó como un candidato de genes supresores de tumores que fueron alterados en casi el 50% de los cánceres pancreáticos. La alteración del gen DPC4 se ha hallado también en los tumores de colon, mama y ovario aunque con una frecuencia mucho menor. Los vectores de la presente invención son particularmente aplicables en el tratamiento de los tumores insensibles a TGF-ß tales como el cáncer pancreático. Los vectores de la presente invención son también aplicables al i-atamiento de células tumorales que contienen los defectos de ia vía p53. Estos tumores incluyen aquellos que poseen alteraciones en p53, mdm2 y p14/p19ARF(gen INK4a). Los vectores de la presente invención también son útiles para tratar células cancerosas con los defectos de la vía Rb. Los defectos de la vía Rb son el resultado de las alteraciones de Rb, ciclina D, kinasa dependiente de ciclina (tal como CDK4) y p16 (gen INK4a). Aunque la presente invención provee un método de uso de los adenovirus recombinantes solos, los adenovirus recombinantes de la presente invención y las formulaciones de los mismos pueden emplearse en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales o por regímenes de tratamiento convencionales. Entre los ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos se ¡ncluyen inhibidores de la síntesis de purina (por ejemplo, pentostatina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, metotrexato) o síntesis de pirimidina (por ejemplo Pala, azarbina), la conversión de ribonucleótidos a desoxiribonucleótidos (por ejemplo hidroxiurea), inhibidores de la síntesis de dTMP (5-fluoroacilo), agentes deteriorantes de ADN (por ejemplo radiación, bleomicinas, etoposida, teniposida, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, mitoxantrona, agentes alquilantes, mitomicina, cisplatina, procarbazina) así como también inhibidores de la función microtubular (por ejemplo vinca alcaloides y colquicina). Los regímenes de tratamiento quimioterapéutico se refieren principalmente a procedimientos no químicos diseñados para la ablación de células neoplásticas tales como terapia de radiación. Ejemplos de terapia de combinación cuando el gen terapéutico es p53, han sido descritos en Nielsen y otros WO/9835554A2 publicada el 20 de agosto de 1998. La respuesta inmunológica es significativa para la administración repetida in vivo de los vectores virales. Por consiguiente, los vectores de la presente invención pueden ser administrados en combinación con agentes inmunosupresores. Ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen ciclosporina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, inmunogobluina linfocítica, anticuerpos contra el complejo CD3, adrenocorticosteroides, sulfasalazina, FK-506, metoxsalen y talidomida. La presente invención provee también un método de ablación de células neoplásticas en una población de células normales contaminadas por dichas células neoplásticas ex vivo mediante la administración de adenovirus recombinantes de la presente invención a dicha población. Un ejemplo de la aplicación de dicho método consiste en las aplicaciones corrientemente empleadas en aplicaciones ex vivo tales como la purga de productos autólogos de células generadoras de estirpe que se conoce comúnmente como purga de médula ósea. El término "producto de células generadoras de estirpe" se refiere a una población de células hematopoyéticas, progenitoras y generadoras de estirpe que son capaces de reconstituir la función hematopoyética a largo término en un paciente que ha recibido terapia mioablativa. Los productos de células generadoras de estirpe se obtienen convencionalmente mediante aféresis o a partir de sangre periférica movilizada o no movilizada. La aféresis se logra convencionalmente a través del uso de procedimientos conocidos usando aparatos para féresis comercialmente obtenibles tales como el COBE Spectra Apheresis system, comercialmente obtenible en COBE Inernational, 1185 Oak Street, Lakewood, CO. Se prefiere optimizar las condiciones de tratamiento para lograr una "purga 3-logarítmica" (es decir remoción de aproximadamente 99.9% de las células tumorales del producto de la célula generadora de estirpe) y más preferiblemente una "purga 5-logarítmica" (remoción de aproximadamente 99.999% de las células tumorales del producto de la célula generadora de estirpe). En la práctica preferida de la invención, un producto de célula de estirpe de un volumen de 100 ml sería tratada en una relación de número de partícula a célula nucleada de aproximadamente 2 x 1011 de los vectores de la presente invención por un período de aproximadamente 4 horas a 37°C.

Aplicaciones para diagnóstico Además de las aplicaciones terapéuticas descritas precedentemente, los vectores de la presente invención son también útiles para propósitos de diagnóstico. Por ejemplo, los vectores de la presente invención pueden incorporar un gen informante que se expresa mediante replicación o infección viral. El término "gen informante" se refiere a un gen cuyo producto es capaz de producir una señal detectable solo o en combinación con elementos adicionales. Ejemplos de genes informantes incluyen el gen de ß-galactosidasa, el gen de luciferasa, el gen de proteína fluorescente verde, las secuencias nucleotídicas que codifican proteínas que son detectables mediante sistemas de formación de imagen tales como rayos X o sistemas de formación de imagen por campo magnético (MRI). Dichos vectores serían útiles para detectar la presencia de una vía funcional (por ejemplo p53 o la vía TGF-beta). Alternativamente, dichos vectores pueden emplearse también para expresar una proteína de superficie de célula capaz de ser reconocida por una molécula cohesiva tal como un anticuerpo fluorescentemente rotulado. Alternativamene, cuando se usa un promotor que responde a la vía, para dirigir un represor de replicación viral (por ejemplo E2F-Rb) los promotores virales tardíos (por ejemplo E2 que es invertido por E2F-Rb o cualquier otro promotor con sitios cohesivos represores por ejemplo sitios cohesivos E2F) podrían usarse para dirigir el gen informante para aplicaciones de diagnóstico donde el promotor que responde a la vía está afuera. Estas construcciones de diagnóstico pueden usarse para propósitos de diagnóstico in vivo o in vitro. Ejemplos de aplicaciones in vivo incluyen la formación de imágenes tales como rayos X, exploradores CT o Formación de Imágenes por Resonancia Magnética (MRI).

Métodos de preparación de los vectores La presente invención provee además un método de producción de los virus recombinantes descritos más arriba, comprendiendo dicho método las etapas de: a. infectar una célula productora con un virus recombinante, b. cultivar dicha célula productora infectada bajo condiciones que permiten la replicación del genoma viral en la célula productora, c. cosechar las células productoras, y d. purifricar el virus recombinante. El término "infectante" se refiere a exponer el virus recombinante a la célula productora bajo condiciones que facilitan la infección de la célula productora con el adenovirus recombinante. En las células que han sido infectadas por copias múltiples de un virus determinado, las actividades necesarias para la replicación viral y el empaquetamiento de viriones son cooperativas. Por lo tanto, se prefiere ajustar las condiciones de manera que exista una significativa probabilidad de que las células productoras estén múltiplemente infectadas con el virus. Un ejemplo de una condición que mejora la produción del virus en la célula productora es un aumento de la concentración del virus en la fase de infección. Sin embargo, es posible que la cantidad total de infecciones virales por célula productora pueda excederse, lo cual daría como resultado efectos tóxicos para la célula. Por consiguiente, sería necesario esforzarse en mantener las infecciones en una concentración de virus en la escala de 1 x 106 a 1 x 1010, preferiblemente aproximadamente 1 x 109, viriones por ml. También pueden emplearse agentes químicos para aumentar la infectividad de la línea de célula productora. Por ejemplo, la presente invención provee un método para aumentar la infectividad de las líneas de células productoras para infectividad viral mediante la inclusión de un inhibidor de calpaína. Ejemplos de inhibidores de calpaína que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen el inhibidor de calpaína 1 (conocido también como N-acetil-leucil-leucil-norleucina, comercialmente obtenible en Boehringer Mannheim). Se ha observado que el inhibidor de calpaína 1 aumenta la infectividad de las líneas de células productoras para los adenovirus recombinantes. El término "célula productora" significa una célula que es capaz de facilitar la replicación del genoma viral del adenovirus recombinante que se desea producir. Se encuentran públicamente disponibles una variedad de líneas de células de mamífero para el cultivo de adenovirus recombinantes. Por ejemplo la línea de célula 293 (Graham y Smiley (1977) J. Gen. Virol 36:59-72) ha sido manipulada para complementar las deficiencias en la función E1 y es una línea de célula preferida para la producción de los vectores corrientes. Ejemplos de otras células productoras incluyen células HeLa, células PERC.6 (tal como se describió en la publicación WO/97/00326, solicitud acta No. PCT/NL96/00244. El término "cultivar bajo condiciones para permitir la replicación del genoma viral" significa mantener las condiciones para la célula productora infectada de manera de permitir que el virus se propague en la célula productora. Es conveniente controlar las condiciones para llevar a un punto máximo la cantidad de partículas virales producidas por cada célula. Por consiguiente, será necesario monitorear y controlar las condiciones de reacción tales como la temperatura, el oxígeno disuelto, el pH, etc. Los biorreactores comercialmente asequibles tales como CeliGen Plus Bioreactor (obtenible comercialmente en New Brunswick Scientific, Inc. 44 Talmadge Road, Edison, NJ) tienen las provisiones para controlar y mantener dichos parámetros. La optimización de las condiciones de infección y cultivo variarán en cierto modo, sin embargo, las condiciones para una eficiente replicación y producción de los virus pueden ser logradas por los expertos- en la técnica, teniendo en cuenta las propiedades conocidas de la línea de célula productora, las propiedades del virus, el tipo de biorreactor, etc. Cuando se emplean 293 células como línea de célula productora, la concentración de oxígeno se mantiene preferiblemente desde aproximadamene 50% hasta aproximadamente 120% de oxígeno disuelto, preferiblemente 100% de oxígeno disuelto. Cuando la concentración de partículas virales (determinada por métodos convencionales tales como HPLC usando una columna Resource Q) comienza a formar meseta, se cosecha el reactor.

El término "cosechar" se refiere a recolectar del medio las células que contienen el adenovirus recombinante. Esto puede lograrse mediante métodos convencionales tales como centrifugación diferencial o medios cromatográficos. En esta etapa, las células cosechadas pueden almacenarse o pueden procesarse adicionalmente por lisis y purificación para aislar el virus recombinante. Para el almacenamiento, las células cosechadas deberían tener el pH regulado en o aproximadamente a un pH fisiológico y deberían congelarse a -70°C. El término "lisis" se refiere a la ruptura de las células productoras. La lisis puede lograrse mediante una variedad de medios que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Cuando se desea aislar las partículas virales de las células productoras, las células son lisadas, usando una variedad de medios que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células de mamífero pueden usarse bajo presión baja (7.03-14.06 kg/cm2 de presión diferencial) o por medios convencionales de congelación -descongelación. El ADN/ARN exógeno libre es removido por degradación con ADNsa/ARNsa. El término "purificación" significa la aislación de una población de partículas de virus recombinantes substancialmente puras. Pueden emplearse técnicas de purificación convencionales tales como centrifugación por gradiente de densidad cromatográfica o diferencial. En la práctica preferida de la invención, el virus se purifica por cromatografía en columna en substancial acuerdo con el procedimiento de Huyghe y otros (1995 Human Gene Therapy 6: 1403-1416 tal como se describe en la solicitud de patente norteamericana copendiente acta No. 08/400,793 presentada el 7 de marzo de 1995. Los métodos y procedimientos adicionales para optimizar la producción de los adenovirus recombinantes de la presente invención se describen en la solicitud de patente norteamericana copendiente acta No. 09/073,076, presentada el 4 de mayo de 1998, titulada "Procedimiento de Producción Viral".

EJEMPLOS Los ejemplos siguientes proveen la metodología y les resultados de experimentos que demuestran la construcción de vectores particulares plásmidos y adenovirales recombinantes. Será evidente para los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención, que la presente invención puede estar realizada en formas distintas de las que se describen específicamente en estos ejemplos, sin apartarse del espíritu o características esenciales de la invención. Las modalidades particulares de la invención descritas a continuación, deben considerarse por lo tanto ilustrativas y no restrictivas. En los ejemplos siguientes "g" significa gramos, "ml" significa mililitros, "mol" significa moles, "°C" significa grados centrígrados, "min" significa minutos, "FBS" significa suero bovino fetal, y "PN" se refiere a la cantidad de partículas de virus recombinante.

EJEMPLO 1 Construcciones de plásmidos El pdOOluc, un plásmido que codifica la luciferasa bajo el control del promotor PAI de 800 pb se obtuvo del Dr. David Luskutoff (Scripps Institute, LaJolla, California). El plásmido pCTMIE-E2F-Rb que contiene el promotor CMV seguido de la secuencia líder adenovirus-5-tripartita, y de un mejorador SV40 hacia el extremo 5' de la secuencia codificadora para la proteína de fusión E2F-RB fue provisto por Doug Antelman (Canji).

EJEMPLO 2 Construcción de plásmidos de luciferasa con promotores que responden a TGF-ß A. Plásmido de PAI-luciferasa Las secuencias de todos los fragmentos se muestran en la dirección 5'-3' dirección del fragmento A de 749 pb flanqueado con los sitios Sacl y Xhol en los extremos 5' y 3' respectivamente, y la caja SV40 TATA en vez de la caja TATA natural dentro del promotor, fue amplificada mediante PCR usando pdOOluc como molde y los cebadores AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA y GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (que contiene la caja SV40 TATA). El producto de PCR resultante fue digerido con Sacl y con Xhol y fue ligado a un fragmento obtenido después de digestión de PGL3-básico, una construcción de luciferasa sin promotor (Promega), para obtener PAI-luciferasa.

B. Plásmido de SRE-luciferasa Se acoplaron los siguientes oligonucleótidos, GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC y GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC. El producto acoplado fue digerido con Xhol y fue ligado a PGL-3-básico digerido con Mlul, terminado en extremo romo con Klenow y digerido con Xhol para obtener pSVT-luc (una construcción de luciferasa con caja SV40 TATA). Los oligonucleótidos que contenían sitios de adhesión Smad4/DPCA, CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC y AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC fueron acoplados y ligados a pSVT-luciferasa digerida con Kpnl para obtener el plásmido SRE-luciferasa.

EJEMPLO 3 Construcción de plásmidos de luciferasa con promotores que responden a p53 A. Plásmido RGC-lucíferasa Dos oligonucleótidos 5'-fosforilados complementarios que contenían sitios de adhesión p53 del cúmulo de genes ribosomales, AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC y CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC fueron moldeados. El fragmento moldeado se ligó a pSVT-luciferasa digerida con Kpnl para obtener el plásmido RGC-luciferasa.

B. Plásmido de p53CON-luciferasa Dos oligonucleótidos 5'-fosforilados complementarios que contenían sitios cohesivos de consenso p53 (p53 CON), CT CGA CGG ACA GC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC y AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC fueron moldeados. El fragmento moldeado se ligó a pSVT-luciferasa digerida con Kpn! para obtener el plásmido p53CON-luciferasa.

C. Plásmido PAI-E2F-Rb La secuencia que contenía el promotor CMV seguido de la secuencia líder adenovirus-5-tripartita y un mejorador SV40 cadena arriba de la secuencia codificadora para la proteína de fusión E2F-RB en el plásmido pCTMIE-E2F-Rb fue extirpada mediante digestión con Bgll y Xbal y el fragmento resultante fue ligado para obtener el plásmido promotor-menos E2F-RB. Un fragmento que contenía el promotor PAI modificado fue extirpado del plásmido PAI-luciferasa mediante digestión con Sacl y Xhol y fue terminado en extremo romo mediante tratamiento con Klenow. Este fragmento fue ligado al plásmido promotor-menos E2F-RB el cual fue digerido con EcoRI y tratado con el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN para obtener el plásmido PAI-E2F-RB.

EJEMPLO 4 Generación de adenovirus recombinantes Un plásmido de transferencia que contenía la secuencia Ad5 con deleción de 3kb en la región E3 pNEB?E3 fue construido por clonación de un fragmento SnaBI de 7.4 kb de pBHG11 (26676 a 34140) para pNEB193 (plásmido de NEB) tratado con BamHI, Accl y Klenow. Se introdujo un sitio de clonación múltiple para el plásmido anterior mediante acoplamiento de los oligonucleótidos 5-fosforilados, AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAGA GAT CCT TAA T y TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T e introducción del fragmento acoplado mediante ligamiento al pNEB?E3 digerido con Pací, para obtener el plásmido pNEB?E3(MCS). El plásmido de transferencia para generar un adenovirus recombinante que codifica E2F-Rb bajo el control del promotor PAI y la proteína fluorescente verde mejorada (GFP) bajo el control del promotor CMV fue construido de la manera siguiente. Se preparó un vector intermediario pABS.4-E2F-Rb ligando un fragmento que contenía el promotor PAI y la secuencia codificadora E2F-Rb preparada mediante digestión de PAI-E2F-Rb con Nací y Xbal y ligando al fragmento plásmido pABS.4 (Microbix) preparado por digestión con Kpnl, tratando con Klenow y redigiriendo con Xbal. Luego se extirpó un fragmento que contenía el promotor PAI, la secuencia codificadora E2F-Rb y el gen de Kanamicina, desde el plásmido PABS.4-E2F-Rb mediante digestión con Pací, se trató con Klenow y se ligó al fragmento plásmido obtenido por digestión del plásmido pNEB?E3 digerido con Pací, y tratando con Klenow para obtener el plásmido pNEB?E3-PAI-E2RF-Rb, sin ningún sitio Pací. El gen de kanamicina en este plásmido fue reemplzado con el promotor CVV operativamente ligado al gen de proteína fluorescente verde (GFP) mediante digestión de pNEB?E3-PAI-E2RF-Rb con Swal y ligándolo al fragmento aislado de pEGFP-N (Clontech) mediante digestión con Aflll y Sspl y tratándolo con Klenow, para obtener el plásmido p?E3-PAI-E2F-Rb-GFP. Los plásmidos de transferencia para generar adenovirus recombinantes que codifican E2F-Rb bajo el control de un promotor que responde a TGF-ß con SRE y proteína fluorescente verde mejorada (GFP) bajo el control del promotor CMV fueron construidos de la manera siguiente. Se introdujo la secuencia codificadora E2F-Rb en el plásmido pNEB?E3(MCS) para obtener el plásmido pNEB?E3-E2F-Rb mediante ligamiento de un fragmento aislado por digestión de pNEB?E3(MCS) con Xbal y Nae I. Se introdujo un promotor que respondía a TGF-ß que contenía SRE en el plásmido precedente mediante la amplificación de esta secuencia por medio de PCR usando SRE-luciferasa como molde y los cebadores fosforilados, GTA AGC TGC CAG AAC ATT TCT C y GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T. El producto resultante de la PCR fue digerido con Spel y fue ligado a pNEB?E3-E2F-Rb digerido con SnaBI y Xbal para obtener p?E3- DPC-E2F-Rb. Los plásmidos de transferencia para generar adenovirus recombinantes que codifican E2F-Rb bajo el control de promotores que responde a p53 y mejorar la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor CMV fueron construidos de la manera siguiente, el promotor que responde a p543 que contiene los sitios cohesivos p53 del cúmulo de genes ribosomales o el sitio de consenso p53 (p53CON) fue introducido en el plásmido pNEB?E3-E2F-Rb mediante amplificación de la secuencia promotora por PCR usando RGC-luciferasa o p53CON-luciferasa como molde y los cebadores fosforilados, GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C y GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T. Los productos de PCR resultantes fueron digeridos con Xbal y ligados a pNEB?E3-E2F-Rb digerido con SnaBI y Xbal para obtener p?E3-RGC-E2F-Rb y pdelataE3-PCON-E2F-Rb.

EJEMPLO 5 Recombinación homologa para generar adenovirus recombinantes Se generaron adenovirus recombinantes, PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad y Con-Ad efectuando recombinación homologa en bacterias tal como se describe en (Chartier y otros (1996) J. Virol. 70:4805-4810). Los plásmidos transferidos fueron digeridos con Ascl para obtener los fragmentos que contienen E2F-Rb bajo el control del promotor que responde a la vía y GFP bajo el control del promotor CMV flanqueado por las secuencias Ad5. El fragmento resultante fue cotransformado en la cepa bacteriana BJ 5183 con un fragmento obtenido mediante digestión de PTG4609 (obtenible en Transgene, Inc. y descrito en Chartier y otros (1996) J. Virol 70:4805-4810) con BstBI y Spel. Las colonias bacterianas resultantes fueron rastreadas para determinar la presencia de los plásmidos infecciosos Ad5 recombinantes deseados, pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad y pCON-GFP-Ad. Estos plásmidos infecciosos fueron luego linearizados mediante digestión con Pací y se purificaron mediante extracción de fenol-cloroformo y precipitación con etanol y se usaron para la transfección de 293 células. La transfección se llevó a cabo usando Superfect (Qsagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron 2.5 µg de plásmidos linearizados para la transfección de 250,000 células cultivadas en placas de 6 pozos con 12 µl de Superfect/pozo. Después de 8 días se observó un efecto citopático debido a la producción de virus. Se cosecharon las células junto con los sobrenadantes de cultivo y se sometieron a tres vueltas de ciclos de congelación-descongelación. Los virus recombinantes en los lisados resultantes fueron amplificados mediante la reinfección con 293 células.

EJEMPLO 6 Líneas de células Todas las líneas de células usadas en este estudio fueron obtenidas a partir de ATCC (Rockville, MD) y se cultivaron como cultivos de monocapas mantenidos a 37°C en un incubador con CO2. 293, Hep3B, MRC9, A549, Panel, U87, Caco2, MCF-7 y WIDR se mantuvieron en un medio Eagle modificado con Dulbecco suplementado con 10% de sueron bovino fetal. Mientras que se cultivaron células MiaPaca-2 en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal y 2.5% de suero de caballo.

EJEMPLO 7 Transfección Se depositaron células en placas de 6 pozos (250,000 células/pozo) o en placas de 24 pozos (62,500 células/pozo) y se dejaron unir durante la noche. Luego se llevaron a cabo transfecciones usando fosfato de calcio para 293 células tal como se ha descrito y con Superfect (Qiagen) para otras células de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 8 Ensayos de informante/luciferasa Las células fueron transfectadas con 1.5 µg de plásmido informante y 1.0 µg de los inhibidores. Se prepararon lisados de post-transfección de 48 h mediante el agregado e incubación a temperatura ambiente durante 10 min en regulador de lisis informante 1X (Promega). La actividad de luciferasa se determinó usando Top Count (Packard) y un equipo de ensayo de Packard de acuerdo con las instrucciones de Packard.

EJEMPLO 9 Ensayos para medir el efecto citopático mediado por virus Se infectaron células con adenovirus de tipo silvestre o recombinante y se tiñeron con 0.5% de cristal violeta preparado en 20% de etanol 6 días después de la infección de acuerdo substancial con el procedimiento descrito en Bischoff y otros (1996) Science 274:373-376.

EJEMPLO 10 Construcción de virus cU3EE v cT1 LT Se amplificó la secuencia promotora MLP mediante PCR usando los cebadores GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC y GAT CTT AAT TAA ATGGCA GTG ACC CGG AAG usando ADN Ad5 tal como en el plásmido pFG140 (Nmicrobix) como molde. Luego se clonó el producto MLP de PCR en el sitio Pací en el plásmido pdelataE3-PCON-E2F-Rb para obtener pdetataE3-PCON-E2F-Rb-MLP. Se amplificó la secuencia codificadora de proteína de adenovirus E3 10.5K mediante PCR usando los cebadores, GCG ACC CAC CCT AAC AGA y GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A y el producto de PCR resultante se clonó en el sitio Hxol en el plásmido pCDNA3.1 (Invitrogen) para obtener el plásmido pCDNA3-10.5. Luego se extirpó la secuencia codificadora de la proteína de 10.5K E3 de adenovirus, a partir de pCDNA3-10.5 mediante digestión con Dralll y Xbal seguido de tratamiento con Klenow y se ligó con Pací y pdelataE3-PCON- E2F-Rb-MLP para obtener el plásmido pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K. Se generaron adenovirus recombinantes cU3EE y cT1LT efectuando recombinación homologa en bacterias tal como ha sido descrito (Chartier y otros 1996, J. Virol. 70:4605-4610). El plásmido de transferencia fue digerido con Ascl para obtener los fragmentos que contenían E2F-Rb bajo el control de la secuencia p53CON y E310.5K bajo el control del promotor MLP flanqueado por las secuencias Ad5. El fragmento resultante fue cotransformado en la cepa bacteriana BJ 52d3 con un fragmento obtenido mediante digestión de PTG4609 (Transgene) con BstBI y spel. Las colonias bacterianas resultantes fueron rastreadas para determinar la presencia del plásmido infeccioso Ad5 recombinante deseado pCEMD. El plásmído infeccioso Add p01/CEMD se obtuvo siguiendo un protocolo similar pero usando un derivado de PTG4609 (Transgene) en el cual la secuencia E1A de tipo silvestre fue reemplazada con una secuencia que contenía E1A con una mutación 01. Estos plásmidos infecciosos fueron luego linéarizados por digestión con Pací, se purificaron con extracción de fenol-cloroformo y con precipitación con etanol y se usaron para la transfección de 293 células. La transfección de los plásmidos pCEMD y p01/CEMD se efectuó para generar los virus recombinantes cU3EE y cTILT respectivamente usando 2.5 µg de plásmidos linearizados para la transfección de 500,000 células cultivadas en placas de 6 pozos con 12 µl de Superfect/pozo. Después de 3 días se observó un efecto citopático debido a la producción de virus. Las células fueron cosechadas junto con ¡os sobrenadantes de cultivo y se sometieron a tres vueltas de ciclos de congelación-descongelación. Los virus recombinantes en los lisados resultantes fueron amplificados mediante la reinfección de 293 células.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un vector viral recombinante selectivamente replicante que comprende un promotor de respuesta a la vía ligado operativamente a un represor de replicación viral.

2.- El vector de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el promotor de respuesta a la vía se selecciona del grupo que consiste en un promotor de respuesta a la vía p53, un promotor de respuesta a la vía Rb y un promotor de respuesta a la vía TGF-beta.

3.- El vector de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el virus se deriva del género adenoviridiae.

4.- El vector de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el represor de replicación viral es E2F-RB.

5.- El vector de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende además un cassette de expresión transgénica.

6.- El vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el cassette de expresión transgénica comprende un gen proapoptótico ligado operativamente a un promotor.

7.- El vector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el gen activador de profármaco es Add E3-10.5 K. 3.- El vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el promotor de respuesta a la vía es un promotor de respuesta a la vía pd3. 9.- El vector de conformidad con la reivindicación d, caracterizado además porque el promotor de respuesta a la vía pd3 es pd3CON. 10.- El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el componente promotor del cassette de expresión transgénica es un promotor temporal. 11.- El vector de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el promotor temporal es MLP. 12.- El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque comprende una deleción en la región codificadora E1a adenoviral con el fin de eliminar la adhesión p300. 13.- El vector de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la deleción en la región codificadora E1a adenoviral comprende una deleción de aminoácidos 4-2d de las proteínas E1a 239R y 243R. 14.- Una formulación farmacéutica que comprende como ingrediente activo un vector recombinante selectivamente replicante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables del mismo. 1d.- Un método para eliminar una célula con un defecto de vía mediante el contacto de dicha célula con un virus recombinante selectivamente replicante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13. 16.- Un vector viral selectivamente replicante, o una formulación farmacéuticamente aceptable del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para usarse en el tratamiento de cáncer, 17.- Una célula transformada con virus recombinante selectivamente replicante que comprende un promotor de respuesta a la vía ligado operativamente a un represor de replicación viral. 1

8.- Un promotor de respuesta a la vía pd3 seleccionado del grupo que consiste en pd3CON y RGC. 1

9.- Un promotor de respuesta a la vía TGF-beta seleccionado del grupo que consiste en PAI y SRE. 20.- Un procedimiento para producir un vector viral selectivamente replicante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende infectar una población de células productoras con una muestra de dicho vector, cultivar dicha línea de células productoras bajo condiciones que permitan la replicación de dicho vector en dichas células productoras y aislar el vector de las células productoras.