MXPA01003538A

MXPA01003538A - Metodo para el tratamiento de quimionucleolisis.

Info

Publication number: MXPA01003538A
Application number: MXPA01003538A
Authority: MX
Inventors: Howard An
Original assignee: Rush Presbyterian St Luke
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2005-09-08
Also published as: JP2013075173A; ES2389555T3; DE69933686D1; AU2004202345A1; ATE305310T1; EP1117422A1; DE69927512T2; EP2374870A2; AU772479B2; WO2000020559A1; US7132098B2; AU5330199A; JP2002526167A; CA2343698A1; JP5623764B2; CA2343698C; JP2015126921A; US20040033221A1; ES2478257T3; JP2010137085A

Abstract

La invencion se relaciona a un metodo de tratamiento para un mamifero que requiere la quimionucleolisis. El metodo comprende la administracion de una cantidad efectiva de proteoglicano, que se somete a la segmentacion de enzima que degrada el proteoglicano y una cantidad efectiva de un factor de crecimiento, efectivo en la promocion de la sintesis de un componente de matriz. La enzima que degrada el proteoglicano es preferentemente la condroitinasa. El factor de crecimiento es preferentemente la proteina osteogenica. La enzima que degrada el proteoglicano, y el factor de crecimiento, se administran preferentemente de forma simultanea.

Description

MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE QUIMIONUCLEÓLISIS DESC l RIPCIÓN Soporte Gubernamental Esta invención se realizó con el soporte del gobierno de E.U.A., según NIH, concesiones 2-P50-AR39239 y AG04736. El gobierno de E.U.A., tiene ciertos derechos en la invención.

Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente de E.U.A., No. de Serie 60/103,161, presentada el 6 de octubre de 1998, la cual se incorpora aqui, en su totalidad, como referencia.

Campo de la Invención La invención se refiere a un método para el tratamiento de un mamífero, que lo necesite, de la quimionucleólisis . Más específicamente, la invención se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad de desdoblamiento del proteoglicano de una enzima que degrada este proteoglicano y una cantidad efectiva, que sintetiza el proteoglicano de un factor de crecimiento.

Antecedentes de la Invención El dolor en la espalda baja constituye una carga económica devastadora para los individuos y la sociedad. EN la industria, es la causa más frecuente de incapacidad: el número de días de trabajo perdidos por año en los Estados Unidos de América es mayor de 100 millones. Kramer, J., Intervertebral Disk Disease. Stuttgart, George Thieme Verlag (1981). Más de 500,000 trabajadores son afectados en E.U.A. , cada año, con un costo mayor de 20,000 millones de dólares. Kranzler, L. I., L et al., Neurologic Clinics 3: 2 (1985). El dolor en la espalda baja está casi siempre asociada con los cambios patológicos en uno o más discos intervertebrales de la espina lumbar. Los discos intervertebrales son un tejido conjuntivo fibrocartilaginoso especializado, cuya función es resistir los esfuerzos de compresión, rotación y tensión aplicados a la columna vertebral. Humzah, M.D. et al., Anat. Rec. 220(4): 337-56(1988). Estos discos actúan como un absorbente de los choques hidrostáticos que acojinan las fuerzas generadas entre dos vértebras y ayudan a estas vértebras a articular suavemente entre sí. El disco es una estructura compleja, que consiste de dos regiones interdependientes, pero distintas morfológicamente; el núcleo pulposo (NP) , un cojín gelatinoso interno, rico en proteoglicanos (PG) y un espacio anular externo fibroso (AF) , obtenido de láminas concéntricas ricas en fibras de colágeno. El metabolismo de las células que producen y mantienen la matriz extracelular de tanto el NP como el AF v , 5 se entiende pobremente. La matriz en el NP es muy similar a aquél encontrado en el cartílago articular. Jahnke, M.R., et al., Biochemical Journal 251(2): 347-56 (1988). Se sintetiza y mantiene a través de la vida adulta por relativamente pocas células. Más del 75% de las células de NP con de tipo 10 condorcitos, pero un número significante de células ^ notocordales grandes están presentes, especialmente antes de la vida adulta. Maldonado, B.A. et al., Journal of Orthopaedic Research 10(5): 677-90 (1992). No es claro si ambos tipos de células de NP sintetizan el PG hidrofílico, 15 de peso molecular grande, nombrado agrecano, que constituye las moléculas más abundantes en el tejido. Como en el cartílago articular, estas moléculas de agrecano interactúan extracelularmente con los cordones lineales grandes del ^ hialuronano (HA) , que forma agregados que llegan a 20 enmarañarse en una red fibrilar compuesta principalmente de colágeno de tipo II. Thonar, E. J. Et al., Rheum, Dis, Clin. North ñm. 19(3) : 635-57 (1993) . Las propiedades de hinchamiento, y de transporte de fluidos e iones, y las propiedades mecánicas intrínsecas de la matriz sólida del 25 colágeno-agrecano, gobiernan el comportamiento de deformación del NP. La red de colágeno da la resistencia de tensión del tejido y obstruye la expansión de las moléculas de agrecano, viscoelásticas, sub-hidratadas, que suministran la rigidez compresiva y habilitan que el tejido se someta a una deformación reversible. El AF contiene una población, relativamente homogénea, de células de tipo condorcitos (Maldonado, B.A., et al., Journal of Orthoaedic Research 10(5): 677-90 (1992)) que sintetizan una matriz más rica en colágeno y más pobre en los PG, que las células del NP. Importantemente, algunas de las células sintetizan el PG y las moléculas de colágeno que no se encuentra normalmente en cantidades significantes en el cartílago. Wu, J. J. et al., Biochemical Journal 248(2): 373-81 (1987); Mayne, R. y Brewton, R.G., "Matriz extracelular del colágeno del cartílago", en Joint Cartilage Degradation. Basic and Clinical Aspects (Woessner, J.R. y Howell, D.S., Eds.). Marcel Dekker, Inc. New York, páginas 81-108 (1993); Thonar, E. J. -M. A., et al., "Marcadores del fluido del cuerpo de los cambios del cartílago en la osteoartritis", en Rheumatic Disease Clínícs of North America: Osteoarthritis (Moskowitz, R., Ed.), W. B. Saunders Co., Philadelphia, páginas 634-658 (1993). El AF es así clasificado usualmente como un fibrocartílago: se construye para la resistencia, más bien que suministrar una deformación reversible.

El metabolismo de las células de discos intervertebrales es mucho menos conocido que aquél de los condorcitos del cartílago articular. El progreso en esta área ha estado limitado por la naturaleza costosa de los acercamientos experimentales in vivo y las restricciones impuestas en el pasado por la carencia de un sistema de cultivo apropiado para estudiar el metabolismo de las células. Chiba et al.# (Chiba K. et al., "Células de núcleos pulposos y fibrosas del espacio anular, cultivadas en alginato: caracterización del metabolismo de matriz en diferentes compartimientos," Transactions of 2nd Co bined Meeting of the Orthopaedic Research Societies of U.S. A., Japan, Canadá y Europe, p. 32 (1995)) han desarrollado un sistema de cultivo celular que toma ventaja de un sistema de cultivo de glóbulos de alginato que se desarrolló y refino para estudiar el metabolismo de los condrocitos estables fenotipicamente y el cambio en la matriz que ellos forman de novo. Háuselmann, H. L. et al., Matxix 12(2): 116-29 (1992); Hauselmann, H. J. et al., J. Cell Sci. 107: 17-27 (1994); Mok, S. S. et al., J. Biol.Chem 269(52): 33021-7 (1994); Petit, B. et al., Experimental Cell Research 225:151-161 (1996) . Como en los condorcitos articulares, las células del disco intervertebral atrapadas en estos glóbulos de alginato, también reforman una matriz extracelular . Chiba, K. et al. Spine 22 (24): 2885-93 (1997). Este sistema de cultivo celular puede ser usado para estudiar el efecto de compuestos en el metabolismo de células tanto de AF como de NP. Este sistema de cultivo celular puede distinguir entre los cambios que ocurren en los compartimientos activos metabólicamente (asociados a las células) e inactivos (además removidos) de la matriz. Chiba et al., han mostrado también que es factible atrapar un disco intervertebral completo del conejo en gel de alginato. Chiba, K., G. B. J. Andersson, et al., Ortho. Res. Soc. Trans. 21: 190(1996). Este acercamiento, el cual semeja estrechamente la situación in vivo, conduce a la retención mejorada de la estructura del disco y promueve altas actividades metabólicas. La herniación del disco intervertebral lumbar es una de las causas más comunes del dolor de la espalda inferior. La herniación del disco es tratada inicialmente en forma conservativa con la terapia física, pero otras modalidades de tratamiento más invasivas son requeridas algunas veces. Por ejemplo, la quimionucleólisis, la disolución del tejido del disco intervertebral, que usa una enzima inyectada localmente, se ha usado por más de treinta años. 0lmaker, et al., Clin. Orthopaedics and Related Res. 257:274 (1990). Como las PG contribuyen en la mayoría de la presión de hinchamiento en el NP, las inyecciones intradiscales de las enzimas que degradan los PG (Bradford, D.S. et al., Journal of Bone and Joint Surgery - American Volunte 65 (9): 1220-31 (1983); Hill, G. M. et al., Clinical Orthopaedics and Related Researches 225: 229-233 (1987)) o los colágenos causan una descompresión de la raiz del nervio atrapada por la masa herniada, y asi ayuda a aliviar el dolor. Hay una evidencia histológica preliminar que las células en los discos tratados con estas enzimas pueden reponer el NO con los PG (Bradford, D. S. et al., Journal of Bone and Joint Surgery - American Volume 65(9): 1220-31 (1983)) que ayuda a reestablecer las propiedades que absorben los choques del cojín intervertebral y, más importantemente, a normalizar las fuerzas y las tensiones colocadas en los discos adyacentes. Pueden surgir complicaciones de la quimionucleólisis, cuando se realiza con dos enzimas usadas comúnmente, es decir la quimiopapaina y la colagenasa. Kitchel y Brown informan que el tratamiento de la quimiopapaina puede conducir a la hemorragia subaracnoide, paraplegia, anafilaxis y aún la muerte. Clin. Orthpaedics and Related Res. 284:63 (1992). Olmarker et al, notaron que la quimiopapaina inyectada es tanto neurotóxica como alergénica, y ese tratamiento con la colagenasa puede conducir a deficiencias neurológicas. Clin. Orthopaedics and Related Res. 257274(1990) .

Debido a que la ciática dolorosa, asociada con la erniación del disco, no es a menudo remediada por tratamientos conservativos, que incluyen la terapia física y la quimionucleólisis, muchos pacientes se someten a la cirugía del disco. Hill. G. M. et al., Clinical Orthopaedics and Related Researches 225:229-233 (1987). Sin embargo, los resultados quirúrgicos no siempre satisfacen e, importantemente, este acercamiento está lejos del óptimo ya que la remoción de un disco intervertebral lumbar causa una desestabilización significante de la espina inferior y predispone a los discos intervertebrales adyacentes a la degeneración en los últimos años. Hill. G. M. et al. Clinical Orthopaedics and Related Researches 225: 229-233 (1987) . Recientemente, se han desarrollado novedosas modalidades de tratamiento para la quimionucleólisis, que evitan algunos de los problemas inherentes en el uso de proteasas, tal como la quimiopapaína y las colagenazas, y pueden evitar la necesidad para la intervención quirúrgica. Una de tales enzimas quimionucleolítica es la condroitinasa ABC, un producto de Proteus vulgaris. La condroitinasa ABC es una endo-N-acetil-D-hexosaminidasa que degrada los mucopolisacáridos, tal como el sulfato de condrotina, sulfato de dermatano, condroitina y ácido hialourónico. Takahashi et al Spine 21 2405 (1966) . Olmarker et al notaron que la condroitinasa ABC es mucho menos perjudicial al tejido espinal que la quimiopapaina . Spine 21: 1952 (1996). La proteína-1 osteogénica (OP-1) también conocida como Proteina-7 Morfogenética del Hueso (BMP-7), es un 5 miembro de la superfamilia de TGF-ß, que ejerce efectos potentes en la diferenciación y metabolismo del osteocito y condorcito. Asahina, I, et al., J. Cell Biol. 123(A): 921-33 (1993) . Las proteínas morfogenéticas del hueso se mostró inducen nueva formación del hueso, cuando se inyectan 10 subcutáneamente en la rata. Cook. S. D. et ai., Clin. Orthop r . 324:29-38 (1996) . El OP-1 humano recombinante (rhOP-1) ha mostrado promueve el crecimiento y la diferenciación de los osteoblastos in vitro. Sampath. T. K. et al., J. Biol. C em. 257:20352-20360 (1992). También causa la diferenciación de 15 las células de origen mesenquimal a lo largo de las trayectorias condrogénicas y osteogénicas. Asahina, I. J. Cell. Biol. 123(4): 921-33 (1993). El OP-1 humano recombinante también ejerce efectos específicos en los condorcitos. Chen, et al.,, demostraron que el OP-1 promueve 20 el crecimiento de los condorcitos esternales de polluelos. Chen. P. et al., J. Cell. Sci 108 (Pt 1): 105-14 (1995). En este sistema, la inducción de la síntesis del colágeno tipo X se notó, lo que sugiere que el OP-1 ejerció un efecto en la maduración de condorcitos igualmente. Los condorcitos del bovino, en contraste, no expresan el colágeno de tipo X en respuesta al OP-1, sino exhiben la síntesis aumentada de las PG y el colágeno de tipo II. Chen, P. et ai., Biochem, Bihys. Res. Comm n. 297(3) : 1253-9 (1993) . Los factores del 5 crecimiento no se usaron en el tratamiento de la quimionucleólisis existente, que utiliza las enzimas de la proteasa, tal como la quimiopapaína y colagenasa, debido a que estas enzimas desdoblan o degradan los factores del crecimiento . 10 Existe así una necesidad para un tratamiento de ^ quimionucleólisis que no sólo suministre un alivio de los síntomas de la herniación del disco intervertebral, sino también suministra una estabilidad aumentada y repare los AF y NP. Similarmente, existe una necesidad para un tratamiento 15 de la quimionucleólisis que suministre un soporte mecánico suficiente a la columna espinal, y que obvie la necesidad de la intervención quirúrgica invasiva. Hay también una necesidad de tener un método de tratamiento quimio- nucleolítico que requiera sólo una modalidad de tratamiento 20 para tanto la disolución del tejido del disco intervertebral mientras suministre tanto la estabilidad como la reparación de ese tejido. El método de tratamiento de la presente invención suministra tales propiedades. 25 Breve Compendio de la Invención Un método de esta invención implica un tratamiento que comprende administrar a un mamífero, que lo necesite de la quimionucleólisis, una cantidad efectiva de desdoblamiento del proteoglicano de una enzima que degrada ^ ^ 5 este proteoglicano; y una cantidad de un factor del crecimiento, efectiva para estimular la formación de un componente de matriz. En una modalidad preferida, el componente de matriz es el proteoglicano. En otra modalidad preferida, el componente de matriz es el colágeno. 10 En otro aspecto, la invención considera un método para reparar las matrices de núcleos pulposos y/o células ^ fibrosas del espacio anular, después de la quimionucleólisis por la enzima que degrada del proteoglicano, que comprende administrar a un mamífero, que necesite tal tratamiento, una 15 cantidad efectiva, que sintetiza el proteoglicano, de un factor de crecimiento. En aún otro aspecto, la invención considera un método para rellenar el núcleo pulposo y/o las células r fibrosas del espacio anular, después de la quimionucleólisis 20 de una enzima que degrada el proteoglicano, que comprende administrar a un mamífero, que necesite tal tratamiento, una cantidad efectiva, que sintetiza el proteoglicano, de un factor de crecimiento. Una enzima preferida, que degrada el 25 proteoglicano, es la condroitinasa. Condroitinasas preferidas incluyen la condroitinasa AC, condroitinasa B y condroitinasa C. Una condroitinasa particularmente preferida es la condroitinasa ABC. Un factor del crecimiento preferido es la proteina 5 osteogénica. Una proteina osteogénica particularmente preferida es la OP-1. Otro factor de crecimiento preferido es el factor ß de crecimiento de transformación. En una modalidad preferida, la enzima que degrada el proteoglicano y el factor de crecimiento se administran 10 simultáneamente. ^ . En otro aspecto, la presente invención considera una composición de materia que comprende una enzima que degrada el proteoglicano y un factor de crecimiento. Preferiblemente, la enzima que degrada del proteoglicano y 15 el factor de crecimiento se formulan como una composición farmacéutica, que contiene un portador y/o vehículo, aceptable farmacéuticamente. En aún otro aspecto, la presente invención ^ considera un equipo que comprende una enzima que degrada del 20 proteoglicano y un factor de crecimiento. En una modalidad preferida, el equipo comprende un recipiente que contiene una enzima que degrada el proteoglicano y un recipiente que contiene un factor de crecimiento. En otra modalidad preferida, el equipo comprende un recipiente que contiene 25 una enzima que degrada del proteoglicano y un factor del crecimiento. Cualquiera de estos equipos incluye opcionalmente instrucciones para usar la enzima que degrada el proteoglicano y el factor de crecimiento en la quimionucleólisis . La presente invención ofrece beneficios y ventajas generales. Una ventaja es que los efectos perjudiciales de la quimionucleólisis en la estructura de las matrices del disco intervertebral, pueden ser contrarrestadas por la inclusión, como parte del tratamiento, de un factor del crecimiento efectivo en promover la reparación de las estructuras del disco. Un beneficio de la presente invención es que la administración de un factor del crecimiento no se daña por la administración de las enzimas de quimionucleólisis proteoliticas . Otra ventaja es que la administración de una enzima quimionucleolitica puede ocurrir concurrentemente con la administración de la proteina del factor de crecimiento, puesto que la enzima no tiene actividad proteolitica y asi no inactiva este factor del crecimiento. Un beneficio más es que este método de tratamiento suministra menores complicaciones que los tratamientos conocidos de la quimionucleólisis.

Aún otros beneficios y ventajas de la presente invención serán evidentes a una persona, con experiencia ordinaria, de la descripción que sigue.

Breve Descripción de los Dibujos En los dibujos, que forman parte de este descripción: 5 la Figura 1 ilustra los efectos de la OP-1 en el contenido del ADN, en microgramos por 9 glóbulos de alginato, del espacio anular fibroso ("AF" ) tratado con la condroitinasa ABC ("C-ABC") . Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 10 ("C-ABC(-)f OP-1 (-)"). Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C- ^ ABC [+) , OP-1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C- ABC(+), OP-1 (+)"). Los datos se presentan todos con barras 15 de error estándar. "N.S." indica que la diferencia en el contenido del ADN en el AF antes y después del tratamiento con la C-ABC en el momento cero, no es significante. La Figura 2 ilustra los efectos de la OP-1 en el s ^ contenido del ADN, en microgramos por 9 glóbulos de 20 alginato, del núcleo pulposo ("NP") tratado con la condroitinasa ABC ("C-ABC"). Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC (-), OP-1 (-)"). Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C- 25 ABC(+), OP-1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C- ABC(+), OP-1 (+)")· Los datos se presentan todos con barras de error estándar. "N.S." indica que la diferencia en el contenido del ADN en el AF antes y después del tratamiento ( 5 con la C-ABC en el momento cero, no es significante. La Figura 3 ilustra los efectos de la OP-1 en la acumulación total del proteoglicano ("PG"), expresado en microgramos por 9 glóbulos de alginato, del espacio anular fibroso ("AF") tratado con la condroitinasa ABC ("C-ABC"). 10 Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC(-), OP-1 (-)"). Las " barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC(+), OP-1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas 15 con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C-ABC(+), OP-1 {+)"). Los datos se presentan todos con barras de error estándar. En el momento cero, la diferencia en la PG total, antes y después del tratamiento, es estadísticamente significante en p < ^ 0.05. El asterisco * representa las diferencias 20 significantes estadísticamente en p < 0.05 cuando C-ABCÍ+), 0P-K+) se compara a C-ABC (+), 0P-1[-) a 7,10, 14, 17 y 21 dias después del tratamiento con la C-ABC. La Figura 4 ilustra los efectos de la OP-l en la acumulación total del proteoglicano ("PG"), expresado en 25 microgramos por 9 glóbulos de alginato, del núcleo pulposo (" P"), tratado con la condroitinasa ABC ("C-ABC") . Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC(-), OP-1 (-)"). Las barras sombreadas representan datos para las células " 5 tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC (+), OP-1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C-ABC(+) OP-1 (+)"). Los datos se presentan todos con barras de error estándar. En el momento cero, la diferencia en la PG total, antes y después 10 del tratamiento, es estadísticamente significante en p < 0.05. El * representa las diferencias significantes - estadísticamente en p < 0.05 cuando C-ABC(+), OP-1 (+) se compara a C-ABC (+), OP-l(-) a los 10, 14, 17 y 21 días después del tratamiento con la C-ABC. 15 La Figura 5 ilustra los efectos de la OP-1 en la acumulación total de proteoglicano ("PG")/ expresado como microgramos de PG por microgramo de ADN del espacio anular fibroso ("AF") tratado con la condroitinasa ABC ("C-ABC"). Las barras abiertas representan datos para las células no 20 tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC(-), OP-1 (-)"). Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC(+), OP-1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C-ABC(+), OP-1 (+)"). Los 25 datos se presentan todos con barras de error estándar. En el momento cero, la diferencia en la PG total, antes y después del tratamiento, es estadísticamente significante en p < 0.05. El * representa las diferencias significantes estadísticamente en p < 0.05 cuando C-ABC(+), OP-K+) se compara a C-ABC(+ ), OP-l(-) a los 7, 10, 14, 17 y 21 días después del tratamiento con la C-ABC. La Figura 6 ilustra los efectos de la OP-1 en la acumulación total del proteoglicano ("PG"), expresado como microgramos de PG por microgramo de ADN del espacio anular pulposo ("NP") tratado con la condroitinasa ABC ("C-ABC"). Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC(-), OP-1 (-)"). Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC (+), OP-1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C-ABC (+ ), OP-1 (+)"). Los datos se presentan todos con barras de error estándar. En el momento cero, la diferencia en la PG total, antes y después del tratamiento, es estadísticamente significante en p < 0.05. El * representa las diferencias significantes estadísticamente en p < 0.05 cuando C-ABC(+), OP-1 (+) se compara a C-ABC(+ ), OP-1 (-) a los 7, 10, 14, 17 y 21 días después del tratamiento con la C-ABC. La Figura 7 ilustra los efectos de la OP-1 en la síntesis del proteoglicano ("PG"), expresado como cuentas por minutos ("CPM por 9 glóbulos de alginato, del espacio anular fibroso ("AF") tratado con la condroitinasa ABC ("C- ABC") . Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la OABC o la OP-1 ("C-ABC(-), 0P-f ' 5 1 (-)"). Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC (+), 0P-1(- )"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C-ABC (+), OP- 1 (+)"). Los datos se presentan todos con barras de error 10 estándar. El * representa las diferencias significantes estadisticamente en p < 0.05 cuando C-ABC(+), OP-K+) se ' compara a C-ABC (+), OP-l(-) a los 7, 14 y 21 días después del tratamiento con la C-ABC. La Figura 8 ilustra los efectos de la OP-1 en la 15 síntesis del proteoglicano ("PG")/ expresado como cuentas por minuto {"CMP") por 8 glóbulos de alginato, del espacio anular pulposo ("NP") tratado con la condroitinasa ABC ("C- ABC" ), Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC (-), OP- 20 1 (-)"). Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC (+ ), 0P- 1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ( "C-ABC (+), OP-1 (+)"). Los datos se presentan todos con barras de error 25 estándar. El * representa las diferencias significantes estadísticamente en p < 0.05 cuando C-ABC(+), OP-1 (+) se compara a C-ABC (+) * OP-l(-) a los 7, 14, y 21 dias después del tratamiento con la C-ABC. La Figura 9 ilustra los efectos de la OP-1 en la ^ 5 síntesis del proteoglicano ("PG"), expresado como cuentas por minuto ( "CPM") por microgramo del ADN, del espacio anular fibroso ("AF") tratado con la condroitinasa ABC ("C- ABC") . Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC (-), OPIO 1 (-)")· Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC (+), OP-l(-^ )"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ( "C-ABC (+), OP- 1 (+)"). Los datos se presentan todos con barras de error 15 estándar. El * representa las diferencias significantes estadísticamente en p < 0.05 cuando C-ABC(+), OP-l(+) se compara a C-ABC (+ ), OP-l(-) a los 7, 14, y 21 días después del tratamiento con la C-ABC. ^ La Figura 10 ilustra los efectos de la OP-1 en la 20 síntesis del proteoglicano ("PG"), expresado como cuentas por minuto ("CPM") por microgramo del ADN del núcleo pulposo ("NP") tratado con la condroitinasa ABC ("C-ABC") . Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("C-ABC , OP-1 (-)"). Las 25 barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente ("C-ABC(+), OP-1 (-)"). Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("C-ABC (+), OP-1 (+)"). Los datos se presentan todos con barras de error estándar. El * ^ " 5 representa las diferencias significantes estadísticamente en p < 0.05 cuando C-ABC (+), OP-l(+) se compara a C-ABC (+), OP- 1 (-) a los 7 y 14 días después del tratamiento con la C-ABC. La Figura 11 ilustra los efectos de la OP-1 humana recombinante ("rhOP-1") en la síntesis del proteoglicano 10 ("PG") y el colágeno, en el espacio anular fibroso ("AF"; barras abiertas ) y el núcleo pulposo ("NP", barras llenas) . ^ En el control ("Cont") no se agregó la rhOP-1. La síntesis del PG se expresó como el porcentaje de las 35S-PG sintetizadas cuando 100 ng/ml de la rhOP-1 o 200 ng/ml de la 15 rhOP-1 se agregan, comparado con el control. La síntesis del colágeno se expresó como el porcentaje de la 3H- idroxiprolina sintetizada cuando 100 ng/ml de la rhOP-1 o 200 ng/ml de la rhOP-1 se agregan, comparado con el control. Los datos se presentan todos con las barras de error 20 estándar. La Figura 12 representa estudios duplicados que ilustran los efectos de la OP-1 en la acumulación de los proteoglicanos en el espacio anular fibroso ("AF", panel izquierdo) y el núcleo pulposo ("NP", panel derecho), 25 expresado como microgramos por 9 glóbulos de alginato, en seguida del tratamiento de la condroitinasa ABC ("C-ABC") . Las barras abiertas representan datos para las células no tratadas con la C-ABC o la OP-1 ("W/O C-ABC W/O OP-1") . Las barras sombreadas representan datos para las células tratadas con la C-ABC solamente (con "C-ABC W/O OP-1") . Las barras llenas representan los datos de las células tratadas con tanto la C-ABC como la OP-1 ("con C-ABC, con OP-1") . Los datos se presentan todos con barras de error estándar.

Descripción Detallada de la Invención Un método de la invención considera el tratamiento de un mamífero que necesite la quimionucleólisis. Un mamífero que necesite tal tratamiento se identifica, por ejemplo, por la diagnosis diferencial en seguida de la presentación con dolor de la espalda baja. La herniación del disco intervertebral puede ser diagnosticada, por ejemplo, por quejas de una historia del dolor en la espalda inferior, seguido por el examen físico de la espalda inferior. La imagen radiográfica del diagnóstico, tal como la MRI, puede ser realizada para confirmar el diagnóstico. La quimionucleólisis es indicada usualmente en mamíferos que son intratables con la terapia física, donde hay acuitamiento de la herniación de disco. La quimionucleólisis se realiza típicamente por la inyección directa en el espacio intervertebral de una enzima, que causa la disolución del tejido del disco intervertebral por la hidrólisis de proteínas. Cuando se usan las enzimas de degradación del proteoglicano, no proteolitico, para alterar el tejido del disco intervertebral, las cadenas de glicosaminoglicano de los proteoglicanos presentes en el AF y el NP se desdoblan enzimáticamente, mientras las proteínas del núcleo del proteoglicano permanecen intactas. EN otras palabras, tales proteoglicanasas no proteoliticas despolimerizan las cadenas de glicosaminoglicano del componente de proteoglicano del AF y el NP. Un número de enzimas que degradan el proteoglicano pueden ser usadas en el tratamiento de la presente invención, que incluyen la condroitinasa (condroitina-liasa) que despolimeriza los glicosaminoglicanos del sulfato de condroitina (particularmente el condrotitin-4-sulfato y condroitin-6-sulfato) por la eliminación de los enlaces 1, -hexosaminídicos, hialuronidasa, hialurono-glucosaminidasa, hialuronoglucuronidasa, N-acetil-glucosaminidasa, haluronato-liasa, condroitinsulfatasa, condro-4-sulfatasa y condro-6-sulfatasa. Una condroitinasa particularmente preferida es la condroitinasa ABC (condroitin-ABC-liasa: EC 4.2.2.4), que es una endo-ß-?-acetil-D-hexosaminidasa. Otras condroitinasas preferidas incluyen la condroitinasa AC (condroitin-AC-liasa) , condroitinasa B (condroitin-B-liasa) y condroitinasa C (condroitin-C-liasa) . Como se puede ver, una enzima que degrada el proteoglicano incluye cualquier glicosidasa que pueda degradar el sulfato de condroitina o el ácido C 5 hialurónico. La cantidad de la enzima que degrada el proteoglicano, usada en un método de la presente invención, es una cantidad efectiva de desdoblamiento del proteoglicano. Una cantidad efectiva que desdobla el 10 proteoglicano de la enzima particular que degrada el proteoglicano, se puede determinar midiendo la formación de ^ ' los productos terminales de reacción en el tiempo, cuando la enzima que degrada el proteoglicano se incuba en la presencia de su substrato. Asi, por ejemplo, una unidad (U) 15 de la condroitinasa ABC se define como la cantidad de la enzima que cataliza la formación de 1 mmol de un disacárido insaturado del condroitin-6-sulfato por minuto, a 37°C, a un pH de 8.0. Una cantidad efectiva que desdoble el , ^ proteoglicano de una enzima que degrada el proteoglicano 20 está en el intervalo aproximado de 0.01 U/disco a aproximadamente 10 U/disco, preferiblemente de alrededor de 0.05 U/disco hasta alrededor de 5 U/disco y más preferiblemente de aproximadamente 0.1 U/disco a 10 U/disco. La cantidad déla enzima que degrada el proteoglicano, 25 administrada a un mamífero huésped puede también ser expresada como una cantidad por unidad de volumen. Asi, una cantidad efectiva que desdobla el proteoglicano de una enzima que degrada el proteoglicano está en el intervalo aproximado de 0.0001 ü/ml hasta 100 U/ml, preferiblemente de " 5 alrededor de 0.05 U/ml hasta 50 U/ml y más preferiblemente de alrededor de 0.1 U/,ml hasta 20 U/ml. Un método de la presente invención también implica la administración a un mamífero que lo necesite la quimionucleólisis, de una cantidad de un factor de 10 crecimiento, efectiva para estimular la formación de un componente de matriz. Una cantidad efectiva de síntesis del - proteoglicano de un factor de crecimiento se puede administrar o alternativamente una cantidad efectiva de la síntesis del colágeno de un factor de crecimiento puede ser 15 administrada. Se pueden usar una amplia variedad de factores de crecimiento en la presente invención. Los factores del crecimiento son proteínas que pueden activar la proliferación celular y/o diferenciación. Muchos factores 20 del crecimiento son pleuripotentes y pueden conducir al crecimiento y/o diferenciación de células en una variedad de tipos de células. Factores de crecimiento útiles en la presente invención incluyen aquellos factores de crecimiento que estimulan la síntesis de matriz, estimulando la 25 producción del proteoglicano y el colágeno. Un factor del crecimiento adecuado para su uso en un método de la invención, incluye cualquier factor de crecimiento que tenga el potencial de estimular la síntesis de la matriz, tal como, por ejemplo, la síntesis del proteoglicano y el colágeno. Tal factor de crecimiento repara las matrices del núcleo pulposo y/o el espacio anular fibroso, siguiendo el tratamiento de quimionucleólisis. Tal factor de crecimiento también rellena los componentes del proteoglicano y/o el colágeno del NP y/o AF, después de la quimionucleólisis con la enzima que degrada el proteoglicano. Así, la administración de un factor de crecimiento restaura la resistencia mecánica al disco intervertebral, en seguida de la quimionucleólisis. De esta manera, la fusión del disco intervertebral puede ser retardada o aún evitada. Factores de crecimiento preferidos incluyen los miembros de la familia del factor de crecimiento ß de transformación, esta familia tiene efectos proliferativos en muchos tipos de células mesenquimales y epoteliales. Miembros de la familia del factor de crecimiento ß de transformación que se prefieren incluyen la proteína 2 morfogenética del hueso (BMP-2) / proteína 4 morfogenética del hueso (BMP-4); y los factores de crecimiento de transformación ß-1, ß-2 y ß-3 (factores de crecimiento queratinocíticos potentes) . Otros miembros útiles de la familia del factor de crecimiento ß de transformación incluyen la BMP-3, BMP-5, BMP-6, BMP-O, DPP, Vgl, Vgr, proteína 60A, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, CDMP-1, CDMP-2, CDDMP-3, BMP-10, BMP-11, BMP-13, BMP-15, Univin, Nodal, Screw, ADMP, Neural y sus variantes de secuencia de aminoácidos. Otros factores del crecimiento preferidos incluyen el factor de crecimiento epidemial (EGF) , que induce la proliferación de células tanto mesodermales como ectodermales, particularmente los queratinocitos y fibroblastos; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , que ejercen efectos proliferativos en las células mesenquimales; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , tanto ácidos como básicos; y factor de crecimiento 1 de tipo insulina (IGF-1) y 2 (IGF-2) que medían la respuesta de la hormona del crecimiento, particularmente el crecimiento del hueso. Factores del crecimiento más preferidos incluyen las proteínas osteogéncas. Una proteína osteogénica particularmente preferida es la OP-1, también conocida como la proteína 7 morfogenética del hueso (BMP-7) . La OP-1 es un miembro de la superfamilia del gene del factor de crecimiento ß de transformación. Es un residuo de 139 aminoácidos del homodimero largo de peso molecular de 36,000. La OP-1 induce nueva formación del hueso in vivo y promueve la reparación de los defectos del hueso segmental diafiseales.

Como se describe en la solicitud de patente de E.U.A., también pendiente. No. de Serie 60/103,161, presentada el 6 de octubre de 1998, y cuya descripción de incorpora aquí como referencia en su totalidad. Las proteínas osteogénicas útiles incluyen aquéllas que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 70% de homología o "similaridad" de secuencia y preferiblemente el 80% de homología, con una proteína moforgénica de referencia, seleccionada del grupo de las proteínas que ocurren naturalmente. Una secuencia candidato de aminoácidos, que se piensa será funcionalmente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia, puede estar alineada con ella, usando el método de Needleman et al., J. Mol. Biol.. 48:443-453 (170), realizada convenientemente por programas de computadora, tal como el programa Align (DNAstar, Inc.), Los huecos internos y las inserciones de aminoácidos en la secuencia candidato se ignoran para los fines de calcular la relación definida, expresada convencionalmente como un nivel de la homología de la secuencia de aminoácidos o identidad, entre las secuencias candidato y de referencia. La "homología de la secuencia de aminoácidos" se entiende aguí incluye tanto la identidad como similaridad de la secuencia de aminoácidos. Las secuencias homologas comparten residuos de aminoácidos idénticos y/o similares, donde estos residuos similares son substituciones conservativas para, o "mutaciones de puntos permitidas" de, los residuos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. Asi, una secuencia de C^ 5 polipéptidos candidato que comparte el 70% de homologia de aminoácidos con una secuencia de referencia es una en donde cualquier 70% de los residuos alineados son o idénticos a o son substituciones conservativas de, los residuos correspondientes en una secuencia de referencia. 10 Según se usa aqui, "substituciones conservativas" son residuos que son física o funcionalmente similares a los ^ residuos de referencia correspondientes, por ejemplo, que tienen un tamaño, configuración, carga eléctrica, propiedades químicas similares, que incluyen la capacidad de 15 formar uniones covalentes o de hidrógeno, o similares. Substituciones conservativas particularmente preferidas son aquéllas que cumplen con los criterios definidos para una mutación de punto aceptada en Dayhoff et al (1978), 5 Atlas / of Protein Sequence and Structure, Suppl. 3. ch. 22 (pp. 20 354-352). Nati,. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. 20007. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un aminoácidos por otro con caracteristicas similares, por ejemplo, substituciones dentro de los siguientes grupos son bien conocidas: (a) valina, glicina; 25 (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina. El término de "variante conservativa" o "variación conservativa" también incluye el ^ ^ 5 uso de un aminoácido substituido en lugar de un aminoácido afín no substituido en una cadena de polipéptido dada, con la condición que los anticuerpos que tienen la especificidad de unión para la cadena de polipéptido substituida resultante tengan también la especificidad de unión (es 10 decir, una "reacción cruzada" o "inmunorreacción" con ella) la cadena de polipéptido sin sustituir o afín. ^ - Proteínas activas osteogenicamente útiles pueden también tener cadenas de polipéptidos con secuencias de aminoácidos, que comprendan una secuencia codificada por un 15 ácido nucleico que hibridice, bajo condiciones de hibridización de severidad baja, media o alta, a secuencias osteogénicas que codifican el ADN o el ARN, por ejemplo secuencias de terminal C que definen los siete dominios de cisteína conservados de OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5, MP- 20 6, 60A, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3 y similares. Según se usa aquí, las condiciones de hibdridización estrictas altamente se definen como la hibridización de acuerdo con técnicas conocidas en 40% de formamida, 5 X SSPE, 5 X Solución de Denhardt y 0.1% de SDS 25 a 37°C, durante la noche, y lavado en 0.1 X SSPE, 0.1% de SDS a 50°C. Las condiciones estrictas estándar son caracterizadas en los textos de clonación molecular estándar, disponibles comercialmente . Véase, por ejemplo, el manual Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., " 5 editado por Sambrook, Fritsch y Maniatis {Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) ; DNA Clonin, Volúmenes I y II (D.N. Glover Ed., 1985) Oligonucleotide Síntesis (M. J. Gait Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.- D. Hames & S.J. Higgins Eds. 1984) y B. Perbal, A. Practical Guide To 10 Molecular Cloning (1984) . Una cantidad efectiva de la síntesis del ' proteoglicano de un factor de crecimiento se puede determinar, por ejemplo, por ensayo de la cantidad de proteoglicanos sulfatados en una muestra tratada con el 15 factor de crecimiento que usa el ensayo del tinte DMMB. Hauselmann et al., J. Cell. Sci 107_17-27 (1994). Alternativamente, la síntesis del proteoglicano puede ser medida vigilando la toma del azufre-35 (35S) por las células , „ en la muestra tratada con el factor de crecimiento. El 20 factor de crecimiento que sintetiza el proteoglicano puede ser administrado a un mamífero huésped en dosis diarias sencillas o divididas de alrededor de 100 ug/disco hasta 10 mg/disco diariamente, preferiblemente alrededor de 200 pg/disco hasta alrededor de 1 mg/disco diariamente y más 25 preferiblemente de alrededor de 200 g/disco hasta alrededor de 500 ug/disco. La cantidad del factor de crecimiento que sintetiza el proteoglicano, administrada a un mamífero huésped en una dosis sencilla o dividida diariamente, puede también ser expresada como una cantidad por unidad de volumen. Asi, el factor de crecimiento que estimula el proteoglicano puede ser administrada a un mamífero huésped en dosis sencillas o divididas diariamente de alrededor de 50 ng/ml hasta alrededor de 5 mg/ml, diariamente, de preferencia alrededor de 200 ng/ml hasta 500 ug/ml y más preferiblemente de alrededor de 200 hasta 500 ng/ml. Las composiciones unitarias pueden contener tales cantidades o sus submúltiplos para componer la dosis diaria. Una dosis adecuada puede ser administrada en múltiples subdosis por día. Estas múltiples subdosis por día pueden aumentar a la dosis diaria total, cuando tal dosificación sea deseada por la persona que prescribe la droga.

El régimen de dosis para tratar una condición de enfermedad con un compuesto y/o composición útil en esta invención, se selecciona de acuerdo con una variedad de factores, que incluyen el tipo, edad, peso, sexo, condición de dieta y médica del paciente, la severidad de la enfermedad, la ruta de administración, las consideraciones farmacológicas, tal como la actividad, eficacia, perfiles farmacocinéticos y toxicológicos del compuesto particular empleado, si se utiliza un sistema de entrega y si el compuesto se administra como parte de una combinación de droga. Asi, el régimen de dosis empleado realmente puede variar en forma amplia y, por lo tanto, puede desviarse del régimen de dosis preferido, señalado antes. Se considera que los factores de crecimiento pueden ser administrados o en forma sencilla o en un "cóctel", que comprende más de un factor de crecimiento. Por ejemplo, una mezcla de la OP-1 y la BMP-4 puede ser administrada simultáneamente para suministrar una cantidad efectiva de síntesis del proteoglicano del factor de crecimiento. Para facilitar la administración simultánea de un cóctel de factores de crecimiento, este cóctel del factor del crecimiento se puede formular como una composición farmacéutica que contiene portadores y vehículos convencionales, aceptables farmacéuticamente, como se describe aquí en otro sitio. También se considera que la cantidad efectiva de desdoblamiento del proteoglicano de una enzima que degrada el proteoglicano y la cantidad efectiva de síntesis del proteoglicano de un factor de crecimiento, se pueden administrar simultáneamente a un mamífero que necesite la quimionucleólisis . El efecto de una enzima que degrade el proteoglicano, tal como la condroltinasa ABC, es máxima dentro de 24 horas después de la inyección, aunque aproximadamente el 2% de la cantidad administrada puede aún encontrarse en el NP 10 dias después de la inyección. (~" 5 Takahashi et al., Spine 21: 2405-2411 (1996). Los factores de crecimiento requieren típicamente al menos 24 horas para inducir un efecto a través de la cascada del factor de crecimiento. La OP-1, por ejemplo, exhibe su efecto máximo en el metabolismo de los condorcitos aproximadamente 72 10 horas después de la administración. Para facilitar la administración simultánea de una enzima que degrada el - proteoglicano y un factor de crecimiento, la combinación de estos dos compuestos puede ser preparada como una composición de materia que comprende una enzima que degrada 15 el proteoglicano y un factor de crecimiento. Esta combinación puede ser formulada como una composición farmacéutica que contiene portadores u vehículos aceptables farmacéuticamente convencionales, como se describe aquí en otro sitio. 20 La cantidad efectiva de desdoblamiento del proteoglicano de una enzima que degrada el proteoglicano y la cantidad efectiva que sintetiza el proteoglicano de un factor de crecimiento, pueden también ser administradas en secuencia a un mamífero que necesite la quimionucleólisis . 25 La administración de la enzima que degrada< el proteoglicano puede seguir con la administración del factor de crecimiento en cualquier punto después de la administración de la enzima que degrada el proteoglicano, preferiblemente dentro de aproximadamente 24 horas después de completar la administración de la enzima que degrada el proteoglicano. Sin embargo, se entenderá que la administración del factor de crecimiento puede ser repetida en múltiples ocasiones después de la administración de la enzima que degrada el proteoglicano . Un mamífero, que necesite la quimionucleólisis, puede recibir una o más administraciones de la enzima que degrada el proteoglicano hasta lograr el resultado clínico deseado. Así, por ejemplo, múltiples dosis de la enzima que degrada el proteoglicano pueden ser administradas hasta que exista una reducción en el dolor presentado, . o hasta que el análisis de diagnóstico, tal como el MRI, demuestra que el grado de herniación del disco intervertebral ha disminuido. La administración del factor de crecimiento puede luego proceder, y puede también utilizar múltiples administraciones hasta que se logre el resultado clínico deseado. Por ejemplo, la reparación del AF y el NP en seguida de la administración del factor de crecimiento, puede ser confirmada por el análisis de diagnóstico, tal como por el MRI. El practicante experimentado apreciará que la administración del factor de crecimiento seguido por la administración de la enzima que degrada del proteoglicano se controla para así impedir la recurrencia de los síntomas o para impedir la recurrencia de la herniación. La administración de una enzima que degrada el ^ 5 proteoglicano es realizada preferiblemente por la inyección directa en el espacio del disco intervertebral. Similarmente/ la administración de un factor de crecimiento se hace preferiblemente por la inyección directa en el espacio del disco intervertebral. Sin embargo, también se 10 considera que el factor de crecimiento puede ser administrado por infusión continua en el espacio ^ intervertebral usando, por ejemplo, una bomba de infusión continua, implantable o externa, equipada con un catéter intervertebral apropiado. 15 El método de tratamiento de la invención se usa para tratar un mamífero huésped, tal como un ratón, rata, conejo, perro, caballo, primate tal como un mono, chimpancé o humano, que tenga una condición que requiera el método de ^ tratamiento. 20 Un compuesto útil en la presente invención se puede formular como una composición farmacéutica. Tal composición puede luego ser administrada parenteralmente en formulaciones de dosis unitarias, que contengan portadores y vehículos convencionales, no tóxicos, aceptables 25 farmacéuticamente, según sea deseado. El término parenteral, según se usa aquí, incluye las inyecciones intervertebrales, o las técnicas de infusión locales. La formulación de las drogas se discute en, por ejemplo, Hoover, John E. (Ed.) Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Edición). Mack Publishing CO., Easton, Pennsylvania, 1990, y Liberman, H. A. y Lachman, L. Eds Pharmaceutical Dosage Forms, Maree! Decker, New York, N.Y. 1980. como se discute aquí en orto sitio, la administración de una enzima que degrada el proteoglicano o el factor de crecimiento de la invención, es típicamente por la inyección local directa o la infusión local en el espacio del disco intervertebral. Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas estériles, inyectables, pueden ser formuladas de acuerdo con la técnica conocida, usando agentes adecuados de dispersión o humectación y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede también ser una solución inyectable estéril o suspensión en un diluente o solvente no tóxico, aceptable parenteralmente, como una solución en 1, 3-butanodiol . Entre los vehículos aceptables y solventes que se pueden emplear está el agua, la solución de Ringer, y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites estériles fijos son empleados convencionalmente como un medio de solvente o de suspensión. Para este fin, cualquier aceite fijo blando puede ser empelado, que incluyen los mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos, tal como el ácido oleico, encuentran uso en la preparación de sustancias inyectables. La dimetil-acetamida, agentes tensoactivos que incluyen los detergentes iónicos y no iónicos, polietilen- 5 glicoles, pueden ser usados. Mezclas de solventes y agentes humectantes, tal como aquéllos discutidos antes, son también útiles. Para fines terapéuticos, las formulaciones para la administración parenteral pueden estar en la forma de 10 soluciones o suspensiones para inyección, acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles. Estas soluciones y v ^ suspensiones pueden ser preparadas de polvos o gránulos estériles, que tienen uno o más de los portadores o diluentes usados en las formulaciones para la administración 15 oral, como es bien conocido en la técnica. Los compuestos pueden ser disueltos en agua, polietilen-glicol, propilen- glicol, etanol, aceite de maiz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, alcohol bencílico, cloruro de sodio y/o varios reguladores. Otros 20 auxiliares y modos de administración son bien y ampliamente conocidos en la técnica farmacéutica. Un compuesto, útil en la presente invención, puede también ser formulado en liposomas, como se discute en Hoover, John E. (Ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences 25 (18a Edición) Mack Publishing CO., Easton, Pennsylvania, 1990, p. 1691. Los liposomas se forman dispersando los fosfolipidos en un medio acuoso. Las substancias solubles en agua o lipidos se pueden atrapar en el espacio acuoso dentro de un liposoma, o dentro de las capas dobles de lipidos del liposoma, respectivamente. Asi, un factor de crecimiento puede ser formulado en liposomas para su uso en el método de la invención, usando técnicas bien conocidas en el arte. Como se mencionó antes, la cantidad del ingrediente activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosis sencilla varia dependiendo del huésped mamífero que se trata y el modo particular de administración. En otra modalidad, la presente invención considera un equipo que comprende una enzima que degrada el proteoglicano y un factor de crecimiento. Tal equipo contiene una enzima que degrada el proteoglicano de la invención, empacado junto con un factor de crecimiento de la invención. El equipo se empaca en una manera convencional, como se bien conocido en la técnica. Un equipo de la invención comprende preferiblemente un recipiente que contiene una enzima que degrada el proteoglicano y un recipiente que contiene un factor de crecimiento. Tal recipiente puede ser un frasco o contenedor de vidrio, un frasco o contenedor de plástico u otros contenedores adecuados, como es bien conocido en el arte. En otra modalidad preferida, el equipo comprende un recipiente que contiene una enzima que degrada el proteoglicano y un factor de crecimiento. Tal equipo es especialmente adecuado para la administración simultánea de una enzima que degrada el proteoglicano y un factor de crecimiento/ de acuerdo con un método de la invención. Cualquiera de los equipos, descritos anteriormente, incluyen, opcionalmente, instrucciones para usar la enzima que degrada el proteoglicano, y el factor de crecimiento en la quimionucleólisis . Por ejemplo, las instrucciones suministran detalles en usar los componentes del equipo en un método de la presente invención. Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar además, pero no limitar, la presente invención.

Ejemplo 1: Regulación mejorada del metabolismo de matriz extracelular por las células del espacio anular fibroso y del núcleo pulposo del conejo, con el uso de la proteina-1 osteogénica recombinante . MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo Celular: Discos intervertebrales lumbares (IVD) se disecaron asépticamente de la espina de conejos blancos de Nueva Zelanda, después de la eutanasia. El NP y AF se separaron por la disección directa y agrupación separadamente. Las células se liberaron de cada tejido por la digestión de enzima en secuencia (Pronase 1 hora, y Collagenase P y DNAse II por 16 horas) y las células aisladas encapsuladas en 1.2% de alginato de baja viscosidad a 2 milIones/mi, como se describió previamente. Chiba, K, et al. spine 22:2885 (1997) . Los cultivos se mantuvieron en DMEM/F 12 más 10% de FBS con un cambio diario del medio.

Medición del Efecto de la rhOP-1 en la Proliferación Celular y la Síntesis de la PG y el Colágeno: En el dia 7 del cultivo, las células en alginato se incubaron en la presencia de varias concentraciones de la OP-1 humana recombinante del factor de crecimiento (rhOP-1) durante 72 horas. El cultivo fue también tratado como sigue: (1) Para medir la proliferación celular, el MTT (5%) se agregó al medio de estos cultivos durante al menos 60 minutos. Después de disolver los glóbulo con agentes de quelación de calcio, las células se sometieron a lisis, se centrifugaron y se midió la absorbencia del sobrenadante a 550 nm. Mosmann, T. J. Iiamunol, Methods 65: 55 (1984) . (2) Para medir la síntesis de la PG, se agregó el 35S-sulfato (20 µ^/p??) al medio, durante al menos 4 horas del periodo de incubación de 72 horas, en la presencia de la rhOP-1. Después de remover el medio, los glóbulos se disolvieron y los dos compartimientos [matriz (CM) asociada con las células y matriz removida ulteriormente (FRM) ] separada por centrifugación moderada. Mok S.S. et al. J. Biol.. Chem. 269:33021 (1994). Cada fracción se solubilizó con papaina y la incorporación del 35S-sulfato determinó el uso de un ensayo de filtración rápido para recuperar las 35S-PGs precipitadas por azul de alciano. Masuda K. et al., Anal. Biochem. 227:167 (1994). (3) para medir la síntesis del colágeno, los cultivos se rotularon con 3H-prolina en DMEM+2% de FBS, durante las últimas 16 horas de tratamiento con la rhOP-1. Después de remover el medio, el colágeno en los glóbulos se extrajo. Cada extracto se dializó contra el agua, seguido por la peptinización y diálisis. La 3H-hidroxiprolina (como una medida del 3H-colágeno) se cuantificó después de la hidrólisis ácida seguida por la separación de los imino-ácidos radioetiquetados por la cromatografía HPLC en una columna de intercambio de cationes. Hauselmann, H. J. et al., J. Cell Sci. 107-.ll (1994). Acumulación de PG y Colágeno en Glóbulos e Alginato: Las células se cultivaron con DMEM/F12+10% FBS en la ausencia o presencia continua de la rhOP-1 (100 ng/ml) . En varios puntos de tiempo, los glóbulos se trataron con papaina a 60°C y las digestiones de la papaina se analizaron en los contenidos de la PG (por el procedimiento de DMMB) , hidroxiprolina (que usa la cromatografía HPLC de fase inversa después de la hidrólisis ácida y la rotulación de PITC) y el ADN (por el método fluorométrico, que usa el tinte Hoechst 33258). Chiba, K et al., Spine 22:2885 (1997). Análisis Estadístico: Los análisis estadísticos se realizaron en ANOVA de una vía, con la prueba de PLSD de Fischer como una prueba post hoc.

RESULTADOS proliferación Celular y Contenido del ADN: El análisis MTT reveló que la rhOP-1 tenía un efecto mitogénxco significante en altas concentraciones solamente (AF:100 y 200 ng/ml, P < 0.01; NP: 100 ng/ml, P < 0.01). El tratamiento con la rhOP-1 (100 ng/ml) se asoció con todos los puntos de tiempo estudiados con un aumento en el contenido total de ADN de los cultivos de AF (% de control; día 3 = 135%, día 6 = 134%; día 11 = 126%; día 14 = 126%) pero n de cultivos de NF (p > 0.05) . Síntesis de la PG: El tratamiento de la rhOP-1 resultó en un aumento significante, dependiente de la dosis, en la síntesis de la PG, por ambos cultivos de AF y NP mantenidos en la presencia del 10% de FBS (véase la Figura 1, p < 0.001). El régimen de la síntesis de la PG permaneció significantemente elevada en ambos cultivos de AF y NP, cuando se expresan por iq del ADN. las células de la NP fueron más responsivas que las células de AF a la rhOP-1 (régimen de síntesis como % de control: AF = 230%; NP = 460%) . Se debe notar que en la presencia o ausencia de la rhOP-1, las células de AF produjeron más 35S-PG que las células del NP. Síntesis del Colágeno: La síntesis del colágeno ^ 5 simulada por la rhOP-1 por ambas células de NP y de AF en una manera dependiente de la dosis (véase la Figura 11, P < 0.01), pero la magnitud de la respuesta fue menos marcada que en el caso de la síntesis de la PG (véase la Figura 11, P < 0.01) . Aunque la rhOP-1 tiene un efecto mitogénico 10 significante a altas dosis, el régimen de la síntesis del colágeno permaneció significantemente elevada cuando se V ^ expresa por µ? del ADN. Como se observó en el caso de la síntesis de la PG, las células de AF produjeron bajo todas condiciones más 3H-colágeno que las células de NP. 15 Acumulación de Matriz: La adición de la rhOP-1 a 100 ng/ml al medio, resultó en un aumento marcado en el contenido total de la PG y el colágeno en ambos glóbulos de AF y NO. En ambos del AF y NP este aumento fue sólo menor durante la primera semana, pero drástico durante la segunda 20 semana del cultivo con la rhOP-1 (datos no mostrados) . Este retardo es evidente especialmente en el caso de la acumulación del colágeno.

DISCUSIÓN Estos Datos muestran la capacidad de la rhOP-1 del factor de crecimiento para estimular el metabolismo de ambas células de AF como de NP. Aunque esta proteína morfogenética sólo tiene un efecto mitogénico moderado en las células, las estimula para sintetizar las PG y el colágeno a regímenes más rápidos que en la presencia del 10% de FBS solo. El estimulo de las síntesis de la PG es especialmente grande en el caso de las células del NP que son normalmente mucho menos efectivas que los condorcitos articulares o las células AF para reformar una matriz asociada a las células, in vitro. Interesantemente, los efectos de estímulo de la síntesis de la rhOP-1 en la PG son más evidentes que aquéllos en el metabolismo del colágeno. En discos humanos, el contenido de la PG disminuye con la edad y cae rápidamente en la enfermedad degenerativa del disco (Gower, W.E. et al,. J. Bone Joint Surg. 52-A:1154 (1969), cuando se desgarra longitudinal y circularmente. que refleja la alteración de la estructura de la red del colágeno, son a menudo observaos por el MRI. Los datos demuestran que la rhOP-1 del factor de crecimiento es útil como un agente terapéutico en promover la síntesis y reparación de la matriz de ambos elementos de AF y NP de las IVD humanas que se degeneran, por el aumento en la síntesis del protoglicano y el colágeno.

Ejemplo 2: Proteína Osteogénica - 1 Estimulación de la Síntesis del Proteoglicano por el Núcleo Pulposo y el Espacio Anular Fibroso, en Seguida de un Tratamiento de Quimionucleólisis Inducido por la Condroitinasa ABC. 5 MATERIALES Y MÉTODOS Se removieron las espinas lumbares en bloque, bajo condiciones asépticas, de ratones blancos adolescentes de Nueva Zelanda, que pesan 3 a 4.0 kg (IACUC aprobación # 94- 10 053) . Los discos lumbares se disecaron y el NP se separó en cada caso del AF. Las células se aislaron separadamente de ^ ' los dos tejidos por la digestión en secuencia de la enzima y se resuspendieron en 1.2% de alginato estéril de baja viscosidad a 2 milIones/mi. Chiba, K. et al., Supine 15 22:2285-2803 (1997) . Los glóbulos se formaron expresando esta solución en gotas, a través de una aguja de calibre 22, en una solución 102 mM de CaCl2. Las células de NP y AF en los glóbulos se mantuvieron en n cultivo en lotes del medio /-¦ ^ DMEM/F-12, que contiene 10% de FBS, 25 ug/ml de ascorbato y 20 50 g ml de gentamicina. Este medio completo se cambió diariamente a través de todo el estudio. El día 14 del cultivo, los glóbulos se dividieron en tres grupos. El primero comprendía los glóbulos cultivados por 12 días adicionales en un medio completo 25 (Grupo 1 - Cultivos de control) . Los glóbulos en los otros dos grupos se cultivaron primero durante 2 horas, en la presencia de la enzima que degrada el proteoglicano, la condroitinasa ABC (C-ABC) (0.1 U/ml) para agotar las PG de la matriz, seguido por lavados de 3 x 30 minutos, después de cultivar los glóbulos para los siguientes 12 días en el medio completo, o en la presencia (Grupo 2) o la ausencia (Grupo 3) del factor de crecimiento OP-1 a 200 ng/ml . En varios momentos, la matriz en los glóbulos se solubilizó por la digestión con papaína a 60°C. Se analizaron las digestiones en el contenido de ADN, usando el tinte Hoechst 33258 y la fluorometría, y las PG sulfatadas, usando el ensayo del tinte DMMB, Hauselmann, H. J. et al., J. Cell. Sci. 107:17-27 (1994). Para cada punto de tiempo, todos los análisis de los glóbulos NP y AF se realizaron en 3 conjuntos de 9 glóbulos cada uno. Los análisis estadísticos se realizaron en el ANOVA de una vía con la prueba PLSD de Fisher como una prueba post hoc. RESULTADOS El contenido del ADN no disminuyó durante el tratamiento de las células del NP o AF con la C-ABC. El contenido del ADN se elevó moderadamente en todos los grupos de las células del NP y AF durante los siguientes nueve días después de alcanzar una estabilización. Aunque el aumento no fue tan pronunciado en los glóbulos de NP y AF cultivados con la OP-1, esta diferencia no es estadísticamente significante. Figuras 1 y 2. Observaciones similares y conclusiones se obtuvieron cuando los contenidos de la PG se expresó por <' " 5 glóbulo o por xg del ADN. Figuras 3 a 10 y 12. Consecuentemente, todos los valores para los contenidos de la PG se presentaron aqui solamente como xg de PG por 9 glóbulos. Como se muestra en la Figura 12, los contenidos de la PG sulfatada de los glóbulos de NP y AF no expuestos a la 10 C-ABC aumentan progresivamente con el tiempo de cultivo. El tratamiento con la C-ABC causó que el contenido de la PG cayera por más del 85% en los glóbulos tanto de NP como de AF. Aunque la recuperación de matriz fue claramente evidente en ambos glóbulos de NP y AF, regresaron al medio completo 15 sin la OP-1, la matriz asi formada nunca alcanzó el contenido de la PG visto en los glóbulos no tratados con la C-ABC. La OP-1 a 200 ng/ml parece no tener un efecto significante en la acumulación de la matriz durante los ^ 20 primeros 3 dias después del tratamiento con la C-ABC. En contraste marcado, entre los dias 3 y 6, las células tanto de NP como de AF expuestas a la OP-1, reestablecieron una matriz tan rica en las PG sulfatadas como aquellas células de control no expuestas a la C-ABC. En los últimos momentos, 25 la OP-1 continuó para ejercer su efecto simulatorio en las células tratadas con la C-ABC: los valores alcanzados en los contenidos de la PG fueron significantemente mayores que aquéllos no solamente de las células tratadas con la C-ABC no expuestas a la OP-1, sino también de las células de control (P < 0.01). Figura 12.

DISCUSIÓN Estos Datos demuestran la efectividad de la OP-1 del factor de crecimiento en el estimulo de la reparación de la matriz por las células de NP y AF, después que su matriz se ha agotado casi totalmente de los glicosaminoglicanos sulfatados por una enzima que degrada el proteoglicano. Los resultados son inesperados por varias razones. Primera, los datos muestran que las células de NP y AF son tan responsivas como los condorcitos articulares al estímulo inducido por la OP-1 de la síntesis de la PG. Mientras no se desea estar unido por la teoría, debido a que la OP-1 es mucho más efectiva en la regulación mejorada de la síntesis del agrecano que de las PG pequeñas no agregadas en el cartílago articular (Hunch, K, et al., Artritis Rheum. 40: 2157-2161 (1997)). es más probable que el enriquecimiento den las G reportado tenga reflejos principalmente en la incorporación en la reparación de matriz de las moléculas de agregano recientemente sintetizadas.

Segundo, los resultados indican que la OP-1 o factores de crecimiento relacionados con modos similares de acción, son útiles en estimular la reparación de la matriz in vivo, no sólo después de la quimionucleólisis, inducida ^ 5 clínicamente, sino también en el tratamiento terapéutico de la degeneración del disco. Tercero, los datos muestran que la combinación de una enzima que degrada el proteoglicano y un factor de crecimiento proporcionen un método de quimionucleólisis que 10 es superior al uso de una enzima que degrada el proteoglicano, tal como la condroitinasa ABC sola.

Ejemplo 3: Estimulación de la Proteína-1 osteogénica de la reparación de la matriz del cartílago por el núcleo pulposo 15 y el espacio anular fibroso. Este ejemplo demuestra la eficacia de la proteína osteogénica en estimular la reparación de la matriz del cartílago por las células, específicamente las células del núcleo pulposo ("NP" ) y el espacio anular fibroso ("AF"), 20 aisladas de los discos intervertebrales ("IVD" ) . En este Ejemplo, los discos lumbares se aislaron de conejos blancos de Nueva Zelanda y el tejido del NP se separó del tejido de AF por disección. Las células de NP y AF se aislaron separadamente de los dos tejidos por la 25 digestión de la enzima en secuencia y resuspendidos en 1.2% de alginato estéril de baja viscosidad, que luego se formó en glóbulos. Las células se cultivaron separadamente en el medio DMEM/F-12 que contiene 10% de FBS, con el medio siendo cambiado diariamente. Después de 7 días, cada cultivo se subdividió en tres grupos. El primer grupo fue un grupo de control que no se trató con la OP-1. El segundo y tercer grupos crecieron en la presencia de la OP-1 durante 72 horas, el segundo grupo se trató con 100 ng/ml de la OP-1 y el tercer grupo se trató con 200 ng/ml de la OP-1. La 3H-prolina radioetiquetada se agregó a los cultivos por al menos 4 horas de incubación con la OP-1. Después de la incubación, el colágeno se extrajo de los cultivos y el régimen de la producción del colágeno se determinó midiendo la incorporación radietiquetada en los extractos. La producción del colágeno se asocia con el crecimiento y la reparación de la matriz del cartílago. Para determinar el régimen de la proliferación celular, el contenido de cada ADN de grupo se midió usando el tinte Hoechst 33258. La proteína osteogénica aumentó la producción del colágeno en los cultivos celulares tanto del NP como el AF, en una manera que depende de la concentración. El tercer grupo incorporado más radioetiquetado que el segundo grupo, el cual, a su vez, incorporó más radioetiquetado que el primer grupo de control. La proteína osteogénica tiene un efecto mitógeno significante en concentraciones altas, que cuentan para algo de la elevación en la producción del colágeno. No obstante, el régimen de la síntesis del colágeno aumentó significantemente aún cuando la proliferación de la célula aumentado cuenta para esto. Los resultados sugieren que la proteína osteogénica simula el crecimiento y la reparación de la matriz extracelular.

Ejemplo 4: Desarrollo de los modelos de animales para la degeneración del disco intervertebral. Evaluación de los cambios morfológicos/ biomecánico y bioquímicos en el disco/ debido a la degeneración. Entre los numerosos modelos de animales para la degeneración de disco, dos modelos de conejo se seleccionaron, el tipo "herida de puñal" del modelo fibroso anular (Lipson, S.J. Muir H, Spine 6:194-210 (1981), al igual que el modelo de inyección intradiscal de la C-ABC (Kato, F. et al., Clin. Orthop. 253:301-308 (1990). Estos modelos se pueden reproducir y los cambios bioquímicos se han descrito en diferentes etapas de la degeneración. Se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda, cada uno pesando alrededor de 2.5 kg. Se anestesiaron con quetamina intramuscular, 45 mg/kg, y se mantuvieron con una inyección IV de 5-20 mg/kg, según sea necesario y por una máscara de oxígeno/óxido nitroso. En seguida de la preparación y cubierta, se usó el acercamiento retroperitoneal posterolateral para exponer los aspectos anterior lateral de los discos. Para el grupo de tipo herida de puñal, se hizo una incisión transversal en el espacio anular ventral fibroso, usando una hoja número 11. Para el grupo que quimionucleólisis, 0.25 ce de la C-ABC (187 U/ml) se inyectaron en el disco con una aguja de calibre 28, unida a una micro jeringa. Cada animal tenía dos discos tratados por el tipo herida de puñal o quimionucleólisis y dos discos de control. Los niveles se escogieron aleatoriamente. La herida se cerró en capas y la recuperación normal se vigiló 1 día después de la cirugía. Tres animales se sacrificaron de ambos grupos de tipo herida de puñal y quimionucleólisis en la 2, 4, B, 12 y 24 semanas (un total de 30 conejos) .

Evaluación Morfológica Se obtuvo la MRI un día antes del sacrificio, para determinar el grado de degeneración del disco. Adicionalmente, para evaluar los cambios histológicos en el AF y NP, , se realizó la histología de rutina en un disco tratado y uno de control de cada período de tiempo. Para la histología, los segmentos del movimiento se fijan en formalina regulada con fosfato, descalcificada, incrustada en parafina, seccionada y teñida con H & E. Los resultados de MRI e histologia se clasificaron por los criterios de Thompson. Para la MRI, los segmentos de movimiento antes de la carga se formaron en imágenes a la temperatura ambiente en un crio-imán 1.5 Tesla (escáner Sigma, General Electric Medical Systems, Milwaukee, WI) con bobinas de solenoide de diámetro de 10.16 +o 112.7 cm. Se usaron las secuencias de eco de giro convencionales. Las imágenes de peso T2 se obtuvieron de cada segmento de movimiento en el plano sagital con la secuencia de eco de giro convencional. Las imágenes axiales y para-sagitales de peso T2 se obtuvieron con TE-33 y 80 mseg., TR 2000 mseg., 2 NEX, rebanadas de espesor de 1.0 mm, campo de exhibición de 8 cm2 y matriz de 512 x 256.

Las imágenes de MRI se examinaron para los cambios de señal del NP y el AF interno (normal, oscuro, intermedio) y la presencia de desgarres anulares. Adicionalmente, cualquier cambio estructural, tal como la altura de disco, involución del espacio anular externo, la presencia de degeneración mixoide, separación del NP de la placa terminal, fenómeno de vacío, nodos de Schmorl, y herniación se anotaron. Los cambios degenerativos se evaluaron de I a V, con base en Vemon-Roberts (Tabla 1) . Con el desgarre radial en mente, los discos se clasificaron como I: normal, II, ; desgarres transversales o desgarres circunferenciales, III: desgarres radiales, IV: degeneración avanzada con pérdida de la altura del disco. Las imágenes sagitales de las secciones histológicas se analizaron y graduaron de Thompson I a V (Tabla 2) . Las secciones de MRI y de histología se correlacionaron.

Tabla I. Clasificación MRI (Vemon-Roberts) 5 Tabla 2. Descripción de los Grados Morfológicos por Thompson Pruebas Biomecánicas La meta es determinar los cambios en la rigidez axial y de torsión dinámica del disco y en la respuesta a la histéresis debida a las varias etapas de la degeneración del disco, cuando se compara a un disco normal. Las pruebas biomecánicas se realizaron dentro de 12 horas después de la eutanasia de todos los animales, para preservar la composición bioquímica, tanto como sea posible.

Protocolo: Inmediatamente después de sacrificar los animales, se obtuvieron los segmentos de movimiento lumbares, y los tejidos suaves extraños y los elementos posteriores se removieron dejando intactas las unidades del f "- 5 cuerpo vertebral - disco - cuerpo vertebral . La parte superior e inferior de cada unidad se cortó por una sierra de hueso de diamante, de baja velocidad, de modo que las superficies superior y posterior resultantes fueran paralelas al plano transversal medio del disco. El espécimen 10 preparado se sometió a una carga de compresión axial constante de 50 N durante 30 minutos. El desplazamiento ..· axial que resulta de la carga constante se midió para investigar si hay algún comportamiento de arrastre. Luego, las cargas cíclicas (50 + 20 N) se aplicaron a frecuencias 15 de 0.5 y 5 Hz. La carga máxima de 20 N se selecciona no para causar una deformación permanente del tejido del disco, la falla de la placa de extremo o el hueso subcondral, o la delaminación o desgarres en el espacio anular. Los ciclos de carga y descarga se repitieron 20 veces para asegurar la 20 saturación para ciclos sucesivos, y un intervalo de tiempo de 5 minutos se permitió entre cada condición de carga, para asegurar la recuperación de la presión intradiscal. En seguida de las pruebas de compresión, el espécimen se mantuvo en una condición libre de carga durante 30 minutos y 25 se sometió a momentos de torsión aplicados en una manera similar. El momento medio de torsión y la amplitud es de 1.5 Nm y 0.5 Nm, respectivamente, y las frecuencias de carga son de 0.1 y 1.0 Hz. Mientras se carga, las señales de la celda de carga, LVDT (RVDT en el caso de las pruebas de torsión) y el sensor de presión se muestrean a 10, 50, 100 ó 500 Hz. Las unidades del cuerpo vertebral - disco - cuerpo vertebral, obtenidas de animales experimentales sometidos una vez a la compresión cíclica y pruebas de torsión. Sin embargo, las pruebas biomecánicas se repitieron dos veces en las unidades de cuerpo vertebral - disco - cuerpo vertebral, obtenidas primero con discos intactos y el segundo con discos de tipo herida de puñal. Las pruebas biomecánicas de las unidades de cuerpo vertebral - disco - cuerpo vertebral, con heridas de puñal, se realizaron para investigar las respuestas biomecánicas inmediatamente después de la lesión. Las curvas de desplazamiento de carga se obtuvieron y analizaron para determinar la rigidez dinámica y la histéresis. Esta rigidez dinámica es determinada como la relación de la carga de entrada cresta a cresta al desplazamiento cresta a cresta en el ciclo 20, en tanto la histéresis se define por la relación del área de la envoltura de las trayectorias de carga y descarga al área según la trayectoria de carga. Las curvas de presión intradiscales de carga son también obtenidas y analizadas para investigar la relación entre la carga aplicada y las respuestas de la presión intradiscal . La pendiente de la presión intradiscal, dp/dl ( pa/N) es determinada dividiendo la presión cresta a cresta por la carga cresta a cresta y los desplazamientos de fase (retardo de tiempo entre la carga controlada y la presión intradiscal) como se representa como el área definida por la envoltura de las trayectorias de carga y descarga. El comportamiento de arrastre se describe por la cantidad del desplazamiento axial y de torsión, medido de la curva de desplazamiento-tiempo obtenida bajo condiciones de carga estática constantes, y los cambios de la presión intradiscal durante el mismo período de tiempo son también determinados de la curva de presión-tiempo intradiscal correspondiente.

Estudios Bioquímicos El propósito de estos estudios es identifica en el tiempo, cambios en la composición bioquimica que resulta de los modelos de degeneración de disco del conejo, de inyección intradiscal C-ABC o de tipo herida de puñal, y para correlacionar las características biomédicas con la composición bioquímica del disco. En seguida de las pruebas biomecánicas, desde cada unidad de cuerpo vertebral - disco - cuerpo vertebral, el disco es extirpado y las pruebas bioquímicas, que se describieron antes, son también realizadas. Se removió todo el segmento espinal lumbar. La mitad de los especímenes e analizaron en las pruebas bioquímicas. La composición bioquímica de los discos se cuantificó en términos del proteoglicano, colágeno (hidroxiprolina) y contenidos de entrelazamiento estable del colágeno. La otra mitad se fijó en 4% de paraformaldehído en PBS, descalcificado, incrustado en parafina, seccionado y evaluado por la histología y el inmuno-teñido. Las secciones sagitales (5-8 mm) de cada disco se tiñeron con hematoxilina y eosina, al igual que Safranin-O. Las secciones en serie de cada animal se probaron para la inmunorreactividad del colágeno del tipo II y el tipo I, Los anticuerpos monoclonales del ratón contra el colágeno humano de tipo II y el colágeno del tipo I se usaron como los anticuerpos primarios. Las secciones se contra-tiñeron con hematoxilina de Meier antes del montaje.

Ejemplo 5: Determinación de la reparación in vivo mediada por la OP-1, de discos intervertebrales en modelos de animales para la degeneración del disco intervertebral. Este Ejemplo prueba la utilidad potencial de la OP-1 inyectada intradiscalmente en el mismo momento como la solución de la C-ABC o en el momento de la punción de AF, en promover la reparación del NO y AF. Protocolo: Doce conejos de Nueva Zelanda, que pesan 3 kilogramos, se usaron para la prueba de tipo herida de puñal y de herida de puñal + la OP-1. Cada conejo tiene un disco que recibe la herida de puñal sola y el otro disco recibe la herida de puñal + la OP-1. Veinticuatro conejos adicionales se dividieron en 4 grupos (inyección de solución 5 salina de control, OP-1 sola, C-ABC sola, C-ABC + OP-1). Cada conejo tiene sólo dos discos inyectados. Después de la administración intravenosa de pentobarbital sódico (25 mg/kg) , se tomaron radiografías de la línea básica. En seguida de la inhalación del isoflurano, cada conejo se 10 colocó en una posición postrada lateral y la superficie anterior del disco lumbar se expuso a través del r - v acercamiento retroperitoneal posterolateral . La condroitinasa-ABC (187 U/ml) sola, OP-1 (2 ug) sola o la C- ABC premezclada con OP-1 (2 µg) se inyectaron en los dos 15 discos intervertebrales lumbares inferiores (30 µ? de solución por disco) con una aguja de calibre 28 unida a una micro jeringa. Para el grupo de control, un volumen igual de solución salina se inyectó. La herida se lavó varias veces con una solución salina estéril, que contiene antibióticos, v ' 20 y luego se cerró con suturas en capas. Tres conejos en cada grupo se sacrificaron con una dosis en exceso del pentobarbital a las 2, 4, 8 y 16 semanas después de la inyección. Después de la eutanasia, se tomaron radiografías para evaluar el estrechamiento del espacio del disco. Todo 25 el segmento de la espina lumbar se removió, se fijó en 4% de paraformaldehído en PBS, descalificado e incrustado en parafina. Las secciones sagitales (5-8 mm) de cada disco se tiñeron con hematoxilina y eosina, al igual que la Safranin- 0. Las secciones en serie de cada animal se probaron para el colágeno de tipo II y la inmunorreactividad del colágeno de tipo I. Se usaron los anticuerpos monoclonales del ratón contra el colágeno humano de tipo II, y el colágeno de tipo 1, como los anticuerpos primarios. Las secciones se contra-tiñeron con la hematoxilina de Meier antes del montaje. De lo anterior, se observará que se pueden efectuar numerosas modificaciones y variaciones, sin apartarse del espíritu y ámbito verdaderos de la presente invención. Se entenderá que no se intenta o debe ser inferida alguna limitación con respecto a los ejemplos específicos presentados. La descripción intenta cubrir por las reivindicaciones anexas, todas las modificaciones que se encuentren dentro del ámbito de dichas reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método de tratamiento, que comprende administrar a un mamífero, que necesite la quimionucleólisis : (a) una cantidad efectiva de desdoblamiento del proteoglicano, de una enzima que degrada este proteoglicano; y (b) una cantidad de un factor del crecimiento, efectiva en estimular la formación de un componente de matriz.
2. El método de la reivindicación 1, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa.
3. El método de la reivindicación 2, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa ABC.
4. El método de la reivindicación 2, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa AC.
5. El método de la reivindicación 2, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa B.
6. El método de la reivindicación 2, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa C.
7. El método de la reivindicación 1, en que el factor de crecimiento es la proteína osteogénica.
8. El método de la reivindicación 7, en que la proteína osteogénica es la OP-1.
9. El método de la reivindicación 1, en que el factor de crecimiento es el factor de crecimiento ß de transformación .
10. El método de la reivindicación 1, en que la enzima que degrada el proteoglicano y el factor de crecimiento se administran simultáneamente.
11. El método de la reivindicación 1, en que el componente de matriz es el proteoglicano.
12. El método de la reivindicación 1, en que el componente de matriz es el colágeno.
13. Un método para reparar las matrices del núcleo pulposo y/o el espacio anular fibroso, en un disco intervertebral, en seguida de la quimionucleólisis, por una enzima que degrada el proteoglicano, este método comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva que sintetiza el proteoglicano, de un factor de crecimiento.
14. El método de la reivindicación 13, en que el factor de crecimiento es una proteína osteogénica.
15. El método de la reivindicación 14, en que la proteína osteogénica es la OP-1.
16. El método de la reivindicación 13, en que el factor de crecimiento es el factor de crecimiento ß de transformación .
17. Un método para rellenar el proteglicano en el núcleo pulposo y/o el espacio anular fibroso, en un disco intervertebral, en seguida de la quimionucleólisis, por una enzima que degrada del proteglicano, que comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva de síntesis del proteoglicano de un factor de crecimiento.
18. El método de la reivindicación 17, en que el factor de crecimiento es una proteína osteogénica.
19. El método de la reivindicación 18, en que la proteína osteogénica es la OP-1.
20. El método de la reivindicación 17, en que el factor de crecimiento es el factor de crecimiento ß de transformación.
21. Una composición de materia, que comprende una enzima que degrada el proteoglicano y un factor del crecimiento.
22. La composición de materia de la reivindicación 21, en que esta enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa.
23. La composición de materia de la reivindicación 22, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa ABC.
24. La composición de materia de la reivindicación 22, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa AC.
25. La composición de materia de la reivindicación 22, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa B.
26. La composición de materia de la reivindicación 22, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa C.
27. La composición de materia de la reivindicación 21, en que el factor de crecimiento es una . proteina osteogénica.
28. La composición de materia de la reivindicación 27, en que la proteina osteogénica es la OP-1.
29. La composición de materia de la reivindicación 21, en que el factor de crecimiento es el factor de crecimiento ß de transformación.
30. Un equipo, que comprende una enzima que degrada el proteoglicano y un factor de crecimiento.
31. El equipo de la reivindicación 30, en que la enzima que degrada el proteoglicano es la condroitinasa.
32. El equipo de la reivindicación 31, en que la enzima que degrada del proteoglicano es la condroitinasa ABC.
33. El equipo de la reivindicación 31, en que la enzima que degrada del proteoglicano es la condroitinasa AC.
34. El equipo de la reivindicación 31, en que la enzima que degrada del proteoglicano es la condroitinasa B.
35. El equipo de la reivindicación 31, en que la enzima que degrada del proteoglicano es la condroitinasa C.
36. El equipo de la reivindicación 30, en que el factor de crecimiento es una proteina osteogénica.
37. El equipo de la reivindicación 36, en que la proteina osteogénica es la OP-1.
38. El equipo de la reivindicación 30, en que el factor de crecimiento es el factor de crecimiento ß de transformación .