MXPA01000884A

MXPA01000884A - Vacunas de salmonella atenuadas vivas para el control de patogenos de aves.

Info

Publication number: MXPA01000884A
Application number: MXPA01000884A
Authority: MX
Inventors: Kenneth L Roland
Original assignee: Megan Health Inc
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2002-06-04
Also published as: JP2002521345A; EP1100536A2; BR9912410A; WO2000004919A2; AU4991499A; ZA200100976B; US6399074B1; CN1315871A; WO2000004919A3; CA2338555A1

Abstract

Se describe una vacuna para proteger a aves contra la infeccion por microbios gram- negativos patogenos de aves; la vacuna es una cepa recombinante de Salmonella que expresa el antigeno O de un microbio gram-negativo patogeno de aves, tal como una cepa de E. coli que es patogena en aves de corral; la cepa recombinante de Salmonella no expresa tambien el antigeno O de Salmonella; se describen tambien metodos para usar la vacuna para inmunizar a aves.

Description

VACUNAS DE SALMONELLA ATENUADAS VIVAS PARA EL CONTROL DE PATÓGENOS DE AVES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere generalmente a vacunas para aves de corral y otras aves, y más particularmente, a vacunas para proteger a aves de corral y otras aves contra infecciones por bacterias gram negativas patógenas de aves. 10 DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA T_ Las cepas de E. coli patógenas de aves (APEC) causan numerosas enfermedades relacionadas en aves de corral y otras aves, 15 incluyendo saculitis aérea, celulitis, colibacilosis, coligranuloma, colisepticemia, enfermedad de Hjarre, onfalitis, peritonitis, salpingitis y sinovitis (Gross, W. B, en Diseases of Poultry, Calnek et al., eds., lowa State University Press, p. 138-144, 1991 ; Messier et al., Avian Diseases 37:839-844, 1993). Estas enfermedades y otras enfermedades causadas por patógenos de aves 20 gram-negativos pueden conducir a índices incrementados de condenación de cadáveres no para conversión a alimentos, o bien muerte del animal, dando como resultado cada año pérdidas de millones de dólares en la industria de las aves de corral. Véase Norton, R. A. Broiler Industry, Feb. 1998, pp. 28-32.

La contaminación de productos de aves de corral por Salmonella es una fuente significativa de infección por Salmonella en humanos, la cual causa gastroenteritis, y es de esta manera un problema de salud pública importante. Se ha mostrado que la administración oral de células vivas de 5 cepas de S. typhimurium que tienen deleciones atenuantes en los genes cya y crp, provee protección excelente contra el desafío por Salmonella de tipo silvestre en pollos (Hassan et al., Res. Microbiol. 141 :839-850, 1990; Hassan et al., Infecí. Immun. 62:5519-5527, 1994), y se han desarrollado sistemas para la expresión estable de antígenos heterólogos en dichas cepas (Hone et 10 al., Microb. Pathog, 5:407-418, 1998; Strugnell, et al., Gene 88:57-63, 1990; Galán et al., Gene 94:29-35; 1990; Nakayama et al., Bio/Technology 6:693- 'V 697, 1995). ' Las cepas de APEC son representadas principalmente por sólo unos pocos serotipos, O1 , O2, 035 y 078 (Cloud et al., Avian Dis. 29:1084- 15 1093, 1985, Glantz et al., Avian Dis. 6:322-328, 1962; Gross, citado anteriormente), mientras que los serotipos de Salmonella más frecuentes en aves de corral son de los grupos B, C y D. Los serotipos O de bacterias gram negativas tales como E. coli y Salmonella se determinan a nivel molecular mediante la denominada estructura del antígeno O, denominada también 20 cadena específica O u polisacárido O (O-PS), la cual está generalmente formada de longitudes variables de unidades de azúcar idénticas polimerizadas ancladas en la membrana exterior bacteriana como el componente más exterior de moléculas de lipopolisacárido (LPS) (Helander et al., en Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Referonnce, R. A. Meyers, ed., VCH Publishers, Inc., 1995).

Se ha mostrado que el anticuerpo específico contra el antígeno O de LPS brinda protección en modelos de mamífero de infecciones 5 extraiptestinales causadas por E. coli en humanos (Cryz et al., Vaccine 73,449-453, 1995; Pluschke et al., Infecí. Immun. 49:365-370, 1985), y el antígeno O de LPS ha sido reconocido como un antígeno protector para otros patógenos gram-negativos (Ding et al., J. Med. Microb. 37:95-102, 1990; Michet?i et al., Infecí. Immun. 60:1786-1972, 1992; Robbins et al., Clin. Infecí 10 Dis. 15:346-361 , 1992). Además, varios grupos de investigación han reportado el uso de Salmonella atenuada e híbridos de Salmonella-E. coli como *' vehículos para el suministro de vacunas en el caso de antígenos O de varios ? 1 patógenos humanos, incluyendo Shigella sonnei, Vibrio cholerae y Pseudomonas aeruginosa (Black et al., J. Infecí. Dis. 755:1260-1265, 1987; 15 Formal et al., Infecí. Immun. 34:746-750, 1981; Pier et al., Infecí. Immun. 63:2818-2825, 1995); (Morona et al., patente de E.U.A. No. 5,110,588). Sin embargo, hasta el trabajo descrito en la presente, no se había reportado la inmunización de aves de corral con Salmonella atenuada viva que expresa un antígeno O de APEC. 20 El antígeno O de LPS producido por las bacterias E. coli y Salmonella está formado de lípido A, un oligosacárido del núcleo R, y el polisacárido específico O (O-PS), los cuales están enlazados covalentemente en ese orden. Véase Sugiyama et al., J. Bacíeriol. 773:55-58, 1991. En S. íyphimurium, la síntesis de la porción del núcleo R es dirigida por el locus ría y ciertos genes de mantenimiento tales como galE, galU y pgi, mientras que la síntesis de O-PS es dirigida por el grupo de genes ríb, el cual codifica para enzimas que intervienen en la biosíntesis de la unidad de azúcar monomérica, 5 y el gen ríe, el cual codifica para la polimerasa del antígeno O responsable de la polimerización de la unidad de azúcar en una cadena de polisacárido de alto peso molecular. Véase Sugiyama et al., citado anteriormente. Un grupo que investiga los genes que se requieren para la síntesis del antígeno O de LPS en 09 de E. coli, introdujo un plásmido que 10 contiene el locus rfb de 09 de E. coli en cepas mutantes y de tipo silvestre de S. íyphimurium, con defectos en los loci ríb, ríe o ríe, y reportó que la cepa de tipo silvestre que contiene al plásmido expresa a LPS específica para 09 de E. coli y S. íyphimurium sobre la superficie celular, mientras que el mutante ríe fue expresado únicamente en LPS específico de 09. El antígeno O de E. coli 15 fue sintetizado también en el mutante ríb de S. fyphimurium, pero no en el mutante ríe. Véase Sugiyama et al., citado anteriormente. Este grupo concluyó que los productos génicos de los loci ría de S. íyphimurium y ríb de 09 de E. coli, pueden cooperar para sintetizar el antígeno 09 de E. coli en el núcleo R de S. íyphimurium. Sin embargo, este grupo no reportó si alguna de estas 20 construcciones recombinantes de S. íyphimurium podría crecer dentro de un animal hospedero, o generar una respuesta inmune protectora del hospedero contra 09 de E. coli de tipo silvestre ó S. fyphimurium. Por consiguiente, existe la necesidad de una vacuna bivalente para el control de la infección por te** **-* , **** Salmonella y E. coli en aves de corral. Dicha vacuna beneficiaría simultáneamente a la salud pública, y reduciría los costos de producción de aves de corral.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención está dirigida a una vacuna que brinda protección a aves contra la infección por un microbio gram-negativo patógeno de aves (APG-N)- La vacuna comprende células vivas de una cepa recombinante de Salmonella que expresa el antígeno O del microbio APG-N debido a integración, en el cromosoma de Salmonella, del grupo de genes ríb y el gen ríe de APG-N (en lo consecutivo usado intercambiablemente con el grupo de genes ríb/rfe de APG-N)- La cepa recombinante de Salmonella, la cual es un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella, no expresa el antígeno O de la cepa virulenta de Salmonella, debido a una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella, y/o en el gen ríe de Salmonella. En una modalidad preferida, el microbio APG-N es una cepa de APEC, y el grupo de genes ríb/rfe de APG-N es un grupo de genes ríb/rfe de APEC. Esta cepa recombinante de Salmonella tiene otras características que la hacen particularmente útil como una vacuna en aves de corral y otras aves. En primer término, la vacuna puede ser formulada para administración, y se conocen vacunas orales que estimulan el tejido linfoide asociado a intestino (GALT), incluyendo respuestas inmunes en mucosas, humorales y celulares. Las vacunas vivas orales son también de producción menos costosa, y son más fáciles de administrar en el campo, que vacunas inyectables. En segundo término, la falta de expresión del antígeno O de LPS específico para la cepa portadora, evita cualquier interferencia que el antígeno O de LPS portador podría tener sobre la expresión del antígeno O de APQ-N, O su reconocimiento por el sistema inmune del receptor de la vacuna. En tercer término, la cepa recombinante de Salmonella puede brindar protección contra microbios APG-N y la cepa de Salmonella progenitora, puesto que expresa otros antígenos de superficie celular de la cepa de Salmonella progenitora. Además, para vacunas que expresan el antígeno O a partir de una cepa de APEC, el uso de Salmonella más que de E. coli como bacteria portadora, debe proveer una respuesta inmune más vigorosa contra el antígeno O de APEC, debido a que mientras que las subespecies de S. entérica persisten en el bazo y la bolsa de Fabricio, E. coli no invade efectivamente estos tejidos linfoides, o es destruida rápidamente incluso si ocasionalmente tiene éxito para entrar en los mismos. En algunas modalidades, la cepa recombinante de Salmonella usada en la vacuna contiene también un polinucleótido recombinante que codifica para un producto génico deseado. Un producto génico preferido es un antígeno de un microbio gram-positivo patógeno de aves (APG-P), o de un patógeno eucariótico de aves.

En otra modalidad, la invención provee una vacuna multivalente para inmunizar a aves contra por lo menos dos microbios gram-negativos patógenos de aves (APQ-N), la cual comprende células vivas de una cepa recombinante de Salmonella que expresa un antígeno de cada uno de los microbios APG-N, la cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc de cada uno de los microbios APG-N integrado en el cromosoma de Salmonella, y teniendo una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella o en el gen ríe de Salmonella, que inactiva la expresión del antígeno O de Salmonella, en donde la cepa recombinante de Salmonella es un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella. En una modalidad preferida, los microbios APQ-N. O uno de ellos, es una cepa de APEC. En otra modalidad más, la invención provee una vacuna multivalente para inmunizar a una ave contra por lo menos dos microbios APQ. N, la cual comprende una mezcla de células vivas de primera y segunda cepas recombinantes de Salmonella, la primera cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc de un primer microbio APQ-N integrado en el cromosoma de Salmonella, y que expresa el antígeno O del primer microbio APG-N, y la segunda cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc de un segundo microbio APG-N integrado en el cromosoma de Salmonella, y que expresa el antígeno O del segundo microbio APQ-N. en donde cada una de la primera y segunda cepas recombinantes de Salmonella tiene una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella, o en el gen ríe de Salmonella, que inactiva la expresión del antígeno O de Salmonella, y en donde cada una de la primera y segunda cepas recombinantes de Salmonella es un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella. En una modalidad preferida, las cepas recombinantes de Salmonella, o una de ellas en la vacuna multivalente, expresa el antígeno O de una cepa de APEC. 5 La presente invención en otras modalidades está dirigida a métodos para inmunizar a aves contra la infección por microbios APG-N- Estos métodos incluyen un método para inmunizar a una ave contra un microbio APG-N> el cual comprende administrar al ave una cantidad inmunológicamente efectiva de una vacuna que comprenda células vivas de una cepa 10 recombinante de Salmonella que exprese el antígeno O del microbio APG-N. la cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc del microbio APG-N integrado establemente en el cromosoma de Salmonella, y * teniendo una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella, o en el gen ríe de Salmonella, que inactiva la expresión del antígeno O de Salmonella, en 15 donde la cepa recombinante de Salmonella es un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella. Los métodos incluyen también un método para inmunizar simultáneamente a un ave contra más de un microbio APQ-N, el cual comprende administrar al ave una cantidad inmunológicamente efectiva de una vacuna multivalente como se describió anteriormente. Se incluye también 20 un método para inmunizar simultáneamente a un ave contra un microbio APG- N y la especie portadora de Salmonella, el cual comprende administrar al ave una cantidad inmunológicamente efectiva de cualquiera de las vacunas como se describió anteriormente.

En otra modalidad más, la invención provee un método para obtener una vacuna para inmunizar a un ave contra una cepa del microbio APG-N- El método comprende los pasos de seleccionar una cepa de Salmonella capaz de colonizar al ave, integrar en el cromosoma de Salmonella un grupo de genes ríb/ríc del microbio APQ-N, introduciendo una mutación en el grupo de genes rfb de Salmonella, y/o en el gen ríe de Salmonella, y aislar bacterias recombinantes de Salmonella que expresen el antígeno O característico del microbio APG-N, pero que no exprese el antígeno O de Salmonella. En una modalidad, la cepa seleccionada de Salmonella es un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella. En otra modalidad, la cepa seleccionada de Salmonella es una cepa virulenta de Salmonella, y el método comprende además el paso de introducir en la cepa virulenta de Salmonella, una mutación atenuante en un gen de virulencia de Salmonella, y aislar mutantes que tengan virulencia atenuada, comparativamente con la cepa virulenta de Salmonella. Entre las varias ventajas logradas mediante la presente invención, está por lo tanto la provisión de vacunas de Salmonella recombinantes vivas capaces de proteger a aves, y particularmente a aves de corral, contra la infección por cepas de APEC y otros microbios APG-N. y métodos para obtener dichas vacunas, la provisión de vacunas multivalentes útiles para proteger simultáneamente a aves contra la infección por dos o más microbios APG-N. la provisión de métodos para inmunizar a aves contra cepas de APEC y otros microbios APG-N. y la provisión de un método para inmunizar a aves contra cepas de APEC y Salmonella.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un mapa genético del cósmido suicida pMEG219, que muestra las siguientes características: un origen de replicación dependiente de pir (ori R6K); los genes de resistencia a tetraciclina de Tn70 (íetR, teíA); un fragmento de mobilización del plásmido RK2 (mob), el gen de resistencia a kanamicina (Kan), y sitios dobles cos (cos) de pCOS2EMBL; y el alelo ?cya-27 de S. íyphimurium; se indica además la localización de los sitios de restricción Notl y PvuW descritos en el texto. La figura 2 muestra imágenes digitalizadas de western blots de LPS aislado de la cepa de bacterias indicada sondeada con anticuerpo de LPS del grupo B de anti-S. fyphimurium (fig. 2A), o anticuerpo de LPS anti-078 (fig. 2B); La figura 3 muestra imágenes digitalizadas de western blots de LPS aislado de la cepa de bacterias indicada sondeada con anticuerpo de LPS del grupo B de anti-S. íyphimurium (fig. 3A), o anticuerpo de LPS anti-078 (fig. 2B), con un marcador de peso molecular incluido en el gel para el blot mostrado en la figura 3A; La figura 4 es un mapa genético de pMEG287 que muestra la localización de genes descritos en el texto; y La figura 5 es un mapa genético de pMEG055 que muestra la localización de genes descritos en el texto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de que subespecies de Salmonella enferica, en particular S. íyphimurium, pueden ser diseñadas para expresar el antígeno O de microbios APG-N. en particular de las cepas de APEC 078 y 01 , en una forma inmunógena sobre la superficie celular, sin que dicha expresión interfiera con el crecimiento in vivo o colonización del GALT de aves de corral por el portador de Salmonella. Además, el inventor ha descubierto en la presente que la administración oral de dichas cepas recombinantes de Salmonella a pollos, da como resultado una reducción significativa en la capacidad de las cepas virulentas de APEC para infectar y causar enfermedad en los pollos vacunados. De esta manera, una modalidad de la invención es una vacuna para la inmunización de aves contra un microbio gram-negativo patógeno de aves (APG-N)> que comprende células vivas de una cepa recombinante de Salmonella que expresa el antígeno O de la cepa APG-N- El antígeno O de APQ-N es expresado en una forma inmunógena, significando que la porción de antígeno O de APG-N forma parte de una molécula completa de antígeno O de LPS en la cual el antígeno O de APQ-N está unido a una porción del núcleo de LPS y, después de su administración a un ave, es capaz de generar anticuerpos que reaccionan con el antígeno O de LPS del microbio APG-N de tipo silvestre. Típicamente, la porción del núcleo de LPS es sintetizada por el portador recombinante de Salmonella, pero en algunas modalidades, el núcleo de LPS puede ser del mismo microbio APQ-N que el antígeno O, o de un microbio APG-N diferente. Se contempla que la vacuna se puede usar para inmunizar todo tipo de aves, incluyendo pollos, pavos, patos, gansos, faisanes y otras aves domesticadas categorizadas como aves de corral, así como también aves no domesticadas tales como pavos silvestres y especies exóticas tales como loros, periquitos, etc., contra cualquier microbio APQ-N conocido ahora o que subsecuentemente se determine que es patógeno en aves. Dichos microbios APQ-N incluyen, pero no están limitados a: (1 ) cepas de APEC tales como los serotipos 01 , 02, 03, 06, 08, 015, 018, 035, 071 , 074, 078, 087, 088, 095, 0103 y 0109 de E. coli; (2) cepas de Salmonella patógenas de aves, por ejemplo, cepas de los grupos C y D; y (3) especies de los siguientes géneros: Campyíobacter, Bacteroides, Bordetella, Haemophilus, Pasteurella, Francisalla, Actinobacillus, Klebsiella, Moraxella, Pseudomonas, Proteus y Ornithobacíerium. De preferencia, la cepa recombinante de Salmonella expresa el antígeno O de una cepa de APEC. Más preferiblemente, el antígeno O de APEC es característico de los serotipos 01 , 02, 035 o 078, y más preferiblemente el antígeno O es LPS 01 , LPS 02 o LPS 078. La cepa recombinante de Salmonella usada en la vacuna se prepara integrando el grupo de genes rfb/rfc de un microbio APG-N deseado en el cromosoma de una cepa adecuada de Salmonella. Las cepas de Salmonella para su uso como las bacterias portadoras se pueden derivar de cualquier especie de Salmonella que sea capaz de colonizar aves, de preferencia aves de corral. Dichas especies ¡ncluyen, pero no están limitadas a, S. fyphimurium, S. enteridifis, S. gallinarum, S. pullorum, S. arizona, S. heidelberg, S. anatum, S. hadar, S. agana, S. moníevideo, S. kenfucky, S. infantis, S. schwarzengrund, S. saintpaul, S. brandenburg, S. instanbul, S. cubana, S. bredeney. S. braenderup, S. livingsfone, S. berta, S. california, S. senfenberg y S. mbandaka. Como se usa en la presente, "colonizar" significa que la especie de Salmonella es capaz de unirse a, invadir y persistir en, uno o más de los siguientes tejidos en la ave vacunada: pulmón, bazo, hígado, bolsa de Fabricio e intestino ciego. De preferencia, la cepa recombinante de Salmonella se deriva de S. íyphimurium, S. gallinarum, S. pullorum o S. enieriditis. Más preferiblemente, el grupo de genes ríb/ríc de APQ-N es insertado en una cepa de S. íyphimurium. Como se usa en la presente, un grupo de genes ríb/ríc de APQ-N contiene todos los genes necesarios para la síntesis del antígeno O característico de ese microbio APQ-N, incluyendo todos lo genes ríb, cuyos productos se requieren para la biosíntesis de la unidad de azúcar monómerica, así como también el gen ríe, el cual codifica para la polimerasa del antígeno O necesaria para la polimerización de las unidades de azúcar. Se pretende que los términos genes ríb y gen ríe signifiquen los genes de cualquier microbio APG-N identificado por codificar para productos génicos que tengan la misma función en la biosíntesis del antígeno O de los productos de un grupo de genes ríb/ríc de E. coli. En la mayoría de los serotipos de E. coli y Salmonella, el gen ríe está estrechamente enlazado al grupo de genes ríb, que en E. coli tiene aproximadamente 10 kb de longitud, y se localiza cerca de 45 minutos en el mapa genético de E. coli. Sin embargo, en algunas cepas de E. coli, como en S. typhimurium, el gen ríe no está enlazado al grupo de genes ríb, y se puede encontrar a una distancia significativa. Por ejemplo, en S. typhimurium, el grupo de genes ríb, que tiene aproximadamente 21 kb, se extiende desde 44.9-45.3 centisomas en el mapa genético de S. typhimurium, mientras que el gen ríe se localiza a 35.7 centisomas. Un grupo de genes ríb/ríc de APG.N funcionalmente completo puede ser clonado fácilmente usando metodología de rutina de clonación de cósmidos, como se describió anteriormente para la clonación de grupos de genes ríb/ríc de bacterias. Véase, por ejemplo, Viret et al., EP 0 564 689 B1 ; Neal et al., FEMS Microbiol. Letf. 82:345-352, 1991; Haraguchi et al., Microb. Pathog. 6:123-132, 1989; Microb. Pathog. 10:351-361 , 1991 ; Heuzenroeder et al., Mol. Microbiol. 3:295-302, 1989; Bastin et al., Mol. Microbiol. 5:2223-2231 , 1991; y Valvano et al., Infecí. Immun. 57:937-943, 1989. Técnicas generales de clonación de cósmidos se describen también en detalle en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En resumen, se prepara una genoteca de cósmidos de ADN cromosómico del microbio APG-N deseado en la cepa K-12 de E. coli, la cual no produce el antígeno O debido a mutaciones en la región de rfb. La genoteca de cósmidos es sembrada, y se seleccionan las colonias aisladas para la expresión del antígeno O de APG-N usando antisueros específicos para el antígeno O de la cepa APQ-N deseada. El fragmento de ADN cromosómico de APQ-N puede ser aislado a partir de clones de cósmidos positivos, y caracterizado además usando técnicas estándar, tales como mapeo por restricción y subclonación, para determinar la cantidad mínima de ADN de APG-N que se requiere para dirigir la síntesis del antígeno O de APG-N- Esta cantidad mínima es referida en la presente como el grupo de genes rfb/ríc. Para microbios APQ-N en donde el gen ríe se localiza a una distancia considerable del grupo de genes ríb, un fragmento cromosómico de APG-N individual que contenga un grupo de genes ríb/ríc funcional, puede no ser representado en la genoteca de cósmidos. En dichos casos, puede ser necesario realizar otros experimentos de selección y clonación de rutina para clonar el gen ríe, y construir un fragmento recombinante que contenga los genes ríb y el gen ríe. El grupo de genes ríb/ríc es transfectado entonces como un cósmido o plásmido en la cepa seleccionada de Salmonella, y el LPS producido por el recombinante resultante es analizado mediante métodos conocidos en la técnica y los que se describen brevemente a continuación. Se ha reportado que la porción del núcleo de LPS de Salmonella puede no aceptar el antígeno O heterólogo de algunas bacterias, dando como resultado antígeno O no unido, el cual es probablemente menos inmunógeno que las moléculas de LPS completas que poseen el antígeno O heterólogo unido covalentemente a la porción central de las bacterias portadoras (véase documento EP 0 564 689 B1 ; Morona et al., patente de E.U.A. No. 5,110,588). Las cepas recombinantes que expresan el antígeno O de LPS completo, se pueden distinguir de las que expresan el antígeno O no unido mediante análisis SDS-PAGE de LPS extraído de cultivos exponenciales o estacionarios tardíos usando un método rápido de minipreparaciones a pequeña escala (Hitchcock y Brown, J. Bacteriol. 154:269-277, 1983). Las moléculas de LPS separadas se pueden detectar en el gel mediante tinción con plata, o mediante análisis immunoblot usando un anticuerpo específico para el antígeno O. El antígeno O de LPS completo (referido también en la presente como LPS de tipo S o liso), producirá una escalera de bandas de alto peso molecular detectables mediante tinción con plata o análisis immunoblot, mientras que el antígeno O no unido no produce una escalera, y será detectado como una embarradura medíante tinción con plata o tratamiento de sondeo con anticuerpos. En tales casos, el locus ría de Salmonella, que dirige la síntesis del núcleo de LPS, puede ser intercambiado con un locus ría de otra bacteria, tal como K-12 de E. coli o el microbio APG-N> para derivar una combinación de ría y grupos de genes ríb/ríc de APG-N que dirigirá la síntesis del antígeno O de APG-N en una forma inmunógena. Para asegurar la expresión estable del antígeno heterólogo y eliminar la necesidad de usar antibióticos para mantener un elemento extracromosómico en la cepa de Salmonella, el grupo de genes ríb/ríc de APG-N es integrado en el cromosoma de Salmonella. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquier metodología conocida, de preferencia mediante una mutación por deleción/inserción definida en un gen de virulencia para producir un mutante atenuado como se describe más adelante. En forma alternativa, el grupo de genes ríb/ríc de APG-N puede ser integrado en una forma que no atenúe las cepas recombinantes de Salmonella. La cepa recombinante de Salmonella contiene también una mutación en el gen ríe de Salmonella que inactiva la expresión de la polimerasa del antígeno O de Salmonella. Los mutantes de Salmonella defectuosos en la polimerasa del antígeno O producen moléculas de LPS denominadas semirrugosas (LPS SR), las cuales tienen cuando mucho una unidad de azúcar antigénica O unida a cualquier unidad de núcleo determinada en lugar de las 30 a 40 unidades de azúcar usuales observadas en las cepas Rfc+. Es menos probable que estas moléculas de LPS SR interfieran con la capacidad del antígeno O de LPS de APEC mucho más largo, para estimular una respuesta inmune protectora. Las cepa recombinante de Salmonella se puede preparar a partir de una cepa que contenga ya una mutación de ríe, o la mutación de ríe se puede introducir al mismo tiempo que, o después de, la integración de los grupos de genes ríb/ríc de API?C en el cromosoma de Salmonella. Se pueden crear mutantes de ríe de Salmonella usando técnicas de rutina conocidas en la materia. Por ejemplo, se pueden hacer inserciones de transposones aleatorias en el cromosoma de la cepa deseada de Salmonella (véase, por ejemplo, Curtiss, patente de E.U.A. 5,672,345) y se pueden aislar mutantes que tengan el fenotipo Rfc (es decir, la expresión de LPS SR) (Collins et al., J. Bacteriol.: 173:2521-2529, 1991 ). En forma alternativa, se puede introducir una mutación por deleción en el gen rfc de Salmonella usando técnicas de ADN recombinante tales como las descritas en los ejemplos de la presente. En resumen, el gen ríe de S. tyhimurium ha sido clonado y secuenciado, y se piensa que es conservado entre las cepas de Salmonella de los serogrupos A, B y D1 (Collins et al., citado anteriormente). Con base en esta información, el gen ríe de una cepa de Salmonella que pertenezca a uno de estos serogrupos, puede ser clonado y usado para construir un plásmido suicida que contenga una deleción en el gen ríe clonado. La introducción de este plásmido en una cepa de Salmonella ríc+, conducirá a recombinación homologa entre el gen ríe cromosómico y el plásmido Arfe. Las células transformadas son cultivadas entonces en medios que carezcan de selección para el plásmido, y los aislados seleccionados para el fenotipo Rfc. Los mutantes de Salmonella pueden ser puestos a prueba para un fenotipo Rfc mediante análisis SDS-PAGE de LPS aislado de las bacterias, y detección de una alta proporción de LPS SR con una unidad de azúcar O específica para la cepa de Salmonella. Otro procedimiento que se puede usar para seleccionar mutantes de Salmonella para el fenotipo Rfc, es mediante una prueba de sensibilidad a bacteriófagos, usando un fago específico para LPS tipo s. Por ejemplo, S. íyphimurium y otras cepas del grupo B de Salmonella que tienen un fenotipo Rfc (es decir, que expresan LPS tipo s) son lisados por P22, mientras que los mutantes Rfc de estas cepas son resistentes a la lisis mediada por P22, ya que P22 no reconoce el LPS SR expresado por estas cepas mutantes. Se contempla también que se pueda construir una cepa recombinante de Salmonella que exprese el antígeno O de APG-N de más de un microbio APG-N, usando técnicas similares a las descritas en la presente para preparar cepas que expresan un antígeno O de APG-N individual. Debido a que la vacuna comprende células vivas de la cepa recombinante de Salmonella, es posible que bacterias de Salmonella recombinantes vivas puedan ser transmitidas a humanos consumidores de productos alimenticios de aves de corral, tales como huevos y carne. Además, la especie S. eníerica puede causar enfermedades en aves muy jóvenes. De esta manera, una característica importante de la invención, es que la cepa recombinante de Salmonella sea un mutante atenuado de una cepa virulenta de una especie de S. entérica. Como se usa en la presente, un mutante atenuado significa que la cepa recombinante de Salmonella tiene la capacidad de colonizar y replicarse en una ave vacunada, pero que es sustancialmente incapaz de causar los síntomas de enfermedad asociados con infección de la especie de ave en particular que está siendo tratada, o la infección de humanos por su contraparte virulenta. Por el término "sustancialmente incapaz de causar síntomas de enfermedad", se entiende que el mutante atenuado no produce síntomas de enfermedad, o produce dichos síntomas menos severos y/o en menor número. Sin embargo, una cepa mutante atenuada no es necesariamente incapaz de causar algún efecto sobre la función fisiológica normal en el receptor de la vacuna o un humano, y puede ser un patógeno en especies de aves aparte del receptor deseado de la vacuna, así como también otros hospederos no humanos. La cepa recombinante de Salmonella puede derivar de mutantes avirulentos que ocurren naturalmente, de cepas virulentas de especies de S. entérica, o se puede obtener introduciendo mutaciones atenuantes en cepas virulentas de tipo silvestre usando técnicas bien conocidas. Las mutaciones atenuantes pueden ser en genes biosintéticos, genes reguladores y/o genes que intervienen en la virulencia (véase Doggett y Brown, en Mucosal Vaccines, Kiyono et al., eds., Academic Press, San Diego, 1996, 1996, pp. 105-108). Ejemplos de genes cuya mutación conducirá a atenuación ¡ncluyen, pero no están limitados a, una mutación en un gen pab, un gen pur, un gen aro, un gen asd, un gen dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, hlrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, ríe, poxA, galU, y combinaciones de los mismos. Las mutaciones pueden ser inserciones, deleciones parciales o completas, o similares, en tanto la expresión del gen sea disminuida y la virulencia sea disminuida. El experto en la técnica apreciará fácilmente que cualquier mutación génica adecuada se puede usar en la presente invención, en tanto la mutación de ese gen haga que el microorganismo sea atenuado. De preferencia, los microbios que se usan como portadores en la invención tienen por lo menos dos mutaciones, cada una de las cuales actúa para atenuar al microbio y las cuales, en combinación, aumentan significativamente las probabilidad de que el microbio no revertirá a la virulencia de tipo silvestre.

Se conocen en la técnica métodos que se pueden usar para generar mutaciones para producir la cepa recombinante atenuada de Salmonella de la presente invención. Por ejemplo, el transposón Tn70, se puede usar para producir deleciones cromosómicas en una amplia variedad de bacterias, incluyendo Salmonella (Kleckner et al., J. Mol. Biol. 776:125-159, 1977; EPO, Pub. No. 315,682; patente de E.U.A. No. 5,387,744). Recientemente, se cuenta con nuevos métodos para producir deleciones específicas en genes. Estos métodos implican seleccionar inicialmente un gen en el cual la deleción será generada. En un procedimiento, el gen se puede seleccionar a partir de una genoteca genómica obtenida comercialmente, o construida usando métodos bien conocidos en la materia (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Los clones que contengan el gen son aislados de la genoteca genómica mediante complementación de una cepa que contenga una mutación en el mismo gen. En forma alternativa, cuando la secuencia de ADN del gen es conocida, iniciadores seleccionados para el método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) pueden amplificar el gen, con frecuencia con alguna secuencia de flanqueo, a partir de una muestra de bacterias o a partir de ADN genómiico purificado, y el producto de PCR puede ser insertado en un vector de clonación. Una deleción específica en el gen seleccionado se puede generar mediante cualquiera de dos métodos generales. El primer método genera una mutación en un gen aislado de una población de clones contenidos en una genoteca de ADN genómico usando enzimas de restricción, y el segundo método genera la mutación en un gen de secuencia conocida usando PCR. Mediante el uso del primer método, se identifica la posición del gen en un vector usando marcación de transposones, y se genera un mapa de restricción del ADN recombinante en el vector. La información derivada de la marcación de transposones permite que todo el gen, o una porción del mismo, sea separado del vector usando sitios de enzima de restricción conocidos. El segundo método, el cual se basa en la metodología de PCR, se puede usar cuando se conoce la secuencia de ADN del gen. De conformidad con este método, iniciadores de PCR divergentes amplifican las reacciones hacia el extremo 5' y 3' que flanquean un segmento especificado de ADN que será eliminado del gen, y generan un producto de PCR que consiste del vector de clonación y secuencias de nucleótidos flanqueantes hacia el extremo 5' y 3' (Innes et al. eds., PCR Protocols, 1990, Academic Press, New York). En una variación de este método, se producen productos de PCR que representan porciones del gen o secuencia de flanqueo, las cuales son unidas entonces en un vector de clonación. El ADN que contiene al gen mutante puede ser introducido en la bacteria hospedera mediante transformación usando medios químicos o electroporación, mediante infección por fagos recombinantes, o mediante conjugación. En modalidades preferidas, el gen mutante es introducido en los cromosomas de las bacterias, lo cual se puede lograr usando cualquiera de un número de métodos bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, métodos que usan replicones sensibles a temperatura (Hamilton et al., J. Bactepol. 171 :4617-4622, 1989), transformación lineal de mutantes recBC (Jasin et al., J. Bacteriol. 159:783-786, 1984), o replicones restringidos en hospederos, conocidos como vectores suicidas (Miller et al., J. Bacteriol. 170:2575-2583, 1988). El método particular usado es acoplado con un método de contraselección apropiado tal como, por ejemplo, resistencia a ácido fusárico o resistencia a sacarosa, seguido de selección subsecuente de clones que contengan el alelo mutante con base en características fenotípicas o mediante el uso de PCR, hibridación de ácido nucleico o un método inmunológico. La cepa recombinante de Salmonella usada en la presente invención se puede usar también para suministrar un producto génico deseado al ave vacunada. El término "producto génico", como se usa en la presenre, se refiere a cualquier producto biológico o productos obtenidos como resultado de reacciones bioquímicas que ocurren bajo el control de un gen. El producto génico puede ser, por ejemplo, una molécula de ARN, un péptido, una proteína, o un producto obtenido bajo el control de una enzima u otra molécula que sea el producto inicial del gen, es decir, un producto metabclico. Por ejemplo, un gen puede controlar primero la síntesis de una molécula de ARN la cual es traducida mediante la acción de ribosomas en una enzima que controla la formación de glucanos en el medio ambiente externo a la célula original en la cual el gen se encontraba. La molécula de ARN, la enzima y el glucano, son todos productos génicos como el término se usa en la preeente. Ejemplos de productos génicos deseados incluyen, pero no están limitados a, antígenos, varias proteínas de células hospederas, productos farmacológicamente activos, toxinas y agentes moduladores de la apoptosis. 5 Un antígeno o inmunógeno significa una molécula que contiene uno o más epítopes que pueden estimular el sistema inmune de un hospedero para hacer que una respuesta secretoria, humoral y/o inmune celular sea específica a ese antígeno. Un epítope puede ser un sitio en un antígeno al cual se une un anticuerpo específico a ese sitio. Para antígenos de proteína, 10 un epítope podría comprender tres aminoácidos en una conformación espacial que es única para ese epítope; por lo general, un epítope consistirá de por lo menos 6 aminoácidos consecutivos, o más usualmente, por lo menos 10 a 12 aminoácidos consecutivos del antígeno. Se pretende que el término "epítope" sea intercambiable con el término "determinante antigénico", como se usa en 15 la presente. El término "epítope" tiene también el propósito de incluir epítopes de células T auxiliares en los cuales un determinante antigénico es reconocido por células auxiliares T mediante asociación con moléculas de clase II del complejo de histocompatibilidad principal. Además, el término epítope incluye cualquier antígeno, epítope o determinante antigénico que sea reconocido por 20 células T citotóxicas cuando es presentado por una molécula de MHC clase I sobre la superficie de una célula que presenta antígeno. Un epítope de células T citotóxicas puede comprender una secuencia de aminoácidos entre ucí?Mt e?it il tVaí*..- aproximadamente 6 a aproximadamente 11 aminoácidos consecutivos, y de preferencia comprende una secuencia de 8 o 9 aminoácidos consecutivos. Si el producto génico deseado es un antígeno de un agente de enfermedad bacteriano, micótico, parasitario o viral, la cepa recombinante de Salmonella se puede usar para vacunar a aves contra enfermedades causadas por dichos agentes y, al mismo tiempo, como vacunación contra un microbio APQ-N- Por ejemplo, la cepa recombinante de Salmonella se podría usar para suministrar un antígeno de un microbio patógeno de aves que no exprese el antígeno O, tales como bacterias gram positivas (APG-P). Dichos microbios incluyen, pero no están limitados a, especies de Mycoplasma, Lisferia, Borrelia, Chlamydia, Clostridia, Corynebacterium, Coxiella, Erysipelothrix, Flavobacterium, Staphylococcus y Streptococcus. Ejemplos de hongos y parásitos patógenos de aves que se sabe infectan a aves de corral, son las especies de Amoebotaenia, Aproctella, Ascaridia, Aspergillus, Candida, Capillaria, Cryptosporidium, Cyathosiroma, Dispharynx, Eimeria, Fimbriaria, Gongylonemia, Heferakis, Hisfomonas, Oxyspirura, Plasmodium, Raillietina, Sírongyloides, Subulura, Syngamus, Teframeres y Trichosfrongylus. Los virus que se sabe infectan a aves de corral incluyen adenovirus (por ejemplo, virus de la enteritis hemorrágica), astrovirus, coronavirus (por ejemplo, virus de la bronquitis infecciosa), paramixovirus (por ejemplo, virus de la enfermedad de Newcastle), picornavirus (por ejemplo, virus de la encefalomielitis de aves), oxivirus, retrovirus (por ejemplo, virus de la leucosis/sarcoma de aves), reovirus y rotavirus. Los productos génicos preferidos para su uso como antígenos son polisacáridos y proteínas, incluyendo glucoproteínas y lipoproteínas. Genes que codifican para antígenos de estos organismos procarióticos y eucarióticos pueden ser clonados y expresados en la cepa recombinante de Salmonella usando técnicas estándar. En otras modalidades, el producto génico deseado dirige la expresión de un antígeno específico a gametos el cual es capaz de inducir una respuesta inmune que confiere un efecto de antifertilidad sobre el animal inmunizado (véase patente de E.U.A. 5,656,488). Como se usa en la presente, vacuna significa un agente usado para estimular el sistema inmune de un animal, de modo que se brinde protección contra un antígeno no reconocido como antígeno propio por el sistema inmune. Inmunización se refiere al procedimiento de inducir un alto nivel continuo de anticuerpos y/o respuesta inmune celular en la cual los linfocitos T pueden destruir al patógeno y/o activar a otras células (por ejemplo, fagocitos), para hacerlo así en el animal inmunizado, y la cual es dirigida contra un patógeno o antígeno al cual el animal había sido previamente expuesto. En esta solicitud, la frase "sistema inmune" se refiere a las características anatómicas y mecanismos mediante los cuales una especie de ave produce anticuerpos contra un material antigénico que invade a las células de los vertebrados o el fluido extracelular del individuo, y se usa también para incluir respuestas inmunes celulares.

En el caso de la producción de anticuerpos, el anticuerpo producido de esta manera puede pertenecer a cualquiera de las clases inmunológicas, tales como inmunoglobulinas A, D, E, G o M. De particular interés son las vacunas que estimulan la producción de inmunoglobulina A (IgA), puesto que esta es la principal inmunoglobulina producida por el sistema secretor de las especies de aves, aunque las vacunas de la invención no están limitadas a las que estimulan la producción de IgA. Por ejemplo, es probable que las vacunas de la naturaleza descrita en la presente produzcan una amplia gama de otra respuestas inmunes además de la formación de IgA, por ejemplo, inmunidad celular y humoral. Las respuestas inmunes a antígenos están bien estudiadas, y se han reportado ampliamente. Los microbios avirulentos de esta invención se pueden usar también como vectores para la síntesis de otras proteínas, incluyendo moléculas inmunorreguladoras producidas por especies de aves, y productos farmacológicamente activos que podrían estimular o suprimir varias funciones fisiológicas (es decir, velocidad de crecimiento, contenido de grasa o proteína, etc.). El producto génico deseado es codificado por un polinucleótido recombinante. El término "polinucleótido recombinante" se define la presente para referirse al resultado de manipulaciones de laboratorio que dan como resultado la introducción, en la cepa de Salmonella, de un promotor enlazado operablemente a un gen de varias fuentes endógenas y/o exógenas. El promotor es uno que sea funcional en la cepa de Salmonella para que produzca la expresión del gen. El gen puede ser de origen cromosómico, plasmudico o viral. Un gen, como se usa en la presente, es cualquier unidad de herencia biológica capaz de producir un producto génico deseado. Sin embargo, no es necesario que el gen sea un gen completo como está 5 presente en el organismo progenitor y capaz de producir o regular la producción de una macromolécula tal como, por ejemplo, un polipéptido funcional. El polinucleótido recombinante puede codificar, de esta manera, para un producto antigénico completo, o parte del mismo. Un gen se puede referir también a un polinucleótido que tenga una secuencia mutada de la 10 secuencia que ocurre naturalmente presente en el organismo original. El polinucleótido recombinante se puede referir también a una sección larga de ADN que codifica para varios productos génicos, los cuales pueden ser antigénicos o parte de una vía biosintética que conduzca al producto génico deseado. Por ejemplo, dicha sección larga de ADN podría codificar para 5 a 15 15 proteínas necesarias para la síntesis de antígenos fimbriales (fimbrias), los cuales median la adhesión de patógenos a células hospederas (Báumler et al., citado anteriormente). La inducción de una respuesta inmune contra las fimbrias puede brindar protección contra el patógeno. Debe entenderse que el término gen, como se usa en la presente, incluye además moléculas de ADN 20 que carecen de intrones tal como, por ejemplo, es el caso para moléculas de ADNc, en tanto la secuencia de ADN codifique para el producto génico deseado. El polinucleótido recombinante que codifica para el producto génico deseado puede incluir secuencias de ADN aparte del promotor, tales como ^ ^gj^j secuencias de terminación, y otros reguladores de la expresión de genes procap'óticos. El polinucleótido recombinante que codifica para un producto génico deseado puede ser transferido en una cepa de Salmonella en forma de un plásmido, fago o cósmido vector mediante varios medios tales como conjugación, electroporación o transformación (captación de ADN desnudo del medio ambiente externo, el cual puede ser inducido artificialmente por la presencia de varios agentes químicos, tales como iones calcio). Otros métodos tales como transducción son también adecuados, en donde el ADN recombinante en forma de un fago o cósmido vector de transducción es empacado dentro de un fago. Una vez que el polinucleótido recombinante está en el portador Salmonella, puede continuar existiendo como un replicón autónomo separado, o puede ser insertado en el cromosoma de Salmonella, y ser reproducido junto con el cromosoma durante la división celular. De preferencia, el polinucleótido recombinante es incorporado en un sistema "letal equilibrado", el cual selecciona para microorganismos que contienen y son capaces de expresar el producto génico deseado, vinculando la supervivencia del microorganismo a la presencia continua del polinucleótido recombinante. Los mutantes "letales equilibrados" de este tipo se caracterizan por la falta de un gen cromosómico nativo funcional que codifique para una enzima que sea esencial para la supervivencia celular, de preferencia una enzima que catalice un paso en la biosíntesis de ácido díaminopimélico (DAP), e incluso más preferiblemente un gen que codifique para beta aspartato semialdehído deshidrogenasa (Asd). Las enzimas de la vía de DAP y la Asd se requieren para la síntesis de la pared celular. Los mutantes "letales equilibrados" contienen también un gen recombinante el cual puede servir para complementar el gen cromosómico no funcional, y este gen recombinante de complementación es enlazado estructuralmente al polinucleótido recombinante que codifica para el producto génico. La pérdida del gen recombinante de complementación hace que las células mueran por lisis cuando las células están en un ambiente en donde el DAP falta. Esta estrategia es especialmente útil, puesto que el DAP no es sintetizado por eucariontes y, por lo tanto, no estaá presente en tejidos de aves infectadas. Métodos para preparar estos tipos de microbios "letales equilibrados", se describen en la patente de E.U.A. No. 5,672,345. La administración de la vacuna a un ave puede ser mediante cualquier técnica conocida o estándar, incluyendo inyección intramuscular o en mucosas. Los métodos de administración preferidos incluyen ingestión oral o aspersión bronco-nasal-ocular. Estos métodos permiten que la Salmonella recombinante llegue fácilmente al tejido linfoide asociado a intestino (GALT) o al tejido linfoide asociado a bronquios (BALT), e induzca la formación de anticuerpos e inmunidad mediada por células. Un método de administración particularmente preferido es vacunar a las aves recién nacidas, por ejemplo, en el día de la eclosión, mediante aspersión generalizada. Después del crecimiento y la cosecha de la cepa recombinante de Salmonella, las células bacterianas pueden ser liofilizadas, particularmente si van a ser mezcladas en productos alimenticios. La vacuna formada de la Salmonella recombinante se puede preparar usando cualquier excipiente que sea farmacéuticamente aceptable para el tipo de ave que está siendo inmunizado. Por ejemplo, si la vacuna será administrada en forma sólida, las células pueden ser revestidas con y/o encapsuladas en un material que no sea tóxico para el ave inoculada, y compatible con las bacterias. También se pueden usar vehículos sólidos tales como talco o sacarosa. Si la administración va a ser en forma líquida, las células pueden ser suspendidas en un vehículo liquido adecuado, incluyendo, por ejemplo, leche descremada, solución salina normal y/u otras sales no tóxicas a las concentraciones fisiológicas o próximas a las mismas, y otros vehículos líquidos adecuados conocidos por los expertos en ¡a técnica. Cuando sea conveniente, se pueden añadir también adyuvantes para incrementar la antigenicidad. Cuando la vacuna es destinada para administración como una aspersión, las células recombinantes de Salmonella se pueden suspender en un regulador de pH adecuado tal como BSG (solución salina regulada en su pH con gelatina, Curtiss lll, R., J. Bacíeriol. 89:28-40, 1965). La dosificación requerida variará, dependiendo de la cantidad y antigenicidad del antígeno O del LPS de APEC expresado por la cepa recombinante de Salmonella, así como también como el tipo, tamaño y edad del ave que será vacunada. Por ejemplo, se puede requerir una dosificación menor para vacunar a aves recién nacidas, que la dosificación adecuada para vacunar a aves adultas. La experimentación de rutina permitirá establecer fácilmente la cantidad requerida. Por lo general, la dosificación estará en concentraciones que varían de 105 a 109 células vivas por ave. Una dosificación preferida para vacunación por atomización (aspersión) de pollos recién nacidos con vacunas que comprendan células de S. íyphimurium recombinantes vivas, es de aproximadamente 106 a 108 células vivas/ave, y una dosificación particularmente preferida es de aproximadamente 5 X 107 células vivas/ave. Se describen modalidades preferidas de la invención en los siguientes ejemplos. Otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones de la presente serán evidentes para los expertos en la técnica después de considerar la especificación o la práctica de la invención como se describe en la presente. Se pretende que la especificación, junto con los ejemplos, sean considerados únicamente como ejemplo, con el alcance y el espíritu de la invención siendo indicados por las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.

EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra la construcción de una cepa recombinante atenuada de S. íyphimurium que coexpresa LPS del grupo B de S. íyphimurium y LPS 078 de E. coli.

Estrategia de atenuación Se ha mostrado que las cepas de S. íyphimurium que poseen deleciones en los genes cya y crp son atenuadas e inmunógenas en pollos (Hassan et al., Res. Microbiol. 141 :839-850, 1990; Porter et al., Avian Dis. 37:265-273, 1993) y, además, inducen una respuesta inmune protectora contra el desafío de S. íyphimurium de tipo silvestre en esta especie (Hassan et al., citado anteriormente, Hassan et al., Infecí. Immun. 62:5519-5527, 1994). Bioquímicamente, deleciones en cya o crp dan como resultado incapacidad para fermentar varios azúcares, incluyendo maltosa (Botsford et al., Microbiol. Rev. 1992). Por lo tanto, las cepas de la vacuna Acya Acrp de S. íyphimurium forman colonias blancas en medios de maltosa MacConkey, mientras que las cepas de S. fyphimurium de tipo silvestre forman colonias rojas, permitiendo de esta manera un método simple para discriminar entre la cepa usada como vacuna y S. fyphimurium de tipo silvestre. Con base en estos primeros hallazgos, se seleccionó a zlcya ?crp de S. typhimurium como cepa portadora.

Inserción del grupo de genes ríb/ríc 078 en el cromosoma de Salmonella Para facilitar la inserción de ríb 078 en el cromosoma de S. typhimurium y producir una mutación por deleción atenuante en el gen cya de Salmonella en un sólo paso, se construyó un vector de cósmido dependiente de pir, pMEG219. Como se ilustra en la figura 1 y en el cuadro 1 siguiente, pMEG219 tiene las características siguientes: un origen de replicación dependiente de pir, los genes de resistencia a tetracicliina de Tn 0, un fragmento de movilización del plásmido RK2, el gen de resistencia a kanamicina, sitios dobles cos de pCOS2EMBL, y el alelo clonado ?cya-27 de S. íyphimurium. Puesto que el origen es dependiente de pir, este cósmido se puede replicar únicamente en cepas especiales de E. coli que han sido diseñadas para suministrar la proteína Pir (Kolter et al., Cell 15:1199-1208, 1978), pero no en cepas de S. typhimurium de tipo silvestre. El alelo cya-27 contiene una deleción definida de cya que consiste de una deleción de 327 pb de la región de cya hacia el extremo 5' que incluye los primeros 13 codones, así corno también una secuencia de flanqueo de 476 pb hacia el extremo 5' y de 1 ,826 pb de la secuencia de flanqueo hacia el extremo 3' de la deleción. Además, se diseñó un sitio Notl en el punto de la deleción para facilitar la inserción de ADN en el gen cya (P. Sundarum, comunicación personal).

CUADRO 1 Cepas y plásmidos bacterianos Ceps Genotipo relevante Fuente o referencia E. coli ?7122 Cepa 070:K80:H9, naf patógena de Provence et al., Infecí. Immun. aves 60:4460-4467, 1992 GN026 End A l hsdRU supE44 thi-1 recA1 gyrA S. Tinge relA 1 ?(lacZYA-argF)U169 ?pir deoR ( 80?lacZM15) MGNS17 Sm??pir[thi-1 thr-1 leuB6 supE44 Este estudio tonA21 lacY1 recA RP4-2-Tc::Mu ?pir] ?asdA4 ?zhf-2::Tn10 MGN 303 MGN617(pMEG226) Este estudio MGN 1142 MGN617(pMEG315) Este estudio S. typhimurium ?3761 UK-1 , tipo silvestre R. Curtiss lll MGN394 ?cya-27 ?crp-28 P. Sundaram MGN431 ?cya-27 ?crp-28, Mot* P. Sundaram MGNI510 ?phoP22 pMEG113 integrante P. Sundaram MGNI306 ?3761 pMEG226 integrante Este estudio 10 MGN307 zJcya-28.:rfb078 Este estudio MGN868 ?cya-28::rfb078 ?crp-28 Este estudio MGN996 ?cya-28::rfb078 ?crp-28, Mot+ Este estudio MGN 1175 MGN431 ?asd::xylE729 (pYA292) Este estudio MGN1180 ?cya-28::rfb078 ?crp-28, ?rfc, Mot+ Este estudio MGN1181 ?cya-28 :rfb078 ?crp-28, ?rfc, Mot+ Este estudio MGN1182 lcya-2ß;.rft)078 ?crp-28, ?rfc, Mot+ Este estudio MGN 183 ?cya-28::rfb078 ?crp-28, ?rfc, Mot+ Este estudio MGN 'i 184 ?cya-27 ?crp-28 ?rfc, Mot+ Este estudio MGN1 185 ?cya-27 ?crp-28 ?rfc, Mot* Este estudio MGN1717 MGN 1180 Aasd::xylE729 Este estudio MGN1718 MGN171 (pYA292) Este estudio 15 MGN 1720 MGN1717 (pMEG287) Este estudio Plásmidos pYA292 Vector de expresión con or¡ p15a, R. Curtiss promotor Ptrc, Asd+ pYA3 55 PYA3174 (vector de clonación de Brown et al., Proc. Nat. Acad. cósmidos con pSC101 ori ap1) que Sci, USA Ve I. 93 pp. 11149- posee rfft de ?7122 11154, 1996 PMEG055 PYA292 que posee iutA derivado de E. Este estudio coli PMEG113 Vector suicida dependiente de pir que P. Sundaram posee ?crp-28, Tetr pMEG219 Vector de cósmido "suicida" dependiente Este estudio de pirque posee ?cya-27, Tetr, Kanr 20 pMEG226 PMEG219 que posee rfb de ?7122 Este estudio {?cya-28::rfb078) pMEG387 pYÁ292 que posee fimbrias de tipo I Este estudio derivadas de E. coli pMEG315 PMEG149 (vector suicida dependiente Este estudio de pir, sacBR, Apr, provisto por S. Tinge) que posee Arfe , j». .r«ate*Mütj j El grupo de genes rfb/ríc 078 se obtuvo del clon de cósmido pYA3255, el cual contiene la región ' ríb de la cepa ?7122 de APEC (Brown et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:11149-11154, 1996) insertada en el sitio de clonación BamHl del vector de cósmido pYA3174. El análisis de restricción de 5 pYA3255 reveló la presencia de un sitio Nofl dentro del AD? clonado de ?7122 además de dos sitios Nofl que flanquean el sitio de clonación BamHl (Brown et al., citado anteriormente). Por lo tanto, el cósmido pYA3255 fue digerido parcialmente con Norl y ligado a Nofl/Pvull digerido con pMEG219 para producir el cósmido pMEG226, el cual tiene la región ríb de la cepa ?7122 de 10 APEC insertada en el alelo Acya-27 del cósmido pMEG219. El cósmido pMEG226 fue introducido entonces en la cepa MG?617 de E. coli mediante electroporación para producir MG?803 (Cuadro 1 ). La cepa MG?617 tiene una deleción en el gen asd, que da como resultado demanda de ácido diaminopimélico (DAP) (Schleifer et al., Bacteriol Rev. 36:407-477, 1972) y 15 puede sustentar la replicación de pMEG226 puesto que posee también una copia del gen pir (Cuadro 1 ). Para introducir el cósmido pMEG226 en S. typhimurium, la cepa donadora MG?803 de E. coli fue apareada con la cepa ?3761 de S. typhimurium UK-1 de tipo silvestre, aplicando por punto 50 µl de un cultivo 20 nocturno aireado de cada cepa sobre una placa de agar de LB (Miller, H. en Methods in Enzymology, Vol. 152, p. 147, Berger, S. L. y Kimmel, A. R., eds., Academic Press, Inc. 1987) que contenía 200 µg/ml de DAP e incubando durante la noche a 37°C. La mezcla de apareamiento fue raspada de la placa ¡|¡íj ^^¡ con un asa de alambre estéril, y suspendida en 1 ml de BSG. Las células fueron extendidas sobre placas de LB conteniendo 10 µg/ml de tetraciclina, e incubadas durante la noche a 37°C. La contraselección contra la cepa donadora, MGN803, se logró mediante siembra en medios selectivos que no contenían DAP. Puesto que el cósmido pMEG226 no se puede replicar en S. fyphimurium, la única forma en que las células recombinantes pueden adquirir resistencia a la tetraciclina, es si el plásmido se integra en el cromosoma mediante recombinación homologa. Se seleccionaron transconjugantes resistentes a tetraciclina para la producción de LPS 078 mediante aglutinación en portaobjetos usando antisueros anti-O78 específicos, los cuales se obtuvieron de E. coli Reference Center en la Universidad Estatal de Pennsylvania. Un aislado resistente a tetraciclina, O78+, designado como MGN806 (Cuadro 1 ), fue desarrollado estáticamente durante la noche a 37°C en caldo de LB, y sembrado en medios con ácido fusárico (Bochner et al., J. Bacteriol. 243:926-933, 1980) para contraseleccionar contra el plásmido integrado. Las colonias resistentes a ácido fusárico fueron seleccionadas para pérdida de resistencia a tetraciclina y color blanco en medios de maltosa MacConkey. Los mutantes Cya son blancos sobre estos medios, puesto que son incapaces de fermentar la maltosa (Botsford et al., citado anteriormente), mientras que S. tyhimurium de tipo silvestre, el cual puede fermentar la maltosa, produce colonias de color rojo. Un asilado sensible a tetraciclina, Cya", O78+, fue seleccionado y designado como MGN807 (Cuadro 1 ).

Para añadir una deleción en el gen crp de Salmonella, la cepa MGN807 fue transducida con el fago P22 desarrollado sobre la cepa MGN510 (Cuadro 1), como se describió anteriormente (Maloy, S. R., Experimental techniques in bacterial genetics, Jones y Bartlett, Boston, 1990). MGN510 tiene 5 integrado en su cromosoma el plásmido pMEG113 (Cuadro 1 ), el cual es un vector suicida resistente a tetraciclina y dependiente de pir que contiene el gen crp de S. typhiurium con una mutación por deleción definida. Se seleccionaron transductantes sobre placas de LB que contenían 10 µg/ml de tetraciclina. Un transductante fue seleccionado y sembrado en medio con 10 ácido fusárico. Los aislados resistentes a ácido fusárico fueron seleccionados para el fenotipo Crp" mediante siembra por estría sobre placas de maltosa MacConkey que contenían AMPc a 2 mM. En estos medios, las cepas Cya", Crp+ son rojas, mientras que las cepas Cya", Crp+ son blancas. Un aislado Acya::ríb078 ?crp fue designado como MGN868. 15 Puesto que las cepas ?cya?crp no son móviles (Yokota et al., J. Bacteriol. 103:513-516, 1970), y puesto que se sabe que los anticuerpos antiflagelos protegen contra S. typhimurium (Yokoyama et al., Vaccine 16:388- 393, 1998), MGN868 se hizo pasar a través de un tubo de movilidad (Holt et al., Enrichment and Isolation, en Methods for General and Molecular 20 Bacteriology, Gerhardt et al., ed., p. 22, Am. Soc. for Microbiol., Washington, D. C.) lleno de agar para movilidad (Difco), para producir una variante móvil de MGN868, la cual fue designada como MGN996 (Cuadral ).

El LPS expresado por MGN807, MGN868 y MGN996 fue examinado mediante SDS-PAGE y Western blot de la manera siguiente. Células de cada una de estas cepas, así como también ?7122 y MGN431 (Cuadro 1 ) como controles para LPS 078 y LPS de grupo B de S. typhimurium, respectivamente, fueron desarrolladas durante la noche en caldo de LB. Las células fueron ajustadas hasta una OD6oo equivalente, y 1 ml de cada cultivo fue transformado a pellas mediante centrifugación. Se preparó LPS a partir de las células transformadas a pellas mediante el método de Hitchcock y Brown (J. Bacteriol. 154:269-277, 1983). Las muestras se hicieron correr sobre geles de poliacrilamida-SDS a 12.5% por duplicado, fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa, y sondeadas con antisueros específicos de anti-grupo B (Difco) o antisueros anti-O78 específicos, según se describe (ECL Western Blotfing Profocols, p. 16-17, Amersham Life Science, 1997). Los resultados se muestran en la figura 2. Como era de esperarse, el LPS aislado de la cepa ?7122 de E. coli no reaccionó con el anticuerpo anti-grupo B (fig. 2A), pero reaccionó con el anticuerpo anti-O78 (fig. 2B). En forma similar, la cepa control MGN431 de S. fyphimurium (cya-27 crp-28, Mot+), hizo que el LPS reaccionara con el anticuerpo anti-grupo B (fig. 2A), pero no reaccionó con el anticuerpo anti-078 (fig. 2B). Sin embargo, el LPS aislado de las cepas recombinantes MGN807, MGN868 y MGN996 de S. typhimurium, reaccionó con ambos anticuerpos (figs. 2A, 2B) para producir patrones en escalera distintivos de bandas de alto peso molecular, indicando que estas cepas expresan el antígeno O 078 de E. coli y del grupo B de S. typhimurium unido al "núcleo" de Salmonella. La expresión del LPS 078 de alto peso molecular por las cepas recombinantes de Salmonella, indica también que la región ríb clonada de ?7122 en el plásmido pYA3255 contiene también el gen ríe de ?7122. La longitud de cadena promedio para el LPS 078 expresado en las cepas recombinantes de S. typhimurium fue de aproximadamente el mismo tamaño que la longitud de cadena promedio del LPS del grupo B expresado en la misma cepa (compárense los campos MGN807, MGN868 y MGN996 en las figuras 3A y 3B), mientras que la expresión de 078 en ?7122 dio como resultado una longitud de cadena más corta (fig. 3B). Existe un gen cuyo producto se sabe regula la longitud de la cadena de LPS, al cual se le han asignado varios nombres diferentes por diferentes grupos, cid (Bastin et al., Mol. Microbiol. 7:724-734, 1993; Bastin et al., Mol. Microbiol, 5:2223-2231 , 1991), rol (Batchelor et al., J. Bacteriol. 174:5528-5236, 1992; Batchelor et al., J. Bacteriol. 173:5699-5704, 1991 ) y, más recientemente, wzz (Reeves et al., Trends Microbiol. 4:495-503, 1996). Es probable que en las cepas recombinantes MGN807, MGN868 y MGN996 de S. typhimurium, la longitud de la cadena de LPS 078 sea determinada por el gen wzz de S. typhimurium.

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la capacidad de la cepa recombinante MGN996 de S. typhimurium (?cya-28::ríb078, ?crp-28, Mot+) para colonizar pollos y protegerlos del desafío con la cepa ?7122 de APEC de tipo silvestre. Todos los pollos usados en los experimentos descritos en los ejemplos 2 a 4, fueron White Leghorns incubados de huevos fértiles de pollos libres de patógenos específicos (SPF) obtenidos de Specific Pathogen Free Avian Services (SPAFAS, Roanoke, IL). Los huevos fueron incubados y eclosionados en una incubadora/eclosionador Humidaire localizado en el Deparlamento de Biología de la Universidad de Washington, en St. Louis, MO. En este experimento, las aves fueron vacunadas dos veces: una vez en el día de eclosión y de nuevo a los 14 días de edad. Los pollos fueron inoculados en el día de eclosión con 4.6 x 106 CFU de MGN996 por pollo mediante aspersión generalizada. La vacunación por aspersión generalizada se llevó a cabo colocando de 10 a 15 pollos en una caja de aspersión Plexiglás, y suministrando el inoculo usando un aspersor Sure Shot modelo A de acero inoxidable (Milwaukee Sprayer Manufacturing Co., Inc., Milwaukee, Wl) presurizado hasta 7.03 kg/cm2. Se llevaron a cabo pruebas de práctica por anticipado para determinar las condiciones apropiadas para suministrar 0.3 ml/pollo. 26 pollos fueron vacunados con MGN966, y doce pollos fueron vacunados en forma simulada con BSG. Después de la inoculación, los pollos fueron transferidos a aisladores de Horsfall, y se les proveyó alimento y agua a voluntad después del día de las vacunaciones-eclosión. En el día 10, tres pollos, elegidos al azar del grupo vacunado, fueron sometidos a eutanasia mediante inhalación de CO2, y entonces 5 sometidos de inmediato a necropsia para evaluar la colonización. Se tomaron muestras de pulmón, hígado, bazo, bolsa de Fabricio y contenidos cecales de cada ave, se colocaron en bolsas de peto individuales, y se añadieron 5 ml de BSG a cada muestra. Los tejidos fueron homogeneizados en una mezcladora de laboratorio Seward Stomacher 80. Entonces, se depositaron en placas 0.1 10 ml de muestra homogeneizada sobre base de agar MacConkey (Difco) complementada con maltosa a 1%, para bazo, hígado y pulmón, o agar verde brillante (Difco) que contenía 35 µg/ml de novobiocína para muestras de bolsa de Fabricio y contenidos cecales. Las placas fueron incubadas durante la noche a 37°C. Por lo menos una colonia típica de cada placa fue analizada 15 además para confirmar la expresión del tipo de LPS apropiado mediante aglutinación en portaobjetos. Para casos en los cuales no se obtuvieron colonias de la siembra directa, se añadieron 0.5 ml de muestra de tejido homogeneizado a 4.5 ml de caldo de Hajna, y se incubaron durante la noche a 42°C como un enriquecimiento secundario. Un asa del cultivo enriquecido con 20 caldo de Hajna, se hizo correr en estrías sobre agar verde brillante, y se incubó durante la noche a 37°C. Se encontró la cepa MGN996 en las muestras de todos los tejidos examinados. ^^^ji^^jt^^^íí? g^^^^jjrfj^ En el día 14, las aves vacunadas fueron reforzadas con 3.8 x 107 CFU de MGN996 en un volumen de 0.2 ml mediante cebadura oral, usando una c nula de alimentación unida a una jeringa de 1 cm3. En el día 28, todas las aves fueron desafiadas con 7.5 x 107 CFU de la cepa ?7122 de E. coli en un volumen de 0.5 ml mediante la vía intratraqueal, y cuatro días después fueron sometidas a eutanasia mediante inhalación de CO2, y sometidas entonces a necropsia. Las aves sometidas a necropsia fueron evaluadas para lesiones asociadas con la infección por APEC. En este experimento y en los descritos en los ejemplos 3 a 4, el análisis de la puntuación de lesiones se hizo usando la prueba U de Wilcoxon-Mann-Whitney (Zar, J. H., Biosíaiisfical Analysis, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs). En este experimento, se usó un análisis de ?2 para determinar las diferencias entre los grupos con base en el número de aves que no mostraron lesiones (puntuación de lesiones de 1 ), y los resultados se muestran a continuación en el cuadro 2.

CUADRO 2 Puntuación de lesiones promedio de pollos vacunados con MGN996 contra pollos no vacunados después de desafío con la cepa v7122 de APEC1 Grupo # de aves con cada puntuación de Puntuación promedio2 lesiones 1 2 3 4 5 BSG 1 0 1 8 2 3.8° MGN996 10 2 1 7 1 2.4b 1Las aves fueron evaluadas de la manera siguiente: 1 , aves vivas, sin lesiones; 2, aves vivas con sacos aéreos turbios; 3, aves vivas con únicamente un tipo de lesión (por ejemplo, únicamente perihepatitis); 4, aves vivas con lesiones múltiples; 5, aves muertas o moribundas con lesiones típicas de colibacilosis (perihepatitis, pericarditis, seculitis aérea, deshidratación severa). 2 a diferente de b (p=0.0157).

La puntuación de lesiones promedio indica que las aves vacunadas con MGN996 fueron significativamente protegidas del desafío, comparativamente con aves control no vacunadas (?2=5.3, p=0.02). Además, el grupo vacunado mostró una reducción significativa en la puntuación de lesiones promedio general (p=0.157). Estos resultados muestran que el suministro de LPS de E. coli mediante S. íyphimurium atenuado que expresa también el antígeno O del grupo B, brinda a los pollos protección significativa del desafío con E. coli de tipo silvestre. ^sj ^ EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra el efecto de remover la expresión del antígeno O de Salmonella sobre la capacidad para colonizar varios tejidos de pollos. Para eliminar la expresión del antígeno O del grupo B mediante la cepa recombinante de S. íyphimurium, se hizo una deleción definida en el gen rí de Salmonella de MGN996 (Acya::078 Acrp; Cuadro 1 ) y MGN431 (una cepa control con deleción Acya Acrp definida, Cuadro 1 ). La cepa MGN996 o MGN431 fue cruzada con la cepa MGN1142 (Cuadro 1) esencialmente como se describe en el ejemplo 1 , con selección para resistencia a ampicilina. La cepa MGN1142 contiene un vector suicida dependiente de pir que posee un gen ríe mutante de S. fyphimurium. Un transconjugante de cada cruza fue desarrollado durante la noche en caldo de LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y sembrado en placas de agar de LB menos NaCI complementado con sacarosa a 5%, e incubado durante 48 horas a temperatura ambiente. Los aislados fueron seleccionados para el fenotipo Rfc mediante estría cruzada contra el fago P22. Como se describió anteriormente, en esta prueba los mutantes deficientes en la polimerasa del antígeno O de S. fyphimurium son resistentes a P22, mientras que los aislados que expresan la polimerasa del antígeno O de S. typhimurium funcional son sensibles.

Se obtuvieron varios aislados independientes (?/ cst denota el gen ríe de S. typhimurium) designados como MGN1180, MGN1181 , MGN1182 y MGN1183, y los cuales se derivan de MGN996; y las cepas MGN1 184 y MGN1185, las cuales se derivan de la cepa MGN431 de S. fyphimurium. Véase el Cuadro 1. El LPS producido por estas cepas fue aislado y analizado para el antígeno O 078 y grupo B mediante Western blot como se describió anteriormente en el ejemplo 1 , y los resultados se muestran en la figura 3. Como era de esperarse, el LPS producido por la cepa control MGN431 ?cya?crp y sus derivados MGN 1184 y MGN1185 ?rfcst, reaccionó con el anticuerpo de LPS anti-grupo B (fig. 4A), pero no reaccionó con el anticuerpo de LPS anti-O78 (fig. 4B). Sin embargo, el LPS aislado de las cepas ?rícst produjo únicamente especies de bajo peso molecular cuando se sondeó con anticuerpo de LPS anti-grupo B (fig. 4 A), indicando que no expresó el LPS de grupo B de longitud total. Cuando se sondeó con anticuerpo de LPS anti-O78, el LPS producido por MGN996 y sus cepas derivadas de ?rícst (MGN 1180, MGN1181 , MGN1182 y MGN1183) produjo un patrón indicativo de antígeno O de E. coli 078 completo (fig. 4B). El patrón de LPS específico de 078 en la cepa MGN1180 (fig. 4B) fue similar a la longitud de cadena de LPS de grupo B en MGN996 (fig. 4 A), mientras que el patrón de LPS específico de 078 en MGN 1181 (fig. 4B), fue más similar al patrón de LPS 078 observado en la cepa de E. coli 078 de tipo silvestre, ?7122 (fig. 4B). La diferencia en los patrones de LPS fue inesperada, puesto que las dos cepas tienen genotipos aparentemente idénticos (Cuadro 1). Las cepas MGN1180, MGN 1181 y MGN 1184 se eligieron para otros estudios como vacunas posibles contra ?7122 de E. coli.

Diez pollos por cepa fueron inoculados en el día de eclosión mediante cebadura oral con MGN996 (6.9 x 107 CFU/pollo), MGN1180 (4.0 x 5 107 CFU/pollo), MGN1181 (2.4 x 107 CFU/pollo), MGN1184 (1.3 x 107 CFU/pollo) o MGN431 (7.8 x 107 CFU/pollo). Las aves vacunadas fueron colocadas en aisladores, y sometidas a necropsia en el día 10 como se describió anteriormente. Muestras de pulmón, hígado, bazo, bolsa de Fabricio y contenidos cecales, fueron recogidos, procesados y evaluados para 10 colonización como se describe en el ejemplo 2, y los resultados se muestran en el cuadro 3 siguiente.

CUADRO 3 Colonización de pollos por candidatos de vacuna de S. typhimurium 15 Acya ?crp ?rfc recombinante y cepas control (% de aves positivas) Cepei Genotipo Pulmón Bazo Hígado Bolsa de ConteniFabricio dos cecales MGN996 Cyar.rfb 078 Acrp 100% 100% 100% 100% 100% MGN1 180 Cya:: rfb 078 Acrp ?rfc 80% 100% 100% 100% • 100% MGN1181 Cya:: rfb 078 Acrp ?rfc 70% 100% 100% 100% 100% MGN 1184 ?cya ?crp ?rfc 20% 50% 70% 100% 100% MGN431 ?cya ?crp 77% 100% 66% 100% 100% 20 Los resultados indican que todas las cepas ?rícSt puestas a prueba, excepto MGN1184, son capaces de colonizar un gran porcentaje del pulmón, bazo, hígado, bolsa de Fabricio y contenidos cecales de aves. Al -¡^•¡¿-i - igual que las cepas control MGN431 y MGN996, se encontró que las cepas MGN1180 y MGN1181 colonizan el 100% de los bazos de las aves vacunadas. La cepa MGN1184 tiene un fenotipo semirrugoso debido a la mutación Arfe. Se ha reportado que las cepas de S. typhimurium deficientes 5 en LPS exhiben colonización reducida de los pollos (Craven et al., Avian Dis. 38:401-408, 1994). Sin importar la variación de un ave a otra, los resultados obtenidos en este experimento fueron consistente con el hecho de que la colonización por MGN1184 fue severamente deteriorada, confirmando una función del antígeno O de LPS completo en la colonización. Sin embargo, la 10 expresión del antígeno O de E. coli 078 en un fondo de Rfc (MGN1180 y MGN1181 ), dio como resultado un incremento significativo en el porcentaje de aves colonizadas comparativamente con MGN1184, sugiriendo que sería útil evaluar estas cepas para su capacidad para proteger contra el desafío por E. coli. 15 EJEMPLO 4 Este ejemplo ¡lustra la eficacia de una cepa recombinante de S. typhimurium que expresa el antígeno O de E. coli 078, pero que no expresa el 20 antígeno O del grupo B, para proteger a aves contra la enfermedad causada por la infección con la cepa de APEC 078, ?7122. Treinta y cinco pollos por cepa fueron inoculados en el día de la eclosión mediante cebadura oral con 6.5 x 107 CFU de MGN996 (?cya-28::ríb ^^¡^¡¿¡¿¡^^¡¡¡¡¡¡^¡¡^¿¡0^ 078 Acrp-28, Mot+) ó 7.7 x 107 CFU de MGN1180 (?cya-28::ríb 078 ?crp-28 ?ríc, Mot+). Veinte pollos fueron vacunados en forma simulada con BSG. En el día 10, cinco pollos de cada grupo inoculado fueron sometidos a necropsia para evaluar la colonización como se describe en el ejemplo 2. Los resultados de la colonización fueron similares a los observados en el experimento 2 (datos no mostrados). En el día 14, las aves inoculadas previamente con MGN996 fueron reforzadas con 7.4 x 107 CFU de MGN996, y las aves vacunadas previamente con MGN1180 fueron reforzadas con 6.4 x 107 CFU de MGN1180. A todas las aves se le colocó una banda en la pierna en el día 24. Para evaluar las respuestas de anticuerpo en suero post-vacunación, se recogió suero mediante punción de la vena del ala de la mitad de las aves en el día 27, y la otra mitad en el día 28. La mitad de las aves de cada grupo fueron desafiadas en el día 30, y las aves restantes fueron desafiadas en el día 31. La dosis de desafío fue de 9.6 x 107 CFU de la cepa ?7122 de E. coli. Dos aves control murieron antes de la sangría, de modo que únicamente 18 aves control fueron sangradas y desafiadas. Se realizaron necropsias en todas las aves cuatro días después del desafío para evaluar la colonización por ?7122 como se describe en el ejemplo 2, excepto que se recogió también sangre del corazón. La cepa de desafío fue aislada de todas las aves, pero fue encontrada principalmente únicamente en el intestino ciego de aves vacunadas con MGN996 o MGN1180. Los datos de la puntuación de lesiones de los dos días de necropsia fueron agrupados para análisis, y los resultados se muestran el cuadro 4 siguiente.

CUADRO 4 Puntuación de lesiones promedio de pollos vacunados con las cepas MGN996 y MGN1180 de S. typhimuríum, o no vacunados después de desafío con la cepa ?7122 de APEC1 Tralamiento # de aves con cada puntuación Puntuación de lesiones de lesiones promedio 1 2 3 4 5 Ninguno 0 4 6 8 0 3.2a MGN996 9 8 8 5 0 2.3 MGN1180 14 10 4 2 0 1^ La puntuación de lesiones se determinó como se describe en el cuadro 2. 1 a diferente de b, p = 0.0064 a diferente de c, p < 0.0001.

Los resultados confirman la eficacia de la cepa MGN996, e indican que MGN1180 puede ser una vacuna superior de E. coli , puesto que la puntuación de lesiones promedio para las aves vacunadas con MGN1180 es menor que la puntuación de lesiones promedio para MGN996, aunque la diferencia no fue significativa (p=0.08). El suero de cada ave fue evaluado para respuestas de anticuerpo dirigidas contra LPS 078 de E. coli y LPS de S. typhimurium mediante prueba de ¡nmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Las cavidades de una placa de fondo plano lmmulon-l fueron revestidas con 100 µl de LPS de E. coli (Sigma) o LPS de S. typhimurium (Sigma), preparadas a 2.5 µg/ml en TCA (ácido tricloroacético; Sigma) a 0.2% durante 2 horas a 37°C (Hardy, 1994). Después del revestimiento, la placa fue lavada tres veces con una solución de TBS (solución salina regulada en su pH con Tris)/Tween 20 a 0.1 %. Se añadieron sueros diluidos (1 :100) para duplicar las cavidades, y la placa se incubó a 37°C durante 1 hora. Este paso fue seguido de tres lavados con solución de TBS/Tween 20 a 0.1%. La IgG unida fue detectada mediante la adición de un anticuerpo conjugado de HRP de IgG anti-pollo de cabra diluido a 1 :30,000 (KPL). Las placas fueron lavadas de nuevo con TBS/Tween 20 a 0.1 % para remover el anticuerpo de detección no unido. El lavado fue seguido de desarrollo con tabletas de OPD (diclorhidrato de o-fenilendiamina) (Sigma) en regulador de pH de fosfato-citrato con perborato de sodio. Después de 15 minutos a 37°C, la reacción se detuvo mediante la adición de HCl a 3N a cada cavidad. Las placas fueron leídas a 490 nm usando un lector BT2000 Microkinetics (FisherBiotech). Para detectar las IgM e IgA unidas, la placa fue bloqueada primero usando sueros normales de conejo diluidos a 1 :5 durante 45 minutos a 37°C, seguido de tres lavados de TBS/Tween 20 a 0.1 %. Después del bloqueo, se añadió a cada cavidad IgM o IgA anti-pollo de cabra diluido a 1 :5000 (Immunovision), y la placa se incubó a 37°C durante otros 45 minutos. Después de tres lavados en TBS/Tween 20 a 0.1% para remover el anticuerpo no unido, se añadió a cada cavidad anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina de IgC anti-cabra de conejo diluido a 1 :5000 (Sigma). La placa se incubó de nuevo a 37°C durante 45 minutos. Después de la remoción del anticuerpo conjugado no unido, se añadió a cada cavidad un paso de detección de solución de substrato de p-NPP (p-nitrofenilfosfato en dietanolamina; Sigma), y la placa se incubó durante 30 minutos a 37°C. La reacción se detuvo entonces mediante la adición de NaOH a 3M, y la placa se leyó a 405 nm. Las aves eran consideradas seropositivas si se observaba un valor de OD mayor de 0.2. Los controles incluyeron presangrías de 12 aves, y cavidades que contenían únicamente anticuerpo conjugado. Los resultados se muestran en los cuadros 5 y 6 siguientes.

CUADRO 5 Porcentaje de seropositivos para LPS 078, pre- y post-desafío CUADRO 6 Porcentaje de seropositivos para LPS 078 de grupo B, pre- y postdesafío Aproximadamente 50% de las aves vacunadas con MGN996 fueron seropositivas para anticuerpos IgM específicos de 078, mientras que únicamente el 20 ó 30% fueron positivas para anticuerpos IgG e IgA especificas de 078, predesafío. En contraste, 80% de las aves vacunadas con la cepa Rfcsf, MGN 1180, fueron positivas para anticuerpos IgM específicos de 078 predesafío, y 57% y 70% de las aves fueron seropositivas para anticuerpos IgG e IgA específicos de 078, respectivamente. Estos resultados indican una maduración adicional de las respuestas inmunes humorales generadas mediante la vacunación con MGN1180 que con la cepa MGN996 de Rfcsr+. Aunque la seroconversión post desafío fue similar entre los grupos, los valores de OD405 de 85% (22/26) de las aves seropositivas a IgA vacunadas con MGN1180, fueron mayores de 0.5, comparativamente con únicamente 42% (11/26) de las aves vacunadas con MGN996. El alto porcentaje de aves vacunadas en forma simulada y seropositivas para IgM anti-078, se puede deber a reestimulación de células B de la memoria reactivas a un antígeno común de E. coli presente en la preparación de LPS 078 (por ejemplo, núcleo de LPS). Como era de esperarse, las vacunas de MGN996 dieron una respuesta de anticuerpo humoral más fuerte a LPS de S. typhimurium que las vacunas de MGN1180, puesto que MGN1180 produce LPS de S. fyphimurium que tiene únicamente una unidad de azúcar del antígeno O, la cual puede ser enmascarada por el LPS 078. Esta especulación se basa en la observación de que la cepa MGN1180 no aglutina en presencia de antisueros específicos del grupo B, mientras que la cepa MGN1184 (?cya ?crp ?ríc) sí lo hace, aunque más débilmente que una cepa de S. iyphimuriu que expresa el antígeno O de LPS completo. En general, hubo una fuerte correlación entre una respuesta de anticuerpo predesafío sólida y una puntuación de lesiones baja, aunque hubieron pocas aves que no elevaron una respuesta de anticuerpo predesafío desectable y que fueron protegidas, y hubieron pocas aves que elevaron una respuesta de anticuerpo predesafío detectable, pero que fueron evaluadas como si no hubieran sido protegidas. La mayoría de las aves vacunadas con MGN 1 180 fueron seropositivas para anticuerpos 078 (24/30) antes del desafío, mientras que menos aves (17/30) del grupo MGN996 fueron seropositivas.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra la vacunación de pollos con una cepa recombinante de S. typhimurium que contiene también un vector Asd+ que se puede usar para expresar otros productos génicos heterólogos. El vector pYA292 Asd+ (cuadro 1 ) fue introducido en MGN1717 (cuadro 1 ) mediante electroporación, para producir la cepa MGN1718 [(Acya-28::ríb 078 ?crp-28 ?rícl ?asd::xylE729)/pYA292, Mot+]. Los pollos usados en este ejemplo fueron eclosionados de huevos fértiles de pollos libres de patógenos específicos (SPF) obtenidos de Sunrise Farms (Catskill, NY). Veinte pollos fueron vacunados en forma simulada con BSG, y 29 pollos fueron vacunados en el día de la eclosión con 5.6 x 107 CFU de MGN1718 mediante cebadura oral como se describió anteriormente. En el día 14, las aves vacunadas fueron reforzadas con 5.2 x 107 CFU de MGN 1718 mediante cebadura oral, y en el día 28 todas las aves fueron desafiadas con 5 x 107 CFU de ?7122 como se describió anteriormente. Cuatro días después, las aves fueron sometidas a eutanasia, sometidas a necropsia, y evaluadas para lesioness como se describió anteriormente, excepto que se usó un sistema de evaluación nuevo más sensible, el cual se da en el cuadro 7 siguiente, y la puntuación de lesiones promedio usando este sistema de puntuación se muestra más adelante en el cuadro 8.

CUADRO 7 Método para evaluar lesiones Sacos aéreos (torácicos) Normales 0 Turbiedad y densidad moderadas 1 Turbiedad moderada, y densidad acompañada de 2 exudados serosos y puntos de fibrina Turbiedad y densidad extensivas acompañadas de 3 exudado muco- o fibrino- purulento Corazón y pericardio Normales 0 Turbiedad y presencia de fluido excesivo en la 1 cavidad pericárdica Pericarditis aguda 2 Hígado Normal 0 Decolorado y/o ligeras cantidades de exudados 1 fibrinosos Perihepatitis marcada Exámenes bacteriológicos Reaislamiento de E. coli Después de incubación, muestra de sacos aéreos 1 limpiada de en BHI A partir de estría directa para sacos aéreos 2 Después de incubación, muestra de corazón o de 1 fluido pericárdico limpiada en BHI Estría directa a partir de muestra pericárdica o de 2 corazón Incubación de muestra de hígado limpiada en BHI 1 A partir de estría directa del hígado 2 Puntos máximos posibles por ave = 13 CUADRO 8 Puntuación de lesiones promedio para desafío con y 7122 1 a diferente de b (p<0.0001 ) Para evaluar si ia cepa de S. fyphimurium portadora contribuye a la protección contra el desafío con la cepa de APEC, se llevó a cabo un experimento muy similar usando MGN1 175 (cuadro 1 ), la cual es genéticamente muy similar a MGN1718, pero carece del grupo de genes ríb 078. La puntuación de lesiones promedio para controles vacunados en forma simulada, o aves vacunadas después del desafío con 7.5 x 107 CFU de ?7122, se muestra en el cuadro 9 siguiente.

CUADRO 9 Puntuación de lesiones promedio para desafío con ?7122 La puntuación de lesiones promedio para aves vacunadas, no fue significativamente diferente de la obtenida para aves control vacunadas en forma simulada. Este resultado indica que la protección contra la cepa ?7122 de APEC provista por las cepas MGN1718 y MGN1180 de la vacuna de S. typhimurium, se debió a la expresión del antígeno O 078 de E. coli.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra la construcción y eficacia de una modalidad de la cepa de vacuna O-78 que expresa también un operón fimbrial de una cepa de APEC O1 :K1 :H7. Los operones fimbriales son estructuras de superficie celular que han sido asociados con virulencia en cepas de APEC (Dozios et al., Infecí. Immun. 60:2648-2656, 1992; Dozios, et al., Avian Dis. 38:231-239, 1994; Wooley et al., Av. Dis. 36:679-684, 1992), y las fimbrias de tipo I, en particular, ha sido implicadas como importantes para la colonización de células epiteliales de tráquea de aves por cepas de E. coli patógenas de aves (APEC) (Gyimah et al., Avian Dis. 32:74-78, 1998). Los genes que intervienen en la producción de fimbrias de tipo I han sido clonados de un aislado de APEC O1 :K1 :H7, insertados en un vector de plásmido Asd+ (pYA292), y expresados constitutivamente. Un mapa genético del plásmido resultante, pMEG287, se muestra en la figura 4. El plásmido pMEG287 fue introducido en la cepa recombinante MGN1717 de S. typhimurium (cuadro 1), para producir MGN 1720 ([?cya-28:ríb 078 ?crp-28 ?rícl ?asd::xylE729]/pYA292, Mot+. La expresión de fimbrias de tipo I en la cepa MGN1720, se confirmó mediante una prueba de aglutinación de levaduras (Korhonen, T. K., FEMS Microbiol. Letí. 6:421-425, 1979), usando cultivos aireados desarrollados a 37°C. La aglutinación fue sensible a la mañosa, como era de esperarse para las fimbrias de tipo I, y la cepa control, MGN1718, no glutinó las células de levadura. Aunque las cepas de S. typhimurium de tipo silvestre expresan las fimbrias de tipo I, el resultado con la cepa MGN1718 es consistente con el hecho de que la expresión de las fimbrias de tipo I es regulada por ?cya ?crp, y son por lo tanto apenas poco expresadas en cepas Cya" Crp" (Saier et al., J.

Bacteriol. 134:356-358, 1978), y sólo después de dos días de crecimiento estático a 37°C. Se evaluó la eficacia de las cepas MGN 1718 y MGN 1720 en pollos, esencialmente como se describió anteriormente, usando una dosis de desafío de 5 X 107 CFU, y los resultados se muestran a continuación en el cuadre 10.

CUADRO 10 Puntuación de lesiones promedio para desafío con ?7122 PO.0001 1 a diferente de b (p?.0001 ).

Estos resultados muestran que la adición de fimbrias de tipo I da como resultado puntuación de lesiones menor, aunque no estadísticamente significativa. Aunque la adición de fimbrias de tipo I a la cepa usada como vacuna no mejora la protección contra el desafío con 078, puede proveer protección cruzada contra otros serotipos de APEC. Otras fimbrias que se pueden usar son fimbrias de tipo P, incluyendo F11 , las cuales han sido asociadas con cepas de APEC (van den Bosch, et al., Infecí. Immun. 61 :800-806, 1993).

EJEMPLO 7 Este ejemplo ilustra la construcción de una modalidad de la cepa de vacuna 078 que expresa también una proteína de membrana exterior regulada por hierro en E. coli. La capacidad para depurar hierro es una característica de supervivencia importante para los patógenos, debido a que la disponibilidad del hierro es limitativa en el medio ambiente del animal hospedero (Litwin et al., Clin. Microbiol. Rev. 6:509-518, 1993; Peighambari, et al., Avian Dis. 39:116-124, 1995). Varios genes de respuesta al hierro codifican para proteínas de membrana exterior (OMPs), en donde la mayoría de estas proteínas actúan como receptores para compuestos quelatadores de hierro (sideróforos) producidos por las bacterias o el hospedero (Bagg. et al., Microbiol. Rev. 51 :509-518, 1987). Las OMPs reguladas por hierro son antigénicas, y se han detectado anticuerpos contra OMPs reguladas por hierro de E. coli en humanos, conejos, ratones y conejillos de Indias sanos (Griffiths, et al., Infecí. Immun. 47:808-813, 1985). Los anticuerpos producidos contra OMPs reguladas por hierro en E. coli, protegen pasivamente a pavos contra el desafío subsecuente con E. coli 078 patógena de aves (Bolin, et al., Infecí. Immun. 55:1239-1242, 1987), indicando que estas proteínas son antígenos protectores.

Un candidato excelente para un antígeno de vacuna es la OMP , de 78 kDa de respuesta a hierro, lutA. lutA es el receptor para aerobactina y » cloacipa (Bagg, et al., Microbiol. Rev. 51 :509-518, 1987). La síntesis de aerobactina está correlacionada directamente con la virulencia de E. coli en 5 humanos y mamíferos (Litwin et al., Clin. Microbiol. Rev. 6:509-518, 1993; Payne, S. M., Crit. Rev. Microbiol. 16:81-111 , 1988), así como también en aves de corral (Dho et al., Avian Dis. 28:1016-1025, 1984; Emery et al., Avian Dis. 36:504-511 , 1992; Lafont et al., Infecí. Immun. 55:193-197, 1987, Linggood et al., J. Gen. Microbiol. 133:835-842, 1987; Wooley et al., Av. Dis. 10 36:679-684, 1992). La aerobactina es un componente de un sistema de captación de hierro de alta afinidad (Bagg, et al., Microbiol. Rev. 51 :509-518, 1987), lo cual puede explicar su frecuencia entre organismos patógenos. En varios estudios de aislados de E. coli en aves, se ha encontrado que más de 80% de los aislados patógenos producen aerobactina (Dho et al., citado 15 anteriormente; Emery et al., citado anteriormente; Lafont et al., citado anteriormente; Yokoyama et al., citado anteriormente), aunque es rara entre cepas no patógenas. Los genes para la síntesis de aerobactina se encuentran con más frecuencia en plásmidos ColV, y están por lo tanto estrechamente vinculados a la producción de colicina V (Bagg et al., citado anteriormente). 20 Un clon de lutA de pColV-K30, está disponible como plásmido pFS8 (Krone et al., J. Bacteriol. 153:716-721 , 1983). El gen iuíA fue subclonado de pFS8 en un vector de plásmido Asd+ pYA292 para crear pMEG055 (fig. 5), e introducido en un derivado de ?asd de la cepa MGN996 de S. fyphimurium. Los resultados del análisis Western blot indican que la proteípa lutA es expresada constitutivamente, y que la expresión es estable durante 50 generaciones en caldo de L. Otras proteínas de la membrana exterior que pueden ser expresadas incluyen las proteínas de membrana exterior reguladas por hierro FepA, FecA, FhuA, FecA, y una proteína que interviene en la resistencia al suero, Iss. Todas las referencias citadas en esta especificación, ya sea anteriormente o más adelante, se incorporan en la presente como referencia. La descripción de las referencias en la presente se usa solamente para resumir las afirmaciones hechas por los autores, y no se hace reconocimiento alguno a la precisión o pertinencia de las referencias o que alguna referencia sea materia sujeta a patentabilidad.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una vacuna para la inmunización de aves contra un microbio gram-negativo patógeno de aves (APG-N). caracterizada porque comprende células vivas de una cepa recombinante de Salmonella que expresa un antígeno O del microbio APG-N> la cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc del microbio APG-N integrado establemente en el cromosoma de Salmonella, y teniendo una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella, o en el gen ríe de Salmonella, que inactiva la expresión del antígeno O de Salmonella, en donde la cepa recombinante de Salmonella es un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella.

2.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el microbio APG-N es una cepa de Escherichia coli patógena de aves (APEC).

3.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el grupo de genes integrado rfb/ríc de APEC comprende una mutación atenuante en un gen de Salmonella seleccionado del grupo que consiste de pab, pur, aro, asd, dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, ríe, poxA y galil.

4.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la mutación atenuante es una mutación por deleci?n/inserción definida en el gen cya de Salmonella.

5.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la cepa recombinante de Salmonella tiene también una mutación atenuante en el gen crp de Salmonella.

6.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la cepa de APEC tiene un serotipo de 01 , 02, 035 u 078.

7.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cepa recombinante de Salmonella tiene también un polinucleótido recombinante que codifica para un producto génico deseado.

8.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el producto génico deseado es un antígeno de un organismo patógeno de aves.

9.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el organismo patógeno de aves es una cepa de Escherichia coli patógena de aves (APEC), y el antígeno es una fimbria o una proteína de membrana exterior regulada por hierro, de la cepa de APEC.

10.- El uso de células vivas de una cepa recombinante de Salmonella que expresa un antígeno O del microbio APG-N, la cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc del microbio APG-N integrado establemente en el cromosoma de Salmonella, y teniendo una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella, o en el gen ríe de Salmonella, que inactiva la expresión del antígeno O de Salmonella, en donde la cepa recombinante de Salmonella es un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella, en la fabricación de una vacuna para inmunizar a un ave contra un microbio gram-negativo patógeno de aves (APG-N)-

11.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el microbio APQ-N es una cepa de Escherichia coli patógena de aves (APEC).

12.- El uso como se reclama en la reivindicación 11 , en donde el grupo de genes integrado ríb/ríc de APEC comprende una mutación atenuante en un gen de Salmonella seleccionado del grupo que consiste de pab, pur, aro, asd, dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, ríe, poxA y galU.

13.- El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde la mutación atenuante es una mutación por deleción/inserción definida en el gen cya de Salmonella.

14.- El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde la cepa recombinante de Salmonella tiene también una mutación atenuante en el gen crp de Salmonella.

15.- El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde la cepa e APEC tiene un serotipo de 01 , 02, 035 u 078.

16.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde la cepa recombinante de Salmonella tiene también un polinucleótido recombinante que codifica para un producto génico deseado.

17.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el ave es un pollo o un pavo.

18.- El uso como se reclama en la reivindicación 17, en donde la vacuna se administra mediante aspersión generalizada en el día de la eclosión.

19.- El uso como se reclama en la reivindicación 18, que comprende además administrar oralmente al ave una cantidad de refuerzo de la vacuna.

20.- El uso como se reclama en la reivindicación 19, en donde la cantidad de refuerzo se administra en el día 13, 14 ó 15 después del día de la eclosión.

21.- Una vacuna para la inmunización de aves contra por lo menos dos microbios gram-negativos patógenos de aves (APG-N), caracterizada porque comprende una mezcla de células vivas de primera y segunda cepas recombinantes de Salmonella, la primera cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc de un primer microbio APQ-N integrado en el cromosoma de Salmonella y que expresa un antígeno O del • } primer microbio APQ-N, y la segunda cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc de un segundo microbio APG-N integrado en el cromosoma de Salmonella, y que expresa un antígeno O del segundo 5 microbio APG-N, en donde cada una de la primera y segunda cepas recombinantes de Salmonella tiene una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella o en el gen ríe de Salmonella, que inactiva la expresión del antígeno O de Salmonella, y en donde cada una de la primera y segunda cepas recombinantes de Salmonella es un mutante atenuado de una cepa 10 virulenta de Salmonella.

• 22.- Una vacuna para la inmunización de aves contra por lo * > menos dos microbios gram-negativos patógenos de aves (APG-N), caracterizada además porque la vacuna comprende células vivas de una cepa recombinante de Salmonella que expresa un antígeno O de cada uno de los 15 microbios APG-N, la cepa recombinante de Salmonella teniendo un grupo de genes ríb/ríc de cada uno de los microbios APG-N integrado establemente en el cromosoma de Salmonella, y teniendo una mutación en el grupo de genes ríb de Salmonella, o en el gen ríe de Salmonella, que inactiva la expresión del antígeno O de Salmonella, en donde la cepa recombinante de Salmonella es 20 un mutante atenuado de una cepa virulenta de Salmonella.

23.- Un método para obtener una vacuna para inmunizar a un ave contra un microbio gram-negativo patógeno de aves (APG-N), caracterizado porque comprende los pasos de: (a) seleccionar una cepa de * } Salmonella capaz de colonizar al ave; (b) integrar al cromosoma de Salmonella un grupo de genes ríb/ríc del microbio APQ-N; (C) introducir una mutación en el grupo de genes rfb de Salmonella y/o en el gen ríe de 5 Salmonella; y (d) aislar bacterias recombinantes de Salmonella que expresen el antígeno O característico de la cepa de APEC, pero que no expresen el antígeno O de Salmonella, en donde los pasos (b) y (c) se pueden llevar a cabo en cualquier orden.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, 10 caracterizado además porque la cepa seleccionada de Salmonella es un mutaníe atenuado de una cepa virulenta de Salmonella. i

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la cepa seleccionada de Salmonella es una cepa virulenta de Salmonella, y el método comprende además introducir en la 15 cepa virulenta de Salmonella, una mutación atenuante en un gen de Salmonella seleccionado del grupo que consiste de pab, pur, aro, asd, dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, ríe, poxA y galU, y aislar entonces mutantes que tengan virulencia atenuada comparativamente con la cepa virulenta de Salmonella.