MXPA01000195A - Compuestos que tienen actividad antiviral, obtenidos de especies de salvia. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones que contienen moleculas y que tienen por lo menos una porcion a partir del acido beta-(3,4-dihidroxifenil) lactico o acido cafeico, o ambos, los cuales se encuentran en extractos de las plantas del genero Salvia, tales porciones son de formula (I), los agentes activos tienen un peso molecular de por lo menos 190 unidades daltons. Una clase preferida de agentes son aquellos los cuales se conjugan para formar dimeros, trimeros, tetrameros y polimeros mas grandes que contienen tales porciones, entre los mas preferidos estan los dimeros, trimeros, tetrameros y polimeros mas grandes de acido salvianolico. Los compuestos y composiciones se pueden administrar en portadores y excipientes farmaceuticamente aceptables, por via sistematica o local para tratar infecciones virales.

Description

COMPUESTOS QUE TIENEN ACTIVIDAD ANTIVIRAL OBTENIDOS DE ESPECIES DE SALVIA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el uso de agentes activos obtenidos de extractos de las plantas del género Salvia . Los ingredientes activos incluyen conjugados de moléculas que tienen por lo menos una porción de ácido ß-(3,4-dihidroxifenil) láctico o ácido cafeico, o ambos. Los ingredientes activos preferiblemente son ácidos salvianólico, sus dímeros, trímeros y tetrámeros. Los agentes activos, ya sea solos o de manera más preferida en combinación, se pueden administrar a un sujeto para tratar una infección viral o una condición mediada por virus .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Salvia milbiorrhiza . La planta, Salvia miltiorrhiza (SM) , ha sido utilizada durante mucho tiempo en la medicina tradicional china para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y hepáticas. Los extractos de la planta confieren una potente actividad hepatoprotectora in vi tro e in vivo . Hase et al . , Planta. Med. 63:22-6 (1997). El litospermato de magnesio B puede ser uno de los componentes activos -Ref: 126241 principales de SM gue protege al hígado (Liu et al . , Chung Kuo Chung Hsi I Chih Ho Tsa Chih 13: 352-3, 326 (1993) ) . SM también contiene antioxidantes que aparentemente ayudan a la reparación del daño de la membrana cuando se trata miocarditis viral (Meng et al., Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih 12: 345-7, 324-5 (1992) ) . Los pacientes que padecen de hepatitis B crónica han respondido al tratamiento con SM o con polisacárido de Polyporus Umbellatus (PUP) (Xiong, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih 13: 33-5, 516-7 (1993)). Los extractos de hierbas de SM también han demostrado actividad contra VIH (patente de los E.U. No . 5,178,865) y actividad contra la hepatitis (Solicitud PCT Internacional 98/24460; Solicitudes de Patentes Chinas Nos. 1,192,922 y 1,192,918). Se han descrito agentes antivirales activos contra herpes, polio, sarampión, varicela zoster, citomegalovirus, ADN virus y ARN virus, los cuales contienen por lo menos un medicamento crudo de la raíz de Salvia mil tiorrhiza Bunge (patente Europea No. 568,001). También se han preparado extractos de Salvia como agentes contra herpes virus (patente de los E.U. No. 5,411,733) . La planta SM tiene varios componentes los cuales pueden ser extraídos . Los componentes de la raíz se han extraído inicialmente acn etanol, seguido por extracción con agua fría (SM(l)) o con agua caliente (SM(2)) . Ambas fracciones extraídas en agua han demostrado actividad antiviral .

Se han desarrollado agentes antivirales los cuales se dirigen a diferentes puntos en el ciclo de la vida del virus. Por ejemplo, se han desarrollado agentes antivirales para tratar infecciones retrovirales las cuales se dirigen a enzimas específicas de retrovirus tales como transcriptasa inversa (RT) e integrasa. La investigación continúa identificando otros agentes antivirales para combatir enfermedades tales como herpes, hepatitis e influenza.

Agentes antivirales contra retrovirus . Los agentes antivirales dirigidos contra la proteína integrasa incluyen inhibidores peptídicos (patente de los E.U. No. 5,578,573), inhibidores de ligando de ácido nucleico (patentes de los E.U. Nos 5,756,287 y 5,587,468), así como compuestos tales como Equisetina (patente de los E.U. Nos. 5,759,842) y sesquiterpenoides de ermofilano (patente de los E.U. No. 5,858,738) . Hasta la fecha, de los muchos compuestos que se han identificado y aprobado de antemano para su venta por la FDA para VIH, únicamente se han aprobado RT e inhibidores de proteasa. Ácido cafeico como agente antiviral . El ácido cafeico se puede aislar de los tallos de Bougainvillea spectabillis silvestre (Nyctaginaceae) , la cual se ha utilizado en la medicina tradicional contra la hepatitis (Chang et al . , Anticancer Res . 14: 501-6(1994)). Se ha informado que el ácido cafeico inhibe la xantina oxidasa, la cual se asocia con varias enfermedades, por ejemplo gota, hepatitis y tumores (Chan et al . , Anticancer Res . 15: 703-7 (1995); y Chang et al . , (1994)). El producto de oxidación del ácido cafeico (KOP) inhibe el herpes virus hominis tipo 1 y tipo 2 (Thiel et al . , Acta Virol . 27: 200-8 (1983)). El tetrámero de ácido cafeico y las sales de dipotasio y de potasio-sodio del glucósido del tetrámero de ácido cafeico poseen actividad contra VIH, de acuerdo con Kashiwada et al . , J. Nat . Prod. 58: 392-400 (1995). El ácido cafeico producido comercialmente también tiene actividad antiviral, como se demuestra utilizando un ensayo RT para VIH (Kreis et al . Antiviral Res . 14: 323-37 (1990)). Los esteres fenetílicos del ácido cafeico- (CAPE) ejercen actividad inhibidora sobre la proteína integrasa de VIH-l (Fesen et al . Proc. Nati Acad. Sci . USA 90: 2399-2403 (1993); Fesen et al., Biochem Pharmacol . 48: 595-608 (1994), Burke et al . , J. Med. Chem. 38: 4171-8 (1995); Mazumder et al . , J. Med. Chem. 39: 2472-81 (1996) ) . Sin embargo, el método utilizado para preparar polímeros de ácido cafeico influye en su actividad inhibidora de VIH-l y V H-2 (Nakashima et al . , Chem . Pharm . Bull . (Tokyo) 40: 2102-5 (1992)). El ácido cafeico, junto con el ácido cinámico y el ácido rosemarínico también se han propuesto para tratar al virus de la influenza debido a su actividad antioxidante (Solicitud PCT Internacional 98/30228) . Ácidos rosemarínico y li tospérmico como agentes antivirales . El ácido rosemarínico es un dímero de ácido cafeico. Un dímero de ácido rosemarínico es litospermato B. Tanto el ácido rosemarínico como el ácido litospermático se han identificado en extractos de la raíz de SM (Kohda et al . Chem. Pharm . B ul l . ( Tokyo ) 37: 1287-90 (1989)) . El ácido rosemarínico, posee actividad contra VIH (Arda et al . , J. Nat . Prod. 60: 1170-3 (1997)) y es potencialmente un inhibidor de Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) (Dimitrova et al . , Acta Microbiol . Bulg. 29: 65-72 (1993)). El ácido rosemarínico también se ha propuesto para tratar enfermedades inflamatorias y desórdenes (patente de los E.U. No. 4,329,361) . Ácido cinámico como un agente antiviral . Los esteres sustituidos de ácido cinámico inhiben la actividad infecciosa de virus de influenza A/Hong Kong (H3N2) (Serkedjieva et al . , J. Nat . Prod. 55: 294-302 (1992)); los esteres esterílleos de derivados de ácido cinámico han demostrado actividad antiviral í- vi tro contra virus que pertenecen a Pi cornaviri dae , Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae y Herpesviridae ("Antiviral activity of Choles teryl esters of cinnamic acid derivatives , " Z. Naturforsch 53: 883-7 (1998); y Conti eü al . , Antivir. Chem. Chemother, 9: 511-5 (1998)). Los polímeros de deshidrogenación de ácidos cinámicos sustituidos también se han descrito como un material terapéutico contra VIH-l (patentes de los E.U. Nos 5,346,695 y 5,632,980). Ácido salvianólico . El ácido salvianólico no ha sido descrito en la literatura con propiedades antivirales . Se han descrito varias formas de ácido salvianólico (por ejemplo, ácido salvianólico A, ácido acetilsalvianólico) con propiedades antioxidantes (Lin et al . , J. Biochem . Pharmacol . 51: 1237-1241 (1996) . También se ha indicado el ácido salvianólico para evitar el daño hepático y fibrosis, asociado con sus acciones de peroxidación antilipídicas (Hu et al . , Acta Pharmacol . Sin . 18: 478-480 (1997)) y para uso en el tratamiento de enfermedades coronarias (patente japonesa 2,131,423) . Las formas adicionales de ácido salvianólico descritas en la literatura incluyen aquéllas aisladas de extractos acuosos de Salvia cavaleriei (por ejemplo los ácidos salvianólicos A, B, C H e I) (Zhang et al . , Planta Med. 60: 70-72 (1994)) o a partir de S. mil tiorrhiza (por ejemplo, ácido salvianólico K, un trímero de ácido cafeico) (Kasimu et al . , Chem . Pharm . Bull . 46: 500-504 (1998); y Tezuka et al . , Chem Pharm. Bull . 46: 107-112 (1998) ) . Los ácidos salvianólicos F 2 y F 3 se pueden preparar sintéticamente como se describe por Dalla et al . , Tetrahedron 55: 6923-6930 (1999); y Dalla et al . , Tetrahedron Le t t . 39: 8285-8286 (1998) . Se han utilizado miembros adicionales de la familia Salvia como fuentes para obtener Danshen, que incluyen: S. bowleyana, S. deserta, S. miltiorhiza van miltiorhiza f. alba, S. paramiltiorhiza, S. paramiltiorhiza f. pupureo -rubra, S. przewalskii , S. prsewalskii var. mandarinorum, S. sinica f. purpurea y S. trijuga) (Kasiumu r et al., 1998). Los métodos para producir plantas con niveles elevadas de metabolitos secundarios de compuestos tales como ácido salvianólico también se han descrito. Véase la patente de los E.U. No. 5,869,340 (1999). Ácido (3 f 4 -dihidroxi fenil) láctico . Un componente principal de SM es "Danshensu", conocido químicamente como ß-3, 4-dihidroxifenil lactato de sodio (Fen et al., Acta Acad. Med. Primae Shanghai 10: 133-6 (1983); Zhao et al., Chin. Pharm. J. 29: 291-93 (1994)) . Es un compuesto intermediario utilizado en la preparación de ácido rosemarínico en cultivo celular (Al-Sereiti et al., Indian J. Exp. Biol. 37: 124-130 (1999); Bogucki et al., Can. J. Chem. 75: 1783-94 (1997); y patente de los E.U. No. 5,011,775). El tratamiento de enfermedades mediadas por virus con agentes antivirales puede ser muy costoso. Por ejemplo, el tratamiento de VIH-l utilizando transcriptasa inversa e inhibidores de proteasa cuesta aproximadamente $12,000-20,000 por paciente por año. Dado que la mayor parte de los pacientes afectados por VIH viven en naciones en desarrollo, se deben intensificar medicaciones adicionales las cuales sean económicamente más atractivas para el tratamiento de VIH y otras enfermedades virales . La presente invención proporciona un método nuevo de identificar, elaborar y utilizar compuestos y composiciones novedosas de los mismos para uso como sustancias terapéuticas antivirales.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención describe composiciones que contienen moléculas que tienen por lo menos una porción de ácido ß- (3 , 4-dihidroxifenil) láctico o ácido cafeico, o ambas, las cuales se encuentran en extractos del género Salvia, tales porciones son de la fórmula: tales agentes activos tienen un peso molecular de por lo menos 190 unidades daltons. R1 de la porción del ácido ß-(3,4-dihidroxifenil) láctico puede ser -OH, -O- o un enlace, y R2 puede ser -H o un enlace. R3 de la porción de ácido cafeico, puede ser -OH o -O- ; R4 puede ser un enlace o en donde Rs es -OH o un enlace; R6 puede ser -H o un enlace,- y R7 puede ser -H o un enlace . En otra modalidad, se contempla un producto de conjugación, el cual es homopolímero, o heteropolímero de unidades monoméricas de ácido . salvianólico o de formas deshidrogenadas de ácido salvianólico, o ambas, tal producto de conjugación tiene un peso molecular de aproximadamente 492 o mayor, o derivados acetilo, éster o anhídrido de los mismos, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos . En una modalidad preferida, el producto de conjugación es un homopolímero o heteropolímero de unidades monoméricas de ácido salvianólico (I) o formas deshidrogenadas (II) o (III) de ácido salvianólico, tal ácido salvianólico tiene la estructura: y las formas deshidrogenadas de ácido salvianólico tienen las estructuras : en donde R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son hidrógeno o un enlace, y las unidades monoméricas de los homopolímeros o heteropolímeros están unidas entre sí por R1, R2, R3, R4, R5 y R6. La presente invención también se relaciona con un método para elaborar un agente antiviral que comprende incubar ácido salvianólico a un pH alcalino de manera que los homopolímeros o heteropolímeros que se forman poseen mayor actividad antiviral que el ácido salvianólico. Los agentes de la invención poseen actividad antiviral y se pueden administrar en portadores farmacéuticamente aceptables por vía sistémica o local.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación tridimensional del compuesto 5 del Ejemplo 4. La figura 2 es una representación tridimensional del compuesto 6 del Ejemplo 4. La figura 3 es una representación tridimensional del compuesto 7 del Ejemplo 4. La figura 4 es una representación tridimensional del compuesto 8 del Ejemplo 4. La figura 5 es una representación tridimensional del compuesto 9 del Ejemplo 4. La figura 6 es una representación tridimensional del compuesto 10 del Ejemplo 4. La figura 7 es una representación tridimensional del compuesto 11 del Ejemplo 4. La figura 8 es una representación tridimensional del compuesto 12 del Ejemplo 4. La figura 9 es una representación tridimensional del compuesto 13 del Ejemplo 4. La figura 10 es una representación tridimensional del compuesto 2 del Ejemplo 4, formado por dehidrogenación de los carbonos 24 y 38 de ácido salvianólico.

La figura 11 es una representación tridimensional del compuesto 3 del Ejemplo 4, formado por deshidrogenación de los carbonos 24 y 35 de ácido salvianólico. La figura 12 es una representación tridimensional del compuesto 4 del Ejemplo 4, formado por deshidrogenación de los carbonos 27 y 38 de ácido salvianólico. La figura 13 es una representación tridimensional del compuesto 24 del Ejemplo 4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención utiliza un enfoque alternativo para desarrollar medicamentos derivados de extractos de plantas, específicamente los extractos de la planta del género Salvia . Estos agentes activos inhiben la integración viral de diversos virus diferentes, incluyendo retrovirus. En una modalidad, preferida, los agentes activos descritos inhiben la integración de la totalidad o una porción de un genoma viral dentro del genoma de la célula huésped. Los agentes activos también puede inhibir la infección del virus, la progresión del virus o la proliferación del virus, o todas, al interferir en otros puntos en el ciclo de vida del virus. El género Sal vi a (familia Lamiaceae) contiene aproximadamente 700 miembros que se localizan en zonas tropicales y de alta temperatura en el mundo, con algunas 300 especies en Asia, Europa y África y 400 especies en América (J.C. Willis, A DICTIONARY OF FLO ERING PLANTS A?D FER?S (7th edition, Cambridge, University Press, 1966) ; J. Briquet, Labiatae, In DIE ?ATURLICHE? PFLA?ZE?FAMILIE? Vol . IV, 3a, 183-375 (Engler and Prantl eds., Englemann, Leipzig, 1897). Los compuestos antivirales y las composiciones de esta invención se pueden derivar de cualquier miembro del género Salvia, pero preferiblemente de SM y SY.

DEFINICIONES Mediante los términos "cantidad efectiva inhibidora viral", "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva" se quiere significar aquélla cantidad de un agente activo o agentes activos que, cuando se administran a un sujeto con una infección viral o una enfermedad mediada por virus, tal infección o enfermedad es disminuida, o la infección es inhibida en un grado tal que sobrepasa cualquier efecto colateral negativo provocado por el agente o agentes. Tales agentes se deben considerar "agentes antivirales" . Por los términos "condición mediada viral" o "condición mediada por virus" se quiere significar un fenotipo de enfermedad asociado con una infección viral. Por ejemplo, el complejo relacionado con SIDA (ARC) es una condición asociada con una infección por VIH-l. Mediante el término "actividad antiviral" se quiere significar la capacidad de inhibir o disminuir una infección viral o una condición asociada con una infección viral . Los compuestos que tienen actividad antiviral de acuerdo con la invención preferiblemente inhibirán la inhibición in vi tro a una dosificación de = 1 µM o menos, preferiblemente menos que o igual de aproximadamente 10 mM in vi tro . Por el término "actividad de integrasa" se quiere significar una proteína integrasa o una proteína la cual puede integrar un genoma viral o un segmento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped. La mayor parte de las proteínas de integrasa se asocian con miembros de la familia Retroviridae de virus . Por "planta del género Salvia" se quiere significar una planta del género Salvia, de la familia Lamiaceae . Las plantas de Salvia preferidas para aislamiento de compuestos de acuerdo con la invención son " Salvia mil tiorrhiza" o "SM" y "Salvia yunanesis" o "SY". Por "derivados conjugados" o "polímeros mayores" se quiere significar un agente activo el cual comprende un dímero, trímero, tetrámero, etc., en donde la unidad monomérica es una de las siguientes porciones : Los derivados conjugados de polímeros grandes pueden ser homodímeros, homotrímeros , homotetrámeros , etc., o heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros, etc., de las porciones anteriores. Un ejemplo de un derivado conjugado es litospermato B el cual es un dímero de ácido rosemarínico el cual a su vez es un dímero de ácido cafeico.

B. VIRUS El tratamiento o inhibición de cualquier infección viral en respuseta a los compuestos y composiciones antivirales descritas en la presente está dentro del alcance de la presente invención. Los preferidos son virus de las siguientes familias de virus: virus de hepatitis, herpes virus, ortomixovirus, papilomavirus, paramixovirus, picornavirus, poliomavirus y retrovirus.

-Retrovirus. Los compuestos y composiciones descritos aquí preferiblemente se utilizarán para tratar infecciones retrovirales . Aunque los retrovirus pertenecen a un género viral claramente definido y relativamente homogéneo, se han subdividido históricamente en tres agrupamientos taxonómicos, principalmente en base en las consecuencias patológicas de infección. El subgrupo oncovirus incluye retrovirus que tienen la capacidad de provocar enfermedades neoplásicas en el huésped infectado, así como varios virus relacionados, aunque aparentemente benignos . Los lentivirus provocan enfermedades crónicas lentas que generalmente, aunque no siempre, carecen de un componente neoplásico. Los lentivirus deben aún ser asociados claramente con cualquier enfermedad humana o animal . La replicación retroviral se inicia con la penetración intracitoplásmica del núcleo del virión, un proceso mediado por la interacción específica de la glicoproteína de envoltura viral con el receptor específico de superficie celular. Subsecuentemente, una ADN polimerasa dependiente de ARN, asociada al virión, transcribe el genoma de ARN de cadena sencillo a un intermediario proviral de ADN lineal de cadena doble (transcripción inversa) . Una proteína de integración "integrasa" reconoce específicamente ambos extremos del ADN viral y remueve dos nucleótidos de los extremos 3 ' (procesamiento de donador 3 ' ) . El ADN viral procesado y la integrasa después migran al núcleo, en donde la integrasa viral une covalentemente el genoma retroviral al ADN cromosómico del huésped (transferencia de cadena) , por lo que forma el provirus retroviral . El surgimiento del virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-l) como un patógeno humano importante ha incrementado el interés científico en los retrovirus. En particular, la evidencia indica que el ciclo de vida simple delineado antes no es completamente descriptivo del ciclo de replicación de todos los retrovirus. Por ejemplo, VIH-l codifica no menos de seis productos de genes además de los característicos retrovirales Gag, Pol y Env; estos se traducen a partir de un juego nuevo de especies de ARNm viral divididas solas o divididas de manera múltiple. Por lo menos dos de estas proteínas adicionales, denominadas Tat y Rev, actúan en trans para regular directamente la expresión del gen VIH-l. Por lo tanto, las etapas entre la penetración e integración proviral parecen ser muy similares tanto para MLV (virus de leucemia murino) como VIH-l, aunque los fenómenos de postintegración se encuentra que son significativamente más complejos en estos últimos. Más recientemente, se ha vuelto evidente que VIH-l es únicamente uno de una clase completa de retrovirus animales que ahora se denominan como retrovirus "complejos". Los retrovirus pertenecen a estos retrovirus complejos e incluyen todos los lentivivus, espumavirus, así como HTLV-l y virus relacionados (Tabla 1) .

TABLA 1 : Divis iones taxonómicas principal es entre los retrovirus Categoría Subgrupo Prototipo Otros ejemplos Retrovirus simple retrovirus tipo C grupo A RSV ALV, ASV retrovirus tipo C grupo B MLV FeLV, MSV, SNV. REV. SSV retrovirus tipo B MMTV retrovirus tipo D MPMV SRV-1 Retrovirus complejos Lentivirus HTV-1 HIV-2. SIV, virus visna, FIV, virus de leucemia de células T HTLV-l E1AV HTVL-II. STLV. BLY espumavirus HSRV SFV, BFV Abreviaturas. RSV, virus de sarcoma de Rous ; ALV, virus de leucemia aviar; ASV, virus de sarcoma aviar; FeLV, virus de leucemia felina; MSV, virus de sarcoma murino; S V, virus de necrosis del bazo; REV, virus de retículo endoteliosis ; SSV, virus de sarcoma de simio,- MMTV virus de tumor mamario de ratón,- MPMV, virus de mono Masón-Pfizer; SRV-1, retrovirus simio tipo 1; STLV, virus de leucemia en células T simias; BFV, virus espumoso bovino.

Las etapas involucradas en la integración proviral parecen muy similares en retrovirus sencillos y complejos. Debido a esta condición común de mecanismo, un inhibidor de integrasa retroviral inhibirá una amplia gama de organismos tales como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de inmunodeficiencia simia (SIV) , virus de inmunodeficiencia felina (FIV) , virus de leucemia felina (FeLV) , virus de leucemia murina (MuLV) , virus de sarcoma de Rous (RSV) , virus de inmunodeficiencia bovina (BIV) , virus de leucemia de células T humanas (HTLV) . Además de estos retrovirus, los agentes activos de la invención se pueden utilizar como inhibidores contra proteínas similares a integrasa para inhibir la replicación de otros virus tales como el virus de hepatitis B (HBV) .

Otros virus . Los agentes activos descritos en la presente también se contemplan para uso en tratamiento de infecciones virales causadas, por ejemplo, por virus de hepatitis, herpes virus, ortomixovirus , papilomavirus, paramixovirus, picornavirus y poliomavirus. Loe virus preferidos para ser tratados con los agentes activos descritos aquí incluyen los incluidos en la Tabla a continuación : TABLA 2 V ase FUNDAMENTAL VIROLOGY Bernard N. F elds et al . , eds. , 1991) MÉTODOS PARA ELABORAR LOS COMPUESTOS En el ejemplo 1 a continuación se describen las condiciones generales para preparar los extractos de plantas de cualquier especie de Salvia y de manera más preferida de SM y SY, las cuales contienen el agente activo. Los compuestos se pueden preparar de manera sintética como sigue. Se forman por incubación varios compuestos que contienen las porciones de ácido ß- (3 , 4-dihidroxifenil) láctico o ácido salvianólico o ácido cafeico, o ambos, por incubación de los compuestos respectivos a una concentración de 5 mg/ml en NH40H 0.1% hasta por 24 h. Estos incluyen formas deshidrogenadas de ácido salvianólico, dímeros conjugados y polímeros más grandes. El período de tiempo preferido es de 3-24 h. Períodos de incubación mayores de 48 h en NH40H 0.1% pueden resultar en inactivación del compuesto. El período de activación también depende de la concentración inicial del compuesto. Concentraciones más altas del compuesto requerirán períodos más prolongados de incubación para activación. Esta formación también se puede llevar a cabo ajustando el pH de los compuestos en solución a más de pH = 8 por otros reactivos alcalinos. La reacción se requiere por la adición de un ácido, tal como ácido acético 1%, de manera que el pH de la solución resultante sea menor que o igual a 7. Otros factores que contribuyen a la formación de los compuestos nuevos son la temperatura y oxigenación.

D. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y SU ADMINISTRACIÓN Para el tratamiento o mediación de infecciones virales, un compuesto de acuerdo con la invención se puede administrar por vía oral, tópica, parenteral, por aspersión de inhalación o rectalmente, en formulaciones de dosificación unitaria que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos habituales. El término "parenteral", como se utiliza en la presente, incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas, intramusculares, intravasculares o- técnicas de infusión. Además para el tratamiento de animales homeotermos, tales como ratones, ratas, caballos, ganado, borregos, perros, gatos, etc., los compuestos y composiciones descritos en la presente son efectivos en el tratamiento de infecciones virales en su j etos humanos . Para administración al sistema nervioso central, las composiciones se pueden administrar en el líquido cefalorraquídeo. Para administración intratecal, los portadores para administración parenteral, particularmente portadores tales como glucosa en agua o solución salina, son apropiados. Las composiciones también se pueden preparar en liposomas para mejorar la transferencia a través de las barreras de membrana. Las composiciones se pueden preparar para administración transdérmica vía parches. Los solventes utilizados para administración de compuestos hidrofóbicos también se pueden utilizar para este propósito, tales como DMSO o aceites los cuales atraviesen la barrera dérmica. Para administración parenteral, se pueden preparar soluciones de un compuesto terapéutico de la presente invención, por ejemplo, utilizando aceite de ajonjolí o cacahuate, o propilenglicol acuoso. Las soluciones acuosas se pueden amortiguar adecuadamente (preferiblemente a un pH mayor de 8) si es necesario, y el diluyente líquido primero se vuelve isotónico. Tales soluciones acuosas son adecuadas para propósitos de inyección intravenosa. Las soluciones oleosas son adecuadas para propósitos de inyección intraarticular , intramuscular y subcutánea. La preparación de todas estas soluciones bajo condiciones estériles se lleva a cabo fácilmente por técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por aquéllos expertos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo pueden estar en forma adecuada para uso oral, por ejemplo como tabletas, trocizcos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o suaves, o jarabes o elíxires. Las composiciones diseñadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido para la elaboración de composiciones farmacéuticas, y tales composiciones pueden contener uno o más agentes que se seleccionan del grupo que consiste de agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservadores con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente agradables . Las tabletas pueden contener el ingrediente activo en mezcla con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables los cuales son adecuados para la elaboración de tabletas. Para administración oral, se pueden utilizar tabletas que contengan varios excipientes tales como celulosa microcristalina, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dicálcico y glicina junto con diversos desintegrantes tales como almidón (y preferiblemente almidón de maíz, papa o tapioca), ácido algínico y ciertos silicatos complejos, junto con aglutinantes de granulación como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y acacia. Adicionalmente, con frecuencia son muy útiles para propósitos de tableteado agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden utilizar como materiales de relleno en cápsulas de gelatina; los materiales preferidos a este respecto también incluyen lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de peso molecular alto. Cuando se desean para administración oral suspensiones acuosas o elíxires, o ambos, el compuesto activo o la combinación de compuestos se pueden combinar con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, material colorante o tintes y, si así se desea, agentes emulsificantes o que mejoran la suspensión, o ambos, también, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diversas combinaciones similares de los mismos. Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín o como cápsulas de gelatina suave, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva. Los excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio, fosfato de sodio; agentes granulantes y desintegrantes, por ejemplo almidón de maíz o ácido algínico,- agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelación o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden estar sin recubrimiento o se pueden recubrir por técnicas conocidas para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y de esta manera proporcionar una acción sostenida durante un período prolongado. Por ejemplo, se puede utilizar un material de retardo en el tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También se pueden recubrir por técnicas descritas en las patentes de los E.U. Nos. 4,256,108; 4,166,452; y 4,265,874 para formar tabletas terapéuticas osmóticas para liberación controlada o sincronizada. Las suspensiones acuosas pueden contener los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la elaboración de suspensiones acuosas . Tales excipientes incluyen agentes que mejoran la suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidro ipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma acacia,- agentes dispersantes o humectantes los cuales pueden ser fosfátidos que se presentan de manera natural, por ejemplo lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos „ de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxietanol , o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un excitol tal como monooleato de pol ioxie t il ensorbi t ol , o productos de condensación de óxido de etileno con éster parcial derivado de ácidos grasos y anhídridos de excitol, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitano. Tales suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo. Se puede formular una suspensión oleosa al suspender el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Estas composiciones se pueden conservar por la adición de un antioxidante, tal como ácido ascórbico. Los polvos y granulos dispersables son adecuados para la preparación de una suspensión acuosa al mezclarla con agua. Estas composiciones pueden proporcionar el ingrediente activo en mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente que mejora la suspensión y uno o más conservadores. Los dispersantes o agentes humectantes adecuados y los agentes que mejoran la suspensión están ejemplificados por aquéllos mencionados de antemano . Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de oliva o aceite de cacahuate, o un aceite mineral, por ejemplo parafina líquida o mezclas de estos. Los agentes emulsificantes adecuados pueden ser gomas que se presenten de manera natural, por ejemplo goma acacia o goma de tragacanto, fosfátidos que se presenten de manera natural, por ejemplo frijol de soya, lecitina y esteres o éster parcial derivado de ácidos grasos y anhídridos de excitol (por ejemplo monooleato de sorbitano) y productos de condensación de los esteres especiales con óxido de etileno (por ejemplo monooleato de polioxietilen sorbitano) . Se puede preparar un ungüento que contenga las composiciones farmacéuticas de la presente invención, entre otros métodos conocidos en la técnica, al combinar el ingrediente activo con un medio que consiste de un glicol, un alcanol inferior y agua, un agente gelificante y opcionalmente un adyuvante tal como adipato de diisopropilo, sebacato de dietilo, caproato de etilo y laurato de etilo. Los glicoles adecuados incluyen propilenglicol, butilenglicol, polietilenglicol y similares. Generalmente, se utiliza como un agente gelificante un polímero de carboxivinilo preneutralizado con una amina orgánica tal como diisopropilamina y trietilamina o una celulosa (por ejemplo hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa) . Los compuestos y composiciones descritos aquí también se pueden administrar en forma de supositorios para administración rectal del medicamento. Estas composiciones se pueden preparar al mezclar el medicamento con un excipiente adecuado no irritante, el cual es sólido a temperaturas habituales, tales como temperatura ambiente, pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el medicamento. Tales materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles. La cantidad de un compuesto activo o combinación de compuestos que se pueden combinar con los materiales portadores para producir una sola dosificación variarán dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. Las formas de dosificación unitaria generalmente contendrán desde aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 1 g del ingrediente activo. La dosis diaria de los ingredientes activos habitualmente variarán desde entre aproximadamente 1 y aproximadamente 300 mg por kg de peso corporal para la vía oral y de entre aproximadamente 0.1 y 100 mg por kg de peso corporal para administración de infección habitual . La cantidad se puede administrar una vez o dividida en dos o más alícuotas administradas durante el curso de un día. Sin embargo, se comprenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular o sujeto dependerá de varios factores que incluyen la actividad del compuesto específico utilizado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, hora de administración, vía de administración, velocidad de excreción, combinación de medicamento, la duración de la infección viral en el sujeto de que se trate y la gravedad de la infección viral particular que se trate.

Los compuestos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables por cualquier vía efectiva, preferiblemente por una de las tres vías indicadas previamente . Tal administración se puede llevar a cabo en una dosis única o en dosis múltiples. Más particularmente, los agentes terapéuticos novedosos de esta invención se pueden administrar en una amplia variedad de formas de dosificación diferentes, es decir, se pueden combinar con diversos portadores inertes farmacéuticamente aceptables en forma de tabletas, cápsulas, grageas, trocizcos, dulces duros, polvos, aspersiones, cremas, ungüentos, supositorios, jaleas, geles, pastas, lociones, pomadas, suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elíxires, jarabes y similares, como se describe en lo anterior. Los ejemplos que se proporcionan a continuación sirven únicamente para ilsutrar ciertas modalidades de la invención reivindicada y no significa que limiten la invención.

Ejemplo 1 Extracción de agentes antivirales a partir de SM y SY Se preparan como sigue los extractos de plantas de SM y SY: Etapa 1: Se somete a ebullición SY seco en agua destilada Milli-Q (dH20) (18.0 mOhm/cm) y se concentra a una densidad final de 1.30 g/ml. El extracto después se diluye 1:5 con dH20, se centrifuga a 8,000 rpm durante 90 min a 25 °C en un rotor GS-3. El sedimento se desecha y se guarda el sobrenadante. A este sobrenadante se le agrega un décimo de volumen de una solución de HCl 1.0 N para constituir una concentración final de HCl 0.1 N. Este sobrenadante se incuba durante la noche a 25°C. La solución se centrifuga a 8,000 rpm durante 90 min a 25 °C en un rotor GS-3, y el sedimento resultante después se lava con etanol 95% seguido por filtración a través de un sistema de filtro y 0.2 µm. Esto se repite hasta que las soluciones de lavado se vuelven transparentes . El sedimento después se seca en la unidad de filtración a temperatura ambiente seguido por incubación en un horno durante la noche a 70 °C. El polvo se resuspende en dH20 en una relación 1:5 (p/p) de sedimento a agua. El producto resultante después se centrifuga a 25,000 rpm durante 30 min a 25 °C en un rotor Ti45. El sobrenadante se desecha, y el sedimento resultante se resuspende en etanol 50%. Alternativamente, el sobrenadante también se puede resuspender en etanol 50%.

Etapa 2 : La solución resuspendida se filtra para remover los materiales insolubles .

Etapa 3 : La solución filtrada se concentra a un quinto (1/5) del volumen original para formar un precipitado. El sedimento precipitado se lava con agua destilada. El sedimento lavado después se liofiliza durante la noche. El sedimento lavado y seco se denomina como Fracción 1.

Etapa 4 : El polvo seco obtenido de la Etapa 3 se disuelve en metanol 50%. La solución se centrifuga para remover cualquier material insoluble. La solución del sobrenadante se aplica a una columna Sephadex LH-20 equilibrada con agua destilada. La columna se lava extensamente con agua destilada y se eluye con el siguiente orden de soluciones : metanol 15% en agua (v/v) , metanol 30% con ácido acético 1% en agua (v/v) , metanol 40% en agua (v/v) , metanol 50% en agua (v/v) , metanol 75% en agua (v/v) y metanol 100%. El orden de la solución utilizada depende de la solución inicial . La fracción eluida con metanol 50% en agua se concentra y aplica a una columna de CLAP inversa (Ultrasphere ODS, 4.6 x 250 mm, 5 µM) , la cual se equilibra con metanol 10% y ácido fórmico 0.1%. La columna se eluye utilizando un gradiente durante 25 minutos de metanol 10%/ácido fórmico 0.1% y metanol 100%/ácido fórmico 0.1% a 1 ml/min. Los compuestos se detectan al monitorear la absorbancia a 275 nm.

Etapa 5 : La masa molecular de cada fracción eluida de la columna CLAP inversa se analiza por métodos espectroscópicos de masas . El espectro de masas identificó los siguientes compuestos : Los compuestos son de las fórmulas 10 Ácido yunaneico C Ácido yunaneico D #9 Ejemplo 2 Ensayo antiviral: Eficacia de la inhibición viral Ensayo de integrasa VIH-l i n vi tro : Se han desarrollado como se describe en lo siguiente ensayos in vi tro para monitorear la actividad de la integrasa de VIH-l. Estos ensayos utilizan integrasa VIH-l recombinante purificada y sustratos oligonucleotídicos los cuales representan los extremos LTR del ADN viral . La importancia funcional de los datos obtenidos de los ensayos in vi tro se basa en los ensayos que reflejan los eventos funcionales reales los cuales se producen in vi vo . Se han desarrollado ensayos tanto fluorométricos (Lee et al . , Analytical Biochemistry 227: 295-301 (1995)) como radioactivos los cuales mejoran los ensayos in vi tro publicados previamente (Lee et al . , Biochemistry 34: 10205-10214 (1995); Lee et al . , Biochemistry 34: 10215-10223 (1995)). Además, hemos modificado la preparación de enzimas, la cual tiene una calidad mejorada de la muestra de integrasa de VIH-l (Lee and Han, Biochemistry 35: 3837-3844 (1996); Lee et al., Biochemistry 36: 173-180 (1997)). Estas modificaciones del ensayo in vi tro y la preparación de muestras se ha incluido para reflejar mejor los fenómenos que ocurren in vivo . Por lo tanto, los resultados del ensayo in vi tro son elementos de predicción muy útiles de infectividad viral cuando se investigan inhibidores potenciales de integrasa . La actividad de la fracción 1 para inhibir la integrasa de VIH-l se determina como sigue. La fracción 1 se disuelve primero en el volumen apropiado de NH4OH 0.1% (p/v) hasta constituir la concentración final de 15 mg/ml . Después las muestras se centrifugan a 10,000 rpm durante 30 min. Si se forma un sedimento, entonces se remueve el sobrenadante; el sedimento se seca y se vuelve a disolver en NH4OH 0.1%. La solución resultante es la solución concentrada de las fracciones de extracto. A partir de este concentrado, se realizan las siguientes diluciones: 1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 y 1:10,000. Se agregan 1 µl de cada una de estas diluciones a cada mezcla de reacción, lo que corresponde a una concentración final de 75, 15, 7.5, 3.75, 2.5, 1.875, 1.5, 1.25, 1.07, 0.9375, 0.833, 0.75, 0.375, 0.25 0.1875, 0.15 y 0.075 µg/ml, respectivamente. Las pruebas después se llevan a cabo como se ha descrito previamente (Lee et al . , Biochemistry 34: 10205-10214 (1995); Lee et al . , Biochemistry 34: 10215-10223 (1995); Lee y Han (1996)). Para determinar la CI50 y CI90 de cada fracción, se expone gel a una pantalla de PHOSPHORIMAGERH en el intervalo en por ciento determinado por Molecular Dynamics PHOSPHORIMAGERMR. Se determina el por ciento de inhibición al restar el por ciento de separación de cada fracción del por ciento de separación del control positivo y al dividir este valor entre el por ciento de separación del control positivo. Los resultados demuestran que la fracción 1 tiene un CIS0 de 0.2-1.2 µg/ml y una CIgo de 2.5-3.5 µg/ml en el medio de cultivo. En consecuencia, en el mamífero vivo, concentraciones en sangre de hasta aproximadamente 10OX ese nivel se puede tolerar y ser benéficas .

Ejemplo 3 Prueba de los extractos SM in vi tro El modelo de virus de inmunodeficiencia felina (FIV) es un modelo animal aceptado para estudiar medicamentos para uso contra la infección por VIH. FIV es un lentivirus trófico de células T aislado de felinos. FIV recuerda a VIH biológica y bioquímicamente, lo cual incluye una alta homología entre las integrasas de FIV y de VIH. Los gatos infectados con FIV desarrollan el síndrome de inmunodeficiencia adquirida felino (FAIDS) , el cual es similar al SIDA en su gama completa en humanos .

Modelo in vi tro de FIV en cultivo celular : La línea de células de riñon de gato Crandell - Reese ( CrFK) es susceptible a infección por FIV y soporta replicación viral. f Las células CrFK son un medio eficiente para producir virus y realizar ensayos para infección por FIV. Aunque FIV no es citopático para células CrFK infectadas por FIV, están disponibles ensayos diagnósticos para determinar infección por FIV en cultivo de tejido. Los estudios han demostrado la eficacia de SY.

Determinación de la DE50 : Se prueba la fracción 1 para protección de células CrFK a partir de infección por FIV. Por triplicado, se siembran en placas células CrFK a una densidad de 1 x 10s células/matraz T25. Después de incubación durante 24 h para unión de células y crecimiento, las soluciones de los compuestos se aplican a los cultivos celulares durante 24 h. Se producen soluciones al disolver los agentes activos de la invención en amortiguador de fosfato a pH 8 a una concentración de 100 mg/ml, la cual después se centrifuga a 25,000 rpm durante 30 minutos a 25°C en un rotor Ti45. La solución de sobrenadante se remueve, y se reducen por secado tres alícuotas de 1 ml por centrifugación bajo un vacío abierto para determinar la concentración de la solución. El agente activo se reduce por dilución adicionalmente a 2 mg/ml, se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa 0.2 µm y se determina la concentración al determinar la masa del soluto seco en comparación con el control tarado.

Los resultados demuestran que la fracción 1 tiene un intervalo de DES0 entre 0.1 y 1.0 µg/ml y un intervalo de DE90 entre 0.2 y 2.5 µg/ml para prevenir la infección por FIV de células CrFK. Dados estos resultados, las composiciones de la invención se pueden administrar en portadores farmacéuticamente aceptables y se pueden administrar en dosificación suficiente para obtener una concentración en sangre de 10 nM a 1000 nM. Sin embargo, en algunos casos es necesario administrar dosis para obtener una concentración de hasta 10,000 nM en la sangre. Los agentes más activos pueden ser efectivos a una concentración en sangre tan baja como 1 nM.

Ejemplo 4 Conjugación de ácido salvianólico Bajo condiciones alcalinas en ácido salvianólico (Compuesto 1) puede generar tres formas deshidrogenadas adicionales (Compuestos 2-4) . La conjugación de ácido salvianólico y sus derivados (formas deshidrogenadas de ácido salvianólico) a formas diméricas resulta en la formación de varios compuestos cuyas estructuras se muestran. Estas conjugaciones son el resultado de homodímeros o heterodímeros, o ambos, en ácido salvianólico con sus formas deshidrogenadas.

Estos compuestos muestran actividad contra 1 integrasa de VIH-l a concentraciones menores de l µg/ml . Se muestra la estructura base del ácido salvianólico, Compuesto 1, (véase a continuación) : A, B, C y D representan los hidrógenos en los carbonos 24, 27, 35 y 38, respectivamente, del compuesto 1. Estos hidrógenos son los sitios potenciales de conjugación. Por lo tanto, la conjugación del ácido salvianólico a sí mismo (Compuesto 1) , un homodímero, resultará en la formación de las siguientes combinaciones (Compuestos 5-13) : el Compuesto 5 está A conjugado a A (figura 1) ; el Compuesto 6 está A conjugado a B (figura 2) ; el Compuesto 7 está A conjugado a C (figura 3) ; el Compuesto 8 está A conjugado a D (figura 4) ; el Compuesto 9 está B conjugado a B (figura 5) ; el compuesto 10 está B conjugado a C (figura 6) ; el Compuesto 11 está C conjugado a C (figura 7) ; el Compuesto 12 está C conjugado a D (figura 8) ; el Compuesto 13 está D conjugado a D (figura 9) ,- el compuesto 24 está B del Compuesto 1 conjugado a D del compuesto 1 (figura 13) . Las tres formas deshidrogenadas de ácido salvianólico (Compuestos 2-4) que se pueden formar por deshidrogenación en los carbonos 24 y 38, carbonos 24 y 35, y carbonos 27 y 38.

Estas formas tienen las siguientes estructuras de base: Compuesto 2, 24-38 (figura 10) : Compuesto 3, 24-35 (Figura 11): 10 E representa el sitio de conjugación. Compuesto 4, 27-38 (figura 12) : 15 25 F representa el sitio de conjugación.

Las formas deshidrogenadas de ácido salvianólico (Compuestos 2-4) pueden formar homodímeros . Esto significa que el Compuesto 3 se puede conjugar consigo mismo en el sitio E para formar el Compuesto 14, y el Compuesto 4 se conjuga consigo mismo en el sitio F para formar el Compuesto 15. Estas formas deshidrogenadas también pueden formar heterodímeros con ácido salvianólico. Los heterodímeros potenciales que se forman son A de Compuesto 1 conjugado con E del Compuesto 3 para formar el Compuesto 16; B del Compuesto 1 conjugado con el E del Compuesto 3 para formar el Compuesto 17; C del Compuesto 1 conjugado con E del Compuesto 3 para formar el Compuesto 18; D del Compuesto 1 conjugado con E del Compuesto 3 para formar el Compuesto 19; F del Compuesto 4 conjugado con A del Compuesto 1 para formar el Compuesto 20; F del Compuesto 4 conjugado con B del Compuesto 1 para formar el Compuesto 21; F del Compuesto 4 conjugado con C del Compuesto 1 para formar el Compuesto 22; y F del Compuesto 4 conjugado con D del Compuesto 1 para formar el Compuesto 23. Además de estos dímeros, es posible formar trímeros y polímeros más grandes de estas especies. Las variaciones en la estructura de estos compuestos se conocerán por aquéllos expertos en la técnica. También se considera que estos compuestos se pueden modificar para contener grupos acetilo, esteres, anhídridos o sales farmacéuticamente aceptables del Compuesto.

Ejemplo 5 Activación dependiente del tiempo de la actividad antiintecrrasa como resultado de conjugación Se purifica el Compuesto 1 del Ejemplo 4 y se confirma por espectrometría de masas y por RMN. El Compuesto 1 después se incuba con NH40H 0.1% durante varios períodos de tiempo (5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h y 24 h) a una concentración de 5 mg/ml . Las reacciones se detienen por la adición de ácido acético 1% y se realizan ensayos para determinar la actividad contra la integrasa de VIH-l. Los resultados demuestran que existe una activación dependiente del tiempo de las fracciones como un resultado de la incubación en NH40H 0.1%. Esta activación es el resultado de varias conjugaciones del Compuesto 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3 : TABLA 3 Se incubaron compuestos purificados que tienen un peso molecular de 492 (por ejemplo, los compuestos 2-4 como se describe antes) con NH40H 0.1% por diversos períodos de tiempo (5 min, 30 min, l h, 1.5 h, 2.0 h y 3.0 ) a una concentración de 5.0 mg/ml . Las reacciones se detienen por la adición de ácido acético 1% y se realizan ensayos para determinar la actividad contra integrasa de VIH-l. Los resultados demuestran que existe una activación dependiente del tiempo de los Compuestos 2-4 como un resultado de la incubación en NH40H 0.1%. Sin embargo, esta activación no es tan grande como las conjugaciones con el Compuesto 1. En la Tabla 4 se muestran los resultados : TABLA 4 Ejemplo 6 Actividad contra integrasa de VIH del Compuesto 1 activado Se incuban 0.8 g del Compuesto 1 del Ejemplo 4 en 80 ml de NH40H 0.1% hasta una concentración final de 10 mg/ml durante 8 h. Esta fracción activada después se aplica a una columna SEPHADEXHR LH20 y se eluye con concentraciones cada vez mayores de metanol en agua. Las fracciones eluidas se liofilizan y se realizan ensayos para determinar actividad contra integrasa de VIH-l. En la Tabla 5 se muestran los resultados : TABLA 5 La muestra de 50%, la cual tiene la mejor actividad, después se analiza por espectrometría de masas . El espectro de masas muestra dos picos principales de 492 y 986. Estos picos corresponden a un monómero de ácido salvianólico y un dímero de ácido salvianólico, indicando que estas especies representan los principios activos antivirales. Por lo tanto, estos resultados sugieren que el agente antiviral activo responsable de la inhibición de integrasa es el ácido salvianólico o su forma dimérica, o ambos. Se evalúa la eficacia de estas fracciones contra la infección por VIH-l utilizando células CEMTART. Estas células se someten a ingeniería a partir de CEM como se describe en el Ejemplo 8. Se utiliza el ensayo de captura de antígeno p24 de VIH como se describe en el Ejemplo 8. Los resultados se discuten en la Tabla 6 a continuación: TABLA 6 Ejemplo 7 Actividad contra interrasa de VIH-l Se disuelve la fracción 1 del Ejemplo 1 en 40% de metanol (en agua) y se centrifuga durante 30 min a 8,000 rpm en un rotor GSA. Se carga la fracción de sobrenadante en una columna SEPHADEXMR LH20 equilibrada en metanol 40% (en agua) . La columna se lava con una solución de metanol 40% (en agua) y se eluye con 50, 60, 70, 80 y 90% de solución de metanol (en agua) . Las muestras después se liofilizan y disuelven en el volumen apropiado de metanol para constituir la concentración concentrada final de 5 mg/ml . Estas fracciones después se ensayan para determinar la actividad contra integrasa VIH-l. Las concentraciones ensayadas fueron de 5, 2.5, 2, 1.5, 1.25, 1, 0.8, 0.6, 0.4, y 0.2 µg/ml. Se determina el por ciento de inhibición al restar el por ciento de separación de cada fracción del por ciento de separación del control positivo y al dividir este valor entre el por ciento de separación del control positivo.

TABLA 7 Resultados del ensayo de actividad de integrasa VIH-l in vi tro Se combinan las fracciones de la columna de SEPHADEXMR LH20 de 60-80% y se disuelven en 40% de metanol en agua. La muestra resuspendida se centrifuga durante 30 min a 8,000 rpm en un rotor GSA. La solución sobrenadante se aplica a una columna MCI GEL CHP20P (75-150 µ) equilibrada con metanol 40% en agua. La columna se lava con metanol 40% en agua y se eluye con 50, 60 y 70% de metanol en agua. La muestra después se liofiliza y ensaya como se describe previamente bajo diversas condiciones .

TABLA 8 Resultados del ensayo de actividad de integrasa VIH-l ín vi tro Las muestras de MCI GEL CHP20P (75-150 µ) después se analizan por análisis de espectrometría de masas (modo negativo) . Los resultados muestran que MCI 40 tiene un pico mayor de 986 con un pico menor de 494. MCI 50 tiene picos mayores de 492 y 986. MCI 60 tiene picos mayores de 984 y 986. Se ha determinado que el pico 494 representa ácido salvianólico se ha determinado por espectrometría de masas y RMN. El pico 492 representa la forma deshidrogenada de ácido salvianólico. El pico 986 representa una forma dimérica de ácido salvianólico. El pico 984 representa el dímero mixto de 492 y 494. Estos resultados indican que los principios activos de la fracción 1 son un compuesto que tiene un peso molecular de 984 o 986. Estos datos experimentales sugieren que los compuestos diméricos de peso molecular 984 y 986 se generan a partir del Compuesto 1.

E emplo 8 Ensayo de la actividad contra VIH-l de un agente activo Se evalúa con células - CEMTART la eficacia de las fracciones MCI GEL CHP20P (75-150 µ) contra infección por VIH-l. Estas células se someten a ingeniería a partir de células CEM y que expresan constitutivamente los genes VIH-l tat y rev. Las células CEMTAT proporcionan un sistema seguro para determinar infección por VIH pues se han sometido a ingeniería para ser reproductivas para una forma de replicación no competente de VIH-l, viH?tat/rev. Se evalúa la eficacia de los compuestos para inhibir infección por VIH-l utilizando un ensayo de captura de antígeno p24 VIH. Este ensayo utiliza un anticuerpo monoclonal de proteína de núcleo p24 recubierto en placas de 96 pozos en las cuales el medio de cultivo celular o el suero se incuba durante 2 h. Se remueven los sobrenadantes de las células por lo menos una semana después de la infección con VIH?t t rev. Las células se lavan antes de la adición de un anticuerpo policlonal biotinado a VIH-l p24. Después de la adición del sustrato para amplificación de señal, la expresión de p24 se cuantifica directamente en relación a un estándar conocido . Se disuelven MCI 40, 50 y 60 en metanol, y se determina la capacidad de estos compuestos para inhibir la infección por VIH-l en las siguientes concentraciones: 100, 20, 10, 5 y 1 µg/ml. A recipientes de cultivo de tejido de 24 pozos, se agregan 2 ml de 3.33 x 104 células CEMTART junto con las concentraciones de prueba del Compuesto. A esto se le agregan 5000 TCDISO/106 células de inoculo de VIH-l. El medio de cultivo se cambia dos veces a la semana de manera que se resuspenden 0.8 ml de sucesión celular en 2 ml de medio de sustitución. Los sobrenadantes libres de células después se ensayan para determinar la presencia de p24. Posteriormente se evalúa la eficacia contra VIH-l al comparar la producción de antígeno p24 VIH-l en presencia y ausencia de medicamento agregado después de 7 y 10 días. Los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10 : TABLA 9: Día 7 TABLA 10: Día 10 Todas las referencias a las que se hace mención en lo anterior se incorporan en la presente como referencia. También se incorporan como referencia la solicitud parental, solicitud de los E.U. No. 09/104,363 presentada el 25 de junio de 1998. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (56)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para tratar o prevenir una infección viral, caracterizado porgue se lleva a cabo por administración de una composición que contiene una cantidad efectiva inhibidora viral de por lo menos un agente activo que tiene por lo menos una porción de las fórmulas : en donde R1 es -OH, -O- o un enlace; R2 es -H o un enlace; R3 es -OH o -0-; R4 es un enlace o -R-en donde R5 es -OH o un enlace; R6 es -H o un enlace; y R7 es -H o un enlace, el agente activo tiene un peso molecular mayor de 190 unidades daltons.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente activo tiene por lo menos una porción de la fórmula: y por lo menos una porción de la fórmula

3. El método de conf ormidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente activo es un dímero, trímero, tetrámero o polímero mayor de tales porciones.

4. El método de conf ormidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los agentes activos se eligen de entre ácido D- (2, 3 -dihidroxif enil) láctico, ácido rosemarínico, ácido 2 - (3 , 4-dihidroxif eniletenil) cafeico, litospermato B, litospermato B de magnesio, dímeros de ácido 2- (3, 4 -dihidroxif eniletenil) cafeico o

5. El método de conf ormidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la infección viral es causada por un virus de hepatitis, ort omixovi rus , papilomavirus, paramixovirus, picornavirus, poliomavirus o retrovirus .

6. El método de conf ormidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el retrovirus es VIH o FIV.

7. El método de conf ormidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la infección viral es causada por un virus que produce integrasa o una proteína la cual tiene actividad de integrasa .

8. El método de conf ormidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición se administra por vía intranasal, oral, transdérmica, parenteral, intratecal o intravenosa .

9. Un método para tratar a un sujeto o para prevenir una infección viral mediante la administración a un sujeto en necesidad del mismo de una composición que comprende una cantidad efectiva inhibidora viral de dos o más agentes activos y por lo menos dos de tales agentes comprenden por lo menos una de las siguientes fórmulas : en donde R1 es -OH, -O- o un enlace ,- R2 es -H o un enlace ,- R3 es -OH o -O- ,- R4 es un enlace o en donde Re es -OH o un enlace; R6 es -H o un enlace,- y R7 es -H o un enlace, tales agentes activos tienen un peso molecular de más de 190 unidades daltons.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porgue el agente activo es un dímero, trímero, tetrámero o polímero más grande de tales porciones .

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los agentes activos se eligen de entre ácido D- (2 , 3 -dihidroxifenil) láctico, ácido rosemarínico, ácido 2- (3 , 4-dihidroxifeniletenil) cafeico, litospermato B, litospermato B de magnesio, dímeros de ácido 2- (3, 4-dihidroxifeniletenil) cafeico, o

12. E l mé t odo de c onf o rmi dad c on l a reivindicación 9, caracterizado porque la infección viral es causada por un virus de hepatitis, or t omixovirus , papilomavirus, paramixovirus, picornavirus, poliomavirus o retrovirus .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el retrovirus es VIH o FIV.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la infección viral es causada por un virus que produce integrasa o una proteína la cual tiene actividad de integrasa.

15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la composición se administra por vía intranasal, oral, transdérmica, parenteral, intratecal o intravenosa.

16. Una composición antiviral, caracterizada porque comprende dos o más agentes activos, en donde los agentes activos contienen por lo menos una de las siguientes porciones : en donde R1 es -OH, -O- o un enlace ; R2 es - H o un enlace ,- R3 es -OH o -0- ; R4 es un enlace o -?G en donde R5 es -OH o un enlace,- R6 es -H o un enlace; y R7 es -H o un enlace, tales agentes activos tienen peso molecular de más de 190 unidades daltons; en donde tal composición es capaz de inhibir una infección viral cuando se administra a un sujeto en necesidad de la misma.

17. Un método para identificar agentes antivirales a partir de plantas del género Silvia, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) extraer un agente activo de la planta que comprende uno de cualquiera de las siguientes porciones o un conjugado de tal porción en donde R1 es -OH, -O- o un enlace ,- R2 es -H o un enlace ; R3 es -OH o -0- ; R4 es un enlace o -R/ en donde R5 es -OH o un enlace,- R6 es -H o un enlace,- R7 es -H o un enlace; y (b) combinar el primer agente activo con un segundo agente activo que comprende una porción o un conjugado del mismo no representado por el primer agente activo,- y (c) realizar un ensayo para determinar la combinación del primer agente activo y el segundo agente activo para actividad antiviral .

18. Un producto de conjugación el cual es un homopolímero o heteropolímero de unidades monoméricas de ácido salvianólico o formas deshidrogenadas de ácido salvianólico, tal producto de conjugación tiene un peso molecular de aproximadamente 492 o mayor, o derivados acetilo, éster o anhídrido del mismo, o sales farmacéuticamente aceptables del mismo .

19. El producto de conjugación, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 492 hasta aproximadamente 986.

20. El producto de conjugación, de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque tiene un peso molecular de aproximadamente 492.

21. El producto de conjugación, de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque tiene un peso molecular de aproximadamente- 984.

22. El producto de conjugación, de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque tiene un peso molecular de aproximadamente 986.

23. El producto de conjugación, de conformidad con lal reivindicación 19, caracterizado porque es un homopolímero o heteropolímero de unidades monoméricas de ácido salvianólico o formas deshidrogenadas II o III de ácido salvianólico, o ambas, el ácido salvianólico tiene la estructura: y las formas deshidrogenadas de ácido salvianólico tienen las estructuras : (II) en donde R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son hidrógeno o un enlace, y las unidades monoméricas de tales homopolímeros o heteropolímeros están unidas entre sí por R1, R2, R3, R4, R5 y R6.

24. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es un homodímero.

25. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque las unidades monoméricas están unidas por un enlace el cual es R1-R1, R2-R2, R3-R3, R4-R4, R5-R5, o R6-R6.

26. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque las unidades monoméricas se unen por un enlace el cual es R^R2, R^R3, R1-R4, R2-R3, R2-R4, o R3-R4.

27. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es un heterodímero.

28. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las unidades monoméricas se unen por un enlace el cual es R1-R5, R2-R5, R3-R5, o R4-R5.

29. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las unidades monoméricas se unen por un enlace el cual es R^R6, R2-R6, R3-R6, R4-R6, o R5-R6.

30. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un homotrímero.

31. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un heterotrímero.

32. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un homopolímero de cuatro o más unidades monoméricas .

33. El producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un heteropolímero de 4 o más unidades monoméricas .

34. Un método para tratar o prevenir una infección viral al administrar una composición que contiene una cantidad efectiva inhibidora viral de un producto de conjugación de conformidad con la reivindicación 18.

35. El método de -conf ormidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el producto de conjugación es un homodímero, heterodímero, homotrímero o heterotrímero .

36. El método de conf ormidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la infección viral es causada por un virus de hepatitis, or t omixovi rus , papilomavirus, paramixovirus, picornavirus, poliomavirus o retrovirus .

37. El método de conf ormidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el retrovirus es VIH o FIV.

38. El método de conf ormidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la infección viral es causada por un virus que produce integrasa o una proteína la cual tiene actividad de integrasa.

39. El método de conf ormidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el producto de conjugación se administra por vía intranasal, oral, transdérmica, parenteral, intratecal o intravenosa.

40. Un método para elaborar un agente antiviral caracterizado porque comprende incubar ácido salvianólico a un pH alcalino de manera que se forman homopolímeros o heteropolímeros los cuales poseen mayor actividad antiviral que es ácido salvianólico.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque los homopolímeros o heteropolímeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 492 o mayor.

42. El método de conf ormidad con la reivindicación 40, caracterizado porque los homopolímeros o heteropolímeros tienen un peso molecular que varía desde aproximadamente 492 hasta aproximadamente 986.

43. El método de conf ormidad con la reivindicación 42, caracterizado porque los homopolímeros o heteropolímeros tienen un peso molecular de aproximadamente 492.

44. El método de. conf ormidad con la reivindicación 42, caracterizado porque los homopolímeros o heteropolímeros tienen un peso molecular de aproximadamente 984.

45. El método de conf ormidad con la reivindicación 42, caracterizado porque los homopolímeros o heteropolímeros tienen un peso molecular de aproximadamente 986.

46. El método de conf ormidad con la reivindicación 42, caracterizado porque los homopolímeros o heteropolímeros comprenden unidades monoméricas de ácido salvianólico o formas deshidrogenadas II o III de ácido salvianólico, o ambas, el ácido salvianólico tiene la estructura: y las formas deshidrogenadas de ácido salvianólico tienen las estructuras : (II) en donde R1, R2, R3, R4, Rs y Rs son hidrógeno o un enlace, y las unidades monoméricas de tales homopolímeros o heteropolímeros están unidas entre sí por R1, R2, R3, R4, R5 y R6.

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque se forma un homodímero.

48. El método de conf ormidad con la reivindicación 47, caracterizado porque las unidades monoméricas se unen por un enlace el cual es R1-R1, R2-R2, R3-R3, R-R4, Rs-Rs, o R6-R6.

49. El método de conf ormidad con la reivindicación 47, caracterizado porque las unidades monoméricas se unen por un enlace el cual es R^R , R^R3, R^R34, R2-R3, R2-R\ o R3-R4.

50. E l mé t odo de conf ormi dad con l a reivindicación 46, caracterizado porque se forma un heterodímero .

51. El método de conf ormidad con l a reivindicación 50, caracterizado porque las unidades monoméricas se unen por un enlace el cual es R1-R5, R2-R5, R3-R5, o R4-Re.

52. El mé t odo de c onf ormidad c on l a reivindicación 40, caracterizado porque las unidades monoméricas se unen por un enlace el cual es R1-Re, R2-R6, R3-R6, R4-Re, o R5-R6.

53. El mét odo de conf ormidad con l a reivindicación 50, caracterizado porque se forma un homotrímero.

54. El mé t odo de c onf ormi ad c on l a reivindicación 40, caracterizado porque se forma un heterotrímero .

55. El método de conf ormidad con la reivindicación 40, caracterizado porque se forma un homopolímero de cuatro o más unidades monoméricas.

56. El método de conf ormidad con la reivindicación 40, caracterizado porque se forma un heteropolímero de cuatro o más unidades monoméricas.