MXPA00011401A - Composiciones de biopolimero de polimero de polihidroxialcanoato. - Google Patents
Composiciones de biopolimero de polimero de polihidroxialcanoato.Info
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Abstract
Varias composiciones del polimero de PHA novedosas producidas usando los sistemas biologicos incluyen monomeros tales como 3-hidroxibutirato, 3-hidroxipropionato, 2- hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato y 5-hidroxivalerato. Estas composiciones de PHA pueden extenderse facilmente para incorporar monomeros adicionales incluyendo, por ejemplo, 3-hidroxihexanoato, 4-hidroxihexanoato, 6- hidroxihexanoato u otros 3-hidroxiacidos de cadena mas larga y que contienen siete o mas atomos de carbono. Esto se puede lograr tomando productores de PHA naturales y mutandose a traves de mutagenesis quimica o de transposicion para suprimir o inactivar los genes que codifican las actividades indeseables. Alternativamente, las cepas pueden disenarse geneticamente para expresar solamente estas enzimas requeridas para la produccion de la composicion del polimero deseado. Los metodos para disenar geneticamente los microbios que producen PHA son conocidos extensamente en la tecnica (Huisman y Madison, 1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63: 21-53). Estos polimeros tienen una variedad de usos en areas medicas, industriales y otras areas comerciales.
Description
"COMPOSICIONES DE BIOPOLIMERO DE POLIHIDROXIALCANOATO"
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Esta solicitud reclama prioridad para la Patente de los Estados Unidos Número de Serie 60/086,396 presentada el 22 de Mayo de 1998. Numerosos microorganismos tienen la capacidad de acumular las reservas intracelulares de los polimeros de PHA. Los poli [ (R) -3-hidroxialcanoatos] (PHAs) son materiales termoplásticos biodegradables y biocompatibles, producidos de recursos renovables, con una amplia escala de aplicaciones industriales y biomédicas (Williams and Peoples, 1996, CHEMTECH 26, 38-44) . Se han incorporado en los polímeros de PHA alrededor de 100 monómeros diferentes, como se ha dado a conocer en la literatura (Steinbüchel and Valentín, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 128; 219-228) y la biología y genética de su metabolismo se ha revisado recientemente (Huisman and Madison, 1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 6_3: 21-53) . Hasta la fecha, los PHA han visto disponibilidad comercial limitada, con solamente los copolímeros de poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV) quedando disponibles en cantidades de desarrollo. Este copolímero se ha producido mediante fermentación de la bacteria
Ral stonia eutropha . La fermentación y proceso se recuperarán para otros tipos de PHA también se han desarrollado usando una escala de bacterias incluyendo Azotobacter r Alcaligenes latus, Comamonas testosterone y E. coli y Kl ebsiella genéticamente diseñadas y se han revisado recientemente (Braunegg y otros, 1998, Journal of Biotechnology 65: 127-161; Choi and Lee, 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 5_1: 13-21). Se han también examinado los enfoques de síntesis de polímero más tradicionales incluyendo la condensación directa y polimerización de apertura de anillo de las lactonas correspondientes (Jesudason and Marchessault, 1994, Macromolecules 27: 2595-2602) . La síntesis de los polímeros de PHA que contienen el monómero 4-hidroxibutirato (PHB4HB, Doi, Y. 1995, Macromol. Symp. 98, 585-599) o 4-hidroxivalerato y 4-hidroxihexanoato que contienen poliésteres de PHA se han descrito (Valentín y otros, 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 507-514 y Valentín y otros, 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 4^3, 710-716). Estos poliésteres se han fabricado usando métodos similares a aquel descrito originalmente para PHBV, en donde los microorganismos son alimentados de un material de alimentación que no contiene carbohidrato relativamente costosos a fin de forzar la incorporación del monómero en el poliéster de PHA. Los
copolímeros de PHB4HB se pueden producir con una escala de composiciones de monómero que de nuevo proporciona una escala de polímero (Saito, Y, Nakamura, S., Hiramitsu, M. y Doi, Y., 1996, Polym. Int. 39: 169). Los copolímeros de PHA de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato también se han descrito (Shimamura y otros, 1994, Macromolecules 27: 4429-4435; Cao y otros, 1997, Macromol. Chem. Phys. 198: 3559-3557). El nivel más elevado de 3-hidroxipropionato incorporado en estos copolímeros es de 88 por ciento molar (Shimamura y otros, 1994, Macromolecules 2_7: 4429-4435. Los terpolímeros de PHA que contienen 4-hidroxivalerato se ha producido alimentando una cepa de Pseudomonas putida genéticamente diseñada en 4-hidroxivalerato o el ácido levulínico que dio por resultado un PHA de tres componentes, el Poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-4-hidroxi alerato)
(Valentín y otros, 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:
507-514; Steinbüchel y Gorenflo, 1997, Macromol. Symp. 123: 61-66) . Es deseable desarrollar sistemas biológicos para producir polímeros de dos componentes que comprende 4-hidroxivalerato o el poli (4-hidroxivalerato) homopolímero. Los resultados de Steinbüchel y Gorenflo (1997, Macromol. Symp. 123: 61-66) indican que Pseudomonas putida tiene la
capacidad de convertir el ácido levulínico en 4-hidroxivalerato . Hein y otros (1997) trataron de sintetizar el poli-4HV usando la cepa transgénica de Escheri chia coli XLl-Azul pero no tuvieron éxito. Estas celdas llevadas a un plásmido que permitía la expresión de la sintasa de PHA A. eutrophus y los genes de transferasa Clostridi um kl uyveri 4-hidroxibutiril-CoA. Cuando los E. coli transgénicos se alimentaron de 4HV, D-valerolactona, o ácido levulínico, produjeron solamente una cantidad pequeña del hompolímero de PHB. Es claramente deseable debido a razones industriales ser capaces de producir una escala del homopolímero de PHA definido, el polímero y composiciones de terpolímero. Para lograr esto, es deseable ser capaz de controlar la disponibilidad de enzimas individuales en las trayectorias biosintéticas de PHA correspondientes. Por lo tanto un objeto de la presente invención es proporcionar una escala de homopolímero de PHA definido, copolímero y composiciones de terpolímero. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método y materiales para controlar la disponibilidad de las enzimas individuales en las trayectorias biosintéticas de PHA correspondientes.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Varias composiciones del polímero de PHA novedosas producidas usando sistemas biológicos incluyen monómeros tales como 3-hidroxibutirato, 3-hidroxipropionato, 2-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato y 5-hidroxivalerato . Estas composiciones de PHA pueden extenderse fácilmente para incorporar monómeros adicionales incluyendo, por ejemplo, 3-hidroxihexanoato, 4-hidroxihexanoato, 6-hidroxihexanoato u otros 3-hidroxiácidos de cadena más larga que contienen siete o más átomos de carbono. Esto se puede lograr tomando los productores de PHA naturales y mutándose a través de mutagénesis química o transposición para suprimir o inactivar los genes que codifican las actividades indeseables. De manera alternativa, las cepas se pueden diseñar genéticamente para expresar solamente aquellas enzimas requeridas para la producción de la composición de polímero deseada. Los métodos para diseñar genéticamente los microbios que producen PHA son extensamente conocidos en la técnica (Huisman y Madison, 1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63 : 21-53) . Estos polímeros tiene una variedad de usos en áreas médicas, industriales y otras áreas comerciales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una vista esquemática de la trayectoria desde el ácido levulínico hasta poli-4-hidroxivalerato. La Figura 2 es una vista esquemática de una construcción del plásmido pFSld, que incluye el gen lacl
(inductor), el gen de resistencia de ampicilina, y el gen hbcT . La Figura 3 es una vista esquemática de una construcción del plásmido pFS30, que incluye el gen lacl
(inductor) , gen de resistencia a ampicilina, gen de polimerasa de polihidroxialcanoato (phaC) , y gen hbcT .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se han producido varias composiciones de polímero de PHA novedoso usando sistemas biológicos para incorporar los monómeros tales como 3-hidroxibutirato, 3-hidroxipropionato, 2-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato y 5-hidroxivalerato . Estas composiciones de PHA pueden fácilmente extenderse para incorporar monómeros adicionales, incluyendo, por ejemplo, 3-hidroxihexanoato, 4-hidroxihexanoato, 6-hidroxihexanoato u otros 3-hidroxiácidos de cadena más
larga que contienen siete o más átomos de carbono. Las técnicas y procedimientos para diseñar organismos transgénicos que sintetizan los PHA que contienen uno o más de estos monómeros ya sea como el único constituyente o como un co-monómero se han desarrollado. En estos sistemas, el organismo transgénico es ya sea una bacteria v.g., Escheri chia coli , K. pneumoniae, Ral stonia eutropha (anteriormente Alcaligenes eutrophus) , Alcaligenes latus u otros microorganismos capaces de sintetizar los PHA, o una planta superior o componente de planta, tal como la semilla de un cultivo de aceite (Brassica, de girasol, frijol de soya, maíz, cártamo, lino, plantas que acumulan palma o coco o almidón (patata, tapioca, yuca) . Es crucial para la síntesis de PHA eficiente en las cepas de E. coli recombinantes que la expresión de todos los genes involucrados en la trayectoria sean adecuados. Para este fin, los genes de interés se pueden expresar de moléculas de ADN extracromosomales, por ejemplo plásmidos, que resultan intrínsicamente en un efecto de número de copia y consecuentemente niveles de expresión superiores, o, de mayor preferencia, se pueden expresar de la cromosoma. Para fermentaciones a gran escala de los productos de tipo de comodidad se sabe generalmente que los sistemas a base de plásmido son insatisfactorios debido a la carga extra de mantener los plásmidos y los problemas de
la expresión estable. Estas inconveniencias pueden superarse usando enzimas codificadas cromosomalmente mejorando las señales de transcripción y de traslación que anteceden al gen de interés, de tal manera que las expresión es suficiente y estable. Los sistemas biológicos deben expresar una o más enzimas como se requieren para convertir los monómeros en polímeros. Los substratos apropiados incluyen 3-hidroxibutirato, 3-hidroxipropionato, 2-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato, 5-hidroxivalerato, 3-hidroxihexanoato, 4-hidroxihexanoato, 6-hidroxihexanoato y otros 3-hidroxiácidos de cadena más larga que contienen siete o más átomos de carbono. Estas enzimas incluyen la sintasa de polihidroxialcanoato, transferasa de acilo-CoA y transferasa de hidroxiacilo CoA, y la sintetasa de hidroxiacilo CoA. Estas enzimas pueden usarse con estos substratos para producir un sistema biológico tal como una bacteria, levadura, hongos o plantas, un polímero tal como poli (3-hidroxibutirato-co-4-hidroxivalerato) , poli (4-hidroxivalerato) , poli (3-hidroxipropionato-co-5-hidroxivalerato) , poli (2-hidroxibutirato) , poli (2-hidroxibutirato-co-3-hidroxibutirato) , y poli (3-hidroxipropionato) . Los genes que codifican las enzimas requeridas pueden adquirirse de fuentes múltiples. Las Patentes
Norteamericanas Números 5,798,235 y 5,534,432 concedidas a Peoples, y otros, describen la sintetasa, reductasa y tiolasa de polihidroxialcanoato . Un gen de transferasa de 4-hidroxibutirilo CoA de C. aminobutyri cum se describe en Willadsen y Buckel, FEMS Microbiol. Lett. (1990) 70: 187-192) o de C. kl uyveri que se describe por Sóhling y Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178, 871-880) . Una sintetasa de co-enzima A de acilo de Neurospora crassa se describe por Hii y Courtright, J. Bacteriol. 1982. 150(2), 981-983. Una transferasa de hidroxiacilo de Clostridium se describe por Hofmeister y Bucker, Eur. J. Biochem. 1992, 206(2), 547-552. Es importante para producción de PHA eficiente que las cepas no pierdan la capacidad de sintetizar el biopolímero a través de la duración del tren del inoculo y la etapa de producción. La pérdida de cualesquiera de los genes pha da por resultado la pérdida del producto. Ambos son indeseables y la propagación estable de la cepa por lo tanto se requiere. Integrando solamente el gen que codifica la transferasa o la sintasa puede no dar por resultado una producción de polímero significativa. La expresión de enzima puede mejorarse a través de la alteración de la región promotora o mutagénesis u otras técnicas conocidas, seguida por tamizado de la producción del polímero. El crecimiento y morfología de estos
productores de PHA recombinantes no se comprometen mediante la presencia de los genes pha en la cromosoma. La presente invención se comprenderá además hacieneo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1. Poli (3HB-co-4HV) de 4-hidroxivalerato y glucosa en E. coli Construcción de pFSlß. El plásmido pTrcN es un derivado de pTrc99a
(Pharmacia; Uppsala, Suecia) ; la modificación que distingue el pTrcN es la remoción del sitio de restricción Ncol, mediante digestión con Ncol, tratamiento con polimerasa de
T4 ADN, y auto-ligazón. El gen orfZ que codifica la transferasa de 4-hidroxibutiril-CoA de Clostridi um kl uyveri se amplificó usando la reacción de cadena de polimerasa
(PCR) y un estuche de Perkin Elmer (Foster City, CA) usando el plásmido pCK3 (Sohling y Gottschalk, 1996, J. Bacteriol.
(178: 871-880) como el ADN de blanco y las siguientes cargas iniciadoras de oligonucleótido: 5'- TCCCCTAGGATTCAGGAGGTTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAG -3' { orfZ 5' AvrII)
5'-CCTTAAGTCGACAAATTCTAAAATCTCTTTTTAAATTC - 3' ( orfZ 3' SaiI) El producto de PCR resultante se digirió con Avrll y Salí y se ligó a pTrcN que se ha digerido con Xbal (que es compatible con ?vrll) y Salí para formar el plásmido pFSld de tal manera que la transferasa de 4-hidroxibutirilo-CoA se puede expresar de IPTG (isopropil-ß-D-glucopiranosida) -el trcpromotor inducible. Construcción de pFS30 El plásmido pFS30 se derivó de pFSld añadiendo el gen de la sintasa de PHA Ralstonia eutropha PHA (phaC) (Peoples y Sinskey, 1989. J. Biol. Chem. 2_64: 15298-15303) que se ha modificado mediante adición de un sitio de ligazón de ribosoma E. coli intenso como se describe por (Gerngross y otros, 1994. Biochemistry 33: 9311-9320). El plásmido pAeT414 se digirió con Xmal y Stul de manera que el promotor R. eutropha y el gen phaC estructural estaban presentes en un fragmento. El pFS16 se cortó con BamHl, se trató con polimerasa de T4 de ADN para crear extremos romos, luego se digirió con Xmal. Los dos fragmentos de ADN obtenidos de esta manera se ligaron juntos para formar pFS30. En esta construcción, la sintasa de PHB y transferasa de 4-hidroxibutirilo-CoA se expresaron del promotor A. eutrophus phbC (Peoples y Sinskey, 1989, J. Biol. Chem. 264: 15298-15303). Otros plásmidos apropiados
que expresan la sintasa de PHB y transferasa de 4-hidroxibutirilo-CoA se han descrito (Hein y otros, 1997, FEMS Microbiol. Lett. 153: 411-418; Valentín y Dennis, 1997, J. Biotechnol 5_8:33-38). E1 E. coli MBX769 tiene una sintasa de PHA integrada en su cromosoma. Esta cepa es capaz de sintetizar el poli (3-hidroxibutirato) (PHB) de glucosa sin genes extracromosomales presentes. MBX769 también es deficiente en fadR, el represor de la trayectoria de degradación de ácido graso y efector de muchas otras funciones celulares, es deficiente en rpoS, un regulador de la expresión del gen de fase estacionaria, y es deficiente en atoA, una subunidad de la transferasa de acetoacetilo-CoA. MBX769 expresa también a toC, un regulador positivo del sistema de acetoacetato, constitutivamente. E. coli MBX769 que lleva el plásmido pFS16 (Figura 2), que permitió la expresión de la transferasa de Cl ostridi um kl uyveri 4-hidroxibutirilo-CoA, se precultivó a 37°C en 100 mililitros del medio LB que contiene 100 µ gramos por mililitro de ampicilina de sodio en un matraz Erlenmeyer de capacidad de 250 mililitros con agitación a 200 revoluciones por minuto. Las celdas se centrifugaron a 5000 gramos durante 10 minutos para removerlas del medio LB después de 16 horas, y se resuspendieron en 100 mililitros del medio que contiene, por litro: 4.1 o 12.4 gramos de
4-hidroxivalerato de sodio (4HV) ; 5 gramos por litro de 4-hidroxibutirato de sodio (4HB) ; 2 gramos de glucosa; 2.5 gramos de polvo de caldo LB (Difco; Detroit, Mich.); 50 milimoles de fosfato de potasio, pH de 7; 100 µgramos por mililitro de ampicilina de sodio; y 0.1 milimol de isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG). El 4-hidroxivalerato de sodio se obtuvo mediante saponificación de ?-valerolactona en una solución de hidróxido de sodio. Las celdas se incubaron en este medio durante 3 días con agitación a 200 revoluciones por minuto a 32°C en el mismo matraz en donde se habían precultivado. Cuando 4.1 gramos por litro del 4-hidroxivalerato de sodio estaban inicialmente presentes, las celdas acumularon un polímero a 52.6 por ciento del peso de la celda seca que consistía de 63.4 por ciento de unidades de 3HB y 36.6 por ciento de unidades de 4HB pero ningunas unidades de 4HV. Cuando estaban inicialmente presentes 12.4 gramos por litro de 4HB de sodio, las celdas acumularon un polímero hasta 45.9 por ciento del peso de la celda seca que consistía de 95.5 por ciento de unidades 3HB y 4.5 por ciento de unidades de 4HV pero ningunas unidades de 4HB detectables. La identidad del polímero de PHB-co-4HV se verificó mediante análisis de resonancia magnética nuclear
(NMR) del producto sólido obtenido mediante extracción con cloroformo de las celdas enteras seguido por filtración,
precipitación de etanol del polímero del material filtrado, y lavado del polímero con agua. También se verificó mediante análisis cromatográfico de gas (GC) , que se llevó a cabo de la siguiente manera. El polímero extraído (1.20 miligramos) o las celdas enteras liofilizadas (15-50 miligramos) se incubaron en 3 mililitros de una solución de propanolisis que consiste de 50 por ciento de 1, 2-dicloroetano, 40 por ciento de 1-propanol, y 10 por ciento de ácido clorhídrico concentrado a 100°C durante 5 horas. Los componenes solubles en agua de la mezcla resultante se removieron mediante extracción con 3 mililitros de agua. La fase orgánica (1 µL una relación de separación de 1:50 a un régimen de flujo total de 2 mililitros por minuto) se analizó en la columna de GC capilar de sílice fundida SPB-1 (30 m; 0.32 milímetros de ID; 0.25 µm de película; Supelco; Bellefonte, Pa) con el siguiente perfil de temperatura: 80°C, 2 minutos; 10°C por minuto a 250°C, 250°C, 2 minutos. La norma usada para probar la presencia de unidades de 4HV en el polímero era ?valerolactona, que al igual que el ácido 4-hidroxivalérico forma 4-hidroxivalerato de propilo durante la propanólisis . La norma usada para probar las unidades de 3HB en el polímero era PHB.
Ejemplo 2. Poli(4HV) de 4-hidroxivalerato en E. coli.
Escherichia coli MBX1177 no es capaz de sintetizar el poli (3-hidroxibutirato) (PHB) de la glucosa. MBX1177 es un mutante espontáneo de la cepa DH5D que es capaz de usar el ácido 4-hidroxibutírico como una fuente de carbono. MBX1177 que lleva el plásmido pFS30 (Figura 2), que permitió la expresón de la transferasa de Clostridium kl uyveri 4HB-CoA y la sintasa de Ralstonia eutropha PHA, se precultivó a 37°C en 100 mililitros del medio LB que contiene 100 µg por mililitro de ampicilina de sodio. Las celdas se centrifugaron a 5000 gramos durante
10 minutos para removerlas del medio LB después de 16 horas, y se resuspendieron en 100 mililitros de un medio que contiene, por litro: 5 gramos de 4-hidroxivalerato de sodio (4HV); 2 gramos de glucosa; 2.5 gramos de LB que es el polvo del caldo; 100 milimoles de fosfato de potasio, pH de 7; 100 µg por mililitro de ampicilina de sodio; y 0.1 milimol de IPTG. Las celdas se incubaron en este medio durante 3 días con agitación a 200 revoluciones por minuto a 30°C en el mismo matraz en donde se habían precultivado. Las celdas acumularon un polímero a 0.25 por ciento del peso de la celda seca que consistía de 100 por ciento de unidades 4HV. La identidad del polímero poli (4HV) se verificó mediante análisis de GC de celdas enteras que se habían lavado con agua y propanolizaron en una mezcla de 50 por ciento de 1, 2-dicloroetano, 40 por
ciento de 1-propanol, y 10 por ciento de ácido clorhídrico concentrado a 100°C durante 5 horas, con ?-valerolactona como la norma.
Ejemplo 3. Poli (3HB-CO-2HB) de 2-hidroxibutirato y glucosa en E. coli .
E. coli MBX769 que lleva el plásmido pFSld se precultivó a 37°C en 100 mililitros del medio LB que contiene 100 µg por mililitro de ampicilina de sodio en una matraz Erlenmeyer de capacidad ded 250 mililitros con agitación a 200 revoluciones por minuto. Las celdas se centriguaron a 5000 gramos durante 10 minutos para remover de las mismas el medio LB después de 16 horas, y se resuspendieron en 100 mililitros del medio que contienen, por litro: 5 gramos de 2-hidroxibutirato de sodio (2HB) ; 2 gramos de glucosa; 2.5 gramos del polvo de caldo de LB; 50 milimoles de fosfato de potasio, de pH de 7; 100 µgramos por mililitro de ampicilina de sodio; y 0.1 milimol de IPTG. Las celdas se incubaron en este medio durante 3 días con agitación a 150 revoluciones por minuto y 33°C en el mismo matraz en donde se habían precultivado. Las celdas acumularon un polímero hasta 19.0 por ciento del peso de la celda seca que consistía de 99.7 por ciento de unidades de 3HB y 0.3 por ciento de unidades de 2HB. La identidad del
polímero de poli (3HB-co-2HB) se verificó mediante análisis de GC del producto sólido obtenido mediante extracción con cloroformo de las celdas enteras seguidas por filtración, precipitación con etanol del polímero del material filtrado, y lavado del polímero con agua. También se verificó mediante análisis de GC de las celdas enteras que se habían lavado con agua y propanolizado en una mezcla de 50 por ciento de 1, 2-dicloroetano, 40 por ciento de 1-propanol, y 10 por ciento de ácido clorhídrico concentrado a 100°C durante 5 horas, con PHB y 2-hidroxibutirato de sodio como las normas.
Ejemplo 4. Poli(2HB) de 2-hidroxibutirato en E. coli . Escheri chia coli MBX184 no es capaz de sintetizar el poli (3-hidroxibutirato) (PHB) de la glucosa. MBX184 es deficiente en fadR y expresa a toC constitutivamente. MBX184 que lleva el plásmido pFS30 se precultivó a 37°C en 100 mililitros del medio LB que contiene 100 µgramo por mililitro de ampicilina de sodio. Las celdas se centrifugaron a 5000 gramos durante 10 minutos para remover las mismas del medio LB después de 16 horas, y se resuspendieron en 100 mililitros de un medio que contiene, por litro: 5 gramos de 2-hidroxibutirato de sodio (2HB) ; 2 gramos de glucosa; 2.5 gramos del polvo de caldo de LB; 50 milimoles de fosfato de potasio, pH de 7; 100 µgramos
por mililitros de ampicilina de sodio; y 0.1 milimol de IPTG. Las celdas se incubaron en este medio durante 3 dias con agitación a 150 revoluciones por minuto a 33°C en el mismo matraz que se habían precultivado. Las celdas acumularon un polímero hasta 1.0 por ciento del peso de la celda seca que consistía de 100 por ciento de unidades 2HB. La identidad del polímero poli(2HB) se verificó mediante análisis de GC de las celdas enteras que se habían lavado con agua y propanolizado en una mezcla de 50 por ciento de 1, 2-dicloroetano, 40 por ciento de 1-propanol, y 10 por ciento de ácido clorhídrico concentrado a 100°C durante 5 horas, con 2-hidroxibutirato de sodio como la norma.
Ejemplo 5. Poli-3PH y poli-3HP-co-5HV de 1,3- propanodiol y de 1, 5-pentanodiol Escheri chia coli MBX184 que lleva el plásmido pFS30 se precultivó a 37°C en 100 mililitros del medio LB que contiene 100 µgramos por mililitro de ampicilina de sodio. Las celdas se centrifugaron a 5000 gramos durante 10 minutos para remover las mismas del medio LB después de 16 horas, y se resuspendieron en 100 mililitros de un medio que contiene por litro: 10 gramos de 1, 3-propanodiol (1,3-PD) o 1, 5-pentanodiol (1,5-PD); 2 gramos de glucosa; 2.5 gramos de polvo de caldo LB; 50 milimoles de fosfato de
potasio; pH de 7; 100 µgramos por mililitro de ampicilina de sodio; y 0.1 milimol de IPTG. Las celdas de incubaron en este medio durante 3 días con agitación a 200 revoluciones por minuto a 30°C en el mismo matraz en el cual se habían precultivado. Cuando el substrato de diol era 1,3-PD, las celdas acumularon un polímero hasta 7.0 por ciento del peso de la celda seca que consistía enteramente de unidades de 3HP. Cuando el substrato era 1,5-PD, las celdas acumularon un polímero hasta 22.1 por ciento del peso de la celda seca que consistía de más de 90 por ciento de unidades de de 3-hidroxipropionato y menos de 10 por ciento de unidades de 5-hidroxivalerato . La identidad del polímero de poli (3-hidroxipropionato) se verificó mediante análisis de resonancia magnética nuclear del producto sólido obtenido mediante extracción con hipoclorito de sodio de las celdas enteras seguido por centrifugación y lavado del polímero con agua. La identidad de ambos polímeros se verificó mediante análisis de GC del polímero extraído de hipoclorito de sodio que se propanolizó en una mezcla de 50 por ciento de 1, 2-dicloroetano, 40 por ciento de 1-propanol y 10 por ciento de ácido clorhídrico concentrado a 100°C durante 5 horas, con ß-propiolactona y d-valerolactona como las normas.
Ejemplo 6. Poli-5H del ácido 5-hidroxivalérico .
Escheri chia coli MBX1177 que lleva el plásmido pFS30 se cultivó a 37°C en 50 mililitros del medio LB que contiene 100 µgramos por mililitro de ampicilina de sodio. Las celdas se centrifugaron a 5000 gramos durante 10 minutos para remover las mismas del medio LB después de 8 horas, y se resuspendieron en 100 mililitros del medio que contiene, por litro: 10 gramos de 5-hidroxivalerato de sodio (5HV) ; 5 gramos de glucosa; 2.5 gramos de polvo de caldo LB; 50 milimoles de fosfato de potasio, pH de 7; 100 µgramos por mililitro de ampicilina de sodio; y 0.1 milimol de IPTG. El 5HV de sodio se obtuvo mediante saponificación de d-valerolactona. Las celdas se incubaron en este medio durante 3 días con agitación a 200 revoluciones por minuto a 30°C en el mismo matraz en donde se habían precultivado. El análisis de GC se llevó a cabo con celdas enteras liofilizadas que se butanolizaron en una mezcla de 90 por ciento de 1-butanol y 10 por ciento de ácido clorhídrico concentrado a 110°C durante 5 horas; la norma era 5-hidroxivalerato de sodio. Este análisis mostró que las celdas habían acumulado poli(5HV) hasta 13.9 por ciento del peso de la celda seca. La identidad del polímero de poli (5-hidroxivalerato) se verificó mediante análisis de resonancia magnética nuclear del producto sólido obtenido mediante extracción 1, 2-dicloroetano de las celdas enteras seguido por centrifugación y lavado del polímero con agua.
LISTA DE SECUENCIA
<110> Metabolix, Inc. <120> Composiciones del Bipolímero de Polihidroxialcanoato <130> MBX 027 PCT <140> desconocido <141> 1999-05-21 <150> 60/086,396 <151> 1998-05-22 <160> 2 <170> Patente en Ver. 2.0 <210> 1 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> < <222233>> Descripción de Secue Iniciadora- orfZ 5' AvrI I <220> <221> particularidad_miscelánea <222> (1) .. (49) <223> carga iniciadora de oligonucléotido <400> 1 tcccctagga ttcaggaggt ttttatggag tgggaagaga tatataaag 49
<210> 2 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga Iniciadora - orfZ 3' Salí <220> <221> particularidad_miscelánea <222> (1) .. (38) <223> carga iniciadora oligonucléotica <400> 2 ccttaagtcg acaaattcta aaatctcttt ttaaattc 38
Claims (11)
1. Un polímero producido proporcionando uno o más substratos, que comprenden un 2-hidroxiácido, en un sistema biológico que se selecciona del grupo que consiste de bacterias, levaduras, hongos y plantas, en donde el sistema biológico que expresa las enzimas seleccionadas del grupo que consiste de sintasa de polihidroxialcanoato, transferasa de acilo-CoA, transferasa de hidroxiacilo CoA, y sintetasa de hidroxiacilo CoA de tal manera que los polímeros de acumulan.
2. El polímero de la reivindicación 1, en donde el 2-hidroxiácido es 2-hidroxibutirato.
3. El polímero de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste de poli (2-hidroxibutirato) y poli (2-hidroxibutirato-co-3-hidroxibutirato) .
4. El polímero de la reivindicación 2, producido proporcionando el 2-hidroxibutirato y uno o más substratos que se seleccionan del grupo que consiste de 3-hidroxipropionato, 3-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxihexanoato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato, 5-hidroxivalerato y 6-hidroxihexanoato .
5. Un polímero de polihidroxialcanoato que comprende 2-hidroxibutirato como un comonómero, en donde el polímero se produce en un sistema biológico que se selecciona del grupo que consiste de bacterias, levaduras, hongos y plantas, en donde el sistema biológico expresa enzimas que se seleccionan del grupo que consiste de sintasa de polihidroxialcanoato, transferasa de acilo-CoA, transferasa de hidroxiacilo CoA, y sintetasa de hidroxiacilo CoA de tal manera que se acumulan los polímeros.
6. El polímero de la reivindicación 5, en donde el polímero es poli (2-hidroxibutirato) .
7. El polímero de la reivindicación 5, en donde el polímero es poli (2-hidroxibutirato-co-3-hidroxibutirato) .
8. Un método para producir polímeros en un sistema biológico que comprende proporcionar uno o más substratos que comprenden 2-hidroxiácido, en donde el sistema biológico expresa las enzimas seleccionadas del grupo que consiste de sintasa de polihidroxialcanoato, transferasa de acilo-CoA, transferasa de hidroxiacilo CoA, y sintetasa de hidroxiacilo CoA de tal manera que los polímeros se acumulan.
9. El método de la reivindicación 8, en donde los organismos expresan uno o más genes hetereólogos que codifican las enzimas.
10. El método de la reivindicación 8, en donde el 2-hidroxiácido es 2-hidroxibutirato .
11. El método de la reivindicación 8, que además comprende proporcionar con el 2-hidroxibutirato uno o más substratos que se seleccionan del grupo que consiste de 3-hidroxipropionato, 3-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxihexanoato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato, 5-hidroxivalerato y ß-hidroxihexanoato .
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