MXPA00010079A - Celulas de linaje especifico y celulas progenitoras - Google Patents

Abstract

Se describe un método para generar un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a las células de un linaje seleccionado en el cual un marcador con capacidad de ser seleccionado, el cual se expresa diferencialmente en las células del linaje seleccionado en comparación con su expresión en otras células, se introduce en una célula multipotencial y la célula multipotencial se cultiva para inducir la diferenciación de la célula multipotencial en una célula del linaje seleccionado o en una mezcla de células que incluya células del 1inaje seleccionado o se cultiva para inducir la sobrevivencia preferencial de células del linaje seleccionado. Aquellas células que expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado son entonces seleccionadas. Las progenitoras del linaje seleccionado también se describen como es el uso del método en técnicas de ensayo.

Description

CÉLULAS DE LINAJE ESPECIFICO Y CÉLULAS PROGENITORAS CAMPO DE LA INVENCIÓN -5 Esta invención se refiere a células de linaje especifico y células progenitoras, los métodos para obtenerlas y sus usos. Las células germinales embriónicas (ES) plur ipotent es pueden inducirse para diferenciar in vi t ro en una mezcla de tipos de células, que comprenden el ™ saco vitelino embriónico y derivados de las tres capas germinales embriónicas. Sin embargo, la naturaleza desorganizada y heterogénea de la diferenciación impide la manipulación y análisis de los linajes individuales. En particular, la invención proporciona una técnica de selección genética de linaje especifico para establecer poblaciones purificadas de precursoras naturales al diferenciar las células ES. 20 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células germinales (ES) embriónicas son lineas de células no transformadas derivadas directamente del tejido fundador pluripotente en el embrión de ratón o de humano, el epiblasto (Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981; Brook y Gardner, 1997; Thomson et a l , 1998; Shamblott et a l , 1998) . Las células ES pueden propagarse y manipularse genéticamente extensamente mientras i 5 mantienen la capacidad de diferenciación multilinaje, tanto i n vi vo como ín vitro (Robertson, 1987) . La diferenciación de células ES en cultivo refleja con detalle los eventos diferenciales en el embrión. Por lo tanto, en principio, las células ES proporcionan acceso i n ™ vítro a los procesos instructivos y selectivos mediante los cuales se genera la di ver s if icación celular en el embrión mamífero (Smith, 1992) . La diferenciación multilinaje de células ES puede iniciarse mediante agregación simple (Martin y Evans, 1975; Doetschman et a l . , 1985) . Los agregados forman estructuras i conocidas como cuerpos embrioides, cuya diferenciación refleja aspectos de la embr iogénesis de ratón de peri- y postimplantación precoz (Martin et a l . , 1977; Doetschman et a l . , 1985) . Se encontró un arreglo diverso de tipos de células en excrecencias derivadas de los cuerpos embrioides (Weiss y Orkin, 1996) . A pesar de que la representación de 11na3 %s en particular puede disminuir o mejorar mediante el tratamiento con sulfoxido de dimetilo o acido retmoico (RA) , los productos diferenciados consisten siempre de una mezcla de tipos de células. La desorganización intrínseca y la complejidad han limitado la explotación de la diferenciación de células ES 111 vi t ro para la asignación de funciones genéticas en trayectorias de desarrol lo . Diversos reportes han documentado la presencia de células neuronales y glia (Bam, 1995; Fraichard et ai., 1995; Strubmg et a l . , 1995; Okabe et a l . , 1996) en excrecencias corporales embrioides. Esto podría explotarse para detectar, caracterizar y manipular los factores que regulan la neurogenesis y la diferenciación glial. Las células ES podrían utilizarse también como una fuente de células neurales normales o genéticamente manipuladas para estudios bioquímicos y funcionales o para transplantes. Sin embargo, el problema es que estos objetivos, se encuentran severamente comprometidos por la abundancia de las células no neurales en los cultivos y debido a que no es posible concur rentementjg est ablecer o mantener un cultivo predominantemente conteniendo progenitoras de células neurales. Por consiguiente, la técnica falla al proporcionar un método confiable para obtener una población substancialmente pura de una célula de cualquier linaje seleccionado, y células progenitoras de un linaje seleccionado en particular. La técnica falla también al proporcionar ensayos para influencias de desarrollo y otras influencias de factores sobre las células progenitoras de las células diferenciadas de un linaje seleccionado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene como objetivo proporcionar células y/o células diferenciadas de un linaje seleccionado, ensayos para la influencia de los factores sobre tales células y usos de estas células, tal como en transplantes. La presente invención tiene como objetivo también el proporcionar una técnica de selecciona genética para eliminar las células no neurales de cultivos y para permitir la purificación de cuerpos embrioides de precursoras neurales competentes de diferenciación. La presente invención proporciona un método para obtener un cultivo de células de un linaje seleccionado que tiene una combinación de dos pasos. Un paso es seleccionar las células que expresan una característica genética de células de ese linaje. La otra es cultivar dichas células que tienden a diferenciarse en o proliferar como células de ese linaje. El efecto es entregar un cultivo más altamente purificado de las células de linaje seleccionado que de otro modo posible. Por medio del ejemplo, un paso de la combinación es seleccionar las células que expresan un gen conocido por expresarse únicamente en células de progenitoras hematopoyét icas , y el otro es cultivar células en un medio que contiene un nutriente conocido por promover la diferenciación de las células en progenitoras hematopoyéticas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un método para generar un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a las células de un linaje seleccionado, que comprende : (i) introducir en una célula 5 mult ipotencial un marcador con capacidad de ser seleccionado que se expresa di ferencialmente en células del linaje seleccionado en comparación con su expresión en 10 otras células; • (ii) cultivar la célula mult ipotencial para inducir (a) la diferenciación de la célula muí t ipot encial en una célula del linaje seleccionado o en una mezcla de células que sea o que incluya células del linaje seleccionado o i (b) la sobrevivencia preferencial de células del linaje seleccionado; y (iii) seleccionar aquellas células que expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado, El método es adecuado para obtener células, opcionalmente progenitoras, del linaje seleccionado a una pureagí elevada. No obstante siguiendo el método de la técnica para inducir la diferenciación de las células ES en un cultivo que incluye células neurales se puede 5 proporcionar un máximo de aproximadamente 50% de progenitoras neurales, utilizando la técnica de la invención se puede obtener una pureza en exceso de 70%, y en un modalidad especifica descrita a continuación la pureza es substancialmente de 100%. • El paso (ii) da como resultado una población pura de células o un cultivo mixto al menos ligeramente purificado o enriquecido con respecto a las células deseadas y puede llevarse a cabo de manera adecuada al cultivar la célula mult ipot encial en presencia de un factor que induce la diferenciación de la célula en una i célula progenitora del linaje seleccionado. Por medio del ejemplo, un mitógeno especifico para progenitoras neurales es el factor de crecimiento de fibroblasto. La referencia en la presente al término "factor" no pretende limitarse a factores proteinicos o de polipéptidos sino que pretende abarcar cualquier molécula biológicamente activa o molécula biológicamente potencialmente activa. La célula muí t ipot encial puede seleccionarse de células germinales embriónicas (ES) , células germinales embriónicas (EG) , 5 células de carcinoma embrional (EC), un cultivo primario de células fetales, un cultivo primario de células post-natales y un cultivo primario de células adultas. El método puede comprender además células modificadas genéticamente para eliminar, mutar, substituir o agregar genes con ™ objeto de ensayar funciones genéticas en las células progenitoras del linaje seleccionado o adaptar un fenotipo celular para hacerlo más adecuado para transplantes. Por consiguiente, las células pueden obtenerse al introducir un marcador con capacidad de ser seleccionado en una linea celular muí t ipot encial o un cultivo i primario que contiene las células de interés y seleccionar luego las células de interés. El marcador con capacidad de ser seleccionado se introduce opcionalmente mediante la transfección o infección viral por medio de un animal transgénico desde el cual se establecen después los cultivos primarios, de manera adecuada utilizando los métodos descritos en WO-A- 9 4 / 2 4 2 7 4 . Por consiguiente la invención permite venta osamente una población altamente enriquecida de células y en particular todos los I. linajes de poblaciones de un linaje seleccionado para obtenerse. En un ejemplo a continuación la población obtenida es substancialmente 100% pura haciendo posible aislar una sola célula del linaje de la progenitora conocida. La invención es de aplicación para todos los linajes de las I células, particularmente las células progenitoras. Un marcador con capacidad de ser seleccionado expresado en las células que expresan un gen Sox conduce a las células progenitoras neurales; los genes CD34, CD44 Y SCL son adecuados para obtener progenitoras hema topoyét icas , y el gen Nkx 2.5 o GATA-4 para las progenitoras cardiacas. Para generar progenitoras miogénicas, son adecuados MyoO o myE5. El utilizar ácido retinoico induce la diferenciación de células ES en células neurales, DMSO induce la diferenciación en células hematopoyét icas y la ausencia de ácido retinoico induce una población enriquecida en las progenitoras cardiacas.

El método comprende opcionalmente además : (iv) introducir en la célula muí t ipotencial un segundo marcador con capacidad de ser seleccionado que se exprese di ferencialmente en células progenitoras u otras células de un sub-linaje seleccionado en comparación con su expresión en otras células, en donde las células del sub-linaje seleccionado se forman por la diferenciación de células del linaje de progenitora seleccionada; y (v) cuando se ha obtenido un cultivo de células progenitoras del linaje seleccionado, permitir o inducir la diferenciación de las células y seleccionar las células que expresan el segundo marcador con capacidad de ser seleccionado.

Este aspecto de la invención enriquece además la pureza del cultivo de células obtenido, y es de ventaja en los casos en que las células del linaje seleccionado expresan diferencialmente un gen sino también en un nivel ligeramente diferente de células no deseadas . 5 En una modalidad preferida de la invención, descrito a continuación con mas detalle, el marcador con capacidad de ser seleccionado es un gen que codifica para la resistencia antibiotica y para seleccionar aquellas células que expresan el marcador con ^ capacidad de ser seleccionado comprende introducir el antibiótico en el cultivo En uso, la aplicación del antibiótico elimina selectivamente o extirpa las células que no expresan el marcador, dejando atrás una población de células purificada o enriquecida con respecto a aquellas que expresan la | resistencia antibiotica, es decir, células viables de linaje seleccionado. Al menos dos días para la introducción del marcador con capacidad de ser seleccionado son conocidos y adecuados para la invención. El marcador con capacidad de ser seleccionado puede introducirse a la célula muí t ipotencial mediante integración objetivo o retención de gen a un gen que se expresa de manera diferente en las células progenitoras del linaje seleccionado. La expresión del marcador con capacidad de ser seleccionado se enlaza de manera operativa a un gen que se expresa di ferencialmente en un patrón deseado. El marcador con capacidad de ser seleccionado puede introducirse también a la célula mult ipotencial por medio de integración aleatoria como un transgen en don se expresa bajo control de elementos reguladores de un gen que se expresa di f erencialmente en células progenitoras del linaje seleccionado. El marcador con capacidad de ser seleccionado puede ser más generalmente un marcador que cuando se expresa, los resultados en la sobrevivencia preferencial de células que expresan el marcador, con resistencia antibiótica sean tal ejemplo. El marcador con capacidad de ser seleccionado puede ser también un marcador cuya expresión da como resultado una eliminación preferencial de células que expresan el marcador. En esta instancia, el marcador se expresa en células diferentes a aquellas del linaje seleccionado. En una modalidad especifica de la invención descrita en un ejemplo a continuación, la célula mult ipotencial es una célula ES, EC o EG y el método comprende inducir la diferenciación de la célula muí t ipotencial - un método es formar un cuerpo embrioide a partir de la célula - y desasociar las células. En un ejemplo se utiliza tripsina. Es una ventaja que las células individuales se obtengan de esta manera. Estas se mantienen expuestas al medio de cultivo y no adjuntas a las células vecinas se encuentran libres de influencias célula a célula que pudieran afectar el patrón de crecimiento y / o diferenciación de las células, e inhibir la formación de células progenitoras de acuerdo con la invención. Un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a las células progenitoras ventrales es obtenible de acuerdo con la invención, en donde el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa diferencialmente en las células progenitoras neurales y el segundo marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa di ferencialmente en las células progenitoras ventrales. El segundo marcador con capacidad de ser seleccionado para esto se expresa diferencialmente de manera adecuada en las células que expresan Pax 6. Un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a las células progenituras dorsales es obtenible de acuerdo con la invención, en donde el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa di ferencialmente en las células progenitoras neurales y el segundo marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa diferencialment e en las células progenitoras dorsales. El segundo marcador con capacidad de ser seleccionado para esto se expresa di ferencialmente de manera adecuada en las células que expresan Pax 3. La invención proporciona también una célula, preferentemente una progenitura, de un linaje seleccionado, obtenible de acuerdo al método de la invención. Hasta ahora, las preparaciones de las progenituras fueron demasiado impuras para certeza en cuanto a que cualquier célula seleccionada fuera una célula progemtora. Con el cultivo de acuerdo a la invención que puede dar origen a prepa aciones de progenitoras substanclalmente 100% puras, se logra el aislamiento de una progenitora sencilla . La invención proporciona además una composición que comprende una pluralidad de células, en la que una mayoría de las células son células progenitoras de un linaje seleccionado. Preferentemente, al menos 60% de las células son células progenitoras del linaje seleccionado. Más preferentemente, al menos 60% de las células son células progenitoras neurales. Además, la invención proporciona una célula progenitora neural aislada. Una aplicación significativa de la invención se encuentra en el campo de los factores de ensayo para la influencia que puede tener una progenitora seleccionada. De acuerdo con lo anterior, aún la invención proporciona además un ensayo para la influencia de un factor en un cultivo de células progenitoras de un linaje seleccionado, que comprende:- (i) introducir en una célula mult ipotencial un marcador con capacidad de ser seleccionado que se expresa di ferencialmente en células del linaje seleccionado en comparación con su expresión en otras células; (ii) cultivar la célula muí t ipot encial para inducir la diferenciación de la célula mult ipotencial en una célula o mezcla de células del linaje seleccionado que incluya células del linaje seleccionado o para inducir la sobrevivencia preferencial de células del linaje seleccionado; y (iii) seleccionar aquellas células que expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado; (iv) cultivar las células de esta manera obtenidas del linaje seleccionado en presencia del factor . El método de ensayo es preferentemente para ensayo de la influencia de un factor en un cultivo de células progenitoras de linaje seleccionado, en donde el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa di ferencialmente en aquellas células progenitoras. La referencia a un "factor" en este ensayo, pretende ser una referencia a cualquier molécula actual o molécula biológicamente potencialmente activa que puede introducirse en cultivo de células del I 5 linaje seleccionado, y por consiguiente no pretende limitarse a factores proteinicos o de polipéptido. El término también pretende abarcar un gen introducido o modificado en una célula mult ipot encial de la cual se obtiene el linaje seleccionado. Por consiguiente, el ensayo puede utilizarse convenientemente para la influencia de un gen en particular, asi como también para la influencia de factores de polipéptido y/o proteinicos o de pequeñas moléculas de interés. El método puede utilizarse para ensayar si el factor tiene una influencia proliferante, de maduración, toxica o protectora en las células progenitoras del linaje seleccionado, o si un factor tiene una influencia proliferante, de maduración, citotóxica o protectora de glial en las células progenitoras neurales o en otras células di ferencialmente obtenidas después del retiro de selección y diferenciación de las progenitoras.

Es una ventaja el método de ensayo que permite obtener una población de células terminalmente diferenciadas del linaje seleccionado y utilizarlas para tales ensayos como filtros genéticos y de descubrimiento de drogas . Todavía se proporciona también por la invención una célula progenitora neural, o un cultivo que comprende una mayoría de células progenitoras neurales, para transplantes. En un ejemplo descrito a continuación, una célula progenitora neural de la invención se ha aislado y transplantado exitosamente al cerebro de una rata. La célula neural puede ser opcionalmente una célula neuronal o una célula glial. Este transplante también puede llevarse a cabo utilizando células neuronales obtenidas a partir de progenitoras neurales de la invención. Un método adecuado para generar neuronas purificadas comprende obtener un cultivo purificado con respecto a las progenitoras neurales, utilizando el método de la invención en donde el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa dif erencialmente en células que expresan un gen Sox, y cultivar las progenitoras obtenidas en presencia de un medio adecuado para la diferenciación de las progenitoras en neuronas. Un método adecuado k para generar células gliales purificadas P5 comprende obtener un cultivo purificado con respecto a las progenitoras neurales, utilizando el método de la invención en donde el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa di f erencialmente en células que expresan un gen Sox, y cultivar las progenitoras obtenidas en presencias de un medio adecuado para la diferenciación de las progemtoras en células gliales . Aun se proporciona también por la invención una progenitora neural para transplante a fin de tratar enfermedades neurodegenerativas o daños neuronales /cerebrales , células progenitoras neurales para transplante, obtenible a partir de una célula seleccionada de una célula ES, una célula EC, una célula EG, un cultivo primario de células fetales y un cultivo primario de células pos t-natales , para transplante a fin de tratar enfermedades neurodegenerativas o daños neuronales /cerebrales , un método de tratamiento de enfermedades neurjptiegenerat ivas o daños neuronales /cerebrales que comprende el transplante de una célula progenitora neural, y _ un método para preparar una célula progenitora 5 neural o una progenie diferenciada de la misma para almacenamiento, que comprende obtener la célula en un método de acuerdo con la invención y congelar la célula en presencia de un ciroprot ector , tal como sulfoxido de dimetilo al 10%. ) En una modalidad de la invención, un gen de selección/relator, ßq e , se integro mediante recombmacion homologa en el gen sox2, el cual se expresa uniformemente en células precursoras en la placa neural y el tubo neural. La aplicación de G418 a los cultivos para diferenciar los cultivos de las células objetivo sox2 dio como resultado el aislamiento eficaz de las células positivas a Jgeo viables. Estas células expresaron marcadores de células precursoras neuroepiteliales . Se diferenciaron eficazmente en redes de células tipo neuronas que expresaron una variedad de marcadores neuronales. Por consiguiente, se proporciona por la invención un sistema m vi t ro para la disección genética y molecular de diferenciación neural de mamífero, y también una trayectoria para la producción de poblaciones puras de - precursoras neurales genéticamente modificadas o P5 normales y neuronas para estudios funcionales incluyendo transplantes. Además, el planteamiento de la selección de linaje de la invención es aplicable al aislamiento de otras poblaciones precursoras al diferenciar los cultivos de células ES. La invención proporciona además un método para amplificar una población purificada de las células progenitoras de un linaje seleccionado, que comprende 15 mantener las células en cultivo en presencia de un mitógeno; y un factor de crecimiento. Las células progenitoras comprenden preferentemente una codificación genética para un marcador con capacidad de ser seleccionado, cuyo gen se expresa di ferencialmente en las células progenitoras en comparación con su expresión en otras células, y el método comprende además seleccionar las células que expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado. Es una opción para mantener el cultivo sobre una pluralidad de generaciones y ^ seleccionar periódicamente las células que P 5 expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado . Otra opción es mantener el cultivo sobre una pluralidad de generaciones y seleccionar continuamente las células que 10 expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado. Donde el marcador con capacidad de ser seleccionado es de resistencia antibiotica, el método puede comprender el cultivo continuo en presencia de antibiótico. 15 DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención se describe ahora con referencia a los dibujos acompañantes en los cuales : - 20 La Figura 1 muestra la morfología y caracterización de las neuronas y glia en cultivos de 4 días; La Figura 2 muestra la fotografía de contraste de fase de células de día 0 (2a - 4 25 horas después de la colocación en placas) , y teñido de anticuerpos de Soxl (2b) - la escala gráfica es 50 micrones; La Figura 3 muestra un diagrama esquemático de la selección de linaje de acuerdo con la invención; La Figura 4 muestra el enriquecimiento de cultivo para las células positivas a Sox2 mediante selección de G418 ; La Figura 5 muestra la expresión de marcadores precursores neurales de región especifica; La Figura 6 muestra células positivas a Sox2 proliferantes i n vi t ro en respuesta a FGF-2 ; La Figura 7 muestra neuronas derivadas de células ES diferenciadas después de la selección de S ox2 ; La Figura 8 muestra los resultados del ensayo de influencia de draga sónica en los progenitores neurales; y La Figura 9 muestra una neurona derivada de células ES después del transplante in u tero . Con más detalle, la Figura 1 muestra la morfología y caracterización de las neuronas y la glia en cultivos de 4 días. Las células ES E14TG2a se indujeron para diferenciar en agregados para 8 dias, colocadas en placas sobre substrato de pol i-D-1 i sina / laminina en DMEM/F12 complementadas con N2. las células se fotografiaron vivas con óptica de contraste de fase después de 4 dias en cultivo. La mayoría de las células son de tipo neuronal, sus procesos neuríticos conectados a una red celular. (a), (b) y (c) muestran cultivos que fueron teñidos con anti-NFL, anti-MAP2 y anti-GFAP, respectivamente. En la Figura 4, las células Es con una inserción objetivo de ßqeo en el gen Sox2 se indujeron para diferenciar por cultivo como agregados ("cuerpos embrioides") . Después de 4 días se expusieron a 10~6 M de ácido retinoico para 4 días adicionales. Los agregados se desasociaron después y las células se colocaron en placas recubiertas de poli-D-lisina y laminina en un medio libre de suero con complemento N2. Los cultivos no se seleccionaron o expusieron a G418 ya sea durante las 48 horas finales del cultivo de agregado (b, f, h i) o para 24 horas después de la colocación en p l a ca s ( d ) : a. La expresión de ß-galactosidasa enlazada a Sox2 en cultivo no seleccionado 3 horas después de la colocación en placas. b. La expresión de ß-galactosidasa enlazada a Sox2 en cultivo seleccionado de G418 3 horas después de la colocación en placas. c. La expresión de ß-galactosidasa enlazada a Sox2 en cultivo no seleccionado 24 horas después de la colocación en placas. d. La expresión de ß-galactosidasa enlazada a Sox2 en cultivo seleccionado de G418 24 horas después de la colocación en placas. e. Inmunoteñido con anti-Sox2 de cultivo no seleccionado 3 horas después de la colocación en placas. f . Inmunoteñido con anti-Sox2 de cultivo seleccionado G418 3 horas después de la colocación en placas. g. Contrateñido con DAPI el panel e. h. Contrateñido con DAPI el panel f . i. Doble etiquetamiento con anti- nestina (verde) y anti-Sox2 (rojo/anaranjado) del cultivo ^ seleccionado G418 3 horas después P 5 de la colocación de placas. La escala gráfica indica 100 µm para (a,b,c,d), 66.7 µm para (e,f,g,h) y 50 µm para (i) • Para la Figura 5, las células que klO expresan Sox2 se seleccionaron con G418 durante 2 días en cultivos EB, las células se desasociaron y se les dejó adjuntarse a placas de cultivo durante 3 horas antes de la fijación. La expresión para Pax3 (a) , delta-1 (b) , Mash-1 (c) y Math-4a (d) se detectó mediante hibridización ín situ con ribosondas antidetección; la presencia de células que expresan Paxd se detectó al teñir el cultivo con un anticuerpo anti-Pax6 (e) , el cultivo e se etiquetó doblemente con DAPI para localizar los núcleos de todas las células (f ) . Escala gráfica, 100 µm. Para la Figura 6, después de una inducción de 8 días de la diferenciación neural, las células se desasociaron por tr ipsini zación , se colocaron en placas a ba a densidad, y se cultivaron en DMEM/F12 complementado con un medio de N2 en presencia de 10 ng/ml de bFGF y ^ 200 µg/ml de G418. (a) cultivo durante la noche; (b) cultivo de 4 días. Los números de células aumentaron aproximadamente 10 veces sobre el periodo de cultivo. Las células expandidas en presencia de bFGF mantuvieron la expresión de Sox2 como se muestra por medio de teñido X-gal. .10 Escala gráfica: 50 µm. Para la Figura 7, las células que expresan Sox2 seleccionadas mediante exposición de 48 horas a G418 durante el cultivo de cuerpo de embrioide se colocaron en placas y se 15 desarrollaron en ausencia de G418 en un medio de N2 durante 48 horas (a y b) o 96 horas (c-e), o durante 72 horas seguido de 72 horas adicionales en un medio Neurobasal mas complemento de B27 y suero de caballo al 2% (f-i) (Escala gráfica, 20 100 µm) : a,b. Doble mmunoet iquetamiento que muestra la sub-regulacion de Sox-2 (a) en células recientemente diferenciadas que expresan el marcador neuronal ß-tubulma 3 (b) . c. Inmunoteñir para el marcador neuronal ß3-tubulma con contrateñido de yoduro de propidio A que muestra una diferenciación neuronal de >90% de las células. d,e. Doble etiquetamient o para los marcadores neuronales smapsm-I (d) y MAP2/Tau (e) . f . Inmunoteñir para GABA. .10 g. Imagen de contraste de fase de P campo en f. h. Inmunoteñir para glutamato. i. Imagen de contraste de fase de campo en h . 15 En la Figura 8, los cuerpos embrioides ES CCE-sox2 experimentan la selección de g418 se expusieron a las concentraciones indicadas de proteina de draga sónica recombinante . Las células se fijaron e mmunot íñeron para el 20 islote 1/2 de marcador de neurona motora 48 horas después de la disociación. En la Figura 9, las células que expresan sox-2 seleccionadas mediante la exposición a g418 durante el cultivo de cuerpo embpoide se desasociaron, se etiquetaron con PKH26-GL (Sigma) e inyectaron en las vesículas de la parte delantera de los cerebros de fetos de rata E16 i n ú t ero . Después se dejó concluir el embarazo. Las crías se sacrificaron en P2. Se prepararon los cortes de Vibratome y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia. La figura muestra una célula etiquetada con PKH26-GL representativa dentro de la corteza exhibiendo morfología neuronal inmadura típica. Este estudio demuestra que las células seleccionadas por Sox2 pueden integrarse y diferenciarse en el cerebro.

Materiales y Métodos Cultivo de células ES Las líneas de células ES utilizadas en este estudio fueron: E14TG2a (Hooper et a l . , 1987), CGR8 (Mountford et a l . , 1994) y CCE-Sox2, un derivado de CCE (Bradley et a l . , 1984) en las cuales se ha perturbado una copia del gen Sox2 mediante recombinación homologa. Todas las lineas de células ES se mantuvieron en plástico de cultivo de tejido recubierto con gelatina en un medio de Eagle modificado por Glasgow (GMEM) complementado con 10~4 2 -mercaptoetanol , suero de bovino fetal (FCS) aff? 10% y 100 U/ml de LIF (Smith, 1991) .

Inducción de diferenciación. El protocolo básico se basa en el descrito (Bain, 1995). Las células ES se t r ips ini zaron ligeramente en pequeñas masas y se les dejó agregarse en cultivo de suspensión en ausencia de LIF. Después de un cultivo de 4 dias, todo el ácido t rans-ret inoico (RA) se agregó en una concentración de 10~6 M. Después de 4 días adicionales, los agregados se desasociaron mediante incubación con tripsina y trituración. Las células se sembraron a 3 * 105 células /cavidad en placas de 4 cavidades (Nunc) recubiertas con pol i-D-lisina y laminina. El medio de cultivo fue DMEM/F12 (50/50) libre de suero complementado con N2 y, en donde se especifica, B27 (Gibco-BRL) más suero de caballo al 2% .

Preparación del substrato. Las placas de cultivo de tejido se prerecubr ieron con poli-D-1 is ina (PDL- 30-70 kDa, Sigma) durante 20 minutos a una concentración de 10 µg/ml en PBS. Se retiro la PDL en exceso y se enjuagaron las placas con PBS tres veces antes de recubrir con laminina (Sigma) a una concentración de 2-10 µg/ml en PBS durante la noche a 4 °C.

Inmunocitoquímica . El teñido para Soxl y Sox2 se llevo a cabo en cultivos fijos en MEMFA ( formaldehido al 4%, 100 mM de MOPS pH de 7.4, 20 mM de EGTA, lmM de MgSO?) durante 1 hora Para teñir las células con anticuerpos contra GABA y glutamato, se fijaron las células con glutaraldehido al 1% en PBS (Turner, Neurochemist ry ) . Para la detección de otros antigenos int racelulares , se fijaron los cultivos en paraf ormaldehido al 4% en PB? durante 15 minutos. Las células fijas se enjuagaron con PBS, se incubaron con compensador de bloqueo (PBS, 1 mg/ml BSA, Tritón X-100 al 0.1%, y suero de cabra al 1%) durante 30 minutos seguido de incubación con anticuerpos primarios en compensador de bloqueo durante la noche a 4 °C Las células se enjuagaron después con PBS, y se incubaron con una anticuerpo secundario de especie especifica en compensador de bloqueo durante 1 hora. Los cultivos se enjuagaron con tres cambios de PBS, instalados con un medio de instalación Vectashield (Vector) y se examinaron ba o un microscopio fluorescente. Los experimentos de doble et iquetamient o se realizaron al incubar simultáneamente células en combinaciones apropiadas de anticuerpos primarios, seguidos de incubación con anticuerpos secundarios reactivos no cruzados. En algunos experimentos, los cultivos se contrat íñeron con yoduro de propidio o DAPI a concentraciones de lng/ml y 5 µg/ml respectivamente. Se utilizaron las siguientes diluciones para los anticuerpos primarios y secundarios: anti-Soxl y ant?-Sox2 de conejo (1:500), anti-GABA de conejo (1:2000, Sigma), ant ?-glutamato de conejo (1:4000, Sigma), ant ?-ß-tubul ina de ratón 3 (1:200, Sigma); ant?-NF68 de ratón (1:400, Sigma); ant?-MAP2 de conejo, que reacciona con MAP2 y Tau (1:400, Sigma); anti-GFAP de ratón (1:400, Sigma), ant i - sinapsm-I de ratón (1:50, Chemicon), anti-nestma de ratón (1:50, DSHB) , ant?-Pax6 de ratón (1:10, ) . IgG de anti-raton de cabra conjugado con Cy3 (1/50, Jackson ImmunoResearch) , IgG de antiratón de cabra conjugado con FITC (1:100, Sigma) , Ig de anti-conejo de cabra conjugado con FITC (1:100, Sigma), Ig de anti-conejo de cabra 5 conjugado con TRITC (1:50, Sigma) .

Hibridización in situ de células cultivadas. El protocolo se basa en el de (Rosen y Beddington, 1993) adaptado para células cultivadas. Brevemente, los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4% y se permeabi li zaron a -20°C en metanol al 100%. Las células se rehidrataron después a través de una serie de metanol y finalmente se colocó en PBS con Tween- 15 20 al 0.1%. Se realizó la prehibr idi zación durante 1-4 horas en compensador de hibridización (formamida ultrapura al 50%, 5 * SSC, pH de 4.5, 50 mg/ml de heparina, 100 µg/ml de ADN y tARN de esperma de arenque, Tween-20 al 0.1%), se agregaron las sondas etiquetadas con digoxigenina (DIG) a 1 µg/ml durante la noche a 70°C. Los enjuagues al siguiente día se realizaron tres veces durante 30 minutos a 65°C en compensador de enjuague (formaldehído al 50%, 2 * SSC, Tween-20 al 0.1%), tres enjuagues de 5 minutos en TBST (137 mM de NaCl, 25 mM de Tris- HCl, pH de 7.6, 3 mM de KCl, Tween-20 al 0.1%) y bloqueo de 1 hora en suero/TBST al 10%. Después ^ se incubaron las células durante la noche a 4°C 5 con anticuerpo anti-DIG acoplado con fosfatasa alcalina (1,2000, Boehringer-Mannheim) . El día siguiente las células se enjuagaron tres veces 1 hora con TBST y tres veces durante 10 minutos con compensador de fosfatasa alcalina (APB, 100 10 mM de NaCl, 100 mM de Tris pH de 9.5, 50 mM de I MgCl2, T een-20 al 0.1%) . Se dejó proceder la reacción de teñido de fosfatasa alcalina durante 3 horas hasta toda la noche con 4.5 µl/ml de NBT un BCIP de 3.5 µl/min en APB (Boehringer) . 15 Sondas de ARN etiquetadas con DIG. Los cADNs murinos utilizados como plantillas para las ribosondas fueron un fragmento de Pax3 de 519 bp (proporcionadas por la Dra. Rosa Beddington), un clon Del t a-1 de 700 bp (proporcionado por el Dr. Domingos Henrique), un fragmento Mash-1 de 670 bp y un cADN Math-4A de 1.5 kb (ambos fueron proporcionados por el Dr. Francois Guillemot) . Los ADNs se linealizaron y la síntesis de ARN se realizó utilizando polimerasa de ARN T7, T3 o SP6, que incluye mezcla de nucleótido etiquetada con DIG como se recomienda por los proveedores (Boehringer) . Los productos se analizaron en un gel de agarosa al 0.8% y se utilizó aproximadamente 1 µg/ml del ARN antidetección etiquetado con DIG para la hibridización de las células .

Detección de ß-galactosidasa. Se fijaron las células en compensador fijo (glutaraldehído al 0.2%, 0.1 M de compensador de fosfato pH de 7.2, 2 mM de MgCl2, 5 mM de EGTA) durante 10 minutos a 4°C y se enjuagaron tres veces con compensador de enjuague (0.1 M de compensador de fosfato pH de 7.2, 2 mM de MgCl2> . Las células se incubaron después a 37°C durante la noche con 1 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactosida ( X-gal) , 4mM de fericianuro de potasio, 4 mM de ferrocianuro de potasio en compensador de enjuague (Baddington et a l . , 1989) .

Resultados Generación eficaz de neuronas y glía a partir de células ES La inducción de la diferenciación neural se baso en los métodos publicados (Bain, ^ 1995; Fraichard et a l . , 1995) en los que las ? 5 células ES se agregan en suspensión a fin de formar cuerpos embrioides, expuestos a acido retmico, y luego se les de o volverse a unir y crecer en un substrato. Ba o estas condiciones las células de tipo neuronal se tornaron evidentes en las excrecencias después de varios días acompañadas por una variedad de otros tipos de células. Introdujimos dos variaciones en el protocolo el cual abarco la representación de las células neuronales. Primeramente, los cuerpos embrioides se desasociaron antes de la colocación en placas. Esto da como resultado una dispersión homogénea y termina inmediatamente los efectos inductivos y selectivos dentro de los cuerpos embrioides.

Segundo, las células se colocaron en placas en un medio de cultivo neuronal definido (DMEM/F12 mas N2) en substratos recubiertos con poli-D- lisina y lammina las cuales soportan la unión y crecimiento de células neuronales. Cada uno de estos procedimientos tuvo una influencia aditiva en la proporción de células neurales en los cultivos. Cuando se combinan, más de 50% de células viables 4 días después de la colocación de placas tuvieron proceso extendidos y en donde fueron inmuorreact ivas para marcadores neuronales, cadenas ligera y pesada de neurof i lamento , MAP2/tau, o ß tubulina III (Figura 1 y datos no mostrados) . Una proporción más pequeña de células, aproximadamente 20%, expresó el marcador de astrocito GFAP (no mostrado) . Significativamente esta observación no es específica de la línea celular conforme se obtuvieron resultados comparables con tres líneas de células ES independientes y subclones subsiguientes. Sin embargo, los tipos celulares no neurales permanecieron en estos cultivos, frecuentemente ident lf icables como células planas grandes, no refractarias. Si, en cualquier punto, se complementó DMEM/F12 más N2 con suero o mitógenos (complemento FGF-2 o B27) , estas células no neurales se expandieron rápidamente y progresivamente se volvieron el tipo de célula predominante.

Detección de progenitores neurales que expresan La generación de una gran proporción de neuronas y glia diferenciadas sugirió que las células precursoras neurales puedan ser detectables en un punto de tiempo anterior en el protocolo de diferenciación. La Figura 2a muestra un cultivo representativo 4 horas después de colocación en placas. En esta etapa, las células parecen ser morfológicamente no diferenciadas. La soma de la mayoría de las células es pequeña, alargada o de forma oval. Algunas células tienen procesos cortos similares en longitud a sus cuerpos celulares. Estas características morfológicas son similares a las precursoras neurales primarias reportadas previamente (Kalyaní et a l 1997) . Estas células no expresan NF-L o GFAP detectables 3 horas después de la colocación de placas. Después del cultivo durante toda la noche, menos del 1% de la población fue positiva para cualquiera de estos dos marcadores Se examinaron los cultivos para la presencia del filamento intermedio, nestina (Lendahl, et a l . , 1990), el cual se expresa en las células neuroepi teliales . Casi todas las células fueron positivas a la nestina, sin embargo, debido a que la expresión de la nestina ^ no se restringe estrictamente al neuroepitelio P 5 [Hockfield, 1985 #868]. Por lo tanto buscamos un marcador más específico. El factor de transcripción relacionado con SRY Soxl se confina al neuroepitelio de la placa neural y los progenitores neurales divisores en el embrión de ratón precoz (Pevny, datos no publicados) . El gen Sox2 relacionado se expresa en un patrón sobrepuesto que abarca también las células de placa de piso y de cresta neural precoz. El inmunoteñido de células colocadas en placas frescamente con anticuerpos originados contra Soxl y Sox2 reveló que 40-50% de las células fueron positivas (Figura 2b y Figura 3e) . Estas células muy probablemente corresponden a las progenitoras neurales. 20 Selección y purificación de células progenitoras neurales que expresan Sox-2. Para aislar el estanque de progenitoras neurales utilizamos células ES en las cuales se ha integrado el marcador de selección bifuncional/gen relator ßqeo al gen Sox2 mediante recombmacion homologa (ref) . Cuando se indujo para diferenciar como se describe con L anterioridad, aproximadamente 50% de estas 5 células teñidas para la actividad de ß- galactosidasa (Figura 2 y Tabla 1), consistente con la proporción de células que expresan la protema Sox2. Aplicamos G418 a los cultivos de diferenciación para eliminar las células no neurales negativas a Sox2 (Figura 3) . • Se agrego G418 (200 µg/ml) después de la inducción de acido retinoico, ya sea durante el cultivo de cuerpo embrio de o tras la colocación de placas. En ambas condiciones fue evidente la eliminación de apreciable de células. Sin embargo, crucialmente grandes números de células sobrevivieron exhibiendo una • morfología neuroepit el íal típica. Mas alia del 90% de estas células dieron teñido de ß- 20 galactosidasa prominente (Figura 4) . La concordancia con la expresión de proteina Sox2 se confirmo mediante inmunoteñido (Figura 4, Tabla 1) . El factor Soxl relacionado con HMG- caja, un marcador exclusivo de células de la etapa de placa neural plur ipotencial y de precursoras restringidas de CNS en el tubo neural, fue detectable en la gran mayoría de las células. Casi todas las células viables expresaron nestina.

Las células seleccionadas por Sox2 expresan marcadores de especificación de progenitora neural . La organización en desarrollo y subdivisión del sistema nervioso central se realza por modelación temporal y espacial de la expresión génica (Tanabe y Jessell, 1996) . Con objeto de medir la diversidad de diferenciación neural que podria ser alcanzable a partir de células ES en ausencia de organización axial embriónica, hemos comenzado a examinar la expresión de los determinantes clave, los genes Pax y los factores de transcripción bHLH neurogénicos . Los factores de transcripción de caja apareados Pax3 y Pax6 se encuentran en precursoras neurales de división a lo largo del tramo del tubo neural embriónico. Pax3 se expresa inicialmente en la placa neural y subsecuentemente se vuelve indefinido hacia la mitad dorsal del tubo neural (Liem et a l , 1995).

Pax6 se expresa predominantemente en la región ventral del tubo neural (Walther y Gruss, 1991; ^ Tanabe y Jessell, 1996) . La expresión difundida de ambos genes pax se encontró en las células seleccionadas por sox2 analizadas el día de la colocación de placas (Figura 5 y Tabla 2) . Esto sugiere que las precursoras neurales derivadas de células ES pueden adquirir tanto identidades dorsales como ventrales. I Los genes bHLH, mashl y math4A ( neurogenina ) muestran una localización más restringida para los subconjuntos de las progenitoras neurales. La expresión de cada uno se detectó fácilmente en cultivos seleccionados por sox2, pero en insignificantemente menos células que los productos genéticos pax (Figura 5, Tabla 2) . Es probable que la expresión de mashl y math4A especifique sub-poblaciones de progenitoras, ya que la distribución de estos dos factores de transcripción es mutuamente exclusiva en la mayoría de las regiones CNS (Gradwohl et a l . , 1996) . También se examinaron dos marcadores precoces de diferenciación neuronal. El ligante de muesca deltal, el cual se encontró en células comprometidas inmediatamente antes de la diferenciación neuronal (ref), se expreso en solamente 1-2% de las células inmediatamente después de la colocación en placas, indicando que la mayoría de las células no se encuentran comprometidas con la diferenciación terminal (ver también Descripción) . La expresión del ?slote-1/2 de protema de homodominio LIM, un marcador precoz de la diferenciación de neuronas motoras e mterneuronas ventrales (Ericson et a l . , 1992), se examino en cultivos seleccionados por Sox2 48 horas después de la colocación en placas. De manera reproducible 1-2% de las células fueron mmunorreact i vas en esta etapa ( no mostrado ) , Las células seleccionadas por Sox2 prol feran en respuesta a FGF-2. Diversos estudios han presentado evidencia de que el factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF-2) puede soportar la proliferación de progenitoras neurales primarias y lineas de células progenitoras inmortalizadas (Palmer et a l . , 1997). La adición de FGF-2 (lOng/ml) a cultivos seleccionados por Sox-2 estimulo igualmente la proliferación celular. La Figura 6 muestra un cultivo teñido con Xgal típico seguido de la adición de FGF-2. Puede • observarse que todas las células mantienen una morfología relativamente no diferenciada y muestran un fuerte teñido de Xgal. Tales cultivos podrían expandirse y pasarse serialmente durante al menos dos semanas. 10 Diferenciación neuronal de células seleccionadas por Sox2. Con objeto de determinar si las células precursoras seleccionadas por Sox2 mantuvieron la capacidad para la diferenciación neuronal, se extrajo G418 del medio. A las 48 horas las células comenzaron a extender procesos neuríticos y a las 96 horas se había formado una red de células de tipo neurona (Figura 7) . Se perdió la actividad de /?-galactos?dasa de la mayoría de las células (no mostrado) consistentes con la sub-regulacion de Sox2 en las neuronas de diferenciación (ref) . El mmunoteñido confirmo la desaparición de la proteina Sox2 (Figura 7b) . Las cadenas ligera y pesada de neurof ilamento de marcadores pan- neuronales (no mostradas), las proteínas asociadas al microtúbulo (MAPs/tau), /3-tubulina III (Lee et a l . , 1990) y la sinapsina I fueron • 5 detectables de 48 horas en adelante, coincidente con la sub-regulación de Sox2. A las 96 horas, más del 90% de células tenía grandes procesos dendríticos y expresaron marcadores neuronales (Figura 7) . La complementación del 10 medio de cultivo con B27 y suero de caballo ! permitió la maduración adicional de las células neuronales, evidenciadas tanto por el brote incrementado de dendritas y por la producción de neurotransmisores excitadores e inhibidores GABA y glutamato (Figura 7) . El sistema nervioso mamífero se deriva de las células neuroepiteliales del tubo neural y su cresta neural derivada. Durante la neurogénesi s , proliferan estas progenitoras neurales, pierden progresivamente su multipotencialidad y se diferencian finalmente en diversos tipos de neuronas post mitóticas y células guales [Anderson, 1993 #673, McKay, 1989 #672 (Tanabe y Jessell, 1996; McKay, 1997) ] . Los mecanismos implicados en la determinación y diferenciación de las células precursoras neurales son tema de investigaciones intensas. Sin embargo, esto se ha inhibido ^ hasta ahora por la inaccesibilidad relativa y la complejidad del tejido del embrión de mamífero.

Un sistema de modelo m vi t ro de la presente invención en el cual las células neuroepit eliales pueden derivarse y experimentar proliferación y diferenciación proporciona una herramienta poderosa para estudiar factores I intrínsecos y extrínsecos que determinan la especificación y diferenciación neural. Las células ES tienen la capacidad para desarrollarse en cualquier tipo de célula como se evidencia por su colonización de todos los linajes en quimeras (Beddington y Robertson, 1989) . Sin embargo, el prospecto de utilizar las células Es para disecar las trayectorias de desarrollo m vitro se ha frustrado, por una incapacidad para controlar o dirigir la diferenciación. En una modalidad de la invención descrita con anterioridad, se proporciona una estrategia para seleccionar precursoras del linaje de ínteres a partir de cuerpos embrioides en desarrollo. Nuestros resultados demuestran que las precursoras neurales viables pueden aislarse mediante la selección para la actividad del gen Sox2. Estas células pueden inducirse para proliferar o para f 5 diferenciarse en neuronas. Por lo tanto la sobrevivencia y desarrollo del linaje neural i n vi t ro no requiere la interacción continua con otros tipos de células. Además, el descubrir que pueden extirparse componentes celulares significativos sin ocasionar la desintegración de los cuerpos embrioides, ni aparentemente perturbar el desarrollo de las células sobrevivientes es tanto sorprendente como alentador para la aplicación de este planteamiento a otros linajes. De hecho es posible que tal extirpación pueda favorecer el mantenimiento y expansión de poblaciones de células germinales específicas al extraer las fuentes de diferenciación de inducción de señales, las cuales pueden ser ya sea células derivadas de otros linajes o células más maduras del mismo linaje (Mountford y Smith, en comunicación personal) . La expresión heterogénea de los genes de determinación (Figura 5) dentro de los cultivos seleccionados por Sox2 parece ser reflectiva de la especificación de las progenitoras dentro del tubo neural. Por lo » tanto, los requisitos para la inducción, P 5 crecimiento y diferenciación de tipos de progenitora individuales podría investigarse, tanto por la adición de reguladores extracelulares al sistema de cultivo como por la manipulación genética de las células ES antes de la diferenciación. La última particularmente relevante para situaciones en donde la eliminación del gen homocigótico o expresión de transgen i n vi vo originan letalidad embriónica. Además, la capacidad para producir neuronas genéticamente modificadas es propensa a encontrar aplicaciones significantes en la biología y bioquímica celular neuronal. Se ha reportado recientemente que las células ES diferenciadas inyectadas en el cerebro de roedor en desarrollo (Brustle et a l . , 1997) o incluso adulto (Deacon et a l . , 1998) puede colonizar el sistema nervioso huésped y dar origen a fenotipos neuronales maduros. Sin embargo, tales transplantes contienen también células no neuronales. Estas células foráneas pueden dar origen a teratomas y otros crecimientos benignos o malignos. Pueden también interferir con la señalización trófica y pistas de guía del tejido huésped a las células i 5 neurales inyectadas. El aislamiento previo de las precursoras neurales de acuerdo con la invención elimina estos problemas. Además, después de la aplicación de células neurales purificadas de selección de linaje, puede accesarse cualquier etapa de la maduración i n vi tro y cosecharse para transplantes. La invención abre el camino para el desarrollo de células germinales mult ipotenciales humanas análogas a las células ES de ratón de un ejemplo anteriormente citado para el uso clínico en transplantes. Las condiciones neurodegenerativas tales como mal de Parkinson y de Huntington son potencialmente tratables mediante estrategias de reemplazo celular y presentan casos apremiantes para el desarrollo de un recurso de células germinales renovable para la producción de células con capacidad de ser t ransplantadas (Svendsen y Rosser, 1995; Rosenthal, 1998) . El planteamiento de la selección del linaje, en combinación con 'factores instructivas apropiadas, es un componente valioso de tal sistema, al permitir la generación de una población celular definida a partir de una fuente multipotente.

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Tabla 1 Expresión de marcadores neuroepiteliales tras la selección de G418 Marcadores -G 18 +G 18 de teñido positivo (media +/- SEM) /?-galactosidasa 43.8 + 9.4 91 ± 2.6 Sox2 48.4 ± 1.1 95.5 + 1.1 Soxl 46.6 + 5.6 88.7 ± 5.1 Nestina* 90 ± 6.5 94 ± 3.2 Se aplicó G418 a cultivos EB derivados del 6o día de induccióflr'"' en una concentración de 200 µg/ml. Dos días después los agregados se tr ipsini zaron y la suspensión celular se colocó ^fe en el substrato recubierto de poli-D- 5 lisina/laminina en DMEM/F12 más N2. Los cultivos se fijaron 3 horas después de la colocación en placas mediante teñido histoquímico para ?-galactosidasa con X-gal o teñido inmunocitoquímico para Soxl, Sox2 y ^k ' nestina con anticuerpos específicos. Las células teñidas positivamente obtuvieron puntuación bajo un objetivo 40x, se contaron siete a diez campos para cada ejemplo. El resultado se determina como un porcentaje promedio de dos experimentos independientes.

(La nestina* se expresa en el mesodermo somítico además del neuroepitelio) .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo Í contenido en las siguientes reivindicaciones: 5 1. Un método para generar un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a las células de un linaje seleccionado, caracterizado porque comprende: (i) introducir en una célula 10 mult ipotencial un marcador con capacidad de ser seleccionado que se expresa diferencialmente en células del linaje seleccionado en comparación con su expresión en 15 otras células, en donde las células del linaje seleccionado constituyen un sub-conjunto de las células obtenibles a partir de la célula mult ipot encía 1 ; 20 (ii) cultivar la célula mult ipotencial i n vi vo para inducir la diferenciación de la célula mult ipotencial en una célula del linaje seleccionado o en una mezcla 25 de células que incluya las células del linaje seleccionado o para inducir la sobre ivencia preferencial , en un cultivo mixto de células, de células del linaje seleccionado; y (m) seleccionar las células del linaje seleccionado de acuerdo con la expresión diferencial del marcador con capacidad de ser seleccionado introducido en el paso (i) - 2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado para generar un cultivo que se enriquece o purifica con respecto a las células progenitoras de un linaje seleccionado. 3. Un método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la célula mult ipotencial se selecciona a partir de células germinales (ES) embrionicas, células germinales (EG) embrionicas, células de carcinoma (EC) embrionica, un cultivo primario de células fetales, un cultivo primario de células postnatales, y un cultivo primario de células adultas 4. Un método según la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque comprende modificar genéticamente las células mult ipotenciales para eliminar, mutar, substituir, o agregar genes con objeto de (i) ensayar funciones genéticas en células progenitoras del linaje seleccionado, y/o (n) para hacer las células seleccionadas mas adecuadas para transplantes. 5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque comprende : (ív) introducir en la célula mult ipotencial un segundo marcador con capacidad de ser seleccionado que se exprese dif erencialment e en células de un sub-lmaje seleccionado comparado con su expresión en otras células, en donde las células del sub-lmaje seleccionado se forman por la diferenciación de células del linaje de progenitora seleccionada; y (v) cuando se ha obtenido un cultivo de células progemtoras del linaje seleccionado, permitir o inducir la diferenciación de las células y seleccionar las células que expresan el segundo marcador con capacidad de ser seleccionado. 6. Un método según cualquiera de las reivindicación 1 hasta 5, caracterizada porque el marcador con capacidad de ser seleccionado se introduce en la célula mult ipotencial mediante integración objetivo o integración aleatoria de trampa de gen a fin de acoplarse operativamente a un gen que se expresa dif erencialmente en células progenitoras del linaje seleccionado. 7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque el marcador con capacidad de ser seleccionado se introduce en la célula mult ipotencial por medio de integración aleatoria de un transgen en el cual el marcador con capacidad de ser seleccionado se acopla operativamente a un gen que se expresa di ferencialmente en células progenitoras del linaje seleccionado. 8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado porque la célula muí t ipotencial es una célula ES, EG o EC y el método comprenda que forma un cuerpo de embrioide, o de otra manera inducir la diferenciación de las células. 9. Un método según la reivindicación 8, caracterizado porque las células diferenciadas se desasocian a fin de formar un cultivo substancialmente de células individuales , 10. Un método según la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque las células diferenciadas de un cuerpo embrioide se desasocian utilizando una proteasa, tal como tripsina . 11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizado para generar un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a progenitores neurales, que comprende introducir en la célula mult ipotencial un marcador con capacidad de ser seleccionado que se expresa di ferencialmente en células progenitoras neurales. 12. Un método según la reivindicación 11, caracterizado porque el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa en células que expresan un gen Sox. 13. Un método jíjitegún la rei indicación 12, caracterizado porque el gen Sox se selecciona a partir de Sox 1, Sox 2 y Sox 3. 14. Un método según cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 hasta 10, para la generación de células progenitoras cardiacas, caracterizado porque el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa en las células que expresan el gen Nkx 2.5 o GATA-4. 10 15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizado para generar un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a las progenitoras hemat opoyét icas . 16. Un método según la reivindicación 15 15, caracterizado porque el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa en células que expresan CD34, CD44 0 SCL. 17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 16, caracterizado 20 porque el marcador con capacidad de ser seleccionado es un gen con resistencia antibiótica y el método comprende el cultivo en presencia de antibiótico. 18. Un método según la reivindicación 25 5, para obtener un cultivo que se purifica o enriquece con respecto a las células progenitoras ventrales, caracterizado porque el marcador con capacidad de ser seleccionado se ^ expresa di f erencialmente en las células 5 progenitoras neurales y el segundo marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa dif erencialmente en las células progenitoras ventrales . 19. Un método según la reivindicación 10 18, caracterizado porque el segundo marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa di ferencialmente en las células que expresan Pax 6. 20. Un ensayo de la influencia de un 15 factor en un cultivo de células progenitoras de un linaje seleccionado, caracterizado porque comprende : A (i) introducir en una célula multipotencial un marcador con 20 capacidad de ser seleccionado que se expresa di ferencialmente en células progenitoras del linaje seleccionado en comparación con su expresión en otras células, en 25 donde las células progenitoras del linaje seleccionado constituyen un sub-conjunto de las células obtenibles a partir de la célula mult ipotencial,• (ii) cultivar la célula muí t ipot encial ín vi t ro para inducir la diferenciación de la célula mult ipot encial en una célula del linaje seleccionado o en una mezcla de células que incluye células del linaje seleccionado o para inducir la sobrevivencia preferencial, en un cultivo mixto de células, de células del linaje seleccionado; y (iii) seleccionar aquellas células progenitoras del linaje seleccionado de acuerdo con la expresión diferencial del marcador con capacidad de ser seleccionado introducido en el paso (i) , y cultivar las células progenitoras asi obtenidas del linaje seleccionado en presencia del factor . 21. Un método "Tf'egún la reivindicación 20, caracterizado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2 hasta 17. ^ 22. Un método según la reivindicación 5 20 o 21 caracterizado para ensayar si un factor tiene influencia proliferante, de maduración, tóxica o protectora en las células progenitoras del linaje seleccionado. 23. Un método según la reivindicación 10 22 caracterizado para ensayar si un factor tiene influencia proliferante, de maduración, citotóxica o protectora de glial en las células progenitoras neurales. 24. Un método para preparar una célula 15 progenitora neural o una progenie diferenciada de la misma para almacenamiento, caracterizado porque comprende obtener la célula en un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 17 y congelar la célula en presencia de 20 un ciroprotector. 25. Un método para generar neuronas purificadas, caracterizado porque comprende obtener un cultivo purificado con respecto a las progenitoras neurales, utilizando el método de 25 cualquiera de las rei indicaciones 1 hasta 17, en donde el marcador con capacidad de ser seleccionado se expresa di f erencialmente en las células que expresan un gen Sox, y cultivar las k progenitoras obtenidas en presencia de un medio 5 adecuado para la diferenciación de la progemtora en neuronas. 26. Un método según la reivindicación 25, caracterizado según cualquiera de las reivindicaciones 2 hasta 17. 10 27. Un método según la reivindicación í 25 o 26, caracterizado para ensayar si el factor tiene una influencia proliferante, de maduración, toxica o protectora en las células progenitoras del linaje seleccionado. 15 28. Un método según la reivindicación 27, caracterizado para ensayar si el factor tiene una influencia proliferante, de maduración, citotoxica o protectora de glial en las células progenitoras neurales. 20 29. Una célula progenitora neural, o un cultivo caracterizado porque comprende una mayoría de células progenitoras neurales, para transplantes . 30. Una célula o células según la 25 reivindicación 29, carácter i zada ( s ) porque las células progenitoras neurales son células neuronales . 31. Una célula o células según la ^ reivindicación 29, carácter i zada ( s ) porque las 5 células progenitoras neurales son células guales . 32. Un método para preparar una célula progenitora neural o una progenie diferenciada de la misma para almacenamiento, caracterizada 10 porque comprende obtener la célula en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 17 y congelar la célula en presencia de un ciroprotector . 33. Un método para generar neuronas 15 purificada que comprende obtener un cultivo purificado con respecto a las progenitoras neurales, que utiliza el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 17 caracterizado porque el marcador con capacidad de ser 20 seleccionado se expresa diferencialmente en las células que expresan un gen Sox, y cultivar las progenitoras obtenidas en presencia de un medio adecuado para la diferenciación de la progenitora en neuronas. 25 34. Una célula progenitora neural para transplantes para a fin de tratar enfermedades neurodegenerativas o daño neuronal /cerebral . 35. Una célula progenitora neural para transplantes, obtenible de una célula seleccionada a partir de una célula ES, una célula EC, una célula EG, un cultivo primario de células fetales, un cultivo primario de células post-natales y un cultivo primario de células adultas, caracterizada para transplantes a fin de tratar enfermedades neurodegenerativas o daños neuronales /cerebrales . 36. Un método de tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o daños neuronales /cerebrales caracterizado porque comprende el transplante de una célula progenitora neuronal. 37. Un método para amplificar una población purificada de células progenitoras de un linaje seleccionado, caracterizado porque comprende mantener las células en cultivo en presencia de un mitógeno; y un factor de crecimiento 38. Un método según la reivindicación 37, caracterizado porque las células progenitoras comprenden una codificación genética para un marcador con capacidad de ser seleccionado, cuyo gen se expresa diferencialmente en las células progenitoras comparadas con su expresión en otras células, y porque el método comprende además seleccionar las células que expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado. 39. Un método según la reivindicación 38, caracterizado porque el método comprende mantener el cultivo sobre una pluralidad de generaciones y seleccionar periódicamente las células que expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado. 40. Un método según la reivindicación 38, caracterizado porque el método comprende mantener el cultivo sobre una pluralidad de generaciones y seleccionar continuamente las células que expresan el marcador con capacidad de ser seleccionado. 41. Un método según la reivindicación 40, caracterizado porque el marcador con capacidad de ser seleccionado es de resistencia antibiótica y el método comprende el cultivo continuo en presencia dé'?tibiotico.