MXPA00009770A

MXPA00009770A - Nuevas secuencias nucleotidicas que codifican para el gen irp.

Info

Publication number: MXPA00009770A
Application number: MXPA00009770A
Authority: MX
Inventors: Bathe Brigitte
Original assignee: Degussa
Priority date: 1999-10-05
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2002-05-23
Also published as: KR20010050827A; DE19947792A1; CA2319722A1; ID28131A; BR0004642A; ZA200005412B; SK14592000A3; HUP0003894A2; PL342985A1; HU0003894D0; JP2001128692A; EP1090993A1; AU6245100A; CN1290746A

Abstract

La invencion se refiere a un polineuclotido aislado que contiene una secuencia polinucleotida seleccionada del grupo: a) polinucleotido que cuando menos al 70% es identico con un polinucleotido, que codifica para un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacido de SEQ ID I2; b) polinucleotido que codifica para polipeptido que contiene una secuencia de aminoacido que cuando menos 70% es identico con la secuencia aminoacido de SEQ ID NO 2; c) polinucleotido que es completamente a los polinucleotidos de a) o b), y d) polinucleotido que contiene cuando menos 15 bases sucesivas una a la otra de la secuencia polinucleotido de a), b) o c); y procedimiento para la preparacion fermentativa de L-aminoacidos con fortalecimiento o debilitamiento del gen 1rp.

Description

NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN PARA EL GEN lrp CAMPO DE LA INVENCIÓN Es objeto de la presente invención secuencias nucleótidas codificantes para el Gen lrp y procedimiento para la preparación fermentativa de aminoácidos, especialmente Usina y isoleucina utilizando bacterias corineform.es, en las cuales la expresión del gen lrp se influya .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los L-aminoácidos encuentran aplicación en la nutrición de animales, en la industria de los alimentos, y la medicina humana y en la aplicación de la industria farmacéutica. Es conocido que esos aminoácidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes especialmente Corynebacterium glutamicum se producen. Debido a la gran importancia se trabaja constantemente en el mejoramiento del procedimiento de fabricación. Mejoras en el procedimiento pueden ser medidas técnicas de fermentación como agitación y alimentación con oxigeno, o la composición de los medios de nutrición como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación o la elaboración a la forma del Ref: 123581 producto por ejemplo por cromatografía de intercambio de iones o las propiedades intrínsecas de carga del propio microorganismo. Para la mejora de las propiedades de carga o potencia de estos microorganismos se utilizan métodos de la mutagenesis, selección y selección de mutación. De esta manera se obtienen cepas, que son resistentes contra antimetabolitos como por ejemplo lisin - análogo S- (2-aminoetil) cisteina o auxotropos para aminoácidos de significado regulatorio y que producen L-aminoácidos. Desde hace algunos años se han aplicado igualmente métodos de la técnica de recombinación ADN para la mejora de cepas L- aminoácidos que producen cepas de corynebacterium. LRP (leucina-proteína responsable) es un regulador global primeramente descrito para Escherichia coli, el cual influye la transcripción de una serie de genes, cuyo producto de gen toma parte en el transporte, la biosíntesis y la disociación o descomposición de aminoácidos (Calvo y Matthe s, Microbiological Revie s 58, 466 490, 1994) . En los últimos años se identificaron genes similares también en otros organismos como Bradyrhizobium japonicum (King y O'Brian Journal of Bacteriology, 179, 1828, 1831, 1997) Klebsiella aerogenes (Janes y Bernder, Journal of Bacteriology, 181, 1054 - 1058, 1999), Sulfulobus ácidocaldarius (Charlier y soc, Gene 201, 63- 68, 1997) y en el Bacterium Bacillus subtilis gram positivo (Belitsk y asoc, Journal of Bacteriology, 179, 5448-5457, 1997) . La proteína Lrp regular en E. coli su propia expresión, Lrp influye además en E.Coli la expresión de muchos genes, ya sean negativos o positivos. En lo general aquí se estimula la expresión de los productos de gen, que son activos en formas biosintéticas . Productos de gen, que son activos catabolícamente, se regulan por regla general negativamente. En algunos casos se potencia el efecto de Lrp por la adición de L-Leucina, mientras que la adición L-Leucina también puede actuar negativamente (Newman y asoc; Neidhardt y asoc Escherichia coli y Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology. American Society for microbiology, Washington D.C 1513- 1525, 1996) por LRP se regulan en E. coli un gran numero de genes y operones, los cuales en la síntesis de aminoácidos y en el catabolismo de los aminoácidos representan un papel central. En E. coli por ejemplo se regulan los siguientes operones por Lrp negativamente.: liv j, el cual para una proteína de enlace codifica para un sistema de toma de alta afinidad de aminoácidos de cadena ramificada (Haney y asoc. Journal of Bacteriology , 174, 108-115, 1992) y lysU, que codifica la síntesis de tRNA de lisina (Gazeau et asoc., FEBS Letters, 300, 254- 258, 1994). Los hasta ahora conocidos en E. coli genes influidos positivamente pertenecen entre otros, ilvlh, gltBDF y leuABCD (Lin et asoc, Journal of Bacteriology , 174, 1948-1955, 1992) . El ultimo operon mencionado es de un interés básico para la biosintesis de leucina y de interés especial para la biosintesis de lisina de corynebacterium glutamicum. Se sospecha que existe una unión en la auxotrofia -leucina y elevadas productividades de lisina (Schrumpf et asoc Applied microbiology and Biotechnology, 37, 566-571, 1992) . Patek y asoc. (Applied and Enviromental Microbiology, 60, 133-140, 1994) mostraron que una inactivación de leuA en algunos productores de lisina desde C. glutamicum conduce a elevados rendimientos de lisina. Tosaka et asoc.

(Agricultural Biological Chemistry 43, 265- 270, 1979) pudieron alcanzar en una mutante de Brevibacterium lactofermentum por la adición de L-Leucina una disminución de la formación de lisina con un aumento simultaneo de la formación de treonina.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores se han propuesto la tarea de establecer nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de L- aminoácidos especialmente L-Lisina y L-Isoleucina con bacterias corineformes .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención es un olinucleótido aislado de bacterias corineform.es, que contiene una secuencia de polinucleótido, seleccionada del grupo a) polinucleótido, que cuando menos al 70% es idéntico con un polinucleótido, que codifica para un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de SEQ ID No. 2; b) Polinucleótido que codifica para un polipeptido, que contiene una secuencia aminoácida, que cuando menos al 70% es idéntica con la secuencia aminoácida de SEQ ID no 2; c) Polinucleótido, que es complementario a los polinucleótidos de a) y b) y d) Polinucleótido que contiene cuando menos 15 bases sucesivas una a la otra de las secuencias polinucleótidas de a) , b) o c) .

Es objeto de la invención igualmente el polinucleótido según la reivindicación 1, donde preferentemente se trata de un ADN reproducible, conteniendo: (i) la secuencia nucleótida , mostrada en SEQ -ID No 1, (ii) cuando menos una secuencia, que corresponda a la secuencia (i) dentro de la zona de degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia, sea híbrida con la secuencia complementaría a la secuencia i) o ii) y dado el caso, (iv) mutaciones de sentido neutrales de función en (i) Otros objetos son: un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, conteniendo la secuencia nucleótida como se representa en SEQ ID no 1; un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, que codifica para un polipeptido, que contiene la secuencia aminoácida, como se representa en SEQ ID No 2. Es igualmente objeto de la invención polinucléotidos, que en lo esencial consistan de una secuencia polinucleótida, los cuales sean obtenibles por Screening por medio de hibridación de un banco de gen correspondiente, que contenga el gen completo con la secuencia polinucleótida correspondiente SEQ ID No 1, con una sonda, que contenga la secuencia del polinucleótido mencionado según SEQ ID No 1 o un fragmento de la misma y se aisle la secuencia ADN mencionada. Secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención son adecuadas como sondas de hibridación para RNA, cADN y ADN, para aislar en toda la longitud cADN, que codifican para proteína LRP y para aislar cADN o genes, que presenten una gran similaridad de la secuencia con la del gen lrp. Secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención son adecuadas además como cebador para la preparación de ADN desde genes, que codifican proteína lrp, por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebador contienen cuando menos 30, preferentemente 20, hasta preferentemente 20, todavía mas preferentemente cuando menos 15 bases sucesivas. Son igualmente adecuados oligonucleótidos con una longitud de cuando menos 40 o 50 pares de bases. "aislar" significa el separar de su campo rodeante natural. "polinucleótido" se refiere en lo general a poliribonucleótidos y polideoxiribonucleótidos, donde puede tratarse de ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Bajo "polipeptido" se entienden peptidos o proteínas que contienen dos o mas aminoácidos unidos por medio de uniones de peptidos. Los polipéptidos según la invención incluyen un polipeptido de acuerdo con SEQ ID No 2, especialmente tales con actividad biológica de la proteína Lrp y también aquellos, que cuando menos 70% son idénticos con el polipeptido según SEQ ID No 2, preferentemente en 80% y especialmente idénticos en un 90 a 95% con el polipeptido según SEQ Id No 2 y presenten la actividad mencionada. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación fermentativa de aminoácidos especialmente L-Lisina y L-Isoleucina por medio de bacterias corineformes, que especialmente ya producen aminoácidos, cuando el nuevo gen lrp se fortalece o debilita en dependencia de la substancia perseguida. El concepto "reforzar" describe en esta dependencia el aumento de la actividad intercelular de una o de varias enzimas en un microorganismo, que se codifica por el 10 correspondientes ADN, cuando por ejemplo, el numero de copia del gen o de los generes se aumenta, se utiliza un promotor fuerte o un gen, que codifica para una enzima correspondiente con una actividad mas elevada y dado el caso la combinación de esas medidas. El concepto "debilitar" describe en esta dependencia a disminución o exclusión de la actividad intercelular de una o varias enzimas (proteínas) en un microorganismo, que se codifica por el ADN correspondiente, cuando por ejemplo se utiliza una promotor débil o un gen o alelo que codifica para una enzima correspondiente con una actividad mas baja las enzima correspondiente (proteína) se inactiva y dado el caso se combinan esas medidas. Los microorganismos, que son objeto de la presente invención, pueden prepararse de L-Lisina, de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, elasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol. Se puede tratar de un representante de bacterias corineformes especialmente de la especie corinebacterium. En la especie corynebacterium ha de mencionarse especialmente la clase Corynebacteriunmm glutamicum, que en la técnica es conocida por su capacidad, para producir L- aminoácidos. 11 Cepas adecuadas de la especie Corynebacterium, especialmente del tipo Corynebacterium glutamicum, son por ejemplo las cepas del tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoácidophilum ATCC13870 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 y los aminoácidos producidas de ellas producen mutantes o cepas, como por ejemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM5715 Las cepas o las cepas productoras de L-isoleucina Corynebacterium glutamicum ATCC 14309 Corynebacterium glutamicum ATCC 14310 Corynebacterium glutamicum ATCC 14311 12 Corynebacterium glutamicum ATCC 15168 y Corynebacterium ammoiagenes ATCC 6871. Los inventores han conseguido aislar el nuevo gen lrp de C glutamicum codificante de la proteína lrp. El aislamiento del gen lrp o también de otros genes de C glutamicum es primeramente un banco de gen de este microorganismo puesto en E.Coli. La presentación de bancos de gen se describe en lo general en libros de texto y manuales. Como ejemplo se pueden mencionar el texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung Gentechnologie (Edit. Chemie, Wwinheim, Alemania, 1990) o el Manual de Sambrook y Aso. Molecular Cloning, un Laboratorio y Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un banco muy conocido es el E. coli K-12 cepa W3110, que fue presentado por Kohara y Asoc. (Célula 50, 495 - 508 (1987)) en vectores Lambda. Bathe y Asoc. (Molecular and General Genética, 552>255/265, 1996) describen un banco de gen de C. glutamicum ATCC13032, los cuales con ayuda del vector de cosmido SuperCos II (Wahl y Asoc. 1987, Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) en la cepa E.coli K-12 NM554 (Raleigh y Asoc., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) Bormann y Asoc. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) de nuevo describen un banco de gen de C. glutamicum 13 ATCC13032 con utilización de Cosmits pH C 79 (Hohn und Collins Gene 11,291-298 (1980)) para la preparación de un banco genético de C. glutamicum en E.coli también pueden utilizarse plas idos como pBr322 (Bolívar Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Viera y Asoc. 1982 Gene, 19:259-268). Como hospedantes son apropiados especialmente tales cepas E.coli, que son de efectos de restricción y recombinación. Un ejemplo para ello es la cepa DH5ocMcr. que se describió por Grant y Asoc. (Proceeding of the National Academy of Science USA, 87 (1990) 4645-4649) . Los fragmentos ADN largos clonados con ayuda de cosmidos pueden a continuación otra vez de acuerdo con los vectores adecuados para la secuencia sub-clonarse y a continuación ponerse . en secuencia, como se describe por ejemplo Sanger y Asoc. (Proceeding of the National Academy of Science USA, 74:5463-5467, 1977). De esta manera se obtuvo para la nueva secuencia ADN, de C glutamicum codificante para el gen lrp, que es parte constitutiva de la presente invención como SEQ ID NO 1. Además, se derivo desde la presente secuencia ADN con los métodos anteriormente descritos la secuencia aminoacida de la proteína correspondiente. En SEQ ID N02, se representa la secuencia aminoacida que se produce del producto gen lrp. 14 Las secuencias ADN codificantes, que se producen desde SEQ ID NOl, por la degeneración del código genético son igualmente parte constitutiva de la invención. De igual manera es parte de la invención secuencias ADN que se hibridizan con SEQ ID NOl o partes de la misma. En el mundo técnico, son conocidos otros intercambios aminoácidos conservativos como por ejemplo, intercambio de glicina por alanina o de ácido asparagínico contra ácido glutamínico en proteínas como "mutaciones de sentido", que no conducen a ninguna variación básica de la actividad de la proteína, esto es son neutras en la función. Además, es conocida la variación en él termino N y/o C, de una proteína cuya función no se modifica esencialmente o hasta puede estabilizarse. Datos sobre ello encuentra el técnico entre otros en Ben/Bassat y Asoc. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), bei O'Regan y asoc. (Gene 77:237-251 (1989)), bei Sahin-Toth y asoc. (Protein Sciences 3:240/247 (1994)), bei Hochuli y asoc. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en textos conocidos de genética y biología molecular. Las secuencias de aminoácido que se producen de manera adecuada desde SEC ID NO 2, son igualmente partes constitutivas de la invención. 15 De igual manera, son las secuencias ADN que se hibridizan con SEC ID NO 1, o partes de la misma, parte constitutiva de la invención. Finalmente las secuencias ADN son partes de la invención, que se preparan por reacción en cadena polimerasa (PCR) utilizando cebadores, que se producen desde SEC ID NO 1, tales oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de cuando menos 15 pares de bases. Derivaciones para identificación de las secuencias ADN por medio de hibridización las encuentra el técnico en el Manual "The DIG Systems Users Guide for Filter Hybridization" de la firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania 1993) , y en Liebl y asoc. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260). Indicaciones para la amplificación de secuencias ADN con ayuda de la reacción de cadena polimerasa (PCR) la encuentra el técnico entre otros en el Manual de Gait: Oligonukleotidos synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer, Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994) . Los inventores encontraron que el gen lrp, es importante para la preparación de aminoácidos, especialmente L-licina y L-isoleucina. 16 Los inventores encontraron además, que la sobre expresión adicional de una o más encimas del camino de la bio síntesis correspondiente, de la glicolisis, del ciclo del ácido cítrico del metabolismo anapletórico o de la exportación de aminoácido individualmente o en combinación produce otras ventajas para la preparación de aminoácidos, especialmente L-licina y L-isoleucina. Así puede por ejemplo, para la fabricación de L-licina simultáneamente sobre exprimirse la síntesis dihidrodipicolinato que codifica el gen dapA (EP-B 0 197 335), o simultáneamente el gen gap codificante para la dehidrogenasa glicerinaldehido-3-fosfato (Schwinde y soc., Journal of Bacteriology 175: 3905-3908 (1993)), o . simultáneamente el gen mqo codificante para la Malat:Chinon Oxidoreductasa (Molennar y asoc., European Journal of Bioche istry 254, 395-403 (1998)), o . simultáneamente el gen pyc codificante para la carboxilasa Pyruvat (DE-A-19 831 609) , o . simultáneamente el gen LysE codificante para el Export-Lisina (DE-A-195 48 222) . Asi por ejemplo, para la preparación de L-isoleucina se puede sobre exprimir 17 . simultáneamente el gen ilvA codificante para la dehidratasa -treonina (Mocker y asoc. Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072) ) o el gen ilvA codificante para una dehidratasa treonina "feed back resistente" (Fbr)-Allel (Mockel y asoc. (1994) Molecular Microbiología 13: 833-842) o simultáneamente el gen gap codificante para la dehidrogenasa aldehido de glicerina -3 fosfato (Schwinde y asoc., Journal of Bacteriology 175: 3905-3908 (1993)), o simultáneamente para el gen mqo codificante a malato: quiñón óxido reductasa (Mollenar y asoc., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), o . simultáneamente el gen pyc codificante para la carboxilasa Piruvirato (DE-A-19 831 609) . Además, puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos especialmente L-licina y L-isoleucina el impedir reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en Overproduction of Microbial Products, Krumphazl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982) . Los micro organismos pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimiento en lotes o en procedimiento fed batch o en un procedimiento repeated fed batch con el fin de la producción de aminoácidos, 18 especialmente L-lisina y L-isoleucina. Un resumen de los métodos de cultivo conocidos, se presentan en al Manual de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el Manual de Storhas (Biorealtoren und periphere Einnrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbadem 1994) ) . El medio de cultivo que ha de utilizarse debe de manera adecuada cumplir las reivindicaciones de cada cepa. Descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos se presentan en "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Kohlenstoffquelle (Washington D.C., USA, 1981). Como fuentes de carbono pueden servir azúcar y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y grasa de coco, ácidos grasos, como por ejemplo ácido palmitidico, estearínico, ilicoico, alcoholes por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos por ejemplo ácido acético. Estas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezcla. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos que contengan nitrógeno orgánicos, como 19 peptona, extracto de avena, extracto de carne, extracto de melaza, agua de fuente de maíz, harina de frijol de soya y urea o compuestos inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o como mezcla. Como fuentes de fósforo pueden servir ácido fósforos, fosfato dihidrogenato de potasio o fosfato hidrogeno de dipotasio, o las sales correspondientes que contengan sodio. El medio de cultivo debe además contener otras sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, pueden utilizarse materiales deseables como aminoácidos y vitaminas, además de las substancias mencionadas. Al medio de cultivo pueden agregarse pre-etapas adecuadas. Las substancias mencionadas pueden agregarse al cultivo en forma de una aplicación de una sola vez o de manera adecuada irse alimentando durante el cultivo . Para el control pH del cultivo, se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua de amoníaco o compuestos ácidos, como ácido fósforos o ácido sulfúrico de manera adecuada. Para el 20 control del desarrollo de la espuma, pueden agregarse agentes anti espumantes por ejemplo, ester poliglicol de ácido graso. Para mantener correcta la estabilidad de los plasmidos, pueden agregarse al medio agentes activos seleccionados, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aerobicas correctas, se aplican oxígeno o mezclas gaseosas que lo contengan por ejemplo aire al cultivo. La temperatura del cultivo queda normalmente de 20° C a 45°C y preferentemente de 25 a 40° C. El cultivo sé continua hasta que se forma un máximo del aminoácido deseado. Este objeto normalmente se alcanza en un plazo de 10 a 160 horas. El análisis de los aminoácidos se puede realizar por una cromatografía de intercambio de aniones con una siguiente derivación de ninhidrina, como se describe en Spackman y asoc. (Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190) o se puede realizar por fase invertida HPLC, como describen Lindroth y asoc. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174). El procedimiento de acuerdo con la invención sirve para la preparación fermentativa de aminoácidos, especialmente L-lisina y L-isoleucina. Ejemplos La presente invención, se describirá 21 detalladamente a continuación en referencia a ejemplos de realización. Ejemplo 1 : Preparación de un banco de gen cosmido genomico hecho de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ADN cromosomico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 se describió por Tauch y asoc. (1995, Plasmid 33:168-179), se aisló y se disocio parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del producto Sau3AI, Cod. no. 27-0913-02) . Los fragmentos ADN fueron defosforilizados con fosfatasa alcalina encogedora (Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Alemania, descripción producto SAP. Cod. no. 1758250) . Los ADN del vector de cosmido SuperCosl (Wahl y asoc. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164) en referencia de la firma Strategne (La Jolla, USA, descripción de producto SuperCosl equipo de vector cosmido, Código no. 251301) se disocio con la enzima de restricción X da I (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del producto Xvai Cod. no. 27-0948-02) e igualmente defosforilizada con fosfatasa alcalina encogedora de camerón. A. continuación el ADN de cosmido se disocio con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, 22 Descripción del producto BamHI Cod. no. 27-0868-04. La ADN cosmid tratada de esta manera se trato con la mezcla ATCC 13032-ADN tratada y la aplicación de ligasa de ADN T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del producto ligasa T4-ADN, Cod. no. 27-0870-04) . La mezcla de ligamiento fue empacada a continuación con ayuda del Gigapack II XL Packing Extracts (la firma Strategne (La Jolla, USA, descripción del producto Gigapack II XL Packing Extracts (la firma Strategne Cod. no. 200217) en Phageno. Para la infección de la cepa E.coli NM554 (Raleigh y asoc. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) fueron las células en 10 mM MgS04 tomadas y mezcladas con una alícuota de suspensión fageno. La infección y él titulo del banco cosmido se realizaron como se describe en Sambrook y asoc. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) . Donde las células se inocularon sobre LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + lOOµg/ml ampicilina. Después de la incubación durante la noche se seleccionaron a 37° C, clones individuales recombinantes . Ejemplo 2: Aislamiento y secuencia del gen rlp. EL ADN cosmido de una colonia individual, se aisló después de que se produjo la preparación con el Quiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 23 27106, Quiagen, Hilden, Alemania) y se disociaron parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI producto no. 27-0913-02) parcialmente. (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del producto. Los fragmentos ADN fueron defosforilados con fosfatasa alcalina de camerón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP. producto no. 1758250) . Después de una separación electroforética de gel, se realizo el aislamiento de los fragmentos cosmido en la zona mayor de 1500 a 2000 bp con el juego QuiExII Gel Extraction .Kit (Producto no. 20021, Quiagen, Hilden Alemania) . El ADN del vector de secuencia pZero-1 en referencia de la firma Invitrogen (Groningen, Holanda, escrp. del producto Zero Background Cloning Kit, producto no.l K2500-01) que se disocio con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del producto no. 27-0868-04) . La ligasón de los fragmentos de cosmido en el vector de secuencia pZero-1, se realizo como se describe por Sambrook y asoc. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , donde la mezcla ADN se incubó con T4-ligasa (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) durante la noche. Esta mezcla de ligado a continuación se electroporifico en la cepa E. coli DH5ßMCR (Grant, 1990, 24 Proceedings of the National Academy of Sciences USA. , 87- 4645-4649) (Tauch y asoc. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) y se aplano en LD-Agar (Lennox 1955 Virology, 1:190) + 50 µh/ml Zeocina la preparación del plasmido de los clones recombinados se realizo con el biorobot 9600 (producto no. 900200 Quiagen, Hilden, Alemania), la secuencia se realizo por el método de interrupción de cadena -dideoxi de Sanger y asoc. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA., 74: 5463-5467 con modificaciones de Zimmermann y asoc. 1990, Nucleic Acids Research, 18:1067), se aplico el "RR Rhodamin Terminaton Cuele Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (Producto no. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación electroforetica con gel y. análisis de la reacción de secuencia se realizo en una gel "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29:1) (producto no. A124.1, - Roth, Karlsruhe, Alemania) con el aparato "ABI Prism 377" de secuencia de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos de secuencia crudos o toscos obtenidos, se procesaron a continuación con utilización del Staden- Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) Versión 97-0. Las secuencias individuales de los derivados pZero 1, se ensamblaron en un Contig dependiente en común. El análisis de la zona de codificación apoyada en computadora 25 se realizo con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acide Research, 14:217-231) otros análisis se realizaron con el "BLAST search programs" (Altschul y asoc. 1997, Nucleic Acide Research, 25:3389-3402), contra el banco de datos NCBI no redundante de "National Library of Medicine" (USA) . La secuencia nucleótida obtenida, esta en SEQ ID1. El análisis de la secuencia nucleótida se realizo en un lector abierto de 462 pares de bases que se señalo como gen lrp. El gen lrp, codifico para un polipeptido de 154 aminoácidos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 26 PROTOCOLO DE SECUENCIAS <110> Degussa-Hüls AG <120> Nuevas secuencias nucleotidas que codifican al Gen lrp. <130> 99012G BT <140> 10 <141> <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 15 <210> 1 <211> 715 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum 20 <220> <22l> -35_Serial <222> (62) .. (67) 25 <220> <22i> -??_Serial <222> (88) .. (93) <220> 30 <221> CDS <222> (151) .. (612) <400> 1 gccgataacc tttatcatct ggttccaggg ctgccttgga tggcgacacc tccaggcttg 60 35 aatgaatctc ttgcgttttt tgcacactac aatcatcaca caattgccgg gtagttttgt 120 tgccagtttg cgcacctcaa ctaggctatt: gtg caá tat atg aag cta gat tcc 174 Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser 40 1 5 att gat cgc gca att att gcg gag ctt age gcg aat gcg cgc ate tea 222 lie Asp Arg Ala He He Ala Glu Leu Ser Ala Asn Ala Arg He Ser 10 15 20 45 aat etc gca ctg gct gac aag gtg cat etc act ceg gga ect tgc ttg 270 Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val His Leu Thr Pro Gly Pro Cys Leu 25 . 30 35 40 50 agg agg gtg cag cgt ttg gaa gcc gaa gga ate att ttg ggc tac age 318 Arg Arg Val Gln Arg Leu Glu Ala Glu Gly He He Leu Gly Tyr Ser 45 50 55 gcg gac att cae ect gcg gtg atg aat cgt gga ttt gag gtg acc gtg 366 •55 Ala Asp He His Pro' Ala Val Met Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val 60 65 ' 70 gat gtc act etc age aac ttc gac cgc tcc act gta gac aat ttt gaa 414 Asp Val Thr Leu Ser Asn Phe Asp Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu 60 75 80 85 age tcc gtt gcg cag cat gat gaa gta ctg gag ttg cae agg ctt ttt 462 Ser Ser Val Ala Gln His Asp Glu Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe 90 95 100 65 27 ggt tcg cea gát tat ttt gtc cgc ate ggc gtt gct gat ttg gag c.

Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Val Arg He Gly Val Ala Asp Leu Glu / 105 110 115 5 tat gag caá ttt tta tcc agt cae att caá acc gtg cea gga att Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser His He Gln Thr Val Pro Gly He 125 130 135 aag ate tea tea cgt ttt gct atg aaa gtg gtg aaa cea gct cgc 10 Lys He Ser Ser Arg Phe Ala Met Lys Val Val Lys Pro Ala Arc 140 145 150 cag gtg tgaagcatgc attttgaagc atgaatcttt ttcatctagt gaaggact Gln Val 15 tcccatgcgt atgaaatcaa tcgcagcaat tgcaatcgct accgccgccc tgg <210> 2 20 <211> 154 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 25 Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser He Asp Arg Ala He He Al; 1 5 10 1! Leu Ser Ala Asn Ala Arg He Ser Asn Leu Ala Leu Ala Asp Ly 20 • 25 30 30 His Leu Thr Pro Gly Pro Cys Leu Arg Arg Val Gln Arg Leu Gl 35 40 45 Glu Gly He He Leu Gly Tyr Ser Ala Asp He His Pro Ala Va 35 50 55 60 Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val Asp Val Thr Leu Ser Asn Ph 65 70 75 40 Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu Ser Ser Val Ala Gln His As 85 90 ? Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Va 100 105 110 45 He Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser 115 120 125 He Gln Thr Val Pro Gly He Ala Lys He Ser Ser Arg Phe Ala l 50 130 135 140 Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro Gln Val 145 150 55

Claims

28
REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Polinucleótido aislado desde bacterias corineformes que contienen una secuencia polinucleótida seleccionada de los grupos: a) polinucleótido que cuando menos al 70% es idéntico con un polinucleótido, que codifica para un polipeptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID 12; b) polinucleótido que codifica para un polipeptido que contiene una secuencia de aminoácido que cuando menos 70% es idéntico con la secuencia aminoácido de SEQ ID NO 2/ c) polinucleótido que es complementario a los polinucleótidos de a) o b) , y d) polinucleótido que contiene cuando menos 15 bases sucesivas una a la otra de la secuencia polinucleótido de a) , b) o c) . 2.- Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque, el polinucleótido es un ADN recombinante, replicable en bacterias corineformes.
3.- Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque, el polineuclotido es una ARN. 29
4.- Polineuclotido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque, contiene la secuencia de ácido nucleótico como se representa en SEC ID NO 1.
5.- ADN replicable de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizado porque, contiene: (i) la secuencia necleotida mostrada en SEQ-ID-No. 1, o (ii) cuando menos una secuencia la cual corresponde a la secuencia (i) dentro de la zona de la degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia hibridizada con la secuencia complementaría a la secuencia (i) o (ii) , y dado el caso (iv) mutaciones de sentido neutrales de función en (i) .
6.- Secuencia polinucleótida de acuerdo con la reivindicación 2, que codifica para un polipeptido que contiene la secuencia aminoácida representada en SEQ ID NO 2.
7.- Procedimiento para la preparación de ácidos L-aminoácidos caracterizado porque, se realizan los siguientes pasos: 30 a) fermentación de las bacterias que producen el L-aminoácido deseado, en las cuales cuando menos el gen lrp, se debilita o refuerza; b) establecimiento del producto deseado en el medio o en las células de las bacterias; y c) aislamiento del L-aminoácido .
8.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque, se utilizan bacterias en la cual adicionalmente se refuerzan otros genes del camino de biosintesis del L-aminoácido deseado.
9.- Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizado porque, se utilizan bacterias en las cuales el camino de metabolismo se desconecta cuando menos parcialmente, los cuales disminuyen la formación del L-aminoácido deseado.
10.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque, se utiliza una cepa transformada con un vector plasmido, y el vector plasmido lleva la secuencia necleotida codificante para el gen lrp.
11.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque, se introduce en el gen lrp de la bacteria un retardo o inserción para debilitar. 31
12.- Procedimiento con una o varias de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque, se utilizan bacterias corineformes que producen L-aminoácido.