MXPA00009561A - Cepas microbianas y procesos para la fabricacion de biomateriales. - Google Patents
Cepas microbianas y procesos para la fabricacion de biomateriales.Info
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Abstract
Se proporcionan ADN y cepas microbianas geneticamente modificadas construidas empleando estos constructos de ADN que producen una enzima nucleasa con especificidad para ADN Y/o ARN. Estas cepas secretan nucleasas en el periplasma o medio de crecimiento en una cantidad efectiva para incrementar la productividad y/o recuperacion del polimero, y son especialmente adecuadas para su uso en procesos de fomento de alta densidad de celulas. Estos constructos son utiles para modificar cepas microbianas para mejorar procesos de produccion y recuperacion para polimeros tales como proteinas intracelulares, tales como enzimas, factores de crecimiento, y citocinas; para la produccion de polihidroxialcanoatos; y para la produccion de polisacaridos extracelulares tales como goma xantano, alginatos, goma gelano, zooglano, acido hialuronico y celulosa microbiana.
Description
CEPAS MICROBIANAS Y PROCESOS PARA LA FABRICACIÓN DE BIOMATERIALES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Se reclama prioridad con base en la solicitud provisional norteamericana No. de serie 60/079,938, presentada el día 30 de Marzo de 1998. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente al ámbito de sistemas bacterianos genéticamente manipulados para la producción y recuperación mejoradas de polímeros tales como, por ejemplo, proteínas intracelulares, materiales de polihidroxialcanoato, y polisacáridos extracelulares. Las fermentaciones microbianas se emplean para la fabricación de un gran número de productos farmacéuticos e industriales, incluyendo antibióticos, ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas, vitaminas, polímeros tales como polihidroxialcanoatos, y polisacáridos (Atkinson & Mavituna, "Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook" (Manual de Ingeniería Química y Biotecnología) , 2a edición (Stockton Press, EUA 1991) ) . La productividad y recuperación mejoradas de un producto más altamente purificado son áreas principales de desarrollo para incrementar las utilidades. Para muchos de estos productos, la tendencia en la industria generalmente es hacia fermentaciones con densidades mayores de células con el objeto de incrementar la productividad. Densidades celulares superiores a 100 g/L se logran de manera rutinaria. L disminución de los costos globales de procesos de fermentació mediante el incremento de la recuperación del producto partir de la biomasa celular o bien, en algunos casos a parti del medio, es otra forma de incrementar la productividad. Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son materiales termoplástico biodegradables y biocompatibles, producidos a partir d recursos renovables, con un amplio rango de aplicacione industriales y biomédicas (Williams & Peoples, CHEMTECH 26:38 44 (1996) ) . Se han descrito varias cepas bacterianas procesos de fermentación para la producción de PHAs, tales como los mencionados, por ejemplo, en Lee & Chang, Advances i Biochemical Engineering Biotechnology, 52:27-58 (1995); Poirier et al., Bio/Technology 13:142-50 (1995); Doi, Macromol. Symp. 9 :585-99 (1995). Métodos de producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) empleando cepas bacterianas específicas se describen en las patentes Norteamericanas No. 4,477,654 de Holmes et al., No. 5,364,778 de Byrom, y No. 5,266,470 de Sénior et al. (empleando Ralstonia eutropha (antes Alcaligenes eutrophus) a partir de carbohidrato) ; patente Norteamericana No. 5,346,817 de Akiyama et al.
(empleando cepas de Ralstonia eutropha cultivadas en ácidos grasos) ;patente Norteamericana No. 4,336,334 de Powell et al.
(empleando Methylobacterium organophilum) ; patentes Norteamericanas No. 5,302,525 y No. 5,434,062 de Groleau et al. (empleando Methylobacterium extorquens); patente Norteamericana No. 5,292,860 de Shiotani et al. (empleando cepas de Aeromonas cultivadas en ácidos grasos) ; patentes Norteamericanas No. 5,059,536 y No. 5,096,819 de Page et al. (empleando Azotobacter vinelandii) ; patente Norteamericana No. 4,786,598 de Lafferty (empleando Alcaligenes latus) ; patentes Norteamericanas No. 5,344,769 de Witholt et al. y No. 5,290,910 de Shiotani et al., documento PCT WO 92/18553 y documento PCT WO 92/21708 (empleando Pseudomanas putida) ; patentes Norteamericanas No. 5,245,023 de Peoples et al., No. 5,334,520 de Dennis, No. 5,371,002 de Dennis et al., No. 5,512,456 de Dennis, No. 5,518,907 de Dennis et al., y No. 5,663,063 de Peoples et al. (empleando Escherichia coli transgénico) . Los polihidroxialcanoatos (PHAs) se acumulan dentro de las células microbianas como inclusiones granulares discretas que aun cuando amorfas por naturaleza son insolubles en agua. La recuperación de PHAs a partir de las células después de fermentación puede lograrse por cualesquiera de varios métodos, que incluyen (1) extracción en solvente (2) destrucción química de toda la biomasa no PHA empleando hipoclorito, peróxido de hidrógeno o bien tratamiento con ozono; (3) procesamiento más suave que involucra el trastorno celular, tratamiento enzimático, y lavado. En el último proceso, es posible conservar los granulos de PHA en el estado amorfo y emplear la suspensión de granulos lavados como látex. Es necesario lisar células que contienen PHA con el objeto d obtener un látex de PHA a partir de las células empleando u proceso acuoso. Se hicieron esfuerzos para reducir l viscosidad del lisado. Por ejemplo, la patente Norteamerican No. 4,910,145 de Holmes et al. describe un proceso acuoso par la extracción de PHA a partir de una biomasa bacteriana, qu emplea un paso de tratamiento térmico a una temperatura d 150grados C para reducir la viscosidad del lisado. E documento PCT WO 94/24302 y el documento PCT WO 94/1028 enseña el uso de un tratamiento de peróxido de hidrógeno par degradar el ácido nucleico como un medio para reducir l viscosidad. La adición de nucleasa a los lisados celulare para reducir la viscosidad y realzar un procesamient posterior se conoce también generalmente. Este enfoque, si embargo, es demasiado costoso para emplearse en productos d fermentación que involucran fermentaciones con altas densida de células. Los procesos de fermentación son empleados ampliamente para la fabricación de enzimas y otras proteínas bioactivas. En muchos casos, la recuperación puede ser mejorada por la adición de nucleasa a los lisados de células crudos con el objeto de degradar el ácido nucleico. De manera provechosa, este enfoque degrada también completamente el ADN lo que elimina efectivamente el posible contagio de marcadores de resistencia a los antibióticos o bien otros elementos genéticos. Como en el caso de los PHAs, sin embargo, el proceso de adición de nucleasas exógenas es un proceso costoso. Los polisacáridos microbianos son producidos por la fermentación de numerosos microorganismos diferentes (Delest, P. 1989, páginas 301-313. Fermentation technology of microbial polysaccharides in Gums and Stabilisers for the Food Industry 5 (Tecnología de fermentación de polisacáridos microbianos en gomas y estabilizadores para la industria alimenticia 5) , Phillips, G.O. Wedlock, D.J. y Williams, P.A. eds. IRL Press en Oxford University Press, Nueva York) . Por ejemplo, cepas de Xanthomonas se emplean comercialmente para la producción de goma de xantano (Kennedy & Bradsha , Prog. Ind. Microbiol. 19:319-71 (1984)), y han sido sometidas a técnicas de manipulación genética (Hassler & Biotechnol. Prog. 6_: 182-87
(1990) ) . Durante ésta y en fermentaciones similares, la viscosidad del medio se eleva dramáticamente conforme se produce el polisacárido extracelular. Por consiguiente, y para lograr un buen mezclado en el fermentador, la mezcladora requiere de energía adicional. El corte incrementado resultante puede provocar que ocurra cierta lisis celular, que libera ácido nucleico en el medio. El ácido nucleico es difícil de remover y presenta un problema de calidad de producto significativo, especialmente en uso de los polisacáridos en aplicaciones biomédicas, reduciendo la eficacia de los procesos de separación tales como, p ejemplo, cromatografía, cristalización, precipitació centrifugación, y filtración. Por consiguiente, es un objeto de esta invención ofrec métodos mejorados para la producción y recuperación emplean procesos de fermentación, especialmente los que emplean alt densidades de células de polihidroxialcaonato, polisacárido y otros componentes intracelulares y extracelulares. Es otro objeto de esta invención ofrecer cepas microbian mejoradas para su uso en procesos de fermentació especialmente los procesos en los cuales ocurre lisis celul o bien densidades altas de células, o bien que resultan en u alta viscosidad. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se han desarrollado constructos de ADN y cepas microbian genéticamente manipuladas construidas empleando est constructos de ADN, que producen una enzima nuclea heteróloga o bien homologa modificada con especificidad pa ADN y/o ARN. La nucleasa heteróloga puede ser obtenida partir de otro organismo, manipulada para incrementar actividad enzimática o bien nucleasas homologas en las mism cepas mutadas y después seleccionada empleando ensayos para actividad nucleasa con el objeto de seleccionar las bacteri que expresan nucleasas con una actividad realzada. Estas cep secretan nucleasas en el periplasma o medio de crecimiento una cantidad efectiva para realzar la recuperación de los polímeros y son especialmente adecuadas para su uso en proceso de fermentación con altas densidades de células. Polímeros ejemplares incluyen proteínas intracelulares tales como, por ejemplo, enzimas, factores de crecimiento, y citocinas; polihidroxialcanoato; y polisacáridos tales como goma de xantano, alginatos, goma gelano, zooglano, ácido hialurónico, y celulosa microbiana. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se han demostrado métodos para mejorar la fermentación y el proceso de recuperación para productos de fermentación microbiana mediante el uso de cepas que secretan una nucleasa durante el proceso de fermentación, donde la nucleasa misma no es el producto de fermentación deseado. Se divulgan métodos para manipular genéticamente las cepas para que secreten nucleasas útiles en este método. En una modalidad, una cepa que no expresa una nucleasa adecuada es genéticamente manipulada para expresar una nucleasa heteróloga con una actividad suficiente para obtener la mejora de proceso deseada. En una segunda modalidad, una cepa que expresa una nucleasa pero con una actividad insuficiente para obtener la mejora de proceso deseada es genéticamente modificada para expresar una nucleasa suficiente empleado el gen de nucleasa aislado de esta cepa y los métodos descritos aquí. En una tercera modalidad, una cepa que expresa una nucleasa adecuada a partir de un gen de nucleasa heterólogo o bien homólogo es mutada y los mutantes que expresan niveles suficientes de nucleasa son seleccionados para obtener la mejora de proceso deseada. DEFINICIONES El término "realzar" se refiere a un proceso de fermentación mejorado en donde el ácido nucleico liberado por la lisis celular durante la fermentación es degradado por la nucleasa, en una cantidad que previene el incremento de la viscosidad lo que puede resultar en espuma, mezcla insatisfactoria y de un gran requerimiento de energía para el mezclado. El término realzado se refiere también a un proceso de recuperación mejorado en donde, en un proceso en el cual el producto deseado es producido de manera intracelular y requiere de lisis celular para su recuperación, el ácido nucleico liberado por lá lisis celular durante la fermentación es degradado después del paso de lisis celular, en una cantidad que previene el incremento de la viscosidad y que facilita los pasos de recuperación que pueden incluir filtración por centrifugación, precipitación, etc. La expresión "gen de nucleasa" heterólogo se refiere a un gen de nucleasa aislado de un huésped otro que la cepa a mejorar. La expresión "gen de nucleasa homólogo" se refiere a un gen de nucleasa aislado del huésped a mejorar. Este gen puede ser modificado adicionalmente para mejorar la actividad de la nucleasa, NUCLEASA Y GENES QUE CODIFICAN LAS NUCLEASAS Las nucleasas y los genes que codifican las nucleasas que so adecuadas para su uso en los métodos descritos aquí puede obtenerse a partir de numerosas fuentes. Como se emplea aquí, las nucleasas "heterólogas" son expresadas a partir de ácid nucleico que codifican las nucleasas, donde la nucleasa h sido obtenida a partir de un organismo otro que el organism en el cual es insertada para realzar la producción de polímer y/o recuperación de polímero; o bien donde el organismo e mutado y tamizado para una actividad nucleasa mejorada. S puede obtener una actividad nucleasa mejorada donde s incrementa la cantidad de nucleasa, o bien la activida específica o especificidad de sustrato de la nucleasa. Las nucleasas son secretadas por un amplio rango de microorganismos y algunos de los genes correspondientes han sido clonados y caracterizados. Fuentes de genes de nucleasa incluyen S. marcescens (No. de acceso de GenBank M19495), Anabaena PCC7120 (No. de acceso de GenBank X64706) , Bacillus subtilis (No. de acceso de GenBank U66480), Staphylococcus hyicus (No. de acceso de GenBank L23973) , Staphylococcus intermedius (No. de acceso de GenBank X67678) , Escherichia coli (No. de acceso de GenBank X55818) , Shigella flexneri (No. de acceso de GenBank U30471) , Methanobacterium thermoautotrophicum (No. de acceso de GenBank AE000833) , y Methanococcus jannaschii (No. de acceso de GenBank U67584) . De preferencia, la nucleasa se disociada tanto de ácido ribonucleico (ARN) como de ácido desoxiribonucleico (ADN) . La nucleasa de preferencia es activa en un amplio rango de temperaturas y en un amplio rango de pH. La nucleasa es también de preferencia tolerante a la presencia de aditivos de procesamiento tales como, por ejemplo, sales, surfatantes y estabilizadores. Después de la lisis celular y después de un período de incubación para permitir que la nucleasa degrade el ácido nucleico, es preferible que la nucleasa sea removible fácilmente, como por ejemplo por digestión de proteasa, cromatografía, filtración o centrifugación. Por ejemplo, la nucleasa microcócica [ (desoxi) ribonucleato-3f -nucleotidohidrolasa, EC 3.1.4.7] puede hidrolisar ya sea el ácido ribonucleico (ARN) o bien el ácido desoxiribonucleico (ADN) para producir 3 ' -fosfomononucleótidos y dinucleótidos. La enzima es estable a un nivel de pH comprendido entre aproximadamente 0.1 y 10 con una actividad máxima a un pH de aproximadamente de 9 a 10 en presencia de 0.1-100 puM de iones Ca2+. El gen que codifica esta enzima ha sido aislado y caracterizado a partir de Staphylococcus aureus (Shortle, Gene 22:181-89 (1983)) y es funcionalmente expresado en numerosas bacterias heterólogas (Shortle, Gene 22:181-89 (1983); Miller, et al., J. Bacteriol. 169:3508-14 (1987); Liebl, et al., J. Bacteriol. 174:1854-61 (1992); LeLoir, et al., J. Bacteriol.
176:5135-39 (1996)). La nucleasa extracelular proveniente de Serratia marcescens es producida en un sistema recombinante disponible comercialmente como BENZONASE TM (Nycomed Pharma A/S y sus filiales, incluyendo la empresa American International Chemical Ine (Natick, MA) ) . El gen que codifica esta enzima también ha sido caracterizado (Ahrenholtz et al., J. Bacteriol. 60:3746-51 (1994) ) . MÉTODOS DE MANIPULACIÓN DE LAS CEPAS MICROBIANAS Una vez que el gen de nucleasa que codifica la enzima nucleasa seleccionada ha sido aislado y caracterizado, es integrado en la cepa microbiana de tal manera que le organismo secrete nucleasa en el periplasma o medio de crecimiento. En una modalidad preferida, cepas microbianas para la producción de PHAs de longitud de cadena corta (R. Eutropha, E. coli) o bien PHAs de longitud de cadena media (Pseudomonas sp. MBX978 y P. putida) son generadas mediante la integración de un gen de nucleasa como, por ejemplo, el gen de nucleasa de S. aureus, en el cromosoma de la cepa que produce PHA. Por ejemplo, un gen que codifica nucleasa puede ser aislado a partir de S. aureus mediante amplificación empleando reacciones en cadena de polimerasa con oligonucleótidos que reconocen el gen nuc que codifica la nucleasa. Después de la reacción en cadena de polimerasa, el ADN amplificado puede ser clonado en el vector de clonación de reacción en cadena de polimerasa pCR2. 1 (Invitrogen Corp. San Diego, CA) . Plásmidos que contienen el inserto de gen de nucleasa pueden ser identificados y analizados para la expresión de nucleasa empleando placas de agar de ADNasa (Difco Laboratories, Detroit MI) . Varios medios están disponibles para transferir el gen de nucleasa en la cepa de producción de PHA de elección para la expresión del gen de nucleasa. Por ejemplo, para su transferencia en Ralstonia, el gen puede colocarse bajo el control de un promotor de Ralstonia e insertado en un amplio rango de lectores de clonación huéspedes, como por ejemplo pLAFR3. Un promotor y dispositivo para lograr la expresión en Ralstonia puede encontrarse en Peoples & Sinskey, Mol. Microbiol. (1989) y J. Biol. Chem 262, 15298-15303 (1989) . Enfoques similares empleando vectores de clonación de amplio rango de huéspedes pueden aplicarse en el caso de bacterias de géneros tales como Areomonas, Azotobacter, Burkholderia, Comamonas, Methylbacterium, Paracoccus, Pseudomonas, Rhizobium, y Zoogloea. Alternativamente, un cásete de expresión puede ser manipulado para la nucleasa de tal manera que pueda integrarse en el cromosoma del huésped apropiado y expresarse. Tales casetes de expresión se describen, por ejemplo, en Herrero et al., J. Bacteriol 172: 6557-67 (1990). El gen de nucleasa y un gen de marcador como por ejemplo gen que confiere resistencia a los antibióticos, se clonan entre las secuencias de reconocimient para una transposasa en vectores tales como las series pUT pLOF (Herrero et al., J. Bacteriol 172:6557-67 (1990)). Cuand se emplean plásmidos püT, secuencias de regulación d transcripción no son necesarias entre las secuencias d reconocimiento para la transposasas, mientras que con la series pLOF, estas secuencias reguladoras deben esta presentes dentro de la región entre las secuencias d reconocimiento para la transposasas. Plásmidos pUT y pLO pueden ser mantenidos solamente en cepas de E. coli qu permiten la replicación de este plásmido en virtud de l presencia de lisógeno ? pir. El constructo nucleasa-marcado es introducido en células bacterianas por conjugación a parti de cepas de E.coli ? pir o bien mediante transformación electroporación con ADN de plásmido. En ausencia de ? pir, e plásmido se pierde de la célula. En una cierta frecuencia, e fragmento de ADN encerrado por las secuencias d reconocimiento para la trasposasa y que incluye dicha secuencias, será transferido al cromosoma. Las células en la cuales ha ocurrido este evento pueden ser aisladas mediant selección por colocación en placas de la conjugación, transformación, o mezcla de electroporación , en medios d crecimiento sólidos que contienen el antibiótico para el cua resistencia es conferida por el constructo. Colonias d células que crecen en este medio son después tamizadas par determinar la actividad nucleasa en vivo o in vitro. La actividad in vivo puede ser examinada mediante la colocación en placas de los productores de nucleasa putativos en placas de agar de prueba de ADNasa empleando visualización con HCL N l o bien verde de metilo (Difco Laboratories, Detroit MI) . La actividad in vitro puede ser determinada mediante la incubación del sobrenadante de cultivo o el sobrenadante acuoso de células tratadas con cloroformo, con ADN de peso molecular alto como por ejemplo ADN cromosomal, seguido por resolución de ADN en geles de agarosa amortiguado con PH. La utilidad de estas cepas manipuladas es fácilmente evaluada comparando los resultados de la fermentación y procesos corriente abajo empleando el tipo salvaje y los integrantes de nucleasa. MÉTODOS PARA USAR LAS CEPAS MANIPULADAS Las cepas manipuladas pueden ser empleadas en varias fermentaciones microbianas empleadas en la fabricación de productos farmacéuticos e industriales, incluyendo antibióticos, ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas, vitaminas, polihidroxialcanoatos, y polisacáridos (Atkinson & Mavituna, "Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook", 2nd edición (Stockton Press, USA 1991)). En una modalidad preferida el proceso de fermentación incluye densidades de células superiores a 100 g/L. Las cepas son especialmente útiles en procesos en los cuales el producto debe ser recuperado por lisis celular, y más particularmente en procesos que requieren de cromatografía, cristalización, precipitación, centrifugación, y/o procesos de separación por filtración. En una modalidad preferida, los métodos y cepas descritas aquí se emplean en procesos de fermentación para la producción de PHAs tales como los descritos, por ejemplo, en Lee & Chang, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, 52:27-58 (1995); Poirier et al., Bio/Technology 13:142-50 (1995); Doi, Macromol. Symp. 9 :585-99 (1995); patentes Norteamericanas No. 4,477,654 de Holmes et al., No. 5,364,778 de Byrom, No. 5,266,470 de Sénior et al., No. 5,346,817 de Akiyama et al., No. 4,336,334 de Po ell et al., No. 5,302,525 y No. 5,434,062 de Groleau et al., No. 5,292,860 de Shiotani et al., No. 5,059,536 y No. 5,096,819 de Page et al., No. 4,786,598 de Lafferty No. 5,344,769 de Witholt et al. y No. 5,290,910 de Shiotani et al., No. 5,245,023 de Peoples et al., No. 5,334,520 de Dennis, No. 5,371,002 de Dennis et al., No. 5,512,456 de Dennis, No. 5,518,907 de Dennis et al., y No. 5,663,063 de Peoples et al. En otra modalidad preferida, los métodos y cepas descritos aquí se emplean para la producción de látex de PHA altamente puro, que puede tener muchas aplicaciones. Ejemplos de estas aplicaciones se describen en el documento PCT WO 91/13207 (composiciones de látex de PHA para revestimiento de papel) ;
GB 2 292 648 A (látex de PHA en formulaciones de revestimient arquitectónicos); PCT WO 96/00263 (látex de PHA d revestimientos para alimentos, especialmente quesos) , PCT W 92/09211 y patente Norteamericana No. 5,229,158 de Yalpan (composiciones de granulos de PHA para su uso como sustituto de crema de leche) ; PCT WO 92/09210 y patente Norteamerican No.5,225, 227 de Yalpani (PHAs como saborizantes en alimentos) y PCT WO 96/17369 (PHAs empleados para la producción d componentes de tubos de rayos catódicos) . Es generalment necesario lisar las células que contienen PHA con el objeto d obtener un látex de PHA a partir de las células empleando u proceso acuoso. Métodos para lisar células microbianas so bien conocidos en la técnica e incluyen la homogeneizació física, ondas de ultrasonido, tratamiento enzimático y co detergente, asi como ciclos de csngelamiento/descongelamiento En otra modalidad preferida, los métodos y cepas manipulada aquí son útiles para la producción de polisacáridos Polisacáridos microbianos pueden ser producidos mediante l fermentación de numerosos microorganismos diferentes. Po ejemplo, cepas de Xantomonas se emplean comercialmente para l producción de goma de xantano (Kennedy & Bradsha , Prog. Ind. Microbiol. 19^:319-71 (1984)), y cepas de pseudomonas elodea s emplean para la producción de goma de gelano (Kng, et al., Appl. Environ. Micro. 43_:1086-941 (1982)). Otros ejemplo incluyen alginatos, primariamente a partir de algas cafés, qu se emplean extensivamente en la industria alimenticia (Well in Extracelular Microbial Polysaccharides (Sanford & Laskin eds.) página 299 (ACS, Washington, DC (1997)). Los alginato pueden también ser producidos mediante la fermentación d cepas de Azotobacter (Chen et al., Appl. Environ. Micro £9:543-46 (1985)). El ácido hialurónico es también otr ejemplo de polímero que es producido para aplicacione biomédicas empleando estreptococos (Dougherty & van de Rijn J. Biol. Chem. 269:169-75 (1994). Los métodos y sistemas descritos aquí pueden ser especialment provechosos cuando se emplea en combinación con el enfoque d lisis celular para la recuperación de goma de xantano descrit por Pollock en el documento US 5,354,671 y por Murofushi e al., en el documento US 5,705,368 y por Homma et al., en e documento US 5,679,556. Cepas de xantomonas adecuadas PATRA la practica del métod divulgado son descritas por Bauer et al., en el documento U 4,400,467 y por Pollock et al., en el documento US 5,472,870. Numerosas otras cepas microbianas se emplean para produci polisacáridos y pueden adaptarse al método divulgado aquí Técnicas de manipulación genética están ahora disponibles par todos estos microbios, como se describe, por ejemplo, Method in Enzymology (Métodos en Enzimología) Volumen 204 "Bacteria Genetic Systems (Sistemas Genéticos Bacterianos) : Miller J.H editor, Academic Press, New York.
La producción de celulosa por Acetobacter es divulgada por Ben-Bassat et al, en el documento US 5,821,109 y por Tonouchi et al, para Acetobacterin manipulada genéticamente según US 5,792,630. La producción de exopolisacárido por Zoogloea y la manipulación genética de este microbio es descrita por Easson et al., en el documento US 4,948,733 y el documento US 5,091,376. El polisacárido microbiano conocido como goma de gelano es un miembro de una familia de exopolisacáridos estructuralmente relacionados conocidos como "esfinganos" (Pollock T.J. 1993, J. Gen. Microbiol. 139:1939:1945, Pollock et al., en US 5,854,034 y referencias). La goma de gelano es producida por Pseudomonas elodea (número de cepa de la American Type Culture Collection ATCC 31461) a través de procesos descritos en las patentes norteamericanas Nos. 4,326,052; 4,377,636; 4,385,126 y 4,503,084. Estas cepa y derivados mutantes que incrementan las características de producción de gelano pueden ser manipulados genéticamente de conformidad con lo descrito por Fialho et al., 1991 Letters in Applied Microbiology (Cartas en Microbiología Aplicada) 12 : 85-87 y por Pollock et al., en el documento US 5,854,034). Pro ejemplo, mutantes de esta cepa deficiente en la acumulación de PHB pueden también emplearse para practicar el método divulgado y están disponibles en la American Type Culture Collection como número de cepa ATCC 539678. El ácido' hialurónico es producido por las bacterias Streptococcus, de conformidad, con lo descrito, por ejemplo, por Ellwood et al., documento US 5,563,051 Las composiciones y métodos para la preparación y uso de los mismos descritos aquí se describen adicionalmente a través de los siguientes ejemplos no limitativos. Ejemplo 1: Aislamiento del gen de nucleasa de Staphylococcus aureus El plásmido pNuc 1 ha sido descrito en Liebl et al., J.
Bacteriol., 174: 1854-61 (1992)). La secuencia del gen nuc que codifica la nucleasa microcócica ha sido determinada (Shortle,
Gene 2_2:181-89 (1983)) y es accesible bajo el número de acceso de GenBank J01785. El gen nuc fue amplificado empleando el plásmido purificado pNuc 1 y la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con los iniciadores SNS-Up (5'- TTCTCTAGAATTCAGGAGGTTTTT ATGGCTATCAGTAATGTTTCG-3') (SEQ ID NO:l) y SNS-Dn (5'- GCCGGTACCTTATTGACCTGAATCAGCGTTG-3') (SEQ ID NO: 2) Empleando las siguientes condiciones: 10 ng de ADN de pNuc 1 y
500 mM de cada iniciador fueron mezclados con 45 µl de PCR
SuperMix (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y amplificados (2 minutos a 95° C, seguido por 30 ciclos de 30 segundos a 95° C,
45 segundos a 55° C, 45 segundos a 72° C, y finalmente un paso de extinción de 7 minutos a 68° C. Después de la amplificación por reacción en cadena de polimerasa, se purificó el fragmento de 0.65 Kb que contenía el gen de nucleasa (SEQ ID NO: 3) por electroforesis en gel de agarosa y se ligó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para obtener pCR2.1-nuc. El inserto de este plásmidc fue confirmado por secuenciamiento de ADN como idéntico a la región correspondiente de lo reportado por Shortle (Shortle, 1993, Gene 22:181-89) . Ejemplo 2: Construcción de cepas transgénicas de P. Putida KT2442 que expresa una nucleasa El gen nuc fue removido del plásmido pCR2.1-nuc empleando enzimas de restricción EcoRI y Acc65I e insertado en los sitios correspondientes de pUC18NotI para obtener püC18-nucI. Se obtuvo un gen de canamicina sin promotor a partir del plásmido pBGSld (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342; número de acceso ATCC 37437) por amplificación por reacción en cadena de polimerasa empleando los siguientes iniciadores: ÜnkKl, 5* TGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAAG-3 ' , (SEQ ID NO: 4) y linkK2, 5' ATTTATTCAACAAAGCCGCC-3' (SEQ ID NO: 5) y el fragmento de 0.9 Kb (SEQ ID NO: 6) insertado en el sitio Ecll36II de pUC18Not (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 6557-6567) para obtener pMNX-kan. El gen de canamicina sin promotor fue removido por digestión con EcoRI y Acc651, se le acható el extremo por con un fragmento klenow de ADN polimerasa y se insertó en el sitio pUC18nuc-l. El plásmido resultante, pMNX-nuc fue linearizado con Smal y ligado con un fragmento Ecori/Acc65I de extremo chato que contenía un gen de canamicina sin promotor proveniente de pMNX-kan. Los plásmidos pMNX-nuc-kan recombinantes fueron aislados con base en su resistencia a la canamicina proporcionado por la expresión del operón nuc-kan a partir del promotor lac. El operón nuc-kan fue subsecuentemente removido como un fragmento Notl e insertado en el sitio correspondiente de pUTkan. El plásmido pMUX-nuc-kan fue subsecuentemente empleado para integrar el operón nyuc-kan sin promotor de manera aleatoria en los cromosomas de P. putida KT24A. La conjugación del plásmido se logró empleando E. coli. S17-1 [pMUXnuc-kan] . Cepas transgénicas de P. putida fueron seleccionada en placas de E2/10mM de octanoato/canamicina/cloroamfenicol . De los 12,000 integrantes aleatorios, 1,500 colonias fueron colocadas en placas de manera duplicada en placas de ADNasa agar para seleccionar clones de expresión de nucleasa. Treinta y cinco clones de expresión de nucleasa fueron seleccionados para el análisis in vitro de niveles de nucleasa en el sobrenadante de cultivo y en el periplasma de las cepas. Para este propósito, las células fueron centrifugadas y el sobrenadante que contenía la nucleasa secretada fue recogida. La pella de célula fue subsecuentemente resuspendida en un medio fresco, y se agregaron 100 µl de cloroformo a 500 µl de suspensión para liberar la nucleasa periplásmica. Residuos celulares fueron subsecuentemente centrifugados. Se llevo a cabo electroforesis de ADN en gel con muestras tratadas con benzonasa (0.02 ü) , con sobrenadante de cultivo de estatinas integradas por nucleasa, y con sobrenadante de P. putida KT2442. La actividad nucleasa en las fracciones secretadas y periplásmicas de nueve integrantes diferentes de P. putida nuc en ADN cromosomal proveniente de P. putida KT2442 estuvo presente. Los residuos celulares fueron subsecuentemente removidos por centrifugación . La presencia de nucleasa fue determinada por medio de la incubación de alícuotas del sobrenadante aclarado con 4 µg de ADN cromosomal de P. putida durante 1 hora a una temperatura de 37° C. Como controles. El ADN cromosomal fue incubado con BENZONASE® comercialmente disponible, 0.02 unidades como control positivo o bien sin nucleasa como control negativo. Después de la digestión, las muestras fueron analizadas por electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Clonación Molecular, un Manual de Laboratorio), según la edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.). Empleando esta prueba, cepas que expresan una actividad nucleasa en diferentes niveles y espacio extracelular o periplásmisco o ambos fueron fácilmente identificadas. Estas cepas son llamadas p. putida MBX913 a 926. P. putida MBX924 secretan nucleasa tanto para el periplasma como para el medio extracelular y tiene el operón nuc-can integrado en el gen que codifica ARNr de 23S. Ejemplo 3: Construcción de cepas transgé icas de R. eutropha 40124 que expresan un gen de nucleasa Cepas transgénicas de R. eutropha 40124 fueron seleccionadas después de conjugación de la cepa huésped con E coli. S17-1 [pMUX-nuc-kan] en placas de PCT/glu osa al 1%/ácido naladíxico/canamicina. Se inocularon diez colinias aleatorias en medio liquido de PCT/lucosa al 1%, ácido naladíxico/canamicina y se cultivo durante 20 horas a una temperatura se 30° C. Solamente el cultivo de R. Eutropha MBX917 produjo una nucleasa activa que fue localizada en el periplasma de la cepa transgénica. Ejemplo 4: Construcción de cepas transgénicas de P. putida MBX978 que expresan un gen de nucleasa Cepas transgénicas de P. putida MBX978 fueron seleccionadas después de conjugación de la cepa huésped con E. coli S17-1
[pMUX-nuc-kan] en placas de E2/10p-M de placas de octanoato/canamicina/ácido naladíxico y subsecuentemente fueron colocadas en placas de manera repetida en placas de
ADNasa agar con los antibióticos apropiados. Se colocaron en placas de manera repetida un total de 50 colonias positivas para nucleasa en placas de E2/10mM de placas de octanoato/canamicina/ácido naladíxico. Se cultivaron 9 aislados (P. putida MBX979-987) subsecuentemente en medio líquido E2/10mM de octanoato/canamicina/ácido naladíxico. Todos los clones secretan actividad nucleasa en el periplasma. MBX984 secretó los niveles más altos de nucleasa. Las nueve cepas fueron probadas en 50 ml de E2/10mM de medio líquido de octanoato para características de crecimiento y acumulación de PHA. Los resultados aparecen en la tabla 1 a continuación. Células fueron cultivadas en un medio E2 con 10 mM de octanoato como fuente de carbono. MBX985 retuvo las capacidades de crecimiento y actividades de acumulación de PHA de la cepa de tipo salvaje. Tabla 1: Producción de PHA por derivados de MBX978 con un gen de nucleasa integrado. Cepa Nucleasa3 OD600b td (hr) PHAa MBX978 - 3. 7 1 . 5 34.3 MBX979 +++++ 3. 6 1 . 6 30.7 MBX981 + 3. 4 1.4 32.9 MBX982 ++ 3. 5 1 . 6 32.0 MBX984 ++++ 2 . 8 1 . 6 14.9 MBX985 +++ 3 . 8 1 . 4 33.2 a actividad nucleasa relativa; b densidad óptica del cultivo a 600 nm al final del experimento;
c tiempo de duplicación de la cepa; d porcentaje de PHA de peso seco de célula bacteriana. Ejemplo 5: Construcción de cepas transgénicas de E. coli MBX247 que expresan un gen de nucleasa Cepas transgénicas de E. coli MBX247 fueron seleccionadas después de conjugación de la cepa huésped con E. coli S17-1 [pMUX-nuc-kan] en placas de E2/10mM de placas de octanoato/canamicina/ácido naladíxico y subsecuentemente fueron colocadas en placas de manera repetida en placas de ADNasa agar con los antibióticos apropiados. Se colocaron en placas de manera repetida un total de 75 colonias positivas para nucleasa en placas de E2/10mM de octanoato/0.51 de licor de extracto de maíz/canamicina/ácido naladíxico. Se cultivaron 9 aislados subsecuentemente en medio líquido R10/2% glucosa/canamicina/ácido naladíxico. En cuatros aislados, el gen de nucleasa fue exitosamente integrado en el cromosoma (MBX988-991) . Las actividades nucleasa en las diferentes cepas transgénicas fueron analizadas. Se llevó a cabo electroforesis de ADN en gel con muestras tratadas con fracciones periplásmicas de E. coli MBX247, E. coli MBX988 cultivadas en medio RIO, E. coli MBX988 cultivada en medio LB, R. eutropha MBX917, R. eutropha 40124, Pseudomonas MBX985, Pseudomonas MBX978, P. putida MBX924, P. putida KT2442, y con marcadores de pesos moleculares. Las actividades nucleasa fueron analizadas en cepas transgénicas diferentes empleando la digestión de ADN cromosomal y ensayo de electroforesis en gel de conformidad con lo descrito en el ejemplo 2. Estas cepas manipuladas fueron después modificadas mediante la introducción de genes que codifican las enzimas biosintéticas de PHA, de conformidad con lo descrito en las patentes Norteamericanas No. 5,245,023; 5,334,520; 5,371,002; 5,512,456; 5,518,907;p y 5,663,063. Ejemplo 6: Aislamiento de suspensiones de granulos de PHA a partir de P. putida MBX978 y un derivado de expresión de nucleasa Se cultivaron P. putida MBX978 y P. putida MBX985 en una densidad de células de 200 g/L en cultivos de lotes alimentados de 20 L con octanoato como fuente de carbono. Después de la fermentación cada cultivo fue complementado con 1 mM de CaCl2 y ajustado a un pH 8.5 con hidróxido de amonio. Los cultivos fueron después lisados empleando un homogeneizador de alta presión que opera a presiones que varían de 5,624,800 kg/m2 a 14,062,000 kg/m2 (de 8,000 a 20,000 psi). Cada muestra de lisado fue incubada durante 1 hora a temperatura ambiente, y después la viscosidad fue determinada a 20° empleando un viscómetro de Brookfield LVF (huso # 1, 60 rpm) . Además de muestras de cepas de tipo salvaje y cepas que expresan nucleasa, los lisados fueron preparados a partir de cultivo de tipo salvaje complementado con nucleasa comercial (BENZONASE™, 10 µ L/L de cultivo; . Los resultados de las determinaciones de viscosidad aparecen en la tabla 2 y muestran que la integración del gen de nucleasa como en MBX985 resultó en una viscosidad reducida del lisaio a niveles similares a los obtenidos para la cepa de tipo salvaje con adición de benzonase. Tabla 2: Presiones y viscosidades de trastorno resión de -trastorno Viscosidad (cP) Kg/m2 (psi) MBX978 MBX985 MBX978 + BENZONASE '
5,624,800 (8000) 48.0 9.5 9.0 8,437,200 (12000) 39.5 8.0 9.0 11,249,600 (16000) 38.0 8.0 8.0 14,062,000 (20000) 17.0 5.5 7.5
LISTA DE SECUENCIAS <110> Metabolix <120> Cepas microbianas y procesos para la fabricación de biomateriales <130> MBX 025 PCT <140> desconocido <141> 1999-03-30 <150> 60/079,938 <151> 1998-03-30 <160> 5 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: iniciador de oligonucleótidos SNS-Up <400> 1 ttctctagaa ttcaggaggt ttttatggct atcagtaatg tttcg <210> 2 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: iniciador de oligonucleótidos SNS-Dn <400> 2 gccggtacct tattgacctg aatcagcgtt g <210> 3 <211> 684 <212> ADN <213> Staphylococcus aureus <220> <221> gen <222> (1) .. (684) <223> gen de nucleasa de Staphylococcus aureus <400> 3
gaattcagga ggtttttatg tatggcaatt gtttcaatat tacttatagg gatggctatc 60 agtaatgttt cgaaagggca atacgcaaag aggtttttct ttttcgctac tagttgctta 120 gtgttaactt tagttgtagt ttcaagtcta agtagctcag caaatgcatc acaaacagat 180 aacggcgtaa atagaagtgg ttctgaagat ccaacagtat •tagtgcaac ttcaactaaa 240 aaattacata aagaacctgc gactttaatt aaagcgattg atggtgatac ggttaaatta 300 atgtacaaag gtcaaccaat gacattcaga ctattattgg ttgatacacc tgaaacaaag 360 catcctaaaa aaggtgtaga gaaatatggt cctgaagcaa gtgcatttac gaaaaaaatg 420 gtagaaaatg caaagaaaat tgaagtcgag tttgacaaag gtcaaagaac tgataaatat 480 ggacgtggct tagcgtatat ttatgctgat ggaaaaatgg taaacgaagc tttagttcgt 540 caaggcttgg ctaaagttgc ttatgtttac aaacctaaca atacacatga acaacattta 600 agaaaaagtg aagcacaagc gaaaaaagag aaattaaata tttggagcga agacaacgct 66C gattcaggtc aataaggtac cggc 684 <210> 4 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: iniciador de oligonucleótidos linkKl
<400> 4 tgtctgctta cataaacagt aatacaaag <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: iniciador de oligonucleótidos linkK2
<400> 5 atttattcaa caaagccgcc
Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1. Una cepa bacteriana para la producción de un producto seleccionado dentro del grupo que consiste de antibióticos, ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas, 5 vitaminas, polihidroxialcanoato, y polisacáridos, donde las bacterias expresan un gen de nucleasa heterólogo o bien un gen de nucleasa homólogo modificado genéticamente en una cantidad efectiva para secretar nucleasa en el periplasma o un medio de crecimiento en 10 donde las . bacterias fermentan para degradar al ácido nucleico de tal manera que se realce la recuperación de producto. 2. La bacteria de conformidad con la reivindicación 1 que puede crecer hasta densidades de células de por lo menos 15 50 g/1. 3. La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 2 que produce un polihidroxialcanoato a niveles de hasta 40% de su peso de célula seca. 4. La cepa bacteriana de la reivindicación 2 para su uso en 20 un proceso acuoso para fabricar suspensión de gránalos de poli (3-hidroxialcanoatos) esencialmente libres de ácidos nucleicos. 5. La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 para su uso en un proceso para elaborar polisacáridos 25 seleccionados dentro del grupo que consiste de goma de xantano, alginatos, goma de gelano, zooglano, ácido hialurónico, y celulosa microbiana. 6. La cepa bacteriana de conformidad ccn la reivindicación 1, donde el gen de nucleasa es un gen heterólogo obtenido a partir de un organismo otro que la cepa bacteriana. 7. La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 1, en donde el gen de nucleasa es integrado en una cepa huésped seleccionada dentro del grupo que consiste de Ralstonia eutropha, Methylobacterium organophilum, Methylobacterium extorquens, Aeromonas caviae, Azoba ter vinelandii, Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudorr cnas aeruginosa, Pseudomonas acidophila, Pseudomonas resinovorans, Escherichia coli, y Klebsiella. 8. La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 1, donde la nucleasa es expresada en una cantidad efectiva para degradar por lo menos el 95% de la totalidad del ácido nucleico liberado después de la lisis de las células en menos de 24 horas. 9. La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 1, donde la nucleasa es codificada por un gen homólogo que ha sido modificado para incrementar la actividad nucleasa. 10. La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 9, donde la cepa bacteriana es mutada y las bacterias mutadas son tamizadas para determinar una cantidad incrementada de actividad nucleasa. 11. Un proceso de fermentación que co prende la adición a un medio de crecimiento de una cepa bacteriana para la producción de un producto seleccionado dentro del grupo que consiste de antibióticos, ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas, vitaminas, polihidroxialcanoato, y polisacáridos, donde las bacterias expresan un gen de nucleasa heterólogo o cien un gen de nucleasa homólogo genéticamente modificad- en una cantidad efectiva para secretar nucleasa er. el periplasma o medio de crecimiento para degradar el éoido nucleico de tal manera que se realce la recuperación del producto. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde la cepa bacteriana es cultivada a densidades de cé las de por lo menos 50 g/1. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde la cepa bacteriana produce polihidroxialcanoato. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, que comprende además el cultivo de la cepa bacteriana cara producir niveles de por lo menos 40% de su pese de células seca. 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, que comprende además el lisado de las células. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, que comprende además el uso de un proceso acuoso para elaborar una suspensión de granulos de poli (3- 5 hidroxialcanoatos) esencialmente libre de ácidos nucleicos . 17. El método de conformidad con la reivindicación 11 empleado en un proceso para elaborar polisacáridos seleccionados dentro del grupo que consiste de goma de 10 xantano, alginatos, goma de gelano, zooglano, ácido hialurónico, y celulosa microbiana. 18. El método de conformidad con la reivindicación 11 empleado en un proceso para elaborar proteínas intracelulares seleccionadas dentro de grupo que 15 consiste de enzimas, factores de crecimiento, y citocinas . 19. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde el gen de nucleasa es integrado en una cepa huésped seleccionada dentro del grupo que consiste de Ralstonia 20 eutropha, Methylobacterium organophilum, Methylobacterium extorquens, Aeromonas caviae, Azoba ter vinelandii, Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas acidophila, Pseudomonas 25 resinovorans, Escherichia coli, y Klebsiella. 20. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde la cepa secreta nucleasa en el periplasma o medio de cultivo. 21. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde la cepa expresa nucleasa en el medio de crecimiento en una cantidad efectiva para degradar por lo menos el 95% de la totalidad del ácido nucleico liberado después de la lisis de células en el medio de crecimiento en menos de 24 horas. 22. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde la cepa bacteriana expresa una nucleasa homologa, que comprende además la mutación de la cepa bacteriana y el tamizado para bacterias que expresan una actividad nucleasa incrementada. 23. El método de conformidad con la reivindicación 11, donde la bacteria expresa una nucleasa homologa, que comprende además la manipulación genética de la nucleasa para incrementar la actividad nucleasa.
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