MXPA00008982A - Metodo cosmetico para tratar la piel - Google Patents

Abstract

Un mètodo cosmètico para proporcionar por lo menos un beneficio para el cuidado de la piel selecionado de:tratamiento/prevenciòn de arrugas, flacidez y/o piel envejecida, deposiciòn elevada de colàgeno en la piel, mejoramiento de la textura de la piel, suavidad y/o firmeza;el mètodo comprende aplicar a la piel una composiciòn tòpica que comprendeàcido petroselènico y/o los derivados del mismo.

Description

MÉTODO COSMÉTICO PARA TRATAR LA PIEL Esta invención se refiere a un método cosmético para mejorar la condición y la apariencia de la piel y al uso de ácido petroselénico en la preparación de composiciones tópicas para mejorar la condición y apariencia de la piel. La piel está sometida al deterioro como consecuencia de desórdenes dermatológicos, abuso ambiental (viento, aire acondicionado, calefaccaciones centrales) o como consecuencia del proceso normal de la edad (envejecimiento cronológico) que se puede acelerar por la exposición de la piel al sol (envejecimiento por efectos de la luz). En años recientes, la demanda de composiciones cosméticas y métodos cosméticos para mejorar la apariencia y condición de la piel, ha crecido en grandes proporciones. Cada vez con más frecuencia, los consumidores buscan con más frecuencia productos cosméticos "contra el envejecimiento" que traten o retarden las señales visibles del envejecimiento cronológico y del envejecimiento por efectos de la luz sobre la piel como las arrugas, líneas de expresión, flacidez, hiperpigmetación y manchas de la edad. También, con frecuencia, los consumidores buscan otros beneficios de los productos cosméticos además del efecto "contra el envejecimiento". El concepto de "piel sensible" ha también elevado la demanda del consumidor por productos cosméticos que mejoren la apariencia y la condición de una piel sensible, vedijuda y/o seca, y para aliviar la piel roja y/o irritada. Los consumidores también desean productos cosméticos que traten las manchas, barros y defectos, etc. Muchas personas están preocupadas por el grado de pigmentación de su piel. Por ejemplo, la piel con manchas de la edad o pecas desean que estas manchas de pigmentación sean menos notorias. Otras desean reducir el oscurecimiento de la piel provocado por la exposición al sol o desean aclarar su color natural de piel. Para cumplir con estas necesidades, se han realizado muchos intentos para desarrollar productos que reduzcan la producción de pigmento en los melanocitos. Sin embargo, las substancias hasta ahora identificadas tienden a tener efectos colaterales indeseables, por ejemplo, irritación de la piel. En consecuencia, tales sustancias no son adecuadas para uso cosmético y solamente se pueden aplicar en concentraciones en las cuales su efecto aclarador sobre la piel sea menos deseado. Al usar una combinación de diferentes sustancias aclaradoras de la piel puede considerarse que reduce los efectos colaterales, pero existe un riesgo potencial de que al utilizar esta combinación se reduzca el efecto aclarador de la piel debido a los efectos de competencia. Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar la efectividad de productos cosméticos aclaradores de la piel, particularmente, aquéllos que no irriten la piel. Es bien conocido el uso de ácidos grasos, entre los que se cuentan el ácido petroselénico, para formulaciones cosméticas para el tratamiento del cabello. El documento EP-A-116439) describe tónicos para el cabello que incluyen ácidos grasos (como el ácido petroselénico) para aliviar la caspa y el escozor comezón y para estimular el crecimiento del cabello. El documento EP-A- 709084 describe el uso de un aceite de semilla de cilantro, el cual es rico en triglicérido de ácido petroselénico, en una composición cosmética para las condiciones de humectación de la piel. Ahora, hemos encontrado otras propiedades no descubiertas del ácido petroselénico, que son útiles en composiciones cosméticas para la aplicación tópica en la piel para proporcionar beneficios del cuidado de la piel no descubiertos anteriormente. Se ha encontrado que se puede obtener un tratamiento efectivo y la prevención de condiciones normales sobre piel debidas al envejecimiento cronológico o envejecimiento por efectos de la luz, como las arrugas, líneas de expresión, flacidez, hiperpigmentación y manchas de la edad, mediante la aplicación de composiciones cosméticas en la piel las cuales comprenden ácido petroselénico o los derivados del mismo. También, se ha encontrado que el uso de ácido petroselénico en composiciones cosméticas proporciona con ventajas otros beneficios para la piel además de beneficio contra el envejecimiento como es aliviar piel irritada y/o sensible y aclarado de la piel.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método cosmético para proporcionar por lo menos un beneficio para el cuidado de la piel seleccionado de: tratamiento/prevención de arrugas, flacidez, piel envejecida y/o dañada por efectos de la luz; deposición elevada de colágeno en la piel, producción elevada de decorin en la piel, mejoramiento en la recuperación del tejido; aclarado de la piel; aliviar irritaciones, piel roja y/o sensible; mejorar la textura de la piel; suavidad y/o firmeza; el método comprende la aplicación sobre la piel de una composición tópica que comprende ácido petroselénico y/o los derivados del mismo. La presente invención también abarca el uso de ácido petroselénico y/o los derivados del mismo en una composición tópica para proporcionar por lo menos un beneficio para el cuidado de la piel seleccionado de: tratamiento/prevención de arrugas, flacidez, piel envejecida y/o dañada por efectos de la luz; deposición elevada de colágeno en la piel, producción elevada de decorin en la piel, mejoramiento en la recuperación del tejido; aclarado de la piel; aliviar irritaciones, piel roja y/o sensible; mejoramiento de la textura de la piel; suavidad y/o firmeza. Los métodos y uso inventivos del ácido petroselénico de este modo proporciona beneficios contra el envejecimiento, los cuales dan como resultado la promoción de una piel flexible y suave con elasticidad mejorada y una aparición reducida o retardada de arrugas y de piel envejecida, con un color de piel mejorado. Se logra una mejora general en la apariencia, textura y condición, en particular con respecto a un aspecto radiante, claro y una apariencia general joven de la piel. Los métodos y usos inventivos también son benéficos para aliviar y calmar la piel irritada y/o sensible. El ácido petroselénico es también útil para la aplicación tópica en piel humana para reducir la producción de melanina y de este modo, aclarar la piel sobre la cual fue aplicada. De este modo, los métodos inventivos proporcionan ventajosamente un amplio rango de beneficios para el cuidado de la piel. El término "tratamiento" como se usa en la presente, dentro de su alcance, incluye el reducir, retardar y/o evitar las condiciones de la piel antes mencionadas como piel arrugada, envejecida, dañada por efectos de la luz y/o irritada y generalmente mejora la calidad de la piel y mejora su apariencia y textura al evitar o reducir las arrugas y aumentar su flexibilidad, firmeza, suavidad, flexibilidad y elasticidad para la piel. Los métodos cosméticos y los usos de ácido petroselénico invención, pueden ser útiles para una piel en tratamiento, la cual ya presenta arrugas, envejecimiento, o características de irritación o daños por efectos de la luz o para el tratamiento de piel joven para así evitar o reducir los cambios de deterioro antes mencionados debidos al proceso de envejecimiento por edad/luz normal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El ácido petroselénico, de aquí en adelante llamado PA es un ácido graso de cadena larga (C18) monoinsaturado, con una fórmula CH3(CH2)10CH = CH(CH2)4COOH. La invención también incluye los derivados del ácido libre el cual de este modo comprende fracciones de ácido petroselénico. Entre los derivados preferidos se encuentran aquellos derivados de sustitución del grupo carboxilo del ácido, como los esteres (por ejemplo, esteres retínilo, esteres triglicéridos, esteres monoglicéridos, esteres diglicéridos, fosfoésteres), amidas (por ejemplo, derivados de ceramidas), sales (por ejemplo, metal álcali, sales de metal de tierra álcali, sales de amoniaco); y/o aquellos derivados de la sustitución de la cadena de carbón C18, como el alfa hidroxi y/o derivados de beta hidroxi. En el caso de los derivados de éster triglicérido, se incluyen todos los isómeros de posición de sustitutos de PA en la estructura básica del glicerol. Los triglicéridos deben contener por lo menos una fracción de PA. Por ejemplo, de las tres posiciones esterificables en la estructura básica de glicerol, las posiciones 1 y 2 se pueden esterificar con PA y con otro lípido en la posición 3, o como alternativa, la estructura básica de glicerol se puede esterificar con PA en las posiciones 1 y 3 con otro lípido en la posición 2. Los aceites que son ricos en triglicérido de ácido petroselénico también son, de esta manera, adecuados para usarse en la presente invención. Estos aceites están disponibles a la venta e incluyen aceite de semilla de perejil, aceite de semilla de zanahoria, aceite de fruto de hinojo, aceite de semilla de chirivía, aceite de semilla de cilantro, aceite de semilla de perifolio, aceite de planta alcaravea, y aceite de semilla de apio. En donde el término "ácido petroselénico" o "PA" se utilice dentro de esta especificación se debe entender que los derivados del mismo que comprendan fracciones de PA también están incluidos. Las "fracciones de PA" se refieren a una porción (porciones) de ácilo graso de un derivado de PA. El ácido petroselénico, activo a ser empleado de conformidad con la presente invención está presente en la composición tópica en una cantidad efectiva. Normalmente, la cantidad total de activo está presente en una cantidad entre 0.0001% a 50% en peso de la composición. Con más preferencia la cantidad es de 0.0% a 10% y con mayor preferencia se encuentra de 0.1% a 5% a fin de obtener el máximo de los beneficios a un costo mínimo. Vehículo Dermatológico Aceptable La composición utilizada de conformidad con la invención también comprende un vehículo dermatológicamente/cosméticamente aceptable para actuar como diluyente, dispersante o portador para el activo PA. El vehículo puede comprender materiales comúnmente empleados en productos para el cuidado de la piel como el agua, emolientes líquidos o sólidos, aceites de silicón, emulsificantes, solventes, humectantes, engrosadores, polvos, propelentes y sus semejantes. Usualmente, el vehículo formará de 5% al 99.9%, de preferencia del 25% al 80% en peso de la composición, y puede, en ausencia de otros adjuntos cosméticos, formar el equilibrio de la composición. Materiales Opcionales Benéficos para la Piel v Adjuntos Cosméticos Además del activo, PA, se pueden incluir otros activos específicos benéficos para la piel, como los bloqueadores de sol, otros agentes aclaradores de la piel, agentes bronceadores de la piel. El vehículo también puede incluir adjuntos como perfumes, opacantes, conservadores, colorantes y tampones.

Preparación del Producto, Forma. Uso v Empaquetamiento Para preparar la composición tópica usada en el método de la presente invención, se puede utilizar la manera usual para preparar productos para el cuidado de la piel. Los componentes activos se incorporan generalmente en un vehículo dermatológicamente aceptable en una manera convencional. Los componentes activos pueden primero disolverse o dispersarse adecuadamente en una porción de agua u otro solvente o líquido para ser incorporados dentro de la composición. Las composiciones preferidas son emulsiones de aceite-en-agua o de agua-en-aceite. La composición puede estar en la forma de productos para el cuidado de la piel convencionales como crema, gel, loción o sus parecidos. La composición también puede estar en la forma de los llamados "productos lavables", por ejemplo, un baño o un gel para baño, que posiblemente contenga un sistema de suministro para los activos para promover la adherencia a la piel durante el enjuague. Con más preferencia, el producto es un producto "de permanencia"; un producto que se aplica a la piel sin contar con el paso de enjuague deliberado después de aplicarlo sobre la piel. La composición se puede empacar de cualquier forma adecuada como un tarro, botella, tubo, bola giratoria, o semejante en una manera convencional. El método de la presente invención se puede aplicar una o más veces diariamente sobre la piel que requiera del tratamiento. Las mejorías en la apariencia de la piel usualmente serán visibles después de 3 a 6 meses, dependiendo de la condición de la piel, la concentración de los componentes compuestos activos utilizados en el método inventivo, la cantidad de composición utilizada y la frecuencia con la cual se aplica. En general, se aplica una pequeña cantidad de la composición, por ejemplo, de 0.1 a 5 ml sobre la piel desde el recipiente adecuado o el aplicador y se distribuye sobre y/o se frota en la piel utilizando las manos y dedos o cualquier otro dispositivo adecuado. Opcionalmente, puede seguir el paso de enjuague dependiendo si la composición está formulada como un producto "de permanencia" o de "enjuague". Con el fin de que la presente invención se entienda más fácilmente, se proporcionan los siguientes ejemplos únicamente con sentido ilustrativo.

EJEMPLOS Este ejemplo demuestra los beneficios contra el envejecimiento del ácido petroselénico. Ejemplo 1 n Identificación del Desorden de Procoláqeno-I v Decorin en la piel In Vivo siguiendo el Tratamiento Tópico de Ácido Retinóico con propósitos comparativos. Se conoce que el colágeno, una proteína predominante de la estructura de la piel, imparte a la misma resistencia a la tensión. El decorin es un proteoglican conocido que es importante para la deposición controlada y correcta de la estructura extracelular de la piel. También se conoce dentro de la técnica, que los niveles de colágeno y decorin en la piel se reducen de manera importante en la piel dañada por efectos de la luz o de edad. Muchos estudios han demostrado que los niveles de colágeno tipo I en la piel disminuyen con la edad y/o con un daño por efectos de la luz aumentado (por ejemplo, Lavker, R. J. Inv. Derm., (1979), 73, 79-66; Griffiths et.al. N. Eng, J. Med. (1993) 329, 530-535). En el caso de decorin, se ha demostrado que la expresión mRNA y la expresión del proteoglican se reduce grandemente en la piel dañada por efectos de la luz in vitro (Bernstein et. al. Lab. Invest. (1995)72, 662-669). La reducción de los niveles en estas proteínas de la piel se asocia de acuerdo con una disminución en la resistencia a la tensión de la piel, provocando arrugas y flacidez. Es bien conocido dentro de la técnica que el ácido retinóico es un potente activo contra el envejecimiento e induce la reparación dérmica de una piel dañada por efectos de la luz. Se ha demostrado que la prevención de arrugas y la recuperación dérmica siguiendo el tratamiento tópico para la piel con ácido retinóico surge a través de una nueva deposición de colágeno y síntesis en la piel (por ejemplo, Griffiths et.al. N. Eng. J. Med. (1993) 329, 530-535). Es ampliamente aceptado que el fortalecimiento de la estructura dérmica al elevar el nivel de colágeno en la piel al usar ácido retinóico proporciona beneficios de recuperación contra el envejecimiento/dérmica. El procolágeno I es un precursor de colágeno. La producción aumentada de procolágeno I en respuesta a una aplicación compuesta de prueba es una referencia de un nivel aumentado de colágeno. Se reclutaron dos grupos de mujeres con grados idénticos o casi idénticos de daño suficiente a moderado por efectos de la luz en cada antebrazo externo. Se les suministró 0.05% de ácido retinóico en una base humectante (Retinova®) y también con una crema humectante con color coincidente con características sensoriales similares (loción Dermacare®), pero sin ingredientes activos, como un control con placebo. Cada participante de los dos grupos aplicó el Retinova® en un antebrazo externo y el placebo (Dermacare®) en el otro antebrazo externo. El Grupo 1 aplicó los productos diariamente sobre sus antebrazos externos durante 14 semanas y el Grupo 2 aplicó los productos en sus antebrazos externos durante 28 semanas. Al término de los estudios se tomaron dos biopsias completas por punción de 4 mm de espesor de las áreas tratadas de cada antebrazo. El análisis inmunohistoquímico del tejido de la biopsia tomadas de las participantes se desempeño para identificar el efecto del tratamiento con ácido retinóico en la expresión de los componentes de la estructura extracelular de la piel, decorin y procolágeno I, comparado con los antebrazos tratados con placebo. Se siguió el siguiente procedimiento: MATERIALES Un tampón de dilución de anticuerpos para secciones enceradas se compone de Salina Tamponada Tris (TBS), 3% de albúmina de cera bovina (BSA) albúmina de suero bovino, 0.05% de Tritón X.100 y 0.05% de azida sódica. Los anticuerpos primarios para el procolágeno-l (terminal amino) se obtuvieron de Chemicon International Inc. (cat# MAB 1912, rata IgG 1 ) y se usó en las secciones enceradas con una dilución de 1:800; toda la noche a 4°C después de que la sección había sido tratada previamente con tripsina (0.5 mg/ml, 25 minutos, 37°C). Los anticuerpos primarios para el decorin se obtuvieron por Biogénesis (policlónico de conejo) y se usó en las secciones enceradas con una dilución de 1:800, toda la noche a 4°C. Los anticuerpos secundarios biotínilatados anti-rata, obtenidos de DAKO (cat# E0468, policlónico de conejo), se aplicaron a las secciones enceradas a una dilución de 1:400. Los anticuerpos secundarios biotinilatadas anti-conejo, obtenidos de Amersham (cat# RPN 1004, policlónico de burro), se aplicaron a las secciones enceradas a una dilución de 1:400. El streptavidin conjugado con fosfatasa alcalina, obtenido de Zymed (cat# 43-4322), se usó con una concentración de 1:2500. El cromogeno Rojo Rápido se obtuvo de DAKO (cat# K597). Gills # 3 Haemotoxylín nuclear contrateñido obtenido de Sigma (cat# GHS-3), se filtró y se usó sin dilución. La Tripsina se obtuvo de Sigma (cat# T-7186) y los portaobjetos se montaron con Glycerel de DAKO (cat# C563). MÉTODOS Las secciones enceradas del tejido de la biopsia se montaron en portaobjetos recubiertos de silano y se hornearon durante 18 horas a 55°C. Los portaobjetos se desenceraron a través de xilano y alcohol y se llevaron al agua y se transfirieron a TBS. La pluma DAKO® se usó para marcar las secciones. Las secciones se procesaron para una recuperación de antígeno con el uso de tripsina cuando fue necesario, como se indicó para cada anticuerpo. Cuando la recuperación de antígeno fue necesaria, los portaobjetos se incubaron durante 25 minutos a 35°C con tripsina a 0.5 mg/ml (Sigma Cat # T-7186). Subsecuentemente, la proteasa se enjuagó (2 x 2 minutos) con TBS. En caso de ser necesaria la siguiente recuperación de antígeno, o de otra forma directamente después de marcar las secciones, no se bloqueó el enlace de anticuerpos no específicos con soluciones al 5% de un suero principal de anticuerpo secundario en TBS/0.5%. BSA/0.1% de azida sódica como la solución bloqueadora durante por lo menos 20 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda. El exceso de la solución bloqueadora se drenó hacia afuera, pero no se dejaron secar las secciones. Después, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (diluido adecuadamente como se indica anteriormente) en una cámara húmeda durante toda la noche a 4°C. Subsecuentemente, el anticuerpo se drenó de las secciones, sin permitirles que secaran. Los portaobjetos se lavaron con TBS para retirar el anticuerpo primario no enlazado - un enjuague de un minuto seguido por lavados de tres a cinco minutos, y después se incubaron con el anticuerpo secundario adecuado (diluido adecuadamente como se indicó anteriormente) en una cámara húmeda durante una hora a temperatura ambiente. Después, la solución de anticuerpo se drenó de los portaobjetos sin permitir que la sección secara. Los portaobjetos se lavaron con TBS, un enjuague de un minuto seguido por enjuagues de 4 x 5, con el propósito de retirar el anticuerpo secundario no enlazado. Para el anticuerpo secundario biotinilatado, las secciones se incubaron, subsecuentemente con conjugado de streptavidin durante 45 minutos a 37°C y después se lavaron en TBS para retirar el conjugado no enlazado de stretavidin. Se añadió el cromogen y el color se desarrolló bajo observación para evitar las manchas excesivas. Las secciones se contratiñeron y se montaron. Las diferencias en la expresión del procolágeno I y el decorin entre los sitios tratados con ácido retionoic (Retinova®) y placebo (Dermacare®) se determinaron mediante exámenes visuales de las secciones teñidas inmunohistoquímicamente al usar luz microscópica. Este análisis identificó una marcado desorden en ambos, el procolágeno I y el decorin, sobre la piel dañada por efectos de la luz siguiendo la aplicación tópica del ácido retinóico (Retinova®) y los resultados se establecen en la Tabla 1 que sigue. Tabla 1 Efecto del Tratamiento de Ácido Retinóico en la expresión de procoláqeno I v decorin en la piel In Vivo Los componentes procolágeno 1 y decorin de la estructura extracelular son, de este modo, marcadores claramente identificables de la recuperación dérmica inducida por el ácido retinóico Procedimiento para Medir la Síntesis de Procoláqeno-I v de Decorin en Fibroblastos Dérmicos Humanos Preparación de un Medio Condicionado para Fibroblastos Dérmicos Los fibroblastos primarios en la piel de prepucio humano, en el paso 2 (P2) se cultivaron en placas de 12 pozos con 1000 células/cm2 y se mantienen durante 24 horas en una atmósfera al 5% de dióxido de carbono y 4% de oxígeno en un Medio Dulbeccos de Eagles Modificado (DMEM) complementado con 10% de suero de feto vaquilla. Después de este tiempo las células se lavaron con suero libre de DMEM y después se incubaron en un suero libre de DMEM por otras 60 horas. Las capas individuales de fibroblastos se lavaron otra vez con DMEM libre de suero. Los reactivos y los controles de vehículo se añadieron a las células por triplicado con un volumen final de 0.4 ml/DMEM libre de suero fresco por pozo y se incubaron por otras 24 horas. El medio acondicionado de fibroblastos se analizó inmediatamente o se congeló a presión en nitrógeno líquido y se almacenó a -70°C para un futuro análisis. Después, se contaron las células y los datos del análisis de punto secante se estandarizaron subsecuentemente con el número de las células.

Examen de punto secante para la proteína de Procoláqeno-I v Decorin en un Medio Acondicionado con Fibroblastos Dérmicos. Las muestras del medio acondicionado con fibroblastos dérmicos se trató con vehículo (como control) o con reactivos de prueba, se complementaron con 20mM de ditiotreitol (dilución al 1:10 de 200mM de solución de reserva), y 0.1% de dodeciisulfato de sodio (dilución al 1:100 de 10% de solución de reserva), mezclados bien y después incubados a 75°C durante 2 minutos. Una norma para el examen se generó mediante la dilución en serie de un medio acondicionado de fibroblastos limpio de fibroblastos cultivados a 1000 células/cm2 en un matraz de 175 cm2 y se mantuvo en DMEM libre de suero como se describe antes. Las muestras del examen después se aplicaron por triplicado en una lámina prehumedecida de membrana de transferencia Immobilon-P usando un Aparato Bio-Dot de 96 pozos de Bio-Rad como se describe en los lineamientos de los fabricantes. Se aplicaron aproximadamente 200 µl del medio por pozo. Se permitió filtrar el medio a través de la membrana bajo la influencia de la gravedad (30 minutos) después de lo cual se lavó la membrana dos veces don PBS (200 µl). Se permitió que estos enjuagues PBS se filtraran a través de la membrana bajo la influencia de la gravedad (2 x 15 minutos). El aparato Bio-Dot se acopló con una tubería al vacío y se llevó a cabo un tercer y final enjuague de PBS bajo el efecto de succión. Se desacopló el aparato, la membrana se retiró y se cortó rápidamente según fue requerido antes de ser colocada en un tampón bloqueador durante toda la noche a 4°C. Las membranas preparadas para el análisis de decorin se bloquearon con 3% (w/v) BSA/0.1% (v/v) Tween 20 en PBS, mientras que aquéllas para el análisis del procolágeno-l se bloquearon con 5% (w/v) de polvo de leche deshidratada sin grasa/0.05% Tween 20 en PBS: Al día siguiente, las membranas se probaron con una dilución al 1:10000 de anticuerpos primarios para el procolágeno I humano (MAB1912; monoclónico de rata; Chemicon Int. Inc., Temecula, CA) o para decorin humano (Policlónico de conejo; Biogénesis) durante 2 horas a temperatura ambiente. Subsecuentemente, las membranas se lavaron con TBS/0.05% Tween 20 (3 x 5 minutos) y después se Incubaron con una dilución al 1:1000 de fragmentos de 1251-conjugado anti-rata o anti-conejo F(ab')2 (Amersham) según fue requerido durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto, las tiras Immobilon se lavaron otra vez con TBS/Tween 20 (3 x 5 minutos) antes de permitirles secar al aire a temperatura ambiente. Las membranas secas se envolvieron en celofán y fueron expuestas a una pantalla de almacenamiento de fósforo de Dinámica Molecular durante 16-18 horas. Transcurrido este tiempo, la pantalla expuesta se rastreó mediante un aparato de fosfoimagen (Phosphorimager Molecular Dinamics SF) usando un software ImageQuant™, estandarizado al número de células y los efectos de los diferentes reactivos de prueba en la síntesis de decorin y procolágeno I, se determinaron relativos a un valor de control con vehículo de 100 unidades arbitrarias.

PRUEBAS La Tabla 2 siguiente indica los efectos de ácido petroselénico en la síntesis de procolágeno I y decorin de fibroblastos humanos, y las cantidades en las cuales se aplicaron. Con el fin de normativizar los resultados, los efectos de la substancia de prueba se determinaron relativos a un valor de control tratado con vehículo de 100 unidades arbitrarias. A modo de comparación, se llevó a cabo un estudio con ácido retinóico para examinar su efecto en la síntesis de decorin en fibroblastos dérmicos humanos. Las concentraciones de los reactivos usados en los estudios no influenció la viabilidad de la célula. Tabla 2 El Efecto en la Síntesis de Procoláqeno I v Decorin con Ácido Petroselénico Los resultados de la tabla 2 indican que el ácido petroselénico desordena de manera importante la síntesis tanto del procolágeno como del decorin en fibroblastos dérmicos humanos comparados con el control. El nivel de decorin en la piel está asociado con una condición y apariencia mejoradas de la piel. Aumentar el nivel de decorin en la piel es importante para una deposición correcta y controlada de colágeno en la piel, la cual está asociada con muchos beneficios para la piel como la prevención de arrugas y recuperación dérmica de la piel dañada por efectos de la luz. El estudio comparativo con ácido retinóico (1µm) mostró un desorden de decorin 138 +. 14.0 (p = 0.035, n = 4), determinado como relativo a un valor de control tratado con vehículo de 100 unidades arbitrarias. De manera sorprendente, los datos también indican que la magnitud del desorden y la síntesis de decorin en fibroblastos dérmicos humanos efectuado por el ácido petroselénico excede aquél del ácido retinóico y la referencia ya conocida de la recuperación dérmica activa.

Ejemplo 2 Este ejemplo mide la funcionalidad contra las irritaciones del ácido petroselénico. Examen de la viabilidad de Queratinocitos SDS Metodología Los queratinocitos crecieron en placas de 96 pozo a aproximadamente 80% de confluencia en un medio para crecimiento de queratinocitos (KGM) el cual se reemplazó con KGM sin hidrocortizona durante 24-48 horas. Después, las células se trataron con una concentración de sulfato dodecil sódico (SDS) que produciría una viabilidad de célula de aproximadamente 50% (2µ/ml) en presencia o ausencia de ácido petroselénico. Después, las células se dosificaron con ácido petroselénico con las concentraciones indicadas en la siguiente Tabla 3. El control no contenía ningún SDS o compuestos de prueba. Después de incubarse durante 24 horas, el medio se retiró y se determinó la viabilidad mediante el método de Rojo Neutro. Con este método, las células se incubaron durante 3 horas en KGM con un contenido de 25 µg/ml de neutral red después de lo cual, el medio se retiró y se extrajeron las células con 1 ml de 1% (v/v) de ácido acético, 50% (v/v) de etanol por 30 minutos. La absorbencia del extracto a 562 nm se determinó y se evaluó la viabilidad con referencia a los pozos de control que no contenían SDS o compuestos de prueba. Los resultados obtenidos se resumieron en la tabla 3 siguiente: Tabla 3 Todos los valores del ácido petroselénico (PA) muestran la viabilidad significativamente aumentada comparada con el valor SDS 2 µg/ml solo, determinado por ANOVA de 1 vía con comparación múltiple de Student-Neumann-Kuels, p<0.05. Esta metodología ha demostrado que la toxicidad de queratinocito de un irritante se relaciona con el efecto de irritación del agente in vivo (Lawrence, JN, Starkey, S., Dickson, FM & Benford, DJ. Uso de cultivos de queratinocitos humanos y de rata para examinar el potencial de la irritación en la piel. Toxicol. In Vitro. 10, 331-340 (1996)). De este modo, aquí se muestra que el tratamiento con ácido petroselénico reduce de manera importante los efectos tóxicos de SDS en queratinocitos y de acuerdo con esto, que tiene una funcionalidad contra irritaciones.

Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra que el ácido petroselénico puede reducir de manera efectiva los niveles básales de PGE2 (prostaglandina E2) secretado por los queratinocitos in vitro.

Examen de Queratinocito PGE^ Los queratinocitos crecieron en placas de 96 pozos a aproximadamente 80 de confluencia en el medio de crecimiento de queratinocitos (KGM). Éste se reemplazó después con KGM sin hidrocortizona durante 24-48 horas. Después las células se dosificaron con ácido petroselénico en las cantidades mostradas en la Tabla 4 siguiente. No se añadió ácido petroselénico a las células de control. Las células se incubaron con (o para el control, sin) ácido petroselénico durante 24 horas. Al término de la incubación, el medio se cosechó y se examinó para la liberación basal del PGE2 pro-inflamatorio mediante un examen inmunición de enlace de enzima usando un equipo PGE2 comercial (Amersham, Buckingamshire, Inglaterra). Después, las células se probaron para la viabilidad mediante el método de absorción de rojo neutro descrito en el ejemplo 2 anterior. No se encontró que la viabilidad de la células fuera efectuada en forma adversa por el tratamiento con ácido petroselénico usado en las concentraciones probadas.

El potencial contra inflamaciones de los compuestos de la prueba se examinó mediante la habilidad de los componentes para reducir los niveles básales de PGE2 comparados con el control. La importancia estadística fue determinada usando una prueba-t de estudiante. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 4 siguiente: Tabla 4 El análisis estadístico usando un ANOVA de 1 vía con una comparación múltiple de Estudiante-Neumann-Kuels demostró que con 0.1 y 1 µM de ácido petroselénico (PA) redujo de manera importante (p<0.05) la liberación de PGE2 de queratinocitos no estimulados. El PGE2 es un mediador bien conocido de inflamación en la piel, consultar Greaves et. al. "Prostagludus, leukotriemes, fosfolipasa, factor impulsor de plato y citoquinas: un acercamiento integrado para la inflamación de piel humana, "Arch Dermatol. Res (1988) 280 [Supp]: 533-541. Los resultados indican que los queratinocitos tratados con ácido petroselénico producen menos PGE2 de prostaglandina pro-inflamatoria, por lo cual se reduce el potencial inflamatorio de la piel.

Ejemplo 4 Este ejemplo mide el efecto del ácido petroselénico en reducir la respuesta inflamatoria de los fibroblastos dérmicos. Examen de Fibroblastos PGE2 e ICAM Las moléculas de adhesión intracelular (ICAM) y la producción de PGE2 por los fibroblastos de la piel humana se puede inducir por un estímulo PMA inflamatorio (acetato de mirístato fórbico). El PMA representa un tensor externo que induce la tensión oxidativa y las respuestas inflamatorias en las células. Este modelo se usa para la inflamación modelo in vivo.

Los fibroblastos primarios de prepucio humano en el paso 2 (P2) se cultivaron en placas de 96 pozos a 1000 células/pozo y se mantuvieron durante 24 horas en una atmósfera al 5% de dióxido de carbono en un Medio Eagles de Dulbeccos Modificado (DMEM) complementado con 10% de suero fetal de vaquilla. El ácido petroselénico se añadió al medio fresco de células (DMEM, complementado con 10% de suero de feto de vaquilla) en dimetiisulfóxido (DMSO, concentración final 1%) por trípiclado y se incubaron por otras 24 horas. El acetato de mirístato fórbico (PMA) (Sigma) se añadió al medio y las células se incubaron por otras 24 horas. El control no contuvo ningún compuesto de prueba ni PMA. Los fibroblastos/medio se analizaron como se describe abajo, inmediatamente o se congelaron a presión en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70°C para un futuro análisis. Después, se contaron las células y los datos del análisis punto secante se estandarizaron subsecuentemente para el número de células. Examen de Prostaglandina E2 (PGE2): El volumen de 50 µl del medio de cultivo se tomó para un examen PGE2 después de mezclar suavemente la placa de cultivo. Los niveles de PGE2 en el medio se determinaron con un equipo de inmunoexamen PGE2 Biotrak (Amersham, UK). El examen se basó en la competencia entre el PGE2 etiquetadas en la muestra y una cantidad fija de peroxidasa de rábano etiquetada PGE2 para una cantidad limitada de anticuerpo PGE2 específico. Las concentraciones de la muestra no etiquetada PGE2 se determinan de acuerdo con una curva estándar que se obtuvo al mismo tiempo. Examen ICAM-1: El medio se descartó y las células se lavaron con Dulbecco PBS. Para las células lavadas, se añadieron 150 µl 0.1% de Tritón X-100 (Sigma) durante 3 minutos para extraer ICAM de la membrana de la célula. Los extractos se transfirieron a unos tubos centrífugos Eppendoff y se centrifugaron a 1000 g durante 2 minutos para retirar la suciedad de la célula. Un volumen de 100 µl de sobrenadante se usó para el examen ICAM. El ICAM-1 soluble se examinó con un equipo inmunoenzimométríco disponible a la venta (R&D Systems). Las concentraciones de ICAM-1 en las muestras se determinaron en base a una curva estándar que corría en paralelo. Los resultados obtenidos de los exámenes PGE2 e ICAm se resumen en la tabla 5 siguiente. Tabla 5 Efectos del ácido petroselénico en la producción de ICAM y PGE^ PMA-Inducido en fibroblastos de piel humana. * p<0.001 comparado con aquéllas de células tratadas con PMA.

Los resultados anteriores muestran que las células puestas a prueba con estimulantes inflamatorio como PMA (acetato mirístilo fórbico) provoca un aumento en la respuesta inflamatoria según se midió por la producción de prostaglandina (PGE2). El ácido petroselénico aun a niveles de 0.1µm. reduce en forma dramática la respuesta inflamatoria según se midió por la producción de PGE2. De esta manera, los resultados demuestran que el ácido petroselénico tiene una buena actividad contra la inflamación. Los resultados anteriores también demuestran que las células a prueba con PMA provocan un incremento en la producción de ICAM. El ácido petroselénico disminuye la producción de las moléculas de adhesión intramolecular (ICAM), lo cual es otro marcador de inflamación. De este modo, estos resultados también demuestran que el ácido petroselénico tiene buena acción contra la inflamación.

Ejemplo 5 Metodología del examen para aclarar la piel Mantenimiento de las célula Unas células de melanoma de ratón B16-F1 (American Type Culture Collection, Maryland, USA) se mantuvieron en matraces de cultivo de 75 cm2 en un medio RPMI 1640 (Flujo-ICN, cat. No. 12-60-54) complementados con L-glutamina (4 mM) y 10% de suero de feto bovino (FBS) a 37°C en agua saturada, 5% CO2 en el aire atmosférico. Las células fueron pasadas dos veces por semana. Examen de Pigmentación. Unas células subconfluentes B16 se cultivaron en placas microtiter a una densidad de 5000 células/pozo y se cultivaron toda la noche en DMEM (Life Technologies, NY) con un contenido de 10% de suero de feto bovino y 1% de penicilina/estreptomicina sin rojo fenol a 37°C bajo un 5% de CO2. Después de 24 horas, el medio se reemplazó con un medio fresco con un contenido de materiales de prueba o con controles de vehículo. Las células se incubaron durante 72 horas, cuyo lapso permitió que la melanina se hiciera visible en los pozos de control. Después, el medio con contenido de melanina de cada pozo se transfirió hacia una placa limpia de 96 pozos y se cuantificó mediante la lectura de la absorbencia a 530 nm usando un espectrofotómetro con microplaca (Dynatech MR5000) y corrigiendo para la absorción de línea de base del medio fresco. Debido a que la absorción corregida es proporcional a la concentración de melanina, el porcentaje de pigmentación para una sustancia de prueba para aclarar la piel se puede calcular como sigue: % pigmentación = (OD530 prueba/OD530 ref) x 100%; en donde, la prueba OD530 y la ref OD530 indican la absorción corregida promedio del medio desde los pozos con una sustancia de prueba y aquél del medio de los pozos sin la sustancia de prueba. El porcentaje de inhibición provocado por la substancia de prueba es entonces 100 - % pigmentación. Examen de viabilidad de la célula. La producción de melanina se puede reducir por la inhibición de melanogénesis pero también se puede ver afectada por la citotoxicidad o la proliferación de células. Para probar si esto ocurrió, se probó la viabilidad de la célula mediante una absorción de colorante rojo neutro. El rojo neutro es un colorante soluble en agua que pasa a través de la membrana intacta del plasma y se concentra en los lisosomas en células intactas. La absorción total del colorante rojo neutro es proporcional al número de células viables en cultivo. Inmediatamente después de la remoción del medio para el análisis de melanina de los pozos microtiter, 200 µl de colorante rojo neutro precalentado (ej. Sigma, RU, Cat. Nr 2889) en un medio de 25 µg/ml se aplicó a las células y se incubaron durante 3 horas para el mantenimiento de las células. El colorante que no había sido absorbido por las células se retiró por la inversión de la placa y el vaciado en papel absorbente. Las células se lavaron con 200 µl PBS, que fue retirado otra vez. Se añadieron 100 µl de solvente (50% de H2o, 49% de etanol, 1% de ácido acético). Después de 20 minutos a temperatura ambiente, cada placa se agitó durante 5 segundos en un agitador de placas microtitre. La absorción se midió como se explica anteriormente.

Pruebas La Tabla 6 a continuación indica las sustancias aclaradoras de la piel evaluadas y la cantidad en la que se aplican. El porcentaje de inhibición de la producción de melanina provocado por las sustancias de prueba como se describe antes, también se refleja en la tabla. Los valores menores a un control 100% de melanina indican la inhibición de melanogénesis. De esta manera, los resultados en la Tabla 3 muestran que PA inhibe la producción de melanina. En los estudios, la sustancia de prueba se diluyó con DMEM en las cantidades mostradas en la tabla 5 a continuación.

Prueba t estudiante ** p<0.01 p<0.05 (n = 4) Ejemplo 6 La siguiente fórmula describe una crema de aceite en agua apropiada para los métodos y usos de conformidad con la presente invención. Los porcentajes indicados son en peso de la composición.

*Brij 56 es alcohol cetílico POE (10) Alfol 16RD es alcohol cetílico Ejemplo 7 La siguiente formulación describe una crema en emulsión de conformidad con la presente invención.

Ambas composiciones tópicas del ejemplo 6 y 7 proporcionan un tratamiento cosmético efectivo para aclarar el color de la piel y/o para mejorar la apariencia de piel arrugada, de edad, dañada por la luz y/o piel irritada, cuando se aplica sobre la piel que se ha deteriorada por la edad y el tiempo que ha sido expuesta a la luz o cuando se aplica sobre piel joven para ayudar a prevenir o retardar tales cambios de deterioro. Las composiciones se pueden procesar en una manera convencional.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método cosmético para proporcionar por lo menos un beneficio para el cuidado de la piel seleccionado de: tratamiento/prevención de arrugas, flacidez, piel envejecida y/o dañada por efectos de la luz; deposición elevada de colágeno en la piel, producción elevada de decorin en la piel, mejoramiento en la recuperación del tejido; aclarado de la piel; aliviar irritaciones, piel roja y/o sensible; mejorar la textura de la piel; suavidad y/o firmeza; el método comprende aplicar sobre la piel una composición tópica que comprende ácido petroselénico y/o los derivados del mismo.
2. 2. El uso de ácido petroselénico y/o los derivados del mismo para la preparación de una composición tópica para proporcionar por lo menos un beneficio para la piel seleccionado de: tratamiento/prevención de arrugas, flacidez, piel envejecida y/o dañada por efectos de la luz; deposición elevada de colágeno en la piel, producción elevada de decorin en la piel, mejoramiento en la recuperación del tejido; aclarado de la piel; aliviar irritaciones, piel roja y/o sensible; mejorar la textura de la piel; suavidad y/o firmeza.