MXPA00008678A - Nuevas secuencias nucleotidicas que codifican para el gen dapf. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un polinucleçotido aislado que comprende una secuencia polinucleotidica elegida del grupo que consiste de: a) el polinucleotido es identico que codifica para un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; b) el polinucleotido que es edentico a un grado de al menos 70% a un polinucleotido que codifica para el polipeptido que es expresado por el gen dapF contenido en el vector pEC-XT99A-dapF en la cepa depositada de C. Glutamicum DSM 12968; c) polinucleotido que codifica para un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica a un grado de al menos 70% a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO.2; d) el polinucleotido que es complementario a los polinucleotidos que es complementario a los polinucleotidos de a), b) o c), y e) el polinucleotido que comprende al menos 15 bases sucesivas de la secuencia polinucleotidica de a), b), c) o d). Y un proceso para la preparacion fermentativa de L-lisina con amplificacion del gen dapF.

Description

NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN PARA EL GEN dapF CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona secuencias nucleotídicas que codifican para el gen dapF y un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina utilizando bacterias corineformes en las cuales se amplifica el gen dapF.

TÉCNICA ANTERI OR La L-lisina se utiliza en medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en particular en nutrición animal. Se sabe que la L-lisina se prepara mediante fermentación de las cepas de bacterias corineformes, en particular Coryneba cteri um gl u taml cum . Debido a su gran importancia, están siendo emprendidos constantemente trabajos para mejorar el proceso de su preparación. Los mejoramientos al- proceso pueden relacionarse a las medidas de fermentación, tales como por ejemplo la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición del medio nutritivo, tal REF. 122045 como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento al producto por ejemplo mediante cromatografia de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas del microorganismo mismo. Los métodos de mutagénesis, la selección y la selección de mutantes se utilizan para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Las cepas que son resistentes a los antimetabolitos, tales como por ejemplo el análogo de lisina S-(2-aminoetil ) -cisteína, o son auxotróficos para los aminoácidos de importancia regulatoria y producen L-lisina, se obtienen de esta manera. Los métodos de la técnica de ADN recombinante han sido también empleados por algunos años para mejorar las cepas de Coryneba c t eri um que producen L-lisina, mediante la amplificación de los genes de biosíntesis de lisina individuales e investigando el efecto sobre la producción de L-lisina. Los artículos de revisión en este contexto se encuentran, entre otros, en Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", en: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, Londres, Reino Unido, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994)), Jetten and Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sania et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)). En procariotes, se conocen tres diferentes rutas para la biosíntesis de D, L-diaminopimelato- o L-lisina. Estas rutas difieren en la reacción de L-piperidin-2, 6-dicarboxilato ( tetrahidrodipicolinato ) . En la ruta de la succinilasa, el tetrahidrodipicolinato es convertido a D,L-diaminopimelato vía una succinilación por la tetra idrodipicolinato-succinilasa, las transaminación subsecuente (?-succinil-amino-cetopimelato-transaminasa) del grupo ceto, desuccinilación (?-succinil-amino-cetopimelato-desuccinilasa) y luego la epimerización (diaminopimelato-epimerasa) (Gilvarg, 1958, The Journal of Biological Chemistry, 233: 1501-1504). En la ruta de la acetilasa, la cual se realiza en Ba cill us subtili s y Bacill us mega teri um, la acilación del tetrahidrodipicolinato se lleva a cabo por un radical acetilo ( einberger & Gilvarg, 1970, Journal of Bacteriology, 101: 323-324). Una tercera ruta de biosíntesis se describe para B . spha eri cus (Misono et al., 1976, Journal of Bacteriology, .137: 22-27). En este paso de biosíntesis, el cual es denominado la ruta de la deshidrogenasa, tiene lugar la aminación reductiva directa del tetrahidrodipicolinato a D,L-DAP. Con la ayuda de estudios genéticos y enzimáticos, Schrumpf y colaboradores (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) mostraron que en Corynebacterium glutamicum, la biosíntesis de lisina tiene lugar mediante la ruta de deshidrogenasa y mediante la ruta de la succinilasa. Mediante estudios de RMN in vivo por Marx et al. (Biotechnology and Bioengineering 56, 168-180 (1997)) y Sonntag (European Journal of Biochemistry 213: 1325-1331 (1993)) se ha encontrado que en Corynebacterium glutamicum la ruta de la succinilasa y la ruta de deshidrogenasa contribuyen a la producción de L-lisina. El gen para la desuccinilasa (dapE) proveniente de Corynebacterium glutamicum ha sido clonado y secuenciado por Wehrmann et al. (Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)). Ha sido también posible clonar y secuenciar el gen para la succinilasa (dapD) a partir de Corynebacterium glutamicum (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)).

OBJETIVOS DE LA INVENC I ÓN Los inventores tuvieron el objetivo de proporcionar nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de L-lisina.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La L-lisina se utiliza en medicina humana, en la industria farmacéutica y en particular en nutrición animal. Existe por lo tanto un interés general para proporcionar nuevos procesos mejorados para la preparación de L-lisina. Cuando la L-lisina o la lisina se mencionan en lo subsiguiente, no solamente se entiende la base sino también las sales, tales como por ejemplo el monoclorhidrato de lisina o sulfato de lisina. La invención proporciona un polinucleótido aislado proveniente de bacterias corineformes, que comprende una secuencia polinucleotídica elegida del grupo que consiste de: a) polinucleótido que es idéntico a un grado de al menos 70% a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, b) el polinucleótido que es idéntico a un grado de al menos 705 a un polinucleótido que codifica para el polipéptido que es expresado por el gen dapF contenido sobre el plásmido pEC-XT99A-dapF en la cepa DSM 12968 depositada de C. gl u tami cum, c) el polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un grado de al menos 70% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, d) el polinucleótido que es complementario a los polinucleótidos de a) , b) o c) , y e) el polinucleótido que comprende al menos 15 bases sucesivas de la secuencia polinucleotídica de a) , b) , c) o d) . La invención también proporciona el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, siendo éste preferentemente un ADN que es capaz de replicarse, que comprende: i) la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO: 1; o ii) al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro del intervalo de la degeneración del código genético, o iii) al menos una secuencia que se hibrida con .la secuencia complementaria a la secuencia (i) o (ii), y opcionalmente iv) mutaciones en sentido de la función neutra en ( i ) . La invención también proporciona: un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, que comprende la secuencia nucleotídica como se muestra en la SEQ ID NO: 1, un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2, un vector' que contiene la secuencia polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 1, en particular pEC-XT99A-dapF, depositada como DSM 12968; y bacterias corineformes que sirven como la célula huésped, que contienen el vector de conformidad con la reivindicación 7. La invención también proporciona polinucleótidos que comprenden sustancial ente una secuencia polinucleotídica, que son obtenibles mediante selección por medio de hibridación de una genoteca correspondiente, que comprenden el gen completo con la secuencia polinucleotídica correspondiente a la SEQ ID NO: 1, con una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido mencionado, de acuerdo a la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma, y el aislamiento de la secuencia de ADN mencionada . Las secuencias polinucleotídicas de acuerdo con la invención son adecuadas como sondas de hibridación para ARN, ADNc y ADN, con el fin de aislar, en la longitud completa, el ADNc que codifica para la diaminopimelato-epimerasa y para aislar el ADNc o los genes que tienen una alta similitud de secuencia con aquella del gen de la diaminopimelato-epimerasa. Las secuencias polinucleotídicas de acuerdo a la invención son además adecuadas como cebadores para la preparación de ADN de los genes que codifican para la diaminopimelato-epimerasa mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores comprenden al menos 30, preferentemente al menos 20, especialmente preferentemente al menos 15 bases sucesivas. Los oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 40 ó 50 pares de bases son también adecuados.

"Aislado" significa separado de su ambiente natural . "Polinucleótido" en general se refiere a los polirribonucleótidos y a los polidesoxirribonucleótidos , siendo posible que éstos sean ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados . "Polipéptidos" se entiende los péptidos o proteínas que comprenden dos o más aminoácidos unidos vía enlaces peptídicos. Los polipéptidos de acuerdo a la invención incluyen un polipéptido de acuerdo a la SEQ ID NO: 2, en particular aquellos con la actividad biológica de la diaminopimelato-epimerasa, y también aquellos que son idénticos al grado de al menos 70% al polipéptido de acuerdo a la SEQ ID NO: 2, y preferentemente son idénticos a un grado de 80% y en particular a un grado de 90% a 95%, al polipéptido de acuerdo a la SEQ ID NO: 2, y tienen la actividad mencionada. La invención también proporciona un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina utilizando bacterias corineformes, que en particular producen ya L-lisina, y en las cuales las secuencias nucleotídicas que codifican para el gen dapF son amplificadas, en particular sobre-expresadas.

El término "amplificación" en este contexto describe el incremento en la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo mediante el incremento del número de copias del gen o genes, utilizando un promotor potente o utilizando un gen que codifica para una enzima correspondiente que tiene una alta actividad, y combinando opcionalmente estas medidas. Los microorganismos que proporciona la presente invención pueden preparar L-lisina a partir de glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa o a partir de glicerol y etanol. Éstos pueden ser representativos de bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium. Del género Corynebacterium, se puede mencionar en particular la especie Corynebacterium glutamicum, la cual es conocida entre los especialistas para su habilidad para producir L-aminoácidos. Las cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, son, por ejemplo, las cepas de tipo silvestre conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y los mutantes productores de L-lisina o cepas producidas a partir de éstos, tales como, por ejemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FÉRM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM5715 Los inventores han tenido éxito en aislar el Nuevo gen dapF de C. glutamicum, el cual codifica para las enzimas diaminopimelato-epimerasa (EC 5.1.1.7) . Para aislar el gen dapF o también otros genes de C. glutamicum, es primeramente establecida una genoteca de este microorganismo dentro de E. coli. El establecimiento d la genoteca se describe en los libros de texto y manuales en general conocidos. El libro de texto por Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag CEIME, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual por Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) pueden ser mencionados como un ejemplo. Una genoteca bien conocida es aquella de E . col i K-12 cepa W3110 establecida en vectores ? por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)). Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) describen una genoteca de C. gl u tami cum ATCC13032, la cual fue establecida con la ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) en la cepa E . col i K-12 NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575). Bdrmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) a su vez describen una genoteca de C. gl u tami cum ATCC13032 utilizando el cósmido pHC79 (Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Para preparar una genoteca de C. gl u tami cum en E . col i es también posible utilizar plásmidos tales como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Viera et al., 1982, Gene, 19: 259-268). Los huéspedes adecuados son, en particular, aquellas cepas de E . coli que son defectuosas en restricción y en recombinación. Un ejemplo de éstas es la cepa DH5amcr, la cual ha sido descrita por Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) . Los fragmentos de ADN largos, clonados con ayuda de cósmidos, pueden luego a su vez ser subclonados y subsiguientemente secuenciados en los vectores usuales que son adecuados para el secuenciamiento, tal como se describe como por ejemplo por Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977). La nueva secuencia de ADN de C. gl u tami cum que codifica para el gen dapF y la cual es un constituyente de la presente invención como SEQ ID NO: 1 se obtuvo de esta manera. La secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente ha sido además derivada de la presente secuencia de ADN mediante los métodos descritos anteriormente. La secuencia de aminoácidos resultante del producto génico dapF se muestra en la SEQ ID NO: 2. Las secuencias de ADN de codificación que resultan de la SEQ ID NO: 1 por la degeneración del código genético, son también un constituyente de la invención. De la misma manera, las secuencias de ADN que se hibridan con la SEQ ID NO: 1 o partes de la SEQ ID NO: 1 son un constituyente de la invención. Los intercambios conservadores de aminoácidos, tales como por ejemplo intercambio de glicina por alanina o ácido aspártico por ácido glutámico en proteínas, son además conocidos entre los expertos como "mutaciones en sentido" las cuales no conducen a un cambio fundamental en la actividad de la proteína, por ejemplo son de función neutra. Se sabe además que los cambios del extremo N y/o C de una proteína no pueden deteriorar sustancialmente o incluso pueden estabilizar la función de la misma. La información en este contexto puede ser encontrada por el experto, entre otros, en Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), en O'Regan et al.

(Gene 77: 237-251 (1989)), en Sahin-Toth et al.

(Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), en Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular. Las secuencias de aminoácidos que resultan de una manera correspondiente de la SEQ ID NO: 2 son también un constituyente de la invención. De la misma manera, las secuencias de ADN que se hibridan con la SEQ ID NO: 1 o partes de la SEQ ID NO: 1 son un constituyente de la invención. Finalmente, las secuencias de ADN que son preparadas mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores que resultan de la SEQ ID NO: 1 son un constituyente de la invención. Tales oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de al menos 15 pares de bases. Las instrucciones para la identificación de las secuencias de ADN por medio de la hibridación pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GMBH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260) . Las instrucciones para la amplificación de las secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en el manual por Gait: Oligonucleotide Synthesis: un procedimiento práctico (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994). Los inventores han encontrado que las bacterias corineformes producen L-lisina de una manera mejorada después de la sobre-expresión del gen dapF. Para lograr una sobre-expresión, el número de copias de los genes correspondientes puede ser incrementado, o el promotor y la región de regulación o el sitio de enlace al ribosoma corriente arriba (5') del gen estructural puede ser mutado. Los casetes de expresión que son incorporados corriente arriba (5') del gen estructural actúan de la misma manera. Mediante promotores inducibles, es adicionalmente posible incrementar la expresión en el curso de la producción fermentativa de L-lisina. La expresión es de igual modo mejorada por medidas para prolongar la vida 'del ARNm. Además, la actividad enzimática es también incrementada para prevenir la degradación de la enzima proteica. Los genes o construcciones de genes pueden ya sea estar presentes en los plásmidos con un número variante de copias, o pueden estar integrados y/o amplificados en el cromosoma. Alternativamente, una sobre-expresión de los genes en cuestión puede además ser lograda mediante el cambio de la composición del medio y el procedimiento de cultivo. Las instrucciones en este contexto pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Especificación de Patente Europea EPS 0,472,869, en la Patente de los Estados Unidos No. 4,601,893, en Schwarzer and Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Solicitud de Patente Japonesa Laid-Open JP-A-10-229891 , en Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) y en los libros de texto conocidos de genética y biología molecular. Un ejemplo de un plásmido con la ayuda del cual puede ser sobre-expresado el gen dapF es pEC-XT99A-dapF (Figura 2), el cual está contenido en la cepa DSM5715/pEC-XT99A-dapF. El plásmido pEC-XT99A-dapF es un vector lanzadera de E . coli - C . gl utami cum basado en el plásmido pEC-XT99A (Figura 1) . Este vector plasmídico contiene la región de replicación del plásmido pGAl (US-B-5 , 175, 108 ) y el gen de resistencia a la tetraciclina del plásmido pAGl (No. De Acceso AF121000 del Centro Nacional para la Información de Biotectonología, Bethesda, MD, EUA) . Otros vectores plas ídicos que son capaces de replicarse en C. gl u tami cum tales como por ejemplo pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) o pZ8-l (EP-B-0, 375, 889) pueden ser utilizados de la misma manera. Además, puede ser ventajoso para la producción de L-lisina, el sobre-expresar una o más enzimas de la ruta de biosíntesis de la lisina, además del gen dapF. De este modo, por ejemplo: • al mismo tiempo el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato-sintasa puede ser sobre- expresado (EP-B-0, 197, 335) , o • al mismo tiempo un fragmento de ADN que imparte resistencia a la S- ( 2-aminoetil ) -cisteína puede ser amplificado (EP-A-0, 088, 166) , o • al mismo tiempo el gen dapD que codifica para la tetradihidrodipicolinato-succinilasa (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)), o • al mismo tiempo el gen dapE que codifica par ala succinildiaminopimelato-desuccinilasa (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 . (1995)) puede ser sobre-expresado.

Además de la sobre-expresión del gen dapF puede ser ventajoso, para la producción de L-lisina, eliminar las reacciones colaterales no deseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphansz, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982) . Los microorganismo preparados de acuerdo a la invención pueden ser cultivados continuamente o discontinuamente en proceso en lotes (cultivo en lotes) o en lotes de alimentación (proceso de alimentación) o procesos en lotes de alimentación repetidos (proceso de alimentación repetitiva) para fines de producción de L-lisina. Una breve descripción de los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto por Chmiel (Bioprozesstechmk 1. Einführung in die Bioverfahrenstec nik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que va a ser utilizado debe cumplir los requerimientos de las cepas particulares de una manera adecuada. Las descripciones de los medios de cultivo para diversos microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington, D.C., EUA, 1981) . Los azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas, tales como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de nuez y aceite de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, y alcoholes, tales como por ejemplo glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético, pueden ser utilizados como la fuente de carbono. Estas sustancias pueden ser individualmente utilizadas o como una mezcla. Los compuestos que contienen nitrógeno orgánico, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de extracción de maíz, harina de frijol de soya o urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pueden ser utilizados como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno pueden ser utilizadas individualmente o como una mezcla. El ácido fosfórico, el fosfato diácido de potasio o el fosfato ácido dipotásico o las sales correspondientes que contienen sodio, pueden ser utilizados como la fuente de fósforo. El medio de cultivo debe además comprender sales de metales, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, las cuales no son necesarias para el desarrollo. Finalmente, las sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas, pueden ser empleadas además de las sustancias anteriormente mencionadas. Los precursores adecuados pueden además ser agregados al medio de cultivo. Las sustancias iniciales mencionadas, pueden ser agregadas al cultivo en la forma de un lote simple, o pueden ser alimentadas durante el cultivo de una manera adecuada. Los compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, pueden ser empleados de una manera adecuada para controlar el pH . Los antiespumantes, tales como por ejemplo esteres de poliglicol de ácido graso, pueden ser empleados para controlar el desarrollo de espuma. Las sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva, por ejemplo, antibióticos, pueden ser agregadas al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener las condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gas que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire, se introducen en el cultivo. • La temperatura del cultivo es usualmente de 20°C a 45°C, y preferentemente de 25°C a 40°C. El cultivo es continuado hasta que se ha formado un máximo de lisina. Este objetivo es usualmente alcanzado dentro de 1.0 horas a 160 horas. El análisis de L-lisina se puede llevar a cabo mediante cromatografía de intercambio de aniones con la subsiguiente derivatización con ninhidrina, como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) . Los siguientes microorganismos han sido depositados en la Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest : • Corynebacteri um gl utami cum cepa DSM5715/pEC- XT99A como DSM 12967 • Coryneba cteri um gl utami cum cepa DSM5715/pEC- XT99A-dapF como DSM 12968.

El proceso de acuerdo a la invención es utilizado para la preparación fermentativa de L-lisina .

Ej emplos La presente invención es explicada con más detalle en lo subsiguiente con ayuda de los ejemplos de modalidades.

Ejemplo 1 Preparación de una genoteca de cósmido genómico de Corynebacteri um gl utami cum ATCC 13032.

El ADN cromosómico de Coryneba c t eri um gl u tami cum ATCC 13032 se aisló como se describe por Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) y parcialmente escindido con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del Producto Sau3AI, No. De Código 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN fueron desfosforilados con la fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Código no. 1758250). El ADN del vector cósmido SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 84: 2160-21.64), obtenido de la compañía Stratagene (La Jolla, EUA, Descripción del Producto Equipo de Vector Cósmido SuperCosl, Código no. 251301) fue escindido con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Xbal, Código no. 27-0948-02) y de igual modo desfosforilado con la fosfatasa alcalina de camarón. El ADN cósmido fue luego escindido con la ' enzima de restricción BamHl, (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHl, Código no. 27-0868-4) . El ADN cósmido tratado de esta manera se mezcló con el ADN de ATCC13032 tratado, y el lote se trató con la ADN-ligasa T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto T4-DNA-Ligase, Código no. 27-0870-04) . La mezcla de ligadura se empaquetó luego en fagos con ayuda de Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, EUA, Descripción del Producto Gigapack II XL Packing Extract, Código no. 200217) . Para la infección de la cepa E . col i NM 554 (Raleigh et al. 1988, Nucl e i c Acid Research 16: 1563-1575) las células fueron recogidas en sulfato de magnesio (MgS04) 10 mM y mezcladas con una alícuota de la suspensión del fago. La infección y la titulación de la genoteca del cósmido se llevaron a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , siendo sembradas en placas las células sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) con 100 µg/ml de ampicilina. Después de incubación toda la noche a 37°C, se seleccionaron los clones individuales recombinantes.

Ejemplo 2 Aislamiento y secuenciamiento del gen dapF, El AD? cósmido de una colonia individual se aisló con el equipo Qiaprep Spin Miniprep (Producto ?o . 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y fue escindido parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Producto ?o . 27-0913-02). Los fragmentos de AD? fueron desfosforilados con la fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, producto No. 1758250). Después de la separación mediante electroforesis en gel, los fragmentos cósmidos en el intervalo de tamaño de 1500 a 2000 pares de bases fueron aislados con el Equipo de Extracción de Gel QiaExII (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de secuenciamiento pZero-1, . obtenido de la compañía Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción del Producto Zero Backround Cloning Kit, Producto No. K2500-91) fue escindido con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHl, Producto No. 27-0868-04) . La ligadura de los fragmentos cósmidos en el vector de secuenciamiento pZero-1 se llevó a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), la mezcla de ADN es incubada toda la noche con la ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) . Esta mezcla de ligadura fue luego sometida a electroporesis (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) dentro de E . coli cepa DH5 MCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) y sembrada en placa sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) con 50 µg/ml de zeocina. La preparación del plásmido de los clones recombinantes se llevó a cabo con el Biorobot 9600 (Producto No. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania). El secuenciamiento se llevó a cabo mediante el método de detención de cadena didesoxi de Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences E.U.A., 74: 5463-5467) con modificaciones de acuerdo a Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067) . El "Equipo de Secuenciamiento de Ciclo Terminador De dRhodamin RR" de PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania) fue utilizado. La separación mediante electroforesis en gel y análisis de la reacción de secuenciamiento se llevó a cabo en un Gel de "Acrilamida/Bisacrilamida NF de Rotiforesis" (29:1) (Producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABl Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos de la secuencia en bruto obtenidos fueron luego procesados utilizando el paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) versión 97-0. Las secuencias individuales de los derivados pZerol fueron ensambladas a un contig continuo. El análisis de la región de codificación ayudado por computadora se preparó con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) . Los análisis de homología fueron llevados a cabo con los "programas de búsqueda BLAST" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402), contra el banco de datos no redundante del "Centro Nacional para la Información de Biotecnología" (NCBI, Bethesda, MD, EUA) . La secuencia nucleotídica obtenida es mostrada en la SEQ ID NO. 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos mostró una estructura de lectura abierta de 831 pares de bases, la cual fue llamada el gen dapF. El gen dapF codifica para un polipéptido de 277 aminoácidos.

EJEMPLO 3 Construcción del vector de expresión pEC-XT99A, El vector de expresión de E . col i pTRC99A (Amann et al. 1988, Gene 69: 301-315) fue utilizado como el vector inicial para la construcción del vector de expresión lanzadera de E . coli -C . gl u tami cum, pEC-XT99A. Después de la escisión por restricción con BspHI (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto BspHI, Producto No. 1467123) y subsiguiente con tratamiento con Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto de Fragmento Klenow de la ADN-polimerasa I, Producto No. 27-0928-01: método de Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) el gen de la resistencia a la ampicilina (bla) fue reemplazado por el gen de resistencia a la tetraciclina del plásmido pAGl de C . gl u tami cum (GenBank Acceso No. AF121000) . Para esto, la región que lleva el gen de resistencia fue clonado como un fragmento Alul (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Alul, Producto No. 27-0884-01) dentro del vector de expresión linearizado de E . col i , pTRC99A. La ligadura se llevó a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , la mezcla de ADN se incubó toda la noche con la ligasa T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto T4-DNA-Ligase, Producto No. 27-0870-04). Esta mezcla de ligadura fue luego sometida a electroporesis (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiology Letters, 123: 343-7) dentro de E . col i cepa' DH5amcr (Grant, 1990, Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias (Proceedings of the National Academy of Sciences) E.U.A., 87: 4645-4649). El vector de expresión de E . coli construido fue llamado pXT99A. El plásmido pGAl (Sonnen et al. 1991, Gene, 107: 69-74) fue utilizado como la base para la clonación de un replicón mínimo a partir de Coryneba c t eri um gl u tami cum . La escisión por restricción con BalI/PstI (Promega GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto Ball, Producto No. R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto PstI, Producto No. 27-0976-01) del vector pGAl, fue posible para clonar un fragmento de 3484 pares de bases en el vector pK18mob2 (Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169: 303-312) fragmentado con Smal y PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Smal, Producto No. 27-0942-02, Descripción del Producto PstI, Producto No. 27-0976-01) . Por medio de la escisión por restricción con BamHI/XhoI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHl, Producto NO. 27-086803, Descripción del Producto Xhol, Producto No. 27-0950-01) y el tratamiento subsiguiente con Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Fragmento Klenow de ADN-polimerasa I, Producto No. 27-0.928-01; método de Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , fue suprimido un fragmento de 839 pares de bases. A partir de la construcción religada con la ligasa T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto T4-DNA-Ligase, Producto No. 27-0870-04), fue posible clonar el replicón mínimo de C. gl utami cum como un fragmento de 2645 pares de bases en el vector de expresión de E . coli pXT99A. Para esto, el ADN de la construcción que lleva el replicón mínimo fue escindido con las enzimas de restricción Kpnl, Producto No. 27-0908-01) y PstI (American' Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto PstI, Producto No. 27-0886-03) y un tratamiento con la exonucleasa 3'-5' (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) se llevó a cabo subsiguientemente por medio de la polimerasa de Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Fragmento de Klenow de la ADN-Polimerasa I, Producto No. 27-0928-01) . En un lote paralelo, el vector de expresión de E . coli , pXT99A fue escindido con la enzima de restricción RsrII (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto RsrII, Producto No. 1292587) y preparado para la ligadura con la polimerasa de Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Fragmento de Klenow de la ADN-Polimerasa I, Producto No. 27-0928-01). La ligadura del replicón minimo con la construcción vector pXT99A se llevó a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), la mezcla de ADN se incubó toda la noche con la ligasa T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto T4-DNA-Ligase, Producto No. 27-0870-04). El vector de expresión lanzadera de E . coli -C . gl u tami cum, pEC-XT99A, construido de esta manera fue transferido a C . gl u tami cum por medio de electroporación (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303). El transformante pudo ser verificado por análisis del ADN plasmídico reaislado. La construcción del plásmido obtenido de este modo fue llamada pEC-XT99A (Figura 2) . La cepa de E . coli obtenida mediante transformación del plásmido pEC-XT99A en la cepa E . coli DH5amcr fue llamada DH5amcr/pEC-XT99A.

EJEMPLO 4 Expresión del gen dapF, Comenzando a partir de la secuencia nucleotídica del gen de la diaminopimelato-epimerasa, dapF de C. gl u tami cum ATCC 13032 mostrado en la SEQ ID NO. 1, se sintetizaron los cebadores de PCR (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Alemania) . Estos cebadores fueron elegidos de modo que el fragmento amplificado contiene el gen y los sitios de enlace al ribosoma, nativos del mismo, pero no las posibles regiones promotoras. Además, los sitios de escisión de restricción adecuados, que permiten la clonación dentro del vector objetivo, fueron también insertados. Las secuencias de los cebadores de PCR, los sitios de escisión insertados (secuencia subrayada) y el gen amplificado (el tamaño del fragmento en pb es colocado en paréntesis) se listan en la Tabla 1.

El gen de la diaminopimelato-epimerasa dapF de C . gl utami cum ATCC13032 fue amplificado utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y los oligonucleótidos sintéticos descritos en la Tabla 1. Los experimentos de ' PCR fueron llevados a cabo con la ADN-polimerasa de Pfu de la compañía Stratagene (La Jolla, California, Descripción del Producto ADN- Polimerasa de Pfu nativa, Producto No. 600250) en un "Termociclador PCT-100" (MJ Research Inc., Watertown, Mass., EUA) . Un paso de desnaturalización simple de 3 minutos a 94°C fue seguido por un paso de desnaturalización de 30 minutos a 94°C, un paso de recocido por 30 segundos a una temperatura dependiente del cebador de T=(2AT+4GC) -5°C (Suggs, et al., 1981, p. 683-693, En: D. D. Brown, y C. F. Fox (Eds.), Developmental biology using purified genes. Academic Press, Nueva York, EUA) y un paso de extensión a 72°C que duró 90 segundos. Los últimos • tres pasos fueron repetidos como un ciclo 30 veces y la reacción fue terminada con un paso de extensión de 5 minutos a 72°C. El producto preparado de esta manera fue probado para su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. El vector de expresión lanzadera de E . coli - C. gl u tami cum pEC-XT99A mostrado en la Figura 1 (Ejemplo 3) fue utilizado como el vector base para la expresión. El producto de PCR resultante fue escindido completamente con las enzimas de restricción BamHl y Muñí, y ligado dentro del vector de expresión pEC-XT99A, el cual también había sido escindido con las enzimas EcoR? y BamHl (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto EcoRI, Producto No. 27-0854-03, Descripción del Producto BamHl, Producto No. 27-0868- 03) . De esta manera, el gen dapF menos promotor es puesto bajo el control del promotor trc contenido en este plásmido. La ligadura de la amplificación dapFex dentro del vector de expresión pEC-XT99A se llevó a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , la mezcla de ADN es incubada toda la noche con la ligasa T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto T4-DNA-Ligase, Producto No. 27-0870-04). Esta mezcla de ligadura fue luego sometida a electroporesis (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiology Letters, 123:343-7) dentro de E . coli cepa DH5amcr (Grant, 1990, Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias de los E.U.A., 87: 4645-4649) y sembrada en placa sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 5 µg/ml de tetraciclina y 40 µg/ml de X-Gal (ß-D-galactósido de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo ) . Después de' la incubación por 24 horas a 37°C, pudieron ser identificadas las colonias con plásmidos que poseen el inserto, con la ayuda de a-complementación (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). Mediante reaislamiento del ADN plasmídico por el "método de lisis alcalina" de Birnboim y Doly (1997, Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523), el ADN de la construcción de expresión correspondiente fue obtenido a partir de los transformantes. La clonación correcta del plásmido de expresión fue verificada mediante secuenciamiento del inserto.

La construcción plasmídica obtenida de este modo fue llamada pEC-XT99A-dapF. La cepa de E . col i obtenida mediante transformación del plásmido pEC- XT99A-dapF en E . coli cepa DH5amcr fue llamada DH5aMCR/pEC-XT99A-dapF.

EJEMPLO 5 Transformación de la cepa DSM5715 con los plásmidos pEC-XT99A y pEC-XT99A-dapF.

Los plásmidos pEC-XT99A (Ejemplo 3) y pEC-XT99A-dapF (Ejemplo 4) fueron lavados con corriente de agua en la cepa DSM5715 mediante el método de electroporación (Liebl et 'al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303) . Los transformantes obtenidos con la ayuda de la electroporación fueron aislados sobre agar de selección (agar LBHIS (18.5 g/litro de caldo de infusión cerebro-corazón, sorbitol 0.5 M, 5 g/litro de Bacto-triptona, 2.5 g/litro de extracto de Bacto-levadura, 5 g/litro de NaCl, 18 g/litro de Bacto-agar) ) con 15 mg/litro de kanamicina. El ADN plasmídico fue aislado mediante métodos convencionales ( Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), cortado con las endonucleasas de restricción adecuadas (PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto PstI, Producto No. 27-0886-03)) y verificado. Las cepas obtenidas fueron llamadas DSM5715/pEC-XT99A y DSM5715/pEC-XT99A-dapF .

EJEMPLO 6 Preparación de L-lisina.

Las cepas DSM5715/pEC-XT99A y DSM5715/pEC-XT99A-dapF de C. gl utami cum preparadas en el Ejemplo 5, fueron cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y eí contenido de lisina fue determinado en el sobrenadante del cultivo. Para esto, las cepas fueron primeramente incubadas sobre placas de agar (agar de cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/litro) ) por 24 horas a 33°C. Comenzando a partir de estos cultivos de placas de agar, se sembró un precultivo (10 ml de medio en un matraz cónico de 100 ml ) . El medio utilizado para el precultivo fue el medio completo CglII (Bacto-peptona 10 g/litro, extracto de Bacto-levadura 10 g/litro, NaCl 5 g/litro, pH 7.4 (Eggeling et al., 1987, Applied Microbiology and Biotechnology, 25: 346-351). Se agregaron 5 mg/litro de tetraciclina. El precultivo fue incubado por 24 horas a 33°C a 240 rpm en una máquina de agitación. Se sembró un cultivo principal a partir de este precultivo tal que la DO inicial (longitud de onda de medición 660 nm) del cultivo principal fue de 0.2 DO. Se utilizó medio MM para el cultivo principal.

Medio MM: CSL 5 g/litro MOPS 20 g/litro Glucosa 50 g/litro (autoclave separadamente) Sales : {NH4)2S04) 25 g/litro KH2P04 0.1 g/litro MgS04*7 H20 1.0 g/litro CaCl2*2 H20 10 mg/litro FeS04*7 H20 10 mg/litro MnS04*H20 5.0 mg/litro L-Leucina 0.1 g/litro. Biotina 0.3 mg/litro (esterilizado por filtración' Tiamina*HCl 0 . 2 mg/ l i tro ( es teril i z ado por filtración) CaC03 25 g/ li tro Abreviaturas : CSL: Licor de extracción de maíz MOPS: Acido morfolinopropansulfónico El CSL, MOPS y la solución salina se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se esterilizaron en autoclave. El sustrato estéril y las soluciones de vitaminas son luego agregadas, y el carbonato de calcio esterilizado en autoclave en el estado seco, fue agregado también. Se lleva a cabo el cultivo en un volumen de 10 ml en un matraz de 100 ml cónico con amortiguadores. Se agregó tetraciclina (5 mg/litro). El cultivo se llevó a cabo a 33°C y 80% de humedad atmosférica . Para inducir la expresión de dapF, se agregó IPTG 1 mM (tio-ß-galactósido de isopropilo, Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, Alemania) Catálogo Número 15529-019) . Después de 72 horas, la densidad óptica a una longitud de onda de medición de 660 nm y la concentración de lisina formada, fueron determinados. Un fotómetro digital LD 1W de la compañía Lange (Berlín, Alemania) fue empleado para la determinación de la densidad óptica (DO660) . La lisina fue determinada con un analizador de aminoácidos de la compañía Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) mediante cromatografía de intercambio iónico y derivatización post-columna con detección por ninhidrina . El resultado del experimento se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2 PROTOCOLO DE SECUENCIAS <110> Degussa-Hüls AG <120> Nuevas secuencias nucleotidicas que codifican para el gen dapF <130> 990126 BT <140> 0 <141> <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 5 <210> 1 <211> 1084 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum 0 <220> <221> -35_signal <222> (117) .. (123) 5 <220> <221> -10_signal <222> (138) .. (143) <220> 0 <221> CDS <222> (151) .. (981) <400> 1 5 agacgccttc gaacgcacgg tcaccggaac cagacgctat gtcaggcgcc aacgcagctg 60 gttcaacaga gaccaccgcg tgtcctgggt cgacgcctct ggcgatccca ccgcacaagc 120 ctcggagatt ttgggtctac aatagcgagg gtg aat ttg acc ate ccc ttt gcc 174 0 Val Asn Leu Thr He Pro Phe Ala 1 5 aaa ggc cae gcc acc gaa aac gac ttc ate ate ate ccc gat gag gat 222 Lys Gly His Ala Thr Glu Asn Asp Phe He He He Pro Asp Glu Asp 5 10 15 20 gcg cge cta gat tta act cea gaa atg gtg gtc acg ctg tgt gac cgc 270 Ala Arg Leu Asp Leu Thr Pro Glu Met Val Val Thr Leu Cys Asp Arg 25 30 35 40 5C cgc gcc ggg ate ggt gct gat ggt ate etc cgc gtg gtt aaa gct gca 318 Arq Ala Gly He Gly Ala Asp Gly He Leu Arg Val Val Lys Ala Ala 45 50 55 ?C ga~ gta gaa ggc tcc acg gtc gac cea tcg ctg tgg ttc atg gat tac 366 Asp Val Glu Gly Ser Thr Val Asp Pro Ser Leu Trp Phe Met Asp Tyr 60 65 70 cgc aac gcc gat gga tct ttg gct gaa atg tgc ggc aat ggt gtg cgc 414 Arg Asn Ala Asp Gly Ser Leu Ala Glu Met Cys Gly Asn Gly Val Arg 75 80 85 ctg ttc gcg cae tgg ctg tac tcc cgc ggt ctt gtt gat aat acg age 462 Leu Phe Ala His Trp Leu Tyr Ser Arg Gly Leu Val Asp Asn Thr Ser 90 95 100 10 ttt gat ate ggt acc cgc gcc ggt gtc cgc cae gtt gat att ttg cag 510 Phe Asp He Gly Thr Arg Ala Gly Val Arg His Val Asp He Leu Gln 105 110 115 120 gca gat caá cat tct gcg cag gtc cgc gtt gat atg ggc ate ect gac 558 5 Ala Asp Gln His Ser Ala Gln Val Arg Val Asp Met Gly He Pro Asp 125 130 135 gtc acg gga tta tcc acc tgc gac ate aac ggc caá gta ttc gct ggc 606 Val Thr Gly Leu Ser Thr Cys Asp He Asn Gly Gln Val Phe Ala Gly 0 140 145 150 ctt ggc gtt gat atg ggt aac cea cae cta gcg tgc gtt gtg ccg ggc 654 Leu Gly Val Asp Met Gly Asn Pro His Leu Ala Cys Val Val Pro Gly 155 160 165 5 tta agt gcg tcg gct ctt gcc gat atg gaa ctg cgc gca ect acg ttt 702 Leu Ser Ala Ser Ala Leu Ala Asp Met Glu Leu Arg Ala Pro Thr Phe 170 175 180 30 gat cag gaa ttc ttc ccc cae ggt gtg aac gta gaa ate gtc acá gaa 750 Asp Glp Glu Phe Phe Pro His Gly Val Asn Val Glu He Val Thr Glu 185 190 195 200 tta gaa gat gac gca gta tcg atg cgc gtg tgg gaa cgc gga gtg ggc 798 35 Leu Glu Asp Asp Ala Val Ser Met Arg Val Trp Glu Arg Gly Val Gly 205 210 215 gaa acc cgc tcc tgt ggc acg gga acc gtt gct gca gcg tgt gct gct 846 Glu Thr Arg Ser Cys Gly Thr Gly Thr Val Ala Ala Ala Cys Ala Ala 40 220 225 230 tta gct gat gct gga ttg gga gaa ggc acá gtt aaa gtg tgc gtt cea 894 Leu Ala Asp Ala Gly Leu Gly Glu Gly Thr Val Lys Val Cys Val Pro 235 240 245 45 ggt gag gaa gta gaa gtc cag ate ttt gac gac ggc tcc acá etc acc 942 Gly Gly Glu Val Glu Val Gln He Phe Asp Asp Gly Ser Thr Leu Thr 250 255 260 50 ggc cea age gcc ate ate qca etc ggt gag gtg cag ate taagattege 991 Gly Pro Ser Ala He He Ala Leu Gly Glu Val Gln He 265 270 275 gattgtagtt cggcccaagt ttctgggccg ctttacgcgc atccagccac gtttcccgca 1051 ?c gctctagtgc gcgctcgtcc gttaetttga gaa 1084 <210> 2 60 <211> 277 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Val Asn Leu Thr He Pro Phe Ala Lys Gly His Ala Thr Glu Asn Asp 1 5 10 15 Phe He He He Pro Asp Glu Asp Ala Arg Leu Asp Leu Thr Pro Glu 20 25 30 Met Val Val Thr Leu Cys Asp Arg Arg Ala Gly He Gly Ala Asp Gly 35 40 45 He Leu Arg Val Val Lys Ala Ala Asp Val Glu Gly Ser Thr Val Asp 50 55 60 Pro Ser Leu Trp Phe Met Asp Tyr Arg Asn Ala Asp Gly Ser Leu Ala 65 70 75 80 Glu Met Cys Gly Asn Gly Val Arg Leu Phe Ala His Trp Leu Tyr Ser 85 90 95 Arg Gly Leu Val Asp Asn Thr Ser Phe Asp He Gly Thr Arg Ala Gly 100 105 110 Val Arg His Val Asp He Leu Gln Ala Asp Gln His Ser Ala Gln Val 115 120 125 Arg Val Asp Met Gly He Pro Asp Val Thr Gly Leu Ser Thr Cys Asp 130 135 140 He Asn Gly Gln Val Phe Ala Gly Leu Gly Val Asp Met Gly Asn Pro 145 150 155 160 His Leu Ala Cys Val Val Pro Gly Leu Ser Ala Ser Ala Leu Ala Asp 165 170 175 Met Glu Leu Arg Ala Pro Thr Phe Asp Gln Glu Phe Phe Pro His Gly 180 185 190 Val Asn Val Glu He Val Thr Glu Leu Glu Asp Asp Ala Val Ser Met 195 200 205 Arg Val Trp Glu Arg Gly Val Gly Glu Thr Arg Ser Cys Gly Thr Gly 210 215 220 Thr Val Ala Ala Ala Cys Ala Ala Leu Ala Asp Ala Gly Leu Gly Glu 225 230 235 240 Gly Thr Val Lys Val Cys Val Pro Gly Gly Glu Val Glu Val Gln He 245 250 255 Phe Asp Asp Gly Ser Thr Leu Thr Gly Pro Ser Ala He He Ala Leu 260 265 270 Gly Glu Val Gln He 275 Se anexan las siguientes Figuras: Figura 1: Mapa del plásmido pEC-XT99A. Figura 2: Mapa del plásmido pEC-XT99AdapF Las abreviaturas utilizadas en las figuras tienen los siguientes significados: Tet: Gen de resistencia para la tetraciclina dapF: Gen dapF de C. gl utamicum oriE: Origen de replicación codificado por el plásmido proveniente de E. coli rep: Origen de replicación codificado por el plásmido proveniente del plásmido pGAl de C. gl utamicum per: Gen para el control del número de copias provenientes de PGAl EcoRI: Sitio de escisión de la enzima de restricción EcoRI EcoRV: Sitio de escisión de la enzima de restricción EcoRV HincII: Sitio de escisión de la enzima de restricción HincII HindIII: Sitio de escisión de la enzima de restricción HindIII Kpnl: Sitio de escisión de la enzima de restricción Kpnl Salí: Sitio de escisión de la enzima de restricción Salí Smal: Sitio de escisión de la enzima de restricción Smal Sphl: Sitio de escisión de la enzima de restricción Sphl PvulI: Sitio de escisión de la enzima de restricción PvulI BamHl: Sitio de escisión de la enzima de restricción BamHl Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia polinucleotídica elegida del grupo que consiste de: a) el polinucleótido que es idéntico a un grado de al menos 70% a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2; b) el pol'inucleótido que es idéntico a un grado de al menos 70% a un polinucleótido que codifica para el polipéptido que es expresado por el gen dapF contenido en el vector pEC-XT99A-dapF en la cepa depositada de C. gl u tami cum DSM 12968; c) el polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un grado de al menos 70% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2; d) el polinucleótido que es complementario a los polinucleótidos de a), b) o c), y e) el polinucleótido que comprende al menos 15 bases sucesivas de la secuencia polinucleotídica de a) , b) , c) o d) .

2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es un ADN preferentemente recombinante que es capaz de replicarse en bacterias corineformes.

3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es un ARN.

4. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico como se muestra en la SEQ ID NO. 1.

5. El ADN de conformidad con la reivindicación 2, que es capaz de realizar la replicación, caracterizado porque comprende: i) la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO. 1, o ii) al menos una secuencia que corresponde a la . secuencia (i) dentro del intervalo de la degeneración del código genético, o iii) al menos una secuencia que se hibrida con la secuencia complementaria a la secuencia (i) o (ü) / iv) mutaciones en sentido de la función neutra en ( i ) .

6. La secuencia polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 2.

7. El vector que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, en particular el vector lanzadera pEC-XT99A-dapF caracterizado por el mapa de restricción mostrado en la Figura 2, depositado bajo la designación DSM 12968.

8. Una bacteria corineforme que sirve como la célula huésped, caracterizada porque contiene el vector de conformidad con la reivindicación 6.

9. Un proceso para la preparación de L-lisina mediante fermentación de bacterias corineformes, caracterizado el proceso porque se emplean bacterias en las cuales son amplificados, en particular sobre-expresados el gen dapF o las secuencias nucleotídicas que codifican para éste.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las bacterias en las cuales se emplean los genes adicionales de la ruta de la biosíntesis del L-aminoácido deseado, son adicionalmente amplificadas.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las bacterias en las cuales se emplean las rutas metabólicas que reducen la formación de L-lisina son al menos parcialmente eliminadas .

12. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque se emplea una cepa transformada con un vector plasmídico, y el vector plasmídico posee la secuencia nucleotídica que codifica para el gen dapF.

13. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque se emplean las bacterias transformadas con el vector plasmídico pEC-XT99A-dapF, depositado en Coryneba c teri um gl u tami cum bajo el número DSM 12968.

14. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque se utilizan bacterias corineformes que producen L-lisina .

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al mismo tiempo es sobre-expresado el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato-sintasa .

16. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al mismo tiempo se amplifica un fragmento de ADN que imparte resistencia a la S- (2-aminoetil ) -cisteína .

17. Un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina de conformidad con una o más de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se llevan a cabo los siguientes pasos: a) fermentación de la bacteria corinefor e productora de L-lisina en la cual se amplifica al menos el gen dapF; b) concentración de la L-lisina en el medio o en las células de la bacteria; y c) aislamiento de la L-lisina.