MXPA00008142A - Composicion y metodo para el tratamiento de cancer de vejiga - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la composición y método para el tratamiento de cáncer en la vejiga urinaria. Más particularmente, la presente invención se refiere a una composición que comprende un complejo de pared celular M. Phlei (MCC) -ácido desoxiribonucleico (M-ADN) Micobacterium phlei (M. Phlei), en donde el M-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular M.phlei, y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición MCC inhibe la proliferación e induce la apoptosis en las células cancerígenas que se encuentran en la vejiga urinaria del animal.

Description

COMPOSICIÓN Y MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER DE VEJIGA.

Campo del Invento. Esta aplicación es incorporada como referencia y reivindica el beneficio total de la solicitud Provisional Norteamericana 60/075, 1 1 1 , emitida el 18 de Febrero de 1998. La presente invención comprende un complejo de pared celular (BCC) ácido-desoxiribonucleico microbacteriano (B-ADN), en donde el B-ADN es conservado y hecho compuesto en la pared celular bacteriana para que el BCC sea efectivo en el tratamiento de cáncer de vejiga. Más particularmente, la presente invención comprende un complejo de pared celular (MCC) Microbacterium Phlei (M. Phlei)-ADN (M-ADN)-M. Phlei, en donde el M-ADN es conservado y hecho compuesto en la pared celular M . Phlei, para que el MCC sea efectivo en la inhibición de proliferación, e induzca a la apoptosis en células de cáncer de vejigas.

Antecedentes del Invento. El cáncer es una acumulación de redes aberrantes de células anormales, la cual resulta de un exceso de proliferación , o una insuficiencia de apoptosis, o una combinación de las dos. La apoptosis puede ser iniciada por ligandos que se enlazan a receptores en la superficie de la célula (Muzio y asociados Célula 85:817-827, 1996). Las mutaciones en estos receptores pueden causar una falla de apoptosis. La apoptosis también puede ser inducida por proteínas intracelulares incluyendo, pero sin limitarse a reguladores p53/p21 (Levine A. Célula 88:323-331 , 1997). La pérdida de p53/p21 funcional , se correlaciona con la agresividad de una variedad de cánceres (Fisher D. Célula 78:529-542, 1994). Los agentes quimioterapéuticos dependen principalmente, por su efecto terapéutico, de la inducción de apoptosis en células cancerígenas. La resistencia al medicamento, la cual disminuye la efectividad de los agentes quimioterapéuticos, conducen directa o indirectamente a reducir a una apoptosis reducida y está asociada generalmente con un pronóstico deficiente en una variedad de cánceres. El cáncer de la vejiga, es particularmente difícil de tratar con éxito (Lamm y asociados Journal of Urology 153: 1444-1450, 1995). Las preparaciones de origen bacteriano utilizadas para tratar el cáncer de vejiga, incluyen pero no se limitan a basillus Calmette-Guerin (BCG) (Pryor y asociados British Journal of Cáncer 71 :801 -807, 1995) y Regressin® (Bioniche, Inc. London, Ontario, Canadá), un extracto de pared celular microbacteriano (MCWE) formulado como una emulsión de aceite mineral (Patente Norteamericana No. 4,744;984; Chin y asociados Journal of Urology 156: 1 189-1 193, 1996).

BCG no induce apoptosis directamente (Sasaki y asociados Urology International 59: 142-148, 1997). En lugar de esto, BCG estimula las células del sistema inmune para producir moléculas bioactivas, tales como pero sin limitarse a, citoquinas y especies de oxígeno reactivo (Kudoh y asociados British Journal of Urology 80S2:40, 1997), los cuales posteriormente inducen a la apoptosis y citólisis. MCWE, el cual está compuesto principalmente de peptidoglicano y glicolípido, que contiene N-acetilmuramilo-L-alanil-D-isoglutamina y derivados de ácido micólico (Chin y asociados Journal of Urology 156: 1 189-1 193, 1996), está considerado para estimular el sistema inmune mediante la activación de reacciones mediadas por macrófago y monocito (Teware y asociados, Veterinary Parasitology 62:223-230, 1996). Los beneficios terapéuticos obtenidos utilizando BCG y MCWE, son variables e inconsistentes y parecen depender del método de preparación y del método de administración y de la variabilidad en inmunogenicidad y estabilidad de la preparación resultante. Además, el BCG vivo puede causar serios efectos colaterales incluyendo, pero sin limitarse a fiebre, síndrome similares a enfermedad de suero, infección granulomatosa, sepsis y aún la muerte (Lamm y asociados Journal of Urology 147:596-600, 1992). Otros agentes anti-cáncer de vejiga anteriores, también han probado ser menos que adecuados para aplicaciones clínicas. Muchos de estos agentes son ineficientes o tóxicos, tienen significativos efectos colaterales, dan como resultado el desarrollo de la resistencia a la droga o inmunosensibilización, y debilitan al receptor. Además, muchos de estos agentes dependen de los receptores de la superficie de ligando o p53/p21 para su efectividad.

Por lo tanto, existe una necesidad para un agente terapéutico nuevo que inhiba la proliferación e induzca la apoptosis en las células cancerígenas de la vejiga. Este agente terapéutico debe ser útil como un agente celular antl-cáncer de vejiga y como un agente adjunto a otros agentes celulares anti-cáncer de vejiga. Por agente adjunto se entiende un agente útil con otros agentes celulares anticáncer de vejiga para aumentar la efectividad del tratamiento. Además, dicho agente terapéutico debe ser simple y relativamente barato en su preparación, su actividad debe ser reproducible entre preparaciones, su actividad debe permanecer estable con el tiempo, y sus efectos en las células cancerígenas de la vejiga deben ser exitosos con regímenes de dosis que están asociados con una toxicidad mínima.

Sumario del Invento. La presente invención satisface las necesidades anteriores, proporcionando una composición y método que comprende un complejo de pared celular microbacteriana (BCC) - ácido desoxiribonucleico microbacteriano (B-ADN), en donde el B-ADN está conservado y se hace complejo en la pared celular bacteriana, para que el BCC sea efectivo en el tratamiento de células cancerígenas de la vejiga. Más particularmente, la presente invención satisface las necesidades anteriores, proporcionando un complejo de pared celular M . Phlei (MCC)-ADN-Microbacterium Phlei (M . Phlei) (M-ADN) en donde el M-ADN está conservado y se hace un complejo en la pared celular M. Phlei, para que el MCC sea efectivo en la inhibición de la proliferación y en inducir apoptosis en células cancerígenas de la vejiga. MCC es simple y relativamente barato en su preparación, su actividad es reproducir dentro preparaciones, permanece terapéuticamente estable con el tiempo, y es efectivo en regímenes de dosis que están asociados con una toxicidad mínima aún en la administración repetida. Para preparar MCC, M. Phlei son desarrolladas en un medio líquido y son cosechadas. Los M. Phlei son interrumpidos, y los componentes sólidos del M. Phlei interrumpidos, son recolectados mediante sedimentación centrifuga. Los componentes sólidos son desproteinizados, deslipidados, y lavados. Los reactivos libres de DNase son utilizados para minimizar la degradación de M-ADN durante la preparación. MCC, en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable, es administrado en un animal, incluyendo a un humano, en una dosis suficiente para evitar, tratar y eliminar células cancerígenas dentro de la vejiga. La capacidad inesperada y sorpresiva de MCC para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis en células cancerígenas de la vejiga incluyendo, pero sin limitarse a p52/21 anormal y células resistentes al medicamento dirigidas a una necesidad no satisfecha en las artes médicas y proporciona un beneficio importante.

MCC también es efectiva como un agente adjunto para mejorar la efectividad de otros agentes anti-cáncer. Estos incluyen pero sin limitarse a, medicamentos; inmunoestimulantes; antígenos; anticuerpos; vacunas; radiación; agentes quimioterapéuticos; agentes de ácido nucleico; agentes biológicamente construidos, agentes químicamente sintetizados; agentes que se enfocan a las moléculas que dan muerte a las células por activación o inactivación; agentes que inhiben la proliferación e inducen a apoptosis en células de respuesta. Por lo tanto es un objeto de la presente invención, proporcionar una composición y método efectivos para prevenir el cáncer de vejiga. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método efectivo para tratar cáncer de vejiga. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método efectivo para eliminar el cáncer de vejiga. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método efectivo para eliminar cáncer de vejiga. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método que inhibe la proliferación de células cancerígenas de la vejiga. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método que induzca la apoptosis en células cancerígenas de la vejiga.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método que estimule las células de respuesta del sistema inmune, dentro de la vejiga para producir moléculas bioactivas. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método que sea efectivo para inhibir angiogenesis en el cáncer de vejiga. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método que sea efectivo como un agente adjunto para otras terapias anti-cáncer de vejiga. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición de tamaño de partícula y formulación óptima para el reconocimiento por parte de las células de respuesta. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición de tamaño de partícula y formulación óptima para ser tomada por las células de respuesta. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que pueda ser preparada en grandes cantidades. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que permanezca estable con el tiempo. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que mantenga su efectividad con el tiempo. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que sea mínimamente tóxica para el receptor.

Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención, se apreciarán después de una revisión de la siguiente descripción detallada de la modalidad descrita y de las Reivindicaciones adjuntas.

Breve Descripción de las Figuras. Figura 1 . Inhibición de proliferación de HT-1376, HT-1 197, B-16 F1 , THP-1 , NATURAL 264.7, Jurkat, células cancerígenas HL-60 y HL-60 MX-1 mediante MCC. Los resultados son el significado de ± SD de 3 experimentos independientes. Figura 2. Inhibición de proliferación de HT-1376, HT-1 197, B-16F1 , THP-1 , NATURAL 264.7, Jurkat, células cancerígenas de vejiga HL-60 y HL-60MX-1 mediante M . Phlei-ADN (2A), MCC-ADN (2B), timo de becerro-ADN (2 A & 2B) y esperma de arenque-ADN (2A & 2B). Los resultados son el significado ± SD de 3 experimentos independientes. Figura 3. Inhibición de proliferación de células cancerígenas de vejiga de humano HT-1 197 (3A) y HT-1376 (3B) mediante MCC y LPS. Los resultados son el significado ± SD de 3 experimentos independientes. Figura 4. Inducción de fragmentación de ADN en células cancerígenas de vejiga de humano HT-1 197 (4A) y HT-1376 (4B) mediante MCC tratada por DNase y no tratada y mediante hlL-12.

Los resultados mostrados son para 1 de 3 experimentos, cada uno de los cuales proporciono resultados similares.

Figura 5. Liberación de NuMA de células cancerígenas de vejiga de humano HT-1 197 y HT-1376 con aumento de concentraciones de MCC. Los resultados son el significado de ± SD de 3 experimentos independientes. Figura 6. Liberación de NuMA de células cancerígenas de vejiga de humano HT-1 197 (6A) y HT-1376 (6B) con 1 µg/ml MCC o con 100 µg/ml MCC durante 48 horas. Los resultados son el significado de ± SD de 3 experimentos independientes. Figura 7. Liberación de NuMA de células cancerígenas de vejiga de humano HT-1376 con 1 µg/ml de MCC-ADN tratada por DNase I y no tratada y MCC. Los resultados son el significado de ± SD de 3 experimentos independientes. Figura 8. Porcentaje de Liberación de LDH a través de células cancerígenas de vejigas de humano HT-1 197 y HT-1376 como un indicador de citotoxicidad de MCC. Los resultados son el significado de ± SD de 3 experimentos independientes. Figura 9. Estabilidad de MCC durante 6 meses de almacenamiento.

Descripción Detallada del Invento. La presente invención comprende un complejo de pared celular bacteriana (BCC)- ácido desoxiribonucleico bacteriano (B-ADN), en donde el B-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular bacteriana, para que el complejo sea efectivo para prevenir, tratar y eliminar células cancerígenas en la vejiga urinaria de un animal, incluyendo un humano. Muchas especies bacterianas pueden utilizarse para practicar la presente invención incluyendo, pero sin limitarse a especies Coryneform, especies Corynebacterium, especies Rhodococcus, especies Eubacterium, especies Bordetella, especies Escherichia, especies Listeria, especies Nocardia y especies Mycobacterium. Preferentemente se utiliza una especie Mycobacterium incluyendo, pero sin limitarse a M. smegmatis, M. fortuitum, M. kansaasii, M . tuberculosis, M . bovis, M. vacciae, M. avium y M.Phlei. más preferentemente se utiliza M. Phlei de especie de Mycobacterium. Por lo tanto, la presente invención comprende más particularmente un complejo de pared celular M. Phlei (MCC)- ácido desoxiribonucleico, M. Phlei (M-ADN), en donde M-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular M . Phlei, para que MCC sea efectiva para evitar, tratar y eliminar células cancerígenas en la vejiga urinaria. En MCC, la cantidad de M-ADN es enriquecida en forma relativa a la cantidad de M-ADN que se encuentra en una célula M .Phlei intacta. Además, el M-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular M .Phlei para que sea más accesible para las células de respuesta, de lo que es M-ADN dentro de una célula M . Phlei intacta. Aunque no se desee que se enlacen mediante la hipótesis siguiente, se cree que M-ADN , en la forma de oligonucleotidos cortos, y su asociación física con la pared celular M. Phlei, ambas contribuirán a la expresión óptima de la actividad terapéutica de MCC. Los métodos para aumentar la actividad terapéutica de MCC incluyen, pero no se limitan a secuencias o confirmaciones de ADN de suplementación química o estimulación de amplificación biotecnológica, derivadas de las mismas o diferentes especies bacterianas y de elaborar complejos de M-ADN o MCC para transportadores naturales o sintéticos. Además, MCC puede ser administrada antes, al mismo tiempo o después de otro agente anti-cáncer de vejiga para aumentar la efectividad terapéutica. Las composiciones que comprenden MCC y su transportador farmacéuticamente aceptable, son preparadas mediante la conducción uniforme e íntima en la asociación de MCC con transportadores líquidos, con transportadores sólidos, o con ambos. Los transportadores líquidos incluyen, pero no se limitan a transportadores acuosos, transportadores no acuosos, o ambos. Los transportadores sólidos incluyen, pero no se limitan a transportadores biológicos, transportadores químicos y transportadores construidos biotecnológicamente. Entre sus transportadores farmacéuticamente aceptables, MCC puede ser suministrado en suspención acuosa, emulsión de aceite, agua en emulsión de aceite, emulsión de agua en aceite en agua, liposomas, micropartículas, emulsiones específicas de lugar, emulsiones de larga permanencia, emulsiones pegajosas, microemulsiones nanoemulsiones, microesferas, nanoesferas, nanopartículas, mlnibombas, y con varios polímeros naturales o sintéticos que permiten la liberación sostenida de MCC. Además, MCC puede ser utilizado con cualquiera con todos o con cualquier combinación de excipientes, sin consideración del transportador utilizado para presentar MCC a las células de respuesta. Estas se incluyen, pero no se limitan a anti-oxidantes, reguladores, y bacteriostatos, y pueden incluir agentes de suspención y agentes de espesor. Preferentemente, MCC es suministrado en una suspención acuosa. MCC está suspendida en un transportador farmacéuticamente aceptable tal como pero sin limitarse a agua libre de DNase, salina o salina regulada por fosfato (PBS) y es emulsificada por sonicación. De manera opcional, la mezcla amulsificada es homogeneizada por microfluidización. Por ejemplo, MCC utilizado es suspendido en agua libre de DNase y es sonicado en un rendimiento del 20% durante 5 minutos (Modelo W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc). La composición sonicada es homogeneizada por microfluidización a 15,000-30,000 psi para un paso de flujo (Modelo M-1 10Y; Microfluidics, Newton, MA). La mezcla es ya sea procesada ascépticamente o esterilizada terminálmente. Para administración en un transportador acuoso, MCC es emulsificado con un aceite mineral o con aceite neutral tal como pero sin limitarse a un diglicérido, trlgllcérido, un fosfolípido, o lípido, un aceite y mezcla de los mismos, en donde el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos poli no saturados poli insaturados y saturados. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a aceite de frijol soya, aceite de cañóla, aceite de palma, aceite de oliva y migliol , en donde el número de carbonos de ácido graso es de entre 12 y 22 y en donde los ácidos grasos pueden ser saturados o no saturados. De manera opcional, el lípido o fosfolípido cargado puede ser suspendido en el aceite neutral. Por ejemplo, el fosfatidilcolin libre de DNase es agregado a aceite de frijol soya triglicérido libre de DNase en una proporción de 1 gramo de fosfolípido para 20 ml de triglicérido y es disuelto por calentamiento ligero a una temperatura de 50°-60° C. Se agregan algunos gramos de MCC a un contenedor de autoclave seco y la solución de fosfolípido-triglicérido es agregada en una concentración de 20 ml por 1 gramo de MCC. La suspención es incubada durante 60 minutos a una temperatura de 20° C y posteriormente es mezclada con PBS libre de DNase en la proporción de 20 ml de suspención MCC por litro de PBS. La mezcla es emulsificada por sonicación a un rendimiento del 20% durante 5 minutos (Modelo W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.). De manera opcional, la mezcla MCC emulsificada es homogeneizada por microfluidización a 15,000-30,000 psi para un paso de flujo (Modelo M-1 10Y; Microfluidics). La emulsión MCC es transferida a una botella tapada de autoclave para su almacenamiento a una temperatura de 4°C. El tamaño de las partículas MCC debe ser óptimo para el reconocimiento y comprensión por parte de las células de respuesta. Preferentemente el diámetro promedio de las partículas MCC es de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 10,000 nm, más preferentemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 nm y lo más preferente entre aproximadamente 250 y aproximadamente 600 nm. El contenido M-ADN de MCC, preferentemente es de aproximadamente 0.001 y aproximadamente 90 mg/100 mg de MCC, más preferentemente entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 40 mg/100 mg de MCC, lo más preferente entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 30 mg/100 mg de MCC. También es preferente que el contenido de proteínas sea menor de aproximadamente 2 mg/100 mg de MCC, y que el contenido de ácido graso sea menor a aproximadamente 2 mg/100 mg de MCC. Inesperadamente, se encontró que por lo menos aproximadamente el 3.6% del peso seco de MCC es M-ADN extractable. MCC y/o M-ADN son administrados en una cantidad efectiva para inducir una respuesta terapéutica en células de respuesta de la vejiga. La dosis de MCC y/o M-ADN administrado, dependerá de la condición que se está tratando, de la formulación en particular y de otros factores clínicos tales como, peso y condición del receptor y vía de administración. Preferentemente, la cantidad de MCC y/o M-ADN administrada, es desde aproximadamente 0.00001 hasta aproximadamente 100 mg/kg por dosis, más preferente desde aproximadamente 0.0001 hasta aproximadamente 50 mg/kg por dosis, y lo más preferente desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 10 mg/kg por dosis.

Las vías de administración incluyen pero no se limitan a oral, intra-venosa, intra-lesión , intra-tumor, e intra-vejiga.

Preferentemente, MCC y/o M-ADN son administradas mediante instilación en la vejiga urinaria mediante pero sin limitarse a un catheter de tracto urinario. Otros métodos de instilación de MCC y/o M-ADN en la vejiga urinaria, son conocidos por los expertos en el arte. Dependiendo de la vía de administración, el volumen por dosis es preferentemente desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 100 ml, más preferentemente desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 70 ml, y lo más preferente desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 40 ml. MCC y/o M-ADN puede ser administrado en un tratamiento de dosis simple o en tratamiento de dosis múltiples o en un programa o durante un período de tiempo apropiado para el tratamiento de la enfermedad, la condición del receptor y la vía de administración. Cuando se administra a una vejiga urinaria, dependiendo del volumen administrado, la dosis debe permanecer en la vejiga preferentemente desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 8 horas, más preferentemente desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 4 horas, y lo más preferente desde aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 2 horas. Los siguientes ejemplos servirán para ilustrar en forma adicional la presente invención y al mismo tiempo sin embargo constituyendo cualquier limitación de la misma. Pero al contrario, quedará claramente comprendido que el recurso puede tener varias u otras modalidades, modificaciones y equivalentes de la misma las cuales, después de leer la descripción de la presente invención, pueden ser sugeridas por si mismas a aquellos expertos en el arte sin salirse del espíritu de la presente invención y/o del alcance de las Reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLO 1 Preparación de MCC a partir de Microbacterium Phlei y purificación de M-ADN a partir de MCC y a partir de M. Phlei. Se preparó MCC a partir de Microbacterium Phlei (M:Phlei) (deformación 1 10), el M-ADN fue purificado a partir de MCC (M-ADN) y M-ADN fue purificado a partir de M . Phlei (M . Phlei-ADN) tal como se describe en la solicitud número PCT/CA981 /00744. Todos los reactivos fueron seleccionados para mejorar la conservación del ADN. A menos que se manifieste de otra manera, MCC, MCC-ADN y M. Phlei-ADN fueron suspendidos nuevamente en agua libre de DNase o en un regulador libre de DNase farmacéuticamente aceptable y emulsificados por sonicación. MCC, MCC-ADN y M, Phlei-ADN no contuvieron endotoxinas tal como se determinó utilizando un equipo QCL-1000 kit de lisato amebocito Limulus (BioWhittaker, Walkersville, MD).

ELEMPLO 2 Preparación de complejo de pared celular bacterial-ADN-bacterial y de ADN bacterial a partir de otra especie bacteriana. Se prepararon el complejo de pared celular bacterial-ADN (BCC) y bacterial-ADN (B-ADN), a partir de M . smegmatis, M. fortuitous, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Cornybacterium parvum, M. kansaasii, M tuberculosis y M . bovis, tal como el ejemplo 1 .

EJEMPLO 3 Tratamiento de DNase Se digirieron MCC-ADN y MCC, conteniendo cada uno un µg de M-ADN , y Regressin® (Patente Norteamericana No. 4,744,984), con una unidad internacional (I U) de DNase I libre de RNase (Life Technologies) durante una hora a una temperatura de 25° C en 20mM Tris HCl , pH 8.4, 2 mM MgCI2 y 50 mM KCL. La DNase I fue desactivada por la adición de EDTA para una concentración final de 2.5mM y calentándola durante 10 minutos a una temperatura de 65° C.

EJ EMPLO 4 Células y reactivos Células cancerígenas de vejiga de humano HT-1 197 y HT-1376 ????? fueron obtenidas a partir de la Recolección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, Rockville, MD) y fueron cultivadas en MEM suplementado con amino ácidos y vitaminas no esenciales conteniendo 10% de FCS (MEM-FCS) (Gibco Life Science). Las Células HT-1 197 son 4 células de grado de carcinoma de vejiga de transición anaplástica, desarrolladas a partir de un macho humano. Las células HT-1 197 son sensibles a los agentes quimioterapéuticos tales como pero sin limitarse a doxorubicina. Las células HT-1376 son 3 células de grado de carcinoma de transición anaplástica, desarrolladas de una hembra humana. Las células HT-1376 son p53/p21 anormales y son resistentes a agentes quimioterapéuticos tales como, pero sin limitarse a cisplatina y mitomicina. Las células B-16F1 , THP-1 , NATURAL 264.7, Jurkat, #L-60 y HL-60MX-1 , fueron obtenidas a partir de ATCC y fueron cultivadas en el medio recomendado por el ATCC. A menos que se manifieste de otra manera, las células fueron sembradas en 6 placas de cultivo de tejido de pozo de fondo plano en concentraciones de células entre 3 X 105 y 106/ml y fueron mantenidas a una temperatura de 37° C en una atmósfera de C02 al 5%. Se obtuvieron timo de becerro-ADN, esperma de arenque-ADN y lipopolisacaridas de Escherichia coli (LPS) procedentes de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO). Se obtuvo I L-12 de humano recombinante (hlL-12), procedentes de R&D Systems (Minneapolis, MN).

EJEMPLO 5 Inhibición de proliferación de células.

La proliferación de células se determinó utilizando reducción de bromuro de difeniltetrazolina-dimetiltiasol (MTT) (Mosman y asociados, Journal of Inmunological Methods 65:55-63, 1983). Se incubaron durante 24 horas células HT-1376, HT-1 197, B- 16F1 , THP-1 , NATU RAL 264.7, Jurkat, HL-60 y HL-60MX-1 , con desde 0 hasta 10 µg/ml de MCC, M. Phlei-ADN, MCC-ADN , esperma de arenque-ADN y timo de becerro- ADN. MCC (Figura 1 ), M . Phlei-ADN (Figura 2A) y MCC-ADN (Figura 2B), inhibieron la proliferación en una dosis que depende de la forma de administración. El esperma de arenque-ADN (Figuras 2A & 2B) y el timo de becerro ADN (Figuras 2A & 2B), no inhibieron la proliferación . Las células HT-1 197 (Figura 3A) y HT-1376 (Figura 3B), también fueron incubadas durante 24 horas desde 0 hasta 100 µg/ml de MCC y LPS. MCC inhibió la proliferación en una dosis que depende de la forma de administración, en donde LPS no inhibe la proliferación (Figuras 3A & 3B). MCC y M-ADN inhiben la proliferación de HT-1 197 y de p53/p21 anormal, células cancerígenas de vejiga HT-1376 resistentes al medicamento. Además, la inhibición de proliferación de células no es común para todos los ADNs y (esperma de arenque-ADN y timo de becerro-ADN), y no resulta de la inmunoestimulación no específica (LPS). EJ EMPLO 6 Inducción de apoptosis tal como se indica mediante la fragmentación de ADN .

La fragmentación de ADN celular en fragmentos de tamaño de nucleosomas, es característica de células que pasan por apoptosis (Newell y asociados, Nature 357:286-289, 1990). Para evaluar la fragmentación de ADN, se recolectaron células no adherentes, mediante centrifugación en 200 gramos durante 10 minutos. Las bolitas de células no adherentes y las células adherentes restantes, fueron lisadas con 0.5 ml de regulador de lisamiento hipotónico (10 mM regulador Tris, 1 mM EDTA, 0.2% Tritón X-100, pH 7.5). Los lisatos fueron centrifugados en 13,000 gramos por 10 minutos y los flotantes, que contienen ADN fragmentado, fueron precipitados durante la noche a una temperatura de -20° C en isopropanol al 50% y 0.5 M NaCl. Los precipitados fueron recolectados mediante centrifugación y fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 0.7% durante 3 horas a 100V. Las células cancerígenas de la vejiga HT-1 197 y HT-1376, fueron incubadas durante 48 horas con µg/ml MCC o con un ng/ml hl L-12 (Figura 4). MCC indujo a fragmentación de ADN significativa en células HT-1 197 (Figura 4A, banda 2) y HT-1376 (Figura 4B, banda 2), pero no en células adherentes HT-1 197 (Figura 4A, banda 3) y HT-1376 (Figura 4B, banda 3). PBS (Figuras 4A & 4B, banda 5), hlL-12 (Figuras 4A & 4B, banda 4) y MCC tratado por DNase I (Figura 4A & 4B, banda 7), no inducen a fragmentación de ADN en células HT-1 197 o HT-1376 no adherentes. Las células no tratadas (Figuras 4A & 4B, banda 1 ) no mostraron fragmentación de ADN . Se utilizó un escalón ADN 123-bp (Gibco Life Science) para determinar el peso molecular de los fragmentos de ADN de tamaño de nucleosomas (Figuras 4A & 4B, banda L). MCC induce a apoptosis en células cancerígenas de vejiga HT-1 197 y HT-1376, en donde MCC tratado por DNase I no induce a apoptosis en estas células. Esto sugiere que la estructura de los oligonucleotidos intacta del M-ADN es necesaria para la inducción de apoptosis. hl L-12 no induce a apoptosis en células en HT-1 197 o en células HT-1376.

EJEMPLO 7 Inducción de apoptosis tal como se indica mediante solubilización del aparato nuclear de proteína mitótica (NuMA). Los cambios morfológicos sorprendentes en los núcleos de la célula originados por la solubilización y liberación de NuMA, son característicos de la apoptosis. La liberación de NuMA de células cultivadas se determinó en unidades/ml (U/ml), utilizando un ELISA comercial (Calbiochem, Cambridge, MA) (Miller y asociados Biotechniques 15: 1042-1047, 1993). Las células cancerígenas de vejiga HT-1 197 y HT-1376, incubadas durante 48 horas desde 0 a 100 µg/ml de MCC, liberó NuMA en una forma relacionada con la dosis (Figura 5). Las células HT-1 197 (Figura 6A) y HT-1376 (Figura 6B), incubadas con 1 µg/ml o con 100 µg/ml de MCC durante 48 horas, mostraron una liberación mejorada de NuMA durante 24 horas. Las células HT-1 197 incubadas durante 48 horas con MCC y con MCC-ADN, mostraron una liberación de NuMA significativamente mayor con MCC, que con MCC-ADN (Figura 7). El tratamiento DNase I de MCC y de MCC-ADN redujo significativamente la liberación de NuMA (Figura 7). La inducción MCC de apoptosis en células cancerígenas de vejiga HT-1 197 y HT-1376, son ambas dependientes de la dosis y del tiempo. Aunque no se desea que se enlace con las siguientes hipótesis, se cree que tanto la estructura de oligonucleotido de M-ADN y la presentación de M-ADN en la pared celular M. Phlei es importante para la inducción de apoptosis óptima.

EJEMPLO 8 Citotoxicidad MCC La citotoxicidad de la célula está caracterizada por la pérdida de la integridad de la membrana del plasma y liberación de encimas citoplásmicas tales como pero sin limitarse a LDH (Phillips y asociados, Vaccine 14:898-904). Para evaluar la citotoxicidad de MCC, las células cancerígenas de vejiga de humano HT-1 197 y HT-1376, fueron incubadas durante 48 horas desde 0 hasta 100 µg/ml de MCC o con regulador de lisamiento (10mM Tris, 1 mM EDTA, 0.2% Tritón X-100, pH 7.5) como un control para la liberación total de LDH (Filion y asociados Biochim Biophys Acta 1329:345-356, 1997). LDH fue determinado mediante un ensayo comercial (Sigma-Aldrich). El que MCC no fue citotóxico (Figura 8) demuestra que MCC actúa directamente en las células cancerígenas de vejiga HT-1 197 y HT-1376 para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis.

EJEMPLO 9 Tratamiento MCC y MCC-ADN de cáncer de vejiga de humano en ratones nu/nu El cáncer de vejiga de humano (HT-1 197), está establecido como un tumor sólido ectópico en los tejidos subcutáneos de ratones rasurados atímicos inmunodeficientes (ratones nu/nu) y los ratones son divididos en 5 grupos. El grupo 1 recibe un vehículo solo. El grupo 2 recibe MCC. El grupo 3 recibe MCC tratado por DNase I . El grupo 4 recibe MCC-ADN . El grupo 5 recibe MCC-ADN tratado por DNase I . La masa de cáncer es medida antes del tratamiento y en forma semanal durante 4 semanas de tratamiento. Los ratones del grupo 2 y los ratones del grupo 4, muestran regresión de la masa de cáncer. Los ratones del grupo 1 , 3 y 5, no muestran regresión de la masa de cáncer.

EJ EMPLO 10 Tratamiento MCC de cáncer de vejiga de humano. Diez pacientes con cáncer de vejiga ortópica de etapa 3, son divididos en 2 grupos. El grupo 1 recibe instilación intravesicular de MCC en forma semanal, durante 8 semanas. El grupo 2 recibe tratamiento de quimioterapia estándar. Los pacientes del grupo 1 muestran una regresión significativa del cáncer de vejiga y no reportan efectos colaterales de debilitamiento. Los pacientes del grupo 2 muestran una regresión mínima de cáncer de vejiga y reportan efectos laterales de debilitamientos significativos.

EJEMPLO 1 1 Estabilidad MCC Se almacenó MCC en 1 mg/ml, en la forma de una suspención estéril en 0.85% w/v NaCI en el oscuro a una temperatura de 4° C o durante 6 meses. El diámetro de partícula promedio fue calculado utilizando espectrocopía de correlación de fotón (N4 Plus, Coulter Electronics Inc.). La suspención MCC fue diluida con 0.85% w/v de NaCI para un rango de conteo de partícula de conteos entre 5 x 10(4) y 10(6)/sec. El diámetro de la partícula promedio se calculó en un procesador de distribución de tamaño (SDP) utilizando las siguientes condiciones: índice refractivo de fluido 1 .33, temperatura 208 C, viscosidad de 0.93 centipoise, ángulo de medida 90. O8, tiempo de la muestra 10.5 µs, y tiempo de corrida de la muestra 100 segundos. La potencia, la carga eléctrica en la ¡nterfase hidrodinámica entre las partículas y el solvente a granel, fue medido en un Delsa 440SX (Coulter Electronics Inc.) utilizando las siguientes condiciones: corriente 0.7 mA, rango de frecuencia 500 HZ, temperatura 208C, índice refractivo de fluido 1 .33, viscosidad 0.93 centipoise, constante dieléctrica 78.3, conductividad 16.7 ms/cm, en tiempo de 2.5 segundos, fuera de tiempo 0.5 segundos, y tiempo de corrida de la muestra 60 segundos.

Tal como se muestra en la Figura 9, la carga de MCC y el diámetro de MCC que permanecieron relativamente sin cambio durante 6 meses de almacenamiento. Además, la estimulación MCC de la producción IL-12 e inducción de apoptosis en monocitos THP-1 , permaneció sin cambio durante 6 meses de almacenamiento. Debe quedar claro por supuesto, que lo anterior se refiere únicamente a una modalidad preferida de la presente invención y que se pueden realizar numerosas modificaciones o alteraciones de la misma, sin salirse del espíritu y alcance de la presente invención, tal como se establece en las Reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

R E I V I N D I C A C I O N E S Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES:

1.- Una composición que comprende: a. Un ácido desoxiribonucleico microbacteriano (B-ADN); b. Una pared celular microbacteriana desproteinizada y delipidada, en donde B-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular microbacteriana (BCC); y, c. Un transportador farmacéuticamente aceptable, en donde la BCC es efectivo en inducir una respuesta en las células cancerígenas de la vejiga urinaria de un animal.

2.- La composición tal como se describe en la Reivindicación 1, caracterizada además porque el ADN microbacteriano es ADN M.Phlei (M-ADN).

3.- La composición tal como se describe en la Reivindicación 1, caracterizada además porque la pared celular microbacteriana, es pared celular M. Phlei.

4.- La composición tal como se describe en la Reivindicación 1 , caracterizada además porque la respuesta es seleccionada del grupo que consiste de inhibición de proliferación de células cancerígenas e inducción de apoptosis en las células cancerígenas.

5.- La composición tal como se describe en la Reivindicación 4, caracterizada además porque la respuesta es inhibición de proliferación de las células cancerígenas.

6.- La composición tal como se describe en la Reivindicación 4, caracterizada además porque la respuesta es inducción de apoptosis en las células cancerígenas.

/.- La composición tal como se describe en la Reivindicación 1 , caracterizado además porque el vehículo farmacéuticamente aceptable es seleccionado del grupo que consiste de un transportador acuoso y de un transportador no acuoso.

8.- Un método para inducir una respuesta en células cancerígenas en la vejiga urinaria de un animal , comprendiendo la administración al animal de una composición que comprende: a. Un ácido desoxiribonucleico micobacteriano (B-ADN); b. Una pared celular micobacteriana desproteinizada y delipidada, en donde B-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular micobacteriana C BCC; y, c. Un transportador farmacéuticamente aceptable, en una cantidad efectiva para inducir una respuesta en las células cancerígenas en la vejiga urinaria del animal, que tiene células cancerígenas en la vejiga urinaria.

9.- El método tal como se describe en la Reivindicación 8, caracterizado además porque B-ADN es M . Phlei-ADN (M-ADN).

10.- El método tal como se describe en la Reivindicación 8, caracterizado además porque la pared celular micobacteriana es pared celular M .Phlel.

1 1 .- El método tal como se describe en la Reivindicación 8, caracterizado además porque la respuesta es seleccionada del grupo que consiste de inhibición de proliferación de células cancerígenas e inducción de apoptosis en células cancerígenas.

12.- El método tal como se describe en la Reivindicación 1 1 , caracterizado además porque la respuesta es inhibición de proliferación de las células cancerígenas.

13.- El método tal como se describe en la Reivindicación 1 1 , caracterizado además porque la respuesta es Inducción de apoptosis en las células cancerígenas.

14.- El método tal como se describe en la Reivindicación 8, caracterizado además porque el* vehículo es farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste en un transportador acuoso y un transportador no acuoso.

15.- Una composición, que comprende: a. MCC, en donde M Phlei-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular M .Phlei ; y, b. Un transportador farmacéuticamente aceptable.

16.- Un método para tratar células cancerígenas en la vejiga urinaria de un animal, que tiene células cancerígenas en la vejiga urinaria, comprendiendo la administración a un animal que necesita de dicho tratamiento, una composición que comprende: a. MCC, en donde M . Phlei-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular M . Phlei y b. un transportador farmacéuticamente aceptable en una cantidad efectiva para tratar las células cancerígenas en la vejiga urinaria, del animal, que tiene células cancerígenas en la vejiga urinaria urinaria. R E S U M E N La presente invención está relacionada con la composición y método para el tratamiento de cáncer en la vejiga urinaria. Más particularmente, la presente invención se refiere a una composición que comprende un complejo de pared celular M. Phlei (MCC) -ácido desoxiribonucleico (M-ADN) Micobacterium phlei (M .phlei), en donde el M-ADN es conservado y se hace complejo en la pared celular M. phlei, y un transportador farmacéuticamente aceptable. La composición MCC inhibe la proliferación e induce la apoptosis en las células cancerígenas que se encuentran en la vejiga urinaria del animal.