MXPA00003916A - Polipeptidos modificados dependientes de vitamina k - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido de proteína C activado o una proteína C, caracterizado porque comprende un dominio de GLA modificado que aumenta la afinidad de unión a la membrana en relación a un polipéptido de proteína C activado o a una proteína C nativa, dicho dominio de GLA modificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 con por lo menos una substitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28ó33, en donde dicho polipéptido de proteínaC activado o proteína C es efectivo para disminuir la formación de coágulos en mamíferos.

Description

POLIPEPTIDOS MODIFICADOS DEPENDIENTES DE VITAMINA K Antecedentes de la invención Las proteínas dependientes de vitamina K contienen 9 a 13 residuos de ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) en sus residuos amino terminales 45. Los residuos Gla son producidos por enzimas en el hígado que utilizan vitamina K para carboxilar las cadenas laterales de los residuos de ácido glutámico en precursores de proteína. Las proteínas dependientes de vitamina K están involucradas en una variedad de procesos biológicos, de los cuales el mejor descrito es la coagulación sanguínea (revisada en Furie, B. y Furie, B.C., 1988, Cell, 53:505-518). Las proteínas dependientes de vitamina K incluyen proteína Z, proteína S, protrombina, factor X, factor IX, proteína C, factor XII y Gas6. La última proteína funciona en la regulación del crecimiento celular. Matsubara et al., 1996, Dev. Biol., 180:499-510. Los residuos Gla son necesarios para unión de calcio apropiada e interacción de membranas por estas proteínas. Se piensa que el sitio de contacto de membrana del factor X reside dentro de los residuos de aminoácidos 137. Evans y Nelsestuen, 1996, Protein Science 5: supl. 1, 163 Abs. Aunque las regiones conteniendo Gla de las proteínas de plasma muestran un alto grado de homología de secuencia, tienen al menos un rango de 1000 veces en afinidad de membrana. McDonald, J.F. et al., 1997, Biochemistrv.36:5120-5137. El factor Vil funciona en la etapa inicial de coagulación de sangre y puede ser un elemento clave en la formación de coágulos de sangre. El precursor inactivo, o cimógeno, tiene una baja actividad enzimática que aumenta enormemente mediante corte proteolítico para formar factor Vlla. Esta activación puede ser catalizada por el factor Xa, así como por el factor Vlla-tejido, una proteína de membrana integral encontrada en una variedad de tipos de células. Fiore, M.M., et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149. La activación por factor Vlla-tejido es referida como una autoactivación. Está implicado en ambos la activación (formación de factor Vlla de factor Vil) y la subsecuente actividad de factor Vlla. No se conoce la ruta más importante para la activación in vivo. El factor Vlla puede activar los factores IX y X de coagulación sanguínea. El factor de tejido es expresado en altos niveles en la superficie de algunas células de tumor. Es posible un papel para este factor de tejido, y para el factor Vlla, en desarrollo de tumor e invasión de tejidos. Vrana, J.A. et al., Cáncer Res., 56:5063-5070. La expresión celular y acción de factor de tejido también es un factor mayor en la respuesta tóxicoa para choque endotóxico. Dackiw, A. A. et al., 1996, Arch. Surq., 131:1273-1278.

La proteína C es activada por trombina en la presencia de trombomodulina, una proteína de membrana integral de células endoteliales. Esmon, N.L. et al., 1982, J. Biol. Chem.. 257:859-864. La proteína C activada (APC) degrada los factores Va y Villa en combinación con su cofactor, la proteína S. Resistencia a APC es la forma más común de enfermedad de trombosis hereditaria. Dahlback, B., 1995, Blood, 85-607-614. Los inhibidores de vitamina K son administrados comúnmente como una profilaxis para la enfermedad de trombosis. Las proteínas dependientes de vitamina K son usadas para tratar ciertos tipos de hemofilia. La hemofilia A es caracterizada por la ausencia de factor activo VIII, factor Villa, o la presencia de inhibidores para el factor VIII. La hemofilia B es caracterizada por la ausencia de factor IX activo, factor IXa. La deficiencia de factor Vil, aunque rara, responde bien a la administración de factor Vil. Bauer, K.A., 1996, Haemostasis, 26:155-158, supl. 1. La terapia de reemplazo de factor VIII está limitada debido al desarrollo de anticuerpos de factor VIII inhibitorios de alto título en algunos pacientes. De manera alternativa, el factor Vlla puede ser usado en el tratamiento de hemofilia A y B. El factor IXa y factor Villa activan el factor X. El factor Vlla elimina la necesidad de los factores IX y VIII al activar el factor X directamente, y puede superar los problemas de las deficiencias de factor IX y VIII con pocas consecuencias inmunológicas. Hedner et al., 1993, Transfus. Medí. Rev., 7:78-83; Nicolaisen, E.M. et al., 1996, Thromb. Haemost., 76:200-204. Los niveles efectivos de administración de factor Vlla frecuentemente son altos (45 a 90 µg/kg de peso corporal) y la administración necesita ser repetida cada pocas horas. Shumalv, S. et al., 1996, Thromb. Haemost..75:432-436. Se ha encontrado que una forma soluble de factor de tejido (factor de tejido soluble o sTF) que no contiene la región de contacto de membrana, es eficaz en el tratamiento de la hemofilia cuando es co-administrada con el factor Vlla. Patente estadounidense no. 5,504,064. En perros, se mostró que sTF reduce la cantidad de factor Vlla necesarios para tratar la hemofilia. La asociación de membrana por sTF-Vlla es completamente dependiente del sitio de contacto de membrana del factor Vil. Esto contrasta con complejo normal de tejido-factor Vlla, el cual se une a la membrana tanto a través de factor de tejido como Vll(a).

Breve descripción de la invención Se ha descubierto que modificaciones dentro del dominio de ácido ?-carboxiglutám ico (GLA) de poli péptidos depend ientes de vitamina K, intensifican sus afinidades de unión de membrana. Los polipéptidos dependientes de vitam ina K mod ificados en tal manera tienen una actividad intensificada y pueden usarse como anti-coagulantes, pro-coag ulantes o para otras funciones que utilizan proteínas dependientes de vitamina K. Por ejem plo, una molécula de factor Vi l mejorada puede porporcionar varios beneficios al disminuir la dosificación de Vl la necesaria, la frecuencia relativa de adm inistración y/o al proporcionar cam bios cualitativos q ue permiten un tratamiento más efectivo de estados de deficiencia. La invención caracteriza polipéptidos dependientes de vitamina K que incluyen un dominio de G LA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a u n pol ipéptido depend iente de vitam ina K natural correspondiente. El dom inio de GLA modificado es desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el am inoácido 45 e incluye al menos una substitución de amioácido. Por ejemplo, la substitución de aminoácido puede ser en el am inoácido 1 1 , 1 2, 29, 33 o 34. De preferencia , la su bstitución está en el aminoácido 1 1 , 33 o 34. El dom inio GLA modificado puede incluir una secuencia de aminoácidos, la cual, en el estado saturado de calcio, forma una estructura terciaria teniendo un núcleo catiónico con un halo de carga electronegativa .

El po péptido dependiente de vitamina K puede ser, por ejemplo, proteína C, proteína C activada, factor IX, factor IXa, factor Vil, factor Vlla o factor Vlla modificado de sitio activo El dominio GLA modificado de proteína C o proteína C activada puede incluir un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 34 (SEQ ID NO 19) El dominio Gla modificado de la proteína C o proteína C activada también puede incluir una glutamina o residuo de ácido glutámico en el aminoácido 11 (SEQ ID NO 20 y SEQ ID NO 21, respectivamente) De manera adicional, puede substituirse un residuo de glicina en el aminoácido 12 en el dominio de Gla de la proteína C o proteína C activada (SEQ ID NO 24 o SEQ ID NO 35) El dominio Gla modificado de factor Vil, factor Vlla, y factor Vlla modificado de sitio activo, puede contener una substitución en el aminoácido 11 y 33 Por ejemplo, puede substituirse un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO 30) La invención también caracteriza un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido dependiente de vitamina K Como se usa en la presente, el término aislado (purificado) se refiere a una secuencia correspondiente a parte o todo el gene que codifica un polipéptido dependiente de vitamina K, pero libre de secuencias que flanquean normalmente uno o ambos lados del gene en un genoma de mamífero El po péptido dependiente de vitamina K incluye un dominio GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dom in io Gla modificado incluye al menos una substitución de amoniácido. La invención también caracteriza una célula huésped de mam ífero que incluye un vector de ácido nucleico codificando un polipéptido depend iente de vitamina K. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de GLA modificado que intensifica la afin idad de unión de mem brana del polipéptido en relación a un pol ipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio de G LA modificado incluye al menos una substitución de aminoácido en , por ejemplo, el am inoácido 1 1 , 1 2, 29, 33 o 34. El polipéptido dependiente de vitamina K puede ser, por ejemplo, el factor Vi l o factor Vl l a e incluye una substitución de am inoácido en el aminoácido 1 1 y am inoácido 33. Por ejem plo, la substitución de aminoácido puede incluir un residuo de glutamina en el aminoácido 1 1 y un residuo de ácido glutámico en el am inoácido 33 (SEQ I D NO: 30) . La invención tam bién se refiere a una com posición farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de polipéptido dependiente de vitamina K efectivo para inhibir la formación de coágulos en un mam ífero. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de Gla mod ificado q ue intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un pol ipéptido dependiente de vitami na K natural correspondiente. El dominio de GLA modificado incluye al menos una substitución de aminoácido. El polipéptido dependiente de vitamina K puede ser, por ejem plo, proteína C, proteína C activada o factor Vl la modificado de sitio activo. La proteína C o proteína C activada pueden incluir, por ejemplo, un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 34 (SEQ ID NO:19). La proteína C o proteína C activada puede incluir además, una glutamina en el aminoácido 11 (SEQ ID NO:20) o un ácido glutámico en el aminoácido 11 (SEQ ID NO:21). La substitución de aminoácido también puede incluir una glicina en el aminoácido 12 (SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:35). El factor Vlla modificado de sitio activo puede incluir, por ejemplo, un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:33). La invención también caracteriza una composición farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectivo para incrementar la formación de coágulos en un mamífero. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de Gla modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio de Gla modificado incluye al menos una substitución de aminoácido. El polipéptido dependiente de vitamina K puede ser, por ejempio, el factor Vil, factor Vlla, factor IX o factor IXa. La composición farmacéutica también puede incluir factor de tejido soluble. El factor VII o Factor Vlla puede incluir una substitución de aminoácido en el aminoácido 11 y un aminoácido 33. Por ejemplo, un residuo de glutamina puede ser substituido en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico puede ser substituido en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:30).

También se describe un polipéptido dependiente de vitamina K para usarse para tratar un desorden de coagulación. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de Gla modificado, que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación con un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio de Gla modificado incluye al menos una substitución de aminácido. Polipéptidos modificados dependientes de vitamina K útiles incluyen, por ejemplo, proteína C, proteína C activada, factor Vil, factor Vlla, factor Vlla modificado de sitio activo, factor IX y factor IXa, como se describió antes. La invención también caracteriza el uso de un polipéptido dependiente de vitamina K en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un desorden de coagulación. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio de GLA modificado incluye al menos una substitución de aminoácido. Los polipéptidos modificados dependientes de vitamina K útiles incluyen, por ejemplo, proteína C, proteína C activada, factor Vil, factor Vlla, factor Vlla modificado de sitio activo, factor IX y factor IXa como se describió antes. También se describe un método para disminuir la formación de coágulos en un mamífero. El método incluye administrar una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectivo para disminuir la formación de coágulos en el mamífero. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio GLA modificado incluye al menos una substitución de aminoácido. El polipéptido dependiente de vitamina K puede ser, por ejemplo, proteína C, proteína C activada o factor Vlla modificado de sitio activo. La proteína C o proteína C activada pueden incluir un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 34 (SEQ ID NO:19). Puede substituirse adicionalmente una glutamina o ácido glutámico en la proteína C o proteína C activada (SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:21, respectivamente). Puede substituirse además una glicina en el aminoácido 12 (SEQ ID NO:24 o NO:35). El factor Vlla modificado de sitio activo puede incluir un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:30). La invención también caracteriza un método para incrementar la formación de coágulos en un mamífero. El método incluye administrar una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectivo para incrementar la formación de coágulos en el mamífero. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio de GLA modificado incluye al menos una substitución de aminoácido. El polipéptido dependiente de vitamina K puede ser, por ejemplo, factor Vil, factor Vlla, factor IX o factor IXa. El factor Vil o factor Vlla puede incluir un una substitución de aminoácido en el aminoácido 11 y en el aminoácido 33. Por ejemplo, la substitución de aminoácido puede incluir un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminácido 33 (SEQ ID NO:30). A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por alguien de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertence esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos en la presente para practicar la invención, se describen a continuación métodos y mteriales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente son incorporadas por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlarán. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos Las secuencias de aminoácidos del dominio de GLA de tipo natural Vlla y VIIQ11E33 se encontraron en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:33, respectivamente. Las secuencias de aminácidos del dominio de GLA de factor X bovino, proteína C bovina, proteína C humana y proteína bovina C-H11 se encontraron en SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:23, respectivamente. La secuencia de aminoácidos del dominio de GLA de proteína C VQ33E.N34D es encontrada en SEQ ID NO:19. La Figura 1 muestra la unión, con desviaciones estándares, de Vlla tipo natural (círculos vacíos), VIIQ11E33 (círculos rellenos) y factor X bovino (triángulos rellenos), a membranas. La Figura 2 muestra la autoactivación de VIIQ11E33. La línea punteada muestra actividad en la ausencia de fosfolípido. La Figura 3 muestra la activación de factor X por el factor Vlla. Los resultados para el factor Vlla de tipo natural (círculos vacíos) y VllaQ11E33 (círculos rellenos) están dados para una concentración de 0.06 nM. La Figura 4 muestra la coagulación de plasma humano por Vlla y VllaQ11E33 con factor de tejido soluble. La Figura 5 muestra la coagulación de plasma por cimógenos de factor Vil y factor de tejido normal. La Figura 6 muestra la inhibición de la formación de coágulos por factor modificado de sitio activo VllaQ11E33 (DEGR-VllaQ11 E33). La Figura 7 muestra el tiempo de circulación de factor VIIQ11E33 en ratas. La Figura 8 muestra la interacción de membrana por proteínas normales y modificadas. El panel A muestra la interacción de proteína C bovina tipo natural (círculos vacíos) y proteína C-H11 bovina (círculos rellenos) con vesículas. El panel B muestra la interacción de proteína C humana tipo natural (círculos vacío) y proteína C-P11 humana (círculos rellenos) con membranas. En ambos casos, la línea punteada indica el resultado de si toda la proteína adicionada se uniera a la membrana. La Figura 9 muestra la influencia de proteína c activada sobre los tiempos de coagulación. En el panel A, se muestran el promedio y desviación estándar para tres determinaciones de tiempos de coagulación para plasma bovino, para APC bovina tipo natural (círculos vacíos) y para bAPC-H11 (círculos rellenos). En el panel B, se muestran el promedio y desviación estándar de tres réplicas de coagulación de plasma humano para APC humana tipo natural (círculos vacíos) y APC-P11 humana (círculos rellenos). La Figura 10 muestra la inactivación de factor Va por APC bovina y humana. El panel A muestra la inactivación de factor Va por APC bovina tipo natural (círculos vacíos) y APC-H11 bovina (círculos rellenos). El panel B muestra la inactivación de factor Va humano en plasma deficiente de proteína S ya sea por APC humana tipo natural (círculos vacíos) y APC-H11 humana (círculos rellenos). La Figura 11 muestra la distribución electrostática de proteína Z. Las líneas verticales denotan regiones electropositivas y líneas horizontales denotan regiones electronegativas. La Figura 12 muestra la unión de membrana y actividad de varias proteínas Cs. El panel a muestra la unión de membrana por proteína C tipo natural (círculos vacíos), el mutante P11H de proteína c (cuadrados rellenos), el mutante Q33E,N34D (círculos rellenos) y protrombina bovina (cuadrados vacíos). El panel B muestra la inhibición de la coagulación sanguínea por estos mutantes. El panel C muestra la inactivación del factor Va. La Figura 13 compara la unión de membrana y actividad de mutantes de proteína C humana. El panel a compara la unión de membrana de tipo natural (círculos vacíos), E33 (triángulos vacíos) y E33D34 (círculos rellenos). El panel B compara los tiempos de coagulación usando tipo natural (triángulos vacíos), E33 (círculos vacíos) y E33D34 (círculos rellenos). La Figura 14 compara la unión de membrana (Panel A) y la inhibición de coagulación (Panel B) con tipo natural (cuadrados vacíos), H11 (círculos rellenos), E33D34 (triángulos vacíos) y el mutante H11E33D34 triple (círculos vacíos) de proteína C bovina. La Figura 15 muestra las propiedades de interacción de membrana de diferentes proteínas dependientes de vitamina K. El panel A compara la interacción de membrana de factor X humano (círculos rellenos) y bovino (círculos vacíos). El panel B muestra la interacción de membrana por fragmento 1 de protrombina bovina normal (círculos vacíos), fragmento 1 modificado con TNBS en la ausencia de calcio (círculos rellenos) y fragmento 1 modificado con TNBS en la presencia de 25 mM de calcio (cuadrados rellenos). El panel C muestra la proporción de unión de proteína Z a vesículas a pH 9 (círculos rellenos) y 7.5 (círculos vacíos).

Descripción detallada En un aspecto, la invención caracteriza un polipéptido dependiente de vitamina K que incluye un dominio de GLA modificado con afinidad de unión de mem brana intensificada en relación a un polipéptido dependiente de vitam ina K natural correspondiente. Los polipéptidos dependientes de vitami na K son un grupo de proteínas que util izan la vitami na K en su ruta biosi ntética para carboxi lar las cadenas laterales de residuos de ácido glutámico en precursores de proteína. El dominio de GLA contiene 9-1 3 residuos de ácido ?-carboxiglutámico en la región N-term inal del polipéptido, normalmente del aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 45. La proteína Z, proteína S, factor X, factor I I (protrombina) , factor IX, proteína C, factor Vi l y Gas6 son ejemplos de polipéptidos depend ientes de vitamina K. Las posiciones de am inoácidos de los polipéptidos discutidos en la presente son numeradas de acuerdo al factor IX. La proteína S, proteína C, factor X, factor Vi l y protrom bina humana tienen todos un am inoácido menos (posición 4) y deben ser aj ustados de acuerdo a esto. Por ejemplo, la posición real 1 0 de proteína C bovina es una prolina , pero es numerada en la presente como aminácido 1 1 para facilidad de comparación a todo lo largo. Como se usa en la presente, el término "polipéptido" es cualquier cadena de aminoácidos , con respecto a la long itud o mod ificación post-traslacional . En la presente se han designado am inoácidos mediante abreviaturas estándares de tres letras y una letra. Las modificaciones del dom in io de GLA incluyen al menos una substitución de am inoácido. Las substituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras. Las substituciones de am inácidos conservadoras reemplazan un am inoácido con un am inácido de la m isma clase, m ientras que las su bstituciones de aminácidos no conservadoras reemplazan un aminoácido con un am inoácido de una clase diferente. Las substituciones no conservadores pueden resultar en un cambio substancial en la hidrofobicidad del pol ipéptido o en el volumen de una cadena lateral resid ual . Además, las substituciones no conservadores pueden hacer un cambio substancial en la carga del polipéptido, tal como, reducir cargas electropositivas o introducir cargas electronegativas. Ejemplos de substituciones no conservadores incluyen u n am inoácido básico por un am inoácido no polar, o un am inoácido polar por un am inoácido ácido. La substitución de aminoácido puede ser en el aminoácido 1 1 , 12, 29, 33 o 34. De preferencia, la substitución de aminoácido es en el aminoácido 1 1 , 33 o 34. El dominio de GLA modificado puede incluir una secuencia de aminoácidos la cual, en el estado saturado de calcio, contribuye a la formación de una estructura terciaria teniendo un núcleo catiónico con un halo de carga electronegativa. Sin estar un ido a una teoría particular, la afinidad de membrana intensificada puede resultar de un patrón electrostático particular q ue consiste de un núcleo electropositivo completamente rodeado por una superficie electronegativa. Muchos polipéptidos dependientes de vitam ina K son substratos para enzimas unidas a membrana. Ya q ue ning ún polipéptido dependiente de vitamina K muestra la máxima afinidad de unión a membrana potencial de un domi nio de G LA, todos deben contener am inoácidos cuyo propósito sea reducir la afinidad de un ión. En consecuencia , m uchos polipéptidos depend ientes de vitam ina K contienen am inoácidos que no óptimos desde el punto de vista de afinidad máxima. Estos residuos rompen de manera efectiva el sitio de unión para proporcionar un cambio más rápido para una reacción enzimática. La afinidad de membrana disminuida puede servir a varios propósitos. La alta afinidad es acompañada por un intercambio lento, el cual puede limitar las velocidades de reacción. Por ejemplo, cuando la enzima protrombinasa es montada en membranas con alta afinidad de substrato, el intercambio de proteínas desde la membrana, en lugar de catálisis enzimática, es el limitante. Lu, Y. Y Nelsestuen, G.L., 1996, Biochemistry, 35:8201-8209. De manera alternativa, el ajuste de afinidad de membrana por substitución con aminoácidos no óptimos puede balancear los procesos en competencia de procoagulación (factor X, IX, Vil y protrombina) y anticoagulación (proteína C, S). Aunque las afinidades de membrana de proteínas naturales pueden ser óptimas para estados normales, la intensificación de afinidad de membrana puede producir proteínas que son útiles para el estudio in vitro así como terapéuticos mejorados para regular la coagulación sanguínea en condiciones patológicas in vivo. Se describen a continuación varios ejemplos de polipéptidos dependientes de vitamina K de dominio GLA modificado. El polipéptido dependiente de vitamina K puede ser proteína C o proteína C activada (APC). Las secuencias de aminoácidos del dominio de GLA de proteína C humana (hC) y bovina (bC), tipo natural, se muestran en la Tabla 1. X es un residuo de Gla o glu. En general, una proteína con residuos neutrales (por ejemplo, Q) o aniónicos (por ejemplo, D,E) en las posiciones 11, 33 y 34 tendrán mayor afinidad de membrana.

TABLA 1 hC: ANS-FLXXLRH11 SSLXRXCIXX21 ICDFXXAKXI31 FQNVDDTLAF4? WSKH (SEQ ID N0:1) bC: ANS-FLXXLRP11 GNVXRXCSXX21 VCXFXXARXI31 FQNTXDTMAF41 WSFY (SEQ ID N0:2) El dominio de GLA modificado de proteína C o APC puede incluir, por ejemplo, un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 34 (SEQ ID NO:19). El ácido glutámico en la posición 33 puede ser modificado adicionalmente a ácido ?-carboxiglutámico in vivo. Para actividad óptima, el dominio de GLA modificado puede incluir una substitución adicional en el aminoácido 11. Por ejemplo, puede substituirse un residuo de glutamina puede ser substituido en el aminoácido 11 (SEQ ID NO:20) o de manera alternativa, un ácido glutámico o un residuo de ácido aspártico (SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente). Un residuo de histidina puede ser substituido en el aminácido 11 en proteína C bovina (SEQ ID NO:23). Una modificación adicional puede incluir una substitución en el aminoácido 12 de un residuo de glicina por serina (SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:35). El reemplazo del aminoácido 29 por fenilalanina, el aminoácido encontrado en la protrombina, es otra modificación útil (SEQ ID NO:25). La proteína C modificada con afinidad de unión de membrana puede usarse en lugar de otros anticoagulantes inyectables, tales como, heparina. La heparina normalmente es usada en la mayoría de los tipos de cirugía, pero sufre de baja proporción eficacia/toxicidad. Además, la proteína C modificada con afinidad de membrana intensificada puede ser usada en lugar de anticoagulantes orales en la familia de coumarina, tales como warfarina. Estas modificadones también pueden hacerse con APC modificada de sitio activo. El sitio activo de APC puede ser inactivado químicamente, por ejemplo, por N-dansil-glutamil-glicilarginilclorometilcetona (DEGR) o por mutagénesis de sitio dirigido del sitio activo. Sorensen, B.B. et al., 1997, J. Biol. Chem.. 272:11863-11868. La APC modificada de sitio activo funciona como un inhibidor del complejo de protrombinasa. La afinidad de membrana intensificada de APC modificada de sitio activo puede resultar en un polipéptido terapéuticamente más efectivo. El polipéptido dependiente de vitamina K puede ser factor Vil o la forma activa del factor Vil, factor Vlla. El polipéptido de factor Vil natural o que ocurre de manera natural tiene baja afinidad por las membranas. Las secuencias de aminoácidos del dominio de GLA de factor Vil tipo natural humano (hVII) y bovino (bVII) se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2 hVII: ANA-FLXXLRPn GSLXRXCKXX21 QCSFXXARXI31 FKDAXRTKLF41 WISY (SEQ ID NO:3) bVII: ANG-FLXXLRP11 GSLXRXCRXX21 LCSFXXAHXI31 FRNXXRTRQF41 WVSY (SEQ ID NO:4) El dominio de GLA modificado de factor Vil o factor Vlla puede incluir, por ejemplo, un residuo de ácido glutámico o ácido aspártico en el aminoácido 11 (SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27, respectivamente), un residuo de fenilalanina en el aminoácido 29 (SEQ ID NO:28) o un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:29). De preferencia, el dominio de GLA de factor Vil o factor Vlla puede incluir un residuo de glutamina en el am inoácido 1 1 y u n residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ I D NO:30). El polipéptido dependiente de vitamina K mofidicado en esta manera tiene una mayor afinidad por membranas que el polipéptido natural o tipo natural . También tiene una actividad mucho mayor en la autoactivación , en la generación de factor Xa y en varios ensayos de coagulación de sangre. La actividad es particularmente intensificada en condiciones de coag ulación marg inales, tales como, bajos niveles de factor de tejido y/o fosfolípido. Por ejemplo, el factor Vi l modificado es aproximadamente 4 veces tan efectivo como Vl la natural en niveles óptimos de tromboplastina, pero es aproximadamente 20 veces tan efectivo en 1 % de niveles óptimos de trom boplastina . Las señales de procoagulación marginal son probablemente m uy predom inantes in vivo. Actualmente, los ensayos de coagulación disponibles q ue usan niveles óptimos de trom boplastina no pueden detectar las diferencias en tiempos de coagulación entre el plasma normal y aquél de pacientes hemofílicos. Las d iferencias de coagulación entre tales muestras solo son detectadas cuando los niveles no óptimos de tromboplastina o tromboplastina diluida son usados en ensayos de coagulación . Otro ejemplo de un polipéptido dependiente de vitamina K es un factor Vl la modificado de sitio activo. El sitio activo del factor Vl la puede ser modificado q uímicamente, por ejemplo, por DEGR o por mutagénesis de sitio dirigido del sitio activo. El factor Vi l modificado por DEGR es un inhibidor efectivo de la coag ulación por varias rutas de admi nistración . Arnljots, b. et al . , 1 997, J . Vasc. Surq . , 25: 341 -346. Las modificaciones del dominio de GLA pueden hacer más eficaz el factor Vl la modificado de sitio activo debido a una mayor afinidad de membrana. El dominio de GLA modificado de factor Vlla modificado de sitio activo puede incluir, por ejemplo, un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:30). El polipéptido dependiente de vitamina K también puede ser factor IX o la forma activa de factor IX, factor IXa. Como con el factor Vlla modificado de sitio activo, IXa y Xa modificados de sitio activo pueden ser inhibidores de coagulación. Las secuencias de aminoácidos del dominio de GLA de factor IX tipo natural humano (hlX) y bovino (blX) se muestran en la Tabla 3. Por ejemplo, un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico puede ser substituido en el aminoácido 11 (SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32, respectivamente), un residuo de fenilalanina en el aminoácido 29 (SEQ ID NO:33) o un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 34 (SEQ ID NO:34).

TABLA 3 hVII: YNSGKLXXFVQn GNLXRXCMXX21 KCSFXXARXV31 FXNXXRTTXF41 WKQY (SEQ ID NO:5) bVII: YNSGKLXXFVQ11 GNLXRXCMXX2? KCSFXXARXV31 FXNTXKRTTXF4? WKQY (SEQ ID NO:6) En otro aspecto, la invención caracteriza una célula huésped de mamífero que incluye un polipéptido dependiente de vitamina K teniendo un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio de GLA modificado incluye al menos una substitución de aminoácido como se discutió antes. La célula huésped de mamífero puede incluir, por ejemplo, factor Vil modificado o factor Vll a modificado. El dominio de GLA de factor Vi l modificado o Vl la de factor modificado puede contener una substitución de aminoácido en el am inoácido 1 1 y en el am inoácido 33. De preferencia, la substitución de aminácido incluye un residuo de glutamina en el am inoácido 1 1 y un residuo de ácido glutám ico en el am inoácido 33 (SEQ I D NO: 30) . Las célu las h uésped de mam ífero adecuadas son capaces de modificar residuos de glutamato de polipéptido dependiente de vitamina K a ?-caboxiglutamato. Las células de mam ífero derivadas de riñon e h ígado son especialmente útiles como células huésped . La invención también caracteriza una composición farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamene aceptable y una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectiva para inh ibir la formación de coág ulos en u n mamífero. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dominio de GLA modificado con al menos una substitución de aminoácido que intensifica la afinidad de unión de membrana del pol ipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitam ina K natural correspond iente. Polipéptidos modificados dependientes de vitamina K útiles de las composiciones farmacéuticas pueden incluir, sin limitación , proteína C o APC, APC modificada de sitio activo, factor Vl la modificado de sitio activo, factor IXa modificado de sitio activo y factor Xa modificado de sitio activo, como se discutió antes. La concentración de un polipéptido dependiente de vitam ina K efectiva para inhibir la formación de coágulos en un mam ífero puede variar, dependiendo de una variedad de factores, incluyendo la dosificación preferida del compuesto a ser adm inistrada, las características químicas de los compuestos empleados, la formulción de los excipientes del compuesto y la ruta de adm inistración . La dosificación óptima de una composición farmacéutica a ser administrada también puede depender de variables tales como el estado de salud general del paciente particular y la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser usadas para regular la coagulación in vivo. Por ejemplo, las com posiciones pueden ser usadas de manera general para el tratam iento de trom bosis. Alterar solo unos cuantos residuos de aminoácidos del polipéptido como se describió antes, generalmente no afecta de manera significativa la antigen icidad de los polipéptidos mutantes. Los polipéptidos dependientes de vitamina K q ue incl uyen dom inios de G LA modificados pueden ser form ulados en com posiciones farmacéuticas mediante mezcla con excipientes o portadores no tóxicos, farmacéuticamente aceptables. Tales compuestos y composiciones pueden ser preparados para adm inistración parenteral , particularmente en la forma de soluciones l íquidas o suspensiones en soluciones acuosas de amortiguadores fisiológicos; para adm inistración oral, particularmente en la forma de tabletas o cápsulas, o para administración intranasal, particularmente en la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Las com posiciones para otras rutas de admin istración pueden ser preparadas según se desee usando métodos estándares. Las formulaciones para la administración parenteral pueden contener como excipientes com unes, agua o solución sali na estériles , polialquilenglicoles, tales como polieti lenglicol , aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. En particular, polímero de láctido, copolímero de láctido/glicólido o copolímeros de polioxietileno-polioxi propileno biodegradables, biocom patibles, son ejemplos de excipientes para controlar la liberación de u n compuesto de la invención in vivo. Otros sistemas de entrega parenterales adecuados incluyen partículas de copol ímero de etileno-acetato de vin ilo, bom bas osmóticas, sistemas de i nfusión im planlables y liposomas. Las form ulaciones para admin istración por inhalación pueden contener excipientes tales como, lactosa, si se desea. Las formulaciones para inhalación pueden ser soluciones acuosas conteniendo, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril éter, glicocolato y deoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para la administración en la forma de gotas nasales. Si se desea, los compuestos pueden ser form ulados como geles a ser aplicados de manera intranasal. Formulaciones para adm in istración parenteral también pueden incluir glicocolato para admi nistración bucal . En una modalidad alternativa, la invención tam bién caracteriza una com posición farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectiva para incrementar la formación de coágulos en un mam ífero. El pol ipéptido dependiente de vitamina K incl uye un dominio de GLA modificado con al menos una substitución de am inoácido que intensifica la afinidad de unión de mem brana del pol ipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser útiles para el tratamiento de desórdenes de coagulación, tales como, hemofilia A, hemofilia B y enfermedad del hígado. En esta modalidad, polipéptidos dependientes de vitamina K útiles de las composiciones farmacéuticas pueden incluir, sin limitaciones, factor Vil o la forma activa del factor Vil, factor Vlla. El dominio de GLA modificado del factor Vil o factor Vlla puede incluir substituciones en el aminoácido 11 y el aminoácido 33, por ejemplo, un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:30). La composición farmacéutica puede comprender además factor de tejido soluble. El factor Vil es especialmente crítico para la coagulación sanguínea debido a su ubicación en la iniciación de la cascada de coagulación, y su capacidad para activar dos proteínas, los factores IX y X. La activación directa del factor X por el factor Vlla es importante para un posible tratamiento de las principales formas de hemofilia, tipos A y B, debido que los pasos que involucran los factores IX y VIII son evitados completamente. Se ha encontrado que la administración del factor Vil a pacientes es eficaz para el tratamiento de algunas formas de hemofilia. El mejoramiento de la afinidad de membrana del factor Vil o Vlla mediante modificación del dominio de GLA proporciona el potencial para hacer el polipéptido más responsivo a muchas condiciones de coagulación, para disminuir las dosificaciones de Vll/Vlla necesarias, para extender los intervalos en los cuales deben administrarse el factor Vll/Vlla y para proporcionar cambios cualitativos adicionales que resulten en tratamiento más efectivo. De manera global, el mejoramiento del sitio de contacto de membrana del factor Vil puede incrementar tanto su velocidad de activación como mejorar la actividad del factor Vl la sobre el factor X o IX. Estos pasos pueden tener un efecto multiplicativo en velocidades de coag ulación sangu ínea global in vivo, resultando en un factor Vl la muy potente para tratamiento superior de varios desórdenes de coagulación sanguínea. Otros polipéptidos dependientes de vitamina K útiles para incrementar la formación de coágulos incluyen el factor IX y el factor IXa.

En otro aspecto, se describen métodos para dismi nuir la formación de coágulos en un mam ífero. El método incluye adm in istrar una cantidad de polipéptido dependiente de vitam ina K efectiva para d ism inuir la formación de coágulos en el mam ífero. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dom inio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El dominio de GLA modificado incluye al menos una substitución de aminoácido. La proteína C o APC modificada, o los factores Vl la, IXa, Xa y APC bloq ueados de sitio activo, modificados, pueden ser usados para este método. En otro aspecto, la invención también caracteriza métodos para incrementar la formación de coágulos en un mam ífero q ue incluye administrar una cantidad de polipéptido dependiente de vitamina K efectiva para i ncrementar la formación de coág ulos en el mam ífero. El polipéptido dependiente de vitamina K incluye un dom inio de GLA mod ificado que intensifica la afinidad de unión de membrana del pol ipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente. El domin io de GLA modificado incl uye al menos una substitución de aminoácido. El factor Vil o Vlla modificado y factor IX o IXa modificado pueden ser usados en este método. La invención será descrita adicionalmente en los siguientes ejemplo, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos Ejemplo 1 - Factor Vil con actividad y afinidad de membrana intensificadas: Se ha encontrado que la afinidad de unión de membrana del factor Vil de coagulación sanguínea humano puede ser incrementada mediante mutagénesis de sitio dirigido. Se han caracterizado las propiedades de un mutante P11Q.K33E (referido en la presente como Factor VIIQ11E33 o factor Vil mutante (SEQ ID NO:30)). La afinidad de membrana fue incrementada sobre la proteína de tipo natural por aproximadamente 20 veces. Se incrementó la autoactivación por el mutante por al menos 100 veceso sobre aquélla del factor Vil de tipo natural. La forma activada de VIIQ11E33 (referida como VllaQ11E33) mostró aproximadamente 10 veces mayor actividad hacia el factor X. La actividad de coagulación de VllaQ11E33 con factor de tejido soluble en plasma normal fue aproximadamente 10 veces mayor que aquélla de Vlla tipo natural. La actividad de coagulación del cimógeno, VIIQ11E33, con factor de tejido normal (suministrado como una dilución 1:100 de tromboplastina-HS), fue 20 veces mayor que el factor Vil tipo natural. El grado al cual se intensificó la actividad fue dependiente de las condiciones, siendo especialmente activo VIIQ11E33 bajo condiciones de bajos estímulos de coagulación. En general, las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de Bradford usando albúmina de suero bovino como el estándar. Bradford, M.M., 1976, Analyt. Biochem. 248-254. Las concentraciones molares fueron obtenidas de los pesos moleculares de 50,000 para el factor Vil y 55,00 para el factor X. A menos que se indique, todas las mediciones de actividad fueron conducidas en el amortiguador estándar (Tris 0.05 M, pH 7.5, 100 mM NaCI). Producción de factor Vil mutante: Se generó factor Vil mutante a partir de cDNA de factor Vil tipo natural (GenBank acceso número M13232, NID g182799). Petersen et al., 1990, Biochemistrv 29:3451-3457. La mutación P11Q (cambio del aminoácido 11 de un residuo de prolina a un residuo de glutamina) y la mutación K33E (cambio de aminoácido 33 de un residuo de lisina a un residuo de ácido glutámico) fueron introducidas en el cDNA de factor Vil tipo natural mediante una estrategia de reacción en cadena de polimerasa, esencialmente como se describió por Vallette et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:723-733. Durante este proceso, se eliminó un sitio de enzima de restricción Xmalll diagnóstico de mutación. Se diseñaron cuatro iniciadores de PCR para iniciar la síntesis de dos fragmentos mutantes de M13232, uno de Mlu\ a Sg/ll, posiciones 221 a 301, y el otro de BglW a Ssrll, posiciones 302 a 787. Estos iniciadores fueron usados bajo condiciones de ciclización de PCR (GENEAMP, Perkin Elmer) para iniciar la síntesis de fragmento usando 1 ng del cDNA de factor Vil tipo natural como plantilla. Los fragmentos resultantes fueron purificados en gel y se digirieron con Mlu\ y BglW o BglW y SstW. Los dos fragmentos purificados fueron ligados entonces en el cDNA del factor VIII en el vector de expresión Zem219b del cual se había removido la secuencia tipo natural correspondiente como un fragmento M/¿vl-Ssfll. Petersen et al., 1990 supra. Los fragmentos con mutación fueron secuenciados en su totalidad para confirmar las substituciones P11Q y K33E, así como para eliminar la posibilidad de otros cambios de secuencia inducidos por PCR. Transfección, selección y purificación: Se hicieron crecer células de riñon de hámster bebé (BHK) en medio Eagles modificado de Dubeccos complementado con 10% de suero de ternera fetal y penicilina-estreptomicina. Se transfectaron células subconfluentes con el plásmido de expresión del factor Vil usando lipofectAMINE (Gibco BRL) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Dos días post-transfección, las células fueron tripsinizadas y se diluyeron a medio selectivo conteniendo 1 µM de metotrexato (MTX). Las células BHK establemente transfectadas fueron cultivadas subsecuentemente en medio Eagles modificado de Dubeccos libre de suero, complementado con penicilina-estreptomicina, 5 µg/ml de vitamina K, y 1 µM de MTX, y se recolectó medio acondicionado. El medio acondicionado fue aplicado dos veces a una columna de inmunoafinidad compuesta por un anticuerpo monoclonal dependiente de calcio (CaFVII22) acoplado a Affi-Gel 10. Nakagaki et al., 1991, Biochemistrv, 30:10819-10824. El Factor VIIQ11E33 purificado final corrió como una banda simple en la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, sin ninguna evidencia de factor Vlla en la preparación. El mutante VII(P11Q,K33E) puro mostró 1400-2800 unidades de factor Vll/mg. Activación de factor Vil: Se formó factor VllaQ11E33 activado mediante corte del factor Xa bovino de VIIQ11E33 (proporción en peso 1:100, incubación durante 1 h a 37°C). De manera alternativa, se obtuvo factor VllaQ11E33 por autoactivación (37°C, 20 min) en una mezcla conteniendo 7 µM de VIIQ11E33, 0.7 µM de sTF y fosfolípido (fosfatidilserina / fosfatidilcolina (PS/PC), 25/75, 0.1 g/g de proteína). El factor Vlla tipo natural fue una proteína recombinante homogénea (NOVO Nordisk). Dos preparaciones consistieron de un producto liofilizado comercial y producto no liofilizado. La última proteína fue purificada adicionalmente en FPLC mono-Q y mostró una actividad específica de 80,000 unidades/mg, calibrada con un estándar George King NPP. Interacción de membrana intensificada por factor VIIQ11E33: Se condujo la preparación de fosfolípido, ensayo y medición de la unión proteína-membrana mediante el método descrito por Nelsestuen y Lim, 1977, Biochemistry, 30:10819-10824. Se prepararon vesículas unilamelares grandes (LUVs) y vesículas unilamelares pequeñas (SUVs) mediante métodos descritos previamente. Hope, M.J. et al., Biochem. Biophvs. Acta. 812:55-65; Huang, C, 1969, Biochemistry, 8:344-352. Se mezclaron fosfatidilserina altamente pura (cerebro bovino) y fosfatidilcolina de huevo (Sigma Chemical Co.) en cloroformo. El solvente fue removido por una corriente de gas nitrógeno. Los fosfolípidos secos fueron suspendidos en amortiguador. Las SUVs fueron formadas mediante sonicación y filtración en gel , mientras que las LUVs fueron formadas mediante congelación-descongelación y extrusión . Se determinaron las concentraciones de fosfol ípido mediante ensayo de fosfato orgánico, asumiendo una proporción en peso de compuesto fosforoso:fosfol ípido de 25. Se prepararon SUVs ya sea de PS/PC (25/75) o PS/PC (10/90) . Se adicionó proteína a fosfol ípido en las proporciones en peso mostradas en la Fig ura 1 . Se valoró la unión de proteína-membrana mediante dispersión de luz a 90° mediante el método de Nelsestuen y Lim , 1 977 supra. Brevemente, se midieron la intensidad de dispersión de luz de las vesículas de fosfol ípido solas ( ) y después de la adición de proteína (l2) y se corrig ieron por soporte de amortig uador y proteína no unida. La proporción de peso molecular del com plejo proteína-ves ícula (M2) a esa de las vesículas solas (M 1 ), puede estimarse a partir de la relación en la ecuación 1 , donde dn/dc es el índice de refracción de la especie respectiva.

I2/I1 = (M2/M1)2 (dn/dCz/dn/dc 2 (eq . 1 ) Si se conocen las concentraciones de fosfol ípido y proteína, puede estimarse la concentración de [P*PLm ax] unida y proteína li bre [P]. Estos valores, junto con la capacidad de unión de proteína máxima [P*PLmax] de las vesículas (asumidas por ser 1 .0 g/g para todas las proteínas) pueden usarse para obtener la constante de eq uilibrio para la interacción proteína-membrana mediante la relación en la ecuación 2 , donde todas las concentraciones son expresadas como proteína molar o sitios de unión de proteína.

KD=[P][P*PLma?-P*PL]/[P*PL] (eq.2) Se valoró la unión a 5 mM de calcio y se expresa como la proporción, M2/M1. La Figura 1 muestra la unión de Vlla tipo natural (círculos vacíos) y factor VIIQ11E33 (círculos rellenos) a membranas de ya sea PS/PC=25/75, 25 µg/ml (Figura 1A) o PS/PC = 10/90, 25 µg/ml (Figura 1B). VIIQ11E33 tuvieron mucha mayor afinidad que la proteína de tipo natural. La unión a PS/PC (25/75) fue al nivel cuantitativo, de manera que [proteínan re] fue esencialmente cero. En consecuencia, los valores de Kd no pudieron ser estimados a partir de estos datos. La unión de membrana de factor X bovino (triángulos rellenos) se muestra en la Figura 1 como una referencia. El factor X bovino es una de las proteínas de más alta afinidad en esta familia, dando una Kd para PS/PC (20/80) a 2 mM de calcio de 40 nM. McDonald et al., 1997, Biochemistrv, 36:5120-5127. La Kd para factor bovino X, obtenida del resultado a una proporción de proteína/fosfolípido de 0.55 (Figura 1) fue 0.025 µM. También se determinó la unión de factor Vil tipo natural y mutante a membranas de PS/PC (10/90) (Figura 1B). El VIIQ11E33 se unió a menos del nivel cuantitativo, lo cual permitió estimar una constante de unión a partir de la relación en la ecuación 3.

Kd = [proteína?l re][sitio de unión?l re]/[proteínaun?da] (eq.3) Se estimaron los [sitios de unión?lbres] a partir de la ecuación 4, asumiendo una M2/M1 máxima de 1.0 (es decir, [sitios de unióntota?] = [fosfolípidoCOnc en Peso/proteínaMw]). Este es un valor común observado para varias proteínas de esta familia. Ver McDonald et al., 1997, supra. [sitios de unión bres] = [sitios de unióntotai]-[proteínaun?da] (eq.4) Usando estas suposiciones y los datos en una proporción de proteína a fosfolípido de 0.37, los valores de Kd fueron 0. µM para factor X bovino, 5.5 µM para factor Vil tipo natural y 0.23 µM para VIIQ11E33. De esta manera, fue claro que el factor VIIQ11E33 fue mejorado enormemente en la afinidad de unión de membrana sobre el factor Vil tipo natural y tuvo una de las afinidades de unión de membrana más altas entre las proteínas dependientes de vitamina K. Activación intensificada del factor VIIQ11E33: El primer paso en la coagulación involucra la activación del factor Vil. Se condujo la autoactivación de Vil en una solución conteniendo 100 nM de sTF (producto recombinante altamente purificado del Dr. Walter Kisiel, Fiore et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149), 36 nM de VIIQ11E33 y PS/PC (25/75, 22 µg/ml). Se estimó la actividad de VllaQ11E33 en varios intervalos de tiempo mediante la adición de 0.15 mm de substrato S-2288 (Kabi) y valorando la velocidad de liberación de producto de p-nitrofenilfosfato por cambio de absorbancia a 405 nm. La actividad inicial de la preparación de VIIQ11E33 fue menor que 4% aquélla de VllaQ11E33 completamente activo. Se encontró que VIIQ11E33 era un substrato mucho mejor para activación que el factor Vil tipo natural. La Figura 2 muestra la autoactivación del factor VIIQ11E33. Los datos fueron analizados por la relación en la ecuación 5 (ecuación 7 de Fiore et al., 1994, supra).

Ln[VII],=ln[Vlla]o + kcat*y*t (eq.5) ln[Vlla]t es la concentración de factor Vlla en el momento t, kcat es la constante de velocidad catalítica para el factor Vlla actuando sobre Vil y y es la saturación fraccional de sitios de Vlla. Para el factor Vlla tipo natural, esta relación y 1 µM de sTF dieron una kcat de 0.0045/s y una proporción de kcat/Km de 7*103 M'V . Ver, Fiore et al., 194, supra. Para la enzima VIIQ11E33, la autoactivación fue rápida (Figura 2) y solamente fue posible estimar un límite menor para kcat. Esto se obtuvo a partir de Vlla doblando el tiempo de aproximadamente 25 segundos (kcat=(ln2)/t1 2). El valor resultante (kcatmin=0.03/s), junto con la concentración de substrato de esta reacción (3.6*10"8 M) y la suposición de que y=1.0, dio un valor para kcat/[S]=8+105 M*V1. Esto debería estar muy por debajo de la kcat/Km real para VllaQ11E33, pero fue aproximadamente 100 veces mayor que el valor de kcat/Km para el factor Vlla tipo natural/sTF estimado por Fiore et al., 1994, supra. De esta manera, la combinación de la enzima VllaQ11E33 y substrato de factor VIIQ11E33 fue superior a las proteínas de tipo natural en el paso de activación de la coagulación. Esto sugiriió que VIIQ11E33 fue superior a la enzima tipo natural cuando las condiciones de coagulación fueron mínimas. Actividad intensificada de VllaQ11E33: Una vez generado, el factor Vlla activa ya sea el factor X o el factor IX. La activación de factor bovino X (0.1 µM) por factor Vlla fue realizada en 50 mM de amortiguador Tris HCl, pH 7.5, conteniendo 100 mM de NaCI, 5 mM de calcio, varias cantidades de fosfolípido (PS/PC, 25/75) y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino a 22.5°C. El factor Vlla (0.06 nM de VllaQ11E33 o 0.6 nM de Vlla tipo natural) se adicionó en el tiempo cero y se determinó la actividad de Xa en 1, 3 y 5 minutos. Se combinaron alícuotas de la mezcla de reacción (0.2 ml) con amortiguador (0.2 ml) conteniendo 10 mM de EDTA y 0.4 mM de S-2222 (Kabi), un substrato cromogénico para factor Xa. Se determinó el cambio en absorbancia a 405 nm en un espectrofotómetro Beckman DU8. Se calculó la cantidad de factor Xa generada a partir del coeficiente de extinción (1+104 M"1cm"1) del producto de reacción de p-nitrofenilfosfato y una velocidad de 33/s para hidrólisis de substrato mediante Xa bovino purificado bajo las condiciones de este ensayo. La Figura 3 compara la capacidad del factor Vlla tipo natural (círculos vacíos) y VllaQ11E33 (círculos rellenos) para activar el factor X en un sistema purificado. Nuevamente, VllaQ11E33 fue muy superior al factor Vlla tipo natural en esta reacción. La diferencia fue la mayor a concentraciones de fosfolípido bajas y disminuyó a 2 veces a 200 µg de fosfolípido por ml. Esto se esperaba a partir del hecho de que concentraciones de membrana altas provocan que se una una mayor porción de Vlla tipo natural a la membrana. Otra vez, la función incrementada de VllaQ11E33 fue la mayor bajo condiciones de baja exposición a fosfolípido. Coagulación superior de VllaQ11E33: Se condujeron los ensayos de coagulación sanguínea a 37°C usando el método de ladear con la mano para detectar la formación de coágulos. Se permitió que el plasma humano (0.1 ml) se equilibrara a 37°C durante 1 minuto. Se adicionaron varios reactivos en un volumen de 0.1 ml de amortiguador estándar. Se adicionaron factor de tejido soluble (50 nM) y fosfolípido (PS/PC, 10/90, 75 µg/ml) al plasma, junto con la concentración de factor Vlla mostrada en la Figura 4 (0.1 - 32 nM). Finalmente, se adicionó 0.1 ml de 25 mM de CaCI2 para iniciar la reacción. Se midió el tiempo para formar un coágulo. En la mayoría de los casos, se reportaron el promedio y desviaciones estándar de muestras de réplica. La Figura 4 muestra los tiempos de coagulación de Vlla tipo natural versus VllaQ11E33 en plasma humano normal. La coagulación fue soportada por sTF y vesículas de fosfolípido adicionadas. El factor Vil endógeno, tipo natural, es aproximadamente 10 nM en concentración y no tuvo virtualmente ningún impacto sobre los tiempos de coagulación. La coagulación de soporte fue 120 segundos, con o sin sTF. El factor VllaQ11E33 mostró aproximadamente 8 veces mayor actividad que el Vlla tipo natural bajo estas condiciones de ensayo. Se obtuvieron resultados similares con plasma deficiente en factor VIII, sugiriendo que la principal ruta para la coagulación sanguínea en este sistema involucró la activación directa de factor X por factor Vlla. De manera global, el factor VllaQI 1E33 fue superior al Vlla tipo natural en actividad procoagulante soportada mediante vesículas de membrana y factor de tejido soluble. El cimógeno tipo natural no tuvo virtualmente ninguna actividad bajo estas condiciones, como es indicado por tiempos de coagulación de soporte similares de 2 minutos, ya sea que se adicionara o no sTF. Actividad procoaqulante con factor de tejido normal: Se midió la actividad de Vlla y/o VIIQ11E33 con sTF en plamsa humano normal. El factor Vil endógeno pareció no tener ningún impacto en el tiempo de coagulación en este ensayo; el tiempo de coagulación de soporte fue 2 minutos para plasma con o sin factor de tejido soluble. El factor de tejido soluble (50 nM de concentración final) y Vlla fueron adicionados al plasma antes de la solución de calcio. El tiempo de coagulación fue valorado para muestras conteniendo varios niveles de Vlla o VllaQ11E33. Se probaron dos preparaciones de plasma humano, normal y deficiente de factor VIII. Se valoró la coagulación soportada por factor de tejido normal con tromboplastina-HS de cerebro de conejo estándar (HS=alta sensibilidad) conteniendo calcio (Sigma Chemical Co.). Esta mezcla contiene tanto fosfolípidos como factor de tejido unido a membrana. La tromboplastina-HS de cerebro de conejo fue diluida 1:100 en amortiguador y fue usada en el ensayo de Vil (adicionada en la forma de plasma humano normal, el cual contiene 10 nM de factor Vil) y VIIQ11E33 (adicionado como la proteína pura). Se midió la tromboplastina (0.2 ml) fue adicionada al plasma (0.1 ml) para iniciar la reacción y el tiempo requerido para formar un coágulo de sangre. También se condujeron ensayos con tromboplastina de fuerza completa, como se describieron por el fabricante.

A niveles óptimos de tromboplastina humana, Vil tipo natural mostró un nivel normal de actividad, aproximadamente 1500 unidades por mg. Esto es aproximadamente 25 veces menor que la actividad de factor Vlla tipo natural (80,000 unidades por mg). El VIIQ11E33 dio aproximadamente 1500-3000 unidades por mg bajo las condiciones estándares del ensayo, solo 2 veces más que el Vil tipo natural. La diferencia entre Vil tipo natural y VIIQ11E33 fue mucho mayor cuando las condiciones de coagulación fueron sub-óptimas. La Figura 5 muestra los tiempos de coagulación y concentraciones de cimógeno en ensayos que contenían 0.01 veces el nivel normal de tromboplastina. Bajo estas condiciones, VIIQ11E33 fue aproximadamente 20 veces más que el factor Vil tipo natural. De esta manera, la eficacia mayor del VIIQ11E33 mutante fue especialmene evidente cuando las condiciones de coagulación fueron limitadas, lo cual es relevante en muchas situaciones in vivo. Actividades anticoagulantes de DEGR-VllaQ11 E33: Se realizaron ensayos de coagulación estándar con suero humano normal y tromboplastina humana que fue diluida 1:10 con amortiguador. El sitio activo del factor VllaQ11E33 fue modificado por DEGR como se describió por Sorenson, B.B. et al., 1997, supra. La Figura 6 muestra el tiempo de coagulación de DEGR-VllaQ11 E33 (0-4 nm) incubado con tromboplastina, en amortiguador de calcio, durante 15 segundos antes de la adición del plasma. El tiempo para formar un coágulo se determinó con el método de ladeado con la mano. El tiempo de coagulación fue aproximadamente 45 segundos con aproximadamente 1 nm de DEGR-VllaQ11 E33.

Ejemplo 2 - Tiempo de circulación de factor VIIQ11E33 en la rata: Se inyectaron dos ratas Sprague Dawley (3325-350 g) anestesiadas (nembutol de sodio) con 36 µg de factor VIIQ11E33 en el tiempo cero. La inyección fue a través de la vena yugular, en la cual se había colocado una cánula. En los tiempos mostrados en la Figura 7, se retiró sangre de la arteria carótida, en la cual se había insertado una cánula mediante cirugía. La cantidad de factor VIIQ11E33 en la circulación fue estimada a partir del tiempo de coagulación de plasma deficiente en factor Vil humano, al cual se adicionó 1 µl de una dilución 1:10 del plasma de rata. Se usó una dilución 1:100 de tromboplastina-HS de cerebro de rata (Sigma Chemical Co.). La coagulación se valoró mediante el método de ladeado de tubo manual como se describió en el Ejemplo 1. La cantidad de actividad de factor Vil en el plasma antes de la inyección de VIIQ11E33 fue determinada y se sustrajo como un blanco. La concentración de factor VIIQ11E33 en la circulación está dada como log nM. Se condujo un experimento substituto en el cual un tercer animal recibió la operación y canulación pero sin factor VIIQ11E33. La cantidad de actividad de factor Vil en ese animal no cambió con el tiempo del experimento (100 minutos). Al final del experimento, los animales fueron sometidos a eutanasia mediante exceso de nembutol de sodio. Las ratas parecieron normales a lo largo del experimento sin ninguna evidencia de coagulación. Por lo tanto, el factor VIIQ11E33 no provocó coagulación indiscriminada, aún en la rata post-operativa. El tiempo de vida de circulación del VIIQ11E33 fue normal (Figura 7), siendo depurada aproximadamente 40% de la proteína en aproximadamente 60 minutos y aún una desaparición más lenta de la proteína restante. Esto fue similar para la velocidad de depuración de protrombina bovina de la rata. Nelsestuen y Suttie, 1971, Biochem. Biophys. Res. Commun., 45:198-203. Esto es superior a un factor Vlla recombinante tipo natural, lo cual dio un tiempo de circulación para ensayos funcionales de 20-45 minutos. Thomsen, M.K., et al., 1993, Thromb. Haemost., 70:458-464. Esto indicó que el factor VIIQ11E33 no fue reconocido como una proteína anormal y que no fue destruido rápidamente por actividad de coagulación. Apareció como una proteína normal y debería tener un tiempo de vida de circulación estándar en el animal.

Ejemplo 3 - Intensificación del sitio de membrana y actividad de proteína C: La proteína C bovina y humana muestra un alto grado de homología en los aminoácidos de sus dominios de GLA (44 residuos amino terminales), a pesar de aproximadamente 10 veces mayor afinidad de membrana de la proteína humana. La proteína C bovina contiene una prolina en la posición 11 versus una histidina en la posición 11 de la proteína C humana. Se examinó el impacto de reemplazar prolina-11 en la proteína C bovina con histidina, y el cambio inverso en la proteína C humana. En ambos casos, la proteína conteniendo prolina-11 mostró menor afinidad de membrana, aproximadamente 10 veces para proteína C bovina y 5 veces para proteína C humana. La proteína C humana activada (hAPC) conteniendo prolina en la posición 11 mostró 2.4 a 3.5 veces menor actividad que hAPC tipo natural, dependiendo del ensayo usado. APC bovina conteniendo histidina- 11 exhibió hasta 15 veces más actividad que bAPC tipo natural.

Esto demuestra la capacidad para mejorar tanto el contacto de membrana como la actividad por la mutación . Mutaqénesis de la proteína C: Un clon de cDNA de proteína C humana de longitud completa fue proporcionado por el Dr. Johan Stenflo (Dept. of Clinical Chem istry, U n iversity Hospital, Moalmó, Suecia) . El clon de cDNA de proteína C bovina fue proporcionado por el Dr. Donald Foster (ZymoGenetics, I nc. , USA) . El número de acceso GenBank para la secuencia de n ucleótidos de proteína C bovina es KO2435, N I D g 1 63486 y es K02059, N I D g 1 90322 para la secuencia de nucleótidos de la proteína C humana. Se realizó la mutagénesis de sitio dirigido mediante un método de PCR. Para. la m utagénesis de proteína C humana de histidina- 1 1 a prolina, se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos: A, 5'-AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT-3' (SEQ I D NO:7) (correspondiente a nucleótidos 860-895 en el vector pRc/CMV) para crear un sitio Hind l l l entre pRc/CMV y proteína C. B, 5' -GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG CTC CTC CAG GAA-3' (SEQ ID NO:8) (correspondiente a los residuos de aminoácidos 4-1 7 en la proteína C humana, el octavo residuo en esta secuencia fue sometido a m utación de aq uél para proteína C humana a aquél de proteína c bovina , como se indica mediante subrayado). Para la mutagénesis de proteína C bovina de prolina- 1 1 a histidina, se sintetizaron los siguientes ol igonucleótidos: A, (como se describió antes); C , 5' -ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA-3' (SEQ I D NO: 9) (correspondiente a los residuos de aminoácidos 4- 1 5 en proteína C bovina , el sexto residuo fue sometidio a mutación de aq uél para proteína C bovina a aquél de proteína C h umana, según se marca con el subrayado) ; D, 5'-TTC CTA GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT-3' (SEQ I D NO: 1 0) (correspondiente a residuos de aminoácidos 4-1 5 en la proteína C bovina, el séptimo am inoácido fue sometido a mutación de aquél para proteína C bovina a aquél de proteína C humana; los nucleótidos con mutación están subrayados); E, 5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3' (S EQ I D NO: 1 1 ) (correspondiente a nucleótidos 984-101 9 en el vector pRc/CMV), creando un sitio Xba\ entre pRC/CMV y proteína C) . Se clonaron ambos cDNAs de prote ína C humana y bovi na en los sitios Hind lll y Xba I del vector de expresión pRc/CMV. El cDNA de proteína C humana conteniendo el extremo 5' al am inoácido 1 7 fue amplificado por PCR con cDNA de proteína C humana intacto y los iniciadores A y B. El volumen para la reacción de PCR fue 1 00 µl y conten ía 0.25 µg de DNA de plantilla, 200 µM cada uno de los cuatro trifosfatos de desoxiribonucleótido, 0.5 mM de cada in iciador y 2.5 U de Pwo-DNA polimerasa (Boehringer Mannheim) en amortiguador Tris-HCl ( 1 0 mM Tris, 25 m M KCl, 5 m M (N H4)2SO4, y 2 m M MgSO4, pH 8.85) . Las muestras fueron sometidas a 30 ciclos de PCR consistiendo de un periodo de desnaturalización 2 minutos a 94°C, un periodo de templado de 2 minutos a 55°C, y un periodo de alargamiento de 2 m inutos a 72°C. después de la amplficiación , el DNA fue sometido a electroforesis a través de un gel de agarosa 0.8% en 40 m M de amortiguador de Tris-acetato conteniendo 1 mM de EDTA. Los productos de PCR fueron purificados con JET Plasmid Miniprep-Kit (Saveen Biotech AB, Suecia). El cDNA de proteína C humana conteniendo mutaciones respectivas fue cortado mediante Hind lll y Bsr Bl, y se clonó entonces en el vector pRc/CMV que fue cortado por Hind lll/Xba I y que contenía un fragmento de proteína C humana de Bsr Bl al extremo 3' para producir un cDNA de longitud completa, de proteína C humana, con la mutación. El cDNA de proteína C bovina, conteniendo el extremo 5' a través del aminoácido 11, fue amplificado por PCR con cDNA de proteína C humana intacto y los iniciadores A y C. El cDNA de proteína C bovina del aminoácido 11 al extremo 5' fue amplificado con cDNA de protéina c humana intacto y los iniciadores D y E. Estos dos fragmentos de cDNA se usaron como plantillas para amplificar el cDNA de proteína C bovina de longitud completa conteniendo aminoácido con mutación con los iniciadores A y E. Las condiciones de reacción de PCR fueron idénticas a aquéllas usadas para hPAPC. El cDNA de proteína C bovina conteniendo las mutaciones respectivas fue cortado por Hind lll y Bsu 361, y el fragmento Hind IHfBsu36l fue clonado en el vector pRc/CMV conteniendo fragmentos de proteína C bovina intacta desde Bsu 361 hasta el extremo 3' para producir cDNA de proteína C bovina de longitud completa conteniendo la mutación. Todas las mutaciones fueron confirmadas mediante secuenciación de DNA antes de la transfección. Cultivo celular y expresión: La línea celular de riñon humano transfectado con adenovirus 293 se hizo crecer en medio DMEM complementado con 10%?de suero de ternera fetal, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina y 10 µg/ml de vitamina Ki. La transfección se realizó usando el método de lipofectina. Felgner, P.L. et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417. Se diluyeron dos µg de DNA a 0.1 ml con DMEM conteniendo 2 mM de medio de L-glutamina. Se adicionaron diez µl de lipofectina (1 mg/ml) a 100 µl de DMEM conteniendo 2 mM de medio de L-glutamina. Se mezclaron el DNA y la lipofectina y se dejaron a temperatura ambiente durante 10-15 min. las monocapas celulares (25-50% de confluencia en cajas petri de 5 cm) se lavaron dos veces en DMEM con 2 mM de medio de L-glutamina. La mezcla de DNA/lípido se diluyó a 1.8 ml en DMEM conteniendo 2 mM de medio de L-gltuamina, se adicionaron a las células y se incubaron durante 16 horas. Las células fueron alimentadas con 2 ml de medio completo conteniendo 10% de suero de ternera, se dejó que se recuperaran por otras 48-72 horas y entonces se tripsinizaron y sembraron en placas de 10 cm con medio de selección (DMEM conteniendo 10% de suero y 400 µg/ml de Geneticin) a 1:5. Yan, S.C.B. et al., 1990, Bio/Technoloqy 655-661. Se obtuvieron colonias resistentes a Geneticin después de 3-5 semanas de selección. Se escogieron veinticuatro colonias de cada transfección de DNA, se hicieron crecer a confluencia y los medios se clasificaron por expresión de proteína C con un ensayo de dot-blot usando anticuerpo monoclonal HPC4 (para proteína C humana) y anticuerpo monoclonal BPC5 (para proteína C bovina). Se aislaron clones productores de altas cantidades de proteína y se hicieron crecer hasta confluencia en la presencia de 10 µg/ml de vitamina K^ La purificación de proteína C recombinante bovina y su mutante se basaron en el método descrito previamente con algunas modificaciones.

Rezair, A.R., y Esmon, C.T., 1992, J. Biol. Chem., 267:26104-26109. Se centrifugó medio libre de suero acondicionado de células transfectadas establemente a 5000 rpm a 4°C durante 10 minutos. El sobrenadante fue filtrado a través de 0.45 µm de membranas de nitrato de celulosa (Micro Filtration Systems, Japón). Se adicionaron EDTA (5 mM, concentración final) y PPACK (0.2 µM, concentración final) al medio acondicionado a partir de 293 células, entonces se pasaron a través de una columna de intercambio de aniones Pharmacia FFQ a temperatura ambiente usando Millipore Con Sep LC100 (Millipore, USA). La proteína fue levigada con un gradiente de CaCI2 (solución de inicio, 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI, pH 7.4; solución limitante, 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI/30 mM CaCI2, pH 7.4.). Después de la remoción del CaCI2 mediante diálisis y tratamiento de Chelex 100, la proteína fue reabsorbida a una segunda columna FFQ y entonces se levigó con un gradiente de NaCI (solución de inicio 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI, pH 7.4; solución limitante 20 mM Tris-HCI/500 mM NaCI, pH 7.4). En este punto en la purificación, la proteína C bovina recombinante mutante y la de tipo natural fueron homogéneas como fue determinado por SDS-PAGE. La primera columna usada para purificación de proteína C humana recombinante mutante y de tipo natural fue la misma que la descrita para proteína C bovina. El método cromatográfico descrito por Rezair y Esmon fue empleado con algunas modificaciones descritas para el método de purificación de proteína S. Rezair, A.R., y Esmon, C.T., 1992, supra; He, Z. et al., 1995, Eur. J. Biochem., 227:433-440. Las fracciones conteniendo proteína C de la cromatografía de intercambio de aniones fueron identificadas por dot-blot. Se depositaron y aplicaron fracciones positivas a una columna de afinidad conteniendo el anticuerpo HPC-4 dependiente de CaA La columna fue equilibrada con 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCI, pH 7.4, conteniendo 5 mM Benzamidina-HCI y 2 mM CaCI2. Después de la aplicación, la columna se lavó con el mismo amortiguador conteniendo Na Cl 1 M. La proteína C fue levigada entonces con 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCI y 5 mM EDTA, pH 7.4, conteniendo 5 M Benzamidina-HCI. Después de la purificación, se estimó la pureza de todas las preparaciones de proteína C recombinante humana y bovina mediante SDS-PAGE, seguido por manchado con plata. Las proteínas fueron dializadas contra amortiguador (50 mM Tris-HCl y 150 mM NaCI, pH 7.4) durante 12 horas y se almacenaron a 70°C. Las concentraciones de proteínas fueron medidas mediante absorbancia a 280 nm. Asociación de moléculas de proteína C normal y mutante con membranas: Se prepararon LUVs y SUVs mediante los métodos descritos en el Ejemplo 1. Se usó la dispersión de luz a 90° para la luz incidente para cuantificar la unión de proteína-membrana como se describió para el factor Vil (25 µg/ml y PS/PC, (25/75) a 5 mM de calcio (0.05 M amortiguador Tris-0.1M NaCI, pH 7.5). La proteína C bovina conteniendo histidina en la posición 11 interactuó con membranas con aproximadamene 10 veces más afinidad que la proteína de tipo natural. Cuando se ajusta a la ecuación 2, los datos dieron valores de KD de 930±80 nM para proteína C-H11 y 9200±950 nM para proteína C de tipo natural (Figura 8A). La diferencia en afinidad correspondió a aproximadamente 1.4 kcal/ml a 25°C. De hecho, la afinidad de membrana de proteína C bovina-H 1 1 fue casi idéntica a aquélla de proteína C humana natural (660 nM , Figura 8B) . Esto suirió que la prolina 1 1 formó una mayor base para diferencias entre el sitio de unión de membrana de proteínas humana y bovina. La substitución inversa, reemplazo de His-1 1 de proteína C humana por prolina, disminuyó la afinidad de membrana (Fig ura 8B) . Cuando se ajusta a la ecuación 2, estos datos dieron valores de KD de 660+90 nM para proteína C humana tipo natural y 3350±1 1 0 n M para proteína C humana-P 1 1 . El impacto de la introducción de prolina fue solo ligeramente menor que aq uél de prolina en las proteínas bovinas. I m pacto de prolina-1 1 en la actividad de proteína C activada: Se generó proteína C activada por corte de trombina, usando condiciones idénticas para am bas proteínas de tipo natural y mutante. Se mezclaron aproximadamente 1 50 µg de las diversas preparaciones de proteína C (1 mg/m l) con trombina bovina (3 µg) y se incu baron a 37°C durante 5 horas. El producto de reacción se diluyó a 0.025 M amortig uador Tris-0.05M NaCI y se aplicó a un ml de colum na de S P-Sephadex C-50. La colum na se lavó con un ml del m ismo amortiguador y el flujo de lado a lado fue depositado como proteína C activada. Se recuperó aproximadamente 65-80% de la proteína aplicada a la columna. Se determinó la actividad de APC por proteólisis de S2366 (0. 1 m M) a 25°C. Las preparaciones fueron comparadas con preparaciones estándares obtenidas en mayor escala. La APC humana estándar fue proporcionada por el Dr. Walter Kisiel. Para proteínas bovinas, el estándar fue una preparación a g ran escala de APC activada con trombina. La actividad de APC bovina fue consistente para todas las preparaciones de proteínas normal y mutante (±5%) . Se usaron dos preparaciones de APC bovina para comparaciones. La APC humana generada a partir de trom bina fue 55 a 60% tan activa como la estándar. Las concentraciones reportadas en este estudio se basaron en la actividad hacia S2366, en relación con aquélla del estándar. Una prueba APTT estándar usó plasma bovino o humano y reactivo APTT estándar (Sigma Chemical Co. ) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. De manera alternativa, se proporcionó fosfol ípido en la forma de vesículas formadas a partir de fosfolípidos altamente purificados. En este ensayo, se incubó plasma bovino (0. 1 m l) ya sea con caolín (0. 1 ml de 5 mg/ml en 0.05 M amortiguador Tris, 0.1 M NaCI , pH 7.5) o ácido elágico (0. 1 m M en amortiguador) durante 5 m inutos a 35°C. La coagulación se inició al adicionar 0. 1 ml de amortiguador conteniendo fosfol ípido y las cantidades de APC mostradas, seguidas por 0.1 ml de 25 mM cloruro de calcio. Todos los reactivos estaban en amortiguador estándar conteniendo 0.05 M amortiguador Tris, 0.1 M NaCI , pH 7.5. Fue necesario un promedio de una concentración 14 veces mayor de bAPC ti po natural para duplicar el impacto del mutante H 1 1 . El tiempo de coag ulación en bAPC-H 1 1 1 0 nM fue mayor que 1 20 minutos. Reactivo APTT estándar (Sigma Chemical C. ) dio u n tiempo de coagulación de aproximadamente 61 segundos a 35°C con este plasma. El tiem po requerido para formar un coágulo fue registrado mediante técn ica manual. La cantidad de fosfol ípido fue diseñada para ser el componente lim itante en el ensayo y para dar los tiempos de coagulación mostrados. Los fosfolípidos usados fueron SUVs (45 µg/0.4 ml en el ensayo final, PS/PC, 10/90) o LUVs (120 µg/0.4 ml en el ensayo final, PS/PC, 25/75). La actividad anticoagulante de proteína C activada fue probada en varios ensayos. La Figura 9 muestra el im pacto en el ensayo APTT, conducido con fosfolípido lim itante. Bajo las condiciones de este ensayo, los tiempos de coag ulación disminuyeron en una relación inversa , casi lineal con la concentración de fosfol ípido. Fue necesario aproximadamente 14 veces tanta APC bovina tipo natural para igualar el efecto de APC-H 1 1 bovina. Partes del estudio en la Figura 9 se repitieron para membranas de PS/PC (25/75, LUV) . Nuevamente, la actividad estaba limitada por fosfol ípido y su concentración fue ajustada para dar un tiem po de coagulación de control de 360 segundos ( 1 20 µg de 25% PS en el ensayo de 0.4 ml) . Aproximadamente 1 5 veces más de enzima tipo natural fue necesaria para igualar el impacto de mutante H 1 1 . Finalmente, se usó reactivo APTT estándar (Sigma Chem ical Co. , tiempo de coag u lación estándar 50+2 segundos) . Aproximadamene 1 0.0±0.7 nM de enzima tipo natural fue necesaria para doblar el tiempo de coagulación a 102±5 segundos. El mismo impacto fue producido por 2.2±0. 1 nM de APC-H 1 1 vobina. El fosfolípido no fue limitante de la velocidad en el ensayo estándar, de manera que puede esperarse un menor impacto en la afinidad de membrana . Los resultados para proteínas humanas se muestran en la Figura 8B. Aproximadamente 2.5 veces tanta APC humana conteniendo prolina-1 1 fue requerida para prolongar la coag ulación al g rado de APC tipo natural . Un menor impacto de la introducción de prolina-11 puede reflejar las diferencias más pequeñas en afinidad de membrana de las proteínas humanas (Figura 9B). Inactivación de factor Va: Se valoró la inactivación de factor Va mediante el método de Nicolaes et al., 1996, Trombosis and Haemostasis, 76:404-410. Brevemente, para proteínas bovinas, el plasma bovino fue diluido 1000 veces por 0.05 M Tris, 0.1 M NaCI, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y 5 mM de calcio a pH 7.5. Se adicionaron vesículas de fosfolípido (5 µg/0.24 ml de ensayo) y 5 µl de 190 nM trombina fueron adicionadaos a factor V activado. Después de una incubación de 10 minutos a 37°C, se adicionó APC y la incubación se continuó durante 6 minutos. Se adicionaron protrombina bovina (a 10 µM de concentración final) y factor Xa (0.3 nM de concentración final) y la reacción se incubó durante un minuto a 37°C. Se adicionó una muestra de 20 µl de esta reacción de activación a 0.38 ml de amortiguador (0.05 M Tris, 0.1 M NaCI, 5 mM EDTA, pH 7.5) conteniendo substrato S2288 (60 µM). La cantidad de trombina se determinó mediante el cambio en absorbancia en 405 nM (e=1.0*104 M"V\ kca, para trombina = 100/s). Para proteínas humanas, se diluyó 100 veces plasma deficiente en proteína S humana (Biopool Canadá, Inc.), el factor Va fue activado mediante trombina humana y el factor Va producido fue valorado con los reactivos usados para las proteínas bovinas. APC-H11 bovina fue 9.2 veces más activa que el tipo natural (Figura 10A) en factor inactivante Va. Como para la unión de membrana (anterior), el impacto de prolina-11 fue menor con las proteínas humanas, con un promedio de 2.4 veces la diferencia entre las curvas dibujadas para tipo natural y mutante P-1 1 (Figura 1 0B) . Se obtuvieron resultados similares con plasma humano normal .

Ejemplo 4 - Identificación de una afinidad de membrana de arquetipo para el sitio de contacto de membrana de proteínas dependientes de vitamina K: La comparación de varios mutantes de proteína C humana y bovina y otros pol ipéptidos dependientes de vitamina K condujerona un arq ueti po de sitio de contacto de membrana propuesto. El arq uetipo electrostático consiste de un núcleo electropositivo en una superficie de la proteína , creado por iones de calcio unidos, rodeados por un halo de carga electronegativa de aminoácidos de la proteína. Mientras más cerca esté un miembro de esta familia de proteínas a este patrón electrostático, mayor será su afin idad por las mem branas. Las vesículas de fosfol ípido, proteína C bovina tipo natural , estudios de interacción de proteína-membrana, activación y cuantificación de proteína C y análisis de actividad fueron como se describieron en el Ejemplo 3. La proteína C mutante, recombinante, fue generada mediante los sig uientes procedimientos. La mutagénesis de sitio dirig ido fue realizada mediane un método de PCR. Se sintetizaron los siguientes ol igonucleótidos: A, como se describió en el Ejemplo 3; F, 5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGC CCC TCT AGA -3' (SEQ I D NO: 1 1 ) (Correspondiente a los nucleótidos 984-101 9 en el vector pRc/CMV), creando un sitio Xba I entre pRc/CMV y proteína C ; G , 5' -GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC TTC GAA AAT CTC CCG AGC-3' (SEQ I D NO: 1 2) (correspondiente a los residuos de aminoácidos 40-27 en proteína C bovina , los aminoácidos 8 y 9 fueron sometidos a mutación de QN a ED como se marca con subrayado); H , 5' -CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3' (SEQ I D NO: 1 3) (correspondiente a los residuos de aminoácido 38-27 en la proteína humana, los aminoácidos 6 y 7 en esta secuencia fueron sometidos a mutación de QN a ED como se indica con el subrayado) ; I , 5' -GCC AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACÁ CTG-3' (SEQ I D NO: 14) (correspondiente a los residuos de am inoácidos 27-38 en la proteína C humana, los am inoácidos 6 y 7 en esta secuencia fueron sometidos a m utación de QN a ED como se indica con subrayado) ; J , 5' -CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3 (SEQ I D NO: 1 5) (correspondiente a los residuos de am ioácidos 38-27 en proteína C humana , el am inoácido 7 en esta secuencia fue sometido a mutación de Q a E como es indicado con subrayado) ; K, 5'-GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACÁ CTG-3' (SEQ I D NO: 1 6) (correspondiente a los residuos de aminoácidos 27-38 en la proteína C humana, el sexto am inoácido en eesta secuencia fue sometido a m utación de Q a E como es indicado con subrayado); Ambos cDNAs de longitud completa , de proteína C bovina y humana, se clonaron en el sitio Hind l l l y Xba I del vector pRc/CMV. Para obtener mutante de proteína C bovina E33D34, se realizó la am pl ificación de PCR del DNA objetivo como sigue. Se amplificó cDNA de proteína C bovina conteniendo el extremo 5' hasta el aminoácido en la posición 40 con cDNA de proteína C bovina intacta y los in iciadores A y C. Las condiciones de reacción de PCR fueron como se describió enel Ejemplo 3. La m uestra fue sometida a 30 ciclos de PCR consistiendo de un periodo de desnaturalización de 2 m in a 94°C, un periodo de templado de 2 min a 55°C y un periodo de alargamiento de 2 m in a 72°C . Después de la amplificación, el DNA fue sometido a electroforesis a través de un 0.8% en gel de agarosa en 40 m M amrotiguador de Tris-acetato conteniendo 1 mM EDTA. Los productos de PCR fueron purificados con el conjunto Geneclean l l l (Bio 1 01 , I nc. USA) y el fragmento de PCR de cDNA de proteína C bovina conteniendo las respectivas mutaciones fue cortado por Hind l l l y Bbs I . El fragmento Hind l l l/Bbs I y ei fragmento de proteína C humana (Bbs I - extremo 3') fueron clonados en los sitios H ind I I y Xba I del vector pRc/CMV para producir un cDNA de proteína C bovina de longitud completa con las mutaciones. El mutante de proteína C bovina H 1 1 E33 D34 fue creado en la misma manera , pero se usó mutante de proteína C bovino H 1 1 como una plantilla en la reacción de PCR. El cDNA de proteína C humana conteniendo el extremo 5' hasta el aminoácido 38 fue am plificado por PC R con cDNA de prote ína C humana intacta y los iniciadores A y D. El cDNA de proteína C humana del aminoácido 27 al extremo 3' fue amplificado con el cDNA de proteína C humana intacta y los in iciadores B y E. Estos dos fragmentos de cDNA fueron usados como plantillas para amplificar cDNA de proteína C bovina de longitud completa conteniendo los aminoácidos con m utación (E33 D34) con los iniciadores A y B. El mutante de proteína C humana E33 fue obtenido mediante los sig uientes pasos: cDNA de proteína C humana conten iendo el extremo 5' a am inácido 38 se amplificó con cDNA de proteína C humana intacta y los iniciadores A y F. El cDNA de proteína C humana del aminoácido 27 al extremo 3' fue amplificada con cDNA de prote ína C bovina de longitud completa conteniendo ami noácidos con mutación (E33) con los iniciadores A y B. La mezcla de PCR y programa fueron descritos antes. Los productos de PCR de prote ína C humana conten iendo mutaciones respectivas fueron cortados por Hi nd l l l y Sal I , y entonces el fragmento (Hind l l l - Sal I) junto con el fragmento de proteína C humana intacta (Sal I - extremo 3') fueron clonados en los sitios Hind ll l y Xba I del vector pRc/CMV para producir el cDNA de proteína C humana de longitud com pleta con las mutaciones respectivas. Todas las mutaciones fueron confirmadas por secuenciación de DNA antes de la transfección . Se cu ltivó y transfectó la l ínea de células de riñon h umano transfectadas con adenovirus como se describió en el Ejem plo 3. La proteína C recombinante bovina y humana y mutantes fueron purificados como se describió en el Ejemplo 3. Las proteínas dependientes de vitam ina K fueron clasificadas en cuatro grupos con base en sus afinidades por una membrana estándar (Tabla 4) . Secuencias de los residuos amino terminales de algunas proteínas relevantes incluyendo proteína C humana (hC) , proteína C bovina (bC) , protrom bina bovina (bPT) , factor X bovino (bX) y factor Vi l humano (hVI I) están dadas por referencia , donde X es Gla (ácido ?-carboxiglutám ico) o Glu . bPT: ANKGF XXVRK11GN XRXCLXX21PCSRXXAFXA31l-XSLSATDAF4lWAKY (SEQ ID NO: 17) bX ANS-F XXVKQuGNLXRXCLXXjjACSLXXARXVj, FXDAXQTDXF41WSKY (SEQ ID NO: 18) hC ANS-FLXXLRHjjSS XRXCIXXjjICDFXXAKX jjFQNVDDTLAF^WSKH (SEQ ID NO:l) bC ANS-F XX RPuGNVXRXCSXX^VCXFXXARXI^FQNTXDTMAF^WSFY (SEQ ID NO:2) hVTI: ANA-FLXXLRPuGS XRXCKXXjiQCSFXXARXIjjFKDAXRTK F^ ISY (SEQ ID NO:3) TABLA 4 Cargas y afinidad 3 Valor de afinidad mayor igual a kdlsoC?ac?ón/1*107 M"V; el denominador es una kdlsoc?ac?ón normal para otras proteínas.

En la Tabla 4, los mutantes de polipéptidos dependientes de vitamina K están en negritas. La carga total (residuos 1-34) incluye 7 iones de calcio ( + 14) y el extremo amino ( + 1). La proteína Z fue asignada a la clase I en la base de su constante de velocidad de disociación, la cual fue 100 a 1000 veces menor que aquélla de otras proeínas. Si la proteína Z exhibió una constante de velocidad de asociación normal (aproximadamente 107 M"1s"1), la KD sería aproximadamente 10"10 M M. Wei, G.J. et al., 1982, Biochemistry, 21:1949-1959. La última afinidad puede ser la máxima posible para las proteínas de vitamina K. Las proteínas de clase VI difirieron de la clase lll en la presencia de prolina-11, lo cual puede alterar la afinidad por medios no electrostáticos. Aunque existió una correlación relativamente débil entre la afinidad de membrana y la carga negativa neta en los residuos 1-34, se encontró una excelente correlación cuando solo se consideraron los residuos 5, 11, 29, 33 y 34 (Tabla 4). Los últimos aminoácidos están ubicados en la superficie de la proteína. Se modelaron una variedad de proteínas mediante substitución de aminoácidos en la estructura de protrombina y sus potenciales electrostáticos fueron estimados mediante el programa DelPhi. Un bosquejo de patrón después del potencial electrostático de proteína Z bovina se muestra en la Figura 11. Los sitios electronegativos en 7, 8, 26, 30, 33, 34 y 11 producen un halo de carga electronegativa que rodea un núcleo catiónico producido por el poro revestido de calcio (Figura 1 1 ). Mientras más cercana esté la estructura de proteína a esta estructura, mayor será su afinidad por la membrana . Esta correlación es evidente a partir de las proteínas de tipo natural , los mutantes y proteínas modificadas químicamente. El patrón para otras estructuras puede ser extrapolado de la exami nación de los grupos de carga que están ausentes en otras proteínas. Por ejemplo, Lys-1 1 y Arg-1 0 de protrombina bovina generan altas regiones electropositivas en su cercanía; la carencia de Gla-33 en la proteína C y factor Vi l crea menos electronegatividad en aq uellas regiones de proteína . En todos los casos, la afinidad más alta correspondió a una estructura con un núcleo electropositivo que fue rodeado completamente por la superficie de proteína electronegativa, como se m uestra por la proteína Z. Las excepciones a este patrón son las proteínas con Pro-1 1 , la cual puede disminuir la afinidad por un impacto estructural y ser-1 2 (prote ína C humana), la cual es un residuo no cargado único. Para probar adicionalmente la hipótesis de un arquetipo para distribución electrostática , se usó mutagénesis de sitio d irigido para reem plazar Gln33Asn34 de proteína C bovina y humana con Glu33Asp34 (SEQ I D NO: 1 9). Glu33 debería ser modificado adicionalmente a Gla durante procesamiento de proteína. Estos cambios alteraron el potencial electrostático de la proteína C bovina a aq uél el factor X bovino. Se esperó que la afinidad de membrana de la proteína mutante fuera menor que aq uélla del factor X debido a la presencia de prolina- 1 1 . En realidad, el m utante de proteína C bovino proporcionó una afinidad de membrana similar a aquélla de la protrombina bovina (Figura 12A) y ligeramente menor que aquélla del factor X bovino (Tabla 4). Fue más interesante que la inhibición de coágulo por APC fue mayor para el mutante que para la enzima de tipo natural (Figura 12B, C). La inclusión de resultados para el mutante P11H de proteína C bovina del Ejemplo 3 mostró que una familia de proteínas podría ser producida, cada una con diferente afinidad de membrana y actividad, al variar las substituciones de aminoácidos en las posiciones 11, 33 y 34. Los mutantes de proteína C humana conteniendo E33 y E33D34 resultó en un pequeño incremento en la afinidad de unión de membrana (Figura 13a). La actividad de estos mutantes fue ligeramente menor que la enzima de tipo natural (Figura 13b). Los resultados con mutantes de proteína C bovina sugieren que la falla de la mutación E33D34 en la proteína humana puede surgir de H11 y/u otros aminoácidos únicos en la proteína. La Figura 14A muestra que el mutante H11 de la proteína C bovina se unió a la membrana con aproximadamente 10 veces mayor afinidad que la proteína tipo natural, el mutante E33D34 se unió con aproximadamente 70 veces la afinidad, pero aquélla del mutante triple, H11E33D34, fue solo ligeramente mejor que el mutante H 11. Esta relación fue reflejada en la actividad de APC formada a partir de estos mutantes (Figura 14B). Este resultado sugirió que la presencia de H11 redujo el impacto de E33D34 en la afinidad de unión de membrana. Estos resultados indicaron que la introducción de E33D34 pueden no ser óptimos para todas las proteínas. En consecuencia, otras mutaciones pueden ser deseables para crear la proteína C humana que usarán E33D34 y tendrán afinidad de membrana incrementada máxima. El resultado con la proteína bovina sugirió que la histidina 11 puede ser la causa primaria de este fenómeno. En consecuencia, H11 puede ser alterado a glutamina u otro aminoácido en la proteína C humana, junto con la mutación E33D34. Otro aminoácido que puede impactar en la afinidad es la serina en la posición 12, un aminoácido que es completamente único para la proteína C humana. Estos cambios adicionales deberían producir proteínas con afinidad de membrana intensificada. El arquetipo electrostático también fue probado por comparación de factor X humano y bovino. La presencia de lisina-11 en el factor X humano sugiere que debería tener menor afiidad que el factor X bovino. Esta predicción fue confirmada por el resultado mostrado en la Figura 15. Estudios anteriores habían mostrado que la modificación con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) de fragmento 1 de protrombina bovina y humana tuvieron relativamente poco impacto (0 a 5 veces) en la afinidad de membrana. Weber, D.J. et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:4564-4569; Welsch, D.J. et al., 1988, Biochemistry, 27:4933-4938. Las condiciones usdas para la reacción resultaron en derivación del extremo amino, un cambio que está enlazado a afinidad de membrana disminuida. Welsch, D.J. y Nelsestuen, G.L., 1988 Biochemistry, 27:4939-4945. La modificación de proteína en la presencia de calcio, el cual protege el extremo amino, resultó en proteína modificada con TNBS con afinidad mucho mayor por la membrana que el fragmento 1 natural. La sugerencia de que la proteína Z constituye el arquetipo se basó en su constante de velocidad de disociación y que una velocidad de asociación normal generaría una KD= 1 0" 1 0 M . Si puede alcanzarse este valor es incierto. Es posible que la velocidad de asociación lenta de la proteína Z sea provocada por dobiamiento de proteína inapropiado, resultando en una baja concentración de la conformación de unión de mem brana . Si pueden alterarse las condiciones para mejorar el doblam iento de proteína , las velocidades de asociación de la proteína Z deberían mejorar. En realidad, la constante de velocidad de asociación para la proteína Z fue mejorada por alteración de pH . La base para esta observación puede estar relacionada con una característica inusual de la estrctura de protrombina, la cual es la colocación cercana del extremo am ino ( + 1 a pH 7.5) a iones de calcio 2 y 3. La carga + 1 en el extremo am ino es responsable de la región electropositiva ligera justo encima de Ca-1 en la Figura 1 1 . La repulsión de cargas entre Ca y la terminal amino puede desestabilizar el doblamiento de prote ína y podría ser un serio problema para una proteína que tuvo baja estabi lidad de doblamiento. La Tabla 5 proporciona un soporte adicional para el modelo de arq uetipo. Muestra la relación entre la distancia de grupos iónicos de iones estroncio 1 y 8 (correspondientes a calcio 1 y un ion de metal divalente extra encontrado en la estructura de cristal de rayos X de Sr de protrom bina). El patrón sugiere que mientras más cerca esté un grupo ión ico a estos iones metálicos, mayor será su impacto sobre la afinidad de membrana. La excepción es Arg-16, el cual contribuye a la carga del núcleo electropositivo. La mayor afinidad está correlacionada con la carga electronegativa en todos los demás sitios. Esta correlación tam bién se aplica a los residuos de G LA.

TABLA 5 Distancia a Sr-1, 8 e importancia de iones a Las distancias son desde este átomo de protrombina bovina (residuo de protrombina usado en la med ición está dado en paréntesis) a estroncio 1 y 8 de la estructura de fragmento 1 de Sr-protrombina. Seshadri et al. 1 994, Biochemistry 33: 1 087-1092. b Para todos menos 16-R, los cationes disminuyen la afin idad y los aniones incrementan la afinidad. c Thariath et al . 1 997 Biochem . J. 322: 309-31 5. d I mpacto de mutaciones Glu a Asp, las distancias son promedios para los gamma-carboxil-carbonos. Los datos de KD (KM) son de Ratcliffe et al . 1 993 J . Biol . Chem . 268: 24339-45. e La u nión fue de menor capacidad o provocó ag regación , haciendo menos ciertas las comparaciones.

Los resultados en la Figura 1 5C muestran q ue la velocidad de asociación para la proteína Z fue mejorada substancialmente a pH 9, donde una terminal amino debería ser no cargada. La constante de velocidad obtenida a partir de estos datos fue aproximadamente 12-veces mayor a pH 9 q ue a pH 7.5 (Figura 1 5C).

Otras modalidades Se entenderá que aunque la invención ha sido descrita en conjunción con la descripción detallada de la misma , la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la i nvención , el cual está definido por el alcance de las reividicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las sig uientes reividicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Reactivos de la Universidad de Minnesota <120> POLIPEPTIDOS MODIFICADOS DEPENDIENTES DE VITAMINA K <130> 09531/002WO1 <150> 08/955,636 <151> 1997-10-23 <160> 35 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 1 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg His Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa He Phe Gln 20 25 30 Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 2 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg ftr Gly Asn Val Xaa Arg Xaa 1 5 10- 15 Cys Ser Xaa Xaa Val Cys Xaa Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa He Phe Gln 20 25 30 Asn Thr Xaa Asp Thr Met Ala Phe Trp Ser Phe Tyr 35 40 <210> 3 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 3 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa He Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr 35 40 <210> 4 <211> 44 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 4 Ala Asn Gly Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Arg Xaa Xaa Leu Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala His Xaa He Phe Arg 20 25 30 Asn Xaa Xaa Arg Thr Arg Gln Phe Trp Val Ser Tyr 35 40 <210> 5 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 5 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Gln Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cye Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 20 25 30 Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr 35 40 45 <210> 6 <211> 46 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 6 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Gln Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 20 25 30 Xaa Asn Thr Xaa Lys Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr 35 40 45 <210> 7 <211 > 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 7 aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctt 36 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 8 gcactcccgc tccaggctgc tgggacggag ctcctccagg aa 42 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 9 acgctccacg ttgccgtgcc gcagctcctc taggaa 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 10 ttcctagagg agctgcggca cggcaacgtg gagcgt 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 11 gcatttaggt gacactatag aatagggccc tctaga 36 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 12 gaaggccatt gtgtcttccg tgtcttcgaa aatctcccga ge 42 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 13 cagtgtgtca tccacatctt cgaaaatttc cttggc 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 14 gccaaggaaa ttttcgaaga tgtggatgac acactg 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 15 cagtgtgtca tccacatttt cgaaaatttc cttggc 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> oligonucleótido mutagénico de proteína C <400> 16 gccaaggaaa ttttcgaaaa tgtggatgac acactg 36 <210> 17 <211 > 45 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 17 Ala Asn Lys Gly Phe Leu Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cys Leu Xaa Xaa Pro Cys Ser Arg Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu 20 25 30 Xaa Ser Leu Ser Ala Thr Asp Ala Phe Trp Ala Lys Tyr 35 40 45 <210> 18 <211> 44 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 18 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Val Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Leu Xaa Xaa Ala Cys Ser Leu Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa 20 25 30 Asp Ala Xaa Gln Thr Asp Xaa Phe Trp Ser Lys Tyr 35 40 <210> 19 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 19 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg His Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 20 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 20 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gln Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 21 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 21 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Glu Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 22 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 22 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Asp Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 23 <211> 44 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 23 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg His Gly Asn Val Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Ser Xaa Xaa Val Cys Xaa Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa He Phe Gln 25 30 Asn Thr Xaa Asp Thr Met Ala Phe Trp Ser Phe Tyr 35 40 <210> 24 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 24 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gln Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 25 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 25 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg His Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Phe Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Val Asp Aep Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 26 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 26 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Glu Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa He Phe Lys 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr 35 40 <210> 27 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 27 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Asp Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa He Phe Lys 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr 35 40 <210> 28 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 28 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Phe Xaa He Phe Lys 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr 35 40 <210> 29 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 29 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa He Phe Asp 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr 35 40 <210> 30 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 30 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gln Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr 35 40 <210> 31 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 31 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Asp Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 25 30 Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr 35 40 45 <210> 32 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 32 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Glu Gly Asn Leu Xaa Arg ' 1 5 10 15 Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 25 30 Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr 35 40 45 <210> 33 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 33 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Gln Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Phe Xaa Val Phe 25 30 Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr 35 40 45 <210> 34 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 34 Tyr Aen Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Gln Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 25 30 Xaa Asp Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr 35 40 45 <210> 35 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa = ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico <400> 35 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Glu Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys He Xaa Xaa He Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa He Phe Glu 25 30 Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His 35 40

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 Un pohpéptido dependiente de vitamina K que comprende un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana de dicho polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente, comprendiendo dicho GLA modificado al menos una substitución de aminoácido en el residuo 11, 12, 29 o 34 2 El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha substitución de aminoácido está en el aminoácido 11 o 34 3 El po péptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende además una substitución de aminoácido en el aminoácido 33 4 El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho po péptido comprende una substitución de aminoácido en el aminoácido 11 y el aminoácido 33 5 El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido aumenta la formación de coágulos 6 El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido inhibe la formación de coágulos 7 El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende proteína C o proteína C activada 8 El pohpéptido de la reivindicación 7, en donde dicha substitución comprende un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 34 (SEQ ID NO 20) 9. El polipéptido de la reivindicación 8, en donde dicha substitución de aminoácido comprende además una glutamina en el aminoácido 11 (SEQ ID NO:20). 10. El polipéptido de la reivindicación 8, en donde dicha substitución de aminoácido comprende además un ácido glutámico en el aminoácido 11 (SEQ ID NO:21). 11. El polipéptido de la reivindicación 9 o 10, en donde dicha substitución de aminoácido comprende además una glicina en el aminoácido 12 (SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:35). 12. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende el factor Vil o factor Vlla. 13. El polipéptido de la reivindicación 12, en donde dicha substitución de aminoácido comprende un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:30). 14. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende factor IX o factor IXa. 15. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende factor Vlla modificado de sitio activo. 16. El polipéptido de la reivindicación 15, en donde dicha substitución de aminoácido comprende un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO:30) 17. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de GLA modificado comprende una secuencia de aminoácidos, la cual, en el estado saturado de calcio, forma una estructura terciaria que tiene un núcleo catiónico con un halo de carga electronegativa. 18 Un polipéptido dependiente de vitamina K comprendiendo un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana y la actividad de dicho polipéptido en relación a un po péptido dependiente de vitamina K natural correspondiente, comprendiendo dicho dominio de GLA modificado al menos una substitución de aminoácido, en donde dicho polipéptido es uno que inhibe la formación de coágulos 19 El po péptido de la reivindicación 18, en donde dicho dominio de GLA es del aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 45 20 El polipéptido de la reivindicación 18, en donde dicha substitución de aminoácido está en el aminoácido 11, 12, 29, 33 o 34 21 Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido dependiente de vitamina K, en donde dicho polipéptido dependiente de vitamina K comprende un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana y la actividad de dicho polipéptido en relación a un po péptido dependiente de vitamina K natural correspondiente 22 Una célula huésped de mamífero que comprende un vector de ácido nucleico, codificando dicho vector un polipéptido dependiente de vitamina K, dicho po péptido dependiente de vitamina K comprende un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana y la actividad de dicho polipéptido en relación a un po péptido dependiente de vitamina K natural correspondiente, comprendiendo dicho dominio de GLA modificado al menos una substitución de aminoácido 23 Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectivo para inhibir la formación de coágulos en un mam ífero, en donde d icho polipéptido dependiente de vitamina K comprende un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana y actividad de dicho polipéptido en relación a un polipéptido depend iente de vitamina K natural correspondiente, comprend iendo dicho dom inio de GLA modificado al menos una substitución de aminoácido. 24. Una com posición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectiva para incrementar la formación de coágulos, en donde dicho polipéptido dependiente de vitamina K comprende un dominio de GLA modificado q ue intensifica la afinidad de unión de mem brana de dicho pol ipéptido en relaciona un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente, comprendiendo dicho dominio de GLA modificado al menos una substitución de am inoácido en el residuo 1 1 , 1 2 , 29 o 34. 25. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, en donde dicho polipéptido comprende además una substitución de aminoácido en el aminoácido 33. 26. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, en donde dicha composición farmacéutica comprende además factor de tejido soluble. 27. Un polipéptido dependiente de vitam ina K para usarse para tratar un desorden de coagulación , en donde dicho polipéptido dependiente de vitam ina K comprende un domin io de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de mem brana y actividad de dicho polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitam ina K natural correspondiente, com prendiendo dicho dom in io de G LA modificado al menos una substitución de aminoácido. 28. El uso de un polipéptido dependiente de vitami na K en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un desorden de coagulación , en donde dicho poiipéptido dependiente de vitamina K comprende un dom inio de G LA modificado que intensifica la afin idad de unión de membrana y actividad de dicho polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitami na K natural correspondiente, comprendiendo dicho dominio de GLA modificado al menos u na substitución de am inoácido. 29. U n método para disminuir la formación de coágulos en un mamífero que comprende administrar una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectiva para dism inuir la formación de coágulos en dicho mam ífero, en donde dicho polipéptido dependiente de vitam ina K comprende un dominio de GLA modificado que intensifica la afinidad de unión de membrana y actividad de dicho polipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente, comprendiendo dicho dom inio de GLA modificado al menos una substitución de aminoácido. 30. Un método para incrementar la formación de coágulos en un mam ífero que comprende adm inistrar una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina K efectiva para incrementar la formación de coágulos en dicho mam ífero, en donde dicho polipéptido dependiente de vitami na K comprende un dom inio de GLA modificado q ue intensifica la afinidad de unión de membrana de dicho pol ipéptido en relación a un polipéptido dependiente de vitamina K natural correspondiente, comprendiendo dicho dominio de GLA modificado al menos una substitución de aminoácido en el residuo 11, 12, 29 o 34.