MXPA00003255A - Metodos para modular la funcion de serina/treonina proteina cinasa por compuestos basados en 5-azaquinoxalina - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a en parte hacia métodos para modular la función de serina/treonina proteína cinasas con compuestos basados en 5-azaquinolina. Los métodos incorporan células que expresan una serina/treonina proteína cinasa, tal como RAF. Además, la invención describe métodos para evitar y tratar condiciones anormales relacionadas con serina/treonina proteína cinasa en organismos con un compuesto identificado por la invención. Además, la invención pertenece a compuestos de 5-azaquinoxalina y composiciones farmacéuticas que comprenden a estos compuestos y uso de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN MÉTODOS PARA MODULAR LA FUNCIÓN DE SERINA/TREONINA PROTEÍNA CINASA POR COMPUESTOS BASADOS EN 5-AZAQUINOXALINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se proporciona para ayudar a comprender la invención, pero no se admite como técnica anterior para la invención. La transducción de señal celular es un mecanismo fundamental por el cual los estímulos externos que regulan diversos procesos celulares son transmitidos al interior de las células. Uno de los mecanismos bioquímicos clave de la transducción de señales involucra la fosforilación reversible de proteínas, lo que permite la regulación de la actividad de las proteínas maduras al alterar su estructura y función. Las proteínas cinasas mejor caracterizadas en eucariotas fosforilan proteínas en la porción alcohol de los residuos serina, treonina y tirosina. Estas cinasas se encuentran principalmente en dos grupos, aquéllos específicos de fosforilar serina y treonina y aquéllos específicos para fosforilar tirosina. Algunas cinasas, denominadas como cinasas de "especificidad doble", son capaces de fosforilar en los residuos tirosina así como serina/treonina.

Las proteínas cinasas también pueden ser caracterizadas por su posición dentro de la célula. Algunas cinasas son proteínas receptoras transmembranales capaces de unir ligandos externos a la membrana celular. La unión de los ligandos altera la actividad catalítica del receptor de proteína cinasa. Otras son proteínas no receptoras que carecen de un dominio transmembranal . Las proteínas cinasas no receptoras se pueden encontrar en diversos compartimientos celulares desde la superficie interior de la membrana celular hasta el núcleo. Muchas cinasas están involucradas en cascadas reguladoras en donde sus sustratos pueden incluir a otras cinasas cuyas actividades son reguladas por su estado de fosforilación. Finalmente, la actividad del efector corriente abajo se modula por fosforilación que resulta de la activación de tal vía. La familia de la serina/treonina cinasa incluye miembros que regulan muchas etapas de cascadas de señalización que incluyen cascadas que controlan el crecimiento celular, la migración, diferenciación, expresión de genes, contracción muscular, metabolismo de glucosa, síntesis de proteína celular y regulación del ciclo celular. Un ejemplo de una proteína cinasa no receptora que fosforila proteínas objetivo sobre residuos serina y treonina es RAF. RAF modula la actividad catalítica de otras proteínas cinasas, tales como la proteína cinasa que fosforila y por lo tanto activa a la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) .

La RAF en sí misma es activada por la proteína RAS anclada a membrana, la cual a su vez es activada en respuesta a un ligando que activa la proteína receptora de tirosinas cinasas, tales como el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) . La importancia biológica de RAF en el control de eventos celulares está subrayada por el hallazgo de que las formas alteradas de RAF pueden causar cáncer en organismos . La evidencia de la importancia de RAF en cánceres malignos se proporciona por Monia et al., 1996, Nature Medicine 2 : 668, incorporada en la presente como referencia en su totalidad e que incluye todas las figuras y tablas . En un esfuerzo por descubrir tratamientos novedosos contra el cáncer y otras enfermedades, los investigadores biomédicos y químicos han diseñado, sintetizado y probado moléculas que inhiben la función de proteínas cinasas . Algunas moléculas orgánicas pequeñas de una clase de compuestos que modulan la función de las proteínas cinasas. Los ejemplos de moléculas que se ha informado inhiben la función de las proteínas cinasas son compuestos bismonocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos arilo (PCT WO 92/20642), derivados de vinileno-azaindol (PCT WO 94/14808) , l-ciclopropil-4-piridilquinoíonas (patente U.S. No. 5,330,992), compuestos estirilo (por Levitzki et al., patente U.S. No. 5,217,999 e intitulada "Styril Compounds wich Inhibit EGF Receptor Protein Tyrosine Kinase, Lyon & Lyon expediente No. 208/050), compuestos piridilo sustituidos con estirilo (patente U.S. No. 5,302,606), ciertos derivados de quinazolina (solicitud EP No. 0 566 266 Al) , seleoindoles y selenuros (PCT WO 94/03427) , compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) y compuestos de ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495) . Los compuestos que pueden atravesar las membranas celulares y que son resistentes a hidrólisis acida son sustancias terapéuticas potencialmente ventajosas pues se pueden volver altamente biodisponibles después de ser administradas oralmente a pacientes. Sin embargo, muchos de estos inhibidores de proteína cinasa únicamente inhiben débilmente la función de las proteínas cinasas. Además, pueden inhibir a muchas proteínas cinasas y por lo tanto provocan efectos colaterales múltiples como sustancias terapéuticas para enfermedades . Pese al progreso significativo que se ha realizado en desarrollar compuestos para el tratamiento del cáncer, existe la necesidad en la técnica de identificar las estructuras particulares y los patrones de sustitución forman los compuestos capaces de modular la función de proteínas cinasas particulares.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida en parte a métodos para modular la función de serina/treonina proteína cinasa con compuestos basados en 5-azaquinoxalina. Los métodos incorporan células que expresan una serina/treonina proteína cinasa, tal como RAF. Además, la invención describe métodos para evitar y tratar condiciones anormales relacionadas con serina/treonina proteína cinasa en organismos con un compuesto identificado por los métodos descritos aquí. Además, la invención pertenece a composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos identificados por métodos de la invención.

I. Métodos para analizar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa Los métodos de la presente invención proporcionan un medio para modular la función de las serina/treonina proteína cinasa tanto receptores como citosólicas. Estos métodos proporcionan medios para modular las enzimas tanto in vitro como in vivo. Para aplicaciones in vitro, los métodos de la invención se relacionan en parte con el método para identificar compuestos que modulan la función de las serina/treonina proteína cinasa. Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención describe un método para modular la función de una serina/treonina proteína cinasa con un compuesto basado en azabencimidazol . El compuesto azabencimidazol opcionalmente está sustituido con grupos orgánicos . El método comprende poner en contacto células que expresan la serina/treonina proteína cinasa con el compuesto.

El término "función" se refiere al papel celular de una serina/treonina proteína cinasa. La familia de las serina/treonina proteína cinasa incluyen miembros que regulan muchas etapas en las casacadas de señalización, que incluyen cascadas que controlan el crecimiento celular, migración, diferenciación, expresión de genes, contracción muscular, metabolismo de glucosa, síntesis de proteínas celulares y regulación del ciclo celular. El término "actividad catalítica" en el contexto de la invención, define a la velocidad a la cual una proteína cinasa fosforila un sustrato. La actividad catalítica se puede medir, por ejemplo, al determinar la cantidad de un sustrato convertido a un producto como una función del tiempo. La fosforilación de un sustrato se produce en el sitio activo de una proteína cinasa. El sitio activo normalmente es una cavidad en la cual el sustrato se une a la proteína cinasa y es fosforilada. El término "sustrato" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula fosforilada por una serina/treonina proteína cinasa. Preferiblemente, el sustrato es un péptido y de manera más preferible una proteína. En relación a la proteína cinasa RAF, los sustratos preferidos son MEK y el sustrato de MEK, MAPK. El término "activa" se refiere a incrementar la función celular de una proteína cinasa . La función de proteína cinasa preferiblemente es la interacción con un asociado de unión natural y de manera más preferible con actividad catalítica. El término "inhibe" se refiere a una disminución en la función celular de una proteína cinasa. La función de proteína cinara preferiblemente es la interacción con un asociado de unión natural y de manera más preferible con actividad catalítica. El término "modula" se refiere a alterar la función de una proteína cinasa al incrementar o disminuir la probabilidad de que se forme un complejo entre una proteína cinasa y un asociado de unión natural . Un modulador preferiblemente incrementa la probabilidad de que se forme tal complejo entre la proteína cinasa y el asociado de unión natural, y que de manera más preferible incremente o disminuya la probabilidad de que se forme un complejo entre la proteína cinasa y el asociado de unión natural, dependiendo de la concentración del compuesto al que se expone la proteína cinasa, y de manera más preferible disminuye la probabilidad de que se forme un complejo entre la proteína cinasa y el asociado de unión natural . Un modulador preferiblemente activa la actividad catalítica de una proteína cinasa, de manera más preferible activa o inhibe la actividad catalítica de una proteína cinasa dependiendo de la concentración del compuesto expuesto a la proteína cinasa, o de manera más preferible inhibe la actividad catalítica de una proteína cinasa. El término "complejo" se refiere a un ensamblado de por lo menos dos moléculas unidas entre sí. Los complejos de transducción de señal con frecuencia contienen por lo menos dos moléculas proteínicas unidas entre sí. Por ejemplo, un receptor de proteína tirosina proteína cinasa GRB2 , SOS, RAF y RAS se ensamblan para formar un complejo de transducción de señal en respuesta a un ligando mitogénico. El término "asociado de unión natural" se refiere a polipéptidos que se unen a una proteína cinasa en células. Los asociados de unión naturales pueden jugar un papel en la propagación de una señal en un proceso de transducción de una señal de proteína cinasa. Un cambio en la interacción entre una proteína cinasa y un asociado de unión natural se puede manifestar en sí mismo como una probabilidad aumentada o disminuida de que se forme una interacción, o una concentración aumentada o disminuida del complejo de proteína cinasa/asociado de unión natural . Una proteína cinasa y asociado de unión natural se pueden unir a una región intracelular de una proteína cinasa con alta afinidad. Una alta afinidad representa una constante de unión al equilibrio en el orden de 10"6 M o menor. Además, un asociado de unión natural también puede interactuar transitoriamente con una región intracelular de proteína cinasa y modificarla químicamente. Los asociados de unión naturales de proteína cinasa se eligen de un grupo que incluye, pero que no se limita a los dominios SRC homología 2 (SH2) o 3 (SH3) , otros dominios de unión de fosforiltirosina (PTB) , factores de intercambio de nucleótidos de guanina, proteína fosfatasa y otras proteínas cinasas. Los métodos para determinar cambios en interacciones entre proteínas cinasas y sus asociados de unión naturales están disponibles fácilmente en la técnica. El término "serina/treonina proteína cinasa" se refiere a una enzima con una secuencia de aminoácidos se refiere a una enzima con una secuencia de aminoácidos con por lo menos 10% de identidad de aminoácidos con otras enzimas que fosforilan proteínas sobre residuos serina y treonina. Una serina/treonina proteína cinasa cataliza la adición de fosfato en proteínas sobre residuos serina y treonina. Las serina/treonina proteína cinasa pueden existir como proteínas unidas a membrana o como proteínas citosólicas. El término "poner en contacto", como se utiliza en la presente se refiere a mezclar una solución que comprende un compuesto de la invención de 5-azaquinoxalina con un baño de medio líquido con las células de los métodos. La solución que comprende el compuesto también puede comprender otro componente, tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO) , el cual facilita la captación del compuesto o compuestos de 5-azaquinoxalina dentro de las células de los métodos . La solución que comprende el compuesto de 5-azaquinoxalina se puede agregar al baño del medio de las células utilizando un aparato de suministro, tal como un dispositivo basado en pipeta.o un dispositivo basado en jeringa.

El término "compuesto basado en 5-azaquinoxalina" se refiere a un compuesto orgánico de 5-azaquinoxalina sustituido con sustituyentes químicos. Los compuestos de 5-azaquinoxalina son de la estructura general : El término "sustituido", con referencia a la invención, se refiere a un compuesto de 5-azaquinoxalina que forma derivados (es derivatizado) con diversos sustituyentes químicos. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con el método para modular la función de una serina/treonina proteína cinasa, en donde la proteína cinasa es RAF. La RAF proteína cinasa fosforila las proteínas objetivo en los residuos serina o treonina. Una de tales proteínas objetivo es la proteína cinasa (MEK) que fosforila y en consecuencia activa a la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) . La RAF en sí misma es activada por la enzima RAS hidrolizante de guanina trifosfato unido a membrana en respuesta a el receptor estimulado por mitógeno de proteína tirosina cinasas, tales como el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el recepto de factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) . Los métodos de la presente invención pueden detectar compuestos que modulan la función de la RAF proteína cinasa en células. La RAF fosforila una proteína cinasa (MEK) la cual a su vez fosforila una proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) . Los ensayos que monitorean únicamente la fosforilación de MEK por RAF no son sensibles debido a que los niveles de fosforilación de MEK no son significativos. Para resolver este dilema de sensibilidad, la fosforilación tanto de MEK como de MAPK es seguida en los ensayos de la presente invención. La señal de fosforilación de MAPK amplifica la señal de fosforilación de MEK y permite que se siga la fosforilación dependiente de RAF en los ensayos, tal como los ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima. Además, el ensayo de la invención se lleva a cabo en un formato de alto rendimiento de manera que muchos compuestos pueden ser monitoreados rápidamente en un período de tiempo breve. En otro aspecto, la invención describe un método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa, que comprende las etapas de poner en contacto células que expresan la serina/treonina proteína cinasa con el compuesto, y monitorear un efecto sobre las células. El término "monitorear" se refiere a observar el efecto de agregar el compuesto a las células del método. El efecto se puede manifestar en un cambio en el fenotipo celular, proliferación celular, actividad catalítica de proteína cinasa o en la interacción entre una proteína cinasa y un asociado de unión natural . El término "efecto" describe un cambio o una ausencia de cambio en el fenotipo celular o la proliferación celular. "Efecto" también puede describir un cambio o una ausencia de cambio en la actividad catalítica de la proteína cinasa. "Efecto" también puede describir un cambio o una ausencia de un cambio en una interacción entre la proteína cinasa y un asociado de unión natural . Una modalidad preferida de la invención se relaciona con el método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa, en donde el efecto es un cambio o una ausencia de un cambio en el fenotipo celular. El término "fenotipo celular" se refiere a la apariencia exterior de una célula o tejido, o la función de la célula o tejido. Los ejemplos de fenotipo celular son tamaño de la célula (reducción o agrandamiento) , proliferación celular (número aumentado o disminuido de células) , diferenciación celular (un cambio o ausencia de un cambio en la forma celular) , supervivencia celular, apoptósis (muerte celular) , o la utilización de un nutriente metabólico (por ejemplo captación de glucosa) . Los cambios o la ausencia de cambios en el fenotipo celular se mide fácilmente por técnicas conocidas en el arte.

En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa, en donde el efecto es un cambio o una ausencia de cambio en la proliferación celular. El término "proliferación celular" se refiere a la velocidad a la cual se divide un grupo de células . El número de células que crecen en un recipiente se puede cuantificar por una persona experta en la técnica cuando la persona cuenta visualmente el número de células en un volumen definido utilizando un microscopio óptico común. Alternativamente, se pueden cuantificar las velocidades de proliferación celular mediante aparatos de laboratorio que miden óptica o conductivamente la densidad de células en un medio apropiado. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa, en donde el efecto es un cambio o una ausencia de cambio en la interacción entre serina/treonina proteína cinasa con un asociado de unión natural . El término "interacción", en el contexto de la invención, describe un complejo formado entre una región intracelular de una proteína cinasa y un asociado de unión natural o un compuesto. El término "interacción" también se puede extender a un complejo formado entre un compuesto de la invención con regiones intracelulares y regiones extracelulares de la proteína cinasa bajo estudio. Aunque una proteína cinasa citosólica no tendrá región extracelular, un receptor de proteína cinasa albergará una región extracelular y una intracelular. El término "región intracelular" como se utiliza en la presente, se refiere a la porción de una proteína cinasa la cual existe dentro de una célula. El término "región extracelular", como se utiliza en la presente, se refiere a una porción de una proteína cinasa la cual existe fuera de la célula. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa y que comprende además las siguientes etapas: (a) lisar las células para obtener un lisado que comprende serina/treonina proteína cinasa; (b) absorber serina/treonina proteína cinasa a un anticuerpo; (c) incubar la serina/treonina proteína cinasa adsorbida con un sustrato o sustratos; y (d) adsorber el sustrato o sustratos a un soporte sólido o anticuerpo. La etapa de monitorear el efecto sobre las células comprende medir la concentración de fosfato del sustrato o los sustratos. El término "lisar", como se utiliza en la presente se refiere a un método para romper la integridad de una célula de manera que se libere el contenido del interior. La lisis celular se lleva a cabo por muchas técnicas conocidas por las personas expertas en el arte . El método se lleva a cabo preferiblemente por sonicación o técnicas de ruptura celular y de manera más preferible por técnicas con detergente . El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula proteínica que tiene * específicamente una proteína cinasa. Un anticuerpo preferiblemente se une a una clase de proteína cinasa y de manera más preferible se une específicamente a la proteína cinasa RAF. El término "se une específicamente", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que se une a una proteína cinasa con mayor afinidad que a otra proteína cinasa o proteína celular. Un anticuerpo que se une específicamente a una proteína cinasa se unirá a una mayor concentración de la proteína cinasa específica que a otra proteína cinasa o proteína celular. El término "adsorber" como se utiliza en la presente se refiere a la unión de una molécula a la superficie de un anticuerpo o soporte sólido. Los ejemplos de soportes sólidos son celulosa modificada químicamente, tal como fosfocelulosa y nylon. Los anticuerpos se pueden unir a soportes sólidos utilizando técnicas bien conocidas por los investigadores habitualmente expertos en la técnica. Véase por ejemplo Harlo & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual , 1989, Cold Spring Harbor Laboratories . El término "medir la concentración de fosfato" , como se utiliza en la presente, se refiere a técnicas comúnmente conocidas por las personas habitualmente expertas en el arte.

Estas técnicas pueden involucrar cuantificar la concentración de concentraciones de fosfato dentro de un sustrato o determinar las cantidades relativas de fosfato dentro de un sustrato. Estas técnicas pueden incluir adsorber el sustrato a una membrana y detectar la cantidad de fosfato dentro del sustrato por mediciones radioactivas. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa y que comprenden además las siguientes etapas: (a) lisar las células para obtener un lisado que comprende RAF; (b) adsorber el RAF a un anticuerpo; (c) incubar el RAF adsorbido con MEK y MAPK; y (d) adsorber MEK y MAPK a un soporte sólido o un anticuerpo o anticuerpos. La etapa de medir el efecto en las células comprende monitorear la concentración de fosfato de MEK y MAPK. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con el método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa, en donde el compuesto basado en 5-azaquinoxalina tiene la estructura que se establece en la fórmula I como se define en la presente o cualquiera de los subgrupos de los mismos que se establecen aquí . El término "compuesto" se refiere al compuesto o una sal, éster, amida, promedicamento, isómero o metabolito del mismo farmacéuticamente aceptable .

El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una formulación de un compuesto que no abroga la actividad biológica y las propiedades del compuesto. Las sales farmacéuticas se pueden obtener al hacer reaccionar un compuesto de la invención con ácidos inorgánicos u orgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido p-toluensulfdnico, ácido salicílico y similares . El término "promedicamento" se refiere a un agente que se convierte a un medicamento parental in vivo . Los promedicamentos pueden ser más fáciles de administrar que el medicamento parental que en algunas situaciones. Por ejemplo, el promedicamento puede estar disponible por administración oral, pero el parental no, o el promedicamento puede involucrar solubilidad para permitir su administración intravenosa. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa, en donde el compuesto basado en 5-azaquinoxalina tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde se selecciona un compuesto basado en 5-azaquinoxalina del grupo que consiste de compuestos SAQAR. El término "compuestos SAQAR" se refiere al grupo de compuestos basados en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura que se establece en la fórmula I y que se numeran desde A-l hasta A-90 en la siguiente tabla: (I) I_L_. Métodos para evitar o tratar condiciones anormales En otro aspecto, la invención describe un método para prevenir o tratar una condición anormal en un organismo. El método comprende las siguientes etapas: (a) administrar un compuesto de la invención, como se especifica en la presente por la fórmula I con cualquiera de las restricciones que se proporcionan en la presente, a un organismo; y (b) promover o interrumpir la interacción anormal . El término "organismo" se relaciona con cualquier entidad viviente que comprende por lo menos una célula. Un organismo puede ser tan sencillo como una célula eucariótica o tan complejo como un mamífero. En las modalidades preferidas, un organismo se refiere a humanos o mamíferos. El término "prevenir" se refiere al método de la invención que disminuye la probabilidad o que elimina la posibilidad de que un organismo contraiga o desarrolle una condición anormal . El término "tratar" se refiere al método de la invención que tiene un efecto terapéutico por lo menos un alivio parcial o abrogación de la condición anormal en el organismo. El término "efecto terapéutico" se refiere a la inhibición del crecimiento celular causado o que contribuye a una condición anormal (por ejemplo cáncer) . El término "efecto terapéutico" también se refiere a la inhibición de los sectores de crecimiento que causan o que contribuyen a la condición anormal. Un efecto terapéutico libera en cierta medida uno o más de los síntomas de la condición anormal. Con referencia al tratamiento de un cáncer, un efecto terapéutico se refiere a uno o más de los siguientes: (a) una reducción en el tamaño del tumor; (b) inhibición (es decir, frenado o detención) de la metástasis tumoral; (c) inhibición del crecimiento del tumor,- y (d) liberación en cierta medida de uno o más de los síntomas asociados con la condición anormal . Los compuestos que demuestran eficacia contra leucemias se pueden identificar como se describe en la presente, excepto que en vez de inhibir la metástasis, los compuestos en vez pueden frenar o disminuir la proliferación de células o el crecimiento de células . El término "condición anormal" se refiere a una función en las células o tejidos de un organismo que se desvía de sus funciones normales en un organismo. Una condición anormal se puede relacionar con la proliferación celular, la diferenciación celular o la supervivencia celular. Las condiciones proliferativas de células aberrantes incluyen cánceres tales como trastornos fibróticos o mesangiales, angiogénesis y vasculogénesis anormales, sanado de heridas, psoriasis, diabetes mellitus e inflamación. Las condiciones de diferenciación aberrantes incluyen, pero no se limitan a desórdenes neurodegenerativos, velocidades lentas de sanado de heridas y técnicas de injertos de tejido. Las condiciones de supervivencia de células aberrantes se relacionan con condiciones en las cuales se activan o abrogan vías de muerte celular programada (apoptósis) . Muchas proteínas cinasas se asocian con las vías de apoptosis . Las aberraciones en la función de cualquiera de las proteínas cinasas puede llevar a inmortalidad celular o muerte celular prematura. La proliferación, diferenciación y supervivencia celulares son fenómenos medidos simplemente por métodos en la técnica. Estos métodos pueden involucrar observar el número de células o la apariencia de las células bajo el microscopio con respecto al tiempo (por ejemplo días) . El término "administrar" se relaciona ampliamente con la provisión de un organismo y más específicamente con un método para incorporar un compuesto en las células o tejidos de un organismo. Se puede evitar o tratar una condición anormal cuando las células o tejidos del organismo existen dentro del organismo o fuera del organismo. Las células que existen fuera del organismo se pueden mantener o hacer crecer en recipiente de cultivo celular. Para células albergadas dentro del organismo, existen muchas técnicas en el arte para administrar compuestos que incluyen (pero que no se limitan a) aplicación oral, parenteral, dérmica, por inyección y aerosol. Para células fuera del organismo, existen técnicas múltiples en el arte para administrar los compuestos, que incluyen (pero que no se limitan) a técnicas de microinyección celular, técnicas de transformación y técnicas portadoras. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para evitar o tratar una condición anormal en un organismo, en donde el compuesto basado en 5-azaquinoxalina tiene la estructura que se establece en la fórmula I como se define en la presente o en cualquiera de los subgrupos de los mismos que se establecen aquí. En otras modalidades preferidas, la invención se relaciona con un método para evitar o tratar una condición anormal en un organismo, en donde el compuesto basado en 5-azaquinoxalina, que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, se selecciona del grupo que consiste de compuestos SAQAR. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para evitar o tratar una condición anormal en un organismo en donde el organismo es un mamífero.

El término "mamífero" se refiere preferiblemente a organismos tales como ratones, ratas, conejos, cobayos y chivos, de manera más particular a monos y simios, y de manera más preferible a huma *nos . En otra modalidad preferida adicional, la invención se relaciona con un método para evitar o tratar una condición anormal en un organismo, en donde la condición anormal es cáncer o un desorden fibrótico. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para evitar o tratar una condición anormal en un organismo, en donde el cáncer se selecciona con un grupo que consiste de cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de pecho, cáncer cerebral, cáncer cerebral intraaxial, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma y glioma. En otra modalidad preferida adicional, la invención se relaciona con un método para prevenir o tratar una condición anormal en un organismo, en donde el método se aplica a una condición anormal y se asocia con una aberración en una vía de transducción de señal caracterizada por una interacción entre una serina/treonina proteína cinasa y un asociado de unión natural . El término "vía de transducción de señal" se refiere a la propagación de una señal. En general, una señal extracelular se transmite a través de la membrana celular para volverse una señal intracelular. Esta señal después puede estimular una respuesta celular. El término también abarca señales que son propagadas completamente dentro de una célula. Las moléculas polipeptídicas involucradas en los procesos de transducción de señales típicamente son proteínas cinasas receptoras y no receptoras, proteínas fosfatasas receptoras y no fosfatasas, factores de intercambio de nucleótidos y factores de transcripción . El término "aberración", junto con un proceso de transduccidn de señal, se refiere a una proteína cinasa que es sobreexpresada o subexpresada en un organismo, mutado de manera que su actividad catalítica es mayor o menor que la actividad de una proteína cinasa de tipo silvestre, mutada de manera que no puede interactuar más con un asociado de unión natural, ni tampoco se puede modificar por otra proteína cinasa o proteína fosfatasa, y que tampoco intenractúa con un asociado de unión natural . El término "promover o interrumpir la interacción anormal" se refiere a un método que puede llevarse a cabo al administrar un compuesto de la invención a células o tejidos en un organismo. Un compuesto puede promover una interacción entre una proteína cinasa y los asociados de unión naturales para formar interacciones favorables con múltiples átomos en una interfase completa. Alternativamente, un compuesto puede inhibir la interacción entre una proteína cinasa y los asociados de unión naturales al comprometer interacciones favorables formadas entre átomos en la interfase completa. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para evitar o tratar una condición anormal en un organismo cuando la serina/treonina proteína cinasa es RAF.

III, Compuestos y composiciones farmacéuticas de la invención En otro aspecto, las características de la invención de los compuestos de 5-azaquinoxalina que tienen las estructuras que se establecen en la fórmula I : (I) en donde (a) Rx, R2 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de (i) hidrógeno; (ii) alquilo saturado o insaturado; (iii) una amina de fórmula NX2X3, en donde X2 y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros o anillo heteroarilo; (iv) halógeno o trialometilo; (v) una cetona de fórmula -CO-X4, en donde X4 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; (vi) un ácido carboxílico de fórmula -(X5)n-COOH o éster de fórmula - (X6) n-COO-X7, en donde Xs, X6 y X7 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros y en donde n es 0 ó 1; (vii) un alcohol de fórmula (X8)n-OH o una porción de fórmula -(Xt)n-0-X9, en donde X„ y X9 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o de seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trialometilo, carboxilato, nitro y éster, y en donde n es 0 ó 1; (viii) una amida de fórmula -NHCOX10, en donde X10 se selecciona del grupo que consiste de alquilo, hidroxilo, y una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster; (ix) , en donde XX1 y X?a se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros,- (x) una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; (xi) un aldehido de fórmula -CO-H; y (xii) una sulfona de fórmula -S02-X13, en donde X13 se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; y (b) X-. se selecciona del grupo que consiste de nitrógeno, azufre y oxígeno. El término "alquilo saturado" se refiere a una porción alquilo que no contiene ninguna porción alqueno o alquino. La porción alquino puede estar ramificada o sin ramificar. El término "alquilo insaturado" se refiere a una porción alquilo que contiene por lo menos una porción alqueno o alquilo. La porción alquilo puede estar ramificada o sin ramificar. El término "amina" se refiere a una porción química de fórmula NRjR2 en donde Rx y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y porciones éster. El término "arilo" se refiere a un grupo aromático el cual tiene por lo menos un anillo que tiene un sistema de electrones pi conjugados y que incluyen los grupos tanto arilo carbocíclico (por ejemplo fenilo) como arilo heterocíclico (por ejemplo piridina) . El término "carbocíclico" se refiere a un compuesto el cual contiene una o más estructuras de anillo saturadas covalentemente y en donde los átomos que forman la estructura principal del anillo son todos átomos de carbono. Por lo tanto, el término diferencia los anillos carbocíclicos de los heterocíclicos en los cuales la estructura principal del anillo contiene por lo menos un átomo el cual es diferente de carbono. El término "heteroarilo" se refiere a un grupo arilo el cual contiene por lo menos un anillo heterocíclico. El término "halógeno" se refiere a un átomo que se selecciona del grupo que consiste de flúor, cloro, bromo y yodo.

El término "cetona" se refiere a una porción química con la fórmula - (R) n-CO-R' , en donde R y R' se seleccionan del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado, y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, y en donde n es 0 ó 1. El término "ácido carboxílico" se refiere a una porción química con la fórmula -(R)n-COOH, en donde R se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado, y las porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, y en donde n es cero o uno. El término "éster" se refiere a una porción química con la fórmula - (R) n-COOR' , en donde R y R' se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado y de porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros y en donde n es 0 ó 1. El término "alcohol" se refiere a un sustituyente químico de fórmula -ROH, en donde R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y porciones éster. El término "amida" se refiere a un sustituyente químico de fórmula -NHCOR, en donde R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, hidroxilo y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes que, se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster. El término "porción alcoxi" se refiere a un sustituyente químico de fórmula -OR, en donde R es hidrógeno o una porción alquilo saturada o insaturada. El término "aldehido" se refiere a una porción química con fórmula -(R)n-CHO en donde R se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros y en donde n es 0 ó 1. El término "sulfona" se refiere a una porción química con la fórmula -S02-R, en donde R se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura como se establece en la fórmula I en donde R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo saturado o insaturado. En otra modalidad preferida adicional, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura que se establece en la fórmula I en donde R3 y R4 son hidrógeno. En otras modalidades preferidas, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura que se establece en la fórmula I, en donde R- y R2 se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros que opcionalmente está sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster. En otras modalidades preferidas adicionales, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura que se establece en la fórmula I en donde Rx es fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes qué se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, hidroxi y alcoxi . En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura que se establece en la fórmula I en donde R1 es fenilo. En otra modalidad adicional preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura que se establece en la fórmula I, en donde Rx es -hidroxifenilo . En otras modalidades preferidas, la invención se relaciona con un .compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde R2 se seleccioan del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y fenilo opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, hidroxi y alcoxi. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde R2 es hidrógeno . En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde R2 es metilo. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde R2 es fenilo. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde R2 es E n otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde Xj. es nitrógeno u oxígeno. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde Xi es oxígeno . En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde X- es nitrógeno. En otras modalidades preferidas, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde Rs se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno; alquilo saturado o insaturado opcional nte sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster; y una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster. En otras modalidades preferidas adicionales, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene la estructura que se establece en la fórmula I, en donde las porciones R6 y X1( tomadas juntas, forman un compuesto el cual se selecciona del grupo que consiste de los sustituyentes SAQAR. El término "sustituyentes SAQAR" se refiere al grupo de sustituyentes que consisten de metoxi, bencilamino, 4-fluoro-bencilamino, 2-carboxibencilamino, 3-carboxibencilamino, 4-carboxibencilamino, 2-nitrobencilamino, 3-nitrobencilamino, 4-nitrobencilamino, 2-metilbencilamino, 3-metilbencilamino, 4-metilbencilamino, 2-clorobencilamino, 3-clorobencilamino, 4-clorobencilami.no, 2-fluorobencilamino, 3-fluorobencilamino, 4-fluorobencilamino, 2 -( trifluorometil ) bencilamino, 3- (trifluorometil) bencilamino, 4- (trifluorometil) bencilamino, fenetil-l-amino, fenilamino, 2 -carboxifenilamino, 3-carboxifenilamino, 4-carboxifenilamino, 2-nitrofenilamino, 3-nitrofenilamino, 4-nitrofenilamino, 2 -metilfenilamino, 3-metilfenilamino, 4-metilfenilamino, 2-clorofenilamino, 3-clorofenilamino, 4-clorofenilamino, 2-fluorofenilamino, 3-fluorofenilamino, 4-fluorofenilamino, 2 -(trifluorometil) fenilamino, 3 - (trifluorometil) fenilamino, 4- (trifluorometil) fenilamino, pirid-2-amino-pirid-3-amino, pirid-4-a ino y pirid-2-me ilamino. El término "bencilamino" se refiere a un grupo que tiene la estructura que se establece en la siguiente fórmula: en donde el anillo arilo puede estar opcionalmente sustituido en la posición 2, 3 ó 4. El término "fenilamino" se refiere a un grupo que tiene la estructura que se establece en la siguiente fórmula: en donde el anillo arilo puede estar opcionalmente sustituido en la posición 2, 3 ó 4.

El término "fenetil-1-amino" se refiere a un grupo que tiene una estructura como se establece en la siguiente fórmula: El término "pirid-2 -amino" se refiere a un anillo piridina el cual está sustituido con un grupo NH en la posición 2. Similarmente, los términos "pirid-3 -amino" y "pirid-4-amino" se refieren a un anillo piridina el cual está sustituido con un grupo NH en las posiciones 3 y 4, respectivamente. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina que tiene una estructura como se establece en la fórmula I, en donde el compuesto basado en 5-azaquinoxalina se selecciona del grupo que consiste de compuestos SAQAR.

IV. Métodos de síntesis de la invención En otro aspecto, la invención describe una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene una estructura de fórmula I como se define en la presente, cualquiera de los subgrupos de la misma que se establecen en este documento, o su sal, y un portador o diluyente fisiológicamente aceptable. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con una composición farmacéutica en donde el compuesto basado en 5-azaquinoxalina se selecciona del grupo que consiste de compuestos SAQAR. El término "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de un compuesto de 5-azaquinoxalina de la invención con otros componentes químicos, tales como diluyentes o portadores. La composición farmacéutica facilita la administración del compuesto a un organismo. Existen en el arte técnicas múltiples para administrar un compuesto y que incluyen, pero que no se limitan a administración oral, por inyección, en aerosol, parenteral y tópica. Las composiciones farmacéuticas también se pueden obtener al hacer reaccionar compuestos con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares. El término "fisiológicamente aceptable" define un portador o diluyente que no abroga la actividad biológica y propiedades del compuesto .

El término "portador" define un compuesto químico que facilita la incorporación en compuesto en células o tejidos. Por ejemplo, comúnmente se utiliza sulfóxido de dimetilo (DMSO) como un portador que facilita la captación de muchos compuestos orgánicos dentro de las células o tejidos de un organismo. El término "diluyente" define compuestos químicos diluidos en agua que disolverán el compuesto de interés así como estabilizar la forma biológicamente activa del compuesto. Las sales disueltas en soluciones amortiguadoras se utilizan como diluyentes en la técnica. Una solución amortiguadora utilizada comúnmente es solución salina amortiguada con fosfato debido a que imita las condiciones salinas de la sangre humana. Puesto que las sales amortiguadoras pueden controlar el pH de una solución a bajas concentraciones, un diluyente amortiguado rara vez modifica la actividad biológica de un compuesto. En otro aspecto adicional, la invención describe un método para sintetizar un compuesto de la invención, que comprende las etapas de: (a) hacer reaccionar dos amino-6-cloro-3-nitropiridina con un segundo reactivo en un solvente y en presencia de una base, en donde el segundo reactivo se selecciona del grupo que consiste de un alcohol y una amina para proporcionar el primer intermediario; (b) hacer reaccionar el primer intermediario con una 1,2-diona en presencia de un catalizador y un agente reductor y (d) purificar el producto final.

El término "1,2-diona" se refiere a una porción química de la fórmula Rx-C(0) C(0) -R2, se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno,- alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster,- y una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para sintetizar un compuesto de la invención en donde el solvente es n-butanol . En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para sintetizar un compuesto de la invención en el que la base es carbonato de potasio pulverizado. En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el método para sintetizar un compuesto de la invención en el que el segundo reactivo se selecciona del grupo que consiste de reactivos SAQAR.

El término "reactivos SAQAR" se refiere al grupo de reactivos que consisten de metanol, bencilamina, 4-fluorobencilamina, 2-carboxibencilamina, 3-carboxibencilamina, 4-carboxibencilamina, 2-nitrobencilamina, 3-nitrobencilamina, 4-nitrobencilamina, 2-metilbencilamina, 3-metilbencilamina, 4-metilbencilamna, 2-clorobencilamina, 3-clorobencilamina, 4-clorobencilamina, 2-fluorobencilamina, 3-fluorobencilamina, 4-fluorobencilamina, 2 - (trifluorometil) bencilamina, 3- (trifluorometil) bencilamina, 4- (trifluorometil) bencilamina, fenetil-1-amina, anilina, 2-carboxianilina, 3-carboxianilina, 4-carboxianilina, 2-nitroanilina, 3-nitroanilina, 4-nitroanilina, 2-toluidina, 3-toluidina, 4-toluidina, 2-cloroanilina, 3-cloroanilina, 4-cloroanilina, 2-fluoroanilina, 3-fluoroanilina, 4 - f luoroani 1 ina , 2 - ( t r i f 1 uo orne t i 1 ) ani 1 i na , 3-8trifluorometil) anilina, 4 - (trifluorometil) anilina, 2-aminopiridina, 3-aminopiridina, 4-aminopiridina y 2-metilaminopiridina. En otra modalidad preferida adicional, la invención se relaciona con un método para sintetizar un compuesto de la invención en el que el tercer reactivo se selecciona del grupo que consiste de 4-hidroxifenilglioxal, 1-fenil-l, 2-propanodiona y bencil . El término "catalizador" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula química, que cuando se agrega a un grupo de reactivos, puede incrementar la velocidad a la cual los reactivos reaccionan para formar productos. Muchos tipos de catalizadores son bien conocidos por las personas habitualmente expertas en la técnica. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con métodos para sintetizar compuestos de la invención, en donde el agente reductor es hidrógeno . En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con métodos para sintetizar compuestos de la invención, en donde el catalizador es níquel Raney. El resumen de la invención descrito antes es no limitante y otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se dirige en parte a un método para modular la función de serina/treonina proteina cinasa con compuestos basados en 5-azaquinoxalina. Además, la invención se relaciona en parte con métodos para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteina cinasa. Los métodos incorporan células que expresan una serina/treonina proteina cinasa, tal como RAF.

RAF es una proteína cinasa sin receptor que se recluta a la membrana celular cuando se une a RAS activado, una enzima hidrolizante de trifosfato de guanina. RAS se activa cuando se activa la proteína tirosina cinasa receptora activada tal como EGFR o PDGFR, uniéndose a una proteína adaptadora, GRB2 y un factor de intercambio de nucleótido de guanina, SOS. SOS remueve el difosfato de guanina de RAS, lo sustituyen con trifosfato de guanina y de esta manera activa a RAS. RAS después se une a RAF y en consecuencia activa a RAF. RAF después puede fosforilar otras proteínas objetivo en los residuos serina y treonina, tales como la cinasá (MEK) que fosforila y en consecuencia activa la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) . Por lo tanto, RAF sirve como un factor controlador intermediario en la transducción de señal activada por mitógeno. Debido al importante papel regulador de RAF en células, las modificaciones a la secuencia de aminoácido de RAF puede alterar su función y en consecuencia modificar el comportamiento celular. El papel de RAF en la proliferación celular se entiende por la observación de que las mutaciones a la secuencia de aminoácidos de RAF se ha asociado con tumores y cánceres. Debido a que las mutaciones a RAF dan lugar a cáncer en células que llevan a moléculas de RAF que muestran actividad catalítica no regulada, los inhibidores de RAF pueden aliviar o incluso abrogar la proliferación celular que lleva a cáncer en estas células.

Los métodos de la presente invención pueden detectar compuestos que modulan la función de la proteína cinasa RAF en células. RAF fosforila una proteína cinasa (MEK) la cual a su vez fosforila una proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) . Los ensayos que monitorean únicamente la fosforilación de MEK por RAF no son sensibles debido a que los niveles de fosforilación de MEK no son significativos. Para resolver este dilema de sensibilidad, la fosforilación tanto de MEK como de MAPK es seguida en los ensayos de la presente invención. La señal de fosforilación de MAPK amplifica la señal de fosforilación de MEK y permite que se siga la fosforilación dependiente de RAF en ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima. Además, el ensayo de la invención preferiblemente se lleva a cabo en un formato de alto rendimiento de manera que muchos compuestos pueden ser monitoreados rápidamente en un período de tiempo breve. Los métodos de la presente invención han identificado compuestos que inhiben la función de RAF proteina cinasa. Estos compuestos son derivados basados en 5-azaquinoxalina. Aunque se han probado los derivados basados en 5-azaquinoxalina para determinar su capacidad para inhibir las enzimas involucradas con la síntesis de nucleótidos en bacterias, muchos de estos compuestos aún no han sido explorados significativamente con respecto a la inhibición de proteína cinasa.

Debido a que RAF muestra una homología significativa en aminoácidos con otras serina/treonina proteina cinasa, los compuestos basados en 5-azaquinoxalina de la invención de igual manera pueden inhibir las serina/treonina proteina cinasa diferentes a RAF. Por lo tanto, los métodos de la invención también se relacionan con las serina/treonina proteina cinasa diferentes de RAF, que incluyen a las serina/treonina proteina cinasa con receptor y sin receptor. Los métodos de la invención también pertenecen a otros compuestos que modulan la función de RAF en células como el aspecto de alto rendimiento de los métodos lo cual permite un arreglo amplio de moléculas que se pueden probar en un período de tiempo breve. Por lo tanto, los métodos de la invención pueden identificar moléculas existentes no descritas en la presente invención que modulan la función RAF.

I . Actividad biológica de los compuestos basados en 5- azaauinoxalina Los compuestos basados en 5-azaquinoxalina de la presente invención se prueban para determinar su capacidad para inhibir la función de RAF proteína cinasa. Los ensayos biológicos y los resultados de estos estudios de inhibición se reportan aquí. Los métodos utilizados para inhibir la modulación de compuestos basados en 5-azaquinoxalina de la función de proteína cinasa son similares a los descritos en la solicitud U.S. No. de Serie 08/702,232 por Tang et al., e intitulada "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease, " (Lyon & Lyon Expediente No. 221/187), presentado el 23 de agosto de 1996, con respecto al aspecto de alto rendimiento del método. La solicitud 08/702,232 se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, incluyendo cualquier dibujo.

II. Enfermedades objetivo para ser tratadas por los compuestos basados en 1. , 5-triazanaftaleno Los métodos, compuestos y composiciones farmacéuticas descritas en la presente se diseñan para inhibir desórdenes proliferativos celulares al modular la función de la RAF proteína cinasa. Los desórdenes proliferativos resultan en proliferación celular no deseada de uno o más subconjuntos de células en un organismo multicelular lo que resulta en daño para el organismo. Los métodos, compuestos y composiciones farmacéuticas descritas en la presente también pueden ser útiles para tratar y prevenir otros desórdenes en organismos, tales como desórdenes relacionados con muerte celular prematura (es decir, enfermedades neurológicas) o inflamación. Estos desórdenes pueden ser un resultado de moléculas RAF que funcionan inapropiadamente o como resultado de moléculas de proteína cinasa relacionadas con RAF que funcionan inapropiadamente . Las alteraciones en la función de RAF proteína cinasa o proteínas cinasas relacionadas con RAF puede llevar a condiciones proliferativas de células aumentadas o disminuidas eluyentes en ciertas enfermedades. Las condiciones proliferativas de células aberrantes incluyen cánceres, desórdenes fibróticos, desórdenes del mesangio, angiogénesis anormal y vasculogénesis, sanado de heridas, psoriasis, restenosis e inflamación. Los desórdenes fibróticos se relacionan con una formación anormal de matriz extracelular celular. Un ejemplo de un desorden fibrótico es cirrosis hepática. La cirrosis hepática se caracteriza por una concentración aumentada del constituyente de matriz extracelular lo que resulta en la formación de una cicatriz hepática. La cirrosis hepática puede provocar enfermedades tales como las cirrosis del hígado. Los desórdenes proliferativos de células de mesangio se producen debido a la proliferación anormal de células mesangiales. Los desórdenes proliferativos mesangiales incluyen diversas enfermedades renales humanas tales como glomerulonefritis, nefropatía diabética, nefroesclerosis maligna, síndrome de microangiopatía trombótica, rechazo de transplantes y glomerulopatías .

Los tipos preferidos de cánceres que pueden ser tratados por los métodos y compuestos de la invención son cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de pecho, cáncer de cerebro, cáncer cerebral intraaxial, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi, melanoma y glioma. La evidencia de que los compuestos y métodos de la invención pueden ser utilizados efectivamente para sustentar e invertir la proliferación de células cancerígenas se proporciona en la presente como referencia. Los desórdenes angiogénicos y vasculogénicos resultan de proliferación excesiva de vasos sanguíneos. La proliferación de vasos sanguíneos es necesaria en diversos procesos fisiológicos normales tales como el desarrollo embriónico, formación del cuerpo lúteo, sanado de heridas y regeneración de órganos. Sin embargo, la proliferación de vasos sanguíneos también es esencial en el desarrollo de tumores cancerosos . Otros ejemplos de desórdenes proliferativos de vasos sanguíneos incluyen artritis, en donde vasos sanguíneos capilares nuevos invaden las articulaciones y describen el cartílago. Además, las enfermedades proliferativas de vasos sanguíneos incluyen otras enfermedades tales como retinopatía diabética, en donde los capilares nuevos en la retina invaden el humor vitreo, provocan derrames y provocan ceguera. Inversamente, los desórdenes relacionados con el encogimiento, contracción o cierre de vasos sanguíneos, tales como restenosis, también están implicados en la regulación adversa de las proteínas cinasas . Además, la, vasculogénesis y angiogénesis están asociados con el crecimiento de tumores sólidos malignos y metástasis. Un tumor de cáncer que crece vigorosamente requiere un suministro de nutrientes y sangre rica en oxígeno para continuar creciendo. Como consecuencia, un número anormalmente grande de vasos sanguíneos capilares con frecuencia crecen de manera concertada con el tumor y actúan como tuberías de suministro para el tumor. Además de suministrar nutrientes al tumor, los mismos vasos sanguíneos embebidos en el tumor proporcionan una vía para que las células tumorales entren en circulación y realicen metástasis en sitios distantes del organismo. Folkman, 1990, J. Nati . Cáncer Inst . 82:4-6. Una actividad inapropiada de RAF puede estimular desórdenes proliferativos celulares . Las moléculas diseñadas específicamente para modular la función de la RAF proteína cinasa han demostrado que inhiben la proliferación celular. Específicamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido, las cuales se diseñan tanto para unirse ARN mensajero que codifica para la RAF proteína cinasa como el bloqueo de la traducción de ése mensaje, invierten efectivamente la transformación de células A549 in vi tro . Monia et al., 1996, Nature Medicine 2 : 688, incorporada en la presente como referencia en su totalidad incluyendo todas las figuras y tablas. Las células A549 son células malignas humanas. Estos estudios antisentido dirigidos a RAF proporcionan evidencia de que las moléculas de 5-azaquinoxalina de la invención, las cuales modulan la función de la RAF proteína cinasa, pueden sustentar y de igual manera invertir la proliferación de células malignas en un organismo. Se pueden probar estos compuestos de 5-azaquinoxalina en los métodos in vitro que se proporcionan en la presente como ejemplo. Además, los compuestos de 5-azaquinoxalina se pueden probar para determinar su efecto sobre células tumorales in vivo mediante métodos de xenoinjerto que también se proporcionan en la presente como ejemplo. Existen por lo menos dos vías en los cuales una actividad inapropiada de RAF puede estimular la proliferación de células no deseadas de un tipo de células particular: (1) estimular directamente el crecimiento de la célula particular, o (2) incrementar la vascularización de un área particular, tal como un tejido tumoral, por lo que se facilita el crecimiento del tejido. El uso de la presente invención se facilita al identificar primero si se está llevando a cabo un desorden de proliferación celular por RAF. Una vez que se identifican tales desórdenes, los pacientes que padecen de tal desorden pueden ser identificados por análisis de sus síntomas utilizando procedimientos bien conocidos por los médicos o veterinarios habitualmente expertos en la técnica. Tales pacientes pueden ser tratados después como se describe en, la presente. Al determinar si el desorden de proliferación celular es impulsado por RAF se puede llevar a cabo al determinar primero el nivel de actividad RAF que se presenta en la célula o en una posición particular en el cuerpo del paciente. Por ejemplo, en el caso de células cancerígenas, el nivel de una o más actividades de RAF se puede comparar con cánceres activados sin RAF y cánceres activados con RAF. Si las células cancerosas tienen un nivel mayor de actividad RAF en comparación con los cánceres activados por RAF, preferiblemente igual o mayor a los cánceres activados por RAF, entonces son candidatos para tratamiento utilizando métodos moduladores de RAF descritos, y los compuestos de la invención. En el caso de desórdenes proliferativos celulares que surgen debido a la proliferación no deseada de células no cancerosas, se compara el nivel de actividad de RAF con el nivel que se produce en la población en general (por ejemplo, el nivel promedio que se presenta en la población general de personas o animales excluyendo a las personas o animales que padecen de un trastorno proliferativo celular) . Si el trastorno proliferativo celular no deseado está caracterizado por un nivel mayor de RAF que el que se presenta en la población general, entonces el trastorno es un candidato para tratamiento utilizando los métodos de modulación de RAF descritos y los compuestos de la invención.

III, Composiciones farmacéuticas y administración de compuestos basados en 5-azaquinoxalina Los métodos para preparar formulaciones farmacéuticas de los compuestos, métodos para determinar las cantidades de compuestos que se van a administrar a un paciente y los modos de administrar los compuestos a un organismo se describen en la solicitud U.S. No. de Serie 08/702,232 por Tang et al., e intitulada "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", (Lyon & Lyon Expediente No. 221/187) , presentado el 23 de agosto de 1996, y la publicación de patente internacional No. WO 96/22976, por Buzzetti et al., e intitulada "Hydrosoluble 3-Arylidene-2-Oxindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors", publicado el 1 de agosto de 1996, ambas las cuales incorporan en la presente como referencia en su totalidad, incluyendo cualquier dibujo. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que tales descripciones son aplicables a la presente invención y se pueden adaptar fácilmente a la misma.

Eiemplos Los ejemplos a continuación son no limitantes y únicamente son representativos de los diversos aspectos y características de la presente invención. Los ejemplos describen métodos para sintetizar compuestos de la invención y métodos para medir un efecto de un compuesto sobre la función de la RAF proteína cinasa. Las células utilizadas en los métodos están disponibles comercialmente. Los vectores de ácido nucleico albergados por las células también están disponibles inicialmente y las secuencias de genes para las diversas proteínas cinasas son fácilmente accesibles en los bancos de datos de secuencias. Por lo tanto, una persona habitualmente experta en la técnica puede volver a crear fácilmente las líneas de células de una manera adecuada en tiempo al combinar las células disponibles comercialmente, los vectores de ácido nucleico disponibles comercialmente y los genes para proteína cinasa utilizando técnicas fácilmente disponibles para las personas habitualmente expertas en la técnica.

Ejemplo 1; Procedimiento para sintetizar compuestos basados en 5-asaguj-noyali-na qe la. igvengióii Ahora se ilustra la invención en los siguientes ejemplos no limitantes en los cuales, a menos de que se establezca de otra manera: (i) las evaporaciones se llevan a cabo por evaporación giratoria in vacuo; (ii) las operaciones se llevan a cabo bajo una atmósfera de gas inerte tal como nitrógeno; (iii) se realiza la cromatografía líquida de alta resolución (CLAP) en Merck LiChrosorb RP-18 sílice de fase inversa obtenida de E. Merck, Darmstadt, Alemania. (iv) Los rendimientos se proporcionan únicamente para ilustración y no necesariamente son el máximo obtenible,- (v) Los puntos de fusión están sin corregir y se determinan utilizando un aparato de punto de fusión digital HWS Mainz SG 2000; (vi) Las estructuras de todos los compuestos de la fórmula (I) de esta invención se confirman por espectroscopia de resonancia magnética del protón en un espectrofotómetro Brucker AMX500-NMR por microanálisis elemental y, en ciertos casos, por espectroscopia de masas; (vii) se determina la pureza de las estructuras por cromatografía en capa delgada (CCD) utilizando gel de sílice (Merck Silica Gel 60 F254) o por CLAP; y (viii) los intermediarios en general no se caracterizan completamente y se determina la pureza por cromatografía en capa delgada (CCD) o por CLAP.

Procedimientos de síntesis Compuesto A-2 : 6-bencilamino-3 , 4-hidroxifenil-5-azaquinoxalina Se prepara 4-hidroxifenilglioxal a partir de 4-hidroxiacetofenona (Lancaster, Acros) de acuerdo con el método publicado (J. Amer. Chem. Soc., 71, 1045 (1949)). Se prepara 2-amino-6-bencilamino-3-nitropiridina a partir de 2-amino-3-nitropiridina como sigue: 2-amino-6-cloro-3-nitropiridina (17.35 g, 0.10 moles), bencilamina (Fluka) (10.72 g, 0.10 moles) y carbonato de potasio pulverizado (10.4 g, 0.035 moles) en 100 ml de n-butanol se calientan bajo reflujo durante 2 horas. La suspensión se filtra y después de enfriar a temperatura ambiente, se recolecta el sólido por filtración, se lava con butanol y se seca a 50°C in vacuo para proporcionar 6-amino-6-bencilamino-3-nitropiridina (22.2 g, 91%, p.f. 145-146°C) .

Se prepara 6-bencilamino-3 , 4-hidroxifenil-5-azaquinoxalina a partir de 2-amino-6-bencilamino-3-nitropiridina como sigue: se hidrogena 2-amino-6-bencilamino-3 -nitropiridina (25 g, 0.10 moles) bajo 5.5 bar de H2 en presencia de 10 g de níquel Raney en 400 ml de dioxano a 60 °C. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente, se filtra y se agrega 4-hidroxifenilglioxal y se agita durante 2 horas bajo una atmósfera de argón. La suspensión después se diluye con agua, el sólido se recolecta por filtración, se lava con agua, se recristaliza a partir de 2-propanol y se seca in vacuo a 50°C para proporcionar 6 -bencilamino-3 - (4 -hidroxifenil ) -5 -azaquinoxalina (8 g, 24.4%, p.f. 271-273°C).

Compuesto A-l: 6-fenilamino-3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Al sustituir fenilamina en lugar de bencilamina en el procedimiento para el compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona 6-fenilamino-3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina.

Compuesto A-3: 6-metoxi-2-metil-3-fenil-5-azaquinoxalina Al sustituir 1-fenil-l, 2-propanodiona en lugar de 4-hidroxifenilglioxal y metanol en lugar de bencilamina en el procedimiento para el compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona 6-metoxi-2-metil-3-fenil-5-azaquinoxalina.

Compuesto A-4: 6-metoxi-2.3-difenil-5-azaquinoxalina Al sustituir bencilo en lugar de 4-hidroxifenilglioxal y metanol en lugar de bencilamina en el procedimiento para el compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona 6-metoxi-2, 3-difenil-5-azaquinoxalina.

Compuesto A-5: 6- (4-fluorobencilamino) -2-metil-3-fenil-5-azquingx lin Al sustituir 1-fenil-l, 2-propanodiona en lugar de 4-hidroxifenilglioxal y 4-fluorobencilamina en el procedimiento para el compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona 6- (4-fluorobencilamino) -2-metil-3-fenil-5-azaquinoxalina.

Compuesto A-6: 2 , 3-difenil-6- (4-fluorobencilamino) -5-azaquinoxalina Al sustituir bencilo en lugar de 4-hidroxifenilglioxal y 4-fluorobencilamina en lugar de bencilamina en el procedimiento para el compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona 2,3-difenil-6- (4-fluorobencilamino) -5-azaquinoxalina.

Compuesto A-7: 3-fenil-6-fenilamino-5-azaquinoxalina Al sustituir fenilglioxal en lugar de 4-hidroxifenilglioxal y anilina en lugar de bencilamina el procedimiento para el compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona 3-fenil-6-fenilamino-5-azaquinoxalina .

Compuestos A-8 - A-26 Al sustituir la bencilamina sustituida apropiada en lugar de bencilamina en el procedimiento del compuesto A-2, los procesos idénticos proporcionan los siguientes compuestos: Compuesto A-8: 6- (2-carboxibencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-9: 6- (3-carboxibencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-10: 6- (4-carboxibencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-ll: 3- (4-hidroxifenil) -6- (2-nitrobencilamino) -5-azaquinoxalina, Compuesto A-12: 3 - (4-hidroxifenil) -6- (3 -ni robencil mino) -5-azquinoxalina Compuesto A-13 : 3- (4-hidroxifenil) -6- (4-nitrobencilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-14: 3- (4-hidroxifenil) -6- (2-metilbencilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-15: 3- (4-hidroxifenil) -6- (3-metilbencilamino) -5-azaquinoxalina * Compuesto A-16: 3- (4-hidroxifenil) -6- (4-metilbencilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-17: 6- (2-clorobencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-18: 6- (3-clorobencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-19: 6- (4-clorobencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-20: 6- (2-fluorobencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-21: 6- (3-fluorobencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-22-. 6- (4-fluorobencilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-23 : 3 - (4 -hi roxif enil ) -6- [2 -(trif luorometil) bencilamino] -5 -azaquinoxalina Compuesto A-24 : 3 - ( 4 -hidroxif enil ) - 6- [3 - (trif luorometil) bencilamino] -5 -azaquinoxalina Compuesto A-25 : 3 - (4-hidroxif enil) -6- [4 - (trif luorometil) bencilamino] -5 -azaquinoxalina Compuesto A-26: 3- (4-hidroxifenil) -6-fenetil-l-amino) -5-azaquinoxalina Compuestos A-27 - A-48 Al sustituir la anilina sustituida apropiada en lugar de bencilamina en el procedimiento del compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona los siguientes compuestos : Compuesto A-27: 6- (2-carboxifenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-28: 6- (3-carboxifenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-29: 6- (4-carboxifenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-30: 3- (4-hidroxifenil) -6- (2-nitrofenilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-31: 3- (4-hidroxifenil) -6- (3-nitrofenilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-32: 3- (4-hidroxifenil) -6- (4-nitrofenilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-33: 3- (4-hidroxifenil) -6- (2-metilfenilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-34: 3- (4-hidroxifeinl) -6- (3-metilfenilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-35: 3- (4-hidroxifenil) -6- (4-metilfenilamino) -5-azaquinoxalina Compuesto A-36: 6- (2-clorofenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-37: 6- (3-clorofenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-38 : 6- (4-clorofenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-39: 6- (2-fluorofenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-40: 6- (3-fluorofenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-41: 6- (4-fluorofenilamino) -3- (4-hidroxifenil) -5-azaquinoxalina Compuesto A-42 : 3- (4-hidroxifenil) -6- [ (2-trifluorometil) -fenilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-43 : 3- (4-hidroxifenil) -6- [ (3 -trifluorometil) -fenilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-44: 3- (4-hidroxifenil) -6- [ (4-trifluorometil) -fenilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-45: 3- (4-hidroxifenil) -6- (pirid-2 -amino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-46: 3- (4-hidroxifenil) -6- (pirid-3-amino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-47: 3- (4-hidroxifenil) -6- (pirid-4-amino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-48: 3- (4-hidroxifenil) -6- (pirid-2-metilamino] -5-azaquinoxalina Compuestos A~49 - A-67 Al sustituir la bencilamina sustituida apropiada en lugar de bencilamina y fenilglioxal en lugar de 4-hidroxifenilglioxal en el procedimiento del compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona los siguientes compuestos : CompuestoA-49 : 6- (2-carboxibencilamino) -3 -fenil -5-azaquinoxalina CompuestoA-50 : 6- (3-carboxibencilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina CompuestoA-51 : 6- (4-carboxibencilamino) -3 -fenil-5 -azaquinoxalina Compuesto A-52 6- (2-nitrobencilamino-3-fenil) --5-azaquinoxalina Compuesto A-53 6- (3-nitrobencilamino) -3-fenil--5 -azaquinoxalina Compuesto A-54 6- (4-nitrobencilamino) -3 -fenil--5-azaquinoxalina Compuesto A-55 6- (2-metilbencilamino) -3-fenil--5-azaquinoxalina Compuesto A-56 6- (3-metilbencilamino) -3-fenil--5-azaquinoxalina Compuesto A-57 6- (4-metilbencilamino) -3-fenil--5-azaquinoxalina Compuesto A-58 6- (2-clorobencilamino) -3-fenil--5-azaquinoxalina Compuesto A-59 6- (3-clorobencilamino) -3-fenil-•5-azaquinoxalina Compuesto A-60 6- (4-clorobencilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-61: 6- (2-fluorobencilamino) -3 -fenil- 5-azaquinoxalina Compuesto A-62 : 6- (3-fluorobencilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-63 : 6- (4-fluorobencilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-64: 3-fenil-6- [2- (trifluorometil) bencilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-65: 3-fenil-6- [3- (trifluorometil) encilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-66: 3-fenil-6- [4- (trifluorometil) encilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-67: 3-fenil-6- (fenetil-1-amino) -5-azaquinoxalina Compuestos A-68 - A-89 Al sustituir la anilina sustituida apropiada en lugar de bencilamina y fenilglioxal en lugar de 4-hidroxifenilglioxal en el procedimiento del compuesto A-2, el proceso idéntico proporciona los siguientes compuestos: Compuesto A-68 6- (2-carboxifenilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-69 6- (3-carboxifenilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-70 6- (4-carboxifenilamino) -3 -fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-71 6- (2-nitrofenilamino) -3--fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-72 6- (3-nitrofenilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-73 6- (4-nitrofenilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-74 6- (2-metilfenilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-75 6- (3-metilfenilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-76: 6- ( -metilfenilamino) -3 -fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-77: 6- (2 -clorofenilamino) -3 -fenil-5 -azaquinoxalina Compuesto A-78: 6- (3 -clorofenilamino) -3-fenil-5 -azaquinoxalina Compuesto A-79: 6- (4-clorofenilamino) -3-fenil -5-azaquinoxalina Compuesto A-80: 6- (2-fluorofenilamino) -3-fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-81: 6- (3 -fluorofenilamino) -3 -fenil-5-azaquinoxalina Compuesto A-82: 6- (4-fluorofenilamino) -3 -fenil-5 -azaquinoxalina Compuesto A-83: 3-fenil-6- [ (2 -trifluorometil) fenilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-84: 3-fenil-6- [ (3-trifluorometil) fenilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-85: 3-fenil-6- [ (4-trifluorometil) fenilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A- 86 3-fenil-6- (pirid-2 -amino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-87 3-fenil-6- (pirid-3 -amino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-88 3-fenil-6- (pirid-4-amino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-89 3-fenil-6- (pirid-2-metilamino] -5-azaquinoxalina Compuesto A-90: 6-fenilamino-3- (4-metoxifenil) -5 -azaquinoxalina Al sustituir 4-metoxifenilo en lugar de 4-hidroxifenilo en el procedimiento para el compuesto A-l, el proceso idéntico proporciona 6-fenilamino-3- (4-metoxifenil) -5-azaquinoxalina.

Ejemplo 2: Ensayo que mide la función de fosforilación de RAF Al seguir los informes de ensayo, la cantidad de fosforilación catalizada por RAF de su proteína objetivo MEK así co o el objetivo de MEK, MAPK. La secuencia del gen para RAF se describe en Bonner et al., 1985, Molec. Cell . Biol . 5:1400-1407 , y es fácilmente accesible en bancos de datos de secuencia de gen múltiples. La construcción del vector de ácido nucleico y las líneas de células utilizadas para esta porción de la invención se describen completamente en Morrison et al., 1988, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 85 : 8855-8859.

Materiales y reactivos 1. Células Sf9 (Spodoptera frugiperda) ; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD. 2. Amortiguador RIPA: Tris/HCl 20 mM pH 7.4, NaCl 137 mM, glicerol 10%, PMSF 1 mM, 5 mg/l de aprotenina, Tritón X- 100 0.5%; 3. Proteína de fusión de tiorredoxina-MEK (T-MEK) : expresión y purificación de T-MEK por cromatografía de afinidad que se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Catálogo # K 350-01 y R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA 4. His-MAPK (ERK 2); MAPK marcado con His que se expresa en células XLl Blue transformadas con el vector pUCld que codifica para His-MAPK. Se purifica His-MAPK por cromatografía de afinidad Ni. Cat# 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, como se describe en la presente. 5. IgG de chivo contra ratón,- (West Grove, PA. Catalog, # 515-006-008, Lote# 28563. 6. Anticuerpo específico para RAF-1 proteína cinasa: URP2653 de UBI. 7. Amortiguador de recubrimiento: PBS; solución salina amortiguada con fosfato, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD. 8. Amortiguador de lavado: TBST - Tris/HCl 50 mM, pH 7.2, NaCl 150 mM, Tritón X-100 0.1%. 9. Amortiguador de bloqueo: TBST, etanolamina 0.1%, pH 7.4. 10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO. 11. Amortiguador de cinasa (KB) : Hepes/HCl 20 mM pH 7.2, NaCL 150 mM, Tritón X-100 0.1%, PMSF 1 mM, 5 mg/l de aprotenina, ortovanadato de sodio 75 µM, DTT 0.5 mM y MgCl210 mM. 12. Mezcla ATP: MgCl2100 mM, ATP 300 µM, 10 µCi de ?"P ATP (Dupont-NEN) /ml . 13. Solución de detención: ácido fosfórico 1%; Fisher, Pittsburgh, PA. 14. Almohadillas de filtro de fosfato de celulosa Wallac, Turku, Finlandia.

. Solución de lavado de filtro: ácido fosfórico 1%, Fisher, Pittsburgh, PA. 16. Cosechador de placa Tomtec, Wallac, Turku, Finlandia. 17. Lector de placa beta Wallac # 1205, Wallac, Turku, Finlandia. 18. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 pozos NUNC para compuestos y Applied Scientific Catálogo # AS-72092.

Procedimiento La totalidad de las siguientes etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. 1. Recubrimiento de la placa ELISA: se recubrieron pozos ELISA con 100 µl de antisuero de chivo contra ratón purificado por afinidad (1 µg/100 µl de amortiguador de recubrimiento) durante la noche a 4°C. Se utilizaron placas de ELISA durante dos semanas y luego se almacenaron a 4°C. 2. Se invierte la placa y se elimina el líquido. Se agregan 100 µl de solución de bloqueo y se incuban durante min. 3. Se remueve la solución de bloqueo y se lava cuatro veces con amortiguador de lavado . Se seca la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido. 4. Se agregan 1 µg de anticuerpo específico para RAF-1 a cada pozo y se incuba durante 1 hora. Se realiza el lavado como se describe en la etapa 3. 5. Se recalientan los lisados de células Sf9 infectadas con RAS/RAF y se diluyen con TBST a 10 µg/100 µl . Se agregan 10 µg de lisado diluido a los pozos y se incuba durante 1 hora. Se agita la placa durante la incubación. Los controles negativos no reciben lisado. Los lisados de células de insecto Sf9 infectadas con RAS/RAF se preparan después de que las células se infectan con baculovirus recombinante a una MOI de 5 por cada virus, y se cosechan 48 horas después. Las células se lavan una vez con PBS y se lisan en amortiguador RIPA. El material insoluble se remueve por centrifugación (5 min a 10 000 x g) . Las alícuotas de los lisados se congelan en hielo seco/etanol y se almacenan a -80°C hasta su uso. 6. Remoción del material no unido y lavado como se indica antes (etapa 3) . 7. Se agregan 2 µg de T-MEK y 2 µg de His-MAEPK por pozo y se ajusta el volumen a 40 µl con amortiguador cinasa. Los métodos para purificar T-MEK y MAPK de extractos celulares se proporcionan en la presente como ejemplo. 8. Los compuestos prediluidos (solución concentrada 10 mg/ml de DMSO) o extractos 20 veces en TBST más DMSO 1%. Se agregan 5 µl de los compuestos prediluidos/extractos a los pozos que se describen en la etapa 6. Se incuba durante 20 min. Los controles no reciben medicamento. 9. Se comienza la reacción de cinasa por adición de 5 µl de la mezcla ATP; se agitan las placas en un agitador de placa ELISA durante la incubación. 10. Se detiene la reacción de cinasa después de 60 min por adición de 30 µl de solución de detención a cada pozo. 11. Se coloca la almohadilla de fosfocelulosa y la placa de ELISA en un cosechador de placa Tomtec. El cosechado y el lavado se filtra con la solución de lavado de filtro de acuerdo con la recomendación del fabricante . Se secan las almohadillas de filtro. Se sellan las almohadillas de filtro y se colocan en un soporte. Se inserta el soporte en un aparato de detección radioactivo y se cuantifica el fósforo radioactivo en las almohadillas de filtro. Alternativamente, se pueden transferir alícuotas de 40 µl de pozos individuales de la placa de ensayo a las posiciones correspondientes de la almohadilla de filtro de fosfocelulosa. Después de secar al aire a los filtros, se colocan los filtros en una charola. Se agita suavemente la charola, cambiando la solución de lavado a intervalos de 15 min durante l hora. Se secan al aire las almohadillas de filtro. Se sellan las almohadillas de filtro y se colocan en un soporte adecuado para lectura del fósforo radioactivo en las muestras. Se inserta el soporte en un dispositivo de detección y se cuantifica el fósforo radioactivo sobre las almohadillas de filtro. Se miden los valores CIS0 de acuerdo con el protocolo para los siguientes compuestos basados en 5-azaquinoxalina en el ensayo RAF-1 ELISA: (A-l) (A-2) (A-7) (A-36) (A-77) (A-90) Un valor CIS0 es la concentración del inhibidor basado en 5-azaquinoxalina necesario para disminuir la cantidad máxima de proteína objetivo fosforilada o crecimiento celular en 50%.

Los valores CI50 se miden en el ensayo de fosforilación de RAF-l y se muestran en la Tabla 1: TABLA 1 Ejemplo 3: Purificación de Mapk y Mek Las proteínas MAPK y MEK se expresan fácilmente en células por subclonación de un gen que codifica para estas proteínas dentro del vector disponible comercialmente que expresa las proteínas con una etiqueta poli-histidina. Los genes que codifican para estas proteínas están disponibles fácilmente de laboratorios que normalmente trabajan con estas proteínas o por clonación de estos genes a partir de células que contienen bibliotecas de ADNc. Las bibliotecas están disponibles comercialmente con facilidad y una persona experta en la técnica puede diseñar fácilmente sondas de ácido nucleico homologas a las moléculas de ADNc que codifiquen para MEK o MAPK a partir de las secuencias de ácido nucleico de MEK y MAPK, disponibles en bases de datos de genes múltiples tales como Genbank. La clonación de un gen se puede llevar a cabo en un período de tiempo breve utilizando técnicas disponibles actualmente para personas expertas en la técnica. La purificación de MEK y MAPK de extractos celulares se puede llevar a cabo utilizando el siguiente protocolo, el cual se adapta de Robbins et al., 1993, J. Biol . Chem. 268 : 5097-5106: 1. Se lisan las células por sonicación, tensión osmótica o técnicas de presión French disopnibles fácilmente para las personas expertas en la técnica. Un amortiguador de sonicación apropiado se proporciona a continuación. 2. Se equilibra un soporte sólido el cual se conjuga con níquel o cobalto con el amortiguador de equilibrio descrito a continuación. La etiqueta de poli-histidina se une específicamente a los átomos de níquel y cobalto en el soporte sólido. El equilibrio se puede obtener por lavado de la resina tres veces con un volumen del amortiguador de equilibrio igual a diez veces el volumen del soporte sólido. El soporte sólido está disponible fácilmente para las personas habitualmente expertas en la técnica. 3. Agregar el lisado celular al soporte sólido y equilibrar en un recipiente durante cierto período de tiempo. Alternativamente, el soporte sólido se puede empacar dentro de una columna de cromatografía de proteína y se puede hacer fluir el lisado a través del soporte sólido. 4. Lavar el soporte sólido con el amortiguador de lavado descrito antes . 5. Eluir la proteína MEK o MAPK del soporte sólido con una cantidad de amortiguador de elución (proporcionado abajo) que remueve una porción significativa de la proteína del soporte sólido.

Amortiguador de sonicación Fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0 Cloruro de sodio 0.3 M ß-mercaptoetanol 10 mM NP40 1% NaF 10 mM Pefablock 0.5 mM Amortiguador de equilibrio Fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0 Cloruro de sodio »0.3 M ß-mercaptoetanol 10 mM NP40 1% NaF 10 mM Imidazol 1 mM Amortiguador de lavado Fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0 Cloruro de sodio 0.3 M ß-mercaptoetanol 10 mM NP40 1% NaF 10 mM Imidazol 10 mM Amortiguador de elución Fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0 Cloruro de sodio 0.3. M ß-mercaptoetanol 10 mM NP40 1% NaF 10 mM Imidazol 10 -500 mM Ejemplo 4: Ensayo que mide la función de fosforilación del rceptor de EGF Se mide la actividad de cinasa del receptor de EGF (ensayo EGFR-NIH3T3) en células completas, como se describe con detalle en la publicación PCT WO 9640116, presentada el 5 de junio de 1996, por Tang et al., e intitulada "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease", incorporada en la presente como referencia en su totalidad, incluyendo cualquier dibujo. En la Tabla 2 se muestran los valores CIS0 medidos en el ensayo de fosforilación de receptor de EGF: TABLA 2 Ejemplo 5: Ensayo que mide el efecto de compuestos basados en 5-aza uinoxalina en el crecimiento de células que expresan RAS El siguiente ensayo mide las velocidades de crecimiento de células NIH-3T3 que expresan RAS. El propósito del ensayo es determinar los efectos de los compuestos en el crecimiento de células NIH 3T3 que sobreexpresan H-Ras .

Materiales Placas estériles de fondo plano de 96 pozos Placas estériles de fondo redondo de 96 pozos Recipientes estériles de 25 ml ó 100 ml Pipetas, pipetman de canal múltiple Puntas de pipeta estériles Tubos estériles de 15 ml y 50 ml Reactivos SRB 0.4% en ácido acético 1% Base Tris 10 mM TCA 10% Ácido acético 1% DMSO estéril (Sigma) Compuesto en DMSO (100 mM o menos de la solución concentrada) Tri sina-EDTA (GIBCO BRL) Linea celular 3T3/H-Ras (Células NIH 3T3 , clona 7, que expresan el fragmento genómico de H-Ras oncogénico) . Las células se pueden construir utilizando el siguiente protocolo: 1. Se subclona un fragmento de gen que codifica para Ras dentro de un vector disponible comercialmente que transfectará de manera estable células NIH-3T3. El fragmento es del alelo transformante genómico de cHa-ras. 2. Se transfectan células NIH-3T3 con el vector subclonado mediante un método de fosfato de calcio. Se seleccionan las células que expresan el constructo Ras en suero en 2% en DMEM. Se observan focos visibles después de 2 semanas. Se acumulan las células transformadas para generar una línea celular transformada de manera estable.

Medio de crecimiento: Suero bovino 2%/DMEM + glutamina 2 mM, Pen/Strep Protocolo: Día 0 : Siembra en placa de células : Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. Tripsinización de las células. Se transfieren 200 µl de la suspensión celular a 10 ml de isotono. Se realizan las cuentas celulares con un Coulter Counter. 2. Se diluyen las células en medio de crecimiento a 60,000 células/ml. Se transfieren 100 µl de las células a cada pozo en una placa de fondo plano de 96 pozos para proporcionar 6000 células/pozo. 3. Se utiliza la mitad de la placa (4 hileras) para cada compuesto y pozos por cuadruplicado para cada concentración de compuesto, y un conjunto de 4 pozos para el medio control. 4. Se agitan suavemente las placas para permitir unión uniforme de las células. 5. Se incuban las placas a 37°C en un incubador de C02 10%. pía i ; Adición <a$? com uesto; Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. En una placa de fondo redondo de 96 pozos, se agregan 120 µl de medio de crecimiento que contiene 2X final de DMSO % encontrado con la concentración de análisis más elevada del compuesto para las columnas 1 a 11. Por ejemplo, si la concentración más elevada es de 100 µl, y esta se elabora a partir de un concentrado de 100 mM, IX DMSO es 0.1%, de manera que 2X DMSO es 0.2%. Se utiliza esta placa para titular el compuesto, 4 hileras por compuesto. 2. En un tubo estéril de 15 ml, se elabora una solución 2X de la concentración de análisis más elevada del compuesto y medio de crecimiento más 2X DMSO. Se necesitan 1 ml por línea celular. La concentración inicial del compuesto habitualmente es 100 µm, pero esta concentración puede variar en base en la solubilidad del compuesto. 3. Se transfieren 240 µl de la solución del compuesto inicial 2X para cuadruplicar los pozos en la columna 12 de la placa de fondo redondo de 96 "pozos. Se hacen diluciones seriadas 1:2 a través de la placa desde la derecha a la izquierda al transferir 12 µl de la columna 12 a la columna 11, de la columna a la 10 y así sucesivamente hasta la columna 2. Se transfieren 100 µl de las diluciones del compuesto, y 100 µl del medio en la columna 1, sobre 100 µl de medio en células en los pozos correspondientes de la placa de fondo plano de 96 pozos. El volumen total por pozo debe ser de 200 µl. 4. Se regresa la placa al incubador y se incuba durante 3 días.

Día 4: Desarrollo del ensayo Esta parte del ensayo se lleva a cabo en un gabinete . 1. Se aspira o se elimina el medio. Se agregan 200 µl de TCA 10% frío a cada pozo para fijar las células. Se incuba la placa durante por lo menos 60 min, a 4°C. 2. Se desecha TCA y se enjuagan los pozos 5 veces con agua corriente. Las placas se secan volteadas alrevés sobre toallas de papel . 3. Se tiñen las células con 100 µl/pozo de SRB 0.4% durante 10 mi . 4. Se elimina SRB y se enjuagan los pozos 5 veces con ácido acético 1%. Las placas secas se voltean alrevés por completo sobre toallas de papel . 5. Se solubiliza el colorante con 100 µl/pozo de base Tris 10 mM durante 5-10 min en un agitador. 6. Se leen las placas en un lector de placas Dynatech ELISA a 570 nm con referencia a 630 nm. Los compuestos seleccionados inhiben la tasa de crecimento de las células que sobreexpresan RAS, como se ilustra en la Tabla 3.

TABLA 3 Ejemplo 6: Ensayo que mide el efecto de compuestos basados en 5-azaquinoxalina en el crecimiento de células A549 El siguiente ensayo mide las tasas de crecimiento para células A549. El propósito del ensayo es determinar los efectos de los compuestos en el crecimiento de células de carcinoma pulmonar humana A549. Las células A549 están disponibles fácilmente de fuentes comerciales, tales como ATCC (CCL185) .

Materiales: Placas estériles de fondo plano de 96 pozos Placas estériles de fondo redondo de 96 pozos Recipientes estériles de 25 ml o 100 ml Pipetas, pipetman de canal múltiple Puntas de pipeta estériles Tubos estériles de 15 ml y 50 ml Reactivos SRB 0.4% en ácido acético 1% Base Tris 10 mM TCA 10% Ácido acético 1% DMSO estéril (Sigma) Compuesto en DMSO (100 mM o menos de la solución concentrada) Tripsina-EDTA (GIBCO BRL) Línea celular y medio de crecimiento: Células de carcinoma de pulmón humano A549 (ATCC CCL185) Suero bovino fetal 10% en F12-K de Ham Protocolo: Día 0: colocación en placa de las células: Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. Se tripsinizan las células. Se transfieren 200 µl de la suspensión celular a 10 ml de solución isotónica. Se realizan las cuentas celulares con un Coulter Counter 2. Se diluyen las células en medio de crecimiento hasta 20,000 células/ml. Se transfieren 100 µl de células a cada pozo en una placa de fondo plano de 96 pozos para proporcionar 2000 células/pozo. 3. El uso de la mitad de la placa (4 hileras) de cada compuesto y los pozos por cuadruplicado para cada concentración de compuesto, y un conjunto de 4 pozos para el medio control. 4. Se agitan suavemente las placas para permitir unión uniforme de las células . 5. Se incuban las placas a 37 °C en un incubador de C02 %.

Día 1: Adición del compuesto: Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. En una placa de fondo redondo de 96 pozos, se agregan 120 µl de medio de crecimiento que contiene 2X final de DMSO % que se encuentra en la concentración de análisis más elevada del compuesto para las columnas 1 a 11. Por ejemplo, si la concentración de análisis más elevada es 100 µM, y esta se elabora a partir de una concentración 100 mM, IX DMSO es 0.1%, de manera que 2X DMSO es 0.2%. Esta placa se utiliza para titular el compuesto, 4 hileras por compuesto. 2. En un tubo estéril de 15 ml, se elabora una solución 2X de la concentración de análisis más elevada del compuesto en medio de crecimiento más 2X DMSO. Se necesita 1 ml por línea celular. La concentración inicial del compuesto habitualmente es de 100 µM, pero esta concentración puede variar dependiendo de la solubilidad del compuesto. 3. Se transfieren 240 µl de la solución del compuesto inicial 2X a pozos cuadruplicados en la columna 12 de la placa de fondo redondo de 96 pozos. Se hacen diluciones seriadas 1:2 a través de la placa desde la derecha a la izquierda al transferir 120 µl desde la columna 12 a la columna 11, de la columna 11 a la 10, y así sucesivamente hasta la columna 2. La transferencia de 100 µl de las diluciones de compuesto y 100 µl del medio en la columna 1, en 100 µl de medio en células en los pozos correspondientes de la placa de fondo plano de 96 pozos. El volumen total por pozo debe ser de 200 µl . 4. Se regresa la placa al incubador y se incuba durante 3 días .

Dia 5: Desarrollo del ensavo Esta parte del ensayo se lleva a cabo en el gabinete. 1. Se aspira o se elimina por vertido el medio. Se agregan 200 µl de TCA 10% frío a cada pozo para fijar las células. La placa se incuba durante por lo menos 60 min a 4°C. 2. Se desecha TCA y se enjuagan los pozos 5 veces con agua corriente. Se secan las placas volteándolas alrevés sobre toallas de papel . 3. Se tiñen las células con 100 µl/pozo de SRB 0.4% durante 10 min. 4. Se elimina por vertido SRB y se enjuagan los pozos 5 veces con ácido acético 1%. Se secan las placas completamente volteándolas al revés sobre toallas de papel . 5. Se solubiliza colorante con 100 µl/pozo de base Tris 10 mM durante 5-10 min, en un agitador. 6. Se leen las placas en un lector de placas Dynatech ELISA a 570 nm con referencia a 630 nm. Se seleccionan los compuestos que inhiben las velocidades de crecimiento de las células A549 como se ilustra en la Tabla 4.

TABLA 4 Ejemplo 7: Método para determinar la actividad biológica de moduladores RAF in vivo Se pueden utilizar estudios de xenoinjerto para monitorear el efecto de los compuestos de la invención sobre la inhibición de células tumorales de ovario, de melanoma, de próstata, pulmón y tumor mamario. El protocolo para el ensayo se describe con detalle en la publicación PCT WO9640116, presentada el 5 de junio de 1996 por Tang et al., e intitulada "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease", incorporada en la presente como referencia en su totalidad, incluyendo los dibujos. La invención se describe de manera ilustrativa en la presente se puede llevar a la práctica en ausencia de algún elemento o elementos, limitación o limitaciones las cuales no se describen específicamente en este documento. Los términos y expresiones los cuales han han sido utilizados son los que se utilizan como términos de descripción y no como limitación, y no hay intención de que en el uso de tales términos y expresiones se excluya algún equivalente de las características que se muestran y describen o porciones de las mismas, sino que se debe reconocer que las diversas modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención como se reivindica. Por lo tanto, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicamente por modalidades preferidas y características opcionales, se pueden realizar modificaciones y variaciones a los conceptos que se describen aquí por aquéllos expertos en la técnica y que tales modificaciones y variaciones se consideran que están dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas . Todas las referencias no incorporadas previamente en la presente como referencia, incluyendo tanto las referencias de patente como las que no son de patente, se incorporan expresamente como referencias en este documento para todos los propósitos. Las otras modalidades están dentro de las siguientes reivindicaciones .

Claims (40)

REIVINDICACIONES

1. Un método para modular la función de una serina/treonina proteína cinasa con un compuesto basado en 5-azaquinoxalina, que comprende la etapa de poner en contacto células que expresan serina/treonina proteína cinasa con el compuesto.

2. El método como se describe en la reivindicación 1, en el que serina/treonina proteína cinasa es RAF.

3. Un método para identificar compuestos que modulan la función de serina/treonina proteína cinasa, que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto células que expresan serina/treonina proteína cinasa con el compuesto; y (b) monitorear el " efecto sobre las células .

4. El método como se describe en la reivindicación 3, en el que el efecto es un cambio o una ausencia de un cambio en el fenotipo celular.

5. El método como se describe en la reivindicación 3 , en el que el efecto es un cambio o una ausencia de un cambio en la proliferación celular.

6. El método como se describe en la reivindicación 3, en el que el efecto es un cambio o ausencia de un cambio en la actividad catalítica de la serina/treonina proteína cinasa.

7. El método como se describe en la reivindicación 3 , en el que el efecto es un cambio o ausencia de un cambio en la interacción entre serina/treonina proteína cinasa con un asociado de unión natural, como se describe aquí.

8. El método como se describe en la reivindicación 3, que comprende las siguientes etapas : (a) lisar las células para obtener un lisado que comprende serina/treonina proteína cinasa; (b) adsorber la serina/treonina proteína cinasa a un anticuerpo; (c) incubar la serina/treonina proteína cinasa adsorbida con un sustrato o sustratos; y (d) adsorber el sustrato o sustratos a un soporte sólido o anticuerpo; en donde la etapa de monitoreo del efecto en las células comprende medir la concentración de fosfato del sustrato o sustratos .

9. El método como se describe en la reivindicación 3, en el que serina/treonina proteína cinasa es RAF y comprende las siguientes etapas: (a) lisar las células para obtener un lisado que comprende RAF; (b) adsorber RAF a un anticuerpo; (c) incubar RAF adsorbido con MEK y MAPK; y (d) adsorber MEK o MAPK a un soporte sólido o anticuerpo o anticuerpos; en donde la etapa de medir el efecto de las células comprende monitorear la concentración de fosfato de MEK y MAPK.

10. El método como se describe en la reivindicación 1, en el que el compuesto basado en 5-azaquinoxalina tiene la fórmula que se establece en la estructura I : (I) en donde (a) Rlf R2, R3, R4 y R 6, se seleccionan independientemente del grupo que consiste de (i) hidrógeno,- (ii) alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde la porción de anillo está opcionalmente sustituida con uno, dos, o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; (iii) una amina de fórmula NX2X3, en donde X2 y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, y porciones arilo de cinco miembros o seis miembros o anillo heteroarilo; (iv) halógeno o trialometilo; (v) una cetona de fórmula -CO-X4, en donde X4 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; (vi) un ácido carboxílico de fórmula -(Xs)n-C00H o éster de fórmula - (X6)n-COO-X7, en donde X5, X6 y X7 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros y en donde n es 0 ó 1; (vii) un alcohol de fórmula (Xß)n-0H o una porción de fórmula - (Xß)n-0-X9, en donde Xß y X9 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o de seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en donde n es 0 ó 1; (viii) una amida de fórmula -NHCOX10, en donde X10 se selecciona del grupo que consiste de alquilo, hidroxilo, y una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster; (ix) -S03NX.11X.12 , en donde XX1 y X12 se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros ,- (x) una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; (xi) un aldehido de fórmula -CO-H; y (xii) una sulfona de fórmula -S02-X13, en donde X13 se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; y (b) Xx se selecciona del grupo que consiste de nitrógeno, azufre y oxígeno.

11. El método como se describe en la reivindicación 10, en el que Rlf R2, R3, R4 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: (i) hidrógeno; (ii) alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde la porción de anillo está opcionalmente sustituida con uno, dos, o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y és er; (iii) una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster.

12. El método como se describe en la reivindicación 11, en donde Rx y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: (i) hidrógeno; y (ii) fenilo opcionalmente sustituido con el sustituyente que se selecciona del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, nitro, carboxilato, hidroxi y alcoxi .

13. El método como se describe en la reivindicación 12, en el que Xx es nitrógeno u oxígeno.

14. El método como se describe en la reivindicación 13, en el que los sustituyentes X6 y Xlr tomados juntos, forman una porción que se seleccionan del grupo que consiste de sustituyentes SAQAR, como se define en la presente.

15. El método como se describe en la reivindicación 14, en el que el compuesto basado en 5-azaquinoxalina se selecciona del grupo que consiste de compuestos SAQAR, como se definen en la presente.

16. Un método para prevenir o tratar una condición anormal en un organismo, que comprende la etapa de administrar un compuesto basado en 5-azaquinoxalina de fórmula I al organismo: (I) en donde (a) Rt, R2, R3, R4 y .Rs se seleccionan independientemente del grupo que consiste de (i) hidrógeno; (ii) alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde la porción de anillo está opcionalmente sustituida con uno, dos, o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; (iii) una amina de fórmula NX2X3, en donde X2 y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, y porciones arilo de cinco miembros o seis miembros o anillo heteroarilo; (iv) halógeno o trialometilo; (v) una cetona de fórmula -C0-X4, en donde X4 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros,- (vi) un ácido carboxílico de fórmula -(Xs)n-C00H o éster de fórmula - (X6)n-C00-X7, en donde Xs, Xs y X7 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros y en donde n es 0 ó 1; (vii) un alcohol de fórmula (X„)n-0H o una porción de fórmula -(Xß)n-0-X9, en donde Xß y X, se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o de seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en donde n es 0 ó 1; (viii) una amida de fórmula -NHCOX10, en donde X10 se selecciona del grupo que consiste de alquilo, hidroxilo, y una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster; (ix) -S02NX1:LX12, en donde XX1 y X12 se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; (x) una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster,- (xi) un aldehido de fórmula -CO-H; y (xii) una sulfona de fórmula -S02-X13, en donde X13 se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; y (b) Xx se selecciona del grupo que consiste de nitrógeno, azufre y oxígeno.

17. El método como se describe en la reivindicación 16, en el que Rl t R2, R3, R4 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: (i) hidrógeno ; (ii) alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde la porción de anillo está opcionalmente sustituida con uno, dos, o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster; y (iii) una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster.

18. El método como se describe en la reivindicación 17, en el que Rx y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: (i) metilo opcionalmente sustituido con fenilo opcionalmente sustituido con un sustituyente que se selecciona del grupo ue consiste de porciones alquilo, halógeno, hidroxi y alcoxi; y (ii) fenilo opcionalmente sustituido con sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, hidroxi y alcoxi.

19. El método como se describe en la reivindicación 18, en el que Xx es nitrógeno u oxígeno.

20. El método como se describe en la reivindicación 19, en el que los sustituyentes Rß y Xlf tomados juntos, forman una porción que se selecciona del grupo que consiste de sustituyentes SAQAR, como se define en la presente.

21. El método como se describe en la reivindicación 20, en el que el compuesto basado en 5-azaquinoxalina se selecciona del grupo que consiste de compuestos SAQAR, como se define en la presente.

22. El método como se describe en la reivindicación 16, en el que el organismo es un mamífero.

23. El método como se describe en la reivindicación 16, en el que la condición anormal es cáncer o un desorden fibrótico.

24. El método como se describe en la reivindicación 23, en el que la condición anormal es un cáncer que se selecciona del grupo que consiste de cáncer pulmonar, cáncer ovárico, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer cerebral intraaxial, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma y glioma.

25. El método como se describe en la reivindicación 16, en el que la condición anormal se asocia con una aberración en una vía de transducción de señal caracterizada por una interacción entre una serina/treonina proteína cinasa y un asociado de unión natural .

26. El método como se describe en la reivindicación 25, en el que la serina/treonina proteína cinasa es RAF.

27. Un compuesto basado en 5-azaquinoxalina, que tiene una estructura como se establece en la fórmula I : (I) en donde (a) Rí t Ra, R3, R4 y Rß se seleccionan independientemente del grupo que consiste de (i) hidrógeno; (ii) alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde la porción de anillo está opcionalmente sustituida con uno, dos, o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; (iii) una amina de fórmula NX2X3, en donde X2 y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros . (iv) halógeno o trialometilo; (v) una cetona de fórmula -C0-X4, en donde X4 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros,- (vi) un ácido carboxílico de fórmula -(X n-COOH o éster de fórmula - (X6) n-COO-X7, en donde Xs, Xß y X7 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros y en donde n es 0 ó 1; (vii) un alcohol de fórmula (Xß)n-OH o una porción de fórmula -(X8)n-0-X9, en donde X8 y X9 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o de seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en donde n es 0 ó 1; (viii) una amida de fórmula -NHCOX10, en donde X10 se selecciona del grupo que consiste de alquilo, hidroxilo, y una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster; (ix) -S02NX?:X12, en donde XX1 y X12 se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y porciones de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; (x) una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; (xi) un aldehido de fórmula -CO-H; y (xii) una sulfona de fórmula -S02-X13, en donde X13 se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado o insaturado y porciones arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros; y (b) Xx se selecciona del grupo que consiste de nitrógeno, azufre y oxígeno.

28. El método como se describe en la reivindicación 27, en el que Rlf R2, R3, R4 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: (i) hidrógeno,- (ii) alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, en donde la porción de anillo está opcionalmente sustituida con uno, dos, o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster; y (iii) una porción de anillo arilo o heteroarilo de cinco miembros o seis miembros, opcionalmente sustituida con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster.

29. El compuesto como se describe en la reivindicación 28, en el que R3 y R4 son hidrógeno.

30. El compuesto como se describe en la reivindicación 29, en el que Rx y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: (i) metilo opcionalmente sustituido con fenilo opcionalmente sustituido con un sustituyente que se selecciona del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, hidroxi y alcoxi; y (ii) fenilo opcionalmente sustituido con sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de porciones alquilo, halógeno, hidroxi y alcoxi.

31. El compuesto como se describe en la reivindicación 29, en el que Rx y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, metilo, fenilo y 4-hidroxifenilo.

32. El compuesto como se describe en la reivindicación 30, en el que Xx es nitrógeno u oxígeno.

33. El compuesto como se describe en la reivindicación 32, en el que los sustituyentes Rß y Xx, tomados juntos, forman una porción que se selecciona del grupo que consiste de sustituyentes SAQAR, como se define en la presente.

34. El método como se describe en la reivindicación 33, en el que el compuesto basado en 5-azaquinoxalina se selecciona del grupo que consiste de compuestos SAQAR, como se define en la presente.

35. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de 5-azaquinoxalina de cualquiera de las reivindicaciones 26-33 o una sal del mismo, y un portador o diluyente fisiológicamente aceptable.

36. Un método para sintetizar un compuesto como se describe en la reivindicación 27, que comprende las etapas de: (a) hacer reaccionar un primer reactivo con un segundo reactivo en un solvente y en presencia de una base, en donde el primer reactivo es 2-amino-6-cloro-3-nitropiridina y en donde el segundo reactivo es un alcohol o una amina, lo que proporciona un primer intermediario; (b) hacer reaccionar el primer intermediario con un tercer reactivo, en presencia de un catalizador, y un agente reductor, en donde el tercer reactivo es 1,2-diona; y (c) purificar el compuesto de la reivindicación 27.

37. El método como se describe en la reivindicación 36, en el que el segundo reactivo se selecciona de grupos que consiste de reactivos SAQAR, como se define en la presente .

38. El método como se describe en la reivindicación 36, en el que el tercer reactivo se selecciona del grupo que consiste de 4-hidroxifenilglioxal, l-fenil-1,2-propanodiona y bencilo.

39. El método como se describe en la reivindicación 36, en el que el agente reductor es hidrógeno.

40. El método como se describe en la reivindicación 36, en el que el catalizador es níquel Raney.