MXPA00001353A - Materiales y metodos para el control de plagas de homopteros - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con materiales y métodos para el control de plagas de animales no mamíferos;en modalidades específicas, la presente invención se relaciona con materiales y métodosútiles en el control de insectos del orden Homoptera;más específicamente, la presente invención presenta novedosos aislados o cepas, toxinas y genes codificadores de toxinas y genes codificadores de toxinas de Bacillus thuringlensis (B.t) que sonútiles para el control de homópteros;las cepas HD969, PS66D3 y PS50C están específicamente ejemplificadas en la presente por producir mortalidad contra homópteros;en una modalidad preferida, las plagas blanco son seleccionadas entre el grupo que consiste en cigarras de las hojas y cigarras de las plantas.

Description

MATERIALES Y MÉTODOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS DE HOMOPTEROS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El microbio del suelo Bacillus thuringiensis {B.t.) es una bacteria Gram positiva formadora de esporas que se caracteriza por sus inclusiones proteicas cristalinas. Estas inclusiones frecuentemente aparecen microscópicamente como cristales de formas distintivas. Las proteínas pueden ser sumamente tóxicas para las plagas y específicas en su actividad tóxica. Ciertos genes de toxinas de B.t. han sido aislados y secuenciados, y se han producido y aprobado para su uso productos de B.t. basados en ADN recombinante. Además, con el uso de técnicas de ingeniería genética, se están desarrollando nuevos enfoques para administrar toxinas de B.t. a ambientes agrícolas, incluyendo el uso de plantas genéticamente manipuladas con genes de endotoxinas para la resistencia los insectos y el uso de células microbianas intactas estabilizadas como vehículos para transportar la toxina de B.t. (Gaerther, F.H., L. Kim [1988] TIBTECH 6: S4-S7; Beegle, C.C., T. Yamamoto, "History of Bacillus thuringiensis Berliner research and development" Can. Ent. 124: 587-616). Por consiguiente, los genes de toxinas de B.t. aislados tienen cada vez mayor valor comercial. Hasta hace muy poco, el uso comercial de pesticidas de B.t. se ha restringido en gran parte a un estrecho rango de plagas de lepidópteros (orugas). Por mucho años se han utilizado preparaciones de las esporas y cristales de B. Thuringiensis subesp. Kurstaki como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, la variedad kurstaki HD-1 de B. Thuringiensis produce una d-endotoxina cristalina que es tóxica para las larvas de una cantidad de insectos lepidópteros. Los investigadores han descubierto últimamente pesticidas de B.t. con especificidad para un rango más amplio de plagas. Por ejemplo, se han utilizado otras especies de ß.í. por ejemplo israelensis y morrísoni (también conocidas como tenebrionis, también conocidas como B.t. M-7, también conocida como B.t. san diego) para combatir insectos de los órdenes Dípteros y Coleópteros, respectivamente (Gaertner, F.H. [1989] "Cellular Delivery Systems for insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms" en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins edit. Taylor y Francis, Nueva York y Londres, 1990, pág. 245-255). Véase también Couch, T.L. (1980) "Mosquito Pathogenecity of Bacillus thuringiensis var. Israelensis" Developments in Industrial Microbiology 22:61 -76: y Beegle, C.C. (1978) "Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems". Developments in Industrial Microbiology 20:97 - 104. Krieg, A., A.M. Huger, G.A. Langenbruch, W. Shnetter (1983). Z. Ang. Ent. 96:500-508 describen Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, que supuestamente es activa contra dos escarabajos del orden de los coleópteros. Estos son el escarabajo de la papa de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, y Agelastica alni.

Más recientemente, se han identificado nuevas subespecies de B.t. y se han aislado los genes responsables de las proteínas de d-endotoxina activas (Hófte, H, H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52(2):242-255). Hófte y Whiteley clasificaron genes de proteína cristal de B.t. en cuatro clases principales. Las clases eran cryl (específico para Lepidoptera), cryll (específico para Lepidoptera y Díptera), crylll (específico para coleóptera) y cryLV (específico para Díptera). Se ha informado el descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10:271-275. Se ha propuesto cr ry para designar una clase de genes de toxinas que son específicos para los nematodos. Lambert et al. (Lambert, B., L. Buyssc, C. Decock, S. Jansens, C. Piens, B. Saey, J. Seurinck, K. Van Audenhove, J. Van Rie, A. Van Vliet, M. Peferoen [1996] Appl. Environ Microbiol 62(1 ):80-86) describen la caracterización de una toxina Cry9 activa contra lepidópteros. Las solicitudes PVT publicadas WO 94/95771 y WO 24264 también describen aislados de B.t. activos contra plagas de lepidópteros, la patente de los Estados Unidos No. 5,273,746 describe varios aislados de B.t., incluyendo PS192M4, como activos contra los piojos. Gleave et al. ([1991] JGM 138:55-62), Shevelev et al. ([1993] FEBS Lett 336:79-89; y Smulevitch et al. ([1991] FEBS Lett 293:25-26) describen asimismo toxinas de B.t. Recientemente se han identificado muchas clases más de genes de B.t.

Se ha descrito la clonación y expresión de un gen de proteína cristal de B.t. en Escherichia coli en la bibliografía publicada (Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981] Pro. Nati. Acad. Sci. USA 78:2893-2897). La patente de los Estados Unidos No. 4,448,885 y la patente de los Estados Unidos No. 4,467,036 describen la expresión de proteína cristal de ß.í. en coli. Las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,990,332, 5,039,523, 5,126,133, 5,164,180 y 5,69,629 están entre las que describen toxinas de ß.í. que tiene actividad contra lepidópteros. Las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,262,159 y 5.468.636 describen aislaciones de ß.í. PS157CI, PS86AI, y PS75JI para usar contra pulgones. Las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,277,905 y 5,457,179 describen el uso del aislado de ß.í. PS50C para usar contra plagas de coleópteros. La patente de los Estados Unidos no. 5.366.892 describe la secuencia de la toxina 50C(a) de ß.í. la patente de los Estados Unidos No. 5,286,485 describe el uso de PS50C contra plagas de lepidópteros. La patente de los Estados Unidos No. 5,185,148 describe el uso de PS50C contra plagas de escarabajos. La patente de los Estados Unidos No. 5,554,534 describe la secuencia de la toxina 50C(b) de ß.í. las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,262,158 y 5,424,410 describen el uso de PS50C contra acáridos. Como resultado de las extensas investigaciones e inversión de fondos, se han concedido otras patentes para nuevos aislados de ß.í. y nuevos usos de los mismos. Véase Feitelson et al., antes mencionado, para obtener una reseña. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos aislados de ß.í. y nuevos usos de los aislados de ß.í. conocidos sigue siendo materia empírica e ¡mpredecible. Los insectos que pertenecen al orden Homoptera incluyen insectos perforadores y succionadores tales como la cigarra de las hojas o de las plantas. Las cigarras de las hojas y las cigarras de las plantas comparten una estrecha relación evolutiva. Las cigarras de las hojas y las cigarras de las plantas se encuentran en todo el mundo y provocan graves pérdidas económicas en cosechas o plantas ornamentales por medio del daño por alimentación y por ser vectores de enfermedad. Un ejemplo específico de cigarra de las plantas es la cigarra del arroz pardo {Nilaparvata lugens). Debido a sus hábitos alimentarios de perforación y succión, las cigarras de las hojas y las cigarras de las plantas no son fácilmente susceptibles a las aplicaciones foliares de proteínas de Bacillus thuringiensis {B.t.) en sus estados originales, en cristales.

BREVE DESCIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a materiales y métodos para el control de plagas de animales no mamíferos. En modalidades específicas, la presente invención se refiere a materiales y métodos útiles para combatir insectos del orden Homoptera. Más específicamente, la presente invención presenta novedosos aislados, o cepas, toxinas y genes codificadores de toxinas de Bacillus thuringiensis {B.t.) que son útiles para combatir homópteros. Las cepas de ß.í. HD969, PS66D3 y PS50C están ejemplificadas específicamente en este documento por su toxicidad para los homópteros. En una modalidad preferida, las plagas blanco se seleccionan entre el grupo que consiste en cigarras de las hojas y cigarras de las plantas. Las secuencias de nucleótidos útiles de acuerdo con la presente invención codifican toxinas pesticídas. Una modalidad de la presente invención se relaciona con células vegetales transformadas con al menos una secuencia polinucleotídica de la presente invención de tal manera que las células vegetales transformadas expresen toxinas pesticidas en tejidos consumidos por las plagas blanco. Tal transformación de plantas puede llevarse a cabo utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica y típicamente implicarían la modificación del gen para optimizar la expresión de la toxina en plantas. Por otro lado, se puede utilizar los aislados de ß.í. de acuerdo con la presente invención, o los microbios recombinantes que expresan las toxinas descritas que se describieron en la misma, para combatir plagas. En este aspecto, la invención incluye el tratamiento de células de ß.í. o células recombinantes sustancialmente intactas que contiene las toxinas expresadas de acuerdo con la presente invención, tratadas para prolongar la actividad pesticida cuando las células sustancialmente intactas se aplican al entorno de la plaga blanco. La célula tratada actúa como un revestimiento protector para la toxina pesticida. La toxina se activa al ser ingerida por un insecto blanco.

Las toxinas de proteína de ß.í. cristalizada se pueden utilizar en aplicaciones agrícolas para el control de plagas, con métodos de aplicación y formulaciones muy conocidos en la técnica. En una modalidad, la presente invención presenta además toxinas proteicas que están solubilizadas. Las toxinas de la presente invención se distinguen de las exotoxinas de ß.í. que tienen actividad de amplio espectro no específica. 1 De acuerdo con lo descrito en la presente, las toxinas útiles de acuerdo con la presente invención pueden ser toxinas quiméricas producidas al combinar porciones de toxinas múltiples. Además, las toxinas de la presente invención se pueden utilizar en combinación para obtener un mejor control pesticida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee aislados de ß.í. y toxinas activos contra homópteros, incluyendo cigarras de las hojas y cigarras de las plantas. Los aislados específicos útiles de acuerdo con la presente invención han sido designados PS50C, PS66D3 y HD969. En el cuadro 1 se presentan algunas de las características de estas cepas.

CUADRO 1 Cepa Tipo de inclusión Serotipo H Perfil proteico por SDS-PAGE PS50C Esférica 1.8-kumamotoen-sis 133,128 PS66D3 Aplanado, casi 8 75,66,(58) cuadrada HD969 BP a limón a 6 130(s) amorfo PS66D3 es una cepa novedosa. Este microorganismo se ha depositado en la colección permanente de la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Centro de Investigación de la Región del Norte, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604. Estados Unidos. Los números de reposición de cultivos de las cepas depositadas son: Cultivo Número de reposición Fecha de depósito Bacillus thuringiensis N RRL B-21657 19 de febrero de 1997 PS66D3 Los aislados para utilizarse de acuerdo con la presente invención se han depositado bajo condiciones que garantizan la posibilidad de que una persona designada por el Comisario de Patentes y Marcas acceda a los cultivos durante el período en que esta solicitud de patente se encuentra pendiente, bajo 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. Los depósitos están disponibles de acuerdo con los requisitos impuestos por las leyes de patente extranjeras en los países donde se presenten las contrapartidas de la presente solicitud o sus sucesoras. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para llevar a la práctica la presente invención derogando los derechos de patente otorgados por la acción de gobierno. El siguiente asilado, así como los clones que contienen genes que lo codifican están disponibles al público en virtud de la concesión de patentes de los Estados Unidos. Estos aislados y sus correspondientes patentes de los Estados Unidos son: Estas patentes, junto con su descripción de los aislados indicados, así como sus toxinas y genes, se incorporan a la presente por referencia. El aislado HF969 está disponible en la USDA-ARS NRRL Culture Collection, Peoría, llinois. HD969 tiene numerosos genes Cry1 , incluyendo 1Ac, B y 1C. También se han encontrado marcas PCR para uno o más genes de la clase cry7, 8, 9. PS66D3 constituye una serie de proteínas 72 y 64 kDa (un patrón típico 3A, 3B).

Las cepas de HD969, PS66D3 y PS50C produjeron mortalidad de ninfas de N. lugens sustancialmente superior al cabo de 72 horas a la obtenida con controles negativos.

Genes y toxinas Otro aspecto de la presente invención se refiere a toxinas y genes novedosos que se obtienen de los aislados para utilizarse de acuerdo con la presente invención. Las toxinas y secuencias de polinucleótidos de la presente invención se definen de acuerdo con varios parámetros. Una característica esencial de las toxinas aquí descritas, es su actividad pesticida. En una modalidad específica, estas toxinas tienen actividad contra plagas de homópteros. Las toxinas y genes de la presente invención se pueden definir además por sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos. Las secuencias de las moléculas se pueden definir en términos de homología o identidad con ciertas secuencias ejemplificadas, así como también en términos de su aptitud para hibridarse con, o ser amplificadas por ciertas sondas y cebadores ejemplificados. Las toxinas provistas en la presente también pueden ser identificadas sobre la base de su inmunorreactividad con ciertos anticuerpos. Con las indicaciones presentadas en la presente, una persona capacitada en la técnica podría producir y utilizar fácilmente las diversas toxinas y secuencias de polinucleótidos que se describen en la presente.

Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no sólo las secuencias sino también los fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retengan la actividad pesticida característica de las toxinas novedosas específicamente ejemplificadas en la presente. En la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes con actividad pestícida. En la presente, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen igual o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas blanco que las toxinas ejemplificadas. Debe resultar evidente para los expertos en la técnica que los genes que codifican toxinas activas pueden ser identificados y obtenidos por diversos medios. Los genes específicos ejemplificados en la presente se pueden obtener de los aislados depositados en un depósito de cultivos como se describió anteriormente. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también se pueden construir de manera sintética, por ejemplo al utilizar un sintetizador de genes. Se pueden construir fácilmente variaciones de genes utilizando técnicas estándares para preparar mutaciones de punto. Además se pueden preparar fragmentos de estos genes utilizando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo con procedimientos normales. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas tales como ßa/31 o mutagénesis dirigida al sitio para recortar sistemáticamente los nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, se pueden obtener genes que codifican fragmentos activos empleando una variedad de enzimas de restricción. Se pueden utilizar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas. Se pueden obtener toxinas equivalentes y/o genes que codifiquen estas toxinas equivalentes de aislados de ß. í. y/o genotecas de ADN empleando las instrucciones provistas en la presente solicitud. Existe una cantidad de métodos para obtener las toxinas pesticidas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos para las toxinas pesticidas descritas y citadas en la presente para identificar y aislar otras toxinas de una mezcla de proteínas. Específicamente, se puede cultivar anticuerpos para las porciones de toxinas que son más constantes y más diferentes de las demás toxinas de ß.í.. Posteriormente se puede utilizar estos anticuerpos para identificar específicamente toxinas equivalentes con la actividad característica por inmunoprecipitación, ensayo de inmunoabsorbencia vinculado con las enzimas (ELISA) o western blotting. Se puede preparar fácilmente anticuerpos para las toxinas descritas en la presente, o para toxinas equivalentes o fragmentos de las mismas utilizando procedimientos estándares en esta técnica. Posteriormente se pueden obtener genes que codifiquen estas toxinas a partir de los microorganismos. Los fragmentos y equivalentes que conservan la actividad pesticída de las toxinas ejemplificadas se encontrarían dentro del alcance de la presente invención. Además, a causa de la redundancia del código genético, hay una variedad de secuencias de ADN diferentes que pueden codificar las secuencias de aminoácidos aquí descritas. Es de competencia de la persona capacitada en la técnica generar estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o esencialmente las mismas toxinas. Estas secuencias de ADN variantes están dentro del alcance de la presente invención. En la presente, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan notablemente la actividad pesticida. También están incluidos dentro de esta definición los fragmentos que conservan la actividad pesticida. Ciertas toxinas de la presente invención se han ejemplificado específicamente en la presente. Dado que estas toxinas son meramente ejemplificadoras de las toxinas de la presente invención, debe ser evidente que la presente invención también se refiere a las variantes o equivalentes de genes y toxinas novedosas que tienen igual o similar actividad pesticida que las toxinas novedosas ejemplificadas. Las toxinas equivalentes tienen homología de aminoácidos con una toxina ejemplificada novedosa. Estos genes y toxinas equivalentes típicamente tendrán más de 60% de identidad con las secuencias específicamente ejemplificadas en la presente; preferentemente tendrán más de 75% de identidad, más preferentemente más de 80%, muy preferentemente más de 90% y la identidad puede ser mayor de 95%. La homología de aminoácidos será más elevada en las regiones críticas de la toxina que son causantes de la actividad biológica o están implicadas en la determinación de la configuración tridimensional que, en última instancia, es responsable de la actividad biológica, En este aspecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son admisibles y pueden esperarse si estas sustituciones se encuentran en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, se pueden ubicar los aminoácidos en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales se reemplaza un aminoácido de una clase por otro aminoácido del mismo tipo caen dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no altere considerablemente la actividad biológica del compuesto. El cuadro 2 presenta un listado de ejemplos de los aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 2 En algunos casos, también se pueden efectuar sustituciones no conservadoras. El factor crítico consiste en que estas sustituciones no deben producir una merma de la actividad biológica de la toxina.

Las toxinas de la presente invención también se pueden caracterizar en términos de la forma y ubicación de las inclusiones de toxinas, descritas anteriormente. Si bien normalmente se utilizan proteínas cristal en la técnica, también se pueden cultivar los aislados de acuerdo con la presente invención en condiciones que faciliten la secreción de toxinas. Por consiguiente, se puede utilizar el sobrenadante de estos cultivos para obtener toxinas de acuerdo con la presente invención. En consecuencia, la presente invención no se limita a las proteínas cristal; también se contemplan proteínas solubles de utilidad. En la presente, la referencia a polinucleótidos "aislados" y/o toxinas "purificadas" se refiere a estas moléculas cuando no están asociadas con otras moléculas con las cuales se encontrarían en la naturaleza. Por consiguiente, la designación "aislado y purificado" representa la implicancia de la "mano del hombre" de acuerdo con lo descrito. Las toxinas quiméricas y genes también implican la "mano del hombre" El uso de sondas de oligonucleótídos proporciona un método para identificar las toxinas y genes de la presente invención, y otros, genes y toxinas novedosos. Las sondas proveen un método rápido para identificar genes codificadores de toxinas. Los segmentos de nucleótidos que se utilizan como sondas de acuerdo con la presente invención se pueden sintetizar empleando un sintetizador de ADN y procedimientos estándares, por ejemplo.

Toxinas quiméricas También se pueden utilizar genes y toxinas quiméricos, producidos mediante la combinación de porciones de más de una toxina o gen de B. t., de acuerdo con las indicaciones de la presente invención. Se han desarrollado métodos para preparar toxinas quiméricas útiles combinando porciones de proteínas cristal de ß.í. Las porciones que se combinan no necesitan ser pesticidas de por sí, siempre que la combinación de porciones genere una proteína quimérica que sea pesticida. Esto se puede efectuar empleando enzimas de restricción, como se describe, por ejemplo, en la patente europea 0 228 838; Ge, A. Z., N.I., Shivarova, D.H. Dean (1989), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:4037 - 4041 ; Ge, A.Z., D. Rivers, R. Milne, D.H: Dean (1991 ) J. Biol. Chem. 266: 17954 - 17958; Schnepf, H.E., K. Tomczak, J.P., Ortega, H.R. Whiteley (1990) J. Biol. Chem. 265: 209233 - 20930; Honee, G., D., Convents, J. Van Rie, S., Jansens, M. Peferoen, B Visser (1991 ) Mol. Microbiol. 5:2799-2806. Por otro lado, se puede utilizar la recombinación utilizando mecanismos de recombinación celular para obtener resultados similares. Véase, por ejemplo, Caramori, T., A.M. Albertini, A. Galizzi (1991 ) Gene 98:37 - 44; Widner, W.R., H.R. Whiteley (1990) J. Bacteriol 172:2826 - 2832; Bosch, D., B. Schipper, H. van der Kliej, R.A. de Maagd, W.J. Stickema (1994) Biotechnology 12:915 - 918. Se conoce en la técnica una cantidad de otros métodos por los cuales se pueden preparar dichos ADN quiméricos. La presente invención incluye proteínas quiméricas que utilizan genes y toxinas de la presente solicitud.

Huéspedes recombinantes Los genes codificadores de toxinas de la presente invención se pueden introducir en una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La expresión de genes de toxinas da como resultado, directa o indirectamente, la producción y mantenimiento del pesticida. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo Pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados al situs de la plaga, donde proliferan y son ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Por otro lado, el microbio que actúa como huésped del gen de toxina puede ser exterminado y tratado en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, puede ser aplicada entonces al entorno de la plaga blanco. Donde el gen de la toxina de ß.í. se introduce por medio de un vector adecuado en un huésped microbiano y dicho huésped es aplicado al ambiente en estado vivo, es esencial el uso de ciertos microbios huéspedes. Se seleccionan huéspedes de microorganismos conocidos por ocupar la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos son seleccionados para competir satisfactoriamente en el medio determinado (cultivo y otros hábitats de insectos) con los microorganismos de tipo silvestre, para producir un mantenimiento y expresión estables del gen que expresa el pesticida polipeptídico y, convenientemente, dar lugar una mejor protección de pesticida de la degradación y desactivación ambiental.

Se conoce un gran número de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de las plantas) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de especial interés los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes, hongos, especialmente levadura, por ejemplo los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de especial interés las especies bacterianas de la fitosfera, como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii; así como especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S.pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. Son de particular interés los microorganismos pigmentados. Se dispone de una amplia variedad de métodos para introducir un gen de ß.í. que codifica una toxina en un microorganismo huésped en condiciones que dan lugar al mantenimiento y expresión estables del gen.

Estos métodos son muy conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,135,867, que se incorpora a la presente por referencia. Se pueden realizar el control de homópteros utilizando los aislados, toxinas y genes de la presente invención mediante una diversidad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la aplicación de aislados de ß.í. a las plagas (o su habitat), la aplicación de microbios recombínantes a las plagas (o sus hábitats) y la transformación de plantas con genes que codifican las toxinas pesticidas de la presente invención. Los microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, ß.í., E. co// o Pseudomonas. Las transformaciones pueden ser llevadas a cabo por los expertos en la técnica utilizando técnicas estándares. Los materiales necesarios para estas transformaciones se describen en la presente o de lo contrario pueden ser fácilmente obtenidos por los técnicos capacitados. También se pueden emplear genes sintéticos que son funcionalmente equivalentes a las toxinas novedosas de la presente invención para transformar huéspedes. Se pueden encontrar métodos para la producción de genes sintéticos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,380,831 Tratamiento de las células Como se mencionó anteriormente, se puede tratar ß.í. o las células recombinantes que expresan una toxina de ß.í. para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula de pesticida que se forma contiene la toxina de ß.í. dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y protege la toxina cuando la microcápsula se aplica al entorno de la plaga blanco. Las células huésped adecuadas pueden incluir procariotas o eucariotas, que normalmente se limitan a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para organismos superiores tales como mamíferos. Sin embargo, se podrían emplear organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores, donde las sustancias tóxicas son inestables o el nivel de aplicación es suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamífero. Como huéspedes, son de especial interés las procariotas y las eucariotas inferiores, tales como hongos. Al recibir tratamiento la célula generalmente se encontrará intacta y sustancialmente en su forma proliferativa, si bien en algunos casos se pueden emplear esporas. El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo un microbio que contiene el gen de la toxina de ß.í., se puede realizar por medios químicos o físicos, o por una combinación de medios químicos y/o físicos, siempre que la técnica no afecte adversamente las propiedades de la toxina, ni reduzca la capacidad celular de protección de la toxina. Los ejemplos de reactivos químicos son agentes halogenantes, especialmente halógenos de No. atómico 17 - 80. Más específicamente, se puede utilizar yodo en condiciones moderadas y durante tiempo suficiente para obtener los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehidos tales como glutaraldehído; antiinfectivos tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetílpirídinio, alcoholes tales como isopropanol y etanol; diversos fijadores histológicos tales como yodo Lugol, fijador de Bouin, diversos ácidos y fijador de Helly (véase: Humason, Gretchen L. Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando ésta es administrada al medio huésped. Los ejemplos de medios físicos son la radiación de onda corta, tal como la radiación gama y la radiación X, el congelamiento, la irradiación de UV, la liofilización y similares. Los métodos de tratamiento de las células microbianas se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,695,455 y 4,695,462 que se incorporan a la presente por referencia. Las células generalmente tienen mayor estabilidad estructural que aumenta la resistencia a las condiciones ambientales. En los casos en que el pesticida se presenta en una proforma, se debe optar por un método de tratamiento celular que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del pesticida por medio del patógeno plaga objetivo. Por ejemplo, el formaldehído entrecruzará las proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida polipeptídico. El método de tratamiento debe conservar por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las características de especial interés en la selección de una célula huésped para los fines de la producción incluyen la facilidad para introducir el gen de ß.í. en el huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficiencia de expresión, la estabilidad del pesticida en el huésped y la presencia de aptitudes genéticas auxiliares. Las características de interés para utilizar como microcápsulas pesticida incluyen las cualidades protectoras del pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación, y envoltura ¡ntracelular o la formación de corpúsculos de inclusión: la supervivencia en medios acuosos; la falta de toxicidad para mamíferos, la captación de plagas para su ingestión, la facilidad de matar y fijar sin daño a la toxina y similares. Otros factores a considerar incluyen la facilidad de formulación y acarreo, la economía, la estabilidad en el almacenamiento y similares.

Desarrollo de las células El huésped celular que contiene el gen insecticida de ß.í. se puede desarrollar en cualquier medio nutriente adecuado, en el cual la construcción de ADN provea una ventaja selectiva, dando lugar a un medio selectivo de manera que todas o sustancialmente todas las células conserven el gen ß.í. Estas células pueden ser cosechadas posteriormente de acuerdo con los métodos convencionales. Por otro lado, las células se pueden tratar antes de la cosecha. Las células de ß.í. de acuerdo con la presente invención se pueden cultivar utilizando medios y técnicas de fermentación estándares en la técnica. Al completarse el ciclo de fermentación se pueden cosechar las bacterias separando en primer lugar las esporas de ß.í. y los cristales del caldo de fermentación por medios conocidos en la técnica. Las esporas y cristales de ß.í. se pueden recuperar empleando técnicas muy conocidas y utilizarse como preparación convencional de d-endotoxina de ß.í. Por ejemplo, las esporas y cristales se pueden integrar a una formación de polvo humectable, concentrado líquido, granulos u otras formulaciones mediante la adición de agentes tensioactivos, dispersantes, vehículos inertes y otros componentes para facilitar la manipulación y aplicación para plagas blanco específicas. Estas formulaciones y procedimientos de aplicación son muy conocidos en la técnica. Por otro lado, se puede utilizar el sobrenadante del proceso de fermentación para obtener toxinas de acuerdo con la presente invención. Luego se aislan y purifican las toxinas solubles secretadas empleando técnicas de conocimiento generalizado.

Métodos y formulaciones para el control de plagas El control de homópteros empleando los aislados, toxinas y genes de la presente invención se puede lograr medíante una diversidad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la aplicación de aislados de ß.í. a las plagas (o a su habitat), la aplicación de microbios recombinantes a las plagas (o a sus hábitats) y la transformación de plantas con genes que codifican las toxinas pesticidas de la presente invención. Los microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, ß.í., E. Coli o Pseudomonas. Las transformaciones pueden ser llevadas a cabo por los expertos en la técnica utilizando técnicas estándares. Los materiales necesarios para estas transformaciones se han descrito en la presente o de lo contrario pueden ser fácilmente obtenidos por los técnicos capacitados. Los granulos de cebo formulados que contienen un agente de atracción y toxinas de los aislados de ß.í., o microbios recombínantes que contienen los genes que se obtienen de los aislados de ß.í. descritos en la presente pueden ser aplicados al suelo. El producto formulado se puede aplicar también en forma de revestimiento de semilla o tratamiento radicular o tratamiento total de la planta en etapas posteriores al ciclo del cultivo. Los tratamientos de la planta y el suelo de células de ß.í. se pueden emplear en forma de polvos humectables, granulos o espolvoreantes, mezclando con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, cascaras de arroz, cascaras de nuez, y similares). Las formulaciones pueden incluir coadyuvantes esparciadores de la pegajosidad, agentes estabilizantes, otros aditivos para pesticidas o agentes tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser a base de agua o no acuosas y empleadas como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agentes tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Como podrán apreciar los técnicos capacitados, la concentración del pesticida puede variar ampliamente dependiendo del carácter de la formulación específica, especialmente si se trata de un concentrado o debe ser utilizado directamente. El pestícida estará presente en al menos 1% en peso y puede ser 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán de 1 - 95% en peso del pesticida, en tanto que las formulaciones líquidas tendrán generalmente de alrededor de 1 - 60% en peso de sólidos en la fase líquida. Las formulaciones generalmente tendrán de 102 a 104 células/ mg. Estas formulaciones que contienen células se administrarán a razón de aproximadamente 50 mg (líquidas o secas) a 1 kg o más por hectárea. Las formulaciones se pueden aplicar al entorno de la plaga, por ejemplo al suelo y el follaje, mediante rociado, espolvoreo, aspersión, etc.

Mutantes Los mutantes de los aislados novedosos que se obtienen de acuerdo con la presente invención se pueden preparar utilizando procedimientos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener un mutante esporógeno por medio de la mutagénesis con etilmetansulfonato (EMS) de un aislado. Los mutantes se pueden preparar utilizando luz ultravioleta y nitrosoguanidina por procedimientos muy conocidos en la técnica. Un porcentaje más pequeño de mutantes esporógenos se mantiene intacto y no sufre la lisis durante períodos prolongados de fermentación; estas cepas se designan como lisis menos (-). Las cepas lisis menos pueden ser identificadas clasificando mutantes esporógenos en medio para frasco agitador y seleccionando los mutantes que aún están intactos y contengan cristales de toxina de la fermentación. Las cepas lisis menos son adecuadas para un proceso de tratamiento celular que produce una proteína tóxica encapsulada y protegida. Para preparar una variante fagorresistente de dicho mutante esporógeno, se esparce una alícuota del usado de fagos en agar nutriente y se deja secar. Luego se aplica una alícuota de la cepa bacteriana sensible a los fagos directamente sobre el lisado seco y se deja secar. Las placas se incuban a 30°C. Las placas se incuban durante dos días y, tras ese período, se pueden ver numerosas colonias desarrollándose en el agar. Algunas de estas colonias se cosechan y subcultivan en placas de agar con nutrientes. Estos cultivos aparentemente resistentes son analizados para determinar la resistencia a la aplicación cruzada con el lisado de fagos. Se aplica sobre la placa una línea del lisado de fagos y se deja secar. A continuación se aplican los cultivos presuntamente a través de la línea de fagos. Los cultivos bacterianos resistentes no manifiestan lisis en lugar alguno de la raya a través de la línea de fagos después de la incubación durante la noche a 30°C. La resistencia al fago se reconfírma posteriormente aplicando una capa del cultivo resistente sobre la placa de agar nutriente. También se aplica la cepa sensible del mismo modo para que sirva como control positivo. Después de secar, se coloca una gota del lisado de fagos en el centro de la placa y se deja secar. Los cultivos resistentes no exhiben lisis alguna en la zona en que el lisado de fagos ha sido colocada después de la incubación a 30°C durante 24 horas.

Sondas de polinucleótidos Es un hecho muy conocido que el ADN posee una propiedad fundamental denominada complementaridad de base. En la naturaleza, el ADN existe comúnmente en forma de pares de hélices antiparalelas, proyectándose las bases de cada hélice desde esa hélice hasta la opuesta. La base adenina (A) en una hélice siempre se opondrá a la base timina (T) en la otra hélice, y la base guanina (G) se opondrá a la base citosína (C). Las bases se mantienen en oposición por su capacidad para enlazar hidrógeno de esta manera específica. Si bien cada enlace individual es relativamente débil, el efecto neto de muchas bases con enlaces de hidrógeno adyacentes, junto con los efectos de acumulación de las bases, constituye una unión estable de las dos hélices complementarias. Estos enlaces se pueden romper mediante tratamientos tales como un pH elevado o temperatura elevada, y estas condiciones producen la disociación o "desnaturalización" de las dos hélices. Si luego se coloca el ADN en condiciones que tomen termodinámicamente favorable en enlace de hidrógeno de las bases, las hélices de ADN se conjugarán o "híbridarán" y reformarán el ADN de doble hélice original. Si se lleva a cabo en condiciones apropiadas, esta hibridación puede ser sumamente específica. Es decir, que sólo las hélices con un alto grado de complementaridad de base podrán formar estructuras estables de doble hélice. La relación de la especificidad de hibridación a las condiciones de reacción es muy conocida. Por consiguiente, se puede utilizar la hibridación para analizar si dos segmentos de ADN son complementarios en sus secuencias de base. Es este mecanismo de hibridación lo que facilita el uso de sondas para detectar y caracterizar fácilmente las secuencias de ADN que interesan. Las sondas pueden ser ARN o ADN. La sonda tendrá normalmente por lo menos aproximadamente 10 bases, más habítualmente por lo menos aproximadamente 18 bases, y puede tener hasta aproximadamente 50 bases o más, generalmente no más aproximadamente 200 bases si la sonda se prepara sintéticamente. Sin embargo, se pueden emplear con facilidad sondas más largas, y éstas pueden tener, por ejemplo, una longitud de varias kilobases. La secuencia de la sonda está diseñada para que sea por lo menos sustancialmente complementaria a una porción de un gen que codifica una toxina de interés. La sonda no necesita tener complementaridad perfecta con la secuencia a la cual se híbrida. Las sondas pueden ser rotuladas utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Un procedimiento de hibridación útil incluye típicamente los pasos iniciales de aislar la muestra de ADN en cuestión y purificarla químicamente. Se pueden utilizar bacterias usadas o ácido nucleico fraccionado total, aislados de las bacterias. Las células se pueden tratar utilizando técnicas conocidas para liberar su ADN (y/o ARN). La muestra de ADB puede ser cortada en segmentos con una enzima de restricción apropiada. Los segmentos pueden ser separados por tamaño por medio de electroforesis en gel, habitualmente agarosa o acrilamida. Las piezas de interés pueden ser transferidas a una membrana inmovilizante de manera que mantenga la geometría de las piezas. A continuación se puede secar la membrana y prehibrídar para equilibrarla para la posterior inmersión en una solución de hibridación. La manera en la cual se fija el ácido nucleico a un soporte sólido puede variar. Esta fijación del ADN para el posterior procesamiento tiene gran valor para el uso de esta técnica en estudios de campo, alejados de las instalaciones del laboratorio. La técnica de hibridación específica no es esencial para la presente invención. A medida que se realizan mejoras en las técnicas de hibridación, éstas pueden ser fácilmente aplicadas. Como es de conocimiento de los técnicos, si la molécula sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando un fuerte enlace no covalente entre las dos moléculas, se puede presumir lógicamente que la sonda y la muestra son esencialmente idénticas. El marcador detectable de la sonda proporciona un medio para determinar de manera conocida si se ha producido la hibridación. Los polinucleótidos de la presente invención, así como las sondas derivadas de segmentos de los mismos, pueden ser sintetizados utilizando sintetizadores de ADN por medio de procedimientos estándares. En el uso de los segmentos de nucleótidos como sondas, la sonda específica es rotulada mediante cualquier marcador adecuado conocido por los expertos en la técnica, incluyendo los marcadores radiactivos y no radiactivos. Los marcadores radiactivos típicos incluyen 32P, 35S o similares. Se puede construir una sonda marcada con un isótopo radioactivo a partir de una secuencia nucleotídica complementaria de la muestra de ADN mediante una reacción de traducción convencional utilizando DNasas y ADN polimerasa. A continuación se pueden combinar la sonda y la muestra en una solución buffer de hibridación y mantenerla a una temperatura apropiada hasta que se produzca la anelación. A continuación, se lava la membrana para liberarla de materiales extraños, dejando las moléculas de la muestra y la sonda ligada típicamente detectadas y cuantificadas por autorradiografía y/o conteo de centelleo de líquido. Para sondas sintéticas puede ser más aconsejable el uso de enzimas tales como cinasa de polinucleótidos o transferasa terminal para rotular el ADN en el extremo para emplear como sondas. Los marcadores no radiactivos incluyen, por ejemplo, ligandos tales como biotina o tiroxina, así como enzimas tales como hidrolasas o peroxidasas, o los diversos químiolumíniscentes tales como luciferina o compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y sus derivados. Las sondas se pueden preparar de manera intrínsecamente fluorescente de acuerdo con lo descrito en la solicitud internacional No. WO 93/16094. También se puede marcar la sonda en ambos extremos con diferentes tipos de marcadores para facilidad de separación, como, por ejemplo, utilizando un marcador isotópico en el extremo antes mencionado y un marcador de biotina en el otro extremo. La cantidad de sonda marcada presente en la solución de hibridación varía ampliamente, dependiendo de la naturaleza del marcador, la cantidad de sonda marcada que razonablemente se puede unir al filtro y la rigurosidad de la hibridación. En general, se emplearán excesos considerables de sonda para aumentar el coeficiente de unión de la sonda al ADN fijado. Se pueden emplear diversos grados de rigurosidad de hibridación. Cuanto más severas sean las condiciones, mayor será la complementaridad requerida para la formación de doble. La severidad se puede controlarse por medio de la temperatura, la concentración de la sonda, la longitud de la sonda, la potencia iónica, el tiempo y demás factores. De preferencia, la hibridación se lleva a cavo en condiciones rigurosas por medio de técnicas muy conocidas en el medio de acuerdo con lo descrito, por ejemplo, en DNA Probes, de Keller, G.H., M.M. Manak (1987), Stockton Press, Nueva York, NY, pág. 169-170. En la presente, la expresión condiciones "rigurosas" de hibridación se refiere a condiciones que producen el mismo, o aproximadamente el mismo grado de especificidad de hibridación que las condiciones empleadas por los solicitantes de la presente. Específicamente, se llevó a cabo la hibridación de ADN inmovilizado en Southern blots con sondas de genes específicos marcadas con 32P por métodos estándares (Maniatis et al.). En general, la hibridación y lavados posteriores se llevaron a cabo en condiciones rigurosas que dieron lugar a la detección de secuencias blanco con homología con los genes de toxina en cuestión. Para las sondas genéticas de ADN de doble hélice, la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión ha sido descrita por la siguiente fórmula (Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas y F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman y K Moldave [eds.] Academic Press, Nueva York 100: 206-285). Tm 81.5°C + 16.6 Log[Na+] + 0.41 (%G + C) - 0.61 (% formamida) - 600/longitud de doble en pares de bases. Los lavados se llevan a cabo típicamente de la siguiente manera: (1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de baja rigurosidad). (2) Una vez a Tm - 20°C durante 15 minutos en 0.2X SSPE. 0.1 SDS (lavado de moderada rigurosidad). Para sondas de oligonucleótidos, la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La Tm para las sondas de oligonucleótidos se determinó de acuerdo con la siguiente fórmula: Tm (°C) = 2 (número T/A pares de bases) + 4 (números G/C pares de bases) (Suggs, S:V:, T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura y R.B. Wallace [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Utilizando Genes Purificados, D.D. Brown [ed.], Academic Press, Nueva York, 23: 683-693). Los lavados se llevaron a cabo típicamente de la siguiente manera: (1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de baja rigurosidad). (2) Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1X SSPE, 0.1 % SDS (lavado de moderada rigurosidad). La formación del dúplex y la estabilidad dependen de la complementaridad sustancial entre las dos hélices de un híbrido y, como se señaló anteriormente, se puede tolerar cierto grado de falta de coincidencia. Por lo tanto, las secuencias de nucleótidos de la presente invención incluyen mutaciones (tanto simples como múltiples), deleciones, inserciones y combinaciones de las mismas, donde dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido blanco de interés. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en una secuencia de polínucleótidos dada, de muchas maneras, y estos métodos son conocidos por los expertos en la técnica. En el futuro se podrán dar a conocer otros métodos. Los métodos conocidos incluyen, aunque no se limitan a: (1 ) sintetizar químicamente o de otra manera una secuencia artificial que es una mutación, inserción o deleción de la secuencia conocida; (2) utilizar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención como sonda para obtener, por medio de la hibridación, una nueva secuencia o mutación, inserción o deleción de la secuencia de la sonda; y (3) efectuar la mutación, inserción o deleción de una secuencia de ensayo in vitro o in vivo. Es importante advertir que las variantes por mutación, inserción o deleción generadas a partir de una sonda determinada pueden ser más o menos eficientes que la sonda original. Pese a tales diferencias de eficiencia, estas variantes están dentro del alcance de la presente invención. Las variantes por mutación, inserción o deleción de las secuencias de nucleótidos descritas pueden ser fácilmente preparadas por métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. Estas variantes pueden ser utilizadas también como secuencia sustancial con la secuencia original. En la presente, la expresión homología de secuencia se refiere a una homología que es suficiente para permitir que la variante funcione con las mismas características que la sonda original. De preferencia, las variantes tienen identidad de aminoácidos o nucleótidos con las secuencias ejemplificadas superior a 50%; más preferentemente, hay más de 75% de identidad y muy preferentemente, hay más de 90% de identidad. El grado de homología necesario para que la variante funcione en su capacidad pretendida depende del uso pretendido de la secuencia. Es de competencia de una persona con capacitación en esta técnica efectuar mutaciones por mutación, inserción o deleción destinadas a mejorar la actuación de la secuencia o, de lo contrario, proporcionar una ventaja metodológica.

Tecnología de RCP La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) es una síntesis repetitiva, enzimática y con cebadores de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento es muy conocido y utilizado comúnmente por los expertos en la técnica (véase Mullís, patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mulis, Glenn T. Horn, Henry A. Eriich, Norman Arnheim [1985] "Enzymatic Amplification of ß-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" Science 230: 1350-1354). La RCP se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueada por dos cebadores de oligonucleótidos que se hibridan a las hélices opuestas de la secuencia blanco. Los cebadores están orientados con los extremos 3' enfrentados entre sí. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del patrón, la anelación de los cebadores a sus secuencias complementarias y la extensión de los cebadores anelados con una polimerasa de ADN da como resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de RCP. Dado que el producto de la extensión de cada cebador puede servir como patrón para el otro cebador, cada ciclo duplica esencialmente la cantidad de fragmento de ADN producido en el ciclo anterior. Esto produce la acumulación exponencial del fragmento blanco específico, hasta varios millones de veces en pocas horas. Utilizando una ADN polimerasa termoestable tal como polímerasa Taq, que se aisla a partir de la bacteria termófila Thermus aquaticus, se puede automatizar por completo el proceso de amplificación Las secuencias ADN que se obtienen de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar como cebadores para la amplificación por RCP. En la realización de la amplificación por RCP se puede tolerar cierto grado de falta de coincidencia entre el cebador y el patrón. Por lo tanto, las mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente adiciones de nucleótidos al extremo 5') de cebadores que se obtuvieron a la luz de la descripción de la presente que se incluye dentro del alcance de la invención de la presente. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en un determinado cebador por métodos conocidos una persona capacitada en la técnica. Es importante notar que las variantes por mutación, inserción y deleción generadas a partir de una determinada secuencia de cebadores pueden ser más o menos eficientes que las secuencias originales. Pese a tales diferencias de eficiencia, estas variantes están dentro del alcance de la presente invención. Todas las patentes de los Estados Unidos citadas en la presente se incorporan a la presente como referencia. A continuación se presentan ejemplos que ¡lustran los procedimientos para llevar a la práctica la invención. Estos ejemplos no deben ser considerados limitantes. Todos los porcentajes se expresan en peso y todas las proporciones de las mezclas de solventes son en volumen a menos que se indique lo contrario.

EJEMPLO 1 Preparación de los aislados Se cultivaron cepas de ß.í. en un medio de peptona, sales de glucosa hasta que estuvieron completamente esporulados. Fueron cosechados por centrifugación y pulverizados por liofilización. Se extrajeron las proteínas de toxina de las muestras mediante extracción en un buffer de carbonato de sodio, 2-mercaptoetanol con un pH de 10.7 a 11.0 durante la extracción a 37°C. Los extractos proteicos fueron recuperados por centrifugación, dializados con 0.01 M de carbonato de sodio, pH 9.5 y, si fuera necesario, concentrados a por lo menos 1 mg/ml de proteína utilizando un microconcentrador de "columna de espín". Se estimaron las concentraciones proteicas por densitometría de láser utilizando seroalbúmina bovina como parámetro. En estas condiciones, el extracto de la cepa HD969 contenía proteínas en un rango de tamaño de 130 kDa a aproximadamente 62 kDa (así como un número de bandas menores), PS66D3 presentaba una banda importante a aproximadamente 64 kDa y bandas menores a aproximadamente 52 kDa y 30 kDa, PS50C presentaba una banda importante a aproximadamente 62 kDa y numerosas bandas menores.

EJEMPLO 2 Bioensayo de preparaciones contra Nilaparvata lugens, la cigarra de la planta del arroz pardo Los ensayos biológicos consistieron en exponer insectos a una dieta artificial que contenía las preparaciones de ß.í. del ejemplo 1 diluidas a 1 mg mi"1 de la toxina de ß.í.. Se expusieron insectos, como ninfas, a las soluciones de ensayo por espacio de 72 horas. Al cabo de 24 horas los insectos que no se alimentaban satisfactoriamente, a juzgar por la falta de producción de secreción dulce fueron descartados. Los insectos fueron examinados a 0, 24, 48 y 72 horas y se clasificó la supervivencia. Cada bioensayo fue replicado tres veces con 10 insectos utilizados en cada réplica. Se utilizaron controles en buffer, utilizando una vez más 10 insectos, como parte de cada ensayo biológico replicado. Los resultados de estos ensayos están representados en el cuadro 3.

CUADRO 3 Porcentaje de vivos Muestra n Oh 24h 48h 72h HD969 31 100 71 45 16 66D3 30 100 93 57 33 50C 30 100 93 70 40 Control en 30 100 93 83 62 Buffer a Control en 31 100 87 63 60 Buffer b Control en 31 100 87 84 74 Buffer c EJEMPLO 3 Transformación de plantas Un aspecto de la presente invención consiste en la transformación de plantas con genes que codifican las toxinas insecticidas de la presente invención. Las plantas transformadas son resistentes al ataque de las plagas blanco. Los genes que codifican las toxinas pestícidas, de acuerdo con lo descrito en la presente, pueden ser insertados en células vegetales utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se dispone de un gran número de vectores de clonación que consiste en un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas para la preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores consisten, por ejemplo, en las series pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, etc. En consecuencia, la secuencia que codifica la toxina de B. t. puede ser insertada en el vector en un sitio de restricción adecuado. Se utiliza el plásmido resultante para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, luego se cosechan y someten a análisis. Se recupera el plásmido. Se lleva a cabo generalmente el análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos biológicos bioquímícomoleculares como métodos de análisis. Después de cada manipulación, se puede escindir la secuencia de ADN utilizada y unir a la siguiente secuencia de ADN. Se puede clonar cada secuencia de plásmido en el mismo u otros plásmidos. Según el método de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se utiliza el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, debe unirse por lo menos el borde derecho, aunque frecuentemente tanto el borde derecho como el izquierdo del ADN-T del plásmido Ti o Ri como región de flanqueante de los genes a insertar. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en EP 120 516; Hoekema (1985) en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Capítulo 4; Fraley eí al., Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46; y An eí al. (1985) EMBO J. 4: 277-287. Una vez que el ADN insertado ha sido integrado al genoma, es relativamente estable allí y, como regla general, no vuelve a salir. Normalmente contienen un marcador de selección que confiere a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico como puede ser canamicina, G 418, bleomicina, hígromicina o cloranfenicol, entre otros. El marcador individualmente empleado debe permitir, en consecuencia, la selección de células transformadas en lugar de células que no contienen el ADN insertado. Se dispone de un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula huésped vegetal. Esas técnicas incluyen la transformación con ADN-T utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas) o electroporación, así como otros métodos posibles. Si se utilizan Agrobacterias para la transformación, el ADN a insertar tiene que ser clonado en plásmidos especiales, es decir, es un vector intermedio o un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar al plásmído Ti o Ri por recombinación homologa debido a secuencias que son homologas de las secuencias del ADN-T. El plásmído Ti o Ri también contiene la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en Agrobacteria. El vector intermedio puede ser transferido a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar tanto en E. coli como en Agrobacteria. Estos comprenden un gen marcador de selección y un ligante o políligante que se forman por las regiones extremas derecha e izquierda del ADN-T. Se pueden transformar directamente en Agrobacteria (Holsters et al. [1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). La Agrobacterium empleada como célula huésped debe contener un plásmido que acarrea una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede contener más ADN-T. La bacteria así trasformada se utiliza para la transformación de células vegetales. Se pueden cultivar los explantes vegetales ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la célula vegetal. Luego se pueden regenerar plantas enteras a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hojas, segmentos de tallo, tejido meristemático, raíces, aunque también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas pueden ser analizadas a continuación para confirmar la presencia del ADN insertado. No se realizaron demandas especiales con relación a los plásmidos en el caso de la inyección y electroporación. Es posible utilizar plásmidos comunes tales como, por ejemplo, derivados de pUC. En transformación por biolística se puede emplear ADN de plásmido o ADN lineal.

Las células transformadas se regeneran para constituir plantas morfológicamente normales en la forma habitual. Sí un evento de transformación implica una célula de línea germinal, el ADN insertado y el o los rasgos fenotípícos correspondientes se transmiten a las plantas de la progenie. Tales plantas pueden ser cultivadas como se hace habitualmente y cruzadas con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados y otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las correspondientes propiedades fenotípicas. En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas se transforman con genes en los cuales el uso de codones ha sido optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo; patente de los Estados Unidos No. 5,380,831. Además, ventajosamente, se utilizan plantas que codifican una toxina trunca. La toxina trunca típicamente codifica aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina completa. Los métodos para crear genes de ß. í. sintéticos para utilizar en plantas son conocidos en la técnica. Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritas en la presente se presentan sólo con fines ilustrativos y que los técnicos capacitados en el medio pueden sugerir diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos y éstos deben estar incluidos en el espíritu y propósito de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para controlar una plaga de insectos homópteros, que consiste en poner en contacto dicha plaga con una toxina que se obtiene a partir de una cepa aislada de Bacillus thuringiensis seleccionada del grupo que consta de HD969, PS66D3 y PS50C.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha cepa aislada es HD969.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la cepa aislada es PS66D3.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha cepa aislada es PS50C.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha toxina es expresada in planta.

6.- Una toxina que se obtiene de una cepa aislada de Bacillus thuringiensis seleccionada del grupo que consta de HD969, PS66D3 y PS50C, o una porción activa contra homópteros de dicha toxina, toxina que es tóxica para una plaga de insectos homópteros.

7.- La toxina de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha cepa aislada es HD969.

8.- La toxina de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la cepa aislada es PS66D3.

9.- La toxina de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha cepa aislada es PS50C.

10.- Un gen que codifica una toxina que se obtiene de una cepa aislada de Bacillus thuringiensis seleccionada del grupo que consta de HD969, PS66D3 y PS50C, o una porción activa contra homópteros de dicha toxina, toxina que es tóxica para una plaga de insectos homópteros.

11.- El gen de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha cepa aislada es HD969.

12.- El gen de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la cepa aislada es PS66D3.

13.- El gen de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha cepa aislada es PS50C.

14.- Una célula huésped transformada con una toxina que se obtiene de una cepa aislada de Bacillus thuringiensis seleccionada del grupo que consta de HD969, PS66D3 y PS50C, o una porción activa contra homópteros de dicha toxina, toxina que es tóxica para una plaga de insectos homópteros.

15.- La célula huésped transformada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha cepa aislada es HD969.

16.- La célula huésped transformada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la cepa aislada es PS66D3.

17.- La célula huésped transformada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha cepa aislada es PS50C.

18.- La cepa aislada PS66D3 de Bacillus thuringiensis, disponible bajo el número de depósito NRRL B-21657.