MXPA00000842A - Medio de cultivo para cultivar lactobacillus clearans, y un metodo para preservar tal cepa. - Google Patents

Abstract

El cultivo y preservación de Lactobacillus clearans requiere consideraciones especiales debido a que el título disminuye fácilmente. De este modo existe una necesidad urgente de medios de cultivo y preservativos para prevenir tal disminución en el título bacteriano durante el subcultivo y almacenamiento. La presente invención se relaciona con un medio de cultivo en el cual al menos uno o más de sulfuro de sodio o amoniaco disminuyen debido al efecto del Lactobacillus clearans durante el cultivo con la adición de al menos uno o mas de sulfuro de sodio y amoniaco acuoso, asícomo con un método para preservar Lactobacillus clearansen el cual uno o más de un, aminoácido que contiene azufre, ovoalbúmina, polvo biliar, trehalosa, rafinosa, células de levadura muertas, clorela, salvado de arroz, salvado, leche de soya y jugo de zanahoria están presentes como preservativos alrededor de las bacteri

Description

MEDIO DE CULTIVO PARA CULTIVAR Lactobacillus clearans, Y UN METODO PARA PRESERVAR TAL CEPA ANTECEDENTES DE LA INVENCION 1. Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un medio de cultivo que es adecuado para cultivar Lactobacillus clearans, el cual ha sido aislado y seleccionado per los inventores, y un método para preservar Lactobacillus clearans . 2. Descripción de la Técnica Relacionada El ciclo del mundo natural es uno de creación y decadencia, del cual ninguna sustancia biológica escapa. Los pantanos, también, rebosantes con fango reciente de. la decadencia de proteínas liberadas hacia el mundo natural, eventualmente se purifican, permitiendo que la tierra permanezca bella a su propia forma desde tiempos inmemoriales. Los mecanismos mediante los cuales ocurre esto han permanecido ocultos, pero ahora se sabe que involucran principalmente el comportamiento de microorganismos, que conducen al desarrollo contemporáneo de varios sistemas de purificación, incluyendo procesos de lodos activados, y su aplicación en el tratamiento de plantas para aguas residuales de la vida y aguas residuales de plantas. Dada la complejidad relacionada con la cuestión de que tipo de propiedades caracterizan a las bacterias implicadas en tal purificación, no es sorprendente que sea necesario un análisis y corroboración especializada adicionales. Un arreglo amplio y diverso de sustancias son el objeto de tal purificación, y finalmente seria imposible probar todas ellas. En consecuencia, nuestra atención se enfocó sobre sustancias odoríferas (la mayoría de las cuales son productos de la putrefacción y son nocivas) , las cuales son fácil y rápidamente determinables por el olfato, y se clasifican ampliamente en compuestos de azufre odoríferos, compuestos de nitrógeno odoríferos y compuestos de carbono odoríferos. Después de una investigación considerable, estudios sobre los compuestos odoríferos de baja masa molecular, es decir, compuestos de azufre odoríferos, tales como el sulfuro de sodio y sulfuro de metilo, los compuestos de nitrógeno odoríferos tales como el amoniaco, indol, y escatol y compuestos de carbono odorífero tales, como el ácido acético y el ácido butírico, han mostrado de manera concluyente que los objetivos fueron alcanzados de manera suficiente, permitiendo hacer un progreso dramático en la investigación sobre la purificación y desodorización . Es decir, que las bacterias limpiadoras capturan esas sustancias odoríferas como alimento, no como veneno, y las utilizan como componentes celulares para sí mismas o como una fuente de energía, aunque las bacterias que tienen una acción particularmente potente tienen una capacidad desodorizante . Un gran número de bacterias que tienen tales características se encuentran a través del mundo natural, y trabajan con el reloj en el trabajo de purificación para el cual son en su mayoría adecuadas. Nuestros cuerpos son un microcosmos, el canal entérico en particular es un órgano ligado directamente al mundo externo como parte del ambiente natural en sí. Podría sorprender, por lo tanto, que existan "expertos" en purificación en los intestinos. En base a los descubrimientos anteriores, los inventores estudiaron bacterias limpiadoras entéricas entre las bacterias no patógenas capaces de vivir en los intestinos. Es decir, que los inventores aislaron el género Lactobacillus, el cual se encuentra ampliamente en el mundo natural, desde dentro del cuerpo viviente tal como el canal entérico, la boca y la vagina, hasta las hierbas, hojas de árboles, frutas agrícolas, productos alimenticios fermentados, el suelo y aguas residuales. Como resultado, descubrieron la existencia de un grupo anteriormente desconocido que pertenece al género Lactobacillus capaz de exhibir una potente capacidad purificadora en los intestinos. Esas bacterias incluyen una gama considerablemente amplia de especies actualmente clasificadas como pertenecientes al género Lactobacillus, tales como L. casei, L. salivarius, L. brevis, y L. plantarum, y que se conocen colectivamente como Lactobacillus clearans .

Los Lactobacillus clearans, los cuales son lactobacilos novedosos capaces de hacer disminuir el sulfuro de sodio y amoniaco (Solicitud de Patente Japonesa Examinada (Kokoku) 4-632) , son bacterias útiles que exhiben una potente capacidad purificacora en los intestinos a través de su capacidad para incrementar el sulfuro de sodio, sulfuro de amonio, metil mercaptano, etil mercaptano, sulfuro de dimetilo, sulfuro de dietilo, acetaldehido , escatol, indol, metilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, y similares. Los inventores de este modo encontraron que esas especies del género Lactobacillus capaces de exhibir una potente actividad purificadora en los intestinos, descubriendo como resultado de la investigación bacteriológica que esas especies tenían funciones totalmente novedosas, y ganaron una patente para esas especies (1714431). Se ha vuelto evidente que los Lactobacillus clearans no sólo hacen disminuir las sustancias nocivas odoríferas en los intestinos, sino que también son un grupo que forma la flora intestinal, el cual sintetiza vitaminas y aminoácidos y controla el crecimiento de bacterias extrínsecas, que tiene un efecto tremendo sobre grupos tales como bacterias, las cuales pueden ser consideradas bacterias benéficas que tienen acción que es buena para el cuerpo viviente tales como una acción inmunoactivadora, típicamente grupos que pertenecen al género Lactobacillus y el género Bifidocaterium, y bacterias las cuales pueden encontrarse y pueden ser consideradas dañinas debido a su naturaleza nociva y patógena, típicamente grupos que pertenecen al género Veillonella y Clostridium, tales como el elchii, y que controlan, además, el crecimiento de bacterias patógenas, reducen su toxicidad, y asi sucesivamente. La Tabla 1 muestra las diferencias funcionales entre los Lactobacillus clearans y las especies convencionalmente conocidas del género Lactobacillus .

(Tabla 1) Comparación de las funciones entre Lactobacillus clearans y especies convencionales el género Lactobacillus. Parámetro Lactobacillus Especies clearans convencionales de Lactobacillus Vs . Putrefacción Hace disminuir la Utilizan y degradan enteral, sustancias mayoría de los compuestos de carbono odoríferas , compuestos nocivos odoríferos, pero no nocivas-compuestos odoríferos-compuestos tienen acción sobre de azufre, de azufre, compuestos compuestos nocivos compuestos de de nitrógeno y odoríferos tales como nitrógeno y compuestos de carbono- compuestos de azufre y compuestos de utilizándolos , compuestos de carbono degradándolos y nitrógeno desnaturalizándolos .

(Continuación de la Tabla 1) Comparación de las funciones entre Lactobacillus clearans y especies convencionales el género Lactobacillus. Parámetro Lactobacillus clearans Especies convencionales de Lactobacillus Desodorización ++ - a ± fecal Acción sobre Causa considerable Crecimiento cuando los bacterias benéficas crecimiento individuos continúan comúnmente 2 a 10 veces la ingestión presentes en los 10 a 100 veces 1 a 3 veces intestinos 10 veces < • Bifidobacterium • Lactobacillus Acción sobre Suprimidos fuertemente Tienen acción bacterias dañinas por el crecimiento supresora, pero no comúnmente considerable de puede ser muy presentes en los bacterias benéficas anticipada intestinos 1/20 a 1/100 1 a 1/5 • Veillonella 1/20 a 1/100 1 a 1/5 • Clostridium Acción + + - a + antiflatulenta Requerimiento Bajo a moderado alta nutrición nutricional (Continuación de la Tabla 1) Comparación de las funciones entre Lactobacillus clearans y especies convencionales el género Lactobacillus. Parámetro Lactobacillus clearans Especies convencionales de Lactobacillus Capacidad de + - a + crecimi ento intestinal Capacidad - a + estacionaria intestinal Acción sobre Los vuelve no Sin efecto patógenos durante patógenos (Conversión la simbiosis S-R) • Salmonella Patogenicidad Erradicada en descenso inactivada al 47avo co- con los patógenos subcultivo durante varias generaciones de subcultivo con todo • Shigella Patogenicidad patógenos inactivada al 108avo co-subculti o • E. coli (0-157) Patogenicidad inactivada al 18av° co- subcultivo Cuando se considera por qué los Lactobacillus clearans fueron capaces de ser producidos, puede inferirse lo siguiente. Es decir, la tierra fundida naciente se enfrió hace 4,600,000,000 de años, produciendo vapor de agua, el cual formó los primeros océanos. Cuando aún no existia todavía oxígeno, sin embargo, y el mar estaba compuesto de agua caliente ácida que contenía azufre, hierro y similares producidos por el magma. Sustancias orgánicas tales como los aminoácidos y ácidos nucleicos fueron sintetizadas poco tiempo después por reacciones químicas en el mar, las cuales se agregaron y condensaron en forma de gotas oleosas. Eventualmente, fueron surgiendo formas de vida de esas gotas oleosas y continuaron creciendo, consumiendo materiales orgánicos acumulándose en el mar hasta el borde la extinción. Sin embargo, entre esas forma de vida aparecieron bacterias anaerobias capaces de utilizar materiales inorgánicos tales como el azufre disuelto en el océano para adquirir energía y sintetizar materiales orgánicos a partir de dióxido de carbono. Esas bacterias anaerobias evolucionaron durante largos periodos de tiempo, diferenciándose en las primeras bacterias fotosintéticas que utilizaron energía para liberar oxígeno, y los predecesores ancestrales del género Lactobacillus encontrados actualmente. Esos jugaron un papel activo en la purificación de sustancias nocivas odoríferas del magma, gracias a lo cual la mayoría de las sustancias nocivas se precipitaron hacia el fondo del océano, al mismo tiempo que se incrementaba el oxigeno, permitiendo un ambiente hospitalario para que la vida continuara floreciendo gradualmente y formara los bloques constitutivos para el siguiente fenómeno explosivo de la vida. En algún tiempo durante este proceso, la mayoría de los Lactobacillus sucumbieron en la lucha por crecer con otras bacterias que se habían aclimatado a, y adaptado a, el ambiente duro del inmenso mundo natural, escapando a vivir en áreas ricas en nutrientes repletas con la existencia de carbohidratos, aminoácidos, vitaminas y similares y a áreas con un ambiente más moderado, más constante, después de lo cual su potencia purificadora inherente, es decir, la potencia purificadora contra compuestos de azufre odoríferos y nocivos y la potencia purificadora contra compuestos de nitrógeno odoríferos y nocivos, se perdiera gradualmente. El género Lactobacillus, sin embargo, ha retenido la potencia de utilizar compuestos de carbono odoríferos hasta hoy en día. Aunque pueden ser utilizados varios métodos bien conocidos tales como la liofilización, preservación ultrafría o métodos líquidos, húmedos, semisecos y secos o similares como métodos para preservar Lactobacillus s clearans , es más importante prevenir la pérdida de la capacidad característica de los Lactobacillus clearans para hacer disminuir las sustancias odoríferas y nocivas durante el almacenamiento, y el siguiente aspecto más importante es asegurar una mayor viabilidad y preservar a la vez esta capacidad. La investigación efectuada por los inventores claramente reveló la necesidad de consideraciones especiales para este fin. Es decir, que dada la presencia de sustancias que hacen que el titulo bacteriano decline rápidamente durante el subcultivo bacteriano, no sólo el titulo declinará gradualmente, sino que la sobrevivencia estará muy amenazada, sin importar que método de preservación sea utilizado. La liofilización es actualmente el método predominante para preservar bacterias, y los Lactobacillus no son la excepción. Aunque la liofilización ha sido utilizada para todos los productos que necesiten ser almacenados durante periodos de tiempo prolongados, tales como cepas antiflatulentas o de yoghurt, la capacidad de preservación de Lactobacillus básicamente no es considerada muy buena. De hecho, los intentos por recolectar y revivir células liofilizadas de Lactobacillus comercialmente disponibles a nivel doméstico y más amplio no han logrado un conteo de células viables indicado en virtualmente todos los productos, sin importar la fecha de expiración, entre los cuales se encontraban algunos productos en los cuales no fueron encontradas células viables. Este fue el caso, a pesar de la experiencia y los resultados de la investigación de los fabricantes. Los estudios hechos por los inventores sobre Lactobacillus clearans revelaron que no sólo el conteo de células viables declinaba en una primera etapa en presencia de los preservativos comúnmente utilizados, sino que conducían aún a un declive en el título. Puede asumirse que los Lactobacillus clearans son los descendientes, o las llamadas cepas mutantes atavísticas, que han sobrevivido hasta la actualidad debido a la herencia continua de la acción purificadora, la cual sus ancestros conservan a todo costo, contra compuestos de azufre, compuestos de nitrógeno y compuestos de carbono odoríferos. Es imposible predecir que destino tendrán los delicados Lactobacillus clearans, los cuales están ahora en un estado de flujo entre los Lactobacillus ancestrales y los Lactobacillus contemporáneos, bajo el cuidado humano. Las diferentes preocupaciones son mandadas por los medios de cultivo utilizados para cultivar tales bacterias y los preservativos utilizados para preservarlas. De hecho, en las pruebas sobre esas bacterias, el título disminuyó durante el subcultivo y el almacenamiento. Por lo tanto, los aspectos supremos son qué condiciones de subcultivo permitirían que el potente título permaneciera sin ser afectado, y qué condiciones de almacenamiento permitirían que el potente título permaneciera sin ser afectado.

BREVE DE DESCRIPCION DE LA INVENCION Como resultado de una investigación extensa para remediar esos problemas, los inventores desarrollaron un medio de cultivo capaz de sostener el titulo de Lactobacillus clearans, disminuyendo el sulfuro de sodio y amoniaco, y un método de preservación. Es decir, que la presente invención es un medio de cultivo para cultivar el Lactobacillus clearans, que comprende la adición de al menos uno o más del sulfuro de sodio y amoniaco acuoso, de modo que, durante el cultivo de Lactobacillus clearans, al menos uno o más del sulfuro de sodio y amoniaco disminuya por la acción de Lactobacillus clearans a las 24 horas de cultivo, y es un medio de cultivo que preferiblemente comprende la adición de sulfuro de sodio en una concentración de 500 ppm, donde el sulfuro de sodio disminuyó hasta un 10% o más a las 24 horas de cultivo durante el cultivo de Lactobacillus clearans, y que de manera preferible comprende la adición de amoniaco acuoso a una concentración de 500 ppm, donde el amoniaco disminuyó en un 10% o más a las 24 horas de cultivo durante el cultivo de Lactobacillus clearans . El medio de cultivo preferiblemente comprende la adición de al menos uno o más compuestos de azufre odoríferos, compuestos de nitrógeno odoríferos, y compuestos de carbono odoríferos, donde el compuesto de azufre odorífero es preferible al menos uno o más del sulfuro de sodio, sulfuro de hidrógeno, sulfuro de amonio, metil mercaptano, etil mercaptano, dimetil mercaptano, sulfuro de dimetilo, disulfuro de dimetilo, sulfuro de dietilo, sulfuro de dibutilo y derivados de los mismos, el compuesto de nitrógeno odorífero es de manera preferible, al menos, uno o más del amoniaco, escatol, indol, acetanilida, metilamina, dimetilamina, dietilamina, trietilamina, y derivados de los mismos, y el compuesto de carbono odorífero es de manera preferible, al menos uno o más del ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, crotonaldehído, fenol, alcohol butílico, alcohol amílico y derivados de los mismos. El medio de cultivo también, de manera preferible, comprende la adición de al menos uno o más aminoácidos que contienen azufre, ácido glutámico, lisina y ácido aspártico como un aminoácido, preferiblemente la adición de al menos una o más de la Vitamina C, Vitamina E, Vitamina B12, pantotenato de calcio, ácido fólico y nicotinamida como una vitamina, de manera preferible la adición de al menos uno o más del manganeso, zinc, magnesio y molibdeno como un componente mineral, de manera preferible la adición de al menos uno o más de clórela CGF, leche de soya y polvo biliar. La segunda de las presentes invenciones es un método para preservar Lactobacillus clearans, que comprende la presencia de al menos uno o más de los aminoácidos que contienen azufre, ovoalbúmina, polvo biliar, trehalosa, rafinosa, células de levadura muertas, clórela, salvado de arroz, salvado, leche de soya y jugo de zanahoria como preservativo alrededor de los Lactobacillus clearans durante la preservación de los Lactobacillus clearans, y de manera preferible comprende, además del preservativo anteriormente mencionado, la adición de al menos uno o más del ácido glutámico, lisina, ácido aspártico, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina B^, pantotenato de calcio, ácido fólico, nicotinamida, manganeso, zinc, magnesio, molibdeno, sulfuro de sodio, sulfuro de hidrógeno, sulfuro de amonio, metil mercaptano, etil mercaptano, dimetil mercaptano, sulfuro de dimetilo, disulfuro de dimetilo, sulfuro de dietilo, sulfuro de dibutilo, amoniaco, escatol, indol, acetanilida, metilamina, dimetilamina, dietilamina, trietilamina, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, crotonaldehxdo, fenol, alcohol butílico, alcohol amílico y derivados de los mismos alrededor del los Lactobacillus clearans, y además, de manera preferible, comprende la presencia de al menos una o más de leche descremada, pulverizada, derivada de animales, ovoalbúmina, lactosa, polvo de extracto de hígado y suero, así como al menos uno o más de suero de soya derivado de vegetales, trehalosa, rafinosa, almidón, clórela, clórela CGF, salvado de arroz, salvado, jugo de alfalfa, jugo de trébol, extracto de germen de trigo, leche de soya, jugo de tomate, jugo de zanahoria, jugo de uva, polvo de sábila, polvo de té verde, y células de levadura muertas como preservativos, y además de los preservativos anteriormente mencionados, la adición de la menos uno o más del ácido glutámico, lisina, ácido aspártico, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina Bi2, pantotenato de calcio, ácido fólico, nicotinamida, manganeso, zinc, magnesio, molibdeno, sulfuro de sodio, sulfuro de hidrógeno, sulfuro de amonio, metil mercaptano, etil mercaptano, dimetil mercaptano, sulfuro de dimetilo, disulfuro de dimetilo, sulfuro de dietilo, sulfuro de dibutilo, amoniaco, escatol, cetanilida, metilamina, dimetilamina, dietilamina, trietilamina, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, crotonaldehído, fenol, alcohol butílico, alcohol amílico y derivados de los mismos alrededor del los Lactobacillus clearans . Adicionalmente, el método para preservar Lactobacillus clearans puede comprender cualquiera de los métodos de liofilización, preservación ultrafría o en líquido, húmedo, semiseco o seco.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 es una ilustración de un cultivo con el medio de cultivo para Lactobacillus clearans y el ensayo del título en él.

DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los Lactobacillus clearans a los que se hace referencia en la presente invención son cepas novedosas del género Lactobacillus, las cuales tienen las siguientes características bioquímicas (1), (2), (3), y (4). A saber, son cepas de Lactobacillus: (1) las cuales pueden hacer disminuir tanto Na2S-9H20 como NH4OH cuando existen o se agregan 0.5 g de Na2S-9H20 y/o 0.5 mi de NH4OH a 5 g de extracto de carne, 5 de peptona, 1 g de glucosa, 1 g de CaC03, y 1 L de agua (pH neutro); (2) las cuales no muestran acción promotora del crecimiento aún cuando exista o se agreguen 0.5 de Na2S-9H20 y/o 0.5 mL de NH4OH durante la fase de crecimiento logarítmico durante el cultivo de las bacterias en un medio que comprende 1 g de casaminoácido y vitaminas (A: 900 UI; Bi: 1 mg; B2 : 1 mg; B6: 1 mg: 5 ?: nicotinamida : 16 mg; pantotenato de calcio: 8 mg; C: 64 mg; D2 : 120 UI) en medio de Stephanson-Whetham (abreviado como S- ; 1 g de KH2P04, 0.7 de MgS04-7H20; 1 g de NaCl; 4 g de (NH )2HP04; 0.03 g de FeS04-H20; 5 g de glucosa); (3) cepas aisladas naturales que muestran mayor resistencia que los Lactobacillus convencionalmente conocidos y menor resistencia que los Lactobacillus clearans contra Na2S-9H20; y (4) que son bastoncillos gram positivos, no móviles, catalasa negativos, sin reducción de nitratos, sin descomposición de gelatina, sin formación de indol o sulfuro de hidrógeno, y con alta capacidad para formar ácido láctico a partir de glucosa y lactosa, asi como el crecimiento acelerado con la adición de ácido acético (Solicitud de Patente Japonesa Examinada (Kokoku) 4-632) . Los diferentes medios dados en las Tablas 2, 3, 4, 5 y 6, asi como los diferentes tipos de medios clasificados en medio bajo en nutriente, medio moderado en nutriente y medio alto en nutriente, pueden ser utilizados para el subcultivo del Lactobacillus clearans .

(Tabla 2) Composiciones del medio de subcultivo (1) (composición en 1 L) medio de Stephanson-Wetham KH2P04 1 g gS04 ¦ 7H20 0.7 g NaCl 1 g (NH4) 2HPO4 4 g FeS0 -H20 0.03 g Glucosa 5 g (Tabla 3) Composiciones del medio de subcultivo (2) (composición en 1 L) medio MRS (Tabla 4) Composiciones del medio de subcultivo (3) (composición en 1 L) medio bajo en nutriente Medio Composición a-1 1 g de casaminoácido agregado al medio de Stephanson-Wetham (Tabla 4) Composiciones del medio de subcultivo (3) (composición en 1 L) medio bajo en nutriente (continuación) 1) incluye Vitamina A: 900 UI; Vitamina ??: 1 mg Vitamina B2: 1 mg; Vitamina Bi2: 5 µg: n cotinamida : 16 mg pantotenato de calcio: 8 mg; Vitamina C: 64 mg; Vitamina D2 120 UI n 1 g.

(Tabla 5) Composiciones del medio de subcultivo (4) (composición en 1 L) medio moderado en nutriente Medio Composición b-1 1 g de casaminoácido 0.1 g de vitamina 11 5 g de leche descremada agregados a medio de Stephanson-Wetham (Tabla 5) Composiciones del medio de subcultivo (4) (composición en 1 L) medio moderado en nutriente (continuación) 1) incluye Vitamina A: 900 UI; Vitamina Bx : 1 mg Vitamina B2 : 1 mg; Vitamina BX2 : 5 g: nicotinamida : 16 mg pantotenato de calcio: 8 mg; Vitamina C: 64 mg; Vitamina D2 120 UI n 1 g.

(Tabla 6) Composiciones del medio de subcultivo (5) (composición en 1 L) medio alto en nutriente Medio Composición c-1 medio MRS c-2 100 g de leche descremada c-3 30 g de leche descremada agregada a medio MRS El método para ensayar el título del Lactobacillus clearans se describe más adelante; los siguientes son ejemplos de las funciones que tienen esas bacterias: (1) la capacidad de hacer disminuir sustancias nocivas odoríferas tales como el compuesto de azufre sulfuro de sodio y un compuesto de nitrógeno amoniaco; (2) la capacidad para mejorar la flora intestinal, es decir, la capacidad de incrementar bacterias benéficas tales como Bifidobacterium y Lactobacillus, y para hacer disminuir notablemente bacterias dañinas tales como Veillonella y Clostridium, incluyendo Welchii; y (3) la capacidad de suprimir el crecimiento y toxicidad de bacterias patógenas infecciosas intestinales. Aunque esas tres capacidades pueden ser ensayadas individualmente y evaluadas de manera completa, los resultados de estudios extensivos han revelado que las capacidades anteriormente mencionadas de los Lactobacillus clearans que están íntimamente interrelacionadas . Por lo tanto, el ensayo del título se limitó a (1) la capacidad para hacer disminuir sustancias nocivas odoríferas en el intestino, la cual se mide fácilmente y proporciona resultados rápidos. El medio de ensayo de título para ensayar la capacidad para hacer disminuir sustancias nocivas odoríferas en el intestino consistió de 0.5 g de sulfuro de sodio o 0.5 mL de amoniaco acuoso agregado al medio que comprende 5 g de extracto de carne, 5 g de peptona, 5 g de glucosa, 3 g de butirato de sodio, y 3 g de carbonato de calcio. El medio fue inoculado con la bacteria de prueba para un cultivo anaerobio a 37°C, y se determinó la disminución del sulfuro de sodio o amoniaco agregado con el tiempo. A tales tiempos, el sulfuro de sodio fue medido por el método de acetato de plomo o el método de titulación con yodo en JIS K 0102-1985, mientras que el amoniaco fue medido por el método de Nestler o el método de absorbancia de azul de indofenol en JIS K 0102-1985. Los Lactobacillus clearans que se ensayaron son muy diversos; la Tabla 7 da el porcentaje de disminución en el sulfuro de sodio y amoniaco determinado cuando el titulo de tres cepas típicas, a saber, BHPH-L-1 (FERM P-17149, FERM BP-6971), BHPH-L-2 (FERM P-17148, FERM BP-6972), y BHPH-L-3 (FERM P-17150, FERM BP-6973), fue alto.

(Tabla 7) Porcentaje de disminución del sulfuro de sodio y amoniaco por- Lactobacillus clearans con el titulo alto Diminución (%) de Disminución (%) del FERM No. sulfuro de sodio amoniaco 24 hr 48 hr 72 hr 24 hr 48 hr 72 hr P-17148 20 40 50 15 25 40 BP-6972 (Tabla 7) continuación Porcentaje de disminución del sulfuro de sodio y amoniaco por Lactobacillus clearans con el titulo alto El medio de cultivo base idealmente tiene un excelente crecimiento y disminución mínima en el título. Este es el punto más importante relacionado con la producción de bacterias desde el punto de vista práctico del cultivo en masa (a gran escala) . Después de buscar un medio de cultivo ideal, encontramos exitosamente la clave. Es decir, como se indica en la Tabla 8, se vuelve evidente que cuando el cultivo fue manejado con la adición del sulfuro de sodio o amoníaco al medio base, fue esencial para las dos sustancias agregadas que disminuyeran en algún grado a las 24 horas, con subcultivos en los medios sin cualquiera de tal disminución dando como resultado una pérdida considerable del título, haciéndolas finalmente inútiles. Es decir, que la Tabla 8 muestra que, en casos donde se agregaron 0.5 g de sulfuro de sodio y 0.5 mL de amoniaco acuoso a 1 litro de medio, las sustancias odoríferas que sirven como componentes nutrientes inherentes, tales como las sustancias de azufre, nitrógeno y carbono odoríferas, no se utilizaron como fuentes de nutrientes en los medios altos de nutrientes exclusivamente, y que sólo se utilizaron fuentes de nutrientes fácilmente utilizables, dando como resultado mayores cantidades de bacterias, pero con la pérdida gradual y la activación final de las características bacterianas. Aquí, amoniaco acuoso se refiere al reactivo de amoniaco acuoso, tal como una solución acuosa que contiene 25.0 a 27.9 % en peso/volumen de amoniaco .

(Tabla 8) Porcentaje de la disminución del sulfuro de sodio y amoniaco en medios de cultivo a los cuales se hablan agregado La.ctobaci.llus clea.ra.ns Disminución inicial (%) Tipo Medio Sustrato Bacteria probada Compuestos Compuestos agregado FERM NO. de azufre de odoríferos nitrógeno odoríferos 24 48 72 24 48 72 hr hr hr hr hr hr medio a-1 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 10 15 25 10 20 30 y P-17149, BP-6971 15 20 35 15 30 40 ftmoniaco acuoso P-17150, BP-6973 20 30 40 20 35 45 bajo en a-2 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 10 15 25 10 15 20 y P-17149, BP-6971 15 20 30 15 25 40 ínnoniaco acuoso P-17150, BP-6973 25 35 40 20 30 40 (Continuación Tabla 8) Porcentaje de la disminución del sulfuro de sodio y amoniaco en medios de cultivo a los cuales se hablan agregado Lactobacillus clearans Disminución inicial ( %) Tipo Medio Sustrato Bacteria probada Compuestos Compuestos agregado FERM NO. de azuf e de odoríferos nitrógeno odoríferos nutriente a-3 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 15 25 30 15 25 35 y P-17149, BP-6971 20 30 35 20 30 40 Amoniaco acuoso P-17150, BP-6973 25 35 10 20 35 45 medio b-1 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 10 15 25 10 15 20 y P-17149, BP-6971 15 20 30 15 20 30 Amoniaco acuoso P-17150, BP-6973 20 25 30 15 20 25 moderado en b-2 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 0 3 10 10 0 10 y P-17149, BP-6971 0 5 10 0 5 10 Amoniaco acuoso P-17150, BP-6973 0 5 15 0 5 10 nutriente b-3 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 5 10 15 5 7 10 y P-17149, BP-6971 5 10 15 5 8 10 Amoniaco acuoso P-17150, BP-6973 5 7 10 5 7 10 medio c-1 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 0 2 7 0 3 5 y P-17149, BP-6971 0 0 3 0 0 2 Amoniaco acuoso P-17150, BP-6973 2 3 5 2 5 7 alto en c-2 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 0 0 8 0 0 5 y P-17149, BP-6971 0 0 10 0 0 5 ñmoniaco acuoso P-17150, BP-6973 0 0 7 0 0 5 nutriente c-3 Sulfuro de sodio P-17148, BP-6972 0 0 5 0 0 5 y P-17149, BP-6971 0 0 5 0 0 5 Amoniaco acuoso P-17150, BP-6973 0 0 10 0 0 5 Los aminoácidos más importantes que constituyen las células bacterianas o enzimas fueron estudiados por tipo por sus efectos sobre Lactobacíllus clearans . Esto reveló que la adición de aminoácidos específicos, a saber, aminoácidos que contienen azufre tales como la cistin metionina, cisteína y taurina, así como el ácido glutámico, glicina y ácido aspártico, fueron extremadamente efectivos cuando se agregaron durante el subcultivo, mientras que la adición de prolina, tirosina y similares llevó a un rápido de decremento en el título. Es decir, que podrían ser ampliamente clasificados en tres grupos: ciertos tipos de aminoácidos que ayudan a mantener el título de Lactobacíllus clearans, otros tipos que tuvieron menos efecto, y otros aún que llevaron a una disminución significativa en el título. Esto resolvió exitosamente la contradicción en experimentos convencionales, específicamente, la contradicción de que si fuese mejorado un nutriente en un esfuerzo por facilitar el crecimiento de las bacterias, el nutriente sería excelente para las bacterias, aunque las características distintivas de hacer disminuir las sustancias nocivas se perdería. En consecuencia, es necesario puntualizar enfáticamente que los aminoácidos efectivos anteriormente mencionados podrían ser mezclados con los compuestos de azufre, nitrógeno y carbono odoríferos anteriormente mencionados para prevenir que el título decaiga aún más.

Nosotros buscamos sustancias capaces de tal mejora o potenciación y condujimos estudios extensivos. Como resultado, descubrimos que la Vitamina C, la Vitamina E, Vitamina B12, pantotenato de calcio, ácido fólico, nicotinamida y similares fueron vitaminas efectivas. Se volvió claro que esas vitaminas están profundamente implicadas en la producción de enzimas que hacen disminuir sustancias odoríficas tales como compuestos de azufre, nitrógeno y carbono odoríferos. También se descubrió que el manganeso, zinc, magnesio, molibdeno y similares son minerales efectivos. Se volvió claro que esos minerales están profundamente implicados en la actividad de las enzimas que hacen disminuir sustancias odoríferas tales como compuestos de azufre, nitrógeno y carbono odoríferos . Esto fue confirmado cultivando Lactobacillus clearans en medios que contienen las vitaminas y minerales efectivos anteriormente mencionados, y posteriormente removiendo las bacterias, y a continuación agregando simplemente una porción del caldo de cultivo resultante a un líquido que contiene una sustancia odorífica tal como un compuesto de azufre, nitrógeno o carbono odorífico, dando como resultado la disminución de tales sustancias odoríferas. También se descubrió que la clórela CGF, leche de soya, polvo biliar y similares eran sustancias efectivas para mantener el título ce Lactobacillus clearans .

Además del estudio y los componentes del cultivo, también es preferible subcultivar bacterias en la fase de crecimiento logarítmico en medios subsecuentes durante el subcultivo o crecimiento, en un esfuerzo por prevenir la disminución en el título. También es preferible evitar la desnaturalización térmica de los componentes del medio durante la manufactura y esterilización del medio . Se estudió un método de preservación, dando como resultado la conclusión de que el punto más importante es producir primero un preservativo favorable. Los preservativos comúnmente utilizados hasta el presente en lactobacillus , tales como la lactosa, varios tipos de almidón y leche descremada, (1) son fáciles de manejar, (2) son baratos (3) pueden administrarse directamente en el cuerpo viviente, y también no producen incomodidad cuando se toman. Por esas y otras razones, existe una fuerte tendencia a utilizarlos, principalmente por conveniencia humana, aún cuando son favorables y no adecuados para lactobacillus. Actualmente, pueden tomarse en forma de cápsulas entéricas, pero hemos decidido revisar esas circunstancias desde el punto de vista de los lactobacillus, sin asumir prioridad sobre la parte de los humanos, como una manera de llamar la atención hacia los lactobacillus. De este modo, se probaron una amplía variedad de sustancias como preservativos, desde las sustancias a base de proteínas, comúnmente utilizadas en cultivos bacterianos, hasta composiciones de varias sustancias animales y de plantas y sacáridos, para una amplia variedad de cepas bacterianas, incluyendo las tres cepas típicas de Lactobacillus clearans, es decir, BHPH-L-1 (FERM P-17149, FERM BP-6971), BHPH-L-2 (FERM P-17148, FERM BP-6972), Y BHPH-L-3 (FERM P-17150, FERM BP-6973) . Las cantidades en las cuales los preservativos se agregan varían ampliamente dependiendo del tipo de preservativo, con un intervalo variable de idoneidad, y de este modo no pueden determinarse como materia de principio absoluto, sino intervalos generales, en términos de la relación en peso de los sólidos preservativos de 1 a 500 veces de esas células bacterianas centrifugadas . Los almidones en los que se hace referencia a la presente invención, no se limitan a ningún material inicial particular sino que los ejemplos incluyen al almidón soluble, almidón de maíz, almidón de papa y almidón de camote. Las células de levadura muerta a las que hace referencia la presente invención se refieren a levaduras en un estado no viable. Un ejemplo es la levadura de hornear, la cual puede ser tratada con 10 minutos de tratamiento con agua caliente a 100°C y a continuación secada. Después de ser matada, sin embargo, la levadura de hornear puede estar en un estado seco o húmedo. Polvo de extracto de levadura se refiere al extracto de levadura que ha sido secado y convertido en polvo. El método de secado no se limita en particular .

Ejemplos Se subcultivaron Lactobacillus clearans en diferentes medios dados en las Tablas 2, 3, 4, 5 y 6, los medios para ensayar el titulo se inocularon en cada etapa del subcultivo, y el titulo se ensayó desde la primera hasta la novena generaciones. El procedimiento se ilustra en la Figura 1, los resultados del ensayo del titulo se dan en la Tabla 9, y la Tabla 10 resume todas las cepas. El titulo está representado por circuios concéntricos para indicar virtualmente ninguna disminución mostrada en el titulo, por un circulo para indicar una ligera de disminución en, pero suficiente retención del, titulo, por un triángulo para indicar una disminución gradual en el titulo que fue inadecuado para propósitos prácticos, y por una "x" para indicar una pérdida considerable del titulo. Básicamente, se notó una disminución en el titulo en todos los medios, incrementándose en el orden del medio bajo, a moderado, a alto en nutrientes. Esas diferencias incrementaron rápidamente con subcultivos adicionales .

Tabla 9. Correlación entre el número de subcultivos y el titulo de Lactobacillus clearans en varios medios Tabla 9. Correlación entre el número de subcultivos y el titulo de iactojbacillus clearans en varios medios (continuación) 1) compuestos de azufre odoríferos; 2) compuestos de nitrógeno odoríferos (Tabla 10) Cultivo de actobacill s clearans y correlación total de los subcultivos y titulo En vista de sus características, los Lactobacillus clearans fueron cultivados con la adición de las sustancias odoríferas putrefactas entéricas que comprenden compuestos de azufre, nitrógeno y carbono odoríferos agregados a medios de cultivo bajos, moderados y altos en nutrientes, las bacterias fueron transplantadas a medios para ensayar el título, y su título fue ensayado, con los resultados dados en la Tabla 11. Aquí, los componente F son aquéllos que incluyen 0.2 g de sulfuro de metilo, 0.3 de escatol y 1 g de ácido butírico por litro de medio. Otros de los componentes F, sustancias odoríferas putrefactas entéricas que comprenden compuestos de azufre, nitrógeno y carbono odoríferos, tales como el sulfuro de sodio, mercaptano, indol, ácido acético y ácido propiónico podrían ser seleccionados para la prueba sin mayores diferencias en los resultados.

Tabla 11. Correlación entre el número de subcultivos y el titulo de Lacbobacillus clearans en medio que contiene componente F Tabla 11. Correlación entre el número de subcultivos y el titulo de Lactobacillus clearans en medio que contiene componente F (continuación) Tabla 11. Correlación entre el número de subcultivos y el titulo de Lactobaclllus clearans en medio que contiene componente F (continuación) compuestos de azufre odoríferos; compuestos de nitrógeno odoríferos La Tabla 11 muestra que la adición de componentes F al medio base como los medios de subcultivo y crecimiento fue importante para prevenir que el título de Lactobaclllus clearans disminuyera, siendo esto particularmente cierto cuando el medio base fue los medios altos en nutrientes. También estuvo claro que hubo una disminución relativamente menor en el título a la tercera generación del subcultivo cuando se agregaron los componentes F. El título disminuyó de manera rápida posteriormente, sin embargo.

En términos de preservativos, la Tabla 12 muestra los cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans cuando se agregaron preservativos a base de proteínas-aminoácido, la Tabla 13 muestra los cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans cuando se agregaron sacáridos y preservativos complejos de proteína animal-vitamina-mineral, y la Tabla 14 muestra los cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans cuando se agregaron preservativos complejos de proteínas de plantas-vitamina-mineral de otros preservativos. Aquí, jugo de alfalfa y jugo de trébol se refieren a líquidos los cuales se hacen agregando diez veces agua a hierba de alfalfa o hierba de trébol para hacer un jugo, siendo esos utilizados como jugo de alfalfa o jugo de trébol, respectivamente. Las cantidades en las cuales los preservativos se agregaron se expresaron en términos de la relación en peso del preservativo en relación al peso de las células viables. Por ejemplo, una cantidad de 10 indica que el preservativo fue agregado una cantidad 10 veces la de las células viables. La viabilidad de Lactobacillus clearans se expresó como un porcentaje, donde el 100% es el conteo de células viable inmediatamente después de la liofilización. La viabilidad durante a liofilización está indicada como círculos concéntricos cuando la viabilidad es mayor de 90%, como dos círculos concéntricos a un círculo cuando el porcentaje es del 80 al 90%, como un círculo cuando el porcentaje es del 60 al 80%, como un ¦ cuadrado cuando el porcentaje es del 40 al 60%, como un triángulo cuando el porcentaje es del 20 al 40%, y como una "x" cuando el porcentaje es menor del 20%. Los cambios en el titulo de Lactobacillus clearans durante el almacenamiento están indicados como ++ cuando el titulo se mantuvo a un alto nivel, como + cuando el titulo disminuyó ligeramente, como ± cuando el titulo disminuyó claramente, como - cuando el titulo disminuyó considerablemente, como -- cuando el titulo disminuyó rápidamente.

(Tabla 12) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans con el uso de preservativos a base de proteína-aminoácido Preservativo Cambios con el tiempo durante el almacenamiento Resultados durante Viabilidad (%) Cambios ' Tipo Cantidad la en el título agregada liofilización 3 meses 6 meses 12 meses Peptona 10 ? 30 10 2 — Casamir.oácido 10 ? 50 35 20 + Cistina 20 O 70 50 35 + Cisteína 20 O 65 45 30 + Metionina 20 O 65 45 30 + (Tabla 12) Cambios en la viabilidad de Lactóbacill s clearans con el uso de preservativos a base de proteina-aminoácido (continuación) Preservativo Cambios con el tiempo durante el almacenamiento Resultados durante Viabilidad (%) Cambios Tipo Cantidad la en el titulo agregada liofilización 3 meses 6 meses 12 meses Taurina 20 O 70 50 35 + Alanina 20 ? 30 15 5 - Glicina 20 ? 25 10 2 - Glutamato de sodio 20 ? 60 40 20 + Ácido aminobutirico 20 ? 65 45 25 ± Leucina 20 ? 25 10 3 - Lisina 20 ? 30 15 5 + Triptófano 20 ? 25 10 4 - Arginina 20 ? 20 5 2 - Aspargina 20 ? 55 30 15 ± Ovoalbúmina 20 O 70 50 30 Suero de soya 20 O 60 45 25 ± Yema 100 O 50 40 30 ± Gelatina 10 X 10 3 0 — * expresada como una relación en peso del preservativo en relación al peso de células viables (Tabla 13) Cambios en la viabilidad de Lactohacillus clea.ra.ns con el uso de sacáridos y preservativos complejos basados en proteina animal-vitamina-mineral Preservativo Cambios con el tiempo durante el almacenamiento Resultados durante Viabilidad (%) Cambios la Tipo Cantidad en el titulo agregada liofilización 3 meses 6 meses 12 meses Sacáridos Lactosa 100 ? 70 50 20 + Almidón soluble 100 ? 60 40 15 + Almidón de papa 100 ? 30 20 10 - Sucrosa 20 ? 30 15 5 - Glucosa 20 ? 25 15 5 - Trehalosa 40 O 75 50 30 + (Tabla 13) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans con el uso de sacáridos y preservativos complejos basados en proteina animal-vitamina-mineral (continuación) * expresada como una relación en peso del preservativo en relación al' peso de células viables (Tabla 14) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans con el uso de complejos de proteína de planta-vitamina-mineral y otros Preservativo Cambios con el tiempo durante el almacenamiento Resultados durante Viabilidad (%) Cambios la Tipo Cantidad en el título agregada liofilización 3 meses 6 rieses 12 meses Complejos de proteína-vitamina-mineral (planta) Clórela 50 O 65 45 35 + Clórela CGF 20 ? 60 40 30 + Salvado de arroz 20 o 60 50 35 + Salvado 20 o 55 45 33 + Jugo de alfalfa 40 ? 50 35 25 + (hierba ) Miso pulverizado 20 ? 20 10 7 - Polvo de azuki 20 ? 25 10 5 - Harina para fideos 20 X • 20 5 1 — de soba (Tabla 14) Cambios en la viabilidad de Lactábacillvts clearans con el uso de complejos de proteína de planta- itamina-mineral y otros (continuación) * expresada como una relación en peso del preservativo en relación al peso de células viables Es evidente a partir de las Tablas 12, 13 y 14 que el uso de preservativos da alta viabilidad durante la liofilización de Lactobacillus clearans da como resultado buena viabilidad durante el almacenamiento también, y que se obtuvieron disminuciones menores en el titulo al mismo tiempo. Es decir, que determinando la viabilidad justo durante la liofilización, fue posible hacer un progreso dramático en la investigación subsecuente sobre el último estudio de las condiciones, de la selección de los preservativos a la temperatura de precongelamiento y liofilización, tiempo de secado y similares, son consumir mucho tiempo. Como resultado, se volvió claro que los métodos comúnmente utilizados para los Lactobacillus conocidos convencionalmente eran adecuados para condiciones tales como la temperatura de precongelamiento y liofilización y tiempo de secado durante el manejo del Lactobacillus clearans, pero que la efectividad del preservativo fue el factor más importante para sostener la viabilidad y el titulo. Los preservativos sin efectos preservativos cuando se utilizaron por si mismos fueron excluidos, y los preservativos restantes fueron estudiados en varias combinaciones. Algunos de los resultados se dan en las Tablas 15, 16 y 17. Aquí, las cantidades en las cuales los preservativos fueron agregados se expresaron como la relación en peso del preservativo en relación al peso de células viables. Por ejemplo, una cantidad de 10 indica que el preservativo fue agregado en una cantidad 10 veces la de las células viables. La viabilidad de Lactobacillus clearans durante la liofilización está indicada como dos circuios concéntricos cuando la viabilidad es mayor de 90%, como dos circuios concéntricos a un circulo cuando el porcentaje es del 80 al 90%, como un círculo cuando el porcentaje es del 60 al 80%, como un cuadrado cuando el porcentaje es del 40 al 60%, como un triángulo cuando el porcentaje es del 20 al 40%, y como una "x" cuando el porcentaje es menor del 20%. Una comparación de las Tablas 13 y 14 revela que los preservativos dieron mejor viabilidad cuando se utilizaron en combinación que cuando se utilizaron solos. El uso combinado de preservativos derivados de animales con tipos derivados de plantas dieron como resultado buena viabilidad durante la liofilización, por supuesto, pero también mejores efectos durante el almacenamiento posterior. Los resultados se dan en la Tabla 18, donde los cambios en el título de Lactobacillus clearans durante el almacenamiento están indicados como ++ cuando el título se mantuvo a un alto nivel, como + cuando el título disminuyó ligeramente, como ± cuando el título disminuyó claramente, como - cuando el título disminuyó considerablemente y como -- cuando el título disminuyó rápidamente.

(Tabla 15) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans con combinaciones de dos tipos de preservativos Tipo de Cantidad agregada* Resultados durante preservativo la liofilización Ovoalbúmina 10 o~® Trehalosa 20 Ovoalbúmina 10 O Leche descremada 100 Ovoalbúmina 10 ® Leche de soya 70 Ovoalbúmina 10 o~® Jugo de zanahoria 35 Trehalosa 2 o~® Leche descremada 100 Trehalosa 20 ® Leche de soya 70 Trehalosa 20 o Jugo de zanahoria 35 Lecha descremada 75 ® Leche de soya 50 (Tabla 15) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clea.xa.ns con combinaciones de dos tipos de preservativos (continuación) * expresada como una relación en peso del preservativo en relación al peso de células viables (Tabla 16) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans con combinaciones de tres tipos de preservativos Tipo de Cantidad agregada* Resultados durante preservativo la liofili zación Ovoalbúmina 7 Trehalosa 15 O Leche descremada 80 (Tabla 16) Cambios en la viabilidad de XacfcoJacilIus clearans con combinaciones de tres tipos de preservativos (continuación) Tipo de Cantidad agregada* Resultados durante preservativo la liofilización Ovoalbúmina 7 Trehalosa 15 o~® Leche de soya 65 Ovoalbúmina . - 7 Trehalosa 15 o~® Jugo de Zanahoria 30 Ovoalbúmina 7 Leche descremada 70 ® Leche de soya 45 Ovoalbúmina 7 Leche descremada 70 o~® Jugo de zanahoria 30 Trehalosa 15 Leche descremada 70 ® Leche de soya 45 (Tabla 16) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans con combinaciones de tres tipos de preservativos (continuación) relación al peso de células viables (Tabla 17) Cambios en la viabilidad de Lactobacillus clearans con combinaciones de cuatro tipos de preservativos Tipo de Cantidad agregada* Resultados durante preservativo la liofilización Ovoalbúmina 7 Trehalosa 15 ® Leche descremada 70 Leche de soya 45 (Tabla 17) Cambios en la viabilidad de Lacbobacillus clearans con combinaciones de cuatro tipos de preservativos (continuación) Tipo de Cantidad agregada* Resultados durante preservativo - la liofilización Ovoalbúmina 7 Trehalosa 15 o~® Leche descremada 70 Jugo de zanahoria 25 Ovoalbúmina 7 Trehalosa 15 ® Leche de soya 45 Jugo de Zanahoria 25 Trehalosa 15 Leche descremada 70 ® Leche de soya 45 Jugo de zanahoria 25 Ovoalbúmina 7 Trehalosa 15 Leche descremada 70 @ Leche de soya 45 Jugo de zanahoria 25 * expresada como una relación en peso del preservativo en relación al peso de células viables (Tabla 18) Cambios en la viabilidad y titulo de Lactobacillus clearans con el uso de preservativos que dan más del 90% de viabilidad durante la liofilización Fue evidente que se obtuvieron efectos preservativos excelentes con el uso conjunto de sustancias con las cuales los lactobacillus se adhieren y viven juntos en una relación simbiótica en el mundo natural, tal como en el salvado de arroz, salvado, levadura, clórela, hierbas tales como el trébol y frutas tales como las uvas, junto con las sustancias marcadas con un sólo circulo o cuadrado en las Tablas 12, 13 y 14, tales como la leche de soya.

También se confirmó que la capacidad de preservación podría mejorar aún más cuando las sustancias mantienen efectivamente el título, tales como compuestos de azufre, nitrógeno, y carbono odoríferos, aminoácidos tales como los aminoácidos que contienen azufre y ácido glutámico, vitaminas tales como la Vitamina C y pantotenato de calcio, minerales tales como el zinc y el magnesio, y polvo biliar, agregados, ya sean por sí mismos o en combinación, a preservativos altamente efectivos durante el subcultivo de Lactobacillus clearans . Se contemplaron varias formas de preservación además de la liofilización como métodos para preservar Lactobacillus clearans , tales como la preservación de líquidos o masas celulares, preservación semiseca con aproximadamente 15% de contenido de humedad, preservación en seco con un contenido de humedad de aproximadamente el 8%, y preservación ultrafría a -40 y -196°C, pero se obtuvieron básicamente buenos resultados cuando se preservaron con preservativos que mostraron los excelentes efectos descritos anteriormente durante el uso en la liofilización . La presente invención se describe en detalle más adelante con referencia a los ejemplos, pero el alcance de la presente invención no se limita a esos ejemplos únicamente .

(Ejemplo 1) 10 L de medio (pH 7.0) que comprende 5 g de extracto de carne (Wako Puré Chemical Industries, LTD. ) , 5 g de peptona (Wako Puré Chemical Industries, LTD. ) , 3 g de butirato de sodio (Wako Puré Chemical Industries, LTD) , 1 mL de amoniaco acuoso (Wako Puré Chemical Industries, LTD), 10 g de glucosa (Wako Puré Chemical Industries, LTD), 0.5 g de cistina (Wako Puré Chemical Industries, LTD) y 2 g de extracto de levadura (Nihon Seiyacu) por litro de medio se inocularon con Lactobacillus clearans (FERM P-17150, BP-6973) durante 72 horas de cultivo anaerobio a 37 °C. El caldo de cultivo fue centrifugado, dando 10 g de una masa celular. La masa se lavó con 500 mL de solución salina fisiológica (preparada con cloruro de sodio de Wako Puré Chemical Industries, LTD.) y se centrifugó dos veces. La masa celular purificada resultante se introdujo en una solución que consiste de 500 mL de leche de soya (por Tsujimoto Shokuhin Kogyo) , 50 g de leche descremada (Snow Brand Milk Products, Co.), 30 g de trehalosa (Hayashibara KK) , y 0.5 g de cistina (Wako Puré Chemical , Industries, LTD) y se agitó perfectamente. La mezcla se liofilizó al vacio por un método común para dar 133 g de preparación de células bacterianas. El conteo celular fue de 3.0 x 109 células/g. La preparación celular se almacenó a temperatura ambiente con un desecante de gel de sílice (Manabe Kaseihin) y un absorbente de oxigeno ¦ 1 (Mitsubishi Gas Chemical Co . ) , el conteo de células viables se estudió durante 18 meses para calcular la viabilidad, y el titulo se ensayó, con los resultados dados en la Tabla 19. La Tabla 19 muestra que se mantuvo un título de Lactobacillus clearans, virtualmente sin caída.

(Tabla 19) Ejemplo de cambios en el conteo, viabilidad y titulo de células viables de Lactobacillus clearans (Ejemplo 2) 10 L de medio (pH 7.0) que comprende 30 g de suero de soya (Fuji Oil Co.), 1 g de peptona (Waco Puré Chemical Industries, LTD.), 1 g de cistina (Waco Puré Chemical Industries, LTD.), 3 g de acetato de sodio (Waco Puré Chemical Industries, LTD.), 0.2 g de sulfuro de sodio (Waco Puré Chemical Industries, LTD.), 0.01 g de pantotenato de calcio (Waco Puré Chemical Industries, LTD.), y 2 g de levadura de Hornear (Oriental Yeast) por litro de medio se inocularon con Lactobacillus clearans (FER P-17149, BP-6971) durante 72 horas de cultivo anaerobio a 37°C. El caldo de cultivo se centrifugó, dando 28 g de una masa celular que consiste de Lactobacillus clearans y células de levadura muertas. La masa se lavó con 500 mL de solución salina fisiológica (preparada con cloruro de sodio de Waco Puré Chemical Industries, LTD.), y se centrifugó dos veces. La masa celular purificada resultante se introdujo en 500 mL de agua con un contenido de 10 g de clórela seca (Yamaki), 25 g de treahalosa (Hayashibara KK) , y 5 g de almidón soluble (Waco Puré Chemical Industries, LTD.) y se agitó perfectamente. La mezcla fue entonces liofilizada al vacio por un método común para dar 43 g de preparación de células bacterianas. El conteo celular fue de 10.0 x 109 células/g. La preparación celular se almacenó a temperatura ambiente en recipientes de vidrio protegidos contra la luz junto con un desecante de gel de sílice (Manabe Kaseihin) y un absorbente de oxígeno (Mitsubishi Gas Chemical Co . ) , el conteo de células viables se estudió durante 18 meses para calcular la viabilidad, y se ensayó el título con los resultados dados en la Tabla 20. La Tabla 20 muestra que se mantuvo un título de Lactobacillus clearans alto, virtualmente sin caída.

(Tabla 20) Ejemplos de cambios en el conteo, viabilidad y titulo de células viables de Lactobacillus clearans (Ejemplo Comparativo 1) 10 L de medio (pH 7.0) que comprenden 10 g de extracto de carne (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 10 g de peptona (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 3 g de extracto de levadura (Nihon Seiyaku) , 10 g de glucosa (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 2 g de K2HP04, 1 g de MgS04«7H20, 1 g de NaCl, y 1 g de CaCl»2H20 por litro de medio se inocularon con Lactobacillus clearans (FERM P-17150, BP-6973) durante 72 horas de cultivo anaerobio a 37°C. El caldo de cultivo se centrifugó, dando 18 g de una masa celular. La masa se lavó con 500 mL de solución salina fisiológica (preparada con cloruro de sodio de Wako Puré Chemical Industries, LTD.) y se centrifugó dos veces. La masa celular purificada resultante se introdujo en 1000 mL de solución de almidón soluble al 20% (Wako Puré Chemical Industries, LTD. ) y se agitó perfectamente. La mezcla se liofilizó al vacío por un método común para dar 204 g de preparación de células bacterianas. El conteo celular fue de 4.5 x 109 células/g. La preparación celular se almacenó a temperatura ambiente con un desecante de sílice (Manabe Kaseihin) y un absorbente de oxígeno (Mitsubishi Gas Chemical Co.), el conteo de células viables se estudió durante 18 meses para calcular la viabilidad, y se ensayó en título con los resultados dados en la Tabla 21. La Tabla 21 muestra que no únicamente la viabilidad disminuyó rápidamente, sino que el título disminuyó considerablemente, cuando se cultivó Lactobacillus clearans en un medio común y se preservó por un método común.

(Tabla 21) Ejemplo de cambios en el conteo, viabilidad y titulo de células viables de Lactobacillus clearans medio y preservación comunes Conteo de Células viables/g Inmediatamente Cambios en después de la 3 6 12 18 el titulo preparación meses meses meses meses 4.5 X 10a 2.5 X 10a 1.5 X 10a 4.0 X 10* 0 Viabilidad -- 55 33 9 0 (Ejemplo Comparativo 2) 10 L de medio (pH 7.0) que comprende 10 g de extracto de carne (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 10 g de peptona (Wako Puré Chemical Industries, LTD. ) , 3 g de extracto de levadura (Nihon Seiyaku) , 10 g de glucosa (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 2 g de K2HP04, 1 g de MgS04»7H20, 1 g de NaCl y 1 g de CaCl2»2H20 por litro de medio se inocularon con Lactobacillus clearans (FERM P-17150, BP- 6973) durante 72 horas de cultivo anaerobio a 37°C. El caldo de cultivo se centrifugó, dando 18 g de una masa celular. La masa se lavó con 500 mL de solución salina fisiológica (preparada con cloruro de sodio de Wako Puré Chemical Industries, LTD.) y se centrifugó dos veces. La masa celular purificada resultante se introdujo en una solución que consistió de 900 mL de leche de soya) por Tsujimoto Shokuhin Kogyo) , 90 g de leche descremada (Snow Brand Milk Products, Co.), 54 g de trehalosa (Hayashibara KK) , y 0.9 g de cistina (neutra) (Wako Puré Chemical Industries, LTD.) y se agitó perfectamente. La mezcla se liofilizó al vacio por un método común para dar 239 g de preparación de células bacterianas.

El conteo de células fue de 5.0 x 109 células/g. La preparación celular se almacenó a temperatura ambiente con un desecante de gel de sílice (Manabe Kaseihin) y un absorbente de oxígeno (Mitsubishi Gas Chemical Co. ) , el conteo de células viables se estudió durante 18 meses para calcular la viabilidad, y se ensayó el titulo, con los resultados dados en la Tabla 22. La Tabla 22 muestra que se obtuvo una buena viabilidad, aunque no tan buena como en el Ejemplo 1, cuando se cultivaron Lactobacillus clearans por un método común y se preservaron por el método de la presente invención. El titulo, sin embargo, disminuyó un tanto durante el cultivo, y posteriormente tendió a continuar disminuyendo, aunque gradualmente .

(Tabla 22) Ejemplo de cambios en el conteo, viabilidad y titulo de células viables de Lactobacillus clearans en medio común pero con la preservación de la presente invención (Ejemplo Comparativo 3) 10 L de medio (pH 7.0) que comprende 5 g de extracto de carne (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 5 gramos de peptona (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 3 g de butirato de sodio (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 1 g de amoniaco acuoso (Wako Puré Chemical Industries, LTD. ) , 10 g de glucosa (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), 0.5 g de cistina (Wako Puré Chemical Industries, LTD.), y 2 g de extracto de levadura (Nihon Seiyaku) por litro de medio se inocularon con Lactobacillus clearans (FERM P-17150, BP-6973) durante 72 horas de cultivo anaerobio a 37 °C. El caldo de cultivo se centrifugó, dando 10 g de una masa celular. La masa se lavó entonces con 500 mL de solución salina fisiológica (preparada con cloruro de sodio de Wako Puré Chemical Industries, LTD.) y se centrifugó dos veces. La masa celular purificada resultante se introdujo en 550 mL de una solución de almidón soluble 20% (Wako Puré Chemical Industries, LTD.) y se agitó perfectamente. La mezcla se liofilizó al vacio por un método común para dar 112 g de preparación de células bacterianas. El conteo celular fue de 2.5 x 109 células/g. La preparación celular se almacenó a temperatura ambiente con un desecante de gel de sílice (Manabe Kaseihin) y un absorbente de oxígeno (Mitsubishi Gas Chemical Co.), el conteo de células viables se estudió durante 18 meses para calcular la viabilidad, y se ensayó el título, con los resultados dados en la Tabla 23. La Tabla 23 muestra que la viabilidad tendió a ser la misma que el ejemplo comparativo 1 cuando se cultivaron Lactobacillus clearans en el medio de la presente invención y se reservaron por un método común. El título no cayó tan ápidamente como en el Ejemplo Comparativo 1, sino que tendió disminuir gradualnente .

(Tabla 23) Ejemplo de cambios en el conteo, viabilidad y titulo de células viables de Lactobacillus clearans en el medio de la presente invención pero con preservación común Los Lactobacillus clearans son cepas novedosas de lactobacillus que utilizan y degradan compuestos de azufre, nitrógeno, y compuestos de carbono odoríferos, y que han sido identificadas como cepas efectivas que demuestran una capacidad purificadora potente en los intestinos debido a las funciones anteriores. Sin embargo, no existen métodos conocidos como éste para obtener lactobacillus con un alto título que exhiban tales funciones, o métodos para sostener el alto título que se obtiene durante periodos de tiempo prolongados . El uso del medio de cultivo en la presente invención permite que los Lactobacillus clearans con un alto título sean cultivados de una manera estable, de modo que los compuestos de azufre, nitrógeno y carbono nocivos, odoríferos, pueden ser fácilmente degradados y eliminados. En consecuencia, no sólo las sustancias nocivas, odoríferas, entéricas, disminuyen, sino que las bacterias consideradas como benéficas para la flora intestinal pueden incrementarse dramáticamente, mientras que el crecimiento de bacterias dañinas puede ser fuertemente suprimido. El uso del método de preservación en la presente invención permite que Lactobacillus clearans con un alto título sean preservados durante periodos de tiempo prolongados, de modo que los compuestos de azufre, nitrógeno y carbono nocivos, odoríferos, puedan ser fácilmente degradados y eliminados cuando se requiera.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la adición de al menos o ambos del sulfuro de sodio y amoniaco acuoso, de modo que, durante el cultivo de los Lactobacillus clearans, al menos uno o ambos del sul'furo de sodio y amoniaco disminuyen por la acción de los Lactobacillus clearans a las 24 horas de cultivo.

2. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans , caracterizado porque comprende la adición de al menos uno o más compuestos de azufre odoríferos, compuestos de nitrógeno odoríferos y compuestos de carbono odoríferos al medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 1.

3. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque el compuesto de azufre odorífero de conformidad con la reivindicación 2, es al menos uno o más del sulfuro de sodio, sulfuro de hidrógeno, sulfuro de amonio, metil mercaptano, etil mercaptano, dimetil mercaptano, sulfuro de dimetilo, disulfuro de dimetilo, sulfuro de dietilo, sulfuro de dibutilo, y derivados de los mismos.

4. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque el compuesto de nitrógeno odorífero de conformidad con la reivindicación 2 es al menos uno o más del amoniaco, escatol, indol, acetanilida, metilamina, dimetilamina, dietilamina, trietilamina, y derivados de los mismos.

5. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque el compuesto de carbono odorífero de conformidad con la reivindicación 2 es al menos uno o más del ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, formaldehído , acetaldehído, propionaldehído, crotonaldehído , fenol, alcohol butílico, alcohol amílico, y derivados de los mismos.

6. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la adición de al menos uno o más de aminoácidos que contienen azufre, ácido glutámico, lisina, y ácido aspártico como un aminoácido a un medio de cultivo de conformidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5.

7. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la adición de al menos una o más de la Vitamina C; Vitamina E, Vitamina Bi2, pantotenato de calcio, ácido fólico, y nicotinamida como una vitamina al medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6.

8. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la adición de al menos uno o más de manganeso, zinc, magnesio, y molibdeno como un componente mineral a un medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7.

9. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la adición de al menos una o más de clórela CGF, leche de soya, y polvo biliar a un medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8.

10. Un medio de cultivo para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la adición de sulfuro de sodio en una concentración de 500 ppm a un medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, donde el sulfuro de sodio disminuye en un 10% o más a las 24 horas de cultivo durante el cultivo de Lactobacillus clearans .

11. Un medio de cultive para cultivar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la adición de amoniaco acuoso en una concentración de 500 ppm a un medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el amoniaco disminuye en un 10% o más en las 24 horas del cultivo durante el cultivo de Lactobacillus clearans .

12. Un método para preservar Lactobacillus clearans es la presencia de al menos uno o más de aminoácidos que contienen azufre, ovoalbúmina, polvo biliar, trehalosa, rafinosa, células de levadura muerta, clórela, salvado de arroz, salvado, leche de soya, y jugo de zanahoria como preservativo alrededor de los Lactobacillus clearans.

13. Un método para la preservación de Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende, además de un preservativo de conformidad con la reivindicación 12, la adición de al menos uno o más de ácido glutámico, lisina, ácido aspártico, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina ??2, pantotenato de calcio, ácido fólico, nicotinamida, manganeso, zinc, magnesio, molibdeno, sulfuro de sodio, sulfuro de hidrógeno, sulfuro de amonio, metil mercaptano, etil mercaptano, dimetil mercaptano, sulfuro de dimetilo, disulfuro de dimetilo, sulfuro de dietilo, sulfuro de dibutilo, amoniaco, escatol, indol, acetanilida, metilamina, dimetilamina, dietilamina, trietilamina, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, crotonaldehído, fenol, alcohol butílico, alcohol amílico y derivados de los mismos alrededor de Lactobacillus clearans.

14. Un método para preservar Lactobacillus clearans, caracterizado porque comprende la presencia de al menos una o más de leche descremada en polvo derivada de animal, ovoalbúmina, lactosa, polvo de extracto de hígado y suero, así como al menos uno o más de suero de soya derivado de vegetales, trehalosa, rafinosa, almidón, clórela, clórela CGF, salvado de arroz, salvado, jugo de alfalfa, jugo de trébol, extracto de germen de trigo, leche de soya, jugo de tomate, jugo de zanahoria, jugo de uva, polvo de sábila, polvo de té verde, polvo de extracto de levadura y células de levadura muertas como preservativo alrededor de Lactobacillus clearans durante la preservación de Lactobacillus clearans .

15. Un método para preservar Lactobacillus clearans , caracterizado porque comprende, además del preservativo de conformidad con la reivindicación 14, la adición de al menos uno o más de ácido glutámico, lisina, ácido aspártico, Vitamina C, Vitamina E, Vitamina Bi2, pantotenato de calcio, ácido fólico, nicotinamida, manganeso, zinc, magnesio, molibdeno, sulfuro de sodio, sulfuro de hidrógeno, sulfuro de amonio, metil mercaptano, etil mercaptano, dimetil mercaptano, sulfuro de dimetilo, disulfuro de dimetilo, sulfuro de dietilo, sulfuro de dibutilo, 'amoniaco, escatol, indol, acetanilida, metilamina, dimetilamina, dietilamina, trietilamina , ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, formaldehído, acetaldehído, propicnaldehído, crotonaldehído, fenol, alcohol butílico, alcohol amílico, y derivados de los mismos alrededor de Lactobacillus clearans .

16. El método para preservar Lactobacillus clearans de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 hasta 15, caracterizado porque el método preservativo comprende cualquiera de los métodos de liofilización, preservación ultrafría o en líquido, húmedo, semiseco o seco.