MXPA99010882A - Proteinas que tienen actividades ensecticidas ymetodo de uso - Google Patents

Abstract

Se proveen composiciones y, métodos para controlar plagas, particularmente plagas de insectos. Las composiciones comprenden proteínas aisladas de plantas del género Pentaclethra. Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas también se proveen. Dichas secuencias se pueden usar en la transformación de organismos para control de plagas.

Description

PROTEÍNAS QUE IENEN ACTIVIDADES INSECTICIDAS Y MÉTODO DE USO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a composiciones y métodos para controlar especies de insectos. Adicionalmente, la invención se refiere a plantas y otros organismos que se han transformado genéticamente con las composiciones de la invención. Numerosas especies de insectos son plagas problemáticas para las cosechas agrícolas comunes tales como maíz, soya, chícharo, algodón y cosechas de alimentos y fibras similares . El método principal para controlar dichas plagas ha sido mediante la aplicación de compuestos químicos sintéticos. Sin embargo, el uso difundido de compuestos químicos tiene muchos problemas con respecto al ambienta dado que no hay selectividad de los compuestos y al desarrollo de insectos resistentes a los químicos. Otros enfoques de control de plagas se han intentado incluyendo el uso de organismos biológicos que normalmente son "depredadores naturales" de las especies que se quieren controlar. Dichos depredadores pueden incluir otros insectos, hongos, y bacterias tales como Bacill us thuringiensis . Alternativamente, en cautiverio se han originado plagas de insectos, esterilizado y liberado en el ambiente con la esperanza de que el apareamiento entre los insectos estériles y los insectos silvestres fecundos disminuirá la población de insectos. Mientras que estos enfoques han tenido algún éxito, abarcan un gasto considerable y dificultades principales severas actuales . Por ejemplo, es difícil tanto aplicar a los organismos biológicos a grandes áreas y ocasionar que los organismos vivos permanezcan en el área tratada o en las especies de plantas tratadas durante un tiempo extendido. Los insectos depredadores pueden migrar y puedan lavarse los hongos o bacterias de una planta o removerse de un área tratada por la lluvia. Consecuentemente, mientras que el uso de dichos controles biológicos tiene características convenientes y ha cumplido con algún éxito, parecen severamente limitados estos métodos en la práctica. Los avances en biotecnología en las últimas dos décadas no han presentado nuevas oportunidades para el control de plagas mediante ingeniería genética. En particular, los avances en la genética de plantas acoplado con la identificación de los factores de desarrollo de insectos y compuestos defensivos de plantas presentes en la naturaleza o agentes que ofrecen la oportunidad de crear plantas de cultivos transgénicas capaces de producir dichos agentes de defensa y así proteger las plantas contra el ataque de insectos . Las plantas transgénicas que son resistentes a plagas de insectos específicos se han producido usando genes que codifican endotoxinas de Bacill us thuringiensis (Bt) o inhibidores de proteasa de plantas (PIs) . Las plantas transgénicas que contienen genes de endotoxina Bt han mostrado que son efectivas para el control de algunos insectos. La protección de plantas efectivas usando material genético de Pl insertado transgénicamente aún no se ha demostrado en el campo. Mientras gue los cultivadores que expresan genes de Bt puede exhibir actualmente resistencia a algunas plagas de insectos, la resistencia basada en la expresión de un sólo gen podría eventualmente perderse debido a la evolución de resistencia de Bt en los insectos. Por lo tanto, la búsqueda para genes adicionales que pueden insertarse en las plantas para proveer protección de plagas de insectos es necesaria. Los científicos han identificado algunos componentes de plantas específicos o compuestos que actúan como agentes de defensa para proteger una planta del ataque por plagas y patógenos de insectos. Mientras que dichos componentes usualmente están presentes solamente en bajo niveles en varios tejidos de plantas, algunos de ellos también son capaces de inducirse a niveles superiores por el ataque de una plaga de insectos o un patógeno. Ejemplos de dichos compuestos de defensa incluyen alcaloides, terpenos, y varias proteínas tales como enzimas, inhibidores de enzimas y lectinas. De interés particular son los compuestos derivados de plantas que pueden bloquear o alterar la actividad biomolecular normal y por lo tanto inhibir el crecimiento de insectos o matar el insecto. El complejo de gusano de raíz de maíz (CRW) en los Estados Unidos consiste de tres especies, Diabrotica barberi Smith y Lawrence (Northern) , D. undecimpuncta ta howardi Barber (Southern) y D. virgifera virgifera LeConte (Western) . Las especies western y northern contribuyen a la mayor parte del daño económico del maíz. El daño económico y los costos de control se calculan que exceden un mil millones de dólares al año. Como se observó antes, las preocupaciones principales del uso de pesticidas para controlar el daño por CRW son su efecto negativo en el ambiente y el desarrollo de resistencia por el insecto. La rotación de maíz está volviéndose menos efectiva que un método de control de CRW debido al periodo de retardo extendido en CRW western y al desarrollo al comportamiento modificado de poner huevos en CRW western. La generación de plantas transgénicas con resistencia a CRW podría tener un impacto económico mayor. Desafortunadamente, hay relativamente pocos, si es gue ningunos genes disponibles que puedan controlar CRW en plantas transgénicas. Por lo tanto, existe una necesidad de principales insecticidas adicionales, particularmente aquellos activos contra CRW. Las composiciones y métodos para el control de insectos y otras plagas se proporciona. Las composiciones comprenden proteínas que tienen actividades pesticidas que se pueden aislar de plantas de género Pentaclethra . La proteína purificada, así como información de aminoácidos y secuencia de ADN se provee para proteínas que tienen actividad de gusano de raíz. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas pesticidas pueden usarse para transformar plantas bacterias, hongos, levaduras, y otros organismos para el control de plagas. Las composiciones y métodos de la invención pueden usarse en una variedad de sistemas para controlar plagas que son de plantas y que no son de plantas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la secuencia de ADNc de principio activo de gusano de raíz de maíz, pentina-1 de Pentaclethra SEC. de ID NOS. 1 y 2. La Figura 2 provee la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la secuencia de ADNC de Pentina-1, optimizada para la expresión mejorada de SEC. de ID NOS: 3 y 4. La Figura 3 provee la secuencia de aminoácidos de la proteína Pentina-1 con una porción subrayada que representa la secuencia de señales putativa. Los residuos AFS inmediatamente después de la secuencia de señal son los primeros tres residuos de la proteína madura. Los residuos ASK empezando en cinco residuos del inicio de AFS de la proteína madura se designa a la región de terminación amino madura evidente de pentina-1 expresada como la proteína de longitud completa y proteolizada en raíces de maíz. La Figura 4 provee el cásete de expresión para la expresión de secuencias de Pentina-1. Se proveen composiciones y métodos para controlar plagas, particularmente plagas de plantas. En particular, se proveen proteínas pesticidas novedosas. Las proteínas se purifican de los miembros de la familia leguminosa, particularmente el género Pentaclethra de Leguminosa, más particularmente la especie P. macrophylla y P. macroloba . De acuerdo con la invención, las proteínas pesticidas producidas por los miembro del género Pentaclethra pueden aislarse por los métodos conocidos en la técnica. Los métodos para aislamiento de proteínas incluyen cromatografía convencional, incluyendo filtración de gel intercambio de iones y cromatografía de inmunoafinidad por cromatografía de líquidos de alto rendimiento, tal como cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa, cromatografía de líquidos de alto rendimiento de intercambio iónico, cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión de tamaño, enfoque cromatográfico de alto rendimiento y cromatografía de interacción hidrofóbica etc., por separación electroforética, tal como electroforesis de gel unidimensional, electroforesis de gel bidimensional, etc. Ver por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 y 2, Ausubel et al. (eds.), John Wiley & Sons, NY (1988), incorporado en la presente por referencia. Una vez gue la proteína purificada se aisla, la proteína o los polipéptidos de la misma comprendidos, puede caracterizarse y secuencíarse por métodos normales conocidos en la técnica. Por ejemplo, la proteína purificada, o los polipéptidos de los cuales está comprendido, puede fragmentarse como con bromuro de cianógeno o proteasas tales como papaína, quimiotripsina, tripsina, endopeptidasa de lisil-C, etc. (Oike et al. (1982) J. Biol Chem 257 : 9751-9758'; Liu et al. (1983) Int . J. Pept . Protein Res . 21:209-215). Los péptidos resultantes se separan, preferiblemente por HPLC, o por resolución de geles y electromanchado sobre membranas de PVDF, y se someten a secuenciación de aminoácidos. Para lograr esta tarea, los péptidos se analizan preferiblemente por secuenciadores automáticos. Se reconoce que las secuencias de aminoácidos N-terminales, C-terminales o internos puede determinarse. A partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada, se puede sintetizar una secuencia de nucleótidos la cual se puede usar como una sonda para ayudar en el aislamiento de la codificación de gen de proteína pesticida. De la misma forma, los anticuerpos surgidos contra los péptidos parcialmente purificados o purificados pueden usarse para determinar la distribución espacial y temporal de la proteína de interés. Por lo tanto, el tejido en donde la proteína es más abundante, y posiblemente más altamente expresada puede determinarse y se pueden construir los bancos de expresión. Los métodos para la producción de anticuerpos se conocen en la técnica. Ver por ejemplo Antibodies , A Labora tory Manual , Harlow y Lañe (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1988), y las referencias citadas en la presente. Ver también Radka et al (1983) J. Immunol . 128;2804; y Radka et al (1984) Immunogenetics 19 : 63. Tales anticuerpos pueden usarse para aislar proteínas con dominios de unión similares y las proteínas probadas para actividad contra plagas de insectos de interés. Se reconoce gue cualquier combinación de método se puede utilizar para purificar proteínas que tienen propiedades pesticidas. Como se ha determinado un protocolo de aislamiento, la actividad pesticida puede probarse para cada fracción de material obtenido después de cada paso de purificación. Dichos protocolos de purificación darán como resultado una fracción de proteína sustancialmente purificada. Por "sustancialmente purificada" o "sustancialmente pura" se pretende que la proteína este sustancialmente libre de cualquier compuesto asociado normalmente con la proteína en su estado natural . Las preparaciones "sustancialmente puras" de proteína pueden evaluarse por la ausencia de otras bandas de proteínas detectables después de SDS-PAGE como se determinó visualmente - o por barrido de densitometría . Alternativamente, la ausencia de otras secuencias de aminoterminal o residuos N-terminal en una preparación purificada puede indicar el nivel de pureza. La pureza puede verificarse por la recromatografía de las preparaciones "puras" que muestran la ausencia de otros picos por intercambio iónico, electrofóresis de fase inversa o capilar. Los términos "sustancialmente puros" o "sustancialmente purificados" no significa gue se excluyen las mezclas artificiales o sintéticas de las proteínas con otros compuestos. Los términos tampoco significa que excluyan la presencia de impurezas menores que no interfieren con la actividad biológica de la proteína y gue pueden estar presentes, por ejemplo debido a la purificación incompleta. A partir de los fragmentos de la proteína, toda la secuencia de nucleótidos que codifican la proteína puede determinarse por experimentos de PCR. Así, los fragmentos obtenidos de experimentos PCR pueden usarse para aislar secuencias de ADNc de los bancos de expresión. Ver por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Vols. 1-3, Sambrook et al (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989), y las referencias citadas en la presente. De esta forma, las proteínas y las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas pueden aislarse, las cuales son inhibidoras o tóxicas para las especies de insectos particulares. Dichas proteínas y secuencias de nucleótidos de la invención pueden utilizarse para proteger plantas de plagas incluyendo insectos, hongos, bacterias nemátodos virus o viroides y similares, particularmente plagas de insectos. En particular, las secuencias de proteínas y nucleótidos que son inhibidoras o tóxicas para insectos del orden de Coleóptera pueden obtenerse. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de las ordenes Coleópteras, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, ' Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleóptera. Insectos pesticidas de la invención para el cultivo principal incluye: Maíz : Ostrínia nubilalis , gorgo de maíz Europeo; Agrotis ípsilon, oruga nocturna; Helicoverpa zea , tijerilla de maíz; Spodoptera frugiperda , devastador; Dia traea grandiosella , garrapata de maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosell us, garrapata de paja de trigo diminuto; Dia traea saccharalis , garrapata de caña de azúcar; Diabrotica virgifera , gusano de raíz de maíz western; Diabrotica barber) , gusano de raiz de maíz western; Diabrotica undecimpuncta ta howardi, escarabajo de pepino moro, Melanotus spp . , gorgojo; Cyclocephala borealis , escarabajo enmascarado western (larva blanca); Cyclocephala immacula ta , escarabajo enmascarado del sur (larva blanca) ; Popillia japónica , escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria , escarabajo de pulga de maíz; Sphenophorus maidis, maíz de chinche de ave; Rhopalosiphum maidis , pulgón de hoja de maíz; Anuraphis maidiradicis , pulgón de raíz de maíz; Blissus leucopterus , chinche; Melanopl us femurrubrum, chapulín de patas rojas; Melanopl us sanguinípes , chapulín migratorio; Delia pla tura , cresa de seda de maíz; Agromyza parvicornis , minero de hoja de mancha de maíz; Anaphothrips obscrurus , trisanóptero; Solenopsis milesta , hormiga hurtadora; Tetranychus urticae, garrapata de araña de dos manchas; Busseola fusca , garrapata de tallo de maíz Africana (AMB) ; Sesamia calamistis , garrapata Rosa Africana (APB) ; Eldana sacchharina , garrapata de caña de azúcar Africana (ASB) ; Chilo partell us , garrapata de tallo de sorgo (SSB) ; Ostrinia furnacalis , garrapata de maíz Oriental (OCB) ; Sesamia nonagrioides , garrapata de maíz de Europa/N. África; Sorgo : Chilo partell us , garrapata de sorgo; Spodoptera frugiperda , gusano devastador de otoño; Helicoverpa zea , tijerilla de maíz; Elasmopalpus Iignosell us , garrapata de tallo de maíz inferior; Agrotis subterránea , oruga granulada; Phyllophaga crini ta, larva blanca; Eleodes , Conoderus , y Aeol us spp . , cienpies; Oulema melanopus , oruga de hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria , oruga voladora de maíz; Sphenophorus maidis, chinche de maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de hoja de maíz; Sipha flava , pulgón de azúcar de caña de maíz, Blissus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola , mosquito de sorgo; Tetranychus cinnabarinus , garrapata de araña carmín; Tetranychus urtícae, garrapata de araña de dos manchas; Schizophis graminum, chinche verde (pulgón) ; Trigo: Pseudaletia unipuncta ta , gusano devastador; Spodoptera frugiperda , gusano de polilla de otoño; Elasmopalpus l ignosellus , garrapata de paja de trigo pequeño; Agrotis orthogonia , larva western plae; Oul ema melanopus , escarabajo de hoja de cereal; Hypera puncta ta , hoja gorgoro de hoja de clavo; Diabroti ca uncl ecimpuncta ta howardi , escarabajo de pepino moro; pulgón de trigo Ruso; Schizophis graminum, insecto verde; Si tobion avenae, pulgón de grano Inglés; Melanopl us femurrubrum, redlegged grasshopper; Melanopl us differen tialis , saltamontes diferencial; Melanopl us sanguinipes , saltamontes migratorio; Maye tiola destructor, Mosca Hessian; Si todiplosis mosellana , mosquito de trigo; Meromyza americana , gusano de tronco de trigo; Hylemya coarcta ta , mosca de bulba de trigo; Frankliniella fusca , tobáceo thrips; Cephus cinctus, mosca de sierra de tronco de trigo; Eriophyes tulipae, garrapata rizada de trigo; Girasol : Suleima helian thana , polilla de cabeza de girasol; Homeosoma ellectellum, polilla de cabeza de girasol; Zygoramma exclama tionís , escarabajo de girasol; Bo thyrus gibbosus , escarabajo de zanahoria; Neolasioptera murtpeldtiana , mosquito de semilla de girasol; Cochylis hospes, polilla de girasol en bandas; Rachipl usia nu, engarzador de agentina; Smicronyx fulvu . s, gorgoro de siembra de girasol rojo; Cylindrocopturus ad. spers . s , gorgoro de siembra de girasol moro; Algodón: Heliothis virescens, gusano de capullo de tabaco; tielicoverpa zea , gusano de baga; Spodoptera exigua , gusano de polilla de remolacha; Pectinophora gossypiella , gusano de baga rosa; An thonomus grandis , gorgoro de baga; Aphis gossypii , pulgón de algodón; Pseuda tomoscel is seria tus , pulga de algodón; Trial eurodes abutilone , mosca blanca con alas en bandas; Lygus lineolarís , insecto de plantas manchadas; Melanopl us femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differen tial is , saltamontes diferencial; Thrips tabaci , onion thrips; Franklinkiella filsca , tobáceo thrips; Tetranychus cinnabarinus , garrapata de araña carmín/ Tetranychus urti cae , twospotted spider mite; Arroz : Dia traea sacchuralis , garrapata de azúcar de caña; Spodoptera frugiperda , gusano de polilla de otoño; Helicoverpa zea , gusano de tierra de maíz; Colaspis brzmnea , colapsador de uva; Lissorhoptrus oryzophil us , gorgoro de agua de arroz; Si tophil us oryzue, gorgoro de arroz; Nephotettix nigropíctus , saltador de hoja de arroz. ; Blissus leucopterus , chinche; Acrosternum hilare, insecto de madera verde; Soja: Pseuclopl usia incl uclens , engarzador de soja; Anticarsía gemma talis, oruga de alcatán; Pla thypena scabra , gusano de trébol verde; Os trinia nubilalis, garrapata de maíz Europea; Agrotis Ípsilon , larva negra; Spodoptera exigua, gusano de polilla de remolacha; Heliothis virescens , gusano de baga de algodón; Helicoverpa zea , gusano de baga de algodón; Epilachna varivestis , escarabajo de frijol Mexicano; Myzas persicae, pulgón durazno verde; Empoasca fabae, saltador de hoja de papa; Acrosternum hilare, insecto fato verde; Melanopl us femurrubrum, saltamontes de pata roja; Melanopl us differen tialis, saltamontes diferencial; Delia pla tura , gusano de trigo de siembra; Sericothrips variablis , soybean thrips; Thrips ta aci, onion thrips; Tetranychus turkestani , acárido de araña de fresa; Tetranychus urticae, acárido de araña de dos manchas; Cebada : Ostrinia nubilalis, garrapata de maíz Europea; Agrotis Ípsilon, larva negra; Schizophis graminum, insecto verde; Blissus leucopterus , chinche; Acros ternum hilare, insecto fato verde; Euschistus serrus , insecto fato café; Delia pla tura , gusano de trigo de siembra; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Petrobia la tens , k trigo café; Colza de Siembra de Aceite: Brevicoryne brassicae, pulgón de col; escarabajo de pulga, Phyllotreta spp . ; Gusano de polilla Bertha; Mamestra confgura ta ; Polilla de espalda en forma de diamante; Pl utella xylostella ; Alfalfa: engarzador de alfalfa, Autographa californios ; escarabajo morro de alfalfa, Otiorhynchus ligusticií ; oruga de alfalfa, Colias eurytheme; trepador de mancha de alfalfa, Agronyza fron tella ; gorgoro de alfalfa Egipcia, Hypera brunneipeonis ; insecto de gargajo de pradera, Philaerius spumarius ; pulgón de alfalfa moro, Theriophis mecula ta ; gorgoro de hoja de trévol, Hypera puncta ta ; pulgón de chícharo, Acyrthosiphon pisum; pulgón de alfalfa azul, Acyrthosiphor kondoi ; gusano de trébol verde, Pla thypena scabia ; curculio de raíz de trébol, Si tona hispidulus ; chalcid de semilla de alfalfa, Brachophagus roddi ; insecto de planta manchado, Lygus lineolaris ; insecto fato, Chlorochroa sayi ; oruga de frijol aterciopelado, Anticarsia friegiperda , gorgoro - de alfalfa, Hypera postica ; gusano de polilla de otoño, Spodoptera ; trepador de papa, Empoasca fabae; soja engarzador, Psuedol usia incl udens ; Tepador de alfalfa de tres ángulos rodeados, Spissistil us festinus; Véase, por ejemplo, Manya B. Stoetzel (1989) Common Ñames of Insects & Related Organisms, Enlomological Society of America , incorporado en la presente por referencia. Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden usar para aislar otras secuencias homologas en otras especies de plantas particularmente otras especies de leguminosas. Los métodos están disponibles en la técnica para la hibridización de secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias de codificación de otras plantas se pueden aislar de acuerdo con las técnicas bien conocidas basadas en su homología de secuencia a las secuencias de codificación exhibidas en la presente. En estas técnicas todo o parte de la secuencia de codificación se usa como una sonda que se hibridiza selecctivamente a otras secuencias de codificación de pesticidas presentes en una población de fragmentos de ADN genómicos clonados o fragmentos de ADNc (es decir bancos genómicos de ADNc) de un organismo elegido. Por ejemplo, a toda la secuencia de Pentina-1 o porciones de la misma se pueden usar como sondas capaces "de hibridizarse específicamente a las secuencias de codificación correspondientes y RNAs mensajeros. Para lograr la hibridización específica bajo una variedad de condiciones dichas sondas incluyen secuencias gue son únicas y preferiblemente son menores alrededor de 10 nucleótidos de longitud y más preferiblemente por lo menos 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas se pueden usar para amplificar secuencias de codificación de pentina-1 de un organismo elegido por el proceso bien conocido de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Esta técnica puede usarse para aislar secuencias de codificación adicionales de un organismo deseado o como un análisis de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación de ?entina-1 en un organismo.

Dichas técnicas incluyen tamizado por hibridización de bancos de ADN sembrado en placa (cualesquiera placas o colonias; ver por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) y amplificación usando PCR de iniciadores de oligonucleótidos que corresponden a dominios de secuencias conservados entre las secuencias de aminoácidos (ver, por ejemplo Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applica tions, eds., Academic Press (1990)). Por ejemplo, la hibridización de las secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones de restricción reducida, restricción media o condiciones de restricción (por ejemplo, condiciones representadas por una restricción de lavado de 35-40% de formamida con 5x de solución de Denhardt, 0.5% de SDS y lx SSPE a 37 °C; condiciones representadas por una restricción de lavado de 40-45% de formamida con 5x de solución de Denhardt, 0.5% de SDS, y lx SSP a 42°CM y condiciones representadas por una restricción de lavado de 50% de formamida con 5x de solución de Denhardt, 0.5% de SDS y lx de SSPE a 42°C, respectivamente), a ADN que codifica genes de insecticidas descritos en la presente en un análisis de hibridización normal. Ver J. Sambrook et al., Molecular Cloning A Labora tory Manual 2d Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory .

Los términos "condiciones estrictas" o "condiciones de hibridización estrictas" incluye la referencia para condiciones bajo las cuales se puede hibridizar una sonda a su secuencia blanco a un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 dobleces sobre el antecedente) . Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la restricción en las condiciones de hibridización y/o lavado, las secuencias blancos pueden identificarse las cuales son 100% complementarias para la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de restricción se pueden ajustar para permitir alguna desigualdad en la secuencia de manera que se detecten grados inferiores de similitud (sondeo heterólogo) . En general, una sonda es menor a aproximadamente 1,000 nucleótidos de longitud, de preferencia menos de alrededor de 500 nucleótidos de longitud, normalmente de aproximadamente 50 alrededor de 300 nucleótidos de longitud. Normalmente, las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal sea menor que aproximadamente 1.5 M iones Na, normalmente de aproximadamente 0.01 a 1.0 M concentración de iones Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura por lo menos es de 30 para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos alrededor de 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor a 50 nucleótidos) . Las condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones de baja restricción ilustrativas incluyen hibridización con una solución reguladora de pH de 30 a 35 por ciento de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecilsulfato de sodio) a 37°C y un lavado en IX a 2X de SSC (20X de SSC=3.0 M de NaCl/0.3 M de citrato de trisodio) de 50°C a 55°C. Las condiciones de restricción moderadas ilustrativas incluyen hibridización en 40 a 45% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0.5X a IX de SSC de 55°C a 60°C. Las condiciones de alta restricción ilustrativas incluyen hibridización en 50% de formamida, 1M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, y una lavado en 0.1X de SSC de 60°C a 65°C. La especificidad normalmente es la función de lavados después de la hibridización, los factores críticos siendo la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal . Biochem 138:267-284 (1984): Tm=81.5C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) -0.61 (forma %) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, forma % es el porcentaje de formamida en nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, forma % es el porcentaje de formamida en la solución de hibridización y L es la longitud del híbrido en pares de base. La Tm es la temperatura (bajo la resistencia iónica definida y pH) a los cuales el 50% de una secuencia blanco complementaria se hibridiza preferiblemente a una sonda igualada. Tm se reduce por aproximadamente 1°C para cada 1% de desigualdad; por lo tanto, Tm, hibridización y/o condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridizar secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con > 90% de identidad se buscan, la Tm puede disminuir 10°C. Generalmente, las condiciones de restricción seleccionadas para estar aproximadamente 5°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una resistencia iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones severamente estrictas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a l, 2, 3 ó 4°C inferior al punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones moderadamente estrictas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 6, 7, 8 ó 9 ó 10 inferior que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones de restricción bajas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 ó 20 inferior al punto de fusión térmico (Tm) usando la ecuación, hibridización y composiciones de lavado y Tm deseado a aquellos de experiencia ordinaria entenderán que las variaciones en la restricción de hibridización y/o soluciones de lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado de desigualdad da como resultado una Tm menor a 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que se puede usar una temperatura superior. Una guía extensa de la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Labora tory Technígues in Biochemistry and Molecular Biology - - Hybridiza tion wi th Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, New York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, Capitulo 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . En general, las secuencias que codifican para Pentina-1 y otras peptinas insecticidas de la invención e hibridizan al gen descrito en la presente serán por lo menos aproximadamente homologas al 50%, aproximadamente homologas al 70%, homologas hasta aproximadamente 85% u homologas hasta aproximadamente 90% a aproximadamente 95% con la secuencia descrita. Es decir, la similitud de secuencia de la secuencia puede variar compartiendo por lo menos aproximadamente 50%, aproximadamente 70% y aproximadamente 85% hasta aproximadamente 90% a 95% de similitud de secuencia. Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial" . (a) Como se usa en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subgrupo o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia de gen, o el ADNc completo o secuencia de gen. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" significa gue incluye la referencia a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos se puede comparar a una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones para la alineación óptima de las dos secuencias. En general, la ventana de comparación por lo menos es de 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Aquellos expertos en la material entenderán que para evitar una similitud alta a una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótidos, normalmente se introduce un espacio de penalidad y se sustrae del número de igualdades . Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. La alineación óptima de secuencias para comparación puede llevarse a cabo por el algoritmo de homología local de Smithy aterman, Adv. Appl . Ma th 2 : 482 (1981); por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol . Biol . 45:443 (1970); por la investigación del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc . Na ti . Acad. Sci . 85 : 2444 (1988); por implementaciones computarizadas de estos algoritmos incluyendo, pero no limitado a CLUSTAL en el programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Groups (GCG) , 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA; el programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins y Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Research 15:10881-90 (1988); Huang et al., Compu ter Applica tions in the Biosciences S:155-65 (1992), y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24 : 301-331 (1994). La familia de BLAST de programas que pueden usarse para investigaciones de similitud de base de datos incluye: BLASTN para secuencias de investigación de nucleótidos contra secuencias de nucleótidos; BLASTX para secuencias de investigación de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de investigación de proteínas contra secuencias de base de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de investigación de proteínas contra secuencias de base de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de investigación de nucleótidos contra secuencias de base de datos de nucleótidos. Ver Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds. Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York (1995). Como aquellos expertos en la técnica entenderán, las investigaciones en BLAST supone que las proteínas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias que pueden ser tractos homopoliméricas, repeticiones de periodos cortos o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Dichas regiones de baja complejidad puede alinearse entre proteínas no relacionadas aunque otras regiones de proteínas son completamente diferentes. Un número de programas de filtro de baja complejidad pueden emplearse para reducir dichas alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, Comput . Chem, 17:149-163 (1993) y XNU (Claverie and States, Comput . Chem . , 17:191-201 (1993)) que pueden emplearse solos o en combinación. (c) Como se usa en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos incluye referencias a los residuos en las dos secuencias gue son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de la identidad de secuencia se usa en referencia a las proteínas se reconoce que las posiciones en los residuos que son idénticas difieren con frecuencia por sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen para otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren y en las sustituciones conservadoras, la identidad de secuencias porcentual puede ajustarse ascendentemente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservadoras son aquellas que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Normalmente esto implica clasificar una sustitución conservadora como una desigualdad parcial en lugar de una completa, incrementando así la identidad de secuencia de porcentaje. Por lo tanto, por ejemplo, en donde aún aminoácido idéntico se le da una clasificación de 1 y una sustitución no conservadora se le da una clasificación cero, una sustitución conservadora se le da una clasificación entre cero y 1. La clasificación de sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic. Biol . Sci . 4 : 11-11 (19878) por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE ( Intelligenetics, Mountain View, California, USA) . (d) Como se usa en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado para comparar dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos esta en la venta de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones a los cuales la base de ácidos nucleicos o residuos de aminoácidos idénticos se presenta en ambas secuencias para dar el número de posiciones diferentes, dividiendo el número de posiciones iguales por el número total de posiciones en la ventaja de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. (e) (i) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 80'., más preferiblemente por lo menos 90% y aún más preferiblemente por lo menos 95%, comparado con una secuencia de referencia que usa solamente uno de los programas de alineación descritos usando parámetros normales. Alguien con experiencia reconocerá que estos valores pueden ajustarse aproximadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en cuenta la degeneración de codones, similitud de aminoácidos, colocación de marco de lectura y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para este fin normalmente significa la identidad de secuencia de por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, 80%, 90% y más preferiblemente por lo menos 95%. Otra indicación de gue las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas como si dos moléculas se hibridízaran unas con otras bajo condiciones normales. Sin embargo, los ácidos nucleicos que no se hibridizan uno con el otro bajo condiciones estrictas a un son sustancialmente idénticas y los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleicos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido que es la primera codificación de ácidos nucleicos es de reacción inmunológicamente cruzada con el polípéptido codificado con la segunda secuencia de ácidos nucleicos . (e) (ii) Los términos "identidad sustancial" en el contexto de un péptico indica que un péptido comprende una secuencia con por lo menos 70% identidad de secuencia a una secuencia de referencia, de preferencia 80%, más preferiblemente 85%, aún más preferiblemente por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia para la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación específica. De preferencia, la alineación óptima se lleva a cabo usando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunschm J. Mol . Biol. 48 : 443 (1970) . Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos surgidos contra el segundo péptido. Por lo tanto, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos únicamente difieren por una sustitución conservadora. Los péptidos que son "sustancialmente similares comparten secuencias como se observó antes excepto que las posiciones de residuos que no son idénticas pueden diferir por cambios de aminoácidos conservadores.

Se reconoce gue las proteínas pesticidas pueden ser oligoméricas y que variarán en peso molecular, número de promotores, péptidos componentes, actividad contra plagas particulares y en otras características. Sin embargo, por lo métodos establecidos en la presente, las proteínas activas contra una variedad de plagas pueden aislarse y caracterizarse. Son de interés particular las proteínas gue son activas contra el gusano de raíz de maíz (CRW) . Por lo tanto, las proteínas purificadas o parcialmente purificadas de la invención se prueban para actividad insecticida contra gusano de raíz de maíz, incluyendo Diabrotica barberi (Northern) , D. undecimpuncta ta howardi (Southern) , y D. virgifera vergifera (Western) . De esta forma, una proteína designada Pentina-1 se ha aislado la cual tiene actividad insecticida para el gusano de raiz de maíz. La Pentina-1 es una proteína glicosilada de aproximadamente 45 alrededor de 50 kDal . La secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la proteína de Pentina-1 se da en la Figura 1 y SEC. de ID. NOS 1 y 2- La concentración más alta de Pentina-1 en la planta parece estar en las semillas maduras. La proteína es estable al calor y tiene una LC50 de aproximadamente 10 µg/ml de dieta contra el gusano de raíz de maíz. La Pentina-1 y otras proteínas de la invención se pueden alterar en varias formas incluyendo sustituciones, supresiones, truncaciones e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones generalmente se conocen en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas pueden prepararse por mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones en la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Kunkel, T. (1985) Proc Na ti . Acad Sci , USA 82 : 488 -492 ; Kunkel et al (1987) Methods in Enzymol . 154 : 361 -382 ; Patente Norteamericana No. 4,873,192; Walker y Gaastra (eds.) Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishig Company, NY (1983) y las referencias citadas en la presente. Por lo tanto, los genes y secuencias de nucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias presentes en la naturaleza como las formas mutantes . Así mismos las proteínas de la invención abarcan tanto las proteínas presentes en la naturaleza así como las variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes continuaran teniendo una actividad pesticida deseada. Obviamente, las mutaciones que se harán en el ADN que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no crearan regiones complementarias que pudieran producir estructuras de ARN secundarias. Ver, Publicación de Solicitud de Patente EP No. 75,444.

De esta forma, la presente invención abarca las proteínas pesticidas así como componentes y fragmentos de las mismas. Es decir, se reconoce gue los promotores de componentes, polipéptidos o fragmentos de las proteínas puedan producirse los cuales retienen actividad pesticida. Estos fragmentos incluyen secuencias truncadas, así como secuencias de aminoácidos N-terminales, C-terminales internos e internamente suprimidas de las proteínas . La mayoría de la supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteínas no se espera gue produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión, o inserción en su avance, alguien experto en la materia apreciará que el efecto se evaluará por análisis de tamizado de rutina. Es decir la actividad puede evaluarse por análisis de toxicidad de insectos . Las secuencias de nucleótidos pueden usarse entremezclado los protocolos de ADN. El entremezclado de ADN es un proceso para la recombinación recursiva y mutación, llevado a cabo por la fragmentación aleatoria de una coalición de genes relacionados, por el reensamble de los fragmentos y PCR sin iniciadores. Ver, por ejemplo Stemmer, W.P.C. (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 91 : 101 1 - 10151 ; Stemmer, W.P.C. (1994) Na ture 370 : 38 9-391 ; Zhang et al (1997) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 94 : 4504 -4509 ; y Publicación PCT No. 96/19256. Una ventaja del entremezclado de ADN de un diseño rotacional es que el entremezclado puede optimizar la función de genes sin determinar primero cual producto de genes es limitante de régimen. La presente invención provee métodos para entremezclado secuenciado utilizando polipéptidos de la invención y composiciones que resultan del mismo. Generalmente, el entremezclado secuenciado provee un medio para generar bancos de polinucleótidos que tienen una característica deseada que puede seleccionarse o tamizarse. Los bancos de polipéptidos recombinantes se generan a partir de una población de polipéptidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones secuenciadas que tienen identidad de secuencia sustancial y que homólogamente se pueden recombinar in vitro o in vivo. La población de polinucleótidos secuenciados-recombinados comprende una subpoblación de polinucleótidos que tiene características deseadas o ventajosas y que se puede seleccionar por una selección adecuada o métodos de tamizado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo capaz de seleccionarse para, o detectarse en un sistema de tamizado y pueden incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento transcripcional, una transcripción de control de secuencia, procesamiento de ARN, estabilidad de ARN, confirmación de cromatina, traducción u otra propiedad de expresión de un gen o transgen, un elemento de replicación un elemento de unión de proteína o similares, tal como cualquier característica que confiera una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, ia característica seleccionada tendrá un Km y/o Kcat incrementado sobre la proteína tipo silvestre como se prueba en la presente. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado del entrelazamiento secuenciado tendrá una afinidad de unión de ligandos mayor que el polinicleótido tipo silvestre no entremezclado. El incremento en dichas propiedades puede ser de por lo menos 110%, 120%, 130%, 140% o por lo menos 150% del valor tipo silvestre. La Pentina-1 es un miembro de una familia de genes más amplio de estereasas, y más específicamente acil hidrolasas de lípidos como se determina por las similitud de secuencias. El entremezclado de genes es un método que puede mejorar o alterar una actividad biológica de un producto de genes dado. El entremezclado de gen, junto con una estrategia de selección, se puede usar para mejorar propiedades tales como especificidad de sustratos, solubilidad, temperatura y pH óptimos de una proteína o enzima por evolución molecular dirigida. En el caso de toxicidad de Pentina-1 hacia insectos como se determina por las concentraciones letales es un parámetro más relevante.

El entremezclado de genes se puede aplicar a un solo gen que introduce mutaciones dentro del gen a una frecuencia dada. Las combinaciones ole mutaciones sinergísticas que se pueden seleccionar por generaciones subsecuentes de entremezclado de genes a partir de la población mutante primaria. Este enfoque puede aplicarse a Pentina-1. Alternativamente, los diferentes miembros de las familias de genes se codifican por secuencias divergentes o relacionadas se pueden usar para el entremezclado de genes. Esto podrá incluir pero no limitarse a Pentina-1, de Pentaclethra y una etiqueta de secuencia expresada de maíz identificada como 5C9 que codifica a un ADNc que es aproximadamente 57% idéntico a pentina-1 nivel de nucleótidos. Ver la solicitud de patente copendiente 08/449,986 presentada el 25 de mayo de 1995, incorporada aquí por referencia. Las mutaciones concomitantes también serán introducidas por entremezclado de genes contribuyendo más a la diversidad de genética. Después las combinaciones sinergísticas de las fusiones entre los miembros de la familia de genes y las mutaciones recién introducidas pueden seleccionarse por estrategias de evolución molecular dirigidas . Las hidrolasas de acilo de lípido comprenden una familia de múltiples genes diversas que se conservan a través de muchas especies de plantas. Las enzimas exhiben actividad de hidrolización para muchos glico y fosfolípidos. Los sustratos incluyen monogalactosildiacilglicerol, acilesterilgucósido, fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, así como otros muchos sustratos de lípidos. Similarmente, la composición de membrana de varios insectos también como de plantas puede variar de especie a especie y puede afectarse por la dieta o condiciones de crecimiento. Consecuentemente, la actividad de una acil hidrolasa de lípidos dada para un sustrato dado podría afectar tanto la especificidad como la potencia. La especificidad de sustrato alterado podría ser un parámetro para seleccionar productos de entremezclado de genes. La solubilidad y estabilidad de proteínas también se puede seleccionar de productos de genes entremezclados. Las proteínas insecticidas son activas en el ambiente severo de la lumen de intestino de insectos. Sus proteínas se digieren por proteasas y son afectas por condiciones de reducción u oxidación que varían de acuerdo con las especies de insectos probadas. La solubilidad y estabilidad de acil hidrolasas de lipidos tanto en la planta transgénica como en el lumen de intestino de insectos podría afectar la actividad biológica y se podrá alterar mediante las estrategias de entrelazamiento de genes.

Las condiciones para la reacción de enzimas tal como pH y temperatura óptimas también pueden afectar la actividad insecticida de la Pentina-1. El pH de intestino del gusano de raíz de maíz es 5.5-6.0. La sección de los productos de genes de Pentina-1 entrelazados para actividad enzimática hacia sustratos de lípidos en esta escala de pH es de otro parámetro que podría afectar la toxicidad. Por lo tanto, la secuencia de pentina de la presente invención se puede usar en los experimentos de entrelazamiento de genes con otras hidrolasas de lipidos tales como patatinas, y en particular con 5C9. Las proteínas u otros polipéptidos de componentes descritos en la presente pueden usarse solos o en combinación con otras proteínas o agentes para controlar diferentes plagas de insectos. Otras proteínas insecticidas incluyen aquellas de Basillus, incluyendo d-endotoxinas y proteínas insecticidas vegetativas así como inhibidores de proteasa (ambos tipos de serina y cisteina) , lectinas, a-amilasas, peroxidasas, oxidasa de colesterol , y similares. En una modalidad, la expresión de las proteínas de la invención en una planta transgénica se acompaña por la expresión de una o más d-endotoxinas de Bacill us thuringensis (Bt) . Esta co-expresión de más de un principio insecticida en la misma planta transgénica puede lograrse tratando genéticamente una plana para contener y expresar todos los genes necesarios. Alternativamente, una planta, Padre 1, puede tratarse genéticamente para la expresión de proteínas de la invención. Una segunda planta, Padre 2, puede tratarse genéticamente para la expresión de otros principios tales como d-endotoxinas Bt . Cruzando el Padre 1 con el Padre 2, las plantas de progenie pueden obtenerse que expresan todas los genes presentes en ambos Padres 1 y 2. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos de organismos diferentes a Penta cle thra , donde las proteínas reaccionan cruzadamente con anticuerpos surgidos contra las proteínas de la invención o en donde las secuencias de nucleótidos se aislan por hibridización con las secuencias de nucleótidos de la invención. Las proteínas aisladas o codificadas por las secuencias de nucleótidos pueden probarse para actividad pesticida. Las proteínas aisladas pueden analizarse para actividad pesticida por los métodos descritos en la presente u otros bien conocidos en la técnica . En otra modalidad, las proteínas de la invención se pueden usar en combinación con revestimientos de semillas disponibles en la técnica. De esta forma, las semillas transformadas se revisten con aplicaciones de rociadores de insecticida disponibles o polvos. Dichos insecticidas se conocen en la técnica. Ver por ejemplo Patentes Norteamericanas Nos. 5,696,144; 5,695,763; 5,420,318; ,405,612; 4,596,206; 4,356,934; 4,886,541; etc., incorporadas aquí por referencia. Una vez que las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas pesticidas de la invención se han aislado, se pueden manipular y usar para expresar la proteína en una variedad de huéspedes incluyendo otros organismos, incluyendo microorganismos y plantas . Las proteínas de la invención se pueden usar para proteger cultivos agrícolas y productos de plagas mediante la introducción vía un vector adecuado en un huésped microbiano y el huésped aplicado al ambiente o plantas . Los huéspedes de microorganismos se pueden seleccionar los cuales se conocen por ocupar la "fitósfera" (filoplano, filósfera, rizósfera, y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos organismos se seleccionan de manera que son capaces de competir exitosamente en el ambiente en lo particular con los microorganismos tipo silvestre, proveen mantenimiento y expresión estables del gen que expresa el pesticida de polipéptidos, y convenientemente, proveen protección mejorada de pesticidas a partir de la degradación e inactivación ambiental . Las proteínas de la invención se pueden usar en casetes de expresión para la expresión en cualquier huésped de interés. Dichos casetes de expresión comprenderán una región de iniciación transcripcional ligada al gen que codifica al gen pesticida de interés. Dicho cásete de expresión se provee con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del gen de interés que estará bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El cásete de expresión adicionalmente puede contener genes marcadores seleccionables adecuados para el organismo huésped particular. La región de iniciación transcripcional, el promotor, puede ser natural o análogo o extraño o heterólogo para el huésped. Adicionalmente, el promotor puede tener una secuencia natural o alternativamente tener una secuencia sintética. Por extraño se pretende que la región de iniciación transcripcional no este fundada en el huésped tipo silvestre en el cual se introduce la región de iniciación transcripcional. Como se usa en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia de codificación ligada operablemente a la región de iniciación de transcripción que es heteróloga para la secuencia de codificación. Mientras que cualquier promotor o elemento promotor capaz de impulsar la expresión de una secuencia de codificación puede utilizarse, los promotores de raíces son de interés particular para la expresión en plantas (Bevan et al (1993) en Gene Conservation and Exploitation . Proceedings of the 20th Stadler Genetics Symposium, Gustafson et al (eds.) Plenum Press, New York pp . 109-129; Brears et al . (1991) Plan t J. 1:235-244; Lorenz et al . (1993) Plant J. 4:545-554; Patentes Norteamericanas Nos.. 5,459,252; 5,608,149; 5,599,670);; médula (Patentes Norteamericanas Nos. 5,466,785; 5,451,514; 5,391,725); u otros promotores específicos para tejidos y constitutivos (Ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142, incorporada en la presente por referencia. El cásete transcripcional incluirá en la dirección 5' -3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional y de traducción , una secuencia de ADN de interés y una región de terminación transcripcional y de traducción funcional en plantas. La región de terminación puede ser natural con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés o puede llevarse de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles de plásmido de Ti y de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también, Guerineau et al . , (1991) Mol . Gen . Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al . (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al . (1990) Plan t Cell 2:1261-1272; Munroe et al . (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al . (1989) Nucleic Acids Res . 17:7891-7903; Joshi et al . (1987) Nucleic Acid Res . 15 : 9627-9639.

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas o polipéptidos de la invención son particularmente útiles en la manipulación genética de plantas. De esta forma, los genes de la invención se proveen en casetes de expresión para la expresión en la planta de interés. El cásete incluirá secuencias reguladoras de 5' y 3' ligadas operablemente al gen de interés. El gen adicionalmente puede contener por lo menos un gen adicional que será cotransformado o ligado y transformado en el organismo. Alternativamente, los genes de interés pueden proveerse en otro cásete de expresión. Cuando es apropiado, los genes pueden optimizarse para la expresión incrementada en la planta transformada. Es decir, los genes se pueden sintetizar usando codones preferidos de plantas para expresión mejorada. Los métodos están disponibles en la materia para sintetizar genes preferidos de plantas . Ver por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,380,831, 5,436, 391, and Murray et al . (1989) Nucleic Acids Res . 17:477-498, incorporada en la presente por referencia. Dependiendo de en donde la secuencia de ADN de interés se va a expresar, puede ser conveniente sintetizar la secuencia con codones preferidos de plantas o alternativamente con codones preferidos de cloroplastos . Los codones preferidos de plantes pueden determinarse a partir de los codones de frecuencia más alta en las proteínas expresadas en la cantidad más alta en las especies de plantas particulares de interés. Ver, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al . (1991) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 88:3324-3328; y Murray et al . (1989). Nuclei c Acids Research 17 : 477-498. De esta forma, las secuencias de nucleótidos pueden optimizarse para la expresión en cualquier planta. Se reconoce que toda o cualquier parte de la secuencia de genes pueden optimizarse o ser sintéticas". Es decir, las secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas también pueden usarse.

Las modificaciones de secuencias adicionales son conocidas por mejorar la expresión de genes en un huésped celular. Estos incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas señales de sitio de división de exones-intrones, repeticiones similares a transposones y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión de genes. El contenido de G-C de las secuencia se puede ajustar a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula por la referencia en los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se puede modificar para evitar las estructuras de ARNm secundarias previstas de ganchillo . Los casetes de expresión adicionalmente pueden contener secuencias líderes 5 ' en la construcción de casetes de expresión. Dichas secuencias líderes pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción se conocen en la materia e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo líder de EMCV (región de no codificación 5' de Encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, 0., Fuerst, T.R., y Moss, B. (1989) PNAS USA, 86:6126-6130); líderes de potivirus, por ejemplo, líder de TEV (Virus de grabado a agua fuerte de Tobacco) (Allison et al . (1986)); líder MDMV (Virus de Mosaico Enano de Maíz) Virology, 154 : 9-20) ; y proteína de unión de cadena gruesa de inmunoglobulina humana (BíP) , (Macejak, D.G., y Sarnow, P. (1991) Na ture, 353:90-94; líder no traducido de la proteína de revestimiento de ARNm de virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4), (Jobling, S.A., y Gehrke, L., (1987) Na ture, 325:622-625); líder de virus de mosaico de tabaco (TMV), (Gallie, D.R. et al . (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256) ; y líder de virus veteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel, S.A. et al . (1991) Virology, 81:382-385) . Ver también, Della-Cioppa et al . (1987) Plan t Physiology, 84:965-968. Otros métodos conocidos para mejorar la traducción pueden utilizarse también, por ejemplo intrones y similares. Los genes de la presente invención pueden dirigirse al cloroplasto o amiloplasto para la expresión. De esta forma, en donde el gen de interés no se inserta directamente en el cloroplasto o amiloplasto, el cásete de expresión adicionalmente contendrá un gen que codifica un péptido temporal para dirigir el gen de interés al cloroplasto.

Dichos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Von Heijne et al . (1991 ) Plant Mol . Biol . Rep . 9:104-126; Clark et al . (1989) Biol . Chem . 264:17544-17550; della-Cioppa et al . (1987) Plant Physiol . 84:965-968; Romer et al . (1993) Biochem . Biophys . Res Commun . 196:1414-1421; and Shah et al . (1986) Science 233:478-481. La construcción también puede incluir cualquier otro regulador necesario tal como señales de localización nucleares (Kalderon et al . (1984) Cell 39:499-509; y Lassner et al . (1991) Plant Molecular Biology 17:229-234); secuencias de consenso de traducción translacional de plantas (Joshi), C.P. (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653), intrones (Luehrsen y Walbot (1991) Mol . Gen . Genet . 225:81-93) y similares, ligados operablemente a la secuencia de nucleótidos de interés . Se reconoce que la proteína puede expresarse comprendiendo las secuencias de señales nativas. Ver Figura 3. Alternativamente, otras secuencias de señales en la técnica, por ejemplo la secuencia de señal de alfa amilasa de cebada se pueden utilizar. Para preparar el cásete de expresión, pueden manipularse varios fragmentos de ADN de manera que proveen las secuencias de ADN en la orientación apropiada y según sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, los adaptadores o ligadores pueden emplearse para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones pueden implicarse para proveer los sitios de restricción convenientes, la remoción de ADN superfluos, la remoción de sitios de restricción o similares. Con este fin, la mutagénesis in vitro, reparación en el iniciador, restricción, recosido, resecado, unión, PCR, o similares pueden emplearse, en donde pueden implicarse inserciones, supresiones o sustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones. Las composiciones de la presente invención se pueden usar para transformar cualquier planta. De esta forma, las plantas modificadas genéticamente, las plantas, tejidos de plantas, semillas y similares pueden obtenerse. Los protocolos de transformación pueden variar del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledones o dicotiledones dirigidos para transformación. Los métodos adecuados para transformar células de plantas de transformación incluyen microinyección (Crossway et al . (1986) Bio techni ques 4:320-334), electroporación (Riggs et al . (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee et al . (1988) Biotechnology, 6:915- 921), transferencia de genes directa (Paszkowski et al . (1984) EMBO J. , 3 : 2111 -2122 ) , y aceleración de partículas de ballesta (ver, por ejemplo, Sanford et al . , Patente Norteamericana No. 4,945,050; y, McCabe et al . (1988) Bio technology, 6:923-926). También ver, Weissinger et al . (1988) Annual Rev. Genet., 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology, 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soya); McCabe et al. (1988) Bio/Technology, 6:923-926 (soya); Datta et al. (1990) Biotechnology, 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology, 6:559-563 (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol., 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology, 8:833-839; Tomes et al. "Direct DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment, In: Gamborg and Phillips (eds) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer-Verlag, Berlin, 1995 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (London), 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman et al., pp. 197-209. Longman, NY (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports , 9:415-418; y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet., 84:560-566 (transformación mediada-escobilla); D=Halluin et al. (1992) Plant Cell, 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports, 12:250-255 y Christou and Ford (1995) Annals of Botany, 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology, 14:745-750 (maíz vía Agrobacterium tumefaciens) ; todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Donde es conveniente, el plástido de plantas puede transformarse directamente. La transformación estable de plástidos se ha reportado en plantas superiores, ver por ejemplo SVAB et al . (1990) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 87:8526-8530; SVAB & Maliga (1993) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 90:913-917; Staub & Maliga (1993) Embo J. 12:601-606. El método se basa en el suministro con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccional y una dirección del ADN al genoma del plástido a través de recombinación homologa. Adicionalmente, la transformación de plástidos puede lograrse por la transactivación de un transgen con plásticos en reposo por la reacción especifica de tejido de una polimerasa de ARN codificado nuclearmente y dirigida al plástido. Ducho sistema se ha reportado en McBride et al . (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 91:7301-7305. Las células que se han transformado pueden desarrollarse en plantas de acuerdo con formas convencionales. Ver por ejemplo, McCormick et al . (1986) Plant Cell Reports , 5:81-84. Estas plantas pueden desarrollarse y polinarse con la misma cepa transformada o diferentes cepas y la descendencia resultante que tiene las características fenotípicas deseadas identificadas. Dos o más generaciones pueden desarrollarse para asegurar que la característica fenotípica del sujeto se mantenga establemente y sea hereditaria y después las amidas se cultivan para asegurar el fenotipo deseado u otra propiedad o que se haya logrado otra propiedad. Las proteínas serán expresadas en los organismos transformados en cantidades que sean tóxicas para los insectos de interés o inhibidores para el desarrollo de insectos . Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para fines de claridad de entendimiento, será obvio gue ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de la invención descrita. EXPERIMENTAL Purificación de Pentina-1 Se recopilaron semillas de P. macroloba del bosque húmedo de tierras bajas de Costa Rica y se transportó a los laboratorios de los inventores en donde se cortaron, liofilizaron y almacenaron a -20°C antes de usarse. Las semillas congeladas se cortaron en piezas más pequeñas y se homogeneizaron usando un homogeneizador Brinkman. En un procedimiento normal, 10 g de material de semilla se homogeneizaron con 1-2 gr de polivinilpirrolídona insoluble y 50-100 ml de solución reguladora de 10 mM de fosfato de sodio, pH 7.5. El homogenato entonces se agitó a 4°C durante 8 a 10 horas y se centrifugó a 5,000 rpm durante 15 minutos. El fluido sobrenadante se decantó cuidadosamente y se vertió a través de una sola capa de Miracloth, y se recopiló de manera que evitara la transferencia de materiales similares a lípidos en el extracto que se separaron y solidificaron sobre la superficie durante la centrifugación. La pella se descartó y el líquido recuperado que aún estaba nebuloso se centrifugó una segunda vez a 18,000 rpm en un rotor Sorval SS-34 o su equivalente durante 30 minutos. El líquido sobrenadante ligeramente turbio, de aquí en adelante llamado el extracto crudo, se recuperó y la pella se descartó. Una muestra del extracto crudo se guardó para probar y el resto se dializó usando membrana (MWCO) cortada de peso molecular de 3,500 contra cinco cambios de 10 mM de solución reguladora de pH de fosfato de sodio, pH 7.5 a 3°C a 4°C. La relación de fluido de diálisis a extracto fue de por lo menos 20:1. La diálisis continuó durante 8 a 16 horas por intercambio de solución reguladora. El extracto se volvió algo turbio durante la diálisis como resultado de la precipitación de la proteína. Por lo tanto, el extracto dializado se aclaró por centrifugación a 18,000 rpm durante 30 minutos para remover las proteínas desnaturalizadas. El material resultante, después de la centrifugación de aquí en adelante se llama extracto dializado crudo. Los extractos dializados y dializados crudos se analizaron para la composición o contenido de proteína y se encontró que contienen una sustancia que era insecticidamente activa contra el gusano de raíz de maíz (CRW) en análisis biológicos. El insecticida se encontró que es una proteína o sustancia proteínica. Una muestra de 100 ml del extracto crudo dializado se calentó a aproximadamente 80°C usando un baño de agua y se mantuvo a está temperatura durante alrededor de 5 minutos. El extracto caliente se enfrió entonces a menos de 25°C usando un baño de hielo y después enfriando, centrifugando durante 15-30 minutos a 18,000 rpm usando un rotor Sorval SS-34. El líquido de sobrenadante transparente se removió, se guardó y se designó de aguí en adelante como el extracto tratado con calor- El material formado en pellas se descartó. Se observó que algunas veces el extracto tratado con calor recibe una tendencia a gelificarse. El extracto tratado con calor fue proteína analizada usando el método de Brandford con BSA como normal y se encontró que tiene actividad insecticida contra CRW en análisis biológico. Una muestra del extracto caliente se fraccionó y se concentró usando sulfato de amonio. La muestra se enfrió usando un baño de hielo y sulfato de amonio en polvo, muestra de 0.6 g/ml, se agregó lentamente con agitación. Una vez que se completó la adición se sulfato de amonio, la muestra se mantuvo a temperaturas de baño de hielo durante aproximadamente 30 minutos. La muestra después se centrifugó a 4°C durante 20 minuto a 18,000 rpm usando un rotor Sorval SS-34. El líquido sobrenadante y el material formado en pellas se separaron y el material formado en pellas se volvió a solubilizar en una cantidad mínima de solución reguladora de fosfato de sodio 10 mm, pH 7.5 y se dializó extensamente contra su acción reguladora de fosfato de sodio y 10 mM, pH 7.5. El líquido sobrenadante y el material formado en pellas resolubilizado se analizaron para contenido de proteína por el método de Bradfort usando BSA como el estándar y se probó por actividad biológica contra CRW. La mayoría de la Pentina-1 se encontró en el material formado en pellas y fue insecticida contra CRW. Alternativamente, el volumen del extracto caliente se redujo por concentración centrifugal usando Contricon™ o dispositivos de concentración similares de acuerdo con las instrucción del fabricante. Las proteínas también se fraccionaron por cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Pharmacia Sephacryl S-200 o una columna Pharmacia Superóse 12. Diferentes tamaños de columnas se usaron dependiendo de la cantidad de proteína en la muestra que se cromatografió . Generalmente el volumen de muestra no fue mayor a 0.5-1% del volumen de columna. La columna se equilibró con por lo menos dos o tres volúmenes de columna de solución reguladora de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.5, antes de que la muestra se aplicará a la columna. Las proteínas se eluyeron de la columna con solución reguladora de fosfato de sodio y 10 mM pH 7.5. Las fracciones se analizaron para contener proteína por el método Bradford usando BSA como el estándar y se bioanalizaron usando larvas de gusano de raíz de maíz. Los extractos crudos o dializados, extractos calientes, fracciones resolubizadas después de la precipitación de sulfato de amonio, y extractos de fracciones concentradas por otros métodos pueden cromatografiarse mediante este método. El material biológicamente activo se eluyó justo después del volumen de vació. Sugiriendo que el material activo es de peso molecular moderadamente alto. Este resultado concuerda con los cálculos de tamaño obtenidos usando dispositivos de filtro Centricon™ con diferentes escalas de peso moleculares. Lo último indicó que el material activo tiene un peso molecular natural mayor a 100 kFa, el resultado probable de combinar una pluralidad de subunidades de peso molecular 40-55 + 5 Kda . La pureza de fracción se calculó después de la terminación del peso molecular usando SDS-PAGE como se describe más adelante. Estas fracciones fueron esencialmente puras con una banda primaria detectada con un peso molecular subunitario estimado en la escala de 40-55 + 5 kDa. Las muestras tratadas con calor o muestras que se sometieron a cromatografía de exclusión de tamaño se fraccionaron por cromatografía de intercambio aniónico usando una columna de Pharmacia Q Sepharose o una columna de Pharmacia Q. Antes de colocar la muestra en la columna, la columna se lavó primero con 25 mM Tris-HCl o solución reguladora adecuada conteniendo 1 M de NaCl, y después equilibrada con la misma solución reguladora sin NaCl. El pH de la solución reguladora usada en la cromatografía varío entre pH 4 y 10 pH. Con el fin de ilustrar los métodos, la cromatografía, usando solución reguladora de Tris-HCl de 25 mM, pH 9.0 se describe en la presente. Antes de inyectar la muestra en la columna, la muestra se dializó usando una membrana MWCO de 3,500 a través de 2-3 intercambios de solución reguladora de HCl de 25 mM sin 1 M NaCl. Después de la colocación de la columna, se recopiló un flujo de paso y la columna de lavó con Tris HCl de 25 mM, pH 9.0. el lavado también se recopiló. La columna después se eluyó con un gradiente que varia de Tris HCl de 25 mM, pH 9.0, sin NaCl a Tris HCl de 25 mM, pH 9.0, 1 M NaCl. Todas las fracciones recopiladas se dializaron con un mínimo de dos intercambios de solución reguladora contra fosfato de sodio 10 mM ph 7.5. Las fracciones a través de flujo, lavado y eluídas con sal se analizaron por proteína por el método de Bradford usando BSA como el estándar y se bioanalizó usando CRW. El material activo se encontró en el flujo y en las fracciones que se eluyeron entre 0.2 y 0.5 M de NaCl. Para determinar si la capacidad de la columna se excedió, dando como resultado materiales adicionales pasando a través de la columna sin unión, el material activo en el flujo del paso se volvió a aplicar a la columna después de re-equilibrar. La mayoría del material absorbente UV 280 nm pasó a través de la columna. Estas observaciones sugieren gue este material activo tiene diferentes propiedades que el material que se une a la columna y se eluyó con incrementos de NaCl. Las otras soluciones reguladoras usadas también fueron adecuadas para la cromatografía de intercambio aniónico como se muestra por aquellos familiarizados con la materia. El material activo también podrá purificarse por cromatografía de intercambio catiónico. El material de Pentina-1 se purificó hasta casi homogeneidad por cromatografía de exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio aniónico. Las bandas de proteína menores se removieron por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) usando una columna de fase inversa antes del análisis de aminoácidos y determinación de la secuencia de aminoácidos . La pureza de las muestras y el peso molecular subunitario se determinaron por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida al 12% y generalmente siguiendo el método de Laemmli, Na ture 227:680-685 (1970) . Los geles se tiñeron con Azul de Coomassie R250 usando protocolos normales o se tiñeron con plata (Hammer et al., Phytochemistry 28:3019-3026 (1989)). Por SDS-PAG, el peso molecular subunitario de la sustancia activa se encontró que está en la escala de 40-55,000 + 5,000 Daltones. Además de los procedimientos descritos antes, se pueden usar otros procedimientos para separar la sustancia activa de un extracto de semilla cruda. Por ejemplo, se puede someter un extracto al enfoque isoeléctrico (IEF) usando un sistema Rotofor (Bio Rad) . El Rotofor separa las moléculas sobre la base de su pl o punto isoeléctrico. Cada molécula tendrá una carga específica, ya sea positiva o negativa en un pH específico. El Rotofor, usando una corriente eléctrica, mueve las moléculas a través de un gradiente de pH hasta que alcanzan su pl; es decir, el pH el cual tienen una carga neta de cero. Los retenes de moléculas gue migran en su pl debido a que ya no se afectan por la corriente eléctrica. La cámara de enfoque de Rotofor se separa en 20 cámaras más pequeñas por membranas permeables. Estas veinte muestras se remueven simultáneamente para asegurar tan poco mezclado como sea posible. Normalmente, se coloca una muestra en el medio de enfoque, una solución reguladora de pH (ver instrucciones del fabricante) que incluyen 12.5% (v/v) de glicerol y 2.5% de pH 3-10 Amfolitos (Bio Rad) . Después del enfoque, las fracciones se recopilan, el pH de cada una se determina y cada fracción íe realiza contra 1 M de NaCl usando una membrana de MWCO de 3,500 para remover los Amfolitos. Las muestras después se dializan contra agua desionizada para remover el NaCl. Cada fracción se liofilizó y se resuspendió en 0.4 ml de 10 mM de NaCl. Las fracciones de Rotofor que contienen material activo pueden determinarse por análisis de proteínas y bioanálisis con larvas de insectos. Las fracciones de Rotofor entonces pueden someterse a tratamiento adicional o separación como se describe antes. Análisis Biológico El bioanálisis se llevó a cabo usando larvas de neonato de CRW colocadas en dietas artificiales conteniendo Pentina-1 obtenida de P. macroloba como se describió en la presente. La Pentina-1 puede ser de un extracto crudo o purificarse como se enseña en la presente. La Pentina-1 se aplicó tópicamente a la superficie de dieta o se incorporó en la dieta como se enseñó por Czapla y Lang, J. Econo . En to 83 ( 6 ) : 2480-2485 (1990). La charola de cultivó utilizada en los bionálisis se dividió en grupos de tratamiento. Uno de una pluralidad de preparaciones de Pentina-1 o fracciones de las varias separación se tamizaron en cada charola; cada preparación o fracción siendo aplicada a una pluralidad de células; cada célula se infesto con una o más larvas de neonatos. Una película laminar con orificios de ventilación se fijó en la parte superior de cada charola para evitar el escape y permitir intercambio de aire.

Para los análisis tópicos (capa superior) , una solución que contiene Pentina-1 al 2% se preparó en solución salina regulada de fosfato 0.1 M (PBS), pH 7.8. Setenta y cinco microlitros de solución reguladora de Pentina-1 se pipetearon en medio de dieta Stonville en cada célula. La charola de cultivo se rotó para asegurar la distribución igual a la solución de pentina en el medio de dieta. Las células se infectaron y sellaron como se describió antes. El control fue de 75 µl de 0.1 M PBS (únicamente) por célula. Para los análisis de incorporación de dieta, el medio Stoneville se preparó en forma estándar, pero únicamente con 90% del agua prescrita. La Pentina-1 se agregó de manera que la cantidad en la dieta estuvo en la escala de 1-5 µg/g. El tratamiento control consistió de 0.9 ml de solución reguladora agregada a 8.1 g del medio. El medio se vertió en las células y las células se infestaron y cubrieron como se describió antes. Los pesos de los insectos (Peso o Peso Promedio) se determinaron en el día 7 y se dan en las tablas . Tabla A. Efecto de Peptina-1 sobre Gusano de Raíz de Maiz Southern Muestra Concentración (dieta µg/ml] de Mortalidad Control 0 Crudo 1,000 100 Crudo 400 15 AS75 400 60 Fracción de Tamaño 17 8 14 Fracción de Tamaño 18 8 45 Fracción de Tamaño 19 8 29 Notas: AS75 = sulfato de amonio 75% población. Una vez que se purificó la Pentina-1 y se estableció su actividad insecticida, se llevaron a cabo esfuerzos de planeación. El primer paso del proceso fue determinar mediante análisis de machas western la distribución temporal y espacial de Pentina-1 con el fin de identificar el tejido de planta o semilla o tejidos que expresan más probablemente esta proteína. Dado que la Pentina-1 no se aisló en cantidades que permiten la producción de anticuerpos, la proteína se secuenció con el fin de permitir el diseño de péptidos por síntesis. La datos de secuencia de aminoácidos para Pentina-1 se muestran más adelante en la Figura 1. La terminación carboxi y la secuencia interna de aproximadamente 40% de los péptidos de Pentina-1 se recopilaron de 15 péptidos purificados de digestión de LysC y CNBr de proteína de pentina purificada. La secuencia NH2-terminal no se identificó durante este proceso .

Se originaron anticuerpos contra cinco de ios péptidos. Los péptidos sintéticos usados para producir anticuerpos se listan más adelante. Péptido Sintético No. 1 (SEC. DE IDENT. NO: 5) Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro lie Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys Nota: Corresponde a los números de aminoácidos 213-228 de la Figura 1. Péptido Sintético No. 2 (SEC. DE IDENT. NO: 6) Ala Leu Gln Pro Gln Asn Asn Tyr Leu Arg Gln Glu Try Asp Leu Asp Nota: Corresponde a los números de aminoácidos 344-360 de la Figura 1. Péptido Sintético No. 3 (SEC. DE IDENT. NO: 7) Pro Asp Trp Val Val lie Arg Ser Glu Ser Val Gly Lys Note: No corresponde a los aminoácidos de la Figura 1. Péptido Sintético No. 4 (SEC. DE IDENT. NO : 8 ) Lys Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe lie Asn Thr Tyr Asp Ser Ala Nota: No corresponde a los aminoácidos de la Figura 1. Péptido Sintético KS (SEC. DE IDENT. NO: 9) Asn Asn Tyr Leu Arg lie Gln Glu Tyr Asp Leu Pro Pro Ala Leu Nota: Corresponde a los números de aminoácidos 349-363 de la Figura 1. Las manchas de puntos Western de Pentina-1, cada uno de los péptidos sintéticos y una proteína experimental designada 5C9 se incubaron con cada uno de los anticuerpos. Los resultados de incubación indicaron que el anticuerpo originado contra el péptido sintético KS (anticuerpo anti-KS) y el anticuerpo originado contra el péptido sintético (anticuerpo anti-2) reconoció la Pentina-1. Los análisis de machas Western de extractos de tejidos de Pentaclethra macroloba tratados con anticuerpos anti KS indicaron que EL reconocimiento mayor estuvo con las semillas maduras de 30-40 mm de diámetro o más grandes. El ARN total se aisló de estas semillas . El ADN genómico se aisló, los oligonucleótidos degenerados en los codones basados en los péptidos se usaron para amplificar fragmentos genómicos por PCR. La secuencia de exones de los clones resultantes se usó para realizar RT-PCR con oligos específicos, después se llevaron a cabo experimentos de RT-PCR para obtener por lo menos un ADNc de Pentina-1 parcial para sondear el banco de expresión. La información obtenida de la secuenciación de clones de ADNc aleatorios de banco de semillas inmaduras de P. macroloba se usó para generar una tabla de uso de codones nacientes. Los datos obtenidos indicaron que el árbol de P. macroloba no tuvo una inclinación de uso de codones fuerte y que el contenido de GC es moderado. Una matriz para degenerar los iniciadores hacia delante y inversamente que corresponden a los péptidos de Pentina-1 se seleccionaron para su uso. La secuencia de iniciador más adelante fue VVKRLAGYFDV (aminoácidos de Pentina-1 Nos. 76-86: Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val) (SEC. DE IDENT. NO: 10) y la secuencia iniciadora inversa fue ENMENLEK, (aminoácidos de Pentina-1 Nos. 372-379: Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys) (SEC. DE IDENT. NO: 11) . Debido a la pequeña cantidad de tejido disponible, la prueba de iniciador inicial se llevó a cabo usando ADN genómico derivado de hojas de P macroloba . Una de las sesenta y cuatro combinaciones de iniciadores posibles dio un fragmento de 3.0 kb que codificó la secuencia de péptido Pentina-1. El par de iniciadores hacia delante y hacia atrás se usaron para amplificar un fragmento de ADNc de 0.8 kB del ADN total aislado de semillas maduras (30-40 mm) . El tamizado subsecuente del banco de expresión de semillas maduras con esta sonda de ADNc de 0.8 kb produjo varios clones relacionados, uno de los cuales es un clon de 1.4 kb que codifica doce de las quince secuencias de péptidos de Pentina-1 (SEC. DE IDENT. NO:l). Las machas Western se llevaron a cabo con Pentina-1, los péptidos sintéticos de Pentina-1, proteínas de 5C9 y BSA después de la exposición a anticuerpos seleccionados . Los análisis de manchas se trataron con una dilución de 1/10,000 de anticuerpos originados contra cada uno de los péptidos y 5C9. Cada anticuerpo reconoció su antígeno sin reactividad cruzada detectable para BSA, el control negativo. Todos los anticuerpos, excepto los surgidos contra el número de péptidos sintéticos 1, reconoció 1.0 microgramos de 5C9.

Aunque los péptidos sintéticos KS y el número 2 fueron 74% idénticos, el anticuerpo anti-2 no reconoció KS, pero detectó Pentina-1 y 5C9. La secuencia de ácidos nucleicos del clon de Pentina-1 se determinó por procedimientos estándares conocidos por los expertos. La secuencia de ADNc y la secuencia de proteínas de pentina-1 previstas se proveyó en la Figura 1 y SEC. DE IDENT. NO: 1. Bioanálisis de Material Clonado Se llevaron a cabo bioanálisis contra gusano de raiz de maíz Western (WCR) usando E. coli tratados con sonido que se transformaron con uno de varios plásmidos listados (Tabla 1) . Las células transformadas se desarrollaron en aproximadamente 25-35 ml de caldo de TB. Las células se cosecharon después 24 horas por centrifugación. La pella se resuspendió en aproximadamente 1 ml de solución reguladora de PBS y se trató con sonido. La mezcla resultante después se cargó en la parte superior en la superficie de la dieta, después se infestó con larvas neonatas de WCR. La mortalidad se registro después de 4 días. Un resultado positivo indicó 100% mortalidad. Un resultado negativo indicó mortalidad menor al 10%. Un experimento similar implicó el uso de células transformadas desarrolladas en una placa de agar. Las células se rasparon después de suficiente crecimiento, se suspendieron en una pequeña cantidad de solución reguladora de PBS y después la solución se incorporó en la dieta de insectos. Un bionálisis de 4 días también se llevó a cabo con la mortalidad registrada. La Tabla 1 exhibe los resultados de dos bioanálisis replicados. Todas las células transformadas con plásmidos negativos putativos (genes de WCR no letales) no ocasionaron mortalidad de larvas en ninguna prueba. Estos plásmidos son P7725, P88126, y P11426. Los dos plásmidos que contienen la secuencia de codificación para Pentina-1 pero no promotores para producir la proteína actual, PGEM y P11394 no exhibieron actividad de WCR. Sin embargo, todos los plásmidos que contienen la región de codificación para Pentina-1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) y un cásete de expresión funcional exhibieron excelente actividad contra larvas de WCR. Todos estos tratamientos tuvieron mortalidad del 100%. El análisis de manchas Western preliminar indicó que una proteína similar en tamaño a Pentina-1 estuvo presente en estos extractos celulares, pero no en muestras de control negativas. La actividad se observó en ambos tipos de preparación de células y bionálisis.

TABLA 1 Plásmido # Contenido de Tratamiento Tipo de Bioanálisis Resultado de Construcción control de bioanálisis P7725 UBI-Bt Placa de caldo Carga superior de Negativo Neg. microincorporación Negativo Neg.

P8812 Bt Placa de caldo Carga superior de Negativo Neg. microincorporación Negativo Neg.

MoPentina/PGEM Placa de caldo Carga superior de Negativo Neg. microincorporación Negativo Neg.

P11184 ADNc de pentina-1 Placa de caldo Carga superior de Positivo N/A completa de UBI del microincorporación Positivo N/A banco de Clon-Pinll P11335 UBI-Pentina Mod. (ATG- Placa de caldo Carga superior de Positivo N/A TGA)-PinII (modificada microincorporación Positivo N/A del clon completo, pero no maduro putativo P11361 Pentina-1 de ADNc en Placa de caldo Carga superior de Positivo N/A pBK-CMV (promotor lacZ) microincorporación N/A P11394 Pentina-1 (proteína Placa de caldo Carga superior de Negativo Neg. madura) sin promotor o microincorporación Negativo Neg. codón de partida) P11426 UBI-moPAT-CAMV35s Placa de caldo Carga superior de Negativo Neg. microincorporación Negativo Neg.

P11443 Ubi-moPentina-1-Pin Placa de caldo Carga superior de Positivo N/A II/CAMV35S-Pat-CAMV35S microincorporación Positivo N/A Transformación de Plotoplastos Aislados de Células de Suspensión de Maiz con Tres Contrucciones de Genes de Pentina para la Expresión de Genes y para Bioanálisis de CRW I . Protocolo de Transformación de Protoplastos Las células de suspensión Hill (GS3) establecidas se usaron para formar protoplastos. Las célula se recuperaron 3-4 días después del subcultivo. Digestión de células: Las células se dirigieron en solución de enzima a 27 °C durante 3-5 horas con velocidad de agitación de 50-60 RPM. La pared celular se digirió con celulasa y pectoliasa para liberar los protoplastos. Recuperación de protoplastos: el material digerido se paso a través del filtro de 30 mm y los protoplastos se recuperaron por centrifugación del filtrado a 1,000 RPM durante 10 minutos. La pella de protoplastos se resuspendió en 20 ml o 40 ml de solución de KMC. La densidad de protoplasto y el rendimiento de protoplasto total se determinó contando el número de protoplasto con un hemacitómetro . La suspensión se centrifugó para formar pellas de protoplasto. La pella de protoplastos se suspendió en la solución de transformación de MaMg en una concentración de 2 millones de protoplastos por ml. La solución en cantidades de 2 ml (aproximadamente 4 millones de protoplastos) se dispersó en tubos de fondo redondo de 15 ml . Cada tubo fue una replicacíón. Al menos tres réplicas se usaron para cada una construcción de genes de Pentina-1. Las construcciones incluyeron Pentina-1 nativa y la secuencia de Pentina-1 optimizada. Ver SEC. DE IDENT. NOS: 1 y 3, respectivamente. El ADN de plásmidos se agregó a la suspención de protoplastos en los tubos (15 mg de ADN de plásmido/millón de protoplastos) y se mezclaron. Después de la incubación de 5 minutos, 2 ml 40% de polietilenglicol (PEG-8000, Sigma) se agregó a la mezcla de protoplastos/ADN (la concentración de PEG final es de aproximadamente 20%) y se mezcló por la inversión de tubos varias veces y se incubó a temperatura ambiente durante 20-30 minutos . Alrededor de 3 ml de solución salina de W5 se agregó a cada tubo. Los tubos se cubrieron y se invirtieron suavemente. Esto se repitió dos veces hasta gue el volumen final fue 13-14 ml . La suspensión se centrifugó 8 minutos a 1,000 RPM. Se usaron 3 ml de medio FW para resuspender los protoplastos. (Ver enseguida) . Usando una pipeta para Pasteur de plástico comprimible, se dispensó un tratamiento (3 ml) en dos pozos de una placa de cultivos de 6 pozos, se selló con parapelícula y se incubó 24-48 horas en la oscuridad, a 28°C. Después del cultivo, los protoplastos se transfirieron en un tubo de 15 ml usando una pipeta Pasteur comprimible de plástico y se centrifugó 8 minutos a 500 RPM para formar la pella de los protoplastos. El análisis y bioanálisis de proteínas: De un quinto a un cuarto de la pella de protoplasto en cada replicación para cada tratamiento de transformación se muestreó para análisis de expresión de Peptina-1 por análisis Western. El resto de la pella de protoplastos se usó para bioanálisis. Todas las muestras de replicación del mismo tratamiento de transformación, que es transformado con la misma construcción de Peptina-1 se combinó y se incorporó en la dieta para bioanálisis de CRW. Los resultados de bioanálisis se proporcionan en la Tabla 2.

Tabla 2. Efecto de Petina-1 cuando se expresó temporalmente en protoplastos de maíz contra larvas de WCR. Los datos es una combinación de 6 experimentos replicados con el tiempo. Los protoplastos se trataron con sonido y toda la mezcla se incorporó en la dienta.

Plásmido # Contenido de construcción Análisis de Bioanálisis Mortalidad manchas para Pentina de Control Western P111841 UBI-Pentina 1 Completa ADNc de Positivo 32-' N/A banco de clon-PinlI P11335 UBI-Mod Pentina (ATG-TGA) - Positivo 05 N/A Pinll N/A débil (modificado del clon completo pero no maduro putativo) P11443 Ubi-mo Pentin-1-Pin-II/ Positivo 54% N/A Fuerte P8126 UBI-Bt Negativo 0% Control Negativo P3953 UBI-Gus Negativo 0% Control Negativo 1P11184 únicamente se usó en los últimos cuatro experimentos.

II. Construcciones de gen de Pentina-1 para Transformación P11184 - Ubi promotor :: Pentina-1 (clon de longitud completa original) P11335 - Ubi promotor :: Pentina-1 (gen modificado parcialmente) P11443 - Ubi promotor : :moPentina-l (gen optimizado) Soluciones y Medio Usado para Transformación Solución KMC - 1,000 ml KCI 8.65 g MgC12-6H20 16.47 g CaC12-2H20 12.50 g MES 0.5% 5.0 g PH 5.8 con KOH Se esteriliza con filtro Solución de trans ormación de MaMg - 1,000 ml M manitol 108.1 g 15 mM MgC12-6H20 3.05 g 10 mM MES 1.95 g PH 5.7 Se esteriliza con filtro 40% PEG - 100 ml Se agregan 40 g de PEG a 60 ml de solución de transformación de MaMg. Se coloca el microhondas brevemente para disolver PEG. Se agrega más solución de MaMg a un volumen final de 100 ml . Se ajusta a pH 7.0. Se esteriliza con filtro. Solución de enzima para digerir la suspensión celular (Solución de Enzima) La solución de enzima contiene 3% de celulosa RS y 0.3% de pectoliasa Y23 en la solución de protoplastos. Solución de Protoplastos - 1,000 ml M manitol 108.1 g 10 mM MES 1.95 g 1 mM CaC12-2H20 147 mg 1 mM MgC12-6H20 203 mg 1% BSA (optional) 1 g PH 5.7 Se esteriliza con filtro Solución de sal W5 - 1,000 ml 154 mM NaCl 9.0 g 125 mM CaC12-2H20 18.56 g 5 mM KCI 0.373 g 5 M Glucosa 0.901 g PH 5.5 con KOH Se esterüiza con filtro Medio FW - 1,000 ml Sales MS (Sigma M5519) 4.3 g sucrosa 30.0 g manitol 54.0 g Prolina 1.5 g 2, 4-D 3.0 mg l,000x B5 Vitaminas 1 ml PH 5.8 Se esteriliza con filtro Transformación y Regeneración de Callo de Maíz Los embriones de maíz inmaduros de plantas donadoras de invernadero se bombardearon con un plásmido que contiene las tres construcciones de Pentina-1 más un plásmido que contiene el gen marcador seleccionable, PAT, (Wohlleden, W., Arnold, W., Broer, I., Hillemann, D., Strauch, E. y Puehler, A. "Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tue494 and its expression in Mcotiana tabacum " Gene 70:25-37 (1988) que confiere resistencia a la Bialophos herbicida por el siguiente método: Notar: Todas las fórmulas medio están en el Apéndice. Preparación de tejido blanco: Las orejas se esterilizaron superficialmente en 30% de blanqueador Clorox más 0.55 de detergente Micro durante 20 minutos y se enjuagaron dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirparon y se colocaron ejes embriones boca abajo (en la parte de arriba es el escutelo) , 25 embriones por placa. Estos se cultivaron en medio 560L cuatro días antes del bombardeo en la oscuridad. El día del bombardeo, los embriones se transfirieron al medio 560Y durante 4 horas, se dispusieron dentro de la zona blanco 2.5 cm. Preparación de DNA: 100 µl de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 µl de ADN (1 µg) en solución reguladora de TrisEDTA (lµg en total) 100 µl 2.5 M CaC12 10 µl de 0.1 espermidina Cada reactivo se agregó secuencialmente a la suspensión de partículas de tungsteno mientras se mantuvo en el rotador de múltiples tubos. Los plásmidos se ajustaron para una relación final de 1:1 por tamaño. La mezcla final se trató con sonido brevemente y se dejó incubar bajo revolución constante durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos se centrifugaron brevemente, se removió el líquido, se lavaron con 500 ml de 100% de etanol y se centrifugaron 30 segundos. Del nuevo líquido se removió y se agregaron 105 µl de etanol al 100% a la pella de partículas de tungsteno final. Para el bombardeo de pistola de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se trataron con sonido brevemente y se colocaron 10 µl en el centro de cada macrovehículo y se dejó secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Tratamiento de Pistola de Partículas: Las placas de muestra se bombardearon en el nivel #4 en la pistola de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras recibieron un sólo tiro a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/ADN preparadas. Tratamiento subsecuente: Después del bombardeo, los embriones se mantuvieron en medio 560Y durante 2 días después se transfirieron a medio de selección de 560R conteniendo 3 mg/litro Bialphos, y se subcultivaron cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callo resistente de selección, se muestrearon para PCR y para análisis de actividad de TLC de fumonisina esterasa. Las líneas positivas se transfirieron a un medio 288J para iniciar la regeneración de plantas. Después de la maduración de embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados se transfirieron al medio para germinación y se transfirieron al ambiente de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, las plántulas en desarrollo se transfirieron a un medio en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas se establecieron bien. Las plantas se transfirieron a insertos en planos (equivalentes a macetas de 6.35 cm (2.5")) conteniendo tierra de maceta y desarrolladas 1 semana en una cámara de crecimiento, desarrolladas subsecuentemente durante 1-2 semanas en el invernadero, después se transfirieron a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se desarollaron hasta madurez.

APÉNDICE Ingrediente Cantidad Unidad D-I H20 900.000 ml Sales Básales CHU (N6) (SIGMA C-1416) 1.600 g N6 Macronutrientes 10X Stock ## 60.000 ml Nitrato de Potasio 1.680 Sales inferiores B5H 1000X ### 0.600 ml B5H Fe Na EDTA IOOX #### 6.000 ml Mezcla de Vitamina de Eriksson (lOOOX SIGMA-1511) 0.400 ml S & H Mezcla de vitamina lOOX Stock (S3766) 6 000 m? Tiamina .HCL 0.4mg/ml 0.500 ml L-Prolina 1.980 g Caseína Hidrolistato (ácido) 0.300 g Sacarosa 20.000 g Glucosa O.600 g 2,4-D 0.5 mg/ml 1.600 ml Gelrita @ 2.000 g Dicamba 1 mg/ml # 1.200 ml Nitrato de Plata 2 mg /ml # 1.700 ml Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado #= Agregar después de esterilizar y enfriar a temperatura Disolver ingredientes en D-I H2O pulido en secuencia Ajustar a pH 5.8 Llegar a un volumen con D-I H20 pulido después ajustar pH Esterilizar y enfriar a 60°C. ##= Disolver 1.660 g de dihidrato de cloruro de calcio en 950.000 ml de D-I H20 pulido. Después disolver 4.629 de sulfato de amonio; 4.000 g de fosfato de potasio Monobásico KH2P04; 1.850 g de Sulfato de Magnesio 7-H20, MgS04, 7H20; y 28.300 g de Nitrato de Potasio en secuencia. Llegar un volumen con D-I H20 pulido. ### = Disolver 3.000 g de Acido Bórico; 10.000 g de Sulfato Manganésico Monohidrato; 0.250 g de Dihidrato de Molibdato de Sodio; y 0.750 g de Yoduro de Potasio en D-I H20 pulido en secuencia. Llegar a un volumen con D-I H20 pulido. #### = Disolver 3.700 g de Dihidrato de Disodio EDTA y 2.790 g de Sulfato Ferroso 7-Hidrato en D-I H20. Llegar a un volumen con D-I H20. Volumen Total (L) = 1.00 604 A Ingrediente Cantidad Unidad D-I H?0 900.000 ml Sales Básales CHU (N6) (SIGMA C-1416) 1.600 g N6 Macronutrientes 10X Stock ## 60.000 ml Nitrato de Potasio 1.680 g Sales inferiores B5H ÍOOOX ### 0.600 ml B5H Fe Na EDTA lOOX #### 6.000 ml Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511) 0.400 ml I S & H Mezcla de vitamina lOOX Stock (S3766) 6 000 ml 1 Tiamina .HCL 0.4mg/ml 0.500 ml L-Prolina 1.980 g Caseína Hidrolistato (áci do) 0.300 g Sacarosa 20.000 g Glucosa O.600 g 2,4-D 0.5 mg/ml 1.600 ml Gelrita @ 2.000 g Dicamba 1 mg/ml # 1.200 ml Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado #= Agregar después de esterilizar y enfriar a temperatura Disolver ingredientes en D-I H20 pulido en secuencia Ajustar a pH 5.8 Llegar a un volumen con D-I H20 pulido después ajustar pH Esterilizar y enfriar a 60°C. ##= Disolver 1.660 g de dihidrato de cloruro de calcio en 950.000 ml de D-I H20 pulido. Después disolver 4.629 de sulfato de amonio; 4.000 g de fosfato de potasio Monobásico KH2P04; 1.850 g de Sulfato de Magnesio 7-H20, MgS04, 7H20; y 28.300 g de Nitrato de Potasio en secuencia. Llegar un volumen con D-I H20 pulido. ### = Disolver 3.000 g de Acido Bórico; 10.000 g de Sulfato Manganésico Monohidratado; 0.250 g de Dihidrato de Molibdato de Sodio; y 0.750 g de yoduro de Potasio en D-I H20 pulido en secuencia. Llegar a un volumen con D-I H20 pulido. #### = Disolver 3.700 g de Dihidrato de Disodio EDTA y 2.790 g de Sulfato Ferroso 7-Hidrato en D-I H20. Llegar a un volumen con D-I H20. Volumen Total (L) = 1.00 605 J Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado #= Agregar después de esterilizar y enfriar a temperatura Disolver ingredientes en D-I H20 pulido en secuencia Ajustar a pH 5.8 Llegar a un volumen con D-I H20 pulido después ajustar pH Esterilizar y enfriar a 60°C. ##= Disolver 1.660 g de dihidrato de cloruro de calcio en 950.000 ml de D-I H20 pulido. Después disolver 4.629 de sulfato de amonio; 4.000 g de fosfato de potasio Monobásico KH2P04; 1.850 g de Sulfato de Magnesio 7-H20, MgS04, 7H20; y 28.300 g de Nitrato de Potasio en secuencia. Llegar un volumen con D-I H20 pulido. ### = Disolver 3.000 g de Acido Bórico; 10.000 g de Sulfato Manganésico Monohidrato; 0.250 g de Dihidrato de Molibdato de Sodio; y 0.750 g de Yoduro de Potasio en D-I H20 pulido en secuencia. Llegar a un volumen con D-I H20 pulido. #### = Disolver 3.700 g de Dihidrato de Disodio EDTA y 2.790 g de Sulfato Ferroso 7-Hidrato en D-I H20. Llegar a un volumen con D-I H20. Volumen Total (L) = 1.00 604 S Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado #= Agregar después de esterilizar y enfriar a temperatura Disolver ingredientes en D-I H20 pulido en secuencia Ajustar a pH 5.8 Llegar a un volumen con D-I H20 pulido después ajustar pH Esterilizar y enfriar a 60°C. ##= Disolver 1.660 g de dihidrato de cloruro de calcio en 950.000 ml de D-I H20 pulido. Después disolver 4.629 de sulfato de amonio; 4.000 g de fosfato de potasio Monobásico KH2P04; 1.850 g de Sulfato de Magnesio 7-H20, MgS04, 7H20; y 28.300 g de Nitrato de Potasio en secuencia. Llegar un volumen con D-I H20 pulido. ### = Disolver 3.000 g de Acido Bórico; 10.000 g de Sulfato Manganésico Monohidrato; 0.250 g de Dihidrato de Molibdato de Sodio; y 0.750 g de Yoduro de Potasio en D-I H20 pulido en secuencia. Llegar a un volumen con D-I H20 pulido. #### = Disolver 3.700 g de Dihidrato de Disodio EDTA y 2.790 g de Sulfato Ferroso 7-Hidrato en D-I H20. Llegar a un volumen con D-I H20. Volumen Total (L) = 1.00 272 V Ingrediente Cantidad Unidad D-I H20 900.000 ml Sales MS (GIBCO 11117-074) 4.300 g Myo-Inositol 0.100 g Vitaminas MS Solución Stock ## 5.000 ml Sacarosa 40.000 g Bacto-Agar 6.000 g Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado Disolver ingredientes en D-I H20 pulido en secuencia Ajustar a pH 5.8 Llegar a un volumen con D-I H20 pulido después ajustar pH Esterilizar y enfriar a 60°C. ##= Disolver 0.100 g de Acido Nicotínico; 0.020 g de Tiamina.

HCL; 0.100 g de Piridoxina. HCL; y 0.400 g de Glicina en 875.00 ml de D-I H20 pulido en secuencia. Llegar a un volumen con D-I H20 pulido. Hecho en porciones de 400 ml . Tiamina.

HCL & Piridoxina . HCL. están en Descicator Oscuro. Almacenar durante un mes, a menos que se presente contaminación o precipitación, después formar una materia prima fresca. Volumen Total (L) = 1.00 288 J Ingrediente Cantidad Unidad D-I H20 950.000 ml Sales MS 4.300 g Myo-Inositol 0.100 g Vitaminas MS Solución Stock ## 5.000 ml Zeatin .5 mg/ml 1.00 ml Sacarosa 60.000 g Gelrita @ 3.000 g Acido Acético Indol 0.5 mg/ml# 2.000 ml . lmM Acido Absísico 1.000 ml Bialasfos lmg/ml# 3.000 ml Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado Disolver ingredientes en D-I H20 pulido en secuencia Ajustar a pH 5.8 Llegar a un volumen con D-I H20 pulido después ajustar pH Esterilizar y enfriar a 60°C. Agregar 3.5 g/L de Gelrita para biología celular ##= Disolver 0.100 g de Acido Nicotínico; 0.020 g de Tíamina.

HCL; 0.100 g de Piridoxina. HCL; y 0.400 g de Glicina en 875.00 ml de D-I H20 pulido en secuencia. Llegar a un volumen con D-I H20 pulido. Hecho en porciones de 400 ml . Tiamina.

HCL & Piridoxina . HCL. están en Descicator Oscuro. Almacenar durante un mes, a menos que se presente contaminación o precipitación, después formar una materia prima fresca. Volumen Total (L) = 1.00 560 L Ingrediente Cantidad Unidad D-I Agua, filtrada 950.000 ml Sales Básales CHU (N6) (SIGMA C -1416) 4.000 g Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511 0.400 ml Tiamina .HCL 0.4 mg/ml 1.250 ml Sacarosa 20.000 g 2,4-D 0.5 mg/ml 2.000 ml L-Prolina 2.880 g Gelrita @ 2.000 g Nitrato de Plata 2 mg/ml # 4.250 ml Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado #= Agregar después de la esterilización y enfriamiento a temperatura . Disolver los ingredientes en D-I H20 en secuencia Ajustar a pH 5.8 con KOH Llegar al volumen con D-I H20 Esterilizar y enfriar a temperatura ambiente. Volumen Total (L)= 1.00 560 R Ingrediente Cantidad Unidad D-I Agua, filtrada 950.000 ml Sales Básales CHU (N6) (SIGMA C -1416) 4.000 g Mezcla de Vitamina de Erik.sson (1000X SIGMA-1511 1.000 ml Tiamina .HCL 0.4 mg/ml 1.250 ml Sacarosa 30.000 g 2,4-D 0.5 mg/ml 4.000 ml Gelrita @ 3.000 g Nitrato de Plata 2 mg/ml # 0.450 ml Bialofos lmg/ml# 3.000 ml Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado #= Agregar después de la esterilización y enfriamiento a temperatura . Disolver los ingredientes en D-I H20 en secuencia Ajustar a pH 5.8 con KOH Llegar al volumen con D-I H20 Esterilizar y enfriar a temperatura ambiente. Volumen Total (L)= 1.00 560 Y Ingrediente Cantidad Unidad D-I Agua, filtrada 950.000 ml Sales Básales CHU (N6) (SIGMA C-1416) 4.000 Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511 1.000 ml Tiamina .HCL 0.4 mg/ml 1.250 ml Sacarosa 120.000 2, 4-D 0.5 mg/ml 2.000 ml L-Prolina 2.880 g | Gelrita @ 2.000 g Nitrato de Plata 2 mg/ml # 4.250 ml Direcciones : @ = Agregar después de llegar al volumen indicado #= Agregar después de la esterilización y enfriamiento a temperatura . Disolver los ingredientes en D-I H20 en secuencia Ajustar a pH 5.8 con KOH Llegar al volumen con D-I H20 Esterilizar y enfriar a temperatura ambiente. ** Tiempo de autoclave menor debido a que hay un contenido de Sfcarosa incrementado ** Volumen Total (L)= 1.00 Los plásmidos PHP11511 se depositaron con American type Cultere collection, Bethesda, Maryland, y se les da el número de Acceso 209026 y 209025, respectivamente. PHP11361 comprende la secuencia de nucleótidos de secuencia de Pentiná-1 natural. PHP11511 comprende la secuencia de Pentina-1 optimizada. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación indican el nivel de los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan aquí por referencia al mismo grado que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicará específica e individualmente para ser incorporada por referencia . Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplos para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTA DE SECUENCIA (1) INFORMATION GENERAL: (i) SOLICITANTE: CIGAN, AMY L CZAPLA, THOMAS H FALLÍS, LYNN MEYER, TERRY E MUNDELL, SCOTT A SABUS, BRIAN SCHUBERT, KAREL (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS QUE TIENE ACTIVIDADES INSECTICIDAS Y MÉTODO DE USO (iii) NÚMEROS DE SECUENCIA: 11 (iv) DIRIGIR LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: W. MURRAY SPRUILL (ALSTON & BIRD, LLP) (B) CALLE: 3605 GLENWOOD AVE. (C) CIUDAD: RALEIGH (D) ESTADO: NC (E) PAÍS: USA (F) C.P.: 27622 (v) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO: Disco blando (B) COMPUTADORA: PC IBM compatible (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: SPRUILL, W. MURRAY (B) NUMERO DE REGISTRO: 32,943 (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: 5718-9 (ix) INFORMACIÓN DE LA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 919 420 2202 (B) TELEFAX: 919 881 3175 FORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1469 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 31..1257 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO . : 1 : CGGCACGAGC TCGTACAGAT TCTATCCATT ATG AAG TCG AAA ATG GCC ATG CTC 54 Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu 1 5 CTT TTG TTA TTT TGT GTG TTA TCT AAT CAG CTA GTG GCA GCA TTT TCC 102 Leu Leu Leu Phe Cys Val Leu Ser Asn Gln Leu Val Ala Ala Phe Ser 10 15 20 AC CAÁ GCG AAA GCT TCT AAA GAT GGA AAC TTA GTC ACÁ GTT CTT GCC 150 Thr Gln Ala Lys Ala Ser Lys Asp Gly Asn Leu Val Thr Val Leu Ala 25 30 35 40 ATT GAT GGA GGT GGT ATC AGA GGA ATT ATC CCC GGA GTT ATT CTC AAA 198 He Asp Gly Gly Gly He Arg Gly He He Pro Gly Val He Leu Lys 45 50 55 CAÁ CTA GAA GCT ACT CTT CAG AGA TGG GAC TCA AGT GCA AGA CTA GCA 2 6 Gln Leu Glu Ala Thr Leu Gln Arg Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala 60 65 70 GAG TAT TTT GAT GTG GTT GCC GGG ACG AGC ACT GGA GGG ATT ATA ACT 294 Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly Thr Ser Thr Gly Gly He He Thr 75 80 85 GCC ATT CTA ACT GCC CCG GAC CCA CAÁ AAC AAG GAC CGT CCT TTG TAT 342 Ala He Leu Thr Ala Pro Asp Pro Gln Asn Lys Asp Arg Pro Leu Tyr 90 95 100 GCT GCC GAA GAA ATT ATC GAC TTC TAC ATA GAG CAT GGT CCT TCC ATT 390 Ala Ala Glu Glu He He Asp Phe Tyr He Glu His Gly Pro Ser He 105 - " 110 115 120 TTT AAT AAA TCC ACC GCC TGC TCG TTG CCT GGT ATC TTT TGT CCA AAG 438 Phe Asn Lys Ser Thr Ala Cys Ser Leu Pro Gly He Phe Cys Pro Lys 125 130 135 TAT GAT GGG AAG TAT TTA CAÁ GAA ATA ATA AGC CAG AAA TTG AAT GAA 486 Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Gln Glu He He Ser Gln Lys Leu Asn Glu 140 145 150 ACÁ CTA CTA GAC CAG ACÁ ACÁ ACÁ AAT GTT GTT ATC CCT TCC TTC GAC 534 Thr Leu Leu Asp Gln Thr Thr Thr Asn Val Val He Pro Ser Phe Asp 155 160 165 ATC AAG CTT CTT CGT CCA ACC ATA TTC TCA ACT TTC AAG TTA GAG GAA 582 He Lys Leu Leu Arg Pro Thr He Phe Ser Thr Phe Lys Leu Glu Glu 170 175 180 GTT CCT GAG TTA AAT GTC AAA CTC TCC GAT GTA TGC ATG GGA ACT TCA 630 Val Pro Glu Leu Asn Val Lys Leu Ser Asp Val Cys Met Gly Thr Ser 185 190 195 200 GCA GCA CCA ATC GTA TTT CCT CCC TAT TAT TTC AAG CAT GGA GAT ACT 678 Ala Ala Pro He Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys His Gly Asp Thr 205 210 215 GAA TTC AAT CTC GTT GAT GGT GCA ATC ATC GCT GAT ATT CCG GCC CCG 726 Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala He He Ala Asp He Pro Ala Pro 220 225 230 GTT GCT CTC AGC GAG GTG CTC CAG CAÁ GAA AAA TAC AAG AAT AAA GAA 774 Val Ala Leu Ser Glu Val Leu Gln Gln Glu Lys Tyr Lys Asn Lys Glu 235 240 245 ATC CTT TTG CTG TCT ATA GGA ACT GGA GTT GTA AAA CCT GGT GAG GGT 822 He Leu Leu Leu Ser He Gly Thr Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Gly 250 255 260 TAT TCT GCT AAT CGT ACT TGG ACT ATT TTC GAT TGG AGT AGT GAA ACT 870 Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp Thr He Phe Asp Trp Ser Ser Glu Thr 265 270 275 280 TTA ATC GGG CTT ATG GGT CAT GGA ACG AGA GCC ATG TCT GAT TAT TAC 918 Leu He Gly Leu Met Gly His Gly Thr Arg Ala Met Ser Asp Tyr Tyr 285 290 295 GTT GGC TCA CAT TTC AAA GCC CTT CAÁ CCC CAG AAT AAC TAC CTC CGA 966 Val Gly Ser His Phe Lys Ala Leu Gln Pro Gln Asn Asn Tyr Leu Arg 300 305 310 ATT CAG GAA TAC GAT TTA GAT CCG GCA CTG GAA AGC ATT GAT GAT GCT 1014 He Gln Glu Tyr Asp Leu Asp Pro Ala Leu Glu Ser He Asp Asp Ala 315 320 325 TCA ACG GAA AAC ATG GAG AAT CTG GAA AAG GTA GGA CAG AGT TTG TTG 1062 Ser Thr Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys Val Gly Gln Ser Leu Leu 330 335 340 AAC GAA CCA GTT AAA AGG ATG AAT- CTG AAT ACT TTT GTC GTT GAA GAA 1110 Asn Glu Pro Val Lys Arg Met Asn Leu Asn Thr Phe Val Val Glu Glu 345 350 355 360 ACÁ GGT GAA GGT ACC AAT GCA GAA GCT TTA GAC AGG CTG GCT CAG ATT 1158 Thr Gly Glu Gly Thr Asn Ala Glu Ala Leu Asp Arg Leu Ala Gln He 365 370 375 CTT TAT GAA GAA AAG ATT ACT CGT GGT CTC GGA AAG ATA TCT TTG GAA 1206 Leu Tyr Glu Glu Lys He Thr Arg Gly Leu Gly Lys He Ser Leu Glu 38Q 385 390 GTG GAT AAC ATT GAT CCA TAT ACT GAA CGT GTT AGG AAA CTG CTA TTC 1254 Val Asp Asn He Asp Pro Tyr Thr Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe 395 400 405 TGA TACGAATTGA AGTTGTTTCC TCCTTGCCAT ATAGCCTCAC TTTGTTTGGC 1307 AATAAATAAA TAAATAAATG TAATCGTTTG GTTTGATGTC CTTGACTTTG TCATATATGC 1367 TGGCTCTATA AGAAGCACCA GCAGATAAAT AAAGGTTAAT GTTTGAGGTA TWAARWAAAA 1427 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAACTC GA 1469 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 409 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO.:2: Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu Leu Leu Leu Phe Cys Val Leu Ser 1 5 10 15 Asn Gln Leu Val Ala Ala Phe Ser Thr Gln Ala Lys Ala Ser Lys Asp 20 25 30 Gly Asn Leu Val Thr Val Leu Ala He Asp Gly Gly Gly He Arg Gly 35 40 45 He He Pro Gly Val He Leu Lys Gln Leu Glu Ala Thr Leu Gln Arg 50 55 60 Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly 65 70 75 80 Thr Ser Thr Gly Gly He He Thr Ala He Leu Thr Ala Pro Asp Pro 85 90 95 Gln Asn Lys Asp Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Glu Glu He He Asp Phe 100 105 110 Tyr He Glu His Gly Pro Ser He Phe Asn Lys Ser Thr Ala Cys Ser 115 120 125 Leu Pro Gly He Phe Cys Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Gln Glu 130 135 140 He He Ser Gln Lys Leu Asn Glu Thr Leu Leu Asp Gln Thr Thr Thr 145 150 155 160 Asn Val Val He Pro Ser Phe Asp He Lys Leu Leu Arg Pro Thr He 165 170 175 Phe Ser Thr Phe Lys Leu Glu Glu Val Pro Glu Leu Asn Val Lys Leu 180 185 190 Ser Asp Val Cys Met Gly Thr Ser Ala Ala Pro He Val Phe Pro Pro 195 200 205 Tyr Tyr Phe Lys His Gly Asp Thr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala 210 215 220 He He Ala Asp He Pro Ala Pro Val Ala Leu Ser Glu Val Leu Gln 225 230 235 240 Gln Glu Lys Tyr Lys Asn Lys Glu He Leu Leu Leu Ser He Gly Thr 245 250 255 Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Gly Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp Thr 260 265 270 He Phe Asp Trp Ser Ser Glu Thr Leu He Gly Leu Met Gly His Gly 275 280 285 Thr Arg Ala Met Ser Asp Tyr Tyr Val Gly Ser His Phe Lys Ala Leu 290 295 300 Gln Pro Gln Asn Asn Tyr Leu Arg He Gln Glu Tyr Asp Leu Asp Pro 305 310 315 320 Ala Leu Glu Ser He Asp Asp Ala Ser Thr Glu Asn Met Glu Asn Leu 325 330 335 Glu Lys Val Gly Gln Ser Leu Leu Asn Glu Pro Val Lys Arg Met Asn 340 345 350 Leu Asn Thr Phe Val Val Glu Glu Thr Gly Glu Gly Thr Asn Ala Glu 355 360 365 Ala Leu Asp Arg Leu Ala Gln He Leu Tyr Glu Glu Lys He Thr Arg 370 375 380 Gly Leu Gly Lys He Ser Leu Glu Val Asp Asn He Asp Pro Tyr Thr 385 390 395 400 Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe * 405 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1227 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "cDNA of Pentin-1 optimized for enhanced expression" (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..1227 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO.:3: ATG AAG TCC AAG ATG GCC ATG CTC CTC CTC CTC TTC TGC GTG CTC TCC 48 Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu Leu Leu Leu Phe Cys Val Leu Ser 410 415 420 425 AAC CAG CTC GTG GCC GCG TTC TCC ACC CAG GCC AAG GCC TCC AAG GAC 96 Asn Gln Leu Val Ala Ala Phe Ser Thr Gln Ala Lys Ala Ser Lys Asp 430 435 440 GGC AAC CTC GTG ACC GTG CTC GCC ATC GAC GGC GGC GGC ATC CGC GGC 1 4 Gly Asn Leu Val Thr Val Leu Ala He Asp Gly Gly Gly He Arg Gly 445 450 455 ATC ATC CCG GGC GTG ATC CTC AAG CAG CTC GAG GCG ACC CTC CAG AGG 192 He He Pro Gly Val He Leu Lys Gln Leu Glu Ala Thr Leu Gln Arg 460 465 470 TGG GAC TCC AGC GCC AGG CTC GCG GAG TAC TTC GAC GTG GTG GCC GGC 240 Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly 475 480 485 ACC TCC ACC GGC GGC ATC ATC ACC GCC ATC CTC ACC GCC CCG GAC CCG 288 Thr Ser Thr Gly Gly He He Thr Ala He Leu Thr Ala Pro Asp Pro 490 495 500 505 CAG AAC AAG GAC CGC CCG CTC TAC GCC GCC GAG GAG ATC ATC GAC TTC 336 Gln Asn Lys Asp Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Glu Glu He He Asp Phe 510 515 520 TAC ATC GAG CAC GGC CCG TCC ATC TTC AAC AAG TCC ACC GCC TGC TCC 384 Tyr He Glu His Gly Pro Ser He Phe Asn Lys Ser Thr Ala Cys Ser 525 530 535 CTC CCG GGC ATC TTC TGC CCG AAG TAC GAC GGC AAG TAC CTC CAG GAG 432 Leu Pro Gly He Phe Cys Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Gln Glu 540 545 550 ATC ATC TCC CAG AAG CTC AAC GAG ACC CTC CTC GAC CAG ACC ACC ACC 480 He He Ser Gln Lys Leu Asn Glu Thr Leu Leu Asp Gln Thr Thr Thr 555 560 565 AAC GTG GTG ATC CCG TCC TTC GAC ATC AAG CTC CTC CGC CCG ACC ATC 528 Asn Val Val He Pro Ser Phe Asp He Lys Leu Leu Arg Pro Thr He 570 575 580 585 TTC TCC ACC TTC AAG CTC GAG GAG GTG CCG GAG CTC AAC GTG AAG CTC 576 Phe Ser Thr Phe Lys Leu Glu Glu Val Pro Glu Leu Asn Val Lys Leu 590 595 600 TCC GAC GTG TGC ATG GGC ACC TCC GCC GCC CCG ATC GTG TTC CCG CCG 624 Ser Asp Val Cys Met Gly Thr Ser Ala Ala Pro He Val Phe Pro Pro 605 610 615 TAC TAC TTC AAG CAC GGC GAC ACC GAG TTC AAC CTC GTC GAC GGC GCG 672 Tyr Tyr Phe Lys His Gly Asp Thr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala 620 625 630 ATC ATC GCG GAC ATC CCA GCC CCG GTG GCC CTC TCC GAG GTG CTC CAG 720 He He Ala Asp He Pro Ala Pro Val Ala Leu Ser Glu Val Leu Gln 635 640 645 CAG GAG AAG TAC AAG AAC AAG GAG ATC CTC CTC CTG AGC ATC GGC ACC 768 Gln Glu Lys Tyr Lys Asn Lys Glu He Leu Leu Leu Ser He Gly Thr 650 655 660 665 GGC GTG GTG AAG CCG GGC GAG GGC TAC TCC GCC AAC CGC ACC TGG ACC 816 Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Gly Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp Thr 670 675 680 ATC TTC GAC TGG TCC TCC GAG ACC CTC ATC GGC CTC ATG GGG CAC GGC 864 He Phe Asp Trp Ser Ser Glu Thr Leu He Gly Leu Met Gly His Gly 685 690 695 ACC CGC GCC ATG TCC GAC TAC TAC GTG GGC TCC CAC TTC AAG GCC CTC 912 Thr Arg Ala Met Ser Asp Tyr Tyr Val Gly Ser His Phe Lys Ala Leu 700 705 710 CAG CCG CAG AAC AAC TAC CTC CGC ATC CAG GAG TAC GAC CTC GAC CCG 960 Gln Pro Gln Asn Asn Tyr Leu Arg He Gln Glu Tyr Asp Leu Asp Pro 715 720 725 GCC CTC GAG TCC ATC GAC GAC GCC TCC ACC GAG AAC ATG GAG AAC CTC 1008 Ala Leu Glu Ser He Asp Asp Ala Ser Thr Glu Asn Met Glu Asn Leu 730 735 740 745 GAG AAG GTG GGC CAG TCC CTC CTC AAC GAG CCG GTG AAG CGC ATG AAC 1056 Glu Lys Val Gly Gln Ser Leu Leu Asn Glu Pro Val Lys Arg Met Asn 750 755 760 CTC AAC ACG TTC GTC GTG GAG GAG ACC GGC GAG GGG ACC AAC GCC GAG 1104 Leu Asn Thr Phe Val Val Glu Glu Thr Gly Glu Gly Thr Asn Ala Glu 765 770 775 GCG CTC GAC CGC CTC GCC CAG ATC CTC TAC GAG GAG AAG ATC ACC CGC 1152 Ala Leu Asp Arg Leu Ala Gln He Leu Tyr Glu Glu Lys He Thr Arg 780 785 790 GGC CTC GGC AAG ATC TCC CTC GAG GTG GAC AAC ATC GAC CCG TAC ACC 1200 Gly Leu Gly Lys He Ser Leu Glu Val Asp Asn He Asp Pro Tyr Thr 795 800 805 GAG CGC GTG CGC AAG CTC CTC TTC TGA 1227 Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe * 810 815 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 409 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO. Met Lys Ser Lys Met Ala Met Leu Leu Leu Leu Phe Cys Val Leu Ser 1 5 10 15 Asn Gln Leu Val Ala Ala Phe Ser Thr Gln Ala Lys Ala Ser Lys Asp 20 25 30 Gly Asn Leu Val Thr Val Leu Ala He Asp Gly Gly Gly He Arg Gly 40 45 He He Pro Gly Val He Leu Lys Gln Leu Glu Ala Thr Leu Gln Arg 50 55 60 Trp Asp Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Tyr Phe Asp Val Val Ala Gly 65 70 75 80 Thr Ser Thr Gly Gly He He Thr Ala He Leu Thr Ala Pro Asp Pro 85 90 95 Gln Asn Lys Asp Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Glu Glu He He Asp Phe 100 105 110 Tyr He Glu His Gly Pro Ser He Phe Asn Lys Ser Thr Ala Cys Ser 115 120 125 Leu Pro Gly He Phe Cys Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Gln Glu 130 135 140 He He Ser Gln Lys Leu Asn Glu Thr Leu Leu Asp Gln Thr Thr Thr 145 150 155 160 Asn Val Val He Pro Ser Phe Asp He Lys Leu Leu Arg Pro Thr He 165 170 175 Phe Ser Thr Phe Lys Leu Glu Glu Val Pro Glu Leu Asn Val Lys Leu 180 185 190 Ser Asp Val Cys Met Gly Thr Ser Ala Ala Pro He Val Phe Pro Pro 195 200 205 Tyr Tyr Phe Lys His Gly Asp Thr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala 210 215 220 He He Ala Asp He Pro Ala Pro Val Ala Leu Ser Glu Val Leu Gln 225 230 235 240 Gln Glu Lys Tyr Lys Asn Lys Glu He Leu Leu Leu Ser He Gly Thr 245 250 255 Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Gly Tyr Ser Ala Asn Arg Thr Trp Thr 260 265 270 He Phe Asp Trp Ser Ser Glu Thr Leu He Gly Leu Met Gly His Gly 275 280 285 Thr Arg Ala Met Ser Asp Tyr Tyr Val Gly Ser His Phe Lys Ala Leu 290 295 300 Gln Pro Gln Asn Asn Tyr Leu Arg He Gln Glu Tyr Asp Leu Asp Pro 305 310 315 320 Ala Leu Glu Ser He Asp Asp Ala Ser Thr Glu Asn Met Glu Asn Leu 325 330 335 Glu Lys Val Gly Gln Ser Leu Leu Asn Glu Pro Val Lys Arg Met Asn 340 345 350 Leu Asn Thr Phe Val Val Glu Glu Thr Gly Glu Gly Thr Asn Ala Glu 355 360 365 Ala Leu Asp Arg Leu Ala Gln He Leu Tyr Glu Glu Lys He Thr Arg 370 375 380 Gly Leu Gly Lys He Ser Leu Glu Val Asp Asn He Asp Pro Tyr Thr 385 390 395 400 Glu Arg Val Arg Lys Leu Leu Phe * 405 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO . : 5 Met Ser Thr Ser Ala Ala Pro He Val Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO . : 6 : Ala Leu Gln Pro Gln Asn Asn Tyr Leu Arg Gln Glu Tyr Asp Leu Asp 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO . : 7 Pro Asp Trp Val Val He Arg Ser Gln Ser Val Gly Lys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO . : 8 : Lys Ala Phe Val Asn Gly Val Tyr Phe He Asn Thr Tyr Asp Ser Ala 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) STPANDEDNESS: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO.:9: Asn Asn Tyr Leu Arg He Gln Glu Tyr Asp Leu Pro Pro Ala Leu 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO.:10; Val Val Lys Arg Leu Ala Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pentaclethra macroloba (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO.:ll Glu Asn Met Glu Asn Leu Glu Lys 1 5

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES 1. Una proteína sustancialmente purificada aislada del género Pentaclethra, caracterizadA porque tiene propiedades insecticidas.
2. 2. Un polipéptido sustancialmente purificado caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. : 2; b) residuos 22-409 de la secuencia establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2; c) residuos 29-409 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2; y d) un fragmento pesticídicamente activo de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT.

   NO. : 2.
3. 3. Un polipéptido que tiene actividad insecticida contra el gusano de raíz de maíz en donde el polipéptido comprende una variación de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo caracterizada porque consiste de: a) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. : 2; b) residuos 22-409 de la secuencia establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2; y

   c) residuos 29-409 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT.NO.:2, en donde la variación comprende por lo menos una sustitución, truncación, supresión o inserción interna de aminoácidos .
4. 4. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Figura 1 y las SEC. DE IDENT. NOS: 1 y 2.
5. 5. Una proteína sustancialmente modificada que tiene actividad insecticida, caracterizada porque la proteína comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la figura 1 y las SEC. DE IDENT. NOS: 1 y 2.
6. 6. Una secuencia de ADN que codifica la proteína de conformidad con la reivindicación 5.
7. 7. Un vector caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 6.
8. 8. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad insecticida para gusano de raíz de maíz, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO . : 2;

   b) los residuos 22-409 de la secuencia establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2; c) los residuos 22-409 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO . : 2 ; d) un polipéptido que comprende una variación de

   (a) , (b) o (c) , en donde la variación comprende por lo menos una sustitución, truncación, supresión o inserción interna de aminoácidos .
9. 9. Una molécula de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad insecticida, la molécula teniendo una secuencia seleccionada del grupo que consiste de : (a) la secuencia establecida en la Figura 1 y la SEC. DE IDENT. NO: 1; (b) secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad insecticida y que se hibridiza para las secuencias de (a) anterior bajo condiciones estrictas definidas por una restricción de lavado de 0.3 M de NaCl, 0.03 M de citrato de sodio, 0.1% SDS a 70°C; (c) secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad insecticida y que difieren de las secuencias de (a) y (b) debido a la degeneración del código genético.
10. 10. Un organismo caracterizado porque se ha transformado con el vector de conformidad con la reivindicación 7.
11. 11. Una secuencia de nucleótidos aislada caracterizada porque codifica la proteína establecida en la

    Figura 1.
12. 12. La secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es la secuencia establecida en la Figura y la SEC. DE IDENT. NO:l.
13. 13. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia es una secuencia sintética. 1 .
14. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia se ha optimizado para la expresión en maíz.
15. 15. Una planta que se ha transformado establemente con un cásete de expresión que caracterizada porque comprende un promotor que impulsa la expresión en una célula de planta ligado operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. :2;

    b) residuos 22-409 de la secuencia establecida en la SEC. DE IDENT. NO. :2 c) residuos 29-409. de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2; d) un polipéptido que comprende una variación de

    (a) , (b) o (c) en donde la variación comprende por lo menos una sustitución, truncación, supresión o inserción interna de aminoácidos .
16. 16. La planta de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es maíz.
17. 17. La semilla de la planta de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16.
18. 18. La planta de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la Figura 1 y las SEC. DE IDENT. NOS: 1 y 2.
19. 19. La planta de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porgue la secuencia de nucleótidos es la secuencia establecida en la Figura 1 y la SEC. DE IDENT. NO.: 1.
20. 20. La planta de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos se liga operablemente a un promotor preferencial de raices.
21. 21. La planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos se liga operablemente a un promotor preferencial de raíz.
22. 22. La planta de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos se liga operablemente a un promotor preferencial de raíz.
23. 23. Un método para controlar el gusano de raíz de maíz, el método está caracterizado porque comprende: transformar una célula de plantas con un cásete de expresión que comprende un promotor que impulsa una expresión en una célula de plantas ligado operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste de : a) la secuencia de aminoácido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: '2; b) los residuos 22-409 de la secuencia establecida en la SEC. DE IDENT. NO . : 2 ; c) los residuos 29-409 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO.:2; d) un polipéptido que comprende una variación de

    (a), (b) o (c) en donde la variación comprende por lo menos una sustitución, truncasión, supresión o inserción interna de aminoácidos .
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el promotor es un promotor preferencial de raíces.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde la secuencia de nucleótidos tiene una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia establecida en la Figura 1 y 1 SEC. DE IDENT. N0:1; (b) las secuencias de nucleótidos gue codifican un polipéptido que tiene actividad insecticida y que se hibridiza en las secuencias de (a) anterior bajo condiciones estrictas que comprenden; y, (c) secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene actividad insecticida y que difieren de las secuencias de (a) y (b) debido a la degradación del código genético.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación

    25, caracterizado porque la célula de planta es de forma monocotiledónea .
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación

    26, caracterizado porque la monootiledonea es maíz.
28. 28. Una célula de planta que se ha transformado establemente con un cásete de expresión que comprende un promotor que impulsa la expresión en una célula de plantas ligada operablemente a una secuencia de nucleótidos que

    codifica una proteína insecticida en donde la proteína tiene la actividad de gusano de raíz de maíz y se selecciona del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácido establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2; b) los residuos 22-409 de la secuencia establecida en la SEC. DE IDENT.NO.:2; c) los residuos 29-409 de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 2; d) un polipéptido que comprende una variación de

    (a) , (b) o (c) en donde la variación comprende por lo menos una sustitución, truncasión, supresión o inserción interna de aminoácidos .
29. 29. La célula de plantas de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el promotor es un promotor preferencial para raíces.
30. 30. La célula de plantas de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos tiene una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia establecida en la Figura 1 y SEC. DE IDENT. NO. : 1; (b) las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad insecticida y que hibridiza las secuencias de (a) anterior bajo condiciones estrictas

    definidas por una restricción de lavado de 0.3 M de NaCl, 0.03 M de citrato de sodio, 0.01% de SDS a 70°C; y (c) secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad insecticida y que difieren de las secuencias de (a) y (b) debido a la degeneración del código genético.
31. 31. La célula de plantas de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la célula de plantas es de forma monocotiledónea .
32. 32. La planta de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la monocotiledónea es maíz.