MXPA99009970A - Reducción microbiana estereoselectiva de una tetralona racémica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a procedimientos para llevar a cabo la siguiente reducción microbiana esteroselectiva de una tetralona racémica, que comprende:poner en contacto un compuesto de fórmula (1) con un microorganismo, o un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo la presente reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir el (4R) tetralol de fórmula (II) y dejar sustancialmente sin reaccionar la (4S) tetralona de fórmula (V) o"tetralona quiral". La tetralona quiral se puede usar en la síntesis de sertralina. El presente procedimiento comprende además opcionalmente la separación de la (4S) tetralona de fórmula (V) del (4R) tetralol de fórmula (II). El (4R) tetralol se puede reciclar para producir el compuesto de fórmula (I) y el presente procedimiento se repite para producir más (4S) tetralona deseada de fórmula (V).

Description

REDUCCIÓN MICROBIANA ESTEREOSELECTIVA DE UNA TETRALONA RACEMICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos procedimientos para preparar el enantiómero (4S) de 4-(3,4-diclorofenil)-3,4-dihidro-1 (2H)-naftalenona (en los sucesivo denominada "tetralona quiral" o "tetralona (4S)") y, más especialmente, se refiere a la reducción microbiana estereoselectiva de 4-(3,4-diclorofenil)-3,4-dihidro-1(2H)-naftalenona racémica (en lo sucesivo denominada también "tetralona racémica") a la tetralona quiral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tetralona quiral preparada por los procedimientos de la presente invención se puede hacer reaccionar además para preparar cis-(1S) (4S)-N-metil-4-(3,4-diclorofenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-1 -naftalenamina pura, denominada normalmente sertralina. La sertralina es bien conocida por su utilidad, por ejemplo, como agente antidepresivo y anoréctico y en el tratamiento de dependencias químicas, trastornos relacionados con la ansiedad, eyaculación precoz, cáncer y después de un infarto miocardio. Para la preparación de sertralina se conocen procedimientos en la técnica, como por ejemplo, los descritos en las patentes de los Estados Unidos números 4.536.518, 4.777.288, 4.839.104, 4.855.500, 4.940.731 , 4.962.128, 5.082.970, 5.130.338, 5.196.607, 5.248.699, 5.442.116, .463.126, 5.466.880, 5.597.826 y 5.750.794 y, en el artículo de W:M: Welch, Jr. y otro., que se publicó en el Journal of Medicinal Chemistry, vol 27, n° 1 1 , pág. 1508 (1984). Algunas de la patentes anteriormente citadas se refieren a la síntesis de mezclas de isómeros cis y trans de N-metil-4-(3,4-diclorofenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-1 -naftalenamina racémica. Como se describe en las mismas, los isómeros cis y trans, así como los enantiómeros (S) y (R), se pueden separar por procedimientos conocidos por los especialistas en la materia que incluyen, por ejemplo, cristalización fraccionada y cromatografía. También es conocido seleccionar la quiralidad finalmente deseada previamente en la síntesis de sertralina. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 5.750.794 anteriormente citada describe un procedimiento para preparar tetralona quiral haciendo reaccionar la tetralona racémica con un agente de reducción a base de una cetona asimétrica para proporcionar los alcoholes cis y trans correspondientes, dependiendo de la quiralidad del reaccionante asimétrico empleado y, seguidamente, separar los alcoholes y oxidar los alcoholes (1 S, 4S) y/o (1 r, 4S) a la (4S)-tetralona. También es conocido en la técnica que se puedan sintetizar compuestos quirales usando microorganismos, tales como hongos, por ejemplo, levaduras. Por ejemplo, es bien conocido el uso de levaduras para reducir cetonas a alcoholes quirales. Sin embargo, como es conocido por los especialistas en la materia, los rendimientos químicos y ópticos, por ejemplo de los enantiómeros particulares y sus cantidades, de tales reducciones microbianas, varían por lo general de forma substancial dependiendo de, por ejemplo, el microorganismo particular elegido, así como de los substituyentes del material de partida. La patente de los Estados Unidos n° 5.049.497 describe un procedimiento para resolver un derivado racémico de biciclo [4.2.0] octano poniendo en contacto el derivado con levadura de panadería bajo condiciones suficientes para dar una mezcla de una cetona y un alcohol de elevada pureza enatíomérica. Como se describe en dicho documento, solo se reduce un enantiómero de la cetona racémica objeto para dar un alcohol. La patente de los Estados unidos 5.58.764 describe un procedimiento de reducción asimétrica que usa un microorganismo intacto, o una preparación de células usadas del mismo, para convertir una cetona cíclica en el alcohol quiral correspondiente. La patente de los Estados Unidos n° 5.618.707 describe un procedimiento para la reducción estereoselectiva de substratos cetónicos añadiendo los substratos a un medio de cultivo de Zygosaccharomyces bailii ATCC (American Type Culture Collection) n° 38924 o Schizosaccharomyces octosporus ATCC n° 2479, incubando la mezcla resultante y aislando el compuesto hidroxilado por medios convencionales como, por ejemplo, extracción con disolventes orgánicos, adsorción sobre resinas, o cromatografía para usar posteriormente como intermedio en la preparación de un agente que disminuye el colesterol sérico. El compuesto hidroxilado aislado descrito en dicho documento se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) quiral, HPLC de fase inversa o ambas. Consistente con lo que apreciaría un experto en la materia correspondiente, como se describe en el mismo, muchos del gran número de microorganismos que se investigaron para determinar su capacidad para reducir el grupo cetona del substrato seleccionado no consiguieron reducir el grupo cetona con la especificidad o productividad deseadas. Se ha descubierto ahora de forma inesperada que una serie de microorganismos, incluyendo hongos, por ejemplo levaduras y actinomicetos, reduce de forma substancialmente estereoselectiva una tetralona racémica. Más especialmente, la presente reducción microbiana estereoselectiva objeto reduce de forma selectiva la (4R) tetralona de la mezcla racémica dejando la (4S) tetralona substancialmente sin reaccionar. Por otro lado, el (4R) tetralol no deseado producido por el presente procedimiento se puede oxidar y convertir en la tetralona racémica y repetirse el presente procedimiento para proporcionar incluso más (4S) tetralona. La (4S) tetralona producida por el presente procedimiento se puede usar en la síntesis de sertralina. Todos ios documentos citados en ia presente, incluyendo los anteriores, se incorporan en la presente como referencias en su totalidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la reducción microbiológica de grupos carbonilo que comprende, poner en contacto un compuesto cetónico, la tetralona recémica de fórmula (I), con un microorganismo, o un sistema de reducción enzimática, capaz de llevar a cabo la presente reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones adecuadas de modo que se puede formar y acumular en el medio un compuesto que tiene un grupo hidroxi, específicamente, el (4R) tetralol de fórmula (II) y, un compuesto que tiene la estereoquímica deseada, la (4S) tetralona de fórmula (V) siguiente, permanece substancialmente sin reaccionar. La (4S) tetralona de fórmula (V) siguiente, es decir, la tetralona quiral, se puede aislar entonces por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, cromatografía o cristalización. Además, el (4R) tetralol de fórmula (II) se puede separar de los compuestos de fórmulas (lll) a (V), oxidar y formar la tetralona racémica y repetirse la reducción microbiana estereoselectiva presente para producir incluso más cetona quiral deseada. Por consiguiente, la presente ¡nvención proporciona procedimientos para llevar a cabo la siguiente reducción microbiana estereoespecífica: que comprende: poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo la presente reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir más compuesto de fórmula (II) que compuesto de fórmula (lll), quedando así más compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que compuesto de fórmula (IV) sin reaccionar. La presente reducción estereoespecífica también puede representarse por: (0 (II) (V) que comprende: poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo la presente reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir el (4R) tetralol de fórmula (II) y dejar substancialmente sin reaccionar la (4S) tetralona de fórmula (IV). La reducción estereoselectiva comprende además, de forma opcional, la separación de la (4S) tetralona de fórmula (V) del (4R) tetralol de fórmula (II). El (4R) tetralol se puede oxidar entonces para producir la (4R) tetralona, que se hace reaccionar seguidamente, por ejemplo, con un base, para producir la tetralona racémica de fórmoula (I) y la presente reducción microbiana estereoselectiva se puede repetir para producir incluso más (4S) tetralona deseada de fórmula (V), es decir, el enantiómero (4S) de la tetralona racémica de fórmula (I). La presente invención proporciona procedimientos que comprenden la reducción microbiana estereoselectiva de un compuesto de fórmula (I) a un compuesto de fórmula (II): poniendo en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo la presente reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir un compuesto de fórmula (II), con lo cual queda sin reaccionar substancialmente más compuesto de fórmula (V) que compuesto de fórmula (IV) y se produce substanciaimente más compuesto de fórmula (II) que compuesto de fórmula (lll). En una realización preferida, la puesta en contacto del compuesto de fórmula (I) se realiza con un sistema de reducción enzimática. En otra realización preferida, la puesta en contacto del compuesto de fórmula (I) se realiza con un sistema de reducción enzimática en el que la enzima está inmovilizada. En una realización particularmente preferida, la puesta en contacto del compuesto de fórmula (I) se realiza con un sistema de reducción enzimática derivado de Hansenula polymorpha ATCC n° 26012. En otra realización preferida, el microorganismo es una preparación de células usadas del mismo. Todavía en otra realización preferida, el microorganismo es una preparación enzimática en polvo en acetona del mismo. En una realización especialmente preferida de la presente invención se usa microorganismo intacto. En una realización preferida en la que el microorganismo es un microorganismo intacto, el compuesto de fórmula (I) se pone en contacto con un medio de fermentación, caldo de cultivo o disolvente, que comprende el microorganismo. En otra realización preferida en la que el microorganismo es un microorganismo intacto, el compuesto de fórmula (I) se pone en contacto con un microorganismo intacto lavado. En otra realización preferida en la que el microorganismo está intacto, el compuesto de fórmula (I) se pone en contacto con un microorganismo intacto inmovilizado.

En una realización especialmente preferida de la presente invención, el microorganismo es un microorganismo intacto que se desarrolla en un medio de fermentación y el contacto se produce mediante la adición del compuesto de fórmula (I) al mismo. En otra realización especialmente preferida de la presente invención, el microorganismo es un microorganismo intacto que se desarrolla en un medio de crecimiento durante aproximadamente cuarenta y ocho horas, y el contacto se produce en dicho medio de crecimiento mediante la adición del compuesto de formula (I) al mismo y la incubación dura aproximadamente cinco días. En otra realización preferida de la presente invención, el microorganismo en un hongo, por ejemplo, una levadura, un actinomiceto, o uno de sus mutantes que puede llevar a cabo la reducción estereoselectiva. En otra realización preferida de la presente invención, el microorganismo es un hongo. En otra realización todavía más preferida en la que el microorganismo es un hongo, el hongo es Absidia coerulea ATCC n° 20137. En una realización particularmente preferida de la presente invención, el microorganismo es una levadura. En una realización especialmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo es una levadura, la levadura es Hansenula polymorpha ATCC n° 26012, también depositada como ATCC n° 74449.

Cuando se emplea como microorganismo Hansenula polymorpha ATCC n° 26012, también depositada como ATCC n° 74449, la presente reducción microbiana estereoselectiva reduce apreciablemente solo un enantiómero del compuesto de fórmula (I), dando el alcohol correspondiente, es decir, el compuesto de fórmula (II), mientras que el otro enantiómero del compuesto de fórmula (I), es decir, el compuesto de fórmula (V) queda substancialmente sin reaccionar. Como se ha descrito antes, los procedimientos de la presente invención incluyen además opcionalmente la separación, por ejemplo llevada a cabo usando cristalización o cromatografía, del compuesto de fórmula (V) de los compuestos de fórmula (II) a (IV) y el uso de dicho compuesto separado de fórmula (V) en la síntesis de sertralina usando cualquiera de los procedimientos conocidos para ello. Como también se ha descrito antes, se prefiere oxidar el (4R) tetralol aislado de fórmula (II) a la (4R) tetralona de fórmula (IV). Seguidamente, se prefiere además formar el racémico, preferiblemente haciendo reaccionar la (4R) tetralona con una base, transformando la (4R) tetralona de fórmula (IV) en la tetralona racémica de fórmula (I). La oxidación y formación del racémico recicla el (4R) tetralol no deseado a otro ciclo de reducción microbiana estereoselectiva conforme a los procedimientos de la presente invención. El reciclado del (4S) tetralona deseada y disminuye la cantidad de (4R) tetralol no deseado desechado. La oxidación y formación del racémico del producto oxidado se puede llevar a cabo usando cualquiera de los procedimientos conocidos para ello.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los expertos en la técnica comprenderán perfectamente los términos usados en la presente para describir la presente invención; no obstante, en la presente se usan los siguientes términos tal y como a continuación se describen. "Cofactor" significa cualquier cofactor adecuado que comprende el sistema de reducción enzimática como, por ejemplo, NADH, NADPH, FADH, FMNH y/o PQQ o cualquiera de los cofactores que se presenten con la enzima en el microorganismo. "Sistema de reducción enzimática" significa cualquier enzima oxido-reductasa microbiana adecuada y la forma reducida de un cofactor para la enzima oxido-reductasa, pudiendo derivarse el cofactor del microorganismo seleccionado o puediendo derivarse de cualquier fuente adecuada. La enzima que comprende el sistema de reducción enzimática puede estar en forma libre o inmovilizada, por ejemplo, en una columna o unida a esferas. "Reducción microbiana" significa la reducción estereoselectiva de la presente invención, tal y como se lleva a cabo por le sistema de reducción enzimática, comprendiendo el sistema de reducción enzimática el microorganismo intacto o cualquiera de sus preparaciones y similares.

"Microorganismo" incluye cualquier microorganismo intacto o sus preparaciones, incluyendo por ejemplo, una preparación de células usadas del microorganismo; una preparación deshidratada del microorganismo, por ejemplo, una preparación enzimática en polvo en acetona; microorganismo lavado evento de, por ejemplo, medio de fermentación, medio de cultivo y similares; microorganismo inmovilizado, por ejemplo, en una columna, unido a esferas y similares. Los procedimientos proporcionados por la presente invención comprenden la reducción microbiana estereoselectiva de un compuesto de fórmula (I) a un compuesto de fórmula (II): poniendo en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo la presente reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir un compuesto de fórmula (II), mediante lo cual, queda sin reaccionar más compuesto de fórmula (V) que compuesto de fórmula (IV) y se produce substacialmente más compuesto de fórmula (II) que compuesto de fórmula (lll). Como se comprenderá por los expertos en la materia, el compuesto de fórmula (I), la tetralona racémica, es una mezcla de la (4S) tetralona y (4R) tetralona como se muestra a continuación: (trans) (1 S. 4R) (cis) (1 R, 4R).

Los compuestos, o más especialmente, los tetraloles de fórmula (II) son: (trans) (1 S.4R) (cis) (1 R, 4R) Los compuestos, o más especialmente, los tetraloles de fórmula (lll) son: Los compuestos de fórmula (II) y (lll) se describen y reivindican en la patente de los Estados Unidos n° 5.750.794 anteriormente citada. El compuesto deseado de fórmula (V) se puede aislar como se describe a continuación a partir de los compuestos no deseados de fórmula (II) y cualquiera de los compuestos de fórmula (II) ó (IV) que se pudiera haber producido o quedara sin reaccionar, respectivamente, dependiendo de, por ejemplo, el microorganismo seleccionado y las condiciones de incubación. Los compuestos de fórmula (II) se pueden convertir en un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, oxidando o formando el racémico, y llevado a cabo la presente reducción microbiana estereoselectiva para producir cantidades adicionales de la (4S) tetralona de fórmula (V). El procedimiento de la presente invención se lleva a cabo fácilmente. Así, el microorganismo se fermenta (microorganismo intanco) o se incuba (preparación de células usadas, preparación deshidratada o cualquier otra preparación adecuada del microorganismo) en presencia de la tetralona racémica, representada por la fórmula (I), para modificar la tetralona racémica y, más especialmente, para reducir el enantiómero (4R) indeseado de la cetona racémica a su alcohol correspondiente, representado por la fórmula (II), quedando el enantiómero (4S) deseado, representado por la fórmula (V), substancialmente sin reaccionar, de este modo en una etapa, dando lugar al enatiómero (4S) ópticamente enriquecido. El enatiómero (4S) se puede hacer reaccionar además por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica correspondiente como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 4.536.518, 4.777.288, 4.839.104, 4.855.500, 4.940.731 , 4.962.128, 5.082.970, 5.130.338, 5.196.607, 5.248.699, 5.442.116, 5.463.126, 5.466.880, 5.597.826, y 5.750.794 y, en el citado artículo de W.M. Welch, Jr. y otros, para finalmente producir sertralina. La actividad, procedimientos para ensayar las actividades, dosificaciones, formas de dosificación, procedimientos de administración e información anterior relativa a la sertralina se describen por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 4.536.517, 4.777.288 y 4.839.104 anteriormente citadas y en ei artículo de W.M. Welch, Jr. y otros, anteriormente citado. Se puede usar cualquier microorganismo adecuado en el procedimiento de la presente ¡nvención. Como se ha descrito antes, el microorganismo usado en el presente procedimiento puede estar intacto, o en forma de cualquiera de sus preparaciones, por ejemplo, una preparación de células usadas del mismo, una preparación deshidratada del mismo y estar libre o inmovilizado. Sin embargo, cuando se emplea un microorganismo no intacto en la presente ¡nvención como, por ejemplo, una preparación de células usadas, por ejemplo un extracto celular, preparación enzimática en polvo en acetona o en enzima derivada del mismo, los expertos en la técnica comprenderán que también se incluirá un cofactor para la enzima. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción expuesta en la presente y de sus conocimientos relacionados como preparar una preparación de células usadas como se describe, por ejemplo, por R.N. Patel y otros en el artículo "Oxidation of Secondary Alcohols to Methyl Ketones by Yeast" publicado en Apllied and Enviromental Microbiology, 38 (2): 219-223 (197). Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción expuesta en la presente y sus conocimientos relacionados como preparar una preparación enzimática en polvo en acetona como se describe, por ejemplo, por K. Nakamura y otros en el artículo "Asymmetric Reduction of Ketones by the Acetone Powder of Geotrichum candidum" publicado en 'Tetrahedron Letters, 37 (10): 1629-1632 (1996). Además, en los presente procedimientos también se puede usar una enzima (por ejemplo una óxido-reductasa) de cualquier microorganismo adecuado, y esta enzima se puede aislar del microorganismo por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la técnica y, como en el caso del microorganismo intacto, se puede usar en el presente procedimiento en forma libre o inmovilizada. Los expertos en la técnica comprenderán a partir de la descripción expuesta en la presente y de sus conocimientos relacionados como aislar y purificar la enzima del microorganismo adecuado como se describe de forma general, por ejemplo, en los artículos de: M. Wada y otros "Purification and Characterization of NADPH-Dependent Carbonyl Reducíase, Involved in Stereoselective Reduction of Etyl 4-Chloro-3-oxobutanoate, from Candida magnoliae" publicado en Biosci. Biotechnol.

Biochem, 62 (2): 280-285 (1998), P. Trots y otros, "Purification and Properties of NAP (P)H: (quinone-acceptor) oxidoreductase of sugarbeet cells" publicado en Eur. J. Biochem, 234:452-458 (1995), K. M. Madyastha and T. L. Gururaja, "Purification and Some of the Properties of a Novel Secondary Alcohol Dehydrogenase from Alcaligenes eutrophus", publicado en Biochemical and Biophysical Research Communications, 211 (2): 540-546 (1995), O. Bortolini y otros, "Kinetic resolution of vicdiols by Bacillus stearothermophilus diacetyl reducíase" publicado en Tetrahedron: Asymmetry, 9: 647-651 (1998), R. N. Patel y otros, "Stereospecific microbial reducíion of 4,5-dihidro-4-(4-methoxyphenyl)-6-(trifluormethyl-1 H-1 )-benzazepin-2-one" publicado en Enzyme Microb. Technol., 3:906-912 (1991 ) y R.N. Patel y otros, "Stereoselecíive microbial/enzymaíic oxidaíion of (exo, exo)-7-oxabicyclo[2.2.2]hepíane-2,3-dimeíhanol to the corresponding chiral lacíol and lacfone" publicado en Enzyme Microb. Technol., 14:778-784 (1992); y por las patentes de los Estados Unidos números 5.523.223 y la anteriormente citada 5.580.764. Microorganismos adecuados incluyen Hansenula polymorpha ATCC n° 26012, Hansenula polymorpha ATCC n° 74449, Absidia coerulea ATCC n° 20137, Geotrichum candidum ATCC n° 34614, Geotrichum candidum ATCC n° 62401 , Mortierella isabelina ATCC n° 42613, Mortierella isabellina ATCC n° 38063, Mortierella vinacea ATCC n° 09515, Pencillium notatum ATCC n° 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC n° 28575, Monosporium olivacerum v. major ATCC n° 36300, Aureobasidium pullulans ATCC n° 16623, Debaryomyces polymorphus ATCC n° 20280, Saccharomyces cerevisiae ATCC n° 15248, Candida schatavii ATCC n° 24409, Pichia fabianii ATCC 16755 y Streptomyces rímosus ss. rímosus ATCC n° 10970; y sus mutantes que son conocidos o pueden obtenerse de cualquier otra forma por los expertos en la técnica correspondiente y pueden, a pesar de dicha mutación, llevar a cabo la reducción microbiana estereoselectiva descrita en la presente. Los microorganismos intactos preferidos serán los que reducen substancialmente la (4R) tetralona dejando la (4S) tetralona dejando la (4S) tetralona substancialmente sin reaccionar, incluyendo la reacción la reducción o cualquier otra actividad intrínseca que pueda degradar o causar impacto negativo sobre la (4S) tetralona deseada en cualquier etapa del presente procedimiento. Como se apreciará por los expertos en la técnica de la presente descripción, dicha reacción indeseada de la (4S) tetralona puede evitarse substancialmente, por ejemplo, usando la enzima derivada del microorganismo seleccionado frente al microorganismo intacto. Los microorganismos adecuados para usar en la presente reducción microbiana estereoespecífica se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica correspondiente. A continuación se proporciona un ejemplo de un procedimiento adecuado para la preparación de un microorganismo a partir de una solución madre adquirida comercialmente. El procedimiento expuesto a continuación se puede usar para cualquier microorganismo adecuado para usar en el presente procedimiento y, los expertos en la técnica entenderán la descripción expuesta en la presente para modificar cualquier parte del procedimiento, por ejemplo, un procedimiento para preparar el microorganismo, intacto o preparación, por ejemplo de células usadas o deshidratado, libre o inmovilizado; un procedimiento para preparar una enzima adecuada derivada de dichos microorganismos; un procedimiento para poner en contacto la tetralona racémica con el microorganismo o la enzima que comprende el sistema de reducción enzimática derivado de la misma; los componentes del medio de crecimiento y las condiciones, por ejemplo, temperatura, pH y similares; o las condiciones de incubación; para conseguir el resultado deseado en cualquier procedimiento particular. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción expuesta en la presente y de sus conocimientos relacionados cómo preparar los microorganismos intactos inmovilizados como se describen, por ejemplo, por A. Bauer y otros, en el artículo "Polyvinyl alcohol-inmobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitriles" publicado en Biotechnology Letters, 18 (3): 343-348 (marzo de 1996). En la presente invención se puede usar cualquiera procedimiento adecuado para poner en contacto el compuesto de fórmula (I) con el microorganismo o sistema de reducción enzimática. El compuesto de fórmula (I) se puede poner en contacto con el microorganismo o sistema de reducción enzimática en cualquier orden adecuado. Por ejemplo, el compuesto de fórmula (I) se puede añadir a un medio, como un medio de cultivo, que comprende el microorganismo, libre o inmovilizado, o a cualquiera de sus combinaciones; o el medio puede comprender el compuesto de fórmula (I) y el microorganismo se puede añadir entonces a dicho medio; o el compuesto de fórmula (I) y el microorganismo se pueden añadir juntos a dicho medio; o el compuesto de fórmula (I) se puede añadir a una preparación de células usadas del mismo; o el compuesto de fórmula (I) se puede añadir a una preparación deshidratada del microorganismo; o el compuesto de fórmula (I) o el microorganismo o el sistema de reducción enzimática se pueden añadir a un disolvente adecuado que comprenda el otro; y similares. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción expuesta en la presente cómodo modificar cualquiera de las partes dei presente procedimiento según su deseo. Se prefieren especialmente en la presente invención que el microorganismo, o el sistema de reducción enzimática, derive de Hansenula polymorpha ATCC n° 26012. Una muestra liofilizada de Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 (originalmente aportada por D. W. Levine) se depositó en la ATCC, situada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, Estados Unidos de América, bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 26 de junio de 1998. A este cultivo recién depositado se le asignó el número de depósito ATCC n° 74449. Por tanto, también se prefiere especialmente en la presente invención que el microorganismo sea Hansenula polymorpha ATCC n° 74449. Todas las limitaciones sobre la disponibilidad al público del cultivo de microorganismos así depositados se retirarán de forma irrevocable tras la concesión de una patente a partir de la memoria descriptiva de la presente ¡nvención. Los cultivos de Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 se pueden obtener de la ATCC y a continuación se proporciona un ejemplo de un procedimiento adecuado para su preparación a partir de dicha solución madre adquirida de forma comercial. Se añade un cultivo así obtenido a un medio de crecimiento adecuado y se incuba con agitación hasta que se produce el crecimiento, siendo ambas etapas como se considere por los expertos en ia técnica. El cultivo así preparado, se puede usar para inocular cultivos inclinados, con porciones de estos cultivos inclinados congeladas como soluciones madre. Como alternativa, los cultivos de la solución madre líquidos se pueden preparar añadiendo aproximadamente 10% a aproximadamente 20% de glicerol, congelado seguidamente a aproximadamente -80°C, preferiblemente en pequeños tubos criogénicos.

Como se apreciará por los expertos en la técnica para cualquier microorganismo seleccionado y como se expone de forma específica en la presente más adelante en los ejemplos para Absidia coerulea ATCC n° 20137 y la especialmente preferida Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 o ATCC n° 74449, un procedimiento adecuado para preparar el microorganismo es el siguiente: se inocula el microorganismo a partir de un cultivo de la solución madre congelado tal y como se describe antes (aproximadamente una solución madre al 17% en glicerol) en matraces o en un tubo de vidrio con un cierre metálico que contiene un medio de crecimiento (que contiene una alícuota de una solución estéril que incluye Tween® 80, glicerol y agua destilada) cuya composición se describe con más detalle más adelante. La fermentación se lleva a cabo a temperaturas que varían de aproximadamente 22°C a aproximadamente 32°C y, preferiblemente a aproximadamente 29°C, con una agitación adecuada, preferiblemente de aproximadamente 200 rpm a aproximadamente 220 rpm, y, lo más preferible, a aproximadamente 210 rpm. Cuando así se desee, se puede mantener el pH del medio de crecimiento usando tampones adecuados incorporados en ei medio de fermentación y/o ajustar de forma periódica mediante la adición de base o ácido, según se necesiten. En la presente ¡nvención se puede usar cualquier tiempo adecuado de crecimiento del microorganismo, poniendo en contacto el microorganismo con el compuesto de fórmula (I) e incubando el compuesto de fórmula (I) con el microorganismo. El crecimiento adecuado del microorganismo se puede conseguir, por ejemplo, en aproximadamente 24 horas, momento en el que se puede añadir al cultivo una alícuota adecuada de una solución de tetralona racémica en un disolvente adecuado, preferiblemente etanol. La fermentación puede continuar entonces durante, por ejemplo, de dos a aproximadamente seis días y, preferiblemente, durante aproximadamente cinco días, momento en el que el medio de fermentación se puede extraer usando cualquier procedimiento de extracción adecuado en el que un disolvente adecuado, por ejemplo acetato de etilo, metil ¡sobutil cetona, metii etii cetona, cloruro de metileno y similares, preferiblemente acetato de etilo, extraiga los componentes orgánicos del medio de fermentación. Después de la extracción del medio de fermentación y la separación de las fases orgánica y acuosa, los compuestos que comprenden el residuo orgánico se pueden determinar usando cualquier procedimiento adecuado, como por ejemplo, cromatografía, preferiblemente HPLC quiral. Se puede usar en el procedimiento de la presente invención cualquier medio de crecimiento adecuado y el medio de crecimiento adecuado contendrá una fuente o fuentes de carbono asimilable, nitrógeno asimilable y sales inorgánicas que contengan los minerales esenciales. En general, como fuentes asimilables de carbono se pueden usar muchos hidratos de carbono, como por ejemplo, glucosa, maltosa, mañosa, sacarosa, almidón, glicerina, jalea de mijo, melazas, semillas de soja y similares. Las fuentes de nitrógeno asimilable incluyen, por ejemplo, materiales como levadura e hidrolizados de caseína, levadura primaria, extractos de levadura, harina de semilla de algodón, sólidos de semillas de soja, germen de trigo, extractos de carne, peptona, licor de maceración de maíz y sales de amonio. Los nutrientes de sales inorgánicas adecuados para usar en el medio de cultivo de la presente invención incluyen, por ejemplo, las sales habituales que contienen sodio, hierro, magnesio, potasio, cobalto, fosfato y similares. Más especialmente, los medios de crecimiento adecuados para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo: (a) dextrosa (aproximadamente 20 g), extracto de levadura (aproximadamente 5 g), harina de soja (aproximadamente 5 g), NaCI (aproximadamente 5 g), K2OP4 (aproximadamente 5 g) y agua destilada (aproximadamente 1 litro (I)), pH ajustado a aproximadamente pH 7.0 con H2SO4 acuoso; (b) dextrina (aproximadamente 10 g), extracto de carne (aproximadamente 3 g), ardamina pH (aproximadamente 5 g), NZ amina tipo E (aproximadamente 5 g), MgSO4 7H2O (aproximadamente 0.5 g), KH2PO4 (aproximadamente 0.37 g), CaCO3 (aproximadamente 0.5 g) y H2O destilada (aproximadamente 1 I), pH ajustado a aproximadamente 7.1 con HCl acuoso, seguido por una segunda etapa de glucosa (aproximadamente 10 g), Hy-Case SF® (aproximadamente 2 g), extracto de carne (aproximadamente 1 g), licor de maceración de maíz (aproximadamente 3 g) y H2O destilada (aproximadamente 1 I), pH ajustado a aproximadamente pH 7.0; (c) glucosa (aproximadamente 10 g), licor de maceración de maíz (aproximadamente 6 g), KH2PO4 (aproximadamente 3 g), CaCO3 ( aproximadamente 3.5 g), aceite de soja (bruto, aproximadamente 2.2 ml), extracto de levadura (aproximadamente 2.5 g) y H2O destilada (aproximadamente 1 I), pH ajustado de aproximadamente pH 7.0 a aproximadamente pH 7.3 con HCl acuoso; (d) jarabe de malta (aproximadamente 20 g), harina de soja (aproximadamente 5 g), caseína (aproximadamente 1 g), levadura desecada (aproximadamente 1 g), NaCI (aproximadamente 5 g) y H2O destilada (aproximadamente 1 I); (e) lactosa (aproximadamente 75 g), Pharmamedia® (substitutivo de extracto de levadura, aproximadamente 40 g), CaC03 (aproximadamente g), Na2SO4 (aproximadamente 4 g) y H2O destilada (aproximadamente 1 ; (f) ISP n° 2 (véase por ejemplo la página 460 de Handbook of Microbial Media de R. M. Atlas, publicado por L.C. Parks, CRC Press, Inc 1993. ("Handbook"); (g) ISP n° 3 (véase la página 460 de Handbook); (h) ISP n° 4 (véase la página 461 de Handbook); (i) ISP n° 5 (véanse las páginas 461-462 de Handbook); y similares. Un medio de cultivo particularmente preferido es 2X de (a) expuesto antes. Con referencia a los tampones, medios, reactivos, la puesta en contacto o las condiciones de cultivo y similares, no se pretende ser limitante, sino que se interpretarán para que incluyan todos los materiales relacionados que los expertos medios en la técnica puedan conocer como de interés o valor en ei contexto particular en el que se presenta la presente descripción.

Por ejemplo, con frecuencia es posible substituir un sistema tampón o medio de cultivo por otro, de modo que se use una forma diferente pero conocida para conseguir el mismo objetivo al que se dirige el procedimiento, material o composición sugeridos. Además, se entenderá que la presente invención incluye el aumento de escala del presente procedimiento con fines comerciales. Por tanto, como se comprenderá por los expertos medios en la técnica, las variaciones en el medio de crecimiento, las condiciones de fermentación y/o la cantidad de tetralona racémica pueden alterarse para controlar el rendimiento de los compuestos resultantes y sus velocidades relativas de producción. En general, las técnicas empleadas en la presente invención se elegirán con respecto a la eficacia industrial. Los medios de crecimiento, las condiciones de fermentación y las cantidades relativas de microorganismos o de sistema de reducción enzimática y la tetralona racémica descritos en la presente son simplemente ilustrativos de la amplia gama de medios, condiciones de fermentación y cantidades de los materiales de partida que pueden ser empleados de forma adecuada en la presente invención, como se apreciará por los expertos en la técnica, y no pretenden ser limitantes en modo alguno.

Cualquier procedimiento adecuado para aislar y/o purificar cualquier de los productos del presente procedimiento se puede usar en la presente ¡nvención, incluyendo filtración, extracción, cristalización, cromatografía en columna, cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de baja presión o HPLC preparatoria o cualquier combinación adecuada de tales procedimientos. Además, un experto en la técnica apreciará que el alcohol correspondiente no deseado de la (4R) tetralona, el compuesto de fórmula (II), producido por los procedimientos aquí descritos se puede reciclar, por ejemplo, oxidar y formar el racémico como ya se ha descrito en la presente, por cualquier procedimiento conocido, formando la tetralona racémica de fórmula (I) y los procedimientos de la presente ¡nvención repetirse para producir, de nuevo, la (4S) tetralona de fórmula (V) deseada. La oxidación del (4R) tetralol a la (4R) cetona se puede realizar por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. La reacción de racemización puede llevarse a cabo de cualquier forma adecuada aunque por lo general se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 100°C, preferiblemente de aproximadamente 25°C a aproximadamente 65°C. La (4R) tetralona se hace reaccionar con una base a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 85°C, preferiblemente de aproximadamente 50°C a aproximadamente 65°C. Las bases adecuadas para esta reacción de racemización incluyen t-butóxido potásico, hidróxido sódico, metóxido sódico e hidróxido potásico. Una base preferida es el t-butóxido potásico. Los ejemplos detallados expuestos a continuación muestran que una serie de microorganismos, incluyendo hongos, por ejemplo, levaduras y actinomicetos, reducen de forma estereoselectiva la tetralona racémica, proporcionando la (4S) tetralona deseada de fórmula (V), es decir, la tetralona quiral, que se puede separar seguidamente de los compuestos no deseados y hacer reaccionar posteriormente conforme a procedimientos conocidos en la técnica para proporcionar sertralina. La presente invención se ilustra por los siguientes ejemplos. La descripción anterior y siguiente de la presente invención y las diferentes realizaciones no pretenden limitar la invención, sino que son meramente ilustrativas de la misma. Por tanto, se comprenderá que la invención no queda limitada a los detalles específicos de estos ejemplos.

EJEMPLO 1 Reducción de una tetralona racémica usando Hansenula polimorfa ATCC n° 26012 A. Fermentación de la levadura Hansenula polimorfa ATCC n° 26012 Se preparó un cultivo de control (Cl) y un cultivo de ensayo (T1 ) como sigue: se añadieron aproximadamente 2.5 ml de medio de crecimiento estéril (aproximadamente 40 g/l de aproximadamente 10 g/l de harina de soja nutritiva, aproximadamente 10 g/l de extracto de levadura, aproximadamente g/l de NaCI y dextrosa, aproximadamente 10 g/l de K HPO4, con el pH ajustado a aproximadamente 7.0 con H2SO4) a cada uno de dos tubos de 16 x 125 mm de vidrio que tenían cada uno un tapón metálico (C1 , T1 ), seguido por la adición de aproximadamente 0.2 ml de una solución A (aproximadamente 25 g de Tween® 80, aproximadamente 100 g de glicerol y aproximadamente 250 ml de agua destilada, esterilizada por filtrado), a cada uno de los dos cultivos. Se inocularon en T1 aproximadamente 25 µ\ de una solución madre congelada en glicerol aproximadamente al 17% de Hansenula polymorpha ATCC no. 26012. Los dos cultivos en tubo se incubaron a aproximadamente 29°C con agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de aproximadamente 24 horas, se añadieron a C1 y T1 aproximadamente 50 µ\ de una solución madre (aproximadamente 5 mg/ml en aproximadamente etanol al 100%, concentración final de aproximadamente 100 /g/ml) de una tetralona racémica (compuesto de fórmula (I) que comprende los compuestos de fórmulas (IV) y (V), a aproximadamente 5 mg/ml en etanol). Después de aproximadamente cinco días, se añadió un ml de NaCI (saturado) a cada uno de los dos cultivos en tubo. El medio de fermentación de cada cultivo en tubo (aproximadamente 3.6 ml) se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo (puro): se añadió el acetato de etilo, el cultivo en tubo se agitó en vértice y luego se centrifugó a aproximadamente 2,000 rpm (centrífuga IEC®' 300 Second Avenue, Needham Heights, Massachusetts 02194). La capa de acetato de etilo se retiró y la capa acuosa se extrajo durante un segundo período. Los extractos orgánicos reunidos se secaron bajo nitrógeno en un baño de agua a aproximadamente 50°C.

B. Configuración de la cetona residual: Compuestos de fórmulas (IV) y Cada extracto, preparado como se ha descrito antes, se resuspendió en aproximadamente un ml de etanol, y se analizaron aproximadamente 20 µ\ de cada extracto resuspendido por inyección en una columna de HPLC: columna de protección Chiralcel OK (4.6 x 50 mm, Diacel Chemical Industries, LTD, 730 Springdale Drive, P.O. Box 564, Exton Pennsylvania 19341 ) acoplada a una columna Chiralcel OK (4.6 x 250 mm, Diacel). Los compuestos contenidos en cada uno de los extractos resuspendidos inyectados se separaron de forma ¡socrática a aproximadamente 0.8 ml por minuto en una fase móvil (etanol: acetato de etilo, 85:15) y los compuestos comprendidos en los extractos se detectaron usando un detector 996 PDA (Waters® , 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757) ajustado a 254 nm. Como se ilustra por los datos de C1 y T1 en el Cuadro I siguiente, el análisis por HPLC quiral mostró que la inclusión del microorganismo, es decir, Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 proporcionó una relación de 16:1 ( (4S) tetralona de fórmula (V) sin reaccionar frente a (4R), tetralona de fórmula (IV) sin reaccionar), que ilustra además el carácter estereoespecífico del presente procedimiento de reducción microbiana. Los resultados expresados a continuación se basan en la cantidad conocida de cada enantiómero añadido (aproximadamente 50 /g/ml de cada uno de los compuestos de fórmulas (IV) y (V)). Como se ha citado antes, la tetralona racémica de partida de fórmula (I) tenía una concentración de aproximadamente 100 //lg/ml.

CUADRO 1 Los resultados del análisis quiral muestran que el cultivo de Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 (T1 ) reduce de forma substancial la (4R) tetralona, quedando prácticamente sin reaccionar la (4S) tetralona (aproximadamente 4.7% de (4R) tetralona queda frente a un 76% de (4S) tetralona). Se determinó que la (4S) tetralona estaba presente en un ee de aproximadamente 88% ("cantidad porcentual de exceso enantiomérico") por HPLC quiral. Como también se muestra por los datos del Cuadro I, en especial por la relación (4S):(4R), es decir, 16, queda substancialmente más (4S) tetralona sin reaccionar que (4R) tetralona. Conforme a esto, la inclusión del microorganismo intacto, es decir Hansenula polymorpha ATCC n° 26012, produjo una reducción estéreoespecífica substancial de más (4R) tetralona de partida de fórmula (IV) que (4S) tetralona de partida de fórmula (V) (( 4S) : (4R)) y proporcionó mayoritariamente (4R) tetralol de fórmula (II) frente a (4S) tetralol de fórmula (lll) (datos no mostrados). La mayoría del (4R) tetralol producido fue el (1 S, 4R) tetralol y la mayoría de la cantidad minoritaria de (4S) tetralol producido fue el (1S. 4S) tetralol.

EJEMPLO II REDUCCIÓN DE UNA TETRALONA RACEMICA USANDO Absidia coerulea ATCC no. 20137 A. Fermentación del hongo Absidia coerulea ATCC no. 20137 Se prepararon un cultivo de control (C2) y un cultivo de ensayo (T2) como sigue: se añadieron aproximadamente 2.5 ml de medio de crecimiento estéril (aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de harina de soja nutritiva, aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCI y aproximadamente 5 g/l de K2HPO4, con el pH ajustado a aproximadamente 7.0 con H2SO4) a cada uno de dos tubos de vidrio de 16 x 125 mm que tenían cada uno un tapón metálico (C2, T2). Se inocularon en T2 aproximadamente 25 µ\ de una solución madre en giicerol congelada al 17% de Absidia coerulea ATCC no. 20137. Los dos cultivos en tubo se incubaron a aproximadamente 29°C con agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de aproximadamente 48 horas, se añadieron a C2 y T2 aproximadamente 50 µ\ (aproximadamente 5 mg/ml en etanol, concentración final de aproximadamente 100 //l/ml) de una tetralona racémica (como se describe en el Ejemplo I, a aproximadamente 5 mg/ml en aproximadamente etanol al 100%). Después de aproximadamente cinco días, se añadió un ml de NaCI (saturado) a cada uno de los dos cultivos en tubo. El medio de fermentación de cada cultivo en tubo (aproximadamente 3.6 ml) se extrajo con aproximadamente 3 ml de acetato de etilo (puro): se añadió el acetato de etilo, el cultivo en tubo se agitó en vórtice y luego se centrifugó a aproximadamente 2,000 rpm (centrífuga IEC). La capa de acetato de etilo se retiró y se extrajo la capa acuosa durante un segundo período. Los extractos orgánicos reunidos se secaron bajo nitrógeno en un baño de agua a aproximadamente 50°C.

B. Configuración de la cetona residual: Compuestos de fórmula (IV) y (V).

Cada extracto, preparado como se ha descrito antes, se resuspendió en aproximadamente un ml de etanol, y se analizaron aproximadamente 20 µ\ de cada extracto resuspendido por inyección en una columna de HPLC: columna de protección Chiralcel OK (4.6 x 50 mm) acoplada a una columna Chiracel OK (4.6 x 250 mm). Los compuestos contenidos en cada uno de los extractos resuspendidos inyectados se separaron de forma ¡socrática a aproximadamente 0.8 ml por minuto en una fase móvil (etanol :acetato de etilo, 85:15) y los compuestos comprendidos en los extractos se detectaron usando un detector 996 PDA (Waters®) ajustado a 254 nm. Como se ilustra por los datos de HPLC para Cl y TI, la inclusión del microorganismo, es decir, Absidia coerulea ATCC n° 20137 proporcionó una reducción esteroespecífica de más (4R) tetralona de partida de fórmula (IV) que de la (4S) tetralona de partida de fórmula (V). Más específicamente, los resultados del análisis quiral muestran que el cultivo de Absidia coerulea ATCC n° 20137 reduce la (4R) tetralona mientras que deja substancialmente sin reaccionar a la (4S) tetralona (aproximadamente 13.6% de (4R) tetralona queda frente a aproximadamente 40.5% de la (4S) tetralona). Se determinó que la (4S) tetralona estaba presente en un ee de aproximadamente 50% por este HPLC quiral. Como se ¡lustra por los datos para C2 y T2 en el cuadro II siguiente, el análisis de HPLC quiral mostró que la inclusión del microorganismo, es decir, Absidia coerulea ATCC n° 20137 (T2) produjo una relación de al menos dos veces como mucho de (4S) tetralona que quedaba sin reducir frente a la (4R) tetralona sin reducir, demostrando además la estereoespecificidad del presente procedimiento de reducción microbiana. Los resultados expresados a continuación están basados en la cantidad conocida de cada enantiómero añadido (aproximadamente 50 µg/mi de cada uno, como se describe en el ejemplo 1 anterior). Como se ha citado antes, la tetralona racémica de partida tenía una concentración de aproximadamente 10 µg/ml.

CUADRO ll EJEMPLO lll Reducción de una tetralona racémica usando hongos, levaduras y un actinomiceto Como se comprenderá por los expertos en la técnica correspondiente, los microorganismos enumerados en el cuadro lll, que se usaron en la presente reducción, Geotrichum candidum ATCC n° 62401 , Mortierella isabellina ATCC n° 38063, Mortierella vinacea ATCC n° 09515, Penicillium nonatum ATCC n° 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC n° 28757, Monosporium olivaceum v. major ATCC n° 36300, Aureobasidium pullulans ATCC n° 16623, Pichia fabianii ATCC n° 16755, y Streptomyces rímosus ss. rímosus ATCC n° 10970 se separaron como se describe en el ejemplo II; Geotrichum candidum ATCC n° 34614, Mortierella isabellina ATCC n° 42613, Debaryomyces polymorphus ATCC n° 20280 y Saccharomyces cerevisiae ATCC n° 15248 se prepararon como se describe en el ejemplo II, salvo que se repitió la extracción; y Candida schatavii ATCC n° 24409 se preparó como se indica a continuación. Se preparó Candida schatavii ATCC n°24409 y se usó conforme a la presente invención como sigue: se añadieron aproximadamente 2.5 ml de medio de crecimiento estéril (aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de harina de soja nutritiva, aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCI y aproximadamente 5 g/l de K2PO4, con el pH ajustado a aproximadamente 7.0 con H2SO4) a un tubo de vidrio de 16 x 125 mm con un tapón metálico, seguido por la adición de aproximadamente 0.1 ml de una solución esterilizada por filtración de aproximadamente 25 g de Tween® 80, aproximadamente 100 g de glicerol y aproximadamente 250 ml de agua destilada al cultivo. A continuación, se inocularon aproximadamente 25 µl de una solución madre en glicerol a aproximadamente 17% congelada de Candida schatavii ATCC n° 24409 en el cultivo. El cultivo se desarrolló a aproximadamente 29°C, con agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de 48 horas, se añadieron al cultivo aproximadamente 50 µl de una solución madre (aproximadamente 5 mg/ml en aproximadamente etanoi al 100%, concentración final de aproximadamente 100 µl/ml de una tetralona racémica (compuesto de fórmula (I) que comprende los compuestos de fórmulas (IV) y (V), a aproximadamente 5 mg/ml en aproximadamente etanol al 100%).

Después de cuatro días más, el medio de fermentación del cultivo (aproximadamente 2.6 ml) se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo (puro), el cultivo se agitó en vórtice y luego se centrifugó a aproximadamente 2000 rpm (centrífuga IEC®). La extracción se repitió. Los extractos se secaron bajo nitrógeno en un baño de agua a aproximadamente 50°C. El extracto se resuspendió en aproximadamente un ml de etanol, y se analizaron aproximadamente 5 µl del extracto resuspendido por inyección sobre una columna de HPLC: columna de protección Chiralcel OD (4.6 x 50 mm, Diacel Chemical Industries LTD.) acoplada a una columna Chiralcel OD (4.6 x 250 mm, Diacel). Los compuestos contenidos en el extracto resuspendido inyectado se separaron de forma ¡socrática a aproximadamente 0.9 ml por minuto en una fase móvil (hexano:isopropanol, 95:5) y los compuestos en el extracto se detectaron usando un detector 996 PDA (Waters®) ajustado a 210 nm. Como se muestra por la HPLC quiral (llevada a cabo como en el ejemplo I y II), los datos expuestos en el cuadro lll, cada uno de los microorganismos listados en el cuadro lll siguiente redujo de forma estereoespecífica más (4R) tetralona que (4S) tetralona y se produjo generalmente una relación de al menos aproximadamente el doble de (4S) tetralona que quedaba sin reaccionar con respecto a la (4R) tetralona sin reaccionar.

CUADRO Se apreciará que, mientras que Monosporium olivaceum v. major ATTC n° 36300, como se ilustra por los datos del Cuadro lll, reduce substancialmente más (4R) tetralona que (4S) tetralon y, como tal sería un microorganismo preferido para usar en el presente procedimiento, no obstante, también se expone para este cultivo la degradación indeseable de la (4R) tetralona y la (4S) tetralona. La degradación indeseable puede ser debida, por ejemplo, a otras enzimas y similares que comprende el microorganismo intacto. Por tanto, como se comprenderá por los expertos en la técnica a partir de la descripción expuesta en la presente, se prefiere el uso de la enzima aislada de Monosporium olivaceum v. major ATCC n° 36300 frente a Monosporium olivaceum v. major ATCC n° 36300 intacto.

Claims (35)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para la reducción microbiana esteroselectiva de un compuesto de fórmula (I) a compuestos de fórmulas (II) y que comprende: poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo dicha reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir más compuesto de fórmula (II) que compuesto de fórmula (lll), quedando así más compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que compuesto de fórmula (IV) sin reaccionar, seleccionándose dicho microorganismo del grupo formado por: Hansenula polymorpha ATCC n° 26012, Hansenula polymorpha ATCC n° 74449, Absidia coerulea ATCC n° 20137, Geotrichum candidum ATCC n° 34614, Geotrichum candidum ATCC n° 62401 , Mortierella isabellina ATCC n° 42613, Mortierella isabellina ATCC n° 38063, Mortierella vinacea ATCC n° 09515, Penicillium notatum ATCC n° 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC n° 28575,

Monosporium olivaceum v. major ATCC n° 36300, Aureobasidium pullulans ATCC n° 16623, Debaryomyces polymorphus ATCC n° 20280,

Saccharomyces cerevisiae ATCC n° 15248, Cándida schatavii ATCC nc 24409, Pichia fabianii ATCC 16755 y Streptomyces rimosus ss. rímosus ATCC n° 10970; y sus mutantes capaces de llevar a cabo dicha reducción. 2.- Procedimiento según la reivindicación 1 , en el que el compuesto de fórmula (V) se separa de los compuestos de fórmulas (II), (lll) y (IV). 3.- Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha separación se lleva a cabo por cromatografía.

4.- Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha separación se lleva a cabo por cristalización.

5.- Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho compuesto de fórmula (II) se separa de dichos compuestos de fórmulas (lll) y (IV).

6.- Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho compuesto separado de fórmula (II) se recicla a un compuesto de fórmula (I) oxidando dicho compuesto separado de fórmula (II) y sometiendo a racemización dicho compuesto oxidado a dicho compuesto de fórmula (I).

7.- Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha racemización comprende hacer reaccionar dicho compuesto oxidado con una base.

8.- Procedimiento según la reivindicación 1 , en el que dicho compuesto de fórmula (I) se prepara como se define en la reivindicación 6.

9.- Procedimiento según la reivindicación 1 , en el que dicha puesta en contacto se produce con un microorganismo.

10.- Procedimiento según la reivindicación 1 , en el que dicha puesta en contacto se produce con dicho sistema de reducción enzimática.

11.- Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es un microorganismo intacto.

12.- Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es un es una preparación de células usadas del mismo.

13.- Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es una preparación deshidratada del mismo.

14.- Procedimiento según la reivindicación 11 , en el que dicho microorganismo intacto comprende células lavadas de dicho microorganismo intacto.

15.- Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dichas células lavadas están inmovilizadas.

16.- Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha enzima de dicho sistema de reducción enzimática está inmovilizada.

17.- Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha preparación deshidratada es una preparación enzimática en polvo en acetona.

18.- Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo está en un medio de cultivo.

19.- Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicho compuesta de fórmula (I) a dicho medio de cultivo.

20.- Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho sistema de reducción enzimática está en un disolvente.

21.- Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicho disolvente es un disolvente apreciablemente orgánico.

22.- Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicho compuesto de fórmula (I) a dicho disolvente.

23.- Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es dicho Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 o dicho Hansenula polymorpha ATCC n° 74449 o sus mencionados mutantes.

24.- Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha enzima que comprende dicho sistema de reducción enzimática deriva de dicho Hansenula polymorpha ATCC n°26012 o Hansenula polymorpha ATCC n° 74449 o de sus mencionados mutantes.

25.- Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho microorganismo es dicho Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 o dicho Hansenula polymorpha n° 74449 o sus mencionados mutantes.

26.- Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho microorganismo es dicho Hansenula polymorpha ATCC n° 26012 o dicho Hansenula polymorpha n° 74449 o sus mencionados mutantes.

27.- Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo e Absidia coerulea ATCC n° 20137 o sus mencionados mutantes.

28.- Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha enzima que comprende dicho sistema de reducción enzimática deriva de dicho Absidia coerulea ATCC n° 20137 o de sus mencionados mutantes.

29.- Procedimiento según la reivindicación 10, en ei que dicha enzima que comprende dicho sistema de reducción enzimática deriva de dicho Monosporium olivaceum v. major ATCC n° 36300 o de sus mencionados mutantes.

30.- Un procedimiento para la reducción microbiana estereoselectiva de un compuesto de fórmula (I) a compuestos de fórmulas (II) y (lll) que comprende: poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir más compuesto de fórmula (II) que compuesto de fórmula (lll), quedando así más compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que compuesto de fórmula (IV) sin reaccionar, seleccionándose dicho microorganismo del grupo formado por: Hansenula polymorpha ATCC n° 26012, Hansenula polymorpha ATCC n° 74449 y sus mutantes capaces de llevar a cabo dicha reducción.

31.- Procedimiento según la reivindicación 30, en el que dicho microorganismo está en un medio de cultivo.

32.- Procedimiento según la reivindicación 31 , en el que dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicho compuesto de fórmula (I) a dicho medio de cultivo.

33.- Un procedimiento para ia reducción microbiana estereoselectiva de un compuesto de fórmula (I) a compuesto de fórmulas (II) y (lll) que comprende: poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo dicha reducción que comprende una enzima derivada de un microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir más compuesto de fórmula (II) que compuesto de fórmula (lll), quedando así más compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que compuesto de fórmula (IV) sin reaccionar, seleccionándose dicho microorganismo del grupo formado por: Hansenula polymorpha ATCC n° 26012, Hansenula polymorpha ATCC n° 74449 y sus mutantes capaces de llevar a cabo dicha reducción.

34.- Procedimiento según la reivindicación 33, en el que dicho sistema de reducción enzimática está en un disolvente.

35.- Procedimiento según la reivindicación 34, en el que dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicho compuesto de fórmula (I) a dicho disolvente. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procedimientos para llevar a cabo la siguiente reducción microbiana esteroselectiva de una tetralona racémica: que comprende: poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un sistema de reducción enzimática capaz de llevar a cabo la presente reducción, que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima, e incubar la mezcla resultante bajo condiciones suficientes para producir el (4R) tetralol de fórmula (II) y dejar substancialmente sin reaccionar la (4S) tetralona de fórmula (V) o "tetralona quiral". La tetralona quiral se puede usar en la síntesis de sertralína. El presente procedimiento comprende además opcionalmente la separación de la (4S) tetralona de fórmula (V) del (4R) tetralol de fórmula (II). El (4R) tetralol se puede reciclar para producir el compuesto de fórmula (I) y el presente procedimeinto se repite para producir más (4S) tetralona deseada de fórmula (V). PF/todas* P99/1350