MXPA99009388A - Geles de alginato de liberacion sostenida - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con formulaciones de liberación sostenida que utilizan perlas de gel de alginato y con los métodos para producir las mismas.

Description

GELES DE ALGINATQ DE LIBERACIÓN SOSTENIDA CA PO^DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con formulaciones de liberación sostenida que utilizan perlas de gel de alginato y los métodos de las mismas. ~7_ ANTECEDENTES Con los avances en la genética y las tecnologías de ingeniería celular, la disponibilidad de proteínas recombinantes ha generado avances en el uso de las proteínas como "Medicamentos para aplicaciones terapéuticas. Muchas enfermedades o condiciones tratadas con proteínas farmacéuticas requieren niveles sostenidos de proteina para lograr el resultado terapéutico más efectivo. Sin embargo, como con la mayoría de los fármacos de proteina, la vida media ^ biológica generalmente corta requiere una administración frecuente. Esas inyecciones repetidas se dan a varios intervalos los cuales dan como resultado niveles de medicamento fluctuantes a un costo físico y monetario significativo sobre los pacientes. Puesto que muchas condicLones responden mejor a_ niveles controlados de un fármaco, existe la necesidad de la liberación controlada de un medicamento para proporcionar periodos más prolongados de REF.: 31344 liberación consistente. Tales^ medicamentos de liberación sostenida proporcionarían al paciente no únicamente mejores efectos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico, sino también una disminución en la frecuencia de inyecciones asi como en los costos totales. Los intentos actuales por sostener los niveles de medicamento en humanos o animales entre dosis mediante el uso de polímeros biodegradables como matrices para controlar la liberación del medicamento. Por ejemplo, la Patente de la Gran Bretaña No. 1,388,580 describe el uso de hidrogeles para la liberación sostenida de insulina. La Patente Estadounidense No. 4,789,550 describe el uso de microcápsulas de alginato recubiertas con polilisina para la liberación de proteínas mediante la encapsulación de células vivientes. Los intentos de liberación sostenida también han utilizado composiciones poliméricas aniónicas o catiónicas rodeadas por polímeros iónicos de carga opuesta para encapsular células capaces de producir composiciones biológicamente activas. La Patente Estadounidense No. 4,744,933. De igual modo, también han sido descritos recubrimientos múltiples de polímeros reticulados aniónicos o catiónicos como medios para obtener la liberación controlada. Patentes Estadounidenses Nos. 4,690,6>82 y 4,789,516. Además", los intentos adicionales describen el uso de alginatos solos, o alginatos recubiertos con o?ros polímeros biodegradables, para la liberación controlada de composiciones polipeptidicas o precipitados catiónicos de los mismos. PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 y PCT WO 96/03116. Esos intentos, sin embargo, Han probado ser medios insuficientes para obtener la liberación sostenida del fármaco proteico deseado. Se sabe de manera general que el uso de ciertos polímeros biodegradables, por ejemplo, poli'actida co-glicolida, bajo condiciones in vivo, exhibe irrupciones iniciales altas de liberación del medicamento. Johnson, O. et al . , Nature Med/, 2/7: 795 (1996). Además, se sabe de manera general que las _ proteínas utilizadas con las fórmulas actuales de las preparaciones de liberación sostenida pueden experimentar desnaturalización y perder su bioactividad después de la exposición a los agentes encapsulantes . Tales preparaciones utilizan solventes orgánicos los cuales pueden tener efectos dañinos sobre la proteiria de elección. Finalmente, como se discute más adelante, el uso de alginato sólo no ha probado la liberación controlada de proteina deseada necesaria para resultados terapéuticos efectivos. En general, los alginatos son polisacáridos aniónicos naturales, bien conocidos, comprendidos de ácido 1, 4-enIazando-ß-D-manurónico y ácido a-L-gulurónico . Smidsrod, 0. et al . , Trends in Biotechnology, 8: 71-78 (1990); Aslani, P. et al . , J. Microencapsulation, 13/5 : 601-614 (1996) . Los alginatos típicamente varian del 70% de ácido manurónico y 30% de ácido gulurónico, al 30% de ácido manurónico y 70% de ácido gulurónico. Smidsrod, supra. El ácido alginico es insoluble en agua mientras que las sales formadas con iones monovalentes tales como el sodio, potasio y amonio son solubles en agua. McDo ell, R.H., "Properties of Alginates" (Londres, Alginate Industries Ltd, 4a edición 1977). Se sabe que los cationes polivalentes reaccionan con los alginatos para formar espontáneamente geles. Los alginatos tienen una amplia variedad de aplicaciones tales como aditivos de alimentos, adhesivos, tabletas farmacéuticas y apositos para heridas. Los alginatos también han sido recomendados para técnicas de separación de proteínas. Por ejemplo, Gray, C. J. et al., en Biotechnology y Bioengineering, 31 : 607-612 (1988) atraparon insulina en geles de alginato de zinc/calcio para la separación de insulina de otras proteínas del suero. También han sido documentadas matrices de alginato para sistemas de liberación de fármacos, véase por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,695,463 que describe un sistema de liberación de goma de mascar y preparaciones farmacéuticas basadas en alginato. Las perlas de alginato han sido utilizadas para la liberación controlada de varias proteínas tales como: receptor del factor de la necrosis tumoral en perlas de alginato catiónico recubiertas con policationes, Wee, S. F. Proceed. Intern. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater., 21: 730-31 (1994); transformación del factor del crecimiento encapsulado en perlas de alginato, Puolakkainen, P. A. et al . , Gastroenterology, 107 : 1319-1326 (1994); factores angiogénicos atrapados en perlas de alginato de calcio, Downs, E. C. et al , J. of Cellular Physiology, 152:~ 422-429 (1992); albúmina "atrapada en microcápsulas de alginato de quitosan, Polk, A. et al . , J. Pharmaceutical Sciences, 83/2: 178-185 (1994), o perlas de alginato de calcio de quitosan recubiertas con polímeros, Okhamafe, A. O. et al . , J. Microencapsultation, 13/5: 497-508 (1996); hemoglobina encapsulada con perlas de quitosan-alginato de calcio, Huguet, M. L. et al . , J Applied Polymer Science, 51 : 1427-1432 (1994), Huguet, M. L. et al . , Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996) , e interleucina 2 encapsulada en microesferas de alginato-quitosan, Liu, L. S. et al . , Proceed. Intern. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater, 22_: 542-543 (1995) . Los sistemas que utilizan perlas de gel de alginato, o perlas de gel de alginato/calcio para atrapar proteínas sufren de carencias de cualquier efecto de liberación sostenida debido a la rápida liberación de la proteina de las perlas de alginato. Liu, L. S. et al . , • Control. Reí., 43: 65-74 (1997). Para evitar tal liberación rápida], un número de los sistemas anteriores pretenden utilizar recubrimientos poliméricos policatiónicos (por ejemplo, polilisina, quitosan) para retardar la liberación de las perlas de alginato de la proteina. Véase, por ejemplo, Wheatley, M. A. et al . , J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S. F. et al . Supra; Lu, L.S. et al. Supra; Wee, S.F. et al, Controlled Reléase Society, 22: 566-567 (1995) y Lim, et al . supra. Los policationes, tales como la polilisina, son polielectrolitos cargados positivamente, los cuales interactúan con las moléculas de alginato cargadas negativamente para formar complejos polielectroliticos que actúan como barreras de difusión sobre la superficie de la perla._ Los problemas que pueden ocurrir con el uso de policationes son: (1) tales formulaciones pueden ser citotóxicas debido a los policationes (Huguet, M. L. et al . , supra; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13_: 269 (1992); Bergmann, P. et al . , Clinical "Science, 61_: 35 (1984)); (2) los policationes son propensos a la oxidación; (3) las perlas con recubrimientos policatiónicos tienden a no ser erosionables y acomodarse en el cuerpo; (4) tales formulaciones se hacen via procedimientos de recubrimientos laboriosos, los cuales incluyen los elementos múltiples__ de polilisina policatiónica (Padol, et al . , Proceed. Intern. Symp. ^Control. Reí. Bioact. Mater, 2: 216 (1986) y (5) las interacciones iónicas entre la proteina y los policationes pueden dar como resultado pérdida de la actividad de la proteina o causar la inestabilidad de la proteina. En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar formulaciones farmacéuticas que logren mejores medios de liberación sostenida para aplicaciones clínicas. Numerosas proteínas recombinantes o naturales podrían beneficiarse de la liberación constante a largo plazo y, por lo tanto proporcionar resultados clínicos más efectivos. La presente invención proporciona tales avances. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son capaces de proporcionar protección a la proteína, disminuir la degradación y una liberación lenta con mayor estabilidad y potencia de la proteína. También, las composiciones farmacéuticas de la presente invención proporcionan medios sencillos, rápidos y baratos _ de liberación controlada de proteína recombinante para resultados profilácticos politerapéuticos o de diagnóstico efectivos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ?_ La presente invención se relaciona con formulaciones de liberación sostenida que utilizan perlas o partículas de gel de alginato, y los métodos para las mismas.

En particular, la formación de geles de liberación sostenida incluye la coprecipitación de perlas de gel de alginato con un agente biológicamente activo. Este método proporciona la ventaja de producir una carga alta y eficiente de agente biológicamente activo dentro del gel del alginato para la liberación sostenida, logrando a la vez la protección de la protei a, una menor degradación, un incremento en la estabilidad y potencia del agente a ser liberado. .* En consecuencia, un aspecto de la presente invención, proporciona un agente de liberación sostenida que comprende un polímero hidrofílico; un agente biológicamente activó"; y al menos un agente precipitante. Durante la formulación de la composición, el agente biológicamente activo es coprecipitado con el polímero hidrofílico. Además, también pueden ser agregados ^agentes precipitantes a la composición. Como se utiliza aquí, el término coprecipitación se refiere al uso de agentes para la precipitación del agente biológicamente activo junto con el polímero hidrofílico para formar una matriz del polímero y agente precipitados, por ejemplo, la formación de las perlas de alginato sería vía precipitación. Tal precipitación puede ser simultánea o muy próxima a ésta. La precipitación de las moléculas y cualesquier agentes precipitantes relacionados es bien conocida por aquellos expertos en la técnica. Otro aspecto proporciona los métodos para producir las composiciones de liberación sostenida de la presente invención. Estos comprenden los" pasos de disolver un agente biológicamente activo y un polímero hidrofílico con un solvente para formar una primera mezcla; disolver al menos un agente precipitante en un solvente para formar una segunda mezcla; agregar el agente biológicamente activo y la solución polimérica hidrofílica de la primera mezcla con el agente precipitante y el solvente de la segunda mezcla; y coprecipitar el agente biológicamente activo dentro del polímero hidrofílico. Los métodos de la presente, también pueden incluir el uso de agentes precipitantes adicionales. i Además, también se contempló un paso para aislar la composición de liberación sostenida. Como se utiliza aquí, el término solvente se refiere a solventes basados en agua capaces de dispersar o disolver los agentes biológicamente activos, polímeros hidrofílicos o agentes precipitantes de elección. Tales-solvente son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Además de la primer mezcla con la segunda mezcla para formar la composición de coprecipitación, puede hacerse por los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a la adición por goteo, dispersión, rocío o mezclado mediante el uso de chorros de rocío, chorros de aire, atomización y campos eléctricos. El término dispersión, para los propósitos de esta invención, puede significar dispersiones líquidas, sólidas o acuosas. Como se utiliza aquí, el término aislamiento, se refiere al proceso para el aislamiento de la composición de liberación sostenida de la presente invención. Tales procedimientos de aislamiento y purificación son bien conocidos en la técnica. En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición de liberación sostenida producida por los métodos anteriores . Los aspectos adicionales incluyen formulaciones farmacéuticas de las composiciones anteriores y un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable . En otro aspecto más, la. presente invención proporciona las indicaciones para los métodos de tratamiento con las composiciones de liberación sostenida que contienen los agentes biológicamente activos deseados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Composiciones Los polímeros hidrofílicos incluyen a los alginatos derivados de los mismos, pueden obtenerse de varias fuentes comerciales, naturales o sintéticas bien conocidas en la técnica. Como se utiliza aquí, el término polímero hidrof lico se refiere a polímeros solubles en agua o polímeros que tienen afinidad para absorber agua. Los polímeros hidrofílicos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ésos incluyen pero no se limitan a polianiones, incluyendo polisacáridos aniónicos tales como el alginato, carboximetil amilosa, sales de ácido poliacrílico, sales de ácido polimetacrílico, copolímero de etileno de anhídrido maleico (semiéster) , carboximetil celulosa, sulfato de dextran, heparina, carboximetil dextran, carboxi celulosa, 2, 3-dicarboxicelulosa, tricarboxicelulosa, carboxi goma arábiga, carboxi carragenina, carboxi pectina, carboxi goma de tragacanto, carboxi goma de xantano, polisulfato de pentonsan, carboxi almidón, carboximetil quitina/quitosan, curdla*h, hexasulfato de inositol, sulfato de ß-ciclodextrina, ácido hialurónico, condroitin-6-sulfato, sulfato de dermatan, sulfato de heparina, carboxilmetil almidón, carragenina, poligalacturonato, carboxi goma guar, polifosfato, ácido polialdehído-carbónico, poli-l-hidroxi-l-sulfonato-propen-2, ácido _copoliestiren maleico, agarosa, mesoglican, alcoholes polivinílicos sulfopropilados, sulfato de celulosa, sulfato de protamina, fosfo goma guar, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, poliamino ácidos, derivados o combinaciones de los mismos. Un experto en la técnica apreciará otros varios polímeros hidrofílicos que están dentro del alcance de la presente invención. De igual modo, pueden obtenerse agentes precipitantes de varias fuentes comerciales, naturales o sintéticas, las cuales son bien conocidas en la técnica. Los agentes precipitantes incluyen_ pero no se limitan a iones metálicos polivalentes, sales, acétales, citratos, cloruros, carbonatos, hidróxidos, oxalatos, tartratos o hidróxidos de los mismos, ácidos o polímeros solubles en agua. En particular, los iones metálicos pueden incluir pero no se limitan al aluminio, bario, calcio, hierro, manganeso y magnesio, estroncio y zinc. De manera preferible los iones metáiicos son calcio y zinc o sales de los mismos, tales como el acetato de zinc, acetato de calcio o sales de cloro. También pueden utilizarse moléculas pequeñas solubles en agua y sales tales como el sulfato ""de amonio, acetona, etanol y glicerol . Como para los polímeros solubles en agua esos incluyen pero no se limitan a polietilen glicol, copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextran, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos, dextran, poli (n-vinil pirrolidona) polietilen glicol, homopolímeros de propilen glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados, succinato de alcohol polivinílico, glicerina, óxidos de etileno, óxidos de propileno, poloxámeros, copolímeros alcoxilados, polianiones solubles en agua, derivados o combinaciones de los mismos. El polímero soluble en agua puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. Por ejemplo, el peso molecular preferido del polietilen glicol es de entre aproximadamente 700 Da y aproximadamente 100 kDa para facilitar el manejo y eficiencia de la precipitación. Pueden ser utilizados otros tamaños y tipos de agentes precipitantes, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hay sobre la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un agente precipitante deseado para _ una proteína o análogo terapéutico) . Un experto en la técnica apreciará otros agentes precipitantes que están dentro del alcance de la invención. ~~ Como se utiliza aquí, el término amortiguador o solución amortiguadora se refiere al uso de ácidos inorgánicos u orgánicos o una combinación de los mismos para preparar una solución amortiguadora como es sabido en la técnica. Los ácidos inorgánicos dentro del alcance de la presente invención incluyen al haluro de hidrógeno (por ejemplo, ácido clorhídrico) , ácidos fosfórico, nítrico o sulfúrico. Otros ácidos inorgánicos son bien conocidos por un experto en la técnica y se contemplaron aquí. Los ácidos orgánicos dentro del alcance de la invención incluyen a los ácidos carboxilicos alifáticos y ácidos aromáticos tales como los ácidos fórmico, carbónico, acético, propionico, butírico, valérico, caproico, acrílico, malónico, succínico, glutárico, adípico, maleico, fumárico, glicina o fenol sulfónico. Otros ácidos orgánicos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El amortiguador^ preferido de la presente invención incluye sistemas amortiguadores de glicina y ácido glicin fosfórico. Como se utiliza aquí, agente biológicamente activo se refiere a proteínas recombinantes o naturales, ya sea humanas o animales, útiles para aplicación profiláctica, terapé'utica o de diagnóstico. El agente biológicamente activo puede ser natural, sintético, semisintético o derivados de los mismos. Los agentes biológicamente activos de la presente invención deben ser precipitables . Se contemplaron una amplia variedad de agentes biológicamente activos. Esos incluyen pero ^no se limitan a hormonas, citocinas, factores hematopoyéticos, factores del crecimiento, factores antiobesidad, factores tróficos, factores antiinflamatorios, y enzimas (véase también la Patente Estadounidense No. 4,695,463 para ejemplos adicionales de agentes biológicamente activos útiles) . Un experto en la técnica será capaz de adaptar fácilmente un agente biológicamente activo deseado a las composiciones de la presente invención. Tales proteínas incluyen pero no se limitarían a interferones (véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. ,372,808, 5,541,293, 4,897,471, y 4,695,623 incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos) , interleucinas (véase, la Patente Estadounidense No. 5,075,222, incorporada aquí como referencia, incluyendo los dibujos), eritropoyetinas (véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933, y 5,621,008, incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos), factores estimulantes de la colonia granulocítica (véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823 y la Publicación PCT No. 94/17185 incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos) , factor de las células no diferenciadas (Publicaciones PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206 incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos) , y la proteína OB (Publicaciones PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816 incorporadas aquí como referencia, incluyendo las figuras) . Además, los agentes biológicamente activos también pueden incluir pero no se limitan a productos antiobesidad relacionados, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , hormona luteinizante (LH) , hormona estimulante del folículo (FSH) , hormona gonadotropina coriónica humana (HCG) , motilina , interferones (alfa, beta, gamma), interleucinas (IL-1 a IL-12), factor de la necrosis tumoral (TNF) , proteína de unión del factor de la necrosis tumoral (TNF-bp) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor neurotrófico derivado del tejido glial (GDNF) , factor neurotrófico 3 (NT3) , factores del crecimiento de los fibroblastos (FGF) , factor del crecimiento neurotrófico (NGF) , factores del crecimiento óseo tales como la osteoprotegerina (OPG) , factores del crecimiento similares a la insulina (IGF), factor estimulante de la colonia de los macrófagos (M-CSF) , factor estimulante de la colonia de los macrófagos granulocíticos (GM-CSF) , factor del crecimiento derivado de los megaqueratinocitos (MGDF) , trombopoyetina, factor del crecimiento derivado de las plaquetas (PGDF) , factores del crecimiento estimulantes de colonias (CSF) , proteína morfogenética ósea (BMP) , superóxidodismutasa (SOD) , activador del plasminógeno tisular (TPA) , urocinasa, estrep"tocinasa y calicreína. El término proteínas, como se utiliza aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados o combinaciones de los mismos. Los derivados de los agentes biológicamente activos pueden incluir la unión de una o más porciones químicas a la porción proteica. Se ha encontrado que la modificación química de los agentes biológicamente activos proporciona ventajas adicionales en ciertas circunstancias, tales como el incremento de la estabilidad y tiempo de circulación de la proteína terapéutica y disminución de la inmunogenicidad. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar la : i7 modificación química deseada basada en la dosis deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, los usos terapéuticos y otras consideraciones.

Complejos ; Las proteínas, análogos o derivados pueden administrarse complejadas a una composición aglutinante. Tal compOs"ición aglutinante puede tener el efecto de prolongar el tiempo de circulación de la proteína, análogo o derivados o aumentar la actividad del agente biológicamente activo. Tal composición puede ser una proteína (o su sinónimo, péptido) , derivado, análogo o combinación. Por ejemplo, una proteína de unión "o aglutinante para la proteína OB es un receptor de la proteíña OB o porción del mismo,- tal como una porción soluble del mismo. Pueden obtenerse otras proteínas aglutinantes examinando la proteína OB, o la proteína de elección, en el suero, o ser seleccionada empíricamente por la presencia de la unión o aglutinación. Tal unión o aglutinación típicamente no interferirá con la capacidad de la proteína OB o análogo o derivado para unirse al receptor de la proteína OB endógena y/o afectar la transducción de la señal. Además de la proteína OB, también serán aplicados complejos de unión a otras -proteína terapéuticas de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de determinar las proteínas de unión apropiadas para utilizarse con la presente invención.

Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida de la presente invención pueden ser administradas por vía oral (por ejemplo, cápsulas tales como cápsulas duras y cápsulas blandas, preparaciones sólidas tales como granulos, tabletas, pildoras, trociscos o pastillas, sellos, perlas, polvos y formas liofilizadas, preparaciones líquidas tales ~ como suspensiones) y preparaciones no orales (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, transdérmica, visceral, IV (intravenosa) , IP (intraperitoneal) , intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, inyectable, pulmonar, nasal, rectal, y preparaciones transmucosas uterinas) . En general, están comprendidas por la invención las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida que comprenden cantidades efectiva de proteína, o productos derivados, con las composiciones de liberación sostenida de la invención junto con diluentes, preservativos, solubilizantes, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables necesarios para la administración. Véase la PCT 97701331 incorporada aquí como referencia. La formulación farmacéutica óptima para un agente biológicamente activo deseado será determinada por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosis deseada. Las composiciones farmacéuticas ejemplares se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18ava Edición, _ Easton, PA, páginas 1435-1712 (1990)). Los componentes que pueden ser necesarios para la administración incluyen diluentes que contienen varios amortiguadores (por ejemplo, Tris-HCl, acetato) , pH y fuerza iónica; aditivos tales como tensoactivo y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, HCO-60, Polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, glutatión, metabisulfito de sodio) , polisacáridos adicionales (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginato de sodio, hialuronato de sodio, sulfato de protamina, polietilen glicol) , preservativos (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico, metil parabeno, propil parabeno) y sustancias diluentes (por ejemplo, lactosa, manitol) ; la -incorporación del material en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como polímeros o copolímeros de ácido poliláctico/poliglicólico, etc, o combinados con liposomas. También puede utilizarse ácido hilaurónico como un componentes de administración y"" este pueden tener el efecto de promover aún más la duración sostenida en la circulación. Adicionalmente, las composiciones de liberación sostenida de la presente invención también pueden ser dispersadas con aceite (por ejemplo, aceite cíe ajonjolí, aceite de maíz, vegetal) , o una mezcla de los mismos con un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) , o triglicéridos de ácido graso de cadena media (por ejemplo, Migliol - 812) para proporcionar la suspensión oleosa. Las composiciones de la presente invención también pueden ser dispersadas con agentes dispersantes tales como polisacáridos solubles en agua (por ejemplo, manitol, lactosa, glucosa, almidones), ácido hialurónico, glicina, fibrina, colágeno y sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de sodio) . Además, también se contemplaron para utilizarse en la administración de las composiciones de liberación sostenida de la presente invención dispositivos mecánicos diseñados para la liberación " pulmonar de los productos terapéuticos, Incluyendo pero sin limitarse a nebulizadores, inhaladores de dosis medida, e inhaladores de polvos, todos los cuales son familiares a aquellos expertos en la técnica. Los componentes de la administración puede tener influencia sobre el ' estado físico, estabilidad, velocidad de alivio in vivo, y velocidad de eliminación in vivo de las proteínas y derivados de la presente. Un experto en la técnica apreciará los componentes de administración apropiados y/o los dispositivos mecánicos apropiados para utilizarse dependiendo del uso terapéutico, la ruta de administración, la dosis deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, estabilidad de la proteína y otras consideraciones.

Métodos de Uso Terapéuticos . Los usos terapéuticos dependen del agente biológicamente activo utilizado. Un experto en la técnica será capaz de adaptar fácilmente un agente biológicamente activo deseado a la presente invención para sus usos terapéuticos pretendidos. Los usos terapéuticos de tales agentes se exponen con mayor detalles en las siguientes publicaciones incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos. Los usos terapéuticos incluyen, pero no se limitan, a usos para genes similares a los interferones (véanse las Patentes Estadounidenses Nos. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471, y 4,695,623 incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos) , interleucinas (véase, la Patente Estadounidense No. 5,075,222, incorporada aquí como referencia, incluyendo los dibujos), eritropoyetinas (véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933, y 5,621,080, incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos), factores estimulantes de la colonia granulocítica _ (véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823 y la Publicación PCT No. 94/17185 incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos) , factor de las células no diferenciadas (Publicaciones PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206 incorporadas aquí como referencia, incluyendo los dibujos), y la proteína OB (Publicaciones PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816 incorporadas aquí como referencia, incluyendo las figuras). Además, los usos terapéuticos de la presente invención incluyen usos de agentes biológicamente activos incluyendo, pero sin limitarse a productos antiobesidad relacionados, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , hormona luteinizante (LH) , hormona estimulante del folículo (FSH) , hormona gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleucinas (IL-1 a IL-12), factor de la necrosis tumoral (TNF) , proteína de unión del factor de la necrosis tumoral (TNF-bp) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , factor" neurotrófico derivado del tejido glial (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3) , factores del crecimiento de los fibroblastos (FGF) , factor del crecimiento neurotrófico (NGF) , " factores del crecimiento óseo tales como la osteoprotegerina (OPG) , factores del crecimiento similares a la insulina (IGF), factor estimulante de la colonia de los macrófagos (M-CSF) , factor estimulante de la colonia de los macrófagos granulocíticos (GM-CSF) , factor del crecimiento derivado de los megaqueratinocitos (MGDF) , trombopoyetina, factor del" crecimiento derivado de las plaquetas (PGDF) , factores del crecimiento estimulantes de colonias (CSF) , proteína morfogenética ósea (BMP) , superóxidodismutasa (SOD) , activador del plasminógeno tisular (TPA) , urocinasa, estreptocinasa y calicreína. El término proteínas, como se utiliza aquí, incluye a los péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados o combinaciones de los mismos. Además, las composiciones de la presente también pueden ser utilizadas para manufacturar uno o más medicamentos para el tratamiento_ o alivio de las condiciones que pretende tratar el agente biológicamente activo. A manera de ejemplo, también pueden lograrse usos terapéuticos de oxigenación de la sangre y una disminución de la resorción ósea u osteoporosis en ausencia de pérdida de peso. ~ Terapias combinadas . Las composiciones y métodos de la presente pueden ser utilizados en conjunto con otras terapias, tales como dieta alterada y ejercicio. Otros medicamentos, tales como aquellos útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina, y posiblemente amilina) , medicamentos para disminuir el colesterol y la presión sanguínea (tales comoT aquellos que reducen los niveles de lípidos en sangre u otros medicamentos cardiovasculares) , medicamentos que incrementan la actividad (por 'ejemplo, anfetaminas) , diuréticos (para la eliminación de líquido), y supresores del apetito. Tal administración puede ser simultánea o puede ser in seriatum. Además, los métodos de la presente pueden ser utilizados en conjunto con procedimientos quirúrgicos, tales como cirugías cosméticas diseñadas para alterar la apariencia total de un cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías con láser diseñadas para reducir la masa corporal, o cirugías de implantes diseñadas para mejorar la apariencia de la masa corporal) . Los beneficios a la salud de las cirugías cardiacas, tales como las cirugías de desviación u otras cirugías diseñadas para aliviar una condición dañina causada por el bloqueo de vasos sanguíneos por depósitos de grasa, tales como placas arteriales, pueden incrementarse con el uso concomitante de las composiciones y métodos de la presente. Los métodos para eliminar cálculos biliares, tales como métodos ultrasónicos o láser,' también pueden ser utilizados ya sea antes, durante o después de un curso de los métodos terapéuticos de la presente. Además, los métodos de la presente pueden ser utilizados como adjuntos a cirugías o terapias para huesos rotos, músculos dañados u otras terapias que pudieran ser mejoradas por un incremento en la masa de tejido magro . _ Dosis Un experto en la técnica será capaz de determinar las dosis efectivas mediante la administración y observar el efecto terapéutico deseado. La dosis de la preparación de liberación sostenida es la cantidad necesaria para alcanzar la concentración efectiva del agente biológicamente activo in vivo, durante un periodo de tiempo dado. La dosis y frecuencia de administración preferida de las preparaciones de liberación sostenida varía con el tipo de agente biológicamente activo, la duración deseada de la liberación, la enfermedad objetivo, la frecuencia de administración deseada, las especies animales objeto y otros factores. De manera preferible, la formulación de la molécula será tal que entre aproximadamente 0.10 ug/kg/día y 100 mg/kg/día producirán el efecto terapéutico deseado. Las dosis efectivas pueden ser determinadas utilizando las herramientas de diagnóstico sobre el tiempo. A manera de ejemplo, la presente invención proporciona la dosis de proteína OB. Por ejemplo, puede utilizarse primero un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB en la sangre (o plasma o suero) para determinar los niveles endógenos de proteína OB. Tal herramienta de diagnóstico puede _estar en forma de un ensayo de anticuerpo, tal como un ensayo de emparedado de anticuerpo. La cantidad de proteína OB endógena se cuantifica inicialmente, y se determina el nivel basal. Las dosis terapéuticas se determinan a medida que continúa la cuantificación de proteína OB endógena y exógena (es decir, la proteína, análogo o derivado encontrado dentro del cuerpo, ya sea producido o administrado) durante el curso de la terapia. Por ejemplo, puede ser necesaria inicialmente una dosis relativamente alta, hasta que se observe un beneficio terapéutico, y a continuación se utilizan dosis más bajas para mantener los beneficios terapéuticos .

Métodos de Preparación Preparación de Perlas de Proteina/Alginato . Un procedimiento típico es el ilustrado por el siguiente ejemplo que utiliza la proteína OB o leptina como la proteína de elección. Un experto en la técnica comprenderá y será capaz de aplicar esos procedimientos a otros agentes biológicamente activos .

Preparación de la Mezcla de Goteo. El término "mezcla de goteo" como se utiliza aquí se refiere a la mezcla que _contiene el polímero hidrofílico y al agente biológicamente activo. Se agrega un mL de mezcla de alginato al 5% (TRIS 10 mM; pH 8), con agitación magnética, a 4 mL de leptiria (100 mg/mL; TRIS 10 tmM; pH 8) en un vaso de precipitados de 10 mL (en un baño de hielo) . La mezcla se torna turbia. A continuación se agregan 40 mcL de NaOH 4 mM a la mezcla y se continúa agitando durante 15 minutos (sobre hielo) . La mezcla se aclara y su pH final está entre aproximadamente 8.6 a 8.8. La concentración de alginato deberá ser de al menos el 0.05% en peso. Además, el alginato deberá ser preferible al menos 30% de ácido gulurónico. Además de lo anterior, puede agregarse polietilen glicol- a la mezcla de goteo como se discute más adelante. De igual modo, los amortiguadores o excipientes son útiles para la estabilidad de la proteína de elección. Un experto en la técnica será capaz de determinar los ingredientes apropiados que deberán ser agregados para propósitos de estabilidad dependiendo de la proteína elegida para la liberación.

Preparación De La Mezcla de Baño. El término "mezcla de baño" como se utiliza aquí se refiere a la mezcla que contiene los agentes precipitantes utilizados para la coprecipitación del agente biológicamente activo y el polímero hidrofóbico. El baño típicamente contiene 10 mL de mezcla "en un vaso de precipitados de 50 mL que consiste de CaC12 100 mM más otros ingredientes (véase más adelante) . El pH es preferiblemente ácido para ayudar a disminuir el efecto de la irrupción. El pH deberá ser preferiblemente menor de pH 4. El —amortiguador en el baño también dependerá de la proteína utilizada. Un experto^en la técnica será capaz de ajustar la capacidad amortiguadora o fuerza sobre la base de la proteína utilizada. Dependiendo de este modo de la estabilidad de la proteína, si la concentración de amortiguador es demasiado alta, por ejemplo, con G-CSF, la proteTna puede parecer menos estable y disminuirá la liberación sostenida. El baño puede estar comprendido de CaC12, ZnC12, polietilen glicoles ("PEG") y amortiguadores ácidos. El zinc interactúa con la proteína precipitando ésta, ayudando por lo tanto a incrementar la carga de la perla, disminuye el efecto de la irrupción y hace lenta la liberación de la proteína de la perla. El calcio ayuda a formar el precipitado de alginato y a la formación de la perla. El calcio también ayuda a la forma de la perla, especialmente si el baño es viscoso debido a la adición de otros aditivos tales como el PEG. El calcio puede incrementarse cuando se tiene una mayor viscosidad para ayudar a mantener la forma de la perla. La concentración de zinc deberá ser de al menos 0.1 mM y la concentración del calcio deberá de al menos lOmM. La adición de PEG ayuda a incrementar la carga. Se sabe que ciertos PEG precipitan proteínas. El PEG también puede ser agregado a la mezcla ~de proteína/alginato que es goteada en el baño para ayudar_ a maximizar la carga y la liberación sostenida. El peso molecular del PEG puede fluctuar de 700 kDa a 1000 kDa, pero de manera preferible de 700 Da - 100 kDa. Un experto en la técnica será capaz de determinar la cantidad de PEG que debe agregarse a la mezcla de baño pero esta puede ser tan alta como de 99%, de manera preferible menor del 75% en peso. Un experto en la técnica estará consciente de que la concentración de PEG puede ser limitada por la viscosidad del baño.

Preparación de la Perla . En general, las gotas de la mezcla de goteo de leptina/alginato son rociadas, sumergidas o dispersas en una mezcla de baño (como se describió anteriormente) . Además, pueden utilizarse medios electrostáticos para la formación de la perla. Para producir perlas pequeñas, es decir, de menos de unos cuantos cientos de micrones de diámetro, se utiliza una cámara de flujo (boquilla) que consiste de una aguja con un fluj"o de aire coaxial. Una de las dos puertas es conectada l a una línea de gas y la otra puerta a una jeringa (3 mL) utilizada para moldear (a aproximadamente 1 mL/min la mezcla de proteína/alginato en el baño) . Típicamente se inyectan 2 mL de mezcla en 10 mL de mezcla de baño. La boquilla se coloca"a aproximadamente 0.8 cm de la parte superior del vaso de precipitados del baño. El tamaño de la perla es determinado principalmente con la velocidad de flujo del gas, por ejemplo, a una velocidad de flujo de 8 L/min el tamaño de la perla fluctúa de 50-150 micrones de diámetro. La velocidad de flujo de la leptina/alginato tiene un efecto mucho menor sobre el tamaño de la perla. Para perlas grandes (es decir, de 1-3 mm de diámetro) , se utiliza una jeringa de tuberculina de 1 circuito, equipada con una aguja 24G para gotear la mezcla de leptina/alginato en la mezcla de baño. El baño típicamente contiene 1.5% de CaC12 y ZnCl2 de 5 a 50 mM. Las perlas se recolectan vertiéndolas a través de un depurador de células de nylon de 40 micrones. Las perlas se enjuagan sobre el depurador con 5 mL de agua estéril y se secan suavemente desde el lado inferior del depurador con un paño doméstico (barrido gamma 67) . Las perlas se almacenan en un microtubo con tapa roscada estéril.

Carga de la Perla Método de la irrupción: La carga del fármaco de un grupo seleccionado de perlas se determina exactamente pesando 100 mg de las perlas cargas, hidratadas, en 1 mL de citrato de sodio 0.5M, pH 8.5. La suspensión de perlas se incuba a temperatura ambiente hasta que las perlas se desintegran formando usualmente un precipitado. La suspensión se centrifuga a 14K rpm durante 2 minutos, (eppendorf, 5415 C) . El sobrenadante se enfría y se registra la absorbancia a 280 nm. El precipitado se disuelve suspendido este en 1 mL de urea 7M. Se registra la absorbancia de esta .mezcla. La carga de proteína de las perlas cargadas, hidratadas, se expresa como mg de proteína por mg de perlas o mg de proteína por mL de perlas y se determina a partir de la suma de las dos absorbancias .

~ — Método Acumulativo : Éste método se utiliza en conjunto con los estudios de liberación in vitro. La cantidad de proteína liberada de las perlas incluye las irrupciones al final del estudio que se totalizan. Para los detalles, véase más adelante.

Estudios de Liberación In Vitro Se pesaron perlas cargadas, hidratadas (100 mg) en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL (eppendorf) y se les agregó 1 mL de amortiguador (histidina 10 mM, pH 7.4) . la muestra se colocó en un agitador incubador a 37 °C y 100-200 rpm. A intervalos de tiempo seleccionados, se removieron muestras del incubador, se centrifugaron (eppendorf, 1000 rpm, 2 minutos) y se removió ~el sobrenadante y se colocó nuevamente con 1 mL de amortiguador fresco. La cantidad de proteína liberada se determinó a partir de la absorbancia del sobrenadante. Después de haber tomado la muestra liberada final se determinó la cantidad dejada en las perlas por el Método de Carga/Irrupción de Perlas. El por ciento liberado a un tiempo dado se determinó a partir de la suma de la proteína total liberada y lá restante en las perlas al completar el experimento. — Estudios In Vivo Pérdida de Peso en Ratones : En general, los ratones son inyectados una vez con una suspensión de las perlas cargadas o perlas no cargadas. Se utilizan ratones hembra de seis a ocho semanas de edad (tipo C57/BLC) , con un peso típico de 20 gramos. En el caso-de las muestras de perlas, se agregan 350 mcL de amortiguador (MES 50 mM pH6.7) a 100 mg de perlas hidratadas y se agita vorticialmente . La suspensión se extrae en una jeringa de Ice y todas las perlas y 300 mcL del amortiguador se inyectan (aguja 23G) subcutáneamente en el cuello del ratón. Los ratones son pesados diariamente.

Estudio Farmacocinético en Ratas : Se utilizan ratas hembra de seis a ocho semanas de edad (tipo Sprague Dawley) , con un peso típico de 250 gramos. Las inyecciones se efectúan de manera similar a la descrita en los experimentos de pérdida de peso en ratones. La sangre se muestrea por recolección por catéter a varios intervalos de tiempo después de la inyección y las muestras se analizan para detectar leptiña por medio de un ensayo ELISA.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar de manera más completa la invención, pero no deben constituirse en limitantes del alcance de la misma. Además, con respecto a la descripción anterior o los ejemplos siguientes, un experto en la técnica será capaz de hacer los cambios necesarios a las descripciones para la producción a gran escala .

Ejemplo 1 Este ejemplo examina el efecto de la concentración de leptina en las perlas sobre la liberación de la leptina de perlas de alginato coprecipitadas con zinc/leptina . Las pequeñas perlas se prepararon como se describió anteriormente utilizando ZnC12 25 mM en el baño. La perla de mayor concentración, es decir, 66 mg/mL de leptina, se preparó utilizando 84 mg/mL de leptina en alginato al 1% mientras que la pe la de menor concentración, es decir, de 21 mg/mL de leptina se preparó a partir de 21 mg/mL de leptina en alginato al 1%. Cuando la concentración de la leptina en la perla _se incrementa la liberación fraccionada de leptina de la perla disminuye. Para la mayor concentración se libera el 25% de la leptina a las 80h, mientras que para la menor concentración se libera el 80% a las 80h.

Ejemplo 2 " Este ejemplo examina el efecto del nivel de ZnC12 en el- baño sobre la liberación de leptina de las perlas de alginato coprecipitadas con zinc/leptina . Las pequeñas perlas se prepararon "cómo- s describió anteriormente pero el nivel de ZnCl2 en el baño es a 0.5 y 25 mM y la concentración de la leptina en las perlas es de 37 mg/mL (por el método acumulativo) . Este ejemplo muestra que el nivel de ZnC12 en el baño incrementa las perlas resultantes que tienen una menor irrupción y una menor velocidad de liberación de leptina. A ZnCl2 0.5 mM, las perlas tienen una irrupción del 20% y una liberación del 50% a las 40h; mientras que a ZnC12 25mM las perlas tienen una irrupción menor del 5% y una liberación del 25% a las 40h.

Ejemplo 3 Este ejemplo compara una perla de alginato coprec±pitada con zinc/leptina con una formulación de amortiguador de acetato control „(20 mg/mL) en un experimento farmacocinético/de bioactividad combinado. Las pequeñas perlas contienen 64 mg/mL de leptina (es decir, por mL de perlas) y se fabricaron como se describió anteriormente con ZnC12 17 mM en el baño. A las ratas hembra (con un peso corporal de 220g) se les administró una sola inyección SC (subcutánea) a una dosis de 50 mg/kg. Las concentraciones de plasma de la muestra de perlas es sostenida con relación a la del control. Las ratas inyectadas con muestras de la perla mantienen una concentración de leptina en el plasma de más 50 mg/mL durante 112 h en contraste con las 12-18 h para los animales control. Los mayores niveles de leptina en sangre más sostenidos en el grupo con perlas se correlacionan con su pérdida de peso más pronunciada y sostenida en comparación con el grupo control. Las ratas inyectadas con muestras de la perla pierden continuamente peso durante 120h; a las 120h la pérdida total de peso es 9% del peso inicial. En contraste, las ratas control pierden 7% de su peso inicial en 50h pero ganan nuevamente el peso a las 120h.

Ejemplo 4 Este ejemplo muestra el efecto de varios PEG en el baño, además del ZnCl2 10 mM, sobre la eficiencia de la carga y la liberación in vi tro de IL-lra. Las pequeñas perlas se prepararon como se describió anteriormente con IL-lra en PIPES 10 mM pH 6.85. Un baño de perla (A) contiene CaC12 lOOmM, 'znC12 10 mM, 20% de 1K PEG y 20% de 2K PEG. Un segundo baño de perla (B) contiene lo mismo que A pero sin 20% de 1K PEG. La concentración de IL-lra en las perlas A y B es de 58 mg/mL7 es decir, una eficiencia de la carga de 74% de acuerdo a lo determinado a partir de la irrupción de citrato de sodio. La formulación B tiene una irrupción de 55% y una liberación del 75% después de 18h. La formulación A tiene una irrupción del 20% y una liberación del 50% después de 18h. De este modo la adición de PEG en el baño conduce a perlas altamente cargadas que sostienen la liberación sobre la proteína, -. También, la adición de 1K PEK conduce a una irrupción aún menor y una liberación más lenta de la proteíña .

Ejemplo 5 Este ejemplo muestra el efecto de tener PEG, pero no zinc, en el baño sobre la carga de y la irrupción inicial de IL-lra de perlas de alginato. Las perlas pequeñas se prepararon como se describió anteriormente, excepto que el baño contiene 20% de 1K y 20% de 2K PEG además de CaC12 100 mM. La^ eficiencia de la carga es del 93% con 63 mg/mL de IL-lra en la perla. La irrupción inicial es de 35%. De este modo, la adición de PEG al baño puede conducir a una alta carga de proteína sin la presencra de iones zinc.

Ejemplo 6 En este ejemplo se hace una comparación de la efectividad de la liberación de la inyección de un bolo de IL-lra en amortiguador (PIPES 10 mM, pH6.85) y el IL-lra en las perlas de alginato del Ejemplo 1. Se inyectaron SC (subcutáneamente) a ratones Balb/C hembra (peso corporal de 20g) _ al tiempo cero con las diferentes formulaciones, conteniendo cada una 10 mg de IL-lra. A las 18h los ratones son inyectados IV (intravenosamente) con rhIL-lB (0.1 mcg por ratón) y a continuación se sacrificaron 2h después del muestreo de sangre. La sangre se analizó para determinar la concentración de glucosa y el lúmero de linfocitos. La IL-lbeta normalmente causa una caída en la concentración de glucosa y el número de linfocitos, pero la presencia de un cierto nivel de IL-lra protege contra tal pérdida. El resultado del experimento muestra que únicamente los ratones que recibieron la IL-lra contenida en las perlas son protegidos contra la pérdida en el valor de los parámetros de la sangre. Estos resultados demuestran que las perlas de alginato sostienen la liberación de la IL-lra a un nivel efectivo durante al menos 18h.

Ejemplo 7 Este ejemplo es un experimento control que ilustra la preparación y liberación de perlas que contienen proteína utilizando GCSF, donde el baño de precipitación contiene únicamente CaC12 (100 mM) . Las perlas grandes se prepararon como se describió anteriormente. La mezcla de la jeringa contiene 26 mg/mL de GCSF (TRIS 10 mmM pH7) en alginato al 1%. Las perlas preparadas contienen 16 mg/mL de GCSF (de la irrupción de citrato) . De este modo con únicamente CaC12 en el baño la eficiencia de la carga es del 35%. La liberación fraccionada de la proteína muestra una irrupción del 60% y una liberación de 75% en un día. De este modo utilizando un procedimiento conocido descrito en la literatura se obtiene una baja carga de proteína y una rápida liberación.

Ejemplo 8 Este ejemplo muestra el efecto del ZnC12 en el baño sobre la carga y liberación del GCSF en perlas de alginato. Las perlas grandes se prepararon como se describió anteriormente excepto que se agregó ZnC12 10 mM al baño. La mezcla de la jeringa contiene 46 mg/mL de GCSF en alginato al 1%. Las perlas preparadas contienen 28 mg/mL de GCSF (de la irrupción de citrato) . De este modo con la adición de ZnC12 10 mM al baño (además de CaC12_100 mM) la eficiencia de la carga se incrementa del 35% (Ejemplo 6) al 61%. La liberación fraccionada de la proteína muestra una irrupción reducida del 40% y una liberación del 55% "en un día. De este modo la adición de ZnCl2 al baño de CaC12 conduce a una mayor eficiencia de la carga, una menor irrupción y una menor liberación de la proteína.

Ejemplo 9 Este ejemplo muestra el efecto de tener PEG en el baño con el pH del baño siendo ácido sobre la carga y liberación del GCSF con perlas de alginato. Las perlas grandes se prepararon como se describió en el Ejemplo 7 excepto que se agregó 20% de PEG (Aldrich) al baño y el pH del baño es de 1.7. El baño también contiene CaC12 100 mM y ZnC12 10 mM. La eficiencia de la carga para el GCSF es del 54% y la liberación fraccionada (25 mg/mL en las perlas) muestra una irrupción mucho más reducida de menos del 5% y 40% de liberación después de 100 horas. De este modo una mezcla de baño ácido que puede contener PEG (además de CaC12 y ZnC12) conduce a una irrupción más baja y a una liberación más lenta de la proteína.

Ejemplo 10 Este ejemplo muestra el efecto de tener PEG y zinc en el baño y el pH del baño disminuido con agentes acidificantes sobre la carga y la irrupción inicial del GCSF de las perlas de alginato. Las perlas grandes se prepararon como se describió anteriormente, excepto que el baño contiene ZnC12 25 mM, CaC12 100 mM, y 5% de PEG 1K y 5% de PEG 10K. El pH del baño se disminuyó con amortiguador de glicina y ácido fosfórico a pH 1.65. Las perlas resultantes (carga de 20 mg/mL) exhibieron una irrupción de menos del 5% y una liberación fraccionada del 40% en 90h. De este modo una combinación de PEG y zinc '..- y un bajo pH en el baño conduce a una irrupción baja y una liberación lenta.

Ejemplo 11 Este ejemplo muestra _ la preparación de GCSF en perlas de alginato con PEG en un baño de pH bajo sin la adición de iones zinc. Las pequeñas perlas se prepararon como se describió anteriormente excepto que el baño contiene 5% de 1K y 5% de 10K PEG. El pH del baño se disminuyó a 1.43 utilizando amortiguador de glicina y ácido fosfórico. La eficiencia de la carga es de 42% por 14 mg/mL en las perlas (de la irrupción de citrato) . La liberación fraccionada muestra una irrupción de 32% y una liberación del 35% después de 70hT Ejemplo 12 Las perlas grandes de GCSF/alginato del Ejemplo 12, y los Ejemplos 13-15 posteriores, se prepararon de una manera similar a la descrita anteriormente pero con un control más estricto de la sincronización de las diferentes operaciones y un método alternativo para determinar la carga. De manera más específica, se sumergió 1 mL de mezcla de GCSF/alginato en 10 mL de un baño con agitación magnética aproximadamente 2 minutos. Las perlas se filtraron" y lavaron con 5 mL de agua.

El procedimiento total para producir la perla toma aproximadamente 5 minutos. La carga se determinó (por A280) a partir de la diferencia en la cantidad de proteína en la mezcla de alginato sumergida en el baño y la proteína que no quedó incorporada en las perlas formadas, es decir, la proteína remanente en la mezcla de baño y los lavados. Esta cantidad de proteína incorporada en las perlas se dividió por ~el volumen de 1 mL de la mezcla agregada al baño para obtener la carga expresada en mg/mL de perlas. El Ejemplo 12 compara la presencia de PEG en el baño sobre la carga de GCSF en las perlas. Las perlas grandes se prepararon como se describió anteriormente, excepto que el baño contiene CaC12 200 mM y 15% de PEG 8K (pH 5-6) ; el baño de las perlas control tienen CaC12 200 mM. La adición de PEG al baño incrementa la carga de 21.8 mg/mL (eficiencia del 70%) a 26.5 mg/mL (eficiencia del 85%).

Ejemplo 13 Este ejemplo muestra el efecto de bajar el pH del baño sobre la carga y liberación del GCSF con perlas de alginato. La formación de la carga de la perla se determinó como en el Ejemplo 12 con PEG excepto que uno de los baños contiene amortiguador de glicina 0.5 M pH 2.1. La carga a pH 2.1, 24.9 mg/mL (eficiencia del 80%), es similar a la del control". Sin embargo, la liberación inicial a una hora (29%) es menor y la liberación a las 24 h es más sostenida (32%) que la del control (92% a 99% respectivamente) .

Ejemplo 14 Este ejemplo muestra el efecto de la adición de zinc a un baño que contiene PEG sobre la carga de GCSF en perlas de alginato. La formación y carga de la perla se determinaron como en el Ejemplo 12 con PEG. La adición de ZnC12 10 mM al baño incrementó la carga de 26.5 mg/mL (eficiencia del 85%) a 30.3 mg/mL (eficiencia del 97%).

Ejemplo 15 Este ejemplo muestra la irrupción inicial y una liberación sostenida bajas del GCSF de las perlas de alginato. La formación, carga y liberación de la perla se efectuaron de manera similar a la del EJEMPLO 13 excepto que el baño contiene CaC12 100 mM, 5% de PEG 1K y 5% de PEG 2K, y amortiguador de glicina 0.5 M (pH 2.1). Las perlas cargadas contienen 24 mg/mL de GCSF. A lá 1/2 h la liberación inicial es casi cero, a las 19 h la liberación es del 13.6% y a las 44 h la liberación es del 24%.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una composición de liberación sostenida, caracterizada porque comprende: a) un polímero hidrofílico; b) un agente biológicamente activo; y c) al menos un agente precipitante; caracterizada porque el agente biológicamente activo coprecipita dentro del polímero hidrofílico.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente precipitante se selecciona del grupo que ^consiste de iones metálicos polivalentes o sales, acetatos, citratos, cloruros, carbonato o hidróxidos de los mismos.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el ion metálico se selecciona del grupo que consiste de manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, aluminio o zinc.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el agente precipitante es un ion polivalente seleccionado del un grupo que consiste de zinc, calcio o una combinación de los mismos.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero hidrofílico es un polianión.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero hidfofílico es un polisacárido.

7. La composición" de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el polímero hidrofílico es un polisacárido ácido.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el polisacárido es alginato. ""

9. La composición _ de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el alginato contiene al menos 30% de ácido gulurónico.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el alginato consiste de al menos 0.05% en peso.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente biológicamente activo comprende una proteína.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteína consiste de al menos 0.01 mg/mL.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, factores antiobesidad, factores de crecimiento, factores tróficos, y factores antiinflamatorios.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de leptina, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-lra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferones, eritropoyetina, KGF y análogos o derivados de los mismos.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende, además, al menos dos agentes precipitantes.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque al menos uno de los agentes precipitantes se selecciona del grupo que consiste de polímeros solubles en agua.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el polímero soluble en agua" es polietilen glicol.

18. Un método para producir una composición de liberación sostenida, caracterizado porque comprende los pasos de: a) disolver un agente biológicamente activo y un polímero hidrofílico con un solvente para formar una primera mezcla; b) disolver al menos un agente precipitante en un solvente para formar una segunda mezcla; c) agregar la primera mezcla con la segunda mezcla; y d) coprecipitar el agente biológicamente activo con el polímero hidrofílico para formar una partícula coprecipitada .

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente precipitante se selecciona del grupo que consiste de iones metálicos polivalentes o sales, acetatos, citratos, cloruros, carbonato o hidróxidos de los" mismos.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el ion metálico se selecciona del grupo que consiste de manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, aluminio o zinc.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente precipitante es un ion polivalente seleccionado del grupo que consiste de zinc, calcio o una combinación de los mismos.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agente precipitante en la segunda mezcla consiste de al menos 1 mM de calcio y 0.1 M de zinc

23. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el -polímero hidrofílico es un poli-anión.

24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el polímero hidrofílico es un polisacárido.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el polisacárido es un polisacárido ácido.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polisacárido es alginato.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el alginato contiene al menos 30% de ácido gulurónico.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la primera mezcla consiste de al menos 0.05% en peso de alginato.

29. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente biológicamente activo comprende una proteína.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la primera mezcla consiste de al menos 0.01 mg/mL de proteína.

31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que __consiste de factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, factores antiobesidad, factores de crecimiento, factores^tróficos, y factores antiinflamatorios.

32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de leptina, G-CSF, SCF, BDNF, OPG, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-lra, IL2, TNF-bp, MGDF, interferones, eritropoyetina, KGF y análogos o derivados de los mismos.

33. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende, además, al menos dos agentes precipitantes en la segunda mezcla. 3 . El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque al menos uno de los agentes precipitantes se selecciona del grupo que consiste de polímeros solubles en agua. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el polímero soluble en agua es polietilen glicol. 36. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la adición de la primera mezcla a la segunda mezcla ocurre por rocío, campos electrostáticos, adición por goteo, dispersión o mezclado para formar las partículas coprecipitadas . 37. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende, además, el paso de aislar la partícula coprecipitada. 38. El producto de liberación sostenida, caracterizado porque se produce por el método de conformidad con las reivindicaciones 18, 36 y 37. 39. Una formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 15 en un portador, diluente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 40. Un método para tratar una indicación con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 15 caracterizado porque está en un portador, diluente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 41. Un método de tratamiento de un padecimiento, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste del exceso de peso, diabetes, alto- nivel de lípidos en sangre, esclerosis arterial, placa arterial, la reducción o prevención de la formación de cálculos biliares, masa de tejido magro insuficiente, sensibilidad insuficiente a la insulina y apoplejía, con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 15 en un portador, diluente o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde el agente biológicamente activo es leptina, un análogo o derivado del mismo. 42. Un método para tratar un padecimiento seleccionado del grupo caracterizado porque consiste de deficiencias de las células hematopoyéticas, infección, u neutropenia con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 15 en un portador, diluente o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde el agente biológicamente activo es G-CSF, un análogo o derivado del mismo. 43. Un método para tratar la inflamación con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 15 en un portador, diluente o adyuvante farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque el agente biológicamente activo es un IL-lra, un análogo o derivado del mismo,