MXPA99009384A - Composiciones que comprenden conjugados de la proteína ob de humano estable, activa con anticuerpo de cadena fc y métodos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a las composiciones y los métodos relacionados de la proteína OB. Se proporcionan aquísuspensiones de la proteína OB que son estables y activas a pH fisiológico. Tales suspensiones de la proteína OB son usadas para el tratamiento o modulación del nivel de adiposidad de peso, diabetes, y otras condiciones.

Description

COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN CONJUGADOS DE LA PROTEÍNA OB DE HUMANO ESTABLE, ACTIVA CON ANTICUERPO DE CADENA FC Y MÉTODOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a las composiciones de la proteína OB de humano estable, activa a altas concentraciones y en o cerca del pH fisiológico. También se proporcionan las composiciones relacionadas, los métodos de elaboración y los métodos para usar tales composiciones.

Antecedentes Aunque la base molecular para la obesidad es ampliamente desconocida, la identificación del gen "OB" y la proteína codificada ("proteína OB") ha proporcionado algo de claridad en los mecanismos que el cuerpo usa para regular la deposición de grasa corporal. Zhang et al., Naturé 372 : 425-432 (1994); ver también, la Correction at Nature 374 : 479 (1995) . La publicación del PCT No. WO 96/05309, publicada el 22 de febrero, 1996, titulada, "Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof" REF.: 31377 establece completamente a la proteína OB y las composiciones y métodos relacionados, y se incorpora aquí por referencia. Una secuencia aminoácido para la proteína OB de humano, se establece en la WO 96/05309 (incorporada aquí por referencia) SEC ID NOS. 4 y 6 (en las páginas 172 y 174 de tal publicación), y el residuo del primer aminoácido de la proteína madura está en la posición 22 y es un residuo valina. La proteína madura es de 146 residuos (o 145 si la glutamina en la posición 49 está ausente, SEC ID NO. 6) .

La proteína OB es activa in vivo en los ratones ob/ob mutantes (ratones obsesos debido a un defecto en la producción del producto del gen OB) así como en ratones normales, ratones de tipo silvestre. La actividad biológica se manifiesta entre otras cosas en, pérdida de peso. Ver en general, Baringa, "Obese Protein Slims Mice, Science 269 : 475:476 (1995) and Fpedman, "The Alphabet of Weight Control, " Nature 385 : 119-120 (1997) . Se conoce, por ejemplo, que en los ratones ob/ob mutantes, la administración de la proteína OB resulta en una disminución de los niveles de insulina en suero, y los niveles de glucosa en suero. También se conoce que la administración de la proteína OB, resulta en~~una disminución en la grasa corporal. Esto se observó en los ratones mutantes ob/ob, así como en ratones normales no obesos. Pelleymount er et al., Science 269 : 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269 : 543-546 (1995) . Ver también, Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) (Peripheral and central admmistrat ion of microgram doses of OB protein reduced food intake and body weight of ob/ob and diet-induced obese mice but not in db/db obese mice.) En ninguno de estos reportes se han observado toxicidades, aún en las dosis más elevadas.

Para la preparación de una composición farmacéutica para la inyección en humanos, se ha observado que la secuencia de aminoácido de humano es insoluble a pH fisiológico a concentraciones relativamente altas, tal como por encima de aproximadamente 2 mg de la proteína activa/mililitro del líquido. Las dosificaciones en el rango del miligramo de proteína por kilogramo de peso corporal, tal como 0.5 o 1.0 mg/kg/día, son deseables para la inyección de cantidades terapéuticamente efectivas en mamíferos grandes, tal como humanos. Un aumento en la concentración de la proteína,~ es necesario para evitar la inyección de grandes volúmenes, que pueden ser no confortables o posiblemente dolorosos para el paciente.

Con los avances en la tecnología del ADN recombinante, la disponibilidad de las proteínas recombinantes para el uso terapéutico, ha engendrado avances en la formulación de proteínas. Un artículo de revisión que describe la modificación de proteínas y la fusión de proteínas es Francis, Fo cus on Growth Fa c t ors 3_:4-10 (1992) .

Una de tales modificaciones es el uso de la región Fe de inmunoglobulinas . Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que enlaza al antígeno y un dominio constante, conocido como "Fe" que proporciona el enlace a las funciones efectoras tal como las células de complemento o fagocíticas. La porción Fe de una inmunoglobulina tiene una vida media de plasma larga, mientras que la Fab es de vida corta. Capón et al., Nature 337 : 525-531 (1989) .

Las proteínas terapéuticas se han construido usando el dominio Fe para proporcionar vida media mayor o para incorporar funciones tales como enlazamiento del receptor Fe, el enlazamiento de la proteína A, la fijación de complemento y la transferencia placental, que residen en las proteínas Fe de las inmunoglobulinas. Id . Por ejemplo, la región Fe de un anticuerpo I gG1 se ha fusionado al extremo N terminal de CD30-L,~una molécula que enlaza los receptores CD30 expresados en las células tumorales de la Enfermedad de Hodgkin, células del linfoma anaplástico, células de leucemia de células T y otros tipos de células malignas. Ver, la Patente U.S. No. 5,480,981. IL-10, un agente anti-inflamatorio y un agente de ant i-rechazo , se ha fusionado a Fc?2a de murino para aumentar la vida media de circulación corta en la citocina. Zhang, X. et a l . , The Journal of Immunology, 154 : 5590-5600 (1995) . También se han evaluado estudios sobre el uso del receptor del factor de necrosis tumoral enlazado con la proteína Fe de IgC21 de humano para tratar pacientes con choque séptico. Fisher, C. et a l . , N. Engl . J. Med., 334 : 1697:1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of I munology, 156 : 2221-2230 (1996) . Fe también se ha fusionado con el receptor CD4 para producir una proteína terapéutica para el tratamiento de SIDA. Ver, Capón et a l . , Nature, 337 : 525-531 (1989) . Además, el término N de la interleucina 2, también se ha fusionado a la porción Fe de IgGl o IgG3 para superar la vida media corta de la interleucina 2 y su toxicidad sistémica. Ver , Harvill et al? , Immunotechnology , 1.: 95-105 (1995) . _ Para la insulina, se han reportado las preparaciones de la suspensión. Pero, estas condiciones que son aplicables a la insulina no son predictivas de las condiciones que podrían ser aplicables a cualquier otra proteína, incluyendo la proteína OB. La insulina es una proteína claramente pequeña, que tiene características físicas y químicas particulares ; estas características son importantes para determinar las condiciones para la formulación. Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag 1987, describe las suspensiones de insulina (p. 36); ver también , Schlicht krull et al. Insulin Preparations with Prolonged Effect, pp . 729-777 I_n: Hassellblatt et al., Handbook of Experimental Pharmacology New Series, Vol. XXXII-1/2 Springer-Verlag Berlín, Heidelburg, New York (1975) .

A la fecha, no han existido reportes de las preparaciones estables de la proteína OB de humano a las concentraciones de al menos aproximadamente 2 mg/ml a pH fisiológico, y además, no existen reportes de concentraciones estables de una proteína OB de humano activa a al menos 50 mg/ml o por encima. Además, una forma congelada o liofilizada podría usarse para mejorar la estabilidad de anaquel pero, menos deseable que las formas de suspensión listas para usarse descritas aquí. Una forma congelada requiere el almacenamiento a una temperatura de congelación constante que no podría ser deseable debido a los ciclos de descongelado de los refrigeradores y congeladores grado del consumidor. Además, una forma liofilizada debe diluirse y mezclarse lo cual es conveniente y podría establecer la confiabilidad del paciente. Desde el punto de vista de un productor, la elaboración, el almacenamiento y el transporte del líquido congelado es caro y requiere más supervisión que distribución de una formulación lista para usar. También, la elaboración o de otra manera la elaboración de un diluyente disponible o apropiado para una formulación liofilizada es más costosa y menos eficiente que la que no requiere tal diluyente. Existe una necesidad para las formas concentradas de las composiciones farmacéuticas de humano que contienen la proteína OB activa que puede liberarse mediante la inyección a volúmenes bajos. La presente invención satisface estos requerimientos.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona a partir de la observación, que ciertas formulaciones de suspensión permiten la preparación de la proteína OB estable en concentraciones de al menos aproximadamente 2 mg/ml a pH fisiológico. Como se usa aquí, el término, pH fisiológico" se refiere a un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. El uso de tales composiciones permite la liberación de volúmenes relativamente bajos de la proteína Ob terapéutica. Como se expone además aquí, el uso de los agentes de precipitación permite la preparación de las suspensiones de la proteína OB que tienen las características de: 1. Estabilidad mejorada al pH fisiológico como se compara con la misma proteína Ob de humano en la forma de solución. Se demuestran posteriormente en los ejemplos de trabajo, las suspensiones de la proteína OB de humano a concentraciones de 10 mg/ml o superior y a pH 7.0, que, cuando se compara con la misma concentración en solución al pH más alto, lo que permite la solubilidad (pH 4 para la proteína OB de humano en su forma nativa, que aún no está al pH fisiológico) tenga mejores perfiles de HPLC (cromatografía líquida de alta presión) . También se demuestra posteriormente una suspensión de la proteína de fusión Fc-OB a una concentración de 5 mg/ml a aproximadamente pH 7.0, lo cual muestra menos productos de degradación en el almacenamiento con respecto a una solución de la proteína de fusión Fc-OB comparable. 2. El perfil del tiempo de liberación de la inyección prolongada comparado con la misma proteína OB de humano en la forma de solución. Los ejemplos de trabajo demuestran posteriormente un efecto de liberación prolongada usando las suspensiones de la proteína OB de humano actuales altamente concentradas. Tal efecto de liberación prolongada es ventajoso en que la actividad del material se mantiene durante un período de tiempo relativamente mayor, y de esta manera existe una potencia relati amente superior, y la necesidad para menores inyecciones conforme se compara con la proteína OB de humano en solución.

De esta manera, un objetivo de la presente invención es una preparación estable de la proteína OB de humano activa a pH fisiológico, gue tiene una concentración de al menos aproximadamente 2 mg de proteína/ml. Por ejemplo, se proporciona una preparación estable de la proteína OB de humano activa a la concentración de al menos aproximadamente 2.0 mg/ml y" un pH de 7.0. El límite superior de concentración es que la forma de suspensión que es disponible para la administración a un humano, y, como se describe posteriormente, los ejemplos de trabajo han proporcionado una concentración tan alta como 100 mg/ml a pH fisiológico (p. ej., entre pH 6.0 y pH 8.0) .

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una preparación estable de la proteína OB activa de humano dentro del rango de pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0 que tiene una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/ml.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a una preparación estable de la proteína OB activa de humano derivada mediante la unión de una región Fe de una inmunoglobulina a una concentración de al menos aproximadamente 0.5 mg/ml y un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. Más particularmente, se proporcionan las preparaciones estables de la proteína de fusión Fc-OB activa a una concentración de 5 mg/ml a 50 mg/ml a aproximadamente pH 7.5.

En aún otros aspectos, la presente invención proporciona las formulaciones para la proteína OB de humano estable, activa a una concentración de 2 mg de proteína/ml o por _encima, a pH 6.5 hasta pH 7.5. Más particularmente, se proporcionan las formulaciones para la proteína OB de humano estable, activa a una concentración de 20 mg/ml hasta 100 mg/ml a pH 7.0.

Eh otro aspecto, la presente invención proporciona las formulaciones para la proteína_OB de humano estable, activa a una concentración de 10 mg/ml o por encima a un pH de 5.0 a 8.0.~~ En aún otro aspecto, la presente invención proporciona las formulaciones para la proteína OB de humano estable, activa derivada mediante la unión de una región Fe de una inmunoglobulina a una concentración de 0.5 mg/ml o por encima y un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. Más particularmente, se proporcionan las formulaciones para proteína de fusión Fc-OB estable, activa a una concentración de 5 mg/ml a 50 mg/ml a aproximadamente pH 7.5.

Aún otros aspectos de la presente invención, incluyen las composiciones farmacéuticas de los métodos anteriores, para la elaboración de tales composiciones, y los métodos de tratamiento usando las presentes composiciones, y los métodos de elaboración de medicamentos que contienen las presentes composiciones para tal tratamiento.

Breve Descripción de los Dibujos Las FIGURAS 1A y IB son las curvas de respuesta de dosificación en los ratones para la presente suspensión OB de humano (1A) del Ejemplo 1 y un control de la solución de la próteína OB de humano (IB) como se describe en el Ej emplo 1.

La FIGURA 2 es una gráfica que ilustra los niveles de suero OB en perros para el tratamiento de la suspensión de la proteína OB actual y para una solución de la proteína OB de humano de control como se describe en el Ejemplo 1.

La FIGURA 3 es una cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) que traza las formulaciones de la proteína OB de humano a 37°C durante siete semanas: la suspensión de zinc de la proteína OB de humano del Ejemplo 1 es el trazo medio, el control de la solución de la proteína OB de humano del Ejemplo 1 es la línea superior y una suspensión de la proteína OB de humano que se mantiene a -80°C durante 56 días es la línea inferior .

Laf FIGURA 4 es un trazo RP-HPLC de las formulaciones de la proteína OB de humano a 19°C durante 56 días: la solución OB de humano del Ejemplo 1 es la línea superior, la suspensión cristalina de OB de humano del Ejemplo 2 es la línea media, y la suspensión cristalina de OB de humano del Ejemplo 2 a -80°C durante 56 días es la línea inferior.

Las FIGURAS 5A-5C son la secuencia de ADN (SEC ID NO: 1) y la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 2) de la proteína metFc-OB de humano.

Las FIGURAS 6A-6C son la secuencia de ADN (Sec ID NO: 3) y la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 4) de una variante de la proteína metFc-OB de humano.

La FIGURA 7 es una gráfica que representa la velocidad de formación de iso asp en asp 108 (asp 335 usando la numeración de acuerdo a la SEC ID NO: 4) , conforme se determina por HPLC de fase inversa, para la proteína Fc-OB de humano de metionilo recombinante.

Descripción Detallada de la Invención Las presentes composiciones de la proteína OB estable, activa, en general se clasifican como suspensiones, en que el radical de la proteína se precipita y se suspende en un radical líquido. Las composiciones contienen un radical de la proteína OB activo, un agente de precipitación, un agente de modulación de pH y un vehículo líquido. Las presentes proteínas OB, son ya sea amorfas o en la forma cristalina .

Preferentemente, para el uso como una composición terapéutica o cosmética en humanos, se usa la proteína OB con la secuencia aminoácido de la proteína OB de humano nativa (ver Zhang et al., Nature, supra) , opcionalmente con un residuo metionilo N terminal incidente con las expresión bacteriana. Ver, Publicación del PCT WO 96/05309, incorporada aquí por referencia, para los medios del ADN recombinante para preparar las presentes proteínas OB que podrían usarse. Se podrían hacer cambios en los aminoácidos seleccionados, con tal de que los cambios preserven el pliegue global o la actividad de a proteína. La Tabla 1 posterior, establece las sustituciones de aminoácidos conservadas que podrían usarse, en términos de las características particulares (básicas, acidas, polares, hidrofóbicas , aromáticas y de tamaño (pequeño) ) . Ver , en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2 : 95-107, 1991, que se incorpora aquí por referencia. También podrían estar presentes extensiones amino terminales pequeñas, tal como un residuo de metionina amino terminal, un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un tracto de poli-histidina, un epítope antigénico o un dominio enlazador.

Tabla 1 Sustituciones Conservativas de Aminoácidos En general, las proteínas OB de humano que exhibirán estabilidad aumentada en las presentes suspensiones, serán aquellas que, debido a la exposición a pH fisiológico, tienen una región hidrofóbica expuesta en solución. Adicionalmente, las proteínas OB de humano derivadas mediante la unión de una región Fe de una inmunoglobulina al radical de la proteína, exhibirán estabilidad aumentada en las presentes suspensiones.

En general, una región Fe de una inmunoglobulina podría fusionarse genética o químicamente a una proteína OB de humano. Preferentemente, la región Fe se fusiona en el término N de la proteína OB . Ver Solicitud U.S. copendiente No. de Serie 08/770,973, publicada el 20 de diciembre, 1996, incorporada aquí por referencia, para las proteínas de fusión Fc-OB preferidas.

Preferentemente, se usa una región Fe con la secuencia aminoácido de la cadena pesada de inmunoglobulina IgG-1 de humano ( ver Ellison, J.W. et al., Nucleics Acids Res. 10 : 4071-4079 (1982) . Una región Fe preferida se establece en la SEC IN NO: 2 (ver Figura 5) . La secuencia Fc-OB recombmante de la SEC ID NO:^ 2 es una proteína Fc-OB de 378 aminoácidos (no contando el residuo de metionina) . El primer residuo de aminoácido de la proteína Fc-OB en la Figura 5, ácido glutámico, se prefiere para +1 con la metionina en la posición -1. Las variantes o análogos de la porción Fe podrían construirse mediante, por ejemplo, la elaboración de varias sustituciones de los residuos de aminoácidos o los pares de bases.

Los residuos de cisteina pueden eliminarse o reemplazarse con otros aminoácidos para evitar la formación de enlaces cruzados de disulfuro de las secuencias Fe. En particular, el aminoácido en la posición 5 de la SEC ID NO: 2, es un residuo de cisteina. Se podría remover el residuo de cisteina en la posición 5 o sustituirlo con uno o más aminoácidos. Por ejemplo, un residuo de alanina, podría sustituirse por el residuo de alanina en la posición 5 resultando en una secuencia de aminoácido variante. De la misma forma, la cisteina en la posición 5 de la SEC ID NO: 2. podria sustituirse con una serina u otro residuo de aminoácido o eliminarse.

Uña variante o análogo, también podría prepararse mediante la eliminación de los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5 resultando en una proteína Fe de 373 aminoácidos (no contando el residuo de metionina) . Esta secuencia se establece en la SEC ID NO: 4 (ver Figura 6) . Las sustituciones en estas posiciones, también pueden hacerse y están dentro del alcance de esta invención También podrían hacerse las modificaciones para introducir cuatro sustituciones de aminoácidos para remover por calor el sitio de enlazamiento del receptor Fe y el sitio de enlazamiento (Clq) de complemento. De acuerdo con la*~numeración de la SEC ID NO: 4, estas modificaciones variantes incluyen la leucina en la posición 15 sustituida con ácido glutámico, el ácido glutámico en la posición 98 se sustituye con alanina, y la lisina en las posiciones 100 y 102 se sustituye con alaninas.

De manera similar, uno p más residuos de tirosina puede reemplazarse mediante los residuos de fenilalanina. Como se describió anteriormente, se podrían hacer cambios en los aminoácidos seleccionados con tal de que tales cambios preserven el pliegue global o actividad de la proteína de fusión.

Además, la región Fe, también podría enlazarse a la proteína OB de humano de la proteína de fusión Fc-OB mediante los radicales " enla zadores" , si los químicos o aminoácidos de las longitudes variantes. Tales enlazadores químicos son bien conocidos en el arte. Pueden incluirse las secuencias enlazadores de aminoácidos, pero no se limitan a (a) ala, ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala , ala, ala; (d) gly, gly; (e) gly, gly, gly; Cf ) gly, gly, gly, gly, gly; (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly, gly, pro, gly, gly; y (j) cualquier combinación de las subpartes (a) a (i) - La presentes agentes de precipitación podrían ser una sal que tiene un componente catiónico, y podrían seleccionarse de entre calcio, magnesio, zinc, sodio, hierro, cobalto, manganeso, potasio y níguel . Preferentemente, la sal será compatible para el uso en una composición farmacéutica.

Alternativamente los agentes de precipitación, podrían seleccionarse de entre - los agentes que son farmacéuticamente aceptables aún conocidos para precipitar proteínas, tales como polietilen glicoles, u otros polímeros solubles en agua como se establece en los siguientes párrafos. Un agente de precipitación útil inducirá la precipitación de la proteína OB a pH neutro, pero es reversible o se redisuelve debido a la dilución con los disolventes fisiológicamente compatibles, Sin un agente de precipitación apropiado, la proteína OB precipita a pH neutro a una forma que no es reversible, mediante la dilución con los disolvente fisiológicamente compatible s .

El rango de pH es preferentemente desde aproximadamente pH 4.0 hasta aproximadamente pH 8.0, y más preferentemente desde aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5. El pH más preferido para una composición farmacéutica es aquel en el que la proteína OB usando, podría retener su máxima actividad biológica a la concentración de la proteína seleccionada. A pH no fisiológico, la presentes suspensiones de la proteína OB, también podrían tener ventajas. A pH inferior a 5.0, las presentes suspensiones de la proteína OB podrían ser más estables (en términos de la vida de anaquel) que las concentraciones iguales de la proteína Ob en solución a pH igual. Por ejemplo a pH 4.0, y una concentración de 50 mg/ml, las presentes suspensiones podrían tener mayor actividad biológica debido a la administración in vivo que la que tendría la solución equivalente.

El amortiguador podría seleccionarse de entre los que contienen el pH deseado mientras que no se alteren las características de precipitación de la composición. Preferentemente, los amortiguadores serán aceptables para una formulación farmacéutica. Son aceptables Tris, MES y PIPES para las formas amorfa y ^cristalina . El fosfato es un amortiguador preferido para las formas cristalinas.

La suspensión final tendrá preferentemente una concentración de 5 mg/ml a 100 mg/ml para facilidad de la administración terapéutica.

Métodos de Uso Terapéutico . Los usos terapéuticos incluyen modulación del peso, el tratamiento o prevención de diabetes, reducción de lípidos en la sangre (y tratamiento de las condiciones relacionadas), aumento de la masa corporal delgada y aumento de la sensibilidad a la insulina. Además, las presentes composiciones podrían usarse para la elaboración de uno o más medicamentos para el tratamiento o disminución de las condiciones anteriores. Los métodos de administración serán típicamente por inyección, aungue podrían usarse otros medios, tal como liberación pulmonar. Ver PCT WO 96/05309, incorporada aquí por referencia a la página 83 et seq . , por ejemplo. Las presentes suspensiones podrían secarse por atomizado en partículas que tienen un tamaño promedio menor de 10 micrómetros, o más preferentemente, 0.5 a 5 micrómetros.

Modulación del Peso. Las presentes composiciones y métodos podrían usarse para la reducción de peso. Desde otro punto de vista, las presentes composiciones podrían usarse para mantener un peso o nivel deseado de adiposidad. Como se ha demostrado, en los modelos de murino (ver supra ) , la administración de la presente proteína OB resulta en la pérdida de peso. La pérdida de masa corporal es principalmente de tejido adiposo o grasa. Tal pérdida de peso puede asociarse con el tratamiento de las condiciones concomitantes, tal como las anteriores, y por lo tanto constituyen una aplicación terapéutica. Además, los usos cosmético'^ se proporcionan aquí, si la modulación de peso es exclusivamente para el mejoramiento de la apariencia .

Tratamiento de Diabetes . Las presentes composiciones t y métodos podrían usarse en la prevención o tratamiento de la diabetes de tipo II. Como la diabetes de tipo II puede correlacionarse con la obesidad, el uso de la presente invención para reducir peso (o mantener un peso deseado o reducir o mantener un nivel de adiposidad) también puede disminuir o prevenir el desarrollo de diabetes. Además, aún en ausencia de las dosifícaciones suficientes para resultar en la pérdida de peso, las presentes composiciones podrían usarse para prevenir o disminuir la diabetes.

Modulación de Lípidos en la Sangre. Las presentes composiciones y métodos, podrían usarse en la modulación de los niveles de lípidos en la sangre. Idealmente, en situaciones en donde se desee exclusivamente la reducción de los niveles de lípidos en l=Tsangre, o en donde se desee el mantenimiento de los niveles de lípidos en la sangre, la dosificación será insuficiente para resultar en la pérdida de peso. De esta manera, durante un curso inicial de terapia de un paciente obeso, las dosificaciones podrían administrarse, por lo que se logra la pérdida de peso y la disminución del nivel de lípidos en la sangre concomitantes. Una vez que se logra la pérdida de peso suficiente, podría administrarse una dosificación suficiente para prevenir la re-obtención de peso, aún suficiente para mantener los- niveles de lípidos en la sangre deseados, u otras condiciones como se establecen por ejemplo, aquí. Estas dosificaciones pueden determinarse empíricamente, ya que los efectos de la proteína OB son reversibles. P. ej . , Camfield et al., Science 269: 546-549 (1995) a 547. De esta manera, si se observa una dosificación que resulta en la pérdida de peso cuando la pérdida no es deseada, se administraría una dosificación inferior para lograr los niveles de lípidos en la sangre deseados, aún manteniendo el peso deseado. Ver , p . e . , WO Publicación PCT 97/06816 que se incorpora aquí por referencia .

Aumento de la Masa de Tejido Delgado o Sensibilidad a la Insulina . Idealmente, en situaciones en donde exclusivamente se desee un aumento en la masa de tejido delgado, la dosificación será insuficiente para resultar en la pérdida de peso. Así, durante un curso inicial de la terapia de una persona obesa, las dosificaciones podrían administrarse, por lo cual se logra la pérdida de peso y la disminución del tejido graso concomí tante /aumento de la masa delgada. Una vez gue se logra suficiente pérdida de peso, podría administrarse una dosificación suficiente para prevenir la re-obtención de peso, aún suficiente para mantener el aumento de la masa delgada deseada (o la prevención de la reducción de la masa delgada) . Para aumentar la sensibilidad de un individuo a la insulina, podrían tomarse en cuenta consideraciones de dosificación similares. El aumento de la masa de tejido delgado sin pérdida de peso, podría ser suficiente para disminuir la cantidad de insulina (o, potencialmente, amilina, antagonistas o agonistas de amilina o t iazolidindionas u otros fármacos de trataraiento:de diabetes potenciales), se administraría un individuo para el tratamiento de diabetes. Para aumentar la resistencia global, Podrían existir consideraciones de dosificación similares. El aumento de la masa de tejido delgado con el aumento concomitante en la resistencia global, podría lograrse con las dosificaciones insuficientes para resultar en la pérdida de peso. Otros beneficios, tal como un aumento en las células de glóbulos rojos (y la oxigenación en la sangre) y una disminución en la resorción ósea e osteoporos is , también podrían lograrse en ausencia de la pérdida de peso. Ver , p. ei . Y Publicación del PCT No. WO 97/18833 incorporada aquí por-referencia.

Terapias de Combinación. Las presentes composiciones y métodos podrían usarse en conjunción con otras terapias, tales "corno dieta alterada y ejercicio. Otros medicamentos, tal como los usados para el tratamiento de diabetes (p. ej . , insulina y posiblemente amilina, antagonistas o agonistas de los mismos, t iazolidindionas (ver , p . e . , la Publicación PCT No. WO 98/08512 incorporada aguí por referencia), u otros fármacos potenciales para el tratamiento de diabetes, colesterol, y medicamentos para la disminución de la presión sanguínea (tal como aquellos que reducen los niveles de lípidos en la sangre u otros medicamentos cardiovasculares), medicamentos que aumentan la actividad (p. ej . , anfet aminas ) , diuréticos (para la eliminación de líquidos) y supresores del apetito (tal como agentes que actúan sobre los receptores y neuropept ídicos o inhibidores de la toma de serotonina) . Tal administración podria ser simultánea o podría ser in seriat im . Además, los presentes métodos podrían usarse en conjunción con los procedimientos quirúrgicos, tal como cirugías cosméticas diseñadas para alterar la apariencia global de un cuerpo (p. ej . liposucción o cirugías láser diseñadas para reducir la masa corporal o cirugías de implante, diseñadas para aumentar la apariencia de la masa corporal) . Los beneficios de salud de las cirugías cardiacas, tal como cirugías de desviación (bypass) u otras cirugías diseñadas para aliviar una condición dañina causada por el bloqueo de los vasos sanguíneos por los depósitos de grasa, tal como la placa "arterial , podría aumentarse con el uso concomitante de las presentes composiciones y métodos. Los métodos para eliminar los cálculos biliares, tal como los métodos ultrasónicos o láser, también podrían usarse ya sea antes, durante o después de un curso de los presentes métodos terapéuticos. Además, los presentes métodos podrían usarse como un adicional para las cirugías o terapias para huesos rotos, músculo dañado u otras terapias que serían mejoradas por un aumento en la masa de tejido delgado.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, _pero no se elaboran como limitantes del alcance de la misma. El Ejemplo 1 establece la preparación de una suspensión de la proteína OB de humano (como opuesto a una cristalina, como infra ) a una concentración de 100 mg/ml a pH 7.0. El Ejemplo 2 establece la preparación de una suspensión de la proteína OB de humano cristalina. El Ejemplo 3 demuestra una respuesta de dosificación mejorada para las suspensiones de la proteína OB comparado con las soluciones de la proteína OB . El Ejemplo 4 demuestra el perfil de la acción del tiempo retrasado de las presentes suspensiones en un modelo para perro._ El Ejemplo 5 establece la preparación de una suspensión de la proteína Fc-OB amorfa. Los Ejemplos 6 y 7 demuestran la estabilidad mejorada de las presentes suspensiones .

EJEMPLO 1 : Preparación de una suspensión de la proteína OB amorfa .

Este ejemplo ilustra la preparación de una suspensión de la proteína OB de humano de la presente invención. Una suspensión de la proteína OB-de humano amorfa se preparó por precipitación con la sal de zinc. A un pH final de 6.0 a 8.0, se ha obtenido una concentración de 100 mg de proteína/ml de líquido. También se establece una composición de control, de pH 4.0, para una -solución de la pro'teína OB.de humano.

Composición : Radical de proteína: la proteína OB de humano de metionilo recombinante (" rmetHu-lept ina ) como se establece en la SEC ID NO. 4 de la Publicación PCT WO 96/05309, que comienza con el número de aminoácido 22 (Val) y termina con el número de aminoácido 167, que tiene en su término N un residuo metionilo: Precipitante: cloruro de zinc Amortiguador: Tris, MES y Pipes PH final: 6.0 - 8.0 Protocolo de preparación" La solución de la proteína OB de humano de metionilo recombinante (" rmetHu-lept ina" ) se concentró a aproximadamente 40 mg/ml en agua para inyección, se acidificó a pH 3.0, con HCl. Se adicionó cloruro de zinc y se formó la 'suspensión ajustando el pH a cercar de la neutralidad (aproximadamente pH 7.0) adicionando un amortiguador apropiado. Se han usado exitosamente los amortiguadores Tris, MES y PIPES. Las condiciones finales fueron típicamente de amortiguador de 10 a 15 mM, zinc 20 a 1000 µM, pH 6.0 a 8.0 y rmetHu-leptina 10 mg/ml. Las suspensiones se han concentrado permitiendo que las partículas se sedimenten a 4°C durante varias horas y removiendo el sobrenadante. Este procedimiento podría repetirse varias veces hasta que se obtenga la concentración máxima, y se ha usado para obtener aproximadamente suspensiones de 100 mg/ml.

Composición de Control: La solución de la proteína OB de humano de metionilo recombinante (como ant eriormente ) a 20 mg/ml, pH 4.0 que contiene acetato 10 mM y 5% p/v de sorbitol, se usó como una composición de control.

EJEMPLO 2 : Preparación de una suspensión de la proteína OB cristalina.

Este ejemplo ilustra la preparación de una suspensión de la proteína OB cristalina de la presente invención.

Radical de la proteína: Se usó, como en el Ejemplo 1 anterior, la proteína OB de humano de metionilo recombinante .

Procedimiento: Se mezcló rmetHu-leptina a una concentración de 15 mg/ml en HCl 1 mM en una relación 1:1 con NaCl 4 M, Tris 100 mM, pH 8.5, etanol al 2% v/v, a 4°C. Los cristales se formaron espontáneamente ajustando lentamente la temperatura durante varias horas a entre 14°C y 25CC y manteniendo esta temperatura durante al menos 2 horas, dependiendo de la duración del calentamiento a la temperatura final. El "licor madre" (p. ej . , el líquido en el que crecieron los cristales) se reemplazó con un disolvente más apropiado para la inyección, cosechando los cristales por centrifugación y resuspensión en un agente de estabilización cristalino apropiado. Un disolvente de reemplazamiento apropiado es 20-25% de polietilen glicol (que tiene un peso molecular de aproximadamente 4000 daltons a aproximadamente 20,000 daltons, el término "aproximadamente" significa el promedio aproximado de pesos moleculares para las preparaciones de PEG comerciales), amortiguador -a pH neutro apropiado, preferentemente aproximadamente pH 6.0 a aproximadamente pH 8.0, y preferentemente amortiguador de fosfato 10 mM, pH 6.0 a pH 7.5, y etanol al" 2% v/v. En una preparación típica, podría permanecer algo de la sal comercial menor de 0.25 M.

EJEMPLO 3 : Respuesta de la dosificación mejorada para las suspensiones de la proteína OB comparado con las soluciones de la proteína OB .

Este ejemplo demuestra que las presentes suspensiones de la proteína OB son más eficientes que la proteína OB en solución. Los ratones delgados normales se les dieron diariamente inyecciones, durante 5 días, de la presente suspensión a l, 10 y 50 mg de la proteína por kg de peso corporal, o la solución de la proteína OB a la misma dosificación. A los ratones que se les dio la suspensión, perdieron más peso por unidad de masa de la proteína OB dada que a los que no se les dieron iguales dosificaciones de la formulación de la solución. Esto se ilustra en la FIGURA 1A y la FIGURA IB. L"a FIGURA 1A muestra el por ciento del cambio de peso cuando se dio la suspensión del 1 Ejemplo 1. La FIGURA IB muestra el por ciento del cambio del peso cuando se dio la solución de control del Ejemplo 1.

Esto ilustra que la presente suspensión a la misma dosificación es más eficiente que la dada en la forma de solución. Mientras que no se desea ser enlazado por la teoría, esto podría ser debido a la velocidad de absorción más lenta de la suspensión comparado con la solución. La suspensión debe disolverse antes de entrar a la sangre, de modo que este efecto de liberación resulta en mayor eficiencia. Sobre una base másica, menos proteína en suspensión necesita administrarse que en solución. Además, en solución no existe diferencia entre la dosificación de 10 y 5"0 mg/kg en el día 5 (el último día de dosificación) (Ver Tabla 2, posterior) . La suspensión da una curva de la respuesta de dosificación __ más definitiva que la formulación de la solución.

TABLA 2 POR CIENTO DEL CAMBIO DE PESO DEL DÍA 0 Los resultados son un promedio para 5 ratones por tratamiento .

Métodos : Animales: Se usaron ratones CD-1 Normales. Peso base: Aproximadamente 20 gramos. Administración: Los animales se inyectaron SC cada día en el mismo lugar durante 5 días. Manejo: Los anímeles se alojaron en grupos, y se alimentaron ad libitum.

Composiciones: Solución: Se usó la solución de rmetHu-lept ina del Ejemplo 1, a una concentración de 20 mg/ml. Suspensión: Se usó la suspensión de rmetHu-lept ina del Ejemplo 1, a pH 7.0, amortiguador MES 10 mM, Zn 500 mM, 20 mg/ml . PBS: Se usó solución salina amortiguada con fosfato como un placebo. (Las respuestas de la dosificación para los controles usando el líquido de suspensión o el líquido sólo, "sin proteína, fueron similares a PBS,.. no se muestran resultados ) .

EJEMPLO 4 : Niveles en suero de la proteína OB en perros.

Este ejemplo demuestra el perfil de acción del tiempo retrasado de las presentes suspensiones. Métodos: Los perros Beagle se les administraron la suspensión o solución de rmetHu-lept ina . Se extrajo el suero, y los niveles de la proteína OB se midieron a los tiempo ilustrados en la FIGURA 2.

TABLA 3 Composiciones usadas: Solución: Se usó la solución de acuerdo al Ejemplo 1, a una dosificación de 5 mg/kg/día. Suspensión: Se usó la suspensión de acuerdo al Ejemplo 2. Ver Tabla . Animales: Los resultados presentados en la Tabla 3 son para un promedio-de 3 animales. Los animales fueron perros beagle normales. Manej o : Los animales se alojaron individualmente, y se alimentaron ad libitum. Se obedecieron las prácticas del buen manejo de animales. Prueba Una prueba de anticuerpo se usó como en Hotta et al, J. Biol. Chem 271: 255327-25331 (1996) . Resultados Como puede observarse a partir de la FIGURA 2, los picos de concentración de la solución de 1 a 2 horas después de la administración de la proteína,~~ mientras gue los picos de concentración de la suspensión mucho después, después de 10-12 horas. Esto demuestra que la suspensión mantiene una dosificación efectiva mínima para un período de tiempo mayor._ EJEMPLO 5 : Preparación de una suspensión de proteína Fc-OB amorfa .

Este ejemplo ilustra la preparación de una suspensión de la proteína Fc-OB de humano de la presente invención. Se preparó una suspensión de la proteína Fc-OB de humano amorfa por precipitación con la sal de zinc. También se establece una composición de control, de pH 7.5, para una solución de la proteína Fc-OB~de humano Composición : Radical de la proteína: La proteína Fc-OB de humano de metionilo recombinante (" rmetHu-Fc-lept ina" ) como se establece en la SEC ID NO: 4, una proteína de fusión del aminoácido 373, la porción Fe de la proteína que está en los aminoácidos 1-227 y la porción de la proteína OB de humano de la proteína que es Los aminoácidos 228-373, gue tiene en su término N un residuo metionilo: Precipitante: cloruro de zinc Amortiguador: Tris 100 mM PH final : 7.5 Protocolo de preparación: Una solución de rmetHu-Fc-leptina se concentró a aproximadamente 5 mg/ml en amortiguador Tris 100 mM, pH 7.5. Se adicionó cloruro de zinc para formar la suspensión.

Composición de Control: _Una solución de rmetHu-Fc-leptina (como anteriormente) a 5 mg/ml, pH 7.5 que contiene Tris 100 mM, se usó como una composición de control.

EJEMPLO 6 : Estabilidad de las presentes suspensiones de la proteína OB de humano.

Este ejemplo demuestra que las formas amorfa y cristalina de las presentes suspensiones son más estables bajo las condiciones de la prueba de estabilidad acelerada que el_material en solución.

La FIGURA 3 ilustra un tráTza de RP-HPLC que compara la forma amorfa de zinc de la presente suspensión (como en el Ejemplo 1) con la forma de la solución (también como en el Ejemplo 1), a 37°C durante un período de 7 semanas. Como puede observarse, la presente suspensión (línea media) tiene picos inferiores (que indican los productos de corte inferiores) que la forma de la solución (línea superior) . Como una comparación, la línea inferior presenta la forma amorfa de zinc que había sido almacenada durante 7 semanas a -80°C.

La FIGURA 4 ilustra un trazo de RP-HPLC que compara la forma "de la suspensión cristalina del Ejemplo 2 con la forma de la solución (del Ejemplo 1) . Los materiales se almacenaron durante 56 días a 19°C. (El almacenamiento a 37 °C no fue una condición re evante, conforme la forma cristalina pierde su estructura cristalina a 37°C) . La FIGURA 4 muestra que existen más picos, que indican más degradación, para la forma de JLa solución, (pico principal = 86%) que para la forma de la suspensión (pico principal = 94%) . El control en la línea inferior fue la forma cristalina almacenada durante 56 días a -80°C. Los resultados similares se observaron durante 4°C, aunque se presentó la degradación más lentamente.

El producto de degradación principal pareció que era aspartato en la posición aminoácido 108 (de acuerdo a la SEC ID .NO: 4 en la WO PCT 96/05309, usando el residuo "Val" como el número de posición 1) . Se podría seleccionar empíricamente un radical químico más estable en esta posición, tal como otro aminoácido, para mejorar la estabilidad de la molécula. En general, las suspensiones de la presente invención son más estables que la proteína OB en solución.

EJEMPLO 7 : Estabilidad de las presentes suspensiones de la proteína Fc-OB de humano.

Este ejemplo demuestra que la forma amorfa de las presentes suspensiones de la proteína Fc-OB es más estable bajo las condiciones de la prueba de estabilidad acelerada que eljµaterial en solución. _ La forma amorfa de zinc de la presente suspensión (como en el Ejemplo 5) y la forma de la solución (también como en el Ejemplo 5) se colocaron en los estudios de estabilidad almacenando las formas de la suspensión y la solución a 4°C, 29°C y 37 ° durante un período de 2 semanas. Como se muestra en la FIGURA 7, las suspensiones de Fc-leptina almacenadas a 29°C y 37°C, muestran un porcentaje inferior de los productos de degradación con relación al aspartato en la posición aminoácido 108 de la proteína OB gue las soluciones de Fc-leptina almacenadas a las mismas temperaturas, respectivamente.

Mientras gue la presente invención se ha descrito en términos de las modalidades preferidas, se entiende que las variaciones y modificaciones se presentarán para aquellos expertos en el arte. Por lo "tanto, se entiende que las reivindicaciones anexadas cubren todas las variaciones equivalentes que están dentro del alcance de la invención como se reivindica. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una suspensión de la proteína OB de humano que tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0 y una concentración de al menos 0.5 mg/ml, caracterizada porque la proteína OB se deriva mediante la unión de una región Fe de una inmunoglobulina hacia el término N del radical de la proteína OB .

2. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 1, caracterizada porque la porción Fe de la proteína Fc-OB de humano se selecciona del grupo que consiste de : (a) las secuencias de aminoácido Fe se establecen en las SEC ID NOS : 2 y 4 ; (b) las secuencias de aminoácido de la subparte (a) tienen un aminoácido diferente sustituido o eliminado en una o más de las siguientes posiciones (usando la numeración de acuerdo a la SEC ID NO: 2) : (i) uno o más residuos de cisteina reemplazados por un residuo de alanina o serina; (ii) uno o más residuos de tirosina reemplazados por un residuo de fenilalanina; (iii) el aminoácido en la posición 5 se reemplaza con una alanina; (iv) el aminoácido en la posición 20 se reemplaza con ácido glutámico; (v) el aminoácido en la posición 103 se reemplaza con una alanina; (vi) el aminoácido en la posición 105 se reemplaza con una alanina; (vii) el aminoácido en la posición 107 se reemplaza con una alanina; (viii) los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5 se eliminan; (ix) uno o más residuos se reemplazan o eliminan para remover el sitio de enlazamiento del receptor Fe; (x) uno o más residuos se sustituyen o eliminan para remover el sitio de enlazamiento (Clq) de complemento; y (xi) una combinación de las subpartes i-x; y (c) la secuencia de aminoácido de las subpartes (a) o (b) que tiene un residuo metionilo en el término N.

3. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración es de al menos 5 mg/ml.

4. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración está entre 5 mg/ml y 50 mg/ml.

5. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 1, caracterizada porque el pH es pH 7.0.

6. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína OB de humano es rmetHu-Fc-lept ina .

7. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un agente de precipitación farmacéuticamente aceptable.

8. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un agente de precipitación seleccionado de una sal y un polímero soluble en agua.

9. Una suspensión de la proteína OB de humano de la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un agente de precipitación seleccionado de entre calcio, magnesio, zinc, sodio, hierro, cobalto, manganeso, potasio y níquel.

10. Un método para tratar a un individuo para una condición, administrando una dosificación efectiva de una suspensión OB de humano de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la condición se selecciona de entre: (a) modulación del peso, - (b) modulación de la adiposidad ( c) diabetes , (d) modulación del nivel de lípidos en la sangre, (e) aumento en la masa delgada, y (f) aumento en la sensibilidad a la insulina.

11. Un método para preparar una suspensión de la proteína OB de humano, caracterizado porque comprende: combinar, bajo las condiciones apropiadas, un agente de precipitación y una proteína OB de humano en solución, en donde la proteína OB se deriva mediante la unión de una región Fe de una inmunoglobulina al término N del radical de la proteína OB; permitir que la proteína OB de humano precipite; colectar la proteína OB de humano precipitada; y _ opcionalmente, resuspender la proteína OB de humano en un diluyente.

12. Un método de la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína OB de humano se resuspende en un diluyente que tiene un pH de entre 6.0 y 8.0.

13. Un método de la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína OB de humano es rmetHu-Fc-lept ina .