MXPA99009130A

MXPA99009130A - Lineas de maiz resistentes a glifosato

Info

Publication number: MXPA99009130A
Application number: MXPA/A/1999/009130A
Authority: MX
Inventors: Michael Spencer T; Mumm Rita; Jefferson Gwyn J; Mcelroy David; A Stephens Michael
Original assignee: Dekalb Genetics Corporation; Jefferson Gwyn J; Mcelroy David; Mumm Rita; Michael Spencer T; A Stephens Michael
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1999-10-04
Publication date: 2000-09-04

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones relacionados con plantas de maíz resistentes a glifosato, que incluyen los sucesos de transformación GA21, GA25, GJ11 y FI117;también se describen los métodos para utilizar dichos sucesos de transformación de resistencia a herbicidas en los procedimientos de cría o mejoramiento de plantas;la invención incluye además los métodos pana asegurar la pureza de semillas vegetales.

Description

LINEAS DE MAÍZ RESISTENTES A GLIFOSATO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud es una continuación parcial de la Solicitud de Patente de EE.UU. N° Serie ___/___. depositada el 27 de julio de 1997; la cual es una continuación parcial de la Solicitud de Patente de EE.UU. N° Serie 08/832.078, depositada el 03 de Abril de 1997. 1.- CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en general con plantas de maíz transgénicas que son resistentes a los herbicidas y con los métodos para utilizar los mismos. Más específicamente, se relaciona con sucesos de transformación de maíz GA21 , GG25, FI117 y GJ11 . 2. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El control químico de malezas constituye una herramienta poderosa de nuestra era tecnológica. Conocida durante mucho tiempo como una de las operaciones más arduas de la agricultura, la eliminación de malezas se ha convertido en un aspecto completamente nuevo, a medida que un producto químico tras oro era añadido al arsenal de herbicidas. Los EE.UU. han estado a la cabeza tanto en la producción como en el uso de herbicidas y como resultado de ello los rendimientos de los cultivos de maíz, soya, algodón, caña de azúcar, así como de muchos otros cultivos, han aumentado, desde 1945, en algunos casos un 100% o más. Por consiguiente, en tanto el uso de fertilizantes y nuevas variedades de cultivo de alto rendimiento han contribuido en gran medida a la "revolución verde", el control químico de malezas se ha encontrado en la punta de los logros tecnológicos. Un tipo de herbicida que resulta de particular utilidad es uno que presente un amplio espectro de actividad herbicida. El uso de dichos herbicidas omite la necesidad de aplicar herbicidas múltiples. El problema con dichos herbicidas es que habitualmente presentan efectos nocivos para cualquier cultivo que es expuesto ai mismo. Una manera de superar esto es producir plantas de cultivo transformadas con genes que confieran resistencia a ciertos herbicidas de amplio espectro. Los avances recientes en la ingeniería genética han provisto las herramientas necesarias para transformar plantas de manera tal que contengan genes extraños. Por ello, es posible producir plantas que presenten características únicas que son de importancia agronómica. Ciertamente, el control de malezas mediado por la tolerancia a herbicidas es una de dichas características ventajosas que es altamente efectivo en cuanto al costo y compatible con el medio ambiente. Las plantas tolerantes a herbicidas pueden reducir la necesidad de labranza para controlar las malezas, con lo cual se reduce de forma efectiva la erosión del suelo. Además, las plantas resistentes a herbicidas pueden reducir la cantidad de herbicidas diferentes aplicada en el campo. Un herbicida que está sujeto a mucha investigación en este sentido es la N-fosfonometil-glicina, conocido comúnmente como glifosato. El glifosato inhibe la vía del ácido shiquímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos, incluyendo aminoácidos y vitaminas. Específicamente, el glifosato inhibe la conversión del ácido fosfoenolpirúvico y del ácido 3-fosfoshiquímico en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico inhibiendo la enima ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintetasa (EPSP sintetasa o EPSPS). Se ha demostrado que se pueden producir plantas tolerantes a glifosfato introduciendo, en el genoma de la planta, la capacidad de producir un nivel más alto de EPSP sintetasa, siendo preferentemente dicha enzima tolerante al glifosato (Shah y otros, 1986). La introducción en plantas de uno o más genes de degradación de glifosato puede proporcionar un medio para conferir tolerancia a glifosato a dichas plantas y/o para aumentar la tolerancia de plantas transgénicas que ya expresan una EPSP sintetasa tolerante a glifosato dependiendo de los efectos fisiológicos de los productos de la degradación. El metabolismo del glifosato (degradación) ha sido estudiado en una gran variedad de plantas y se ha encontrado poca degradación en la mayoría de dichos estudios. En aquellos casos en que se informó la existencia de una degradación, el producto inicial de la degradación es habitualmente aminometilfosfonato (AMPA) (Coupland, 1985; Marshall y otros, 1987). En estos casos, no queda claro si el glifosato es metabolizado por la planta o por los microbios contaminantes sobre la superficie de la hoja a la cual fue aplicado el glifosato. Se ha informado que el AMPA es mucho menos fitotóxica que el glifosato para la mayoría de las especies vegetales (Franz, 1985) pero no para todas las especies vegetales (Mater, 1983; Tanaka y otros, 1986). La degradación dei glifosato en el suelo es mucho más extensiva y rápida (Torstensson, 1985). El producto de degradación más importante identificado es el AMPA (Rueppel y otros, 1977; Nomura y Hilton, 1977); un fosfonato que puede ser metabolizado por una gran variedad de microorganismos (Zeleznick y otros, 1963; Mastelerz y otros, 1965; Cook y otros, 1978; Daughton y otros, 1979a; 1979b; 1979c; Wackett y otros, 1987a). Se ha identificado una cantidad de cultivos puros de bacterias que degradan el glifosato por una de las dos rutas conocidas (Schowanek y Verstraete, 1990; Weidhase y otros, 1990; Liu y otros, 1991 ). Se ha encontrado una ruta que involucra una "C-P liasa", que degrada al glifosato en sarcosina y ortofosfato inorgánico (Pi) para una especie de Pseudomonas sp. (Shinabarger y Braymer, 1986; Kishore y Jacob, 1987) y de Arthrobacter sp. (Pipke y otros, 1987b). Se encontraron cultivos puros capaces de degradar el glifosato en AMPA para una especie de Flavobacterium sp. (Balthazor y Hallas, 1986), de Pseudomonas sp. (Jacob y otros, 1988) y para Arthrobacter atrocyaneus (Pipke y Amrhein, 1988). Además, se ha identificado una gran cantidad de formas aisladas que convierten el glifosato en AMPA en los fangos activados de la industria cultivos puros de bacterias que degradan el glifosato por una de las dos rutas conocidas (Schowanek y Verstraete, 1990; Weidhase y otros, 1990; Liu y otros, 1991 ). Se ha encontrado una ruta que involucra una "C-P liasa", que degrada al glifosato en sarcosina y un ortofosfato inorgánico (Pi) para un Pseudomonas sp. (Shinabarger y Braymer, 1986; Kishore y Jacob, 1987) y un Arthrobacter sp. (Pipke y otros, 1987b). Cultivos puros capaces de degradar el glifosato a AMPA han sido informados para un Flavobacterium sp. Balthazor y Hallas, 1986), para un Pseudomonas sp. (Jacob y otros, 1988) y para Arthrobacter atrocyaneus (Pipke y otros, Amrhein, 1988). Adicionalmene, se han identificado una gran cantidad de aislados que convierten glifosfato a AMPA a partir de lodos industriales activados que tratan desechos de glifosato (Halas y otros, 1988). Sin embargo, la cantidad y naturaleza de los genes responsables por estas degradaciones no han sido determinados hasta ahora ni se han aislado el o los genes. El desarrollo de plantas resistentes al compuesto de glifosato herbicida ha sido un objetivo de la ingeniería de muchas especies de plantas (Patente de los Estados Unidos número: 4.769.061). El desarrollo de plantas de tabaco resistentes al flifosato, fue revelado por Comai y otros (1985). La resistencia a los herbicidas fue conferida a las plantas por expresión de aroA derivado de Salmonella typhimurium que codifica una forma resistente a glifosato de la enzima EPSP sintetasa. Además, se produjo soya resistente a glifosato (Monsanto, petición APHIS 93-258-Olp). También se han descrito métodos para la producción de plantas de maíz resistentes a glifosato (WO 95/06128; Patente de EE.UU. N°. 5.554.798). De manera similar, se ha descrito un gen de la glifosato oxidorreductasa que puede ser utilizado con el fin de conferir resistencia a glifosato (Patente de EE.UU. N°. 5.463.175). La meta final en la producción de plantas transgénicas de glifosato es proporcionar plantas que pueden ser tratadas con glifosato en un nivel suficiente como para eliminar las malezas, sin un efecto nocivo sobre el rendimiento o la fertilidad. En este sentido el arte anterior ha fracasado. Persiste, por lo tanto, una gran necesidad en la agricultura de plantas de maíz que puedan ser rociadas directamente en el campo con glifosato, eliminando de esa manera las malezas, pero sin provocar efectos nocivos sobre el cultivo mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención pretende superar las deficiencias en el arte anterior proporcionando plantas de maíz transgénicas fértiles, que puedan ser tratadas con glifosato en el campo sin una consiguiente pérdida en el rendimiento o la fertilidad. Por ello, un aspecto de la presente invención se relaciona con una planta de maíz transgénica fértil que contiene un cassette de expresión incorporado en los cromosomas. En realizaciones particulares el cassette de expresión comprende: (i) un gen de EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (ii) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS, donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénica fértil no es afectado por una tasa de aplicación de glifosato que afecta el rendimiento de una planta de maíz que no posee de dicho gen de maíz modificado. En otro aspecto, la planta de maíz puede comprender un promotor que se selecciona del grupo formado por un promotor de actina de maíz, un promotor de histona de maíz y un promotor de histona de Arabidopsis-CaMV 35S fusionado. En una realización, la planta puede comprender un cassette de expresión que deriva de pDPG434, pDPG427 o pDPG443. El cassette de expresión puede definirse además, en realizaciones particulares, como pDPG434, y la planta de maíz puede definirse además por contener un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GA21 y FU 17; las semillas que contienen estos sucesos fueron depositadas en ATCC y se les asignaron los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209033 y ATCC 209031 , respectivamente. La planta de maíz que contiene al suceso de transformación FU 17 puede además definirse por contener un gen bar. En aún otro aspecto, la planta de maíz puede comprender el cassette de expresión pDPG427 y puede definirse además por contener el suceso de transformación GG25 o puede comprender el cassette de expresión del pDPG443 y la planta de maíz se puede definir adicionalmente por comprender el suceso de transformación GJ1 1 ; las semillas que contienen los sucesos de transformación GG"5 y GJ1 1 fueron depositadas en ATCC y se les asignaron los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209032 y ATCC209030, respectivamente. La invención pretende incluir la progenie de cualquier generación y las semillas de las plantas de maíz mencionadas recién, así como las semillas de la progenie de cualquier generación. Aún otro aspecto más de la invención actual comprende un método para preparar una planta de maíz transgénica fértil. El método comprende: (i) la provisión que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; (ii) el contacto de células de maíz receptoras con dicho cassette de expresión bajo condiciones que permitan la incorporación de dicho cassette de expresión por parte de dichas células receptoras; (iii) la selección de células receptoras que comprenden un cassette de expresión incorporado en los cromosomas; (iv) la regeneración de plantas a partir de dichas células seleccionadas; y (v) la identificación de una planta de maíz transgénica fértil, cuyo rendimiento no es afectado por una tasa de aplicación de glifosato que afecta el rendimiento de maíz que no posee el gen de maíz modificado. El método puede comprender cualquier método de contacto incluyendo, pero sin limitaciones a los mismos, bombardeo con microproyectiles, electroporación o transformación mediada por Agrobacterium. Dicha selección puede comprender el tratamiento de las células receptoras con glifosato. El promotor puede ser seleccionado del grupo formado por un promotor de actina de arroz, un promotor de histona de maíz y un promotor de histona de Arabidopsis-CaMV 35S fusionado. En realizaciones particulares, dicho cassette de expresión puede derivar del pDPG434, pDPG427 y/o pDPG443. El cassette de expresión puede ser, en particular, pDPG434 y la planta de maíz puede además definirse por contener un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GA21 y FU 17. En el método, el suceso de transformación también puede ser FU 17 y dicha planta de maíz puede definirse además por contener un gen bar. El cassette de expresión también puede ser pDPG427, y la planta de maíz puede definirse además por contener el suceso de transformación GG25. El método también incluye el cassette de expresión del pDPG443, donde la planta de maíz además se define por contener el suceso de transformación GJ1 1. En aún otro aspecto más, la invención es una planta de maíz transgénica fértil preparada de acuerdo con un método que comprende: (i) la provisión de un cassette de expresión que contiene (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; (ii) el contacto de células de maíz receptoras con dicho cassette de expresión bajo condiciones que permiten la incorporación de dicho cassette de expresión por parte de dichas células receptoras; (iii) la selección de células receptoras que contienen el cassette de expresión incorporado en los cromosomas; (iv) la regeneración de plantas a partir de dichas células seleccionadas; y (v) la identificación de maíz transgénico fértil, cuyo rendimiento no se ve afectado por una tasa de aplicación fértil, cuyo rendimiento no se ve afectado por una tasa de aplicación de glifosato que afecta el rendimiento de maíz que no posee el gen de maíz modificado. El maíz puede contener un promotor seleccionado del grupo formado por un promotor de actina de arroz, un promotor de histona de maíz y un promotor de histona de Arabidopsis-CaMV 35S fusionado. El cassette de expresión puede derivar del pDPG434, pDPG427, y pDPG443. La invención incluye la progenie de cualquier generación de las semillas de la planta de maíz transgénica fértil, así como las semillas de la progenie de la planta de maíz. Aún otro aspecto más de la invención actual es una planta de maíz fértil, endogámica, resistente a glifosato, que contiene un cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS. El promotor puede ser seleccionado del grupo formado por un promotor de actina de arroz, un promotor de histona de maíz y un promotor de histona de Arabidopsis-CaMV 35S fusionado. El cassette de expresión puede derivar del pDPG434, pDPC427 y pDPC443. En realizaciones particulares, la planta de maíz endogámica además puede definirse por contener un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GJ1 1 , FU 17, GG25 o GA21 ; las semillas que contienen estos sucesos de transformación fueron depositadas en ATCC y se les asignaron los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031 , ATCC 209032 y ATCC 209033, respectivamente. Aún otro aspecto más de la invención actual es una planta de maíz transgénica fértil cruzada, resistente a glifosato, preparada de acuerdo con el método que comprende: (i) la obtención de una planta de maíz transgénica fértil que contiene un cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; (ii) el cruzamiento de dicha planta de maíz transgénica fértil con una segunda planta de maíz que no posee el cassette de expresión con el fin de obtener una tercera planta de maíz que contenga dicho cassette de expresión; y (¡ii) el retrocruzamiento de dicha tercera planta de maíz con el fin de obtener una planta de maíz fértil retrocruzada; donde dicho cassette de expresión; y (iii) el retrocruzamiento de dicha tercera planta de maíz con el fin de obtener una planta de maíz fértil retrocruzada donde dicho gen EPSPS modificado es heredado a través de un progenitor masculino. En realizaciones particulares, la segunda planta de maíz es una planta endogámica. La tercera planta de maíz puede ser un híbrido. La planta de maíz puede definirse además, en realizaciones particulares, por comprender un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GJ1 1 , FU 17, GG25 o GA21 , con los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031 , ATCC 209032 y ATCC 209033, respectivamente. Aún otra realización más de la invención es una planta de maíz transgénica fértil cruzada, resistente a glifosato, preparada de acuerdo con el método que comprende: (i) la obtención de una planta de maíz transgénica fértil que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; y (ii) el cruzamiento de dicha planta de maíz transgénica fértil con una segunda planta de maíz que no posee el cassette de expresión, con el fin de obtener una tercera planta de maíz que contenga dicho cassette de expresión; donde dicho gen EPSPS modificado es heredado a través de un progenitor femenino. En realizaciones particulares, la segunda planta de maíz puede ser una planta endogámica, y la tercera planta de maíz puede ser un híbrido. La planta de maíz puede definirse además, en realizaciones particulares, por contener un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GJ11 , FU 17, GG25 o GA21 ; las semillas que contienen estos sucesos de transformación fueron depositadas en ATCC y se les asignaron los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031 , ATCC 209032 y ATCC 209033, respectivamente. Aún otro aspecto más de la invención es una planta de maíz transgénica fértil cruzada, resistente a glifosato, preparada de acuerdo con el método que comprende (i) la obtención de una planta de maíz transgénica fértil que contiene un cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; (¡i) el cruzamiento de dicha planta de maíz transgénica fértil con una segunda planta de maíz, con el fin de obtener una tercera planta de maíz que contenga dicho cassette de expresión; y (iii) el retrocruzamiento de dicha tercera planta de maíz con el fin de obtener una planta de maíz fértil retrocruzada; donde dicho gen EPSPS modificado es heredado a través de un progenitor femenino. En realizaciones particulares, la planta de maíz puede ser una planta endogámica y la tercera planta de maíz puede ser un híbrido. En una realización, la planta de maíz puede definirse además por contener un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GJ1 1 , FU 17, GG25 o GA21 ; las semillas que contienen estos sucesos de transformación poseen los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031 , ATCC 209032 y ATCC 209033, respectivamente. Aún otro aspecto más de la invención actual es una planta de maíz híbrida, resistente a glifosato, que contiene un cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS. En una realización, el promotor se selecciona del grupo formado por un promotor de actina de arroz, un promotor de histona de maíz y un promotor de histona de Arabidopsis-CaMV 35S fusionado y el cassette de expresión deriva del pDPG434, pDPC427 y pDPC443. La planta de maíz puede definirse además, en realizaciones particulares, por contener un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GA21. GG25, GJ11 y FI1 17. Aún otro aspecto más de la invención es una planta de maíz transgénica híbrida, resistente a glifosato, preparada de acuerdo con el método que comprende el cruzamiento de una primera y segunda planta de maíz endogámica, donde una de dichas primera y segunda plantas de maíz endogámicas contiene incorporado en los cromosomas un cassette de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee insoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS. En una realización, el promotor es seleccionado del grupo formado por un promotor de actina de arroz, a promotor de histona de maíz y un promotor de histona de Arabidopsis-CaMV 355 fusionado, y dicho cassette de expresión deriva de pDPG434, pDPG4274 y/o pDG443. La planta de maíz puede definirse además, en realizaciones particulares, por contener un suceso de transformación seleccionado del grupo formado por GA21 , GG25, GJ11 y FI1 17. Aún otro aspecto más de la invención es una planta de maíz transgénica fértil cruzada, resistente a glifosato, preparada mediante un proceso que comprende: (i) la obtención de una planta de maíz transgénica fértil que contienen el cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; (ii) el cruzamiento de dicha planta de maíz transgénica fértil con una segunda planta de maíz, con el fin de obtener una tercera planta de maíz que contenga dicho cassette de expresión; y (iü) el cruzamiento de dicha tercera planta de maíz transgénica fértil con una cuarta planta de maíz, con el fin de obtener una quinta planta de maíz transgénica que contenga dicho cassette de expresión. En una realización, la segunda y cuarta planta de maíz poseen los mismos genotipos, en otra realización la segunda y cuarta planta de maíz poseen genotipos diferentes. Aún otro aspecto más de la ¡nvención está constituido por semillas de una planta de maíz transgénica fértil, conteniendo dichas semillas un cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS, donde dichas semillas se preparan mediante un proceso que comprende los siguientes pasos: (i) obtener una planta de maíz transgénica progenitora fértil que contiene un cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; (ii) mejorar dicha planta progenitora con una segunda planta de maíz fértil con el fin de producir una numerosa progenie fértil de planta de maíz transgénicas, donde dichas plantas de maíz de la progenie incluyen plantas que expresan un cassette de expresión incorporado en los cromosomas que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicha gen EPSPS; (¡ii) la selección de dicha progenie de plantas de maíz de una planta que presenta resistencia a glifosato; y (iv) la obtención de semillas a partir de dicha planta de maíz de la progenie seleccionada. En una realización las plantas de maíz de la progenie están separadas en dos generaciones de la planta de maíz transgénica progenitora. Las plantas de maíz de la progenie que presentan resistencia a glifosato pueden ser seleccionadas evaluando la resistencia a glifosato de las plantas con una tasa de aplicación de, por ejemplo, 1X, 2X, 3X, o 4X (1X es equivalente a 16 onzas de Roundup™ por acre). En una realización particular, la segunda planta de maíz fértil es una planta de maíz no transgénica y la planta es polinizada con polen de una planta de maíz transgénica progenitora masculina. La planta progenitora de maíz se puede polinizar con polen de dicha segunda planta de maíz fértil y donde dicha planta de maíz progenitora es una planta de maíz transgénica progenitora femenina.

Aún otro aspecto más de la invención es un método para incrementar el rendimiento de maíz en un campo que comprende: (i) la siembra de plantas de maíz transgénicas fértiles tranformadas con un cassette de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica una proteína EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz unido operativamente a dicho EPSPS; y (ii) aplicar glifosato a dicho campo en un rango de aplicación que inhiba el rendimiento de una planta de maíz que no comprende dicho gen de maíz modificado, en donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénica fértil no es afectado por dicha aplicación de glifosato. En realizaciones particulares, el rango de aplicación del glifosato puede ser 1X, 2X o 4X. En otro aspecto, la ¡nvención es un método para inhibir el crecimiento de maleza en un campo de maíz que comprende: (i) plantar plantas de maíz transgénicas fértiles transformadas con un cassette de expresión que comprende (a) un gen EPSPS modificado que codifica una proteína EPSPS que posee ¡soleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz unido operativamente a dicho gen EPSPS; y (ii) aplicar glifosato a dicho campo en un rango de aplicación que inhiba el rendimiento de una planta de maíz que no comprende dicho gen de maíz modificado, en donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénica fértil no es afectado por dicha aplicación de glifosato. En realizaciones particulares, el rango de aplicación de glifosato, puede ser 1X, 2X o 4X.

Aún otro aspecto más de la invención es un método para inhibir el crecimiento de malezas en un campo de maíz que comprende: (i) la siembra de plantas de maíz transgénicas fértiles transformadas con un cassette de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un proteína EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; y (ii) la aplicación de glifosato a dicho campo con un tasa de aplicación que inhibe el rendimiento de una planta de maíz que no contiene dicho gen de maíz modificado, donde el rendimiento de dicha aplicación de glifosato. En realizaciones particulares, la tasa de aplicación de glifosato puede ser 1X, 2X o 4X. Aún otro aspecto más de la invención es un método para cultivar maíz que comprende: (i) la siembra de plantas de maíz transgénicas fértiles transformadas con un cassette de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado, que codifica un proteína EPSPS que posee isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz ligado operativamente a dicho gen EPSPS; y (ii) el tratamiento de dicho maíz con glifosato a una tasa de aplicación que inhibe el rendimiento de una planta de maíz que no contiene dicho gen de maíz modificado, donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénica fértil no es afectado por dicha aplicación de glifosato. En realizaciones particulares, la tasa de aplicación puede ser de 1X, 2X, 4X.

Queda claro que la capacidad de proporcionar aún una sola línea de maíz transgénica fértil es, en general, suficiente para permitir la introducción del componente transgénico (por ejemplo, ADN recombinante) de dicha línea en una segunda línea de maíz de elección. Esto se debe a que al proporcionar una descendencia transgénica fértil, la práctica de la invención permite mover a continuación el gen seleccionado, por medio de una serie de manipulaciones de cría, de una línea de maíz a otra línea de maíz completamente diferente. Por ello, la invención actual pretende incluir cualquier planta de maíz, de cualquier generación, que posea uno o más transgenes que contengan uno de los sucesos de transformación GJ1 1 , FU 17, GG25 o GA21 ; las semillas que contienen estos sucesos de transformación poseen los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031 , ATCC 209032 y ATCC 209033, respectivamente. La invención incluye además las semillas de plantas de maíz de cualquier generación que contenga los sucesos de transformación GJ11 , FU 17, GG25 o GA21. En otro aspecto de la invención presente, se revela un método para la producción de alimento que comprende los pasos de: (i) obtener una cultivar la planta Zea mays transgénica fértil que comprende un ADN heterólogo que comprende un evento de transformación seleccionado entre un grupo que consiste en GG25, GJ11 , FU 17 y GA21 , en donde el ADN es hereditario; (ii) cultivar la planta cultivar la planta Zea mays transgénica; (iii) obtener semillas de la cultivar la planta Zea mays cultivada; y (iv) preparar alimento para humanos a partir de las semillas. La presente invención incluye también un método para producir aceite que comprende: (i) obtener una cultivar la planta Zea mays transgénica fértil; fértil que comprende un ADN heterólogo que comprende un evento de transformación seleccionado entre un grupo que consiste en GG25, GJ11 , FU 17 y GA21 , en donde el ADN es hereditario; (¡i) cultivar la planta cultivar la planta Zea mays transgénica; (iii) obtener semillas de la cultivar la planta Zea mays cultivada; y (iv) preparar aceite a partir de las semillas. En otro aspecto de la presente invención se revela un método para la producción de semillas que comprende: (i) obtener una planta de maíz transgénica fértil, que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado, que codifica una proteína EPSPS que posee isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz unido en forma operativa a dicho gen EPSPS; (ii) cultivar dicha planta Zea mays transgénica; y (iii) obtener semillas de dicha planta Zea mays cultivada. Otro aspecto de la presente invención provee un método de cultivar de plantas que comprende los pasos de: (i) plantar en proximidad plinizante semillas capaces de ser plantas parentales primera y segunda, donde la primer planta parental comprende un primer transgen, siendo la planta capaz de ser estéril masculina mediante el tratamiento con un herbicida preseleccionado; (¡i) cultivar las semillas para producir la primera y segunda planta parental; (iii) inducir la esterilidad masculina en la primer planta parental por tratamiento de la planta con el herbicida preseleccionado, (iv) permitir que la segunda planta de maíz sea polinizada por la primer planta parental; y (v) recolectar las semillas producidas por la primer planta. En realizaciones particulares la segunda planta parental también se define como resistente al herbicida preseleccionado. La primera y segunda planta pueden ser seleccionadas de un grupo que consiste en: maíz, trigo, arroz, avena, cebada, sorgo, girasol, alfalfa y soya, El herbicida preseleccionado puede ser glufosinato, imidazolinona, sulfonilurea, canamicina, G418, bromoxinilo o metatrexato. El primer transgen puede comprender un evento de transformación GG25 y/o un evento de transformación GJ11 , o cualquier otro transgen similar adecuado. La segunda planta puede comprender un evento de transformación GA21 y/o un evento de transformación FU 17 o cualquier otro transgen similar adecuado. En realizaciones particulares, el paso de inducir la esterilidad masculina, comprende la aplicación de una concentración de glifosato de 8 onzas por acre a 96 onzas por acre, las cuales pueden aplicarse entre las etapas V5 y VT del desarrollo. Otro aspecto de la invención presente es un método para probar la calidad de una semilla de maíz híbrida que comprende una resistencia herbicida al evento de transformación tal GA21 , GG25, FU 17 o GJ1 1. El método comprende los pasos de (i) plantar dichas semillas, (ii) cultivar las semillas; y (iii) tratar las plantas cultivadas de la semilla con un herbicida preseleccionado. En realizaciones particulares las semillas se seleccionan entre un grupo que consiste en: maíz, trigo, arroz, avena, cebada, sorgo, girasol, alfalfa y soya. En otras realizaciones las semillas son semillas de maíz. El evento de transformación puede comprender un EPSPS mutado y el herbicida preseleccionado puede ser glifosato. Más específicamente, las plantas pueden ser tratadas con de 8 a 96 onzas por acre de glifosato, y este tratamiento puede llevarse a cabo entre las etapas V4 y VT del desarrollo. Alternativamente, el gen puede ser otro gen resistente al herbicida adecuado y el herbicida preseleccionado se selecciona entre un grupo consistente en glufosinato, imidazolinona, sulfonilurea, canamicina, G418, bromoxinilo y metotrexato. Otro aspecto la invención consiste en un método de cultivo de plantas que comprende los pasos de: (i) plantar una semilla capaz de crecer en una primera planta, comprendiendo la planta un evento de transformación que le confiere resistencia al herbicida; (ii) cultivar la semilla para producir la primera planta; (iii) tratar la primer planta con un herbicida preseleccionado para obtener polen que posee el evento de transformación inviable; (iv) permitir que el polen que posee el evento de transformación polinice la primer planta o una segunda planta en donde el polen que posee el evento de transformación permanece viable después del tratamiento; y (b) recolectar semillas de la primera o segunda plantas. El evento de transformación puede comprender un gen EPSPS mutado unido de manera operativa a un promotor funcional en dicha planta, y puede ser un GA21 o FU 17. El tratamiento de la primera planta de maíz puede comprender tratar la primera planta de maíz con de 8 a 96 onzas por acre de glifosato, y puede llevarse a cabo entre las etapas V4 y VT de desarrollo. La primera planta puede ser seleccionada de un grupo que consiste en: maíz, trigo, arroz, avena, cebada, sorgo, girasol, alfalfa y soya. Además del glifosato, el herbicida preseleccionado puede seleccionarse también entre un grupo que se selecciona entre un grupo consistente en glufosinato, imidazolinona, sulfonilurea, canamicina, G418, bromoxinilo y metotrexato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1. Mapa de plásmido del pDPG165. Se muestran los sitios de restricción y las ubicaciones están indicadas como pares de bases. FIG. 2. Mapa de plásmido del pDPG427. Se muestran los sitios de restricción utilizados para los análisis de transferencia Southern y las ubicaciones están indicadas como pares de bases. FIG. 3. Mapa de plásmido del pDPG434. Se muestran los sitios de restricción utilizados para los análisis de transferencia Southern y las ubicaciones están indicadas como pares de bases. FIG. 4. Mapa de plásmido del pDPG443. Se muestran los sitios de restricción utilizados para los análisis de transferencia Southern y las ubicaciones están indicadas como pares de bases. FIG. 5A y 5B. Análisis de transferencia Southern para determinar la cantidad de inserciones de transgenes en GA21. A: La línea 1 contiene ADN GA21 digerido con EcoRV. La línea 2 contiene ADN control no transformado digerido con EcoRV. La línea 3 contiene el pDPG434 digerido con Notl. El transferido fue analizado con sonda con respecto al fragmento Notl de 3.4 Kb del pDPG434. B: El transferido que se mostró en A fue lavado y luego fue analizado nuevamente con sonda con un fragmento de 324 pb del gen EPSPS mutante. FIG. 6. Análisis de transferencia Southern para estimar la cantidad de copias y la integridad del gen EPSPS mutante. La línea 1 contiene ADN GA21 digerido con EcoRl/Xbal. La línea 2 contiene ADN control no transformado digerido con EcoRl/Xbal. La línea 3 contiene el pDPG434 digerido con EcoRl/Xbal. El transferido fue analizado con sonda con el fragmento de PCR de 324 pb del gen EPSPS. FIG. 7. Análisis de transferencia Southern para confirmar la falta de la secuencia estructural del plásmido GA21. El ADN genómico de una planta transformada con el gen bla (línea 1 ), una planta GA21 (línea 2) y el ADN plásmido del pDPG427 fueron digerido con Bglll. El transferido fue analizado con sonda con un fragmento Sspl/AIII de 1.7 Kb del pBluescrip SK(-) que contiene el origen de replicación ColEI y el gen bla. FIG. 8A y 8B. Efecto de la aplicación de glifosato sobre el crecimiento y la fertilidad de los híbridos DK580 y DD626 de los sucesos de transformación GA21 FU 17, GG25 y GJ1 1. Los tratamientos consistieron de la aplicación de glicación a las tasas de OX, 1X y 4X (1X=16 onzas de ROUNDUP ULTRA™ / acre). El valor de ELH promedio (altura de la hoja extendida en centímetros) se midió 10 días después de la aplicación de glifosato. A. Efectos de la aplicación de glifosato en la etapa V4 del desarrollo.

B. Efecto de la aplicación de glifosato en la etapa V8 del desarrollo. FIG. 9A y 9B. Efecto sobre el rendimiento de la aplicación de glifosato en los híbridos DK580 y DK626 con los sucesos de transformación FU 17, GA21 , GG25 y GJ1 1 Se efectuaron comparaciones entre los 4 sucesos de transformación en cada uno de los híbridos tanto con y sin la aplicación de glicación. Además, se efectuaron comparaciones entre cada uno de los híbridos con el suceso de transformación incorporado versus el híbrido sin el suceso de transformación. A. Comparación del efecto de la aplicación de glifosato sobre el rendimiento de híbridos DK580 cuando era aplicado en la etapa V4. B. Efecto de la aplicación de glifosato sobre el rendimiento de híbridos DK626 cuando era aplicado en la etapa V8. FIG. 10. Análisis de transferencia Southern para detectar las inserciones de transgenes GA21 , FU 17, GG25, y GJ1 1. Transferencia Southern de ADN genómico (líneas 2, 5, 10, 1 1 , 12) y ADN plásmido (línea 13) digerido con Bglll. Los transferidos fueron analizados con sonda con la región de poliadenilación nos 3 de 0.27 kb del gen de la nopalina sintetasa de Abrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984). Las líneas 2, 5, 10 y 1 1 contienen ADN genómico de plantas que poseen los sucesos de transformación FU 17, GA21 , GG25 y GJ1 1 , respectivamente. La línea 12 contiene ADN de control negativo de una planta de maíz no transformada y la línea 13 contiene el ADN del plásmido pDPG427.

FIGS 11A, 1 1 B y 1 1 C. Análisis de transferencia Southern para detectar las inserciones de transgenes GA21 , GG25 y GJ1 1 utilizando varias enzimas de restricción. El ADN genómico de una planta control no transformada (línea 1 ) así como de plantas que contenían los sucesos de transformación GA21 , GG25 y GJ1 1 (líneas 2, 3 y 4, respectivamente) fue dirigido con varias enzimas de restricción y analizados con sonda con un fragmento generado por PCR de 324 bp del gen EPSPS (véase el ejemplo 8 para la generación del fragmento EPSPS). El ADN fue digerido con EcoRI (Fig. 1 1 A), Sphl (Fíg. 1 1 B) y Sacl. (Fig 1 1 C). FIG. 12. Secuencia deducida de aminoácidos de la proteína EPSPS mutante de maíz. La secuencia incluye el péptido de tránsito OTP aislado de los genes de la ribulosa 1 ,5-bif osfato carboxilasa oxigenasa de maíz y girasol (RuBisCo), (los aminoácidos 1-125 constituyen el péptido de tránsito). FIG. 13. Disposición de campo para el estudio de la resistencia a glifosato de los híbridos DK580 y DK626 GA21 , GG25, FI117 y GJ11. Se dan los valores de repetición (1-3), columna (COL1-COL12), fila (1-4, híbrido (DK580 o DK626), suceso de transformación (GA21 , FU 17, GG25, o GJ1 1 ), estado transformado o no transformado (N o T), nivel de aplicación de glifosato (OX, 1X o 4X) y la etapa del desarrollo en el momento de la aplicación de glifosato (V4 o V8). Las pruebas se llevaron a cabo en Dekalb, Illinois y Thomasboro, Illinois, durante 1996. Todas las filas se sembraron con el doble de densidad de siembra normal, es decir, 60 millas por fila, porque los híbridos segregaban 1 :1 para la característica de resistencia a glifosato. Las plantas rociadas fueron entresacadas hasta 30 plantas por fila no antes de los 7 días después de la aplicación del glifosato en un momento donde era posible identificar las plantas susceptibles a glifosato. Los lotes no rociados fueron entresacadas hasta 30 plantas por fila en el mismo momento. Fig. 14. Mapa de plásmido del pDPG425. Se muestran los componentes principales y los sitios de restricción y las ubicaciones se indican en pares de kilobases. Fig. 15. Mapa de plásmido del pDPG405. Se muestran los componentes principales y los sitios de restricción y las ubicaciones se indican en pares de bases.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Además de la transformación directa de un genotipo particular con un gen EPSPS mutante, las plantas resistentes a glifosato se pueden obtener cruzando una planta que posee un gen EPSPS mutante con una segunda planta sensible al glifosato. El "cruzamiento" de una planta para obtener una línea de plantas con un mayor rendimiento con relación a la línea de plantas inicial, como se describe en la presente documentación, se define como las técnicas que dan como resultado un gen EPSPS mutante introducido en una línea de plantas por cruzamiento de una línea inicial con una línea de plantas donantes que comprende un gen EPSPS mutante. Para lograr esto en general se llevan a cabo los siguientes pasos: (a) sembrar semillas de la primera (línea inicial) y segunda (línea de plantas donantes que contiene un gen EPSPS mutante) planta progenitora; (b) cultivar las semillas de la primera y segunda planta progenitora hasta obtener plantas que llevan flores; (c) polinizar la flor femenina de la primera planta progenitora con el polen de la segunda planta progenitora; y (d) cosechar las semillas producidas en la planta progenitora que lleva la flor femenina. La conversión por retrocruza se define en la presente documentación como el procedimiento que incluye los pasos de: (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contenga un gen, secuencia de ADN o elemento deseado con una planta de un segundo genotipo que carezca de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (b) seleccionar una o más plantas de progenie que contenga el gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (c) cruzar la planta de progenie con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir los pasos (b) y (c) con el propósito de transferir dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado de una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo.

La incorporación de un elemento de ADN en el genotipo de una planta se define como el resultado del proceso de conversión por retrocruza.

El genotipo de una planta en el cual se ha incorporado una secuencia de ADN puede denominarse un genotipo, línea, endogámico o híbrido convertido por retrocruza. De manera similar, el genotipo de una planta que no posee la secuencia de ADN deseada puede denominarse genotipo, línea, endogámico o híbrido no convertido. Se considera que las plantas resistentes a glifosato pueden obtenerse por transferencia de la secuencia de ADN que contiene un gen EPSPS mutante y las secuencias ADN genómico adyacentes de plantas donantes transformadas con el gen EPSPS mutante FU 17, GA21 , GG25 y GJ11 , con lo cual la planta receptora presenta una mayor tolerancia al herbicida glifosato después de la introducción del gen EPSPS mutante que codifica dicho segmento de ADN. La secuencia de ADN puede además transferirse a otros genotipos por medio del proceso de conversión por retrocruza y la resistencia al glifosato en dichas plantas convertidas por retrocruza, o los híbridos derivados de los mismos, es mayor en relación a la de una planta no convertida. Los sucesos de integración del gen EPSPS mutante, así como el ADN del vector asociado, pueden emplearse como marcadores genéticos en la cría o el mejoramiento asistido por marcadores con el fin de seleccionar las plantas de maíz con una mayor resistencia a herbicidas.

I. Control de malezas con herbicidas El control químico de malezas es una ciencia que involucra conocimientos en los campos de la química y la biología, alguna familiaridad con las reacciones de las plantas a los agentes fitotóxicos y por lo menos experiencia de observación de las respuestas de las malezas y los cultivos comunes a los herbicidas. La ecología de malezas y cultivos y la apreciación de los factores determinantes de la tolerancia y la susceptibilidad son temas importantes. Y finalmente, es necesario un vasto registro de información detallada relativa al rol del control de malezas en la agricultura práctica. Las malezas representan una amenaza para la salud y el bienestar de los seres humanos. Reducen el rendimiento y el valor de ios cultivos; así como también incrementan los costos de producción y cosecha.

Las formas más importantes por las cuales las malezas causan estos efectos son: 1.- Competencia con las plantas de cultivos por los elementos esenciales para el crecimiento y el desarrollo. 2.- Producción de productos químicos tóxicos o irritantes que provocan problemas de salud en el hombre o en los animales. 3.- Producción de cantidades inmensas de semillas o partes reproductivas vegetativas o ambos que contaminan los productos de la agricultura y perpetúan las especies en los campos de cultivo. 4.- Producción en campos de cultivo y en campos que no son de cultivo de vastas cantidades de vegetación que debe ser eliminada.

En las áreas que son de cultivo, las malezas son consideradas más como una molestia que como una amenaza; pero aún en este caso las malezas constituyen un peligro potencial para el ser humano. El polen de las malezas puede provocar la fiebre del heno u otras alergias y las substancias químicas tóxicas presentes en la savia o en las hojas pueden causar irritación o enrojecimiento cuando se produce un rozamiento con las mismas. Algunas substancias producidas por las malezas pueden causar la muerte si son ingeridas. Las malezas tienden a ocultar herramientas y equipo, conectores y válvulas, bocas de irrigación y aún agujeros en la tierra. El crecimiento denso, conservador de humedad de las malezas colaboran en el deterioro de estructuras de madera y en la formación de herrumbre de cercados de metal, construcciones y maquinaria inmóvil. Las mezas secas y muertas constituyen un peligro de fuego, sujetas a ignición por una chispa, un cigarrillo mal apagado o aun un trozo de vidrio que refleje la luz solar. Las malezas reducen el aprovechamiento de las áreas recreativas. Impiden el flujo de agua en los cuerpos de agua y dificultan el tráfico en el agua, en especial en las regiones tropicales y subtropicales. En las tierras de cultivo, las malezas reducen los rendimientos y la calidad de los cultivos, interfieren con la cosecha y aumentan el tiempo y los costos involucrados en la producción de dichos cultivos. Las malezas cobijan insectos y organismos que provocan enfermedades en las plantas; y en algunos casos, sirven como huéspedes alternativos esenciales para las plagas. Algunas malezas son indeseables en tierras de pastoreo, de heno y pastos naturales debido al daño mecánico que le infringen al ganado. Los tallos leñosos, las espinas y las aristas duras de las semillas causan daño en la boca y el tracto digestivo del ganado; y los pelos y las fibras de algunas plantas tienden a formar bolas y obstruir los intestinos, en especial en caballos, provocando serios problemas. Cuando son ingeridas por vacas lecheras, algunas malezas tales como ambrosia, ajo salvaje (Allium vineale L.) y mostaza, entre otros, le dan un olor o sabor distintivo desagradable a la leche y la manteca. Las unidades de desecho de las semillas armadas con púas pueden volverse tan enredadas en la lana de las ovejas hasta el punto de disminuir su valor de mercado. Las plantas parásitas, como el rascalino (Cuscuta sp.), hierba tora (Orobanche sp.), roban las substancias nutritivas orgánicas de las plantas huéspedes. Las malezas pueden además servir como plantas huésped de plagas de la agricultura. Los ejemplos de malezas que sirven como huéspedes para las plagas de la plantas se citan más adelante. El lepido y tanaceto (Descurainia sp.) mantienen grandes poblaciones de polillas diamantinas durante fines de otoño, invierno y primavera; también son huéspedes de áfido de nabo y del áfido verde del durazno. Varias especies de malezas de la familia de la belladona (Solanaceae) son huéspedes de insectos que habitualmente atacan la berenjena, el pimiento, la papa y el tomate; por ejemplo, la solana (Solanum carolinense L.= es un huésped del escarabajo de papa de Colorado, y la belladona negra (S. nigrum L.) es un huésped de la oruga medidora. El dondiego de día es un huésped importante de insectos que atacan batatas, en especial el muy destructor gorgojo de la batata. La ambrosia sirve como huésped para los mosquitos Mansonia, un vector insecto para la enfermedad de encefalitis en seres humanos y filarisis rural. El palo de rosa (Berberís vulgaris L.) es un huésped esencial de la roya del tallo en el trigo en las regiones trigueras del norte de los EE. UU.. La grosella silvestre (Eleusine induce [L] Great.) y tipos de juncia púrpura son huéspedes del virus enano amarillo de la cebada. Las grosellas (Ribes sp.) son huéspedes de la roya de los pinos. Un cultivo que depende en gran medida del control químico de las malezas es el maíz. El maíz se ha cultivado en 60 millones a 83 millones de acres por año en el período de 1982 a 1993. En 1993, quince estados superaban el millón de acres sembrados con maíz y un 74% de los cultivos eran de lowa, Illinois, Nebraska, Minnesota e Indiana. Se aplicaron herbicidas a un 97% aproximadamente del maíz en los EE. UU. y más del 98% de los acres sembrados con maíz lowa, Illinois, Minnesota e Indiana tenían aplicaciones de herbicidas (Agricultura Chemical Usage, 1994). Además, se aplicó un promedio de 2.1 ingredientes activos por acre en 1992. Las malezas compiten con el maíz por nutrientes, agua y luz y cuando no son controladas pueden reducir significativamente el rendimiento del maíz. Por ejemplo, se estima que entre 1972 y 1976 los rendimientos maíz fueron reducidos en un 10% aproximadamente debido a malezas (Chandler, J.M., 1981 , CRC Handbook of Pest Management in Agriculture, Vol. 1 , editado por Pimente. D., págs. 95-109). Es de especial importancia controlar el crecimiento de malezas en las etapas tempranas del desarrollo de la planta de maíz, porque aun cantidades de malezas pueden tener un impacto negativo dramático sobre el rendimiento de los cultivos. Las malezas son controladas primariamente por medios mecánicos o químicos. Si bien se practica ampliamente el cultivo mecánico, las medidas de control químico de las malezas están muy difundidas y más del 95% de los cultivos de maíz en los EE. UU. son tratados con herbicidas químicos. El uso indiscriminado de herbicidas, sin embargo, puede conducir al desarrollo de malezas resistentes.

Por ello es importante desarrollar métodos de control químico de las malezas que representan nuevas formas de acción y que no representen grandes probabilidades de ser seleccionados por malezas resistentes. Un grupo diverso de especies de malezas necesita un rango de métodos de control en maíz. Las malezas de hojas anchas, tales como alcotán, quenopodio, girasol salvaje, ambrosia y pimienta de agua son de cuidado en maíz. Además, las malezas de pastos, tales como el pasto Johnson, pasto común, mijo común de otoño, cola de zorro, gramilla, mijo salvaje y pasto lanoso son comunes en maíz. Las malezas perennes constituyen un problema adicional ya que son capaces de propagarse con semillas y/o socavar partes de la planta y pueden requerir aplicaciones de múltiples herbicidas. El gran conjunto de especies de malezas que se encuentran en un campo de maíz requieren el uso de muchos tipos de herbicidas y muchas aplicaciones a fin de lograr un control de dichas malezas. Por ello, los regímenes de aplicación de los herbicidas varían según el espectro de malezas y las prácticas agronómicas locales. En el cuadro 1 se resume el tratamiento con herbicida de los acres sembrados con maíz en 1993.

CUADRO 1 Aplicaciones de herbicidas en maíz Porcentaje de acres tratados con los principales herbicidas de maíz Fuente: Agricultural Chemical Usage, marzo de 1994, NASS y ERS, USDA. Una sola aplicación de herbicidas cerca del momento de la siembra es lo más común para maíz. Habitualmente esta aplicación comprende uno de los herbicidas de triazina (atrizina, cianazina, simazina) para controlar las malezas de hoja ancha y un herbicida de acetanilida (metolaclor o alaclor) para controlar los pastos anuales. El control de malezas de hojas anchas y pastos problemáticos con herbicidas de post-emergencia, tales como dicamba, bromoxinilo, bentazon, nicosulfurón y primisulfurón, fue aplicado aproximadamente a la mitad de los acres sembrados con maíz en 1993. La elección del herbicida es coherente en todos, excepto en los estados centrales del norte (por ejemplo, Minnesota y Dakota del Sur). La atrazina se utilizó en aproximadamente el 69% de los acres sembrados con maíz en 1993. La mezcla para tanque más común era atrazina y metolaclor para un control de malezas de amplio espectro. El uso de herbicidas en los estados centrales del norte difiere, sin embargo, por cuanto existe una utilización reducida de atrazina debido al sobrante de granos pequeños y de soya en los suelos de pocas lluvias y alto pH de la región. Además, dado que la estación de crecimiento es más corta en la región central del norte, se prefiere emplear herbicidas post-emergentes por cuanto no demoran las operaciones de la siembra. Por ejemplo en 1993, el herbicida más común utilizado en maíz en Minnesota fue el herbicida post-emergente dicamba (todos de Agricultural Chemical Usage, 1994). Al seleccionar el herbicida para el control de malezas en maíz, se debe elegir una substancia química que presente el espectro adecuado de malezas eliminadas y no tendrá efectos adversos de larga duración sobre el medio ambiente. Además al disminuir la labranza y la siembra de acres de labranza mínima para el maíz, es necesario disponer de agentes de control de malezas que puedan aplicarse post-emergencia y aplicarse a lugares específicos según necesidad. Algunos de los herbicidas que actualmente se aplican al maíz son limitados en cuanto al espectro de malezas, pueden persistir en el suelo o contaminar la capa freática o pueden conducir al desarrollo de resitencia al herbicida por parte de las malezas. Más aún, algunos herbicidas que presentan un potencial reducido para los efectos adversos para el medio ambiente y que exhiben un amplio espectro de capacidad de eliminación de malezas, no son discriminatorios en su capacidad de eliminar otras plantas, es decir, las plantas de cultivos tales como el maíz son afectados de manera igual que las especies de malezas. - 10 Solamente a través de la introducción de genes que confieran resistencia a * dichos herbicidas es posible emplear estas substancias químicas para el control de malezas en maíz. El glifosato es un herbicida de post-emergencia y de amplio espectro que es degradado rápidamente en el suelo, presenta una toxicidad baja para los organismos que no son el blanco y no contribuye a la contaminación de la capa freática. La disponibilidad de glifosato para el control de malezas en maíz cultivado a campo ha sido pobre hasta el momento debido al amplio espectro de sus efectos. Las plantas transgénicas resistentes a glifosato descritas en la presente documentación le brindarán al granjero una mayor flexibilidad al tratar los problemas con las malezas. El maíz híbrido resistente a glifosato le brindará al granjero lo siguiente: 1 ) el uso de un herbicida nuevo que ofrece un amplio espectro de control de malezas anuales y perennes, de hojas anchas y pastos; 2) una menor dependencia de las aplicaciones de herbicidas pre-siembra; 3) una mayor flexibilidad en la aplicación de herbicidas sobre una base de según necesidad; 4) un nuevo modo de acción del herbicida que disminuirá la probabilidad de desarrollar malezas resistentes a herbicidas; y 5) un herbicida que se puede emplear en los sistemas sin labranza que conservan la energía y reducen la erosión del suelo. Dadas las ventajas ofrecidas, los herbicidas de post-emergencia están siendo aplicadas a un área de siembra de maíz que es mayor cada año, por ejemplo, aproximadamente 15 millones de acres de maíz, un 20% del total de acres sembrados de maíz reciben solamente aplicaciones de herbicidas post-emergentes. El maíz resistente a glifosato le proporcionará al granjero de un método alternativo para controlar las malezas. Actualmente se aplica un promedio de 2,1 herbicidas al maíz durante la estación de crecimiento. Se espera que el uso de glifosato para el control de malezas reducirá la cantidad de tipos de herbicidas aplicados, así como la cantidad de aplicaciones requeridas. El maíz resistente a glifosato disminuirá, por lo tanto, los riesgos para el medio ambiente provocados por herbicidas en tanto al mismo tiempo incrementa la eficacia del control químico de malezas.

II. Distribución de ADN Después de la generación de células receptoras, la presente invención en general incluye a continuación pasos dirigidos a la introducción de un segmento de ADN exógeno en una célula receptora con el fin de crear una célula transformada. Se cree que la frecuencia de casos de células que reciben ADN es baja. Más aún, es muy probable que no todas las células receptoras que reciben segmentos de ADN darán como resultado una célula donde el ADN se encuentre integrado y/o expresado de forma estable en el genoma vegeta. Algunas solamente mostrarán una expresión inicial y transitoria del gen. Sin embargo, ciertas células provenientes de virtualmente cualquier especie de monocotiledónea pueden ser transformadas de forma estable y estas células pueden desarrollar en plantas transgénicas, por medio de la aplicación de las técnicas descriptas en la presente documentación. Existen muchos métodos para introducir segmentos de ADN transformadores en células, pero no todos son adecuados para la distribución del ADN en las células vegetales. Se cree que los métodos adecuados incluyen virtualmente cualquier método por el cual es posible introducir ADN en una célula, como por ejemplo mediante infección por Agrobacterium, distribución directa de ADN como, por ejemplo, por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh y otros., 1993), por captación de ADN mediada por desecación/inhibición, por electroporación, por agitación con fibras de carburo de silicio, por aceleración de partículas recubiertas con ADN, etc. La transformación medida por Agrobacterium se describió en la Patente de los EE.UU. No. 5,591 ,616, cuyo contenido se incorpora específicamente a la presente documentación a modo de referencia. En algunas realizaciones, se prefieren los métodos de aceleración e incluyen, por ejemplo, bombardeo con microproyectiles y análogos. (i) Electroporación Cuando se desea introducir ADN por medio de la electroporación, se considera que el método de Krzyzek y otros. (Patente de los EE.UU. No. 5.384.253, cuyo contenido se incorpora a la presente documentación a modo de referencia) será particularmente ventajoso. En este método, se emplean ciertas enzimas degradadoras de la pared celular, tales como enzimas degradadoras de pectina, para que las células receptoras blanco se vuelvan más susceptibles a la transformación por electroporación que las células sin tratar. Como alternativa, las células receptoras se pueden volver más susceptibles a la transformación, por lesión mecánica. Para efectuar la transformación por electroporación se pueden emplear tejidos friables, como un cultivo de células en suspensión, o callo embriónico o, como alternativa, se pueden transformar directamente embriones inmaduros u otros tejidos organizados. Se degradarán parcialmente las paredes celulares de las células elegidas exponiéndolas a las enzimas degradadoras de pectina (pectoliasas) o por acción mecánica de forma controlada. Dichas células serán entonces receptoras de la transferencia de ADN por electroporación que se puede llevar a cabo en esta etapa y las células transformadas se identificarán entonces mediante un protocolo de selección o rastreo adecuado según la naturaleza del ADN recién incorporado. (¡i) Bombardeo con micropoyectiles Otro método ventajoso para distribuir segmentos de ADN transformadores en células vegetales es por bombardeo de microproyectiles.

En este método, las partículas se recubren con ácidos nucleicos y se distribuyen en el interior de las células mediante una fuerza de propulsión. Los ejemplos de partículas incluyen aquellas compuestas por tungsteno, oro, platino y análogos. Se considera que en algunos casos la precipitación de ADN sobre las partículas de metal no sería necesaria para la distribución de ADN a una célula receptora utilizando bombardeo con microproyectiles. Sin embargo, se considera que las partículas pueden contener ADN en lugar de estar recubiertas con ADN. Por consiguiente se propone que las partículas recubiertas con ADN podrían incrementar el nivel de distribución de ADN por medio del bombardeo de partículas pero no son en y por sí mismas, necesarias. Una de las ventajas del bombardeo con microproyectiles, además de que constituye un medio efectivo para transformar células vegetales de forma estable y reproducible, es que no se requiere aislamiento de los protoplastos (cristou y otros., 1988) ni susceptibilidad a infección por Agrobacterium. Una realización ilustrativa de un método para distribuir ADN en células vegetales por aceleración es un Sistema de Distribución de Partículas Biolístico, que se puede utilizar para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de una pantalla, como una pantalla de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie filtrante cubierta con las células vegetales cultivadas en suspensión. La pantalla dispersa las partículas de manera tal que no alcanzan a las células receptoras en grandes agregados.

Se cree que la presencia de la pantalla entre el aparato de proyectiles y las células a bombardear reduce el tamaño de los agregados de proyectiles y contribuye a lograr una frecuencia de transformación más alta reduciendo el daño infringido sobre las células receptoras provocando por proyectiles que son demasiado grandes. Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran con preferencia sobre filtros o un medio de cultivo sólido. Como alternativa, se pueden disponer los embriones inmaduros u otras células blanco sobre un medio de cultivo sólido. Las células a bombardear son ubicadas a una distancia adecuada debajo de la placa de detención de macroproyectiles. Si se desea, también se pueden colocar una o más pantallas entre el dispositivo de aceleración y las células a bombardear. El uso de las técnicas descritas en la presente documentación permite obtener hasta 1000 o más focos de células que expresan de forma transiente un gen marcador. La cantidad de células en un foco que expresan el producto génico exógeno 48 horas después del bombardeo a menudo se encuentra en un rango de 1 a 10 y en promedio de 1 a 3. En la transformación por bombardeo, se pueden optimizar las condiciones de cultivo de prebombardeo y los parámetros de bombardeo con el fin de obtener una cantidad máxima de transformantes estables. En esta tecnología son importantes tanto los parámetros físicos como biológicos. Los factores físicos son aquellos que involucran la manipulación de ADN/precipitado de micropoyectiles. Los factores biológicos incluyen todos los pasos involucrados en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células blanco para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo y también la naturaleza del ADN transformante, como ADN alineado o plásmidos superarrollados intactos.

Se cree que las manipulaciones de pre-bombardeo son especialmente importantes para una transformación exitosa de embriones vegetales inmaduros. Por consiguiente, se contempla que puede resultar conveniente ajustar varios de los parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar las condiciones por completo. Puede resultar particularmente conveniente ajustar los parámetros físicos, tales como distancia de la hendidura, distancia de vuelo, distancia al tejido y presión de helio. También es posible minimizar los factores de reducción de trauma (TRF) modificando las condiciones que tiene influencia sobre el estado fisiológico de las células receptoras y que por lo tanto pueden afectar las eficiencias de transformación e integración. Por ejemplo, se puede ajustar el estado osmótico, la hidratación del tejido y la etapa del subcultivo o el ciclo celular de las células receptoras con el fin de lograr una transformación óptima. La ejecución de otros ajustes de rutina es conocida por los expertos en el arte a la luz de la presente descripción. lll. Células receptoras de la transformación El cultivo de tejidos requiere entornos y medios controlados. El término "medio" se refiere a las numerosas mezclas de nutrientes que se utilizan para cultivar células in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto. El medio es habitualmente una suspensión de varias categorías de ingredientes (sales, aminoácidos, reguladores del crecimiento de la mayoría de los tipos celulares. Sin embargo, cada tip de célula específico requiere un rango específico de proporciones de ingredientes para el crecimiento, y un rango aún más específico de fórmulas para un crecimiento óptimo. La tasa de crecimiento celular también va a variar entre cultivos iniciados con la disposición de medios que permiten el crecimiento de este tipo de célula. Los medios de nutrientes se preparan como un líquido, pero éste puede ser solidificado por la adición de dicho líquido a materiales capaces de proporcionar un soporte sólido. El agar es el material utilizado comúnmente con este fin. El bactoagar, agar Hazelton, Geirite y Gelgro son tipos específicos de soporte sólido que son adecuados para el crecimiento de células vegetales en los cultivos de tejido. Algunos tipos de células van a crecer y dividirse en medios de suspensión líquida o sobre soportes sólidos. Como se describe en la presente documentación, las células maíz crecerán en suspensión o sobre un medio sólido, pero la regeneración de plantas en cultivos en suspensión requiere la transferencia desde el medio líquido hasta el medio sólido en algún momento del desarrollo. El tipo y la extensión de la diferenciación de las células en cultivo se verán afectados no sólo por el tipo de medio utilizando y por el entorno, por ejemplo, pH, sino también por el tipo de medio: si es líquido o sólido. En el cuadro 2 se ilustra la composición de varios medios que son de utilidad en la creación de células receptoras y para la regeneración de las plantas. Las células receptoras blanco incluyen, pero sin limitaciones a las mismas, células meristemáticas, callos de tipo 1 , tipo 11 y tipo 1 1 1 , embriones inmaduros y células gaméticas, tales como microesporas, polen, esperma y huevo. Los callos de tipo 1 , tipo II y tipo lll se pueden iniciar a partir de fuentes de tejido que incluyen, sin limitaciones a los mismos, embriones inmaduros, meristemas apicales de plántulas, microesporas y análogos. Aquellas células que son capaces de proliferar como callos también constituyen células receptoras para una transformación genética. La presente invención provee técnicas para transformación embriones inmaduros seguido de iniciación de callos y la subsiguiente regeneración de plantas transgénicas fértiles. La transformación directa de embriones inmaduros obviaría la necesidad de un desarrollo a largo plazo de cultivos de células receptoras. El polen, así como sus células precursoras, las microesporas, pueden tener la capacidad de funcionar como células receptoras para la transformación genética, o como vectores para llevar ADN extraño para su incorporación durante la fertilización. Las células meristemáticas (es decir, células vegetales capaces de una división celular continua y caracterizada por un aspecto citológico no diferenciado, habitualmente se encuentran en los puntos o tejidos en crecimiento de las plantas, como las puntas de raíces, ápices de tallos, brotones laterales, etc.) pueden representar otro tipo de célula vegetal receptora. Debido a su crecimiento indiferenciado y capacidad de diferenciación en órganos y totipotencialidad, una sola célula meristemática transformada podría recuperarse como una planta transformada entera. De hecho se propone que los cultivos en suspensión embriogénicas pueden ser una sistema de células meristemática in vitro, que retiene su capacidad de división celular continua en un estado no diferenciado, controlado por el medio ambiente. , 10 Las células vegetales en cultivo que pueden servir como células « receptoras de una transformación con los segmentos de ADN deseados incluyen células de maíz y, más específicamente, células de Zea mays L. Las células somáticas son de varios tipos. Las células embriogénicas son un ejemplo 9 de células somáticas que pueden se incluidas para regenerar una planta a través de la formación de embriones. Las células no embriogénicas son aquellas que habitualmente no responden de esa manera. Un ejemplo de células no embriogénicas son ciertas células de maíz Black Mexican Sweet (BMS). Estas células fueron transformadas mediante bombardeo con microproyectiles utilizando el gen neo seguido de selección con el aminoglucósido, kanamicina (Klein y otros, 1989). Sin embargo, se encontró que este cultivo de BMS no era regenerable. El desarrollo de callos de maíz embriogénico y los cultivos en suspensión útiles en el contexto de la presente invención, por ejemplo, como células receptoras para una transformación, fueron descritos en la Patente de EE.UU No. 5.134.074, cuyo contenido se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Se pueden emplear ciertas técnicas para enriquecer células receptoras dentro de una población de células. Por ejemplo, el desarrollo de callos tipo II, seguido de una selección manual y el cultivo de tejido embriogénico friable, en general da como resultado el enriquecimiento de células receptoras para su uso, por ejemplo, en la transformación con microproyectiles. El cultivo en suspensión particularmente cuando se emplea el medio descripto en la presente documentación, también puede mejorar la relación de células receptoras a no receptoras en una población dada. Las técnicas de selección manual que se emplean para seleccionar las células receptoras pueden incluir, por ejemplo, la evaluación de la morfología y diferenciación celular o pueden emplear varios medios físicos o biológicos. La crioconservación también se contempla como un método posible para seleccionar células receptoras. La selección manual de células receptoras, por ejemplo, mediante la selección de células superficiales de callos tipo II, es uno de los medios empleados por los inventores en su intento de lograr un enriquecimiento con células receptoras antes del cultivo (ya sea si el cultivo es sobre un medio sólido o en suspensión). Las células preferidas pueden ser aquellas localizadas en la superficie de una agrupación de células y se pueden identificar además por su falta de diferenciación, su tamaño y citoplasma denso. Las células preferidas serán en general aquellas que están menos diferenciadas o que aún no comenzaron a diferenciarse. Por consiguiente, puede resultar conveniente identificar y seleccionar aquellas células que presentan un citoplasma denso, que poseen relativamente pocas vacuolas, con una relación alta de núcleo a citoplasma (determinada, por ejemplo, mediante observaciones citológicas), que son de tamaño pequeño (por ejemplo, 10-20 mm) y que son capaces de presentar divisiones sostenidas y formación de proembriones somáticos. Se propone que también se pueden emplear otros medios para identificar dichas células. Por ejemplo, mediante el uso de colorantes tales como el azul de Evan, que es excluido de células que presentan membranas relativamente no permeables, tales como las células embriogénicas, y que es tomado por las células que están relativamente diferenciadas, como las células tipo raíz y células serpiente (denominadas así debido a su aspecto tipo serpiente). Otros medios posibles para identificar células receptoras incluyen el uso de marcadores de isozimas de las células embriogénicas, tales como la glutamato deshidrogenasa, que puede ser detectada mediante coloración citoquímica (Fransz y otros, 1989). Sin embargo, se debe tener en cuenta que el uso de marcadores de isozimas, como la glutamato deshidrogenasa, puede conducir a un cierto grado de positivos falsos de células no embriogénicas, tales como las células tipo raíz que no obstante presentan una actividad metabólica relativamente alta. (i) Cultivo de células para que sean receptoras de la transformación Los inventores creen que la capacidad de preparar y crioconservar cultivos de células de maíz es importante para ciertos aspectos de la presente invención, por cuanto provee un medio para preparar, de forma reproducible y exitosa, células para una transformación mediada por partículas, electroporación y otros medios para introducir ADN. Los estudios que se describen más adelante explican las técnicas que los inventores aplicaron con éxito para generar cultivos de células de maíz transformables y • 10 regenerables. Los inventores han desarrollado una variedad de diferentes * tipos de medios y ios han empleado para llevar a cabo varios aspectos de la invención. En el siguiente cuadro, cuadro 2, se describe la composición de los medios preferidos por los inventores para llevar a cabo estos aspectos de la invención.

CUADRO 2 Medios de cultivo de tejidos gue se utilizan para el desarrollo de callos tipo II, el desarrollo de cultivos en suspensión y la regeneración de células vegetables (especialmente células de maíz) o. MEDIOS MEDIO BASAL SACAROSA PH OTROS COMPONENTES 7 MS* 2% 6.0 (cantidad/l)** 0.25 mg de tiamina 0.5 mg de BAP 0.5 mg de NAA Bactoagar 10 MS 2% 6.0 0.25 mg de tiamina 1 mg de BAP 1 mg de 2.4-D 400 mg de L-prolina Bactoagar 19 MS 2% 6.0 0.25 mg de tiamina 0.25 mg de BAP 0.25 mg de NAA Bactoagar 20 MS 3% 6.0 0.25 mg 1 mg de BAP 1 mg de NAA Bactoagar MS 2% 6.0 0.25 mg de tiamina 1 mg de 2.4-D ABA 10-7 M BACTOAGAR 101 MS 3% 6.0 Vitaminas MS 100 mg de mioinsitol Bactoagar 142 MD 6% 6.0 Vitaminas MS 5 mg de BAP 0.186 mg de NAA 0.175 mg de IAA 0.403 mg de 2IP Bactoagar 157 MS 6% 6.0 Vitaminas MS 100 mg de mioinositol Bactoagar 163 MS 3% 6.0 Vitaminas MS 3.3 mg de dicamba 100 mg de mioinositol Bactoagar 171 MS 3% 6.0 Vitaminas MS 0.25 mg de 2.4-D 10 mg de BAP 100 mg de mioinositol Bactoagar 173 MS 6% 6.0 Vitaminas MS 5 mg de BAP 0.186 mg de NAA 0.175 de IAA 0.403 mg de 2IP ABA 10-7 M 200 mg de mioinositol Bactoagar 177 MS 3% 6.0 Vitaminas MS 0.25 mg de 2.4-D 10 mg de BAP ABA 10-7 M 100 mg de mioinositol Bactoagar 185 MS 5.8 3 mg de BAP 0.04 mg de NAA Vitaminas RT * 10 1.65 mg de tiamina 1.36 g dé L-prolina 20 g de sorbitol Bactoagar 189 MS 5.8 3 mg de BAP 0.04 mg de NAA 0.5 mg de niacina 800 mg de L-asparagina 100 mg de ácidos Casamínicos 20 g de sorbitol 15 1.4 g de L-prolina 100 mg de mioinositoi Gelgro 201 N6 2% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 1 mg de 2.4-D • 100 mg de hidrolizado de caseína 2.9 g de L-prolina Gelgro 205 N6 2% 5.8 vitaminas N6 2 mg de L-glicina 20 0.5 mg de 2.4-D 100 mg de hidrolizado de caseína 2.9 L-prolina Gelgro 209 N6 6% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 100 mg de hidrolizado de caseína 0.69 de L-prolina Bactoagar 210 N6 3% 5.5 Vitaminas N6 2 mg de 2.4-D 250 mg de pantotenato de Ca 100 mg de mioinositol 790 mg de L-asparagina 100 mg de hidrolizado de caseína 1.4 g de L-prolina Agar Hazelton**** 2 mg de L-glicina 212 N6 3% 5.5 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 2 mg de 2.4-D 250 mg de pantotenato de Ca 10 100 mg de mioinositol 100 mg de hidrolizado de caseína 1.4 g L-prolina Agar Hazelton**** 227 N6 2% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 13.2 mg de dicamba 100 mg de hidrolizado de caseína 2.9 g de L-prolina Gelgro 15 273 N6 2% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 1 mg de 2.4-D 16.9 mg de AgN03 100 mg de hidrolizado de caseína 2.9 g de L-prolina 279 N6 2% 5.8 3.3 mg de dicamba 1 mg de tiamina 0.5 mg de niacina 800 mg de L-asparagina 100 mg de hidroiizado de caseína 100 mg de mioinositol 1.4 g de L-prolina Gelgro**** 288 N6 3% 3.3 mg de dicamba 1 mg de tiamina 0.5 mg de niacina 0.8 g de L-asparagina 100 mg de mioinositol 1.4 g de L-prolina 100 mg de hidrolizado de caseína 16.9 mg de agN03 Gelgro 401 MS 3% 6.0 3.73 mg de Na2EDTA 0.25 mg de tiamina 1 mg de 2.4-D 2 mg de NAA 200 mg de hidrolizado de caseína 500 mg de K2S04 400 mg de KHP04 100 mg de mioinositol 402 MS 3% 6.0 3.73 mg de Na2EDTA 0.25 mg de tiamina 1 mg de 2.4-D 10 2 mg de NAA 200 mg de hidrolizado de caseína 500 mg de K2S04 400 mg de KH2P04 100 mg de mioinositol 409 MS 3% 6.0 3.73 mg de NaEDTA 0.25 mg de tiamina 9.9 mg de dicamba 200 mg de hidroiizado de caseína 2.9 g de L-prolina 500 mg de K2S04 400 mg de KHP04 100 mg de mioinositol 501 Medio de Clark* 2% 5.7 607 1/2 x MS 3% 5.8 1 mg de tiamina 1 mg de niacina Geirite 615 MS 3% 6.0 vitaminas MS 6 mg de BAP 100 mg de mioinositol Bactoagar 617 1/2 x MS 1.5% 6.0 Vitaminas MS 20 50 mg de mioinositol Bactoagar 708 N6 2% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 1.5 mg de 2.4-D 200 mg de hidrolizado de caseína 0.69 g de L-prolina Geirite 721 N6 2% 5.8 3.3 mg de dicamba 1 mg de tiamina 0.5 mg de niacina 800 mg de L-asparagina 100 mg de mioinositol 100 mg de hidrolizado de caseína 0.69 g de L-prolina 54.65 g de manitol Gelgro 726 N6 3% 5.8 3.3 mg de dicamba 0.5 mg de niacina 1 mg de tiamina 800 mg de L-asparagina 100 mg de mioinositol 100 mg de hidrolizado de caseína . 1.4 g de L-prolina 727 N6 3% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 9.9 mg de dicamba 100 mg de hidrolizado de caseína 2.9 g de L-prolina Gelgro 728 N6 3% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 9.9 mg de dicamba 46.9 mg de AgN03 100 mg de hidrolizado de caseína 2.9 g de L-prolina Gelgro 734 N6 2% 5.8 Vitaminas N6 2 mg de L-glicina 1.5 mg de 2.4-D 14 g de secuestrina de Fe (substituyente el Fe-EDTA) 200 mg de hidrolizado de caseína 0.69 g de L-prolina Geirite 735 N6 2% 5.8 1 mg de 2.4-D 0.5 mg de niacina 0.91 mg de L-asparagina 100 mg de mioinositol 1 mg de tiamina 0.5 g de MES 0.75 g de MgC12 100 g de hidrolizado de caseína 0.69 g de L-prolina Gelgro 2004 N6 3% 5.8 1 mg de tiamina 05 mg de niacina 3.3 mg de dicamba 17 mg de AgNO3 1.4 g de L-prolina 0.8 g de L-asparagina 100 mg de hidrolizado de caseína 100 mg de mioinositol Geirite 2008 N6 3% 5.8 1 mg de tiamina 0.5 mg de niacina 3.3 mg de dicamba 1.4 g de L-prolina 0.8 g de L-asparagina Geirite * Medio básico MS descrito en Murashige y Shoog (1962). Este medio se modifica habitualmente disminuyendo el NH4NO3 de 1.64 g/I a 1.55 g/l, y omitiendo el HCl piridoxina, ácido nicotínico, mioinositol y glicina. ** NAA= ácido naftolacético IAA= ácido indolacético 2-IP= 2, isopentil adenina 2,4-D=ácido 2,4-diclorofenoxiacético BAP= 6-benciIaminopurina Aba= ácido abscísico *** Medio básico descrito en Clark (1982) **** Estos medios se pueden eleborar con o sin un agente de solidificación. Se ha desarrollado una cantidad de cultivos de maíz transformables utilizando los protocolos detallados en los siguientes ejemplos. En el cuadro de 3 se muestra una compilación de los cultivos iniciados y evaluados por su capacidad de transformación, en la cual los resultados se indican en las dos columnas de la derecha. En el cuadro se indica el protocolo general de selección que se empleó para cada uno de estos cultivos. Las designaciones numéricas debajo del término "Protocolo" representan lo siguiente: 1.- El tejido (suspensión) fue plaqueado sobre filtros, bombardeado y después se transfirieron los filtros a medio de cultivo.

Después de 2-7 días, los filtros fueron transferidos a medio selectivo.

Aproximadamente 3 semanas después del bombardeo, se repicó el tejido de los filtros como agrupaciones de callos separados en medio selectivo fresco. 2.- Igual que en 1 , excepto que después del bombardeo la suspensión se volvió a colocar en líquido, fue sometido a selección líquida durante 7-14 días y luego se pipetearon con baja densidad sobre placas de selección fresco. 3.- Los callos fueron bombardeados estando directamente sobre el medio o sobre los filtros. Las células fueron transferidas a medio selectivo 1-14 días después del bombardeo de partículas. El tejido fue transferido sobre filtros en 1-3 veces con intervalos de 2 semanas a medio selectivo fresco. Los callos se colocaron brevemente en líquido para dispersar el tejido sobre las placas selectivas a baja densidad. 4.- El tejido de callos fue transferido a placas selectivas uno a siete días después de la introducción de ADN. El tejido fue subcultivado como pequeñas unidades de callos sobre placas selectivas hasta que se identificaron los transformantes.

Las cifras demuestran que 27 de 37 cultivos de maíz eran transformables. De las líneas evaluadas, 1 1 de 20 produjeron plantas fértiles y 7 estaban en progreso. Tal como se indica en este cuadro, se produjeron cultivos transformables a partir de diez genotipos diferentes de maíz, incluyendo variedades híbrida y endogámicas. Estas técnicas para el desarrollo de cultivos transformables son importantes en la transformación directa de tejidos intactos, tales como embriones inmaduros, ya que estas técnicas se basan en la capacidad de seleccionar transformantes en sistemas de células cultivadas.

CUADRO 3 Cultivos de maíz iniciados Genotipo Cultivo Método Transformable Plantas fértiles A188 x B73 G(1x6)92 1 + - G(1x6)716 1 ,2 + - G(1x6)82 1 + - G(1x6)98 1 - NA G(1x6)99 1 - NA D(1x6)122#3 2 - NA D(1x6)1 14 2 - NA D(1x6)17#33 2 - NA HB13-3 3 + + HA 133-227 2. NA G(1x6)17#5C 3 + + ABT4 4 + ' + ABT3C 4 + + AB60 4 + + AB61 4 + + AB63 4 + + AB80 4 + + AB82 4 + + ABT6 4 + ND AB12 4 + + PH2 4 + + AB69 4 + - AB44 4 + - AB62 4 + ND A188xB84 G(1XM)82 1 + - A188xH99 HJ1 1-7 3 + - B73xA188 G(6x1 )12#7 2 - NA D(6X1)11#4 2 - NA E1 2 + - Hi-ll G(CW)31#24 + + B73 (6)913#32 - NA (6)91 #22 NA B73-derived AT824 1 ,2,3 + N1017A AZ1137a 2 + Cat 100 CB 2 + ND CC 2 + ND A188 E4 2 El símbolo " indica que la línea no era transformable después de 3 intento o que las plantas eran estériles. NA indica No Aplicable ND indica No Hecho (ii) Medios En algunas realizaciones, las células receptoras se seleccionan después de su crecimiento en cultivo. Cuando se emplean las éstas, las células cultivadas se hacen crecer sobre soportes sólidos o en la forma de suspensiones líquidas. En cualquier caso, se pueden proveer nutrientes a las células en la forma de medio y condiciones ambientales controladas. Exiten muchos tipos de medios de cultivo para tejidos compuestos por aminoácidos, sales, azúcares, reguladores del crecimiento y vitaminas. La mayoría de los medios empleados en la práctica de la ¡nvención tendrán algunos componentes similares (véase, el cuadro 2), y los medios van a diferir en la composición y en las proporciones de sus ingredientes según la aplicación particular considerada. Por ejemplo, varios tipos de células habitualmente crecen en más de un tipo de medio, pero van a mostrar diferentes relaciones de crecimientos y distintas morfologías según el medio de crecimiento. En algunos medios las células sobreviven pero no se dividen. Ya se han descripto varios tipos de medios apropiados para el cultivo de células vegetales. Los ejemplos de estos medios incluyen, sin limitaciones a los mismo, el medio N6 descripto por Chu y otros. (1975) y el medio MS (Murashige & Skoog, 1962). Los inventores han descubierto que los medios como el MS, que presenta una relación de células receptoras porque promueven la pérdida de capacidad morfogénica. Por otro lado, el medio N6 presenta una relación amoníaco/nitrato algo menor y se considera que promueve la generación de células receptoras porque mantiene las células en un estado proembriónico capaz de divisiones sostenidas. (iii) Mantenimiento El método de mantenimiento de los cultivos de células puede contribuir a su utilidad como fuentes de células receptoras para la transformación. La selección manual de las células para su transferencia a medio de cultivo fresco, la frecuencia de transferencia a medio de cultivo fresco, la composición del medio de cultivo y los factores ambientales, incluyendo, sin limitaciones, calidad y cantidad de luz y temperatura, son todos factores importantes en el mantenimiento de los callos y/o los cultivos en suspensión que son de utilidad como fuentes de células receptoras. Se considera que puede resultar ventajoso alternar los callos entre diferentes condiciones de cultivo para enriquecer un cultivo con células receptoras. Por ejemplo, se propone que las células pueden ser cultivadas en un cultivo en suspensión, para luego ser transferidas a un medio sólido a intervalos regulares. Después de un período de crecimiento sobre un medio sólido, las células pueden seleccionarse manualmente para ser devueltas a un medio de cultivo líquido. Se propone que la repetición de esta secuencia de transferencias a medio de cultivo fresco posibilita el enriquecimiento de células receptoras. También se consideran de utilidad pasar los cultivos a través de un tamiz de 1.9 mm para el mantenimiento de la friabilidad de los callos o cultivo en suspensión y puede resultar ventajoso para enriquecer con células transformables. (iv) Métodos de crioconservación La crioconservación es importante porque permite mantener y conservar un cultidvo de los métodos informados previamente (Finkie, 1985, Withers & King, 1979). El protocolo de crioconservación comprendió la adición de una mezcla crioprotectora concentrada pre-enfriada (0°C) en porciones sobre un período de una a dos horas a células pre-enfriadas (0°C). La mezcla se mantuvo a 0°C durante todo este período. El volumen de crioprotector añadido era igual al volumen inicial de la suspensión de células (adición 1 :1 ) y la concentración final de aditivos crioprotectores era dimetil sulfóxido 10%, polietilenglicol 10% (PM 6000), prolina 0.23 M y glucosa 0.23 M. Se dejó que mezcla alcance el equilibrio a 0°C durante 30 minutos, y en ese tiempo la mezcla de crioprotector/suspensión de células se dividió en alícuotas de 1.5 ml (0.5 ml de volumen celular empaquetado) en crio-viales de polietileno de 2 ml. Los tubos se enfriaron a razón de 0.5°C/minuto hasta -8°C y se mantuvieron a esta temperatura para la formación de núcleos de hielo. Una vez confirmada visualmente la formación extracelular de hielo, los tubos se enfriaron a razón de 0.5°C/minuto desde -8°C hasta -35°C.

Se mantuvieron a esta temperatura durante 45 minutos (para asegurar una deshidratación inducida por congelamiento uniforme en todas las agrupaciones de células). En este punto, las células habían perdido la mayor parte de su volumen osmótico (es decir, quedaba poca agua libre en las células), y podían ser sumergidos sin problemas en nitrógeno líquido para su almacenamiento. La escasez de agua libre restante en la células junto con las velocidades de enfriamiento rápido de -35 a -196 °C impidieron la formación de grandes cristales organizados en las células. Las células se guardan en nitrógeno líquido, que inmoviliza de forma efectiva las células y disminuye la velocidad de los procesos metabólicos hasta el punto en que un almacenamiento a largo plazo no sería nocivo. El descongelamiento de la solución extracelular se llevó a cabo retirando los criotubos del nitrógeno líquido y agitándolos en agua estéril a 42 °C durante 2 minutos aproximadamente. El tubo se retiró del calor de forma inmediata después que los últimos cristales se hubieran funcionado para impedir el calentamiento del tejido. La suspensión de células (todavía en la mezcla crioprotectora) fue pipeteado sobre un filtro, que descansaba sobre una capa de células BMS (la capa nutritiva que proporcionaba un efecto protector durante la recuperación). La dilución del cioprotector se llevó a cabo lentamente a medida que los solutos se alejaban por difusión a través del filtro y los nutrientes difundían hacia arriba las células en recuperación. Una vez que se observó crecimiento en las células descongeladas, dicho tejido fue transferido a medio de cultivo fresco. Las agrupaciones de células se volvieron a transferir al medio de suspensión líquida tan pronta como se había recuperado suficiente masa celular (habitualmente dentro de 1 a 2 semanas).

Una vez que el cultivo se hubiera establecido en el líquido (dentro otras 1 a 2 semanas adicionales), se utilizó para los experimentos de transformación.

Cuando convenía, los cultivos previamente crioconservadores se podían volver a congelar para su almacenamiento.

IV. Segmentos de ADN gue comprenden genes exógenos Como se mencionara previamente, existen vario métodos para construir los segmentos de ADN que llevan el ADN hacia el interior de una célula huésped conocidos por los expertos en el arte. La construcción general de los vectores empleados en la presente documentación son plásmidos que comprenden un promotor, otras regiones reguladoras, genes estructurales y un extremo 3'. Las plantas de la invención actual poseen un gen EPSPS mutante que confiere resistencia al glifosato. La secuencia EPSPS preferida, que se muestra en la FIG. 12, incluyen un péptido transitorio de cloroplasto de maíz en combinación con el gen EPSPS. Se debe comprender que este péptido de tránsito de cloroplasto podría ser homólogo, es decir, del gen EPSPS de maíz, o heterólogo, es decir cualquier otro gen. El péptido de tránsito será preferentemente el péptido de tránsito optimizado utilizando en las contrucciones descriptas en la presente documentación. Como alternativa, el gen EPSPS puede emplearse sin el péptido de tránsito y el gen podrá ser transformado en el genoma del cloroplasto según las técnicas descriptas en la patente de los Estados Unidos. N°: 5.451.513, cuyo contenido se incorpora específicamente en la presente documentación a modo de referencia. Los inventores de la invención han construido varios plásmidos que codifican diversos genes, cuyas características importantes se muestran más adelante en el cuadro 4. Algunos de estos plásmido también se muestran en las FIGS. 1-4: pDPG165 (FIG. 1 ), pDPG427 (FIG.2), pDPG434 (FIG. 3) y pDPG443 (FIG. 4). En el cuadro 4 se muestran los vectores utilizados en la construcción de líneas de maíz GA21 , GG25, GJ1 1 y FU 17, resistentes a glifosato. En el cuadro 5 se muestran los componentes del plásmido pDPG434, que se empleó en la transformación de GA21 y FU 17. El gen que codifica la enzima EPSPS se clonó de Zea mays. Se introdujeron dos mutaciones en la secuencia de aminoácidos de EPSPS para conferir resistencia a glifosato, es decir, una substitución de isoleucina por treonina en la posición de aminoácidos 102 y una substitución de serina por prolina en la posición de aminoácidos 106. Se construyeron los vectores de expresión en plantas pDPG427, pDPG434 y pDPG443 utilizando vectores de expresión mutante de maíz EPSPS mutante en este vector codifica una enzima con cambios en los aminoácidos en las posiciones 102 (treonina a isoleucina) y 106 (prolina a serina). En la presente documentación se puede encontrar una descripción d de la construcción de estos vectores.

CUADRO 4 Vectores utilizados en la transformación de la líneas de maíz GA21, GG25, GJ11 y FU 17, resistentes a glifosato DENOMINACIÓN Y FUENTE DEL VECTOR RECOMBINANTE REPLICÓN PROGENITOR INSERTO DE ADN INTENTO DE EXPRESIÓN DELIBERADA pDPG165 pUCI9 1 ,2,41 pDPG165 pSK- 2,5,6,7 2 pDPG165 pSK- 2,9,7,6 2,7 pDPG165 pSK- 2,6,7,8 2,7 CLAVE: Inserto de ADN e i nte ni 1. El gen bar de Strptomyces higroscopicus codifica la fosfinotricin acetiltransferasa (PAT). Las células que expresan PAT son resistentes al herbicida Basta. White, J., Chang, S.-Y.P., Bibb, M.J. y Bibb, M.J. 1990. Nucí. Ac. Research 18:1062. 2. El gen EPSPS (5-enolpiruvil/shiquimato-3-fosfato sintetasa) de Zea mays fue mutado para conferir resistencia al herbicida glifosato. Se sustituyó una isoleucina por treonina en la posición de aminoácidos 102 y se substituyó una serina por prolina en la posición de aminoácidos 106. 3. Secuencias promotoras del genoma del virus en mosaico de la coliflor. Odell, J.T., Nagy, F. y Chua, N.-H. 1985. Nature 313: 810-812. 4. Secuencias terminadora del plásmido Ti de Agrobaterium tumefaciens. (a) Bevan, M., 1984. Nucleic Acid Research 12: 8711-8721 ; (b) Ingelbrecht, I.L.W., Hemmam, L.M.F., DeKeyser, R.A., Vam Montagu, M.C., Depicker, A:G: 1989. The Plant Cell 1 :671-680; (c) Bevan, M., Barnes, W.M., Chilton, M.D., 1983. Nucleic Acid Research. 11 :369-385; (d) Ellis, J.G., Liewellyn, D.J., Demfis, E.S., Peacocu, W.J. 1987. EMBO J. 6:3203-3208. 5. Secuencias potenciadoras del gen de la alcohol deshidrogenasa de maíz. Callis, J., Fromm, M.E., Walbor, W., 1987. Genes Dev. 1 :1 183-1200. 6. Secuencias terminadoras del plásmido ti de Agrobacterium (extremo 3'-nos) (a) Bevan, M., 1984. Nucleic Acid Research 12: 871 1-8721 ; (b) Ingelbrecht, I.L.W., Hermán, L.M.F., DeKeyser, R.A., Van Montagu, M.C., Depicker, A.G. 1989. The Plant Cell 1 :671-680; (c) Bevan, M., Barnes, W.M., Chilton, M.D., 1983. Nucleic Acid Research. 1 1 :369-385. 7. Una secuencia de un péptido de tránsito de cloroplasto, denominada aquí como secuencia de péptido de tránsito optimizada (OTP), que consta de la secuencia de ADN de los genes de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa de maíz y girasol (RuBisCo) (Lebrun y otros, 1996; Rhone Poulenc Agrochimie). 8. Secuencias promotoras fusionadas del genoma del virus en mosaico de la coliflor y del gen de histona H4 de Arabidopsis thaliana. Construido por Rhone Poulenc Agrochimie. 9. Región 5' de actina-1 que incluyen un promotor de Oryza sativa (McEIroy y otros. 1991 ) CUADRO 5 Resumen de las secuencias presentes en el plásmido pDPG434 Componentes de vector tamaño ap, Kb Descripción promotor e intrón de actina de arroz 1.37 región 5' del gen de actina 1 de arroz que contenía el promotor y el primer intrón (McEIroy y otros., 1991 ) péptido de tránsito optimizado (OTP) 0.37 secuencia del péptido de tránsito de cloroplasto construido sobre la base de secuencias de péptido de tránsito de los genes de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa de maíz y girasol (RuBisCo) (Lebrun y otros., 1996) gen EPSPS mutante de maíz 1.34 gen EPSPS de maíz de tipo salvaje (Lebrun y otros, 1991 ) que contienen mutaciones en las posiciones de aminoácidos 102 (treonina a isoleucina) y 106(prolina a serina) extremos 3'-nos 0.24 región de poliadenilación del gen de la nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984) lac 0.24 una secuencia de codificación lacl, el promotor plac y una secuencia de codificación parcial de la proteína b-galactosidasa o proteína lacZ(Yanisch- Perron y otros., 1985) bla 0.86 el gen de la b-lactamasa del tipo TEM del plásmido de E. coli pBR322 que confiere a las células bacterianas resistencia a la ampicilina y otras penicilinas (Sutcliffe, 1978). El gen se encuentra bajo el control de su promotor bacteriano nativo. ColEI ori 0.65 el origen de replicación de ADN del plásmido de copia E. coli pUC19 (Yamisch-Perron y otros., 1985) V. Identificación de células transformadas utilizando selección " 10 Se cree que el ADN solamente es introducido en un pequeño * porcentaje de células en cualquier experimento. Por ello, con el fin de proporcionar un sistema más eficiente para la identificación de la células que reciben el ADN y lo integran en sus genomas puede resultar conveniente emplear un medio para la selección de las células que son transformadas de manera estable. Una realización ejemplar de dicho método es introducir en la célula huésped, un gen marcador que confiera resistencia a algún agente inhibidor habitual, por ejemplo un antibiótico o un herbicida. Las células potencialmente transformadas son expuestas al agente. En la población de células sobreviviente se encuentran aquellas célula en las cuales el gen que confiere resistencia se ha integrado y en las cuales se expresa a niveles suficientes como para permitir la sobrevida de la célula. Las células pueden ser evaluadas además para confirmar la integración estable del ADN exógeno. Utilizando cultivos embriogénicos en suspensión, se recuperan transformantes estables con una frecuencia de aproximadamente 1 por cada 1000 foci de expresión transiente. Un herbicida que fue sugerido como un agente de selección convenciente es el herbicida de amplio espectro bialafos. El bialafos es un atibiótico tripéptido producido por Streptomyces hygroscopicus y está compuesto por fosfinotricina (PPT), un análogo del ácido L-glutámico y dos residuos de L-alanina. AI eliminar los residuos de L-alanina mediante peptidasa intracelulares, la PPT es liberada y resulta un inhibidor potente de la glutamina sintetasa (GS), una enzima fundamental involucrada en la asimilación de amoníaco y el metabolismo del nitrógeno (Ogawa y otros., 1973). La PPT sintética, el ingrediente activo del herbicida Liberty™ también es efectiva como agente de selección. La inhibición de GS en plantas por la PPT provoca una acumulación rápida de amoníaco y la muerte de las células de la planta. El organismo productor de bialafos y otras especies del género Streptomyces también sintetizan la enzima fosfinotricin acetil transferasa (PAT) que es codificada por el gen bar en Streptomyces hygroscopicus y el gren pat en Streptomyces viridochromogens. El uso del gen de resistencia a herbicidas que codifica la fosfinotricin acetil transferasa (PAT) está descripto en la publicación DE 3642 829 A, donde el gen es aislado de Streptomyces viridochromogenes. En el organismo fuente bacteriano esta enzima acetila el grupo amina libre de la PPT impidiendo la auto-toxicidad (Thompson y otros, 1987). El gen bar ya ha sido clonado (Murakami y otros., 1986; Thompson y otros, 1987) y expresado en plantas transgénicas de tabaco, tomate y papa (De Block, 1987) y de Brassica (De Block, 1989). En informes previos, algunas plantas transgénicas que expresaban el gen de resistencia eran completamente resistentes a las formulaciones comerciales de PPT y bialafos en invernaderos. Otros herbicida que es de utilidad para la selección de líneas de células transformadas en la práctica de la invención es el herbicida de amplio espectro glifosato. El glifosfato inhibe la acción de la enzima EPSPS que es activo en la vía biosintética de los aminoácidos aromáticos. La inhibición de esta enzima conduce a la falta de los aminoácidos fenilalamina, tirosina y triptofano y a los metabolitos secundarios derivados de los mismos. En la patente de los Estados Unidos N°. 4.535.060 se describe el aislamiento de mutaciones EPSPS que infieren resistencia a glifosato al gen par EPSPS de Salmonella typhimurium, aroA. El gen EPSPS fue aconado de Zea mays y se introdujeron mutaciones similares a las encontradas en el gen aroA resistente a glifosato in vitro. El gen mutante codifica una proteína con cambios de aminácidos en los residuos 102 y 106. Si bien estas mutaciones confieren resistencia al glifosato en la enzima EPSPS se anticipa que las otras mutaciones también serán de utilidad. Las realizaciones ejemplares de vectores capaces de distribuir ADN en células vegetales huésped en la invención actual son los plásmidos, pDPG165, pDPG427, pDPG434 y pDPG443. Estos y otros vectores plámidos adecuados se discuten detalladamente en la solicitud de patente de los EE:UU N°.: 08/113,561 , depositada el 25 de agosto, 1993, cuyo contenido se incorpora específicamente en la presente documentación a modo de referencia. Un componente muy importante del plásmido pDPG165 para los fines de una transformación genética es el gen bar que codifica un marcador para la selección de células transformadas expuestas al bialafos o a la PPT.

Los plásmidos pDPG434, pDPG4127, pDPG443 y pDPG436, pDPG447, pDPG465 y pDPG467 contienen un gen EPSPS de maíz con mutaciones en los residuos de aminoácidos 101 y 106 dirigido por varios promotores diferentes (Solicitud de Patente de EE.UU. N° 08/1 13,561 , depositada el 25 de ^ 10 agosto, 1993). Un componente muy importante de estos plásmidos para los » fines de una transformación genética es el gen EPSPS mutado que codifica un marcador para la selección de células transformadas.

VI. Producción y caracterización de maíz transgénico estable 15 Después de efectuar la distribución del ADN exógeno en las células receptoras, los pasos siguientes se refieren en general a la identificación de las células transformadas para su cultivo y la regeneración de la planta. Tal como se mencionó en la presente documentación, con el fin de mejorar la capacidad de identificar transformantes, puede resultar conveniente 20 emplear un gen marcador seleccionable o rastreable como, o además de, el gen de interés de expresión. En este caso, se evaluará en general la población potencialmente transformada exponiendo las células a uno o más agentes de selección, o se podrá rastrear las células por la característica del gen marcador deseado. (i) Selección Una realización ejemplar de métodos para la identificación de células transformadas involucra la exposición de los cultivos bombardeados a un agente de selección como un inhibidor metabólico, un antibiótico, herbicida o análogos. Las células que han sido transformadas y que poseen un gen marcador integrado de forma estable que confiere resistencia al agente de selección utilizado, se dejarán crecer y se dividirán en cultivo. Las células sensibles no serán sometidas a cultivo posterior. Para utilizar el sistema de selección - >ar-bialafos o EPSPS-glifosato, el tejido bombardeado se cultiva durante 0 - 28 días en medio no selectivo y a continuación es transferido a un medio que contiene de 1-3 mg/l de bialafos o 1-3 mM de glifosato según corresponda. En tanto habitualmente se prefieren los rangos de 1-3 mg/l de bialafos o 1-3 mM de glifosato, se propone que los rangos de 0.150 -50mg/l de bialafos o 0.1-50 mM de glifosato serán de utilidad en la práctica de la invención. El tejido se puede colocar sobre cualquier soporte inerte, sólido o semisólido para el bombardeo, incluyendo, pero sin limitaciones a los mismos, filtros y medio de cultivo sólido. El bialafos y el glifosato se proveen como ejemplos de agentes adecuados para la selección de transformantes, pero la técnica de esta invención no está limitada a los mismos.

Un ejemplo de una característica para un marcador de rastreo es el pigmento rojo producido bajo el control locus R en maíz. Este pigmento puede ser detectado cultivado células sobre un soporte sólido que contiene un medio nutritivo capaz de sustentar el crecimiento en esta etapa y seleccionando células de las colonias (agregados visibles de células) que están pigmentadas. Se puede continuar cultivando estas células, ya sea en suspensión o sobre un medio sólido. El locus R es de utilidad para la selección de transformantes de embriones inmaduros bombardeados. De manera similar, la introducción de los genes Cl y B dará como resultado - 10 células y/o tejidos pigmentados. •<- La enzima luciferasa puede emplearse como un marcador de rastreo en el contexto de la presente invención. En presencia del substrato luciferina, las células que expresan la luciferasa emiten luz que puede ser detectado con una película fotográfica o de rayos X, en un luminómetro (o 15 contador de centelleo líquido), mediante dispositivos que aumentan la visión nocturna o mediante una cámara de video muy sensible a la luz, como una cámara de conteo de fotones. Todos estos ensayos no son destructivos y las células transformadas pueden ser cultivadas después de la identificación. La cámara de conteo de fotones resulta especialmente valiosa ya que permite la 20 identificación de células o grupos de células específicas que están expresando la luciferasa y los manipula en tiempo real. Otro marcador de rastreo que se puede emplear es el gen que codifica la proteína de fluorescencia verde.

Se considera además que las combinaciones de marcadores de rastreo y de selección serán de utilidad para la identificación de células transformadas. En algunos tipos de células o de tejidos es posible que el agente de selección, como bialafos o glifosato, no proporcione una actividad de eliminación suficiente como para reconocer claramente las células transformadas o pueden provocar una inhibición no selectiva sustancial de los transformantes y los no transformantes por igual, haciendo entonces que la técnica de selección no sea efectiva. Se propone que la selección con un compuesto inhibidor del crecimiento, como bialafos o glifosato, a concentraciones inferiores a las que causan un 100% de inhibición seguido de rastreo en el tejido en crecimiento de la expresión del gen de una marcado de rastreo, como la luciferasa, permitirá recuperar transformantes de los tipos de células o tejidos que no son susceptibles a selección solamente. Se propone que las combinaciones de selección y de rastreo puede permitir la identificación de transformantes en una variedad más amplia de tipos de células y tejidos. (¡i) Regeneración y producción de semillas Las células que sobreviven a la exposición al agente de selección o las células que se calificaron como positivas en un ensayo de rastreo, pueden ser cultivadas en un medio que sustenta la regeneración de plantas. En una realización ejemplar, los medios MS y N6 pueden ser modificados (véase el cuadro 2) incluyendo substancias adicionales tales como reguladores del crecimiento. U? regulador preferido para dichos propósitos es la dicamba 0 2.4-D. Sin embargo, se pueden emplear otros reguladores del crecimiento, incluyendo NAA; NAA + 2.4-D o tal vez aún picloram. Se ha encontrado que la mejora de medios de esta manera y otras similares facilita el crecimiento de células en etapas de desarrollo específicas.

El tejido se puede mantener en un medio básico con reguladores del crecimiento hasta que haya suficiente tejido disponible como para comenzar los intentos de regeneración de la planta o después de repetidas rondas de selección manual, hasta que la morfología del tejido sea adecuada para la • O regeneración, por lo menos dos semanas, luego se transfieren a un medio que conduce a la maduración de los embrioides. Los cultivos son transferidos cada dos semanas sobre este medio. El desarrollo de brotes señalará el momento de la transferencia a un medio que no posee reguladores del crecimiento. Las células transformadas, identificadas por selección o rastreo y cultivadas en un medio apropiado que soporta la regeneración, se dejarán entonces para que maduran en plantas. Las plántulas en desarrollo son transferidas a una mezcla de crecimiento para plantas sin tierra, y endurecida, por ejemplo, en una cámara de ambiente controlado con un 85% humedad relativa aproximadamente, 600 ppm CO2 y 25-250 microeinsteins m-2 s-1 de luz. Las plantas se maduran, con preferencia, ya sea en una cámara de crecimiento o en invernadero. Las plantas se regeneran de 6 semanas a 10 meses después de la identificación del transformante, dependiendo el tejido inicial. Durante la regeneración, las células se cultivan sobre un medio sólido en recipientes para cultivo de tejido. Las" realizaciones ilustrativas de dichos recipientes son las cajas de Petri y Plant. Las plantas en regeneración se cultivan a una temperatura de 19 a 28°C aproximadamente. Después que las plantas en regeneración alcanzaron la etapa de brote y desarrollo de raíz, pueden ser transferidas a invernadero para su crecimiento y evaluación. Observe, sin embargo, que los granos de las plantas regeneradas pueden requerir ocasionalmente un rescate de los embriones debido a un cese en el desarrollo de los granos y una senescencia prematura de las plantas. Para rescatar los embriones en desarrollo, se recortan los mismos de granos, cuya superficie fue desinfectada, 10-20 días después de la polinización y se cultivan. Una realización de los medios utilizados para el cultivo en esta etapa comprende sales MS, sacarosa 2% y agarosa 5.5 g/l. En el rescate de embriones, se hacen germinar embriones grandes (definidos como mayores que 3 mm de longitud) directamente sobre el medio adecuado. los embriones que son más pequeños pueden ser cultivados durante una semana sobre medio que contiene los ingredientes mencionados junto con ácido abscísico 10-5M y luego son transferidos a un medio de reguladores de crecimiento para su germinación. Se puede recuperar la progenie de las plantas transformadas y evaluar la expresión del gen de expresión exógeno mediante la aplicación localizada de un substrato apropiado a partes de la planta, tal como las hojas. En el caso de las plantas transformadas con bar, se encontró que las plantas progenitoras transformadas (RO) y su progenie (R1 ) no exhibían necrosis relacionada con bialafos después de la aplicación localizada del herbicida Basta 7 a las hojas, si había actividad PAT en las plantas evaluado por un ensayo enzimático in vitro. Toda la progenie PAT positiva evaluada contenía el gen bar, confirmando que la presencia de la enzima y la resistencia a bialafos estaban asociadas con la transmisión a través de la línea germinal del gen marcador. (iii) Caracterización Para confirmar la presencia de ADN exógeno o "transgen(es)" en ' 10 las plantas en regeneración, se pueden llevar a cabo diversos ensayos.

* Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológico moleculares", tales como transferencia Southern y Northern y PGR; ensayos "bioquímicos", tales como los que detectan la presencia de un producto proteico, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y transferencias Western) o mediante función 15 enzimática; los ensayos con partes de plantas, tales como ensayos con hojas o raíces; y también, mediante análisis del fenotipo de la planta regenerada entera. 1.- Integración de ADN, expresión de ARN y herencia 20 Se puede aislar el ADN genómico aislado de las líneas celulares o partes de planta con el fin de determinar la presencia del gen exógeno mediante el uso de técnicas bien conocidas por los expertos en el arte. Se debe tener en cuenta que las secuencias no siempre serán intactas, presumiblemente debido a un reordenamiento o supresión de secuencias en la célula. La presencia de elementos de ADN introducidos con los métodos de la invención puede ser determinada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El uso de esta técnica se amplifican fragmentos discretos de ADN y se detectan por electroforesis sobre gel. Este tipo de análisis permite determinar si un gen está presente en un transformante estable, pero no comprueba la integración del gen introducido en el genoma de la huésped célula. Según la experiencia de los inventores, no obstante, el ADN ha sido O integrado en el genoma de todos los transformantes que demuestran la presencia del gen mediante análisis por PCR. Además, no es posible determina, utilizando técnicas de PCR, determinar si los transformantes poseen genes exógenos introducidos en diferentes sitios de genoma, es decir, si los transformantes son de origen independiente. Se considera que el uso de 5 las técnicas de PCR permitirá clonar fragmentos del ADN genómico huésped adyacente al gen introducido. Una prueba positiva de la integración del ADN en el genoma huésped y las identidades independientes de los transformantes pueden ser determinadas utilizando la técnica de hibridización Southern. El uso de esta 0 técnica permite identificar las secuencias de ADN específicas que fueron introducidas en el genoma huésped y las secuencias de ADN blanqueadoras del huésped. De aquí que el patrón de la hibridización Southern de un transformante dado sirve como una característica identificadora de dicho transformante. Además es posible, mediante hibridización Southern, demostrar la presencia de genes introducidos ADN de alto peso molecular, es decir, confirmar que el gen introducido se ha integrado en el genoma de la célula huésped. La técnica de hibridización Southern provee información que se obtiene utilizando PCR, por ejemplo, la presencia de un gen, pero también demuestra la integración en el genoma y caracteriza cada transformante individual. Se considera que el uso de técnicas de hibridización de transferencia puntual o por bandas, que son modificaciones de las técnicas de hibridización Southern, permitirá obtener la misma información que deriva de la PCR, por ejemplo, la presencia de un gen. Se pueden emplear tanto técnicas de PCR como de Southern para demostrar la transmisión de un transgen a la progenie. En la mayoría de los casos, el patrón característico de la hibridización Southern para un transformante dado segregará en la progenie como uno o más genes Mendelianos (Spencer y otros, 1992) lo cual indica una herencia estable del transgen. En tanto las técnicas de análisis de ADN se pueden llevar a cabo utilizando ADN aislado de cualquier parte de una planta, el ARN solamente se expresará en tipos de células o de tejidos particulares y por consiguiente será necesario preparar ARN de estos tejidos para su análisis. Las técnicas de PCR también se pueden emplear para la detección y cuantificación del ARN producido por los genes introducidos. En esta aplicación del PCR primero es necesario efectuar una transcripción inversa del ARN en ADN, utilizando enzimas tales como la transcriptasa inversa, y luego, mediante las técnicas convencionales de PCR, amplificar el ADN. En la mayoría de los casos, las técnicas de PCR, en tanto son útiles, no demostrarán la integridad del producto del ARN. Se puede obtener información adicional sobre la naturaleza de los productos del ARN por transferencia Northern. Esta técnica permitirá demostrar la presencia de especies de ARN y brindar información acerca de la integridad de dicho ARN. La presencia o ausencia de una especie de ARN también se puede determinar mediante hibridizaciones puntuales o por bandas. Esta técnicas son modificaciones de las transferencias Northern y solamente demostrarán la presencia o ausencia de una especie de ARN: 2. Expresión del gen En tanto la transferencia Southern y la PCR se pueden utilizar para detectar el o los genes en cuestión, no proporcionan información acerca de si el gen está siendo expresado. La expresión se puede evaluar identificando específicamente los productos proteicos de los genes introducidos o evaluados los cambios fenotípicos provocados por su expresión. Los ensayos para la producción e identificación de proteínas específicas pueden emplear las propiedades físico-químicas o estructurales únicas permiten separar las proteínas e identificarlas mediante procedimientos electroforéticos, tales como electroforesis sobre gel nativa o desnaturalizante o enfoque isoeléctrico o mediante técnicas cromatográficas, tales como cromatografía de intercambio o exclusión sobre gel. Las estructuras únicas de proteínas individuales ofrecen oportunidades para utilizar anticuerpos específicos para detectar su presencia en protocolos tales como un ensayo ELISA. Las combinaciones de estos enfoques se pueden emplear con una especificidad aún mayor, como una transferencia Western en donde el anticuerpo se utiliza para localizar productos génicos individuales que fueron separados mediante técnicas electroforéticas. Se pueden utilizar técnicas adicionales para confirmar absolutamente la identidad del producto de interés, como la evaluación por secuenciación de aminoácidos después de la purificación. Si bien se encuentran entre las más utilizadas, también se pueden utilizar otros procedimientos. Los procedimientos de ensayo también se pueden utilizar para identificar la expresión de proteínas por su funcionalidad, en especial la capacidad de las enzimas de catalizar reacciones químicas específicas que involucran substratos y productos específicos. Estas reacciones pueden ser seguidas de la provisión y cuantificación de la pérdida de substrato o la generación de productos de reacción mediante procedimientos físicos o químicos. Los ejemplos son tan variados como la enzima a analizar y pueden incluir ensayos para la actividad enzimática PAT siguiendo la producción de fosfinotricina acetilada marcada radioactivamente a partir de fosfinotricina y 14C-acetil CoA o para la actividad de la antranilato sintetasa siguiendo la pérdida de fluorescencia del antranilato, para mencionar solamente dos.

Con mucha frecuencia la xpresión de un producto génico se determina evaluado los resultados fenotípicos de su expresión. Estos ensayos también pueden tomar muchas formas incluyendo, pero sin limitaciones a las mismas, el análisis de los cambios en la composición química, en la morfología o en las propiedades fisiológicas de la planta. La composición química se puede alterar mediante la expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento que cambian la composición de los aminoácidos y que pueden ser detectados mediante análisis de aminoácidos o mediante enzimas que cambian la calidad del almidón que puede ser analizado por infrarrojo cercano. Los cambios morfológicos pueden incluir una mayor altura o espiguillas más gruesas. Muy a menudo los cambios en la respuesta de las plantas o partes de la planta a los tratamientos impuestos son evaluados bajo condiciones muy controladas denominados bioensayos.

VIL Purificación de proteínas En algunas realizaciones particulares puede resultar conveniente purificar las proteínas codificadas por los transgenes de la invención actual. Las técnicas Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para los expertos en el arte. Estas técnicas comprenden, en un nivel, el fraccionamiento en crudo del medio celular en fracciones con polipéptidos y sin polipéptidos. Una vez separados los polipéptidos de otras proteínas, es posible purificar aún más el polipéptidos de interés utilizando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr una purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad). Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de un péptido puro son: cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión; electroforesis sobre gel de poliacrilamida y enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficiente de purificar péptidos es mediante cromatrografía líquida rápida de proteína o aun HPLC. Ciertos aspectos de la presente ¡nvención se relacionan con la purificación, y en realizaciones particulares, con la purificación substancial de una proteína o péptido codificados. El término "proteína o péptido purificado", * 10 tal como se lo utiliza en la presente documentación, hace referencia a una o composición, que se puede aislar de otros componentes, donde la proteína o el péptido se purifican hasta cualquier grado con relación al estado que se puede obtener naturalmente. Por eso, una proteína o péptido purificado también se refiere a una proteína o a un péptido, libre del entorno donde aparece naturalmente. El término "purificado" se refiere, en general, a una composición de proteínas o péptidos que ha sido sometido a fraccionamiento para eliminar otros componentes y reteniendo substancialmente dicha composición su actividad biológica expresada. Cuando se utiliza el término "substancialmente purificado", esta designación hace referencia a una composición en la cual la proteína o el péptido constituyen el componente más importante de la composición, constituyendo por ejemplo un 59%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% aproximadamente o más de las proteínas en la composición.

Existen varios métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o del péptido que son conocidos para los expertos en el arte a la luz de la presente descripción. Estos métodos comprenden, por ejemplo, la determinación de la actividad específica de una fracción activa o la evaluación de la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción mediante análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de dicha fracción, con el fin de compararla con la actividad específica del extracto inicial y calcular así el grado de pureza, expresado en la presente documentación en términos comparativos como * 10 "cantidad de veces más puro". Las unidades reales utilizadas para representar & la cantidad de actividad dependerán, por supuesto, de la técnica de evaluación particular elegida para la purificación y si la proteína o el péptido expresados presentan o no una actividad detectable. Existen varias técnicas adecuadas para su uso en la purificación de proteínas conocidas para los expertos en el arte. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, precipitación, con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y análogos o por desnaturalización por calor, seguido de centrifugación; pasos de cromatografía tales como de intercambio iónico, filtración por gel, de fase reversa, hidrosilapatita y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis sobre gel, y combinaciones de las mismas así como otras técnicas. Como es sabido en el arte, se cree que se puede cambiar el orden de los distintos pasos de purificación o que se pueden omitir ciertos pasos y aún contar con un método adecuado para la preparación de una proteína o un péptido substancialmente purificados. No hay un requisito general que precise que la proteína o el péptido siempre se deban obtener en su estado más purificado. En realidad se contempla que los productos que no están substancialmente purificados serán de utilidad en ciertas realizaciones. La purificación parcial se puede llevar a cabo utilizando menos pasos de purificación en combinación o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se considera que la cromatografía con columna de intercambio catiónico en un e 10 equipo para HPLC dará como resultado, en general, una purificación más * "veces" mayor que la misma técnica pero en un sistema de cromatografía de baja presión. Los métodos que exhiben un grado más bajo de purificación relativa pueden presentar ventajas en la recuperación total del producto proteico o en el mantenimiento de la actividad de una proteína expresada.

Es un hecho conocido que la migración de un polipéptido puede variar, a veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi y otros, 1977). Por ello se considera que bajo diferentes condiciones de electroforesis, pueden variar los pasos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados. 20 La cromatografía líquida de alta presión (HPLC) se caracteriza por una separación muy rápida con una resolución de picos extraordinaria.

Esto se logra utilizando partículas muy finas y presión alta para mantener una velocidad de flujo adecuada. La separación se puede llevar a cabo en cuestión de minutos o a lo sumo Una hora. Más aún, solamente se necesita un volumen muy pequeño de muestra porque las partículas son tan pequeñas y están tan empacadas por lo que el volumen muerto constituye una fracción muy pequeña del volumen del lecho. Además no es necesario que la concentración de la muestra sea muy grande porque las bancas son tan estrechas que se produce muy poca dilución de la muestra. La cromatografía sobre gel, o cromatografía con tamizado molecular, es un tipo especial de cromatografía de partición que se base en el tamaño de las moléculas. La teoría de esta técnica es que la columna, que se prepara con partículas muy pequeñas de una substancia inerte que contiene pequeños poros, separa las moléculas grandes de las más pequeñas a medida que van pasando por los poros o alrededor de los mismos, dependiendo de su tamaño. En tanto el material que constituye las partículas no adsorba las moléculas, el único factor que determina la velocidad de flujo es el tamaño. Entonces, las moléculas se eluyen de la columna en tamaño decreciente, siempre y cuando la forma sea relativamente constante. La cromatografía sobre gel es la técnica más adecuada para separar moléculas de diferentes tamaños porque la separación es independiente de otros factores como pH, fuerza iónica, temperatura, etc. Tampoco existe prácticamente adsorción, hay menos dispersión de zonas y el volumen de elución se relaciona de forma simple con el peso molecular. La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que se basa en la afinidad específica entre la substancia a aislar y una molécula con la cual se pueda unir específicamente. Esta es una interacción del tipo receptor ligando. El material de la columna se sintetiza por acoplamiento covalente de una de las partes de la unión con una matriz insoluble. El material de la columna puede entonces adsorber específicamente la substancia de la solución. La elución se produce cambiando las condiciones bajo las cuales la unión no tendrá lugar (alterando el pH, la fuerza iónica, la temperatura, etc.). Un tipo particular de cromatografía de afinidad que es de utilidad en la purificación de compuestos que contienen carbohidratos es la cromatografía de afinidad con lectina. Las lectinas son una clase de substancias que se unen con diversos polisacáridos y glicoproteínas. las lectinas se acoplan habitualmente con agarosa mediante bromuro de cianógeno. La conconavallina A acoplada a Sepharosa fue el primer material de este tipo que se utilizó y se ha empleado ampliamente en el aislamiento de polisacáridos y glicoproteínas. Otras lectinas que se han utilizado es la lectina de lentejas, aglutinina de germen de trigo que ha sido de utilidad en la purificación de residuos N- acetilglucosaminilo y lectina de Helix pomatia. Las lectinas mismas se purifican utilizando cromatografía de afinidad con ligandos de carbohidratos. Se ha empleados lactosa para purificar lectinas de habas y maníes; la maltosa ha sido de utilidad en la extracción de lectinas de lenteja y haba; la N-acetil-D-galactosamina se usa para la purificación de lectinas de soya; el N-acetil glucosaminilo se une a las lectinas del germen de trigo; la D- galactosamina se ha empleado en la obtención de lectinas de almeja y la L-fucosa se unirá a lectinas de loto. La matriz debe ser una sustancia que por sí misma no adsorbe moléculas en un grado significativo y que presenta un rango amplio de estabilidad química, física y térmica. El ligando se debe acopiar de manera tal que no afecte sus propiedades de unión. El ligando también debe proveer una unión relativamente estrecha. Debería ser posible, además, eluir la sustancia sin destruir la muestra o el ligando. Una de las formas más comunes de cromatografía de afinidad es la inmunocromatografía de afinidad. La generación de anticuerpos adecuados de acuerdo con la presente ¡nvención se discutirá más adelante.

VIII. Análisis genético de plantas transgénicas resistentes a glifosato En realizaciones particulares de la ¡nvención, se pueden utilizar métodos para detectar variaciones en la expresión de transgenes particulares tales como el gen bar y EPSPS mutante. Este método puede comprender la determinación del nivel de proteína expresada por estos genes o la determinación de alteraciones específicas en el producto expresado.

Obviamente, este tipo de ensayo es importante para el rastreo en los transformantes de una resistencia a herbicidas potencial. Dichos ensayos pueden, en algunos casos, ser más rápidos, más precisos o menos costosos que los ensayos de rastreo convencionales.

La muestra biológica puede ser potencialmente cualquier tipo de tejido vegetal. El ácido nucleico utilizado se aisla de las células contenidas en la muestra biológica de acuerdo con metodologías estándar (Sambrook y otros, 1989). El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN de células enteras o fraccionadas. Cuando se utiliza ARN, puede ser conveniente convertir el ARN en ADN complementario. En una realización, el ARN es ARN de célula entera; en otra, es ARN poli-A. Normalmente, el ácido nucleico es amplificado. Según el protocolo, el ácido nucleico específico de interés es identificado en la muestra directamente utilizando amplificación o con un segundo ácido nucleico conocido después de la amplificación. A continuación, se detecta el producto identificado. En ciertas aplicaciones, la detección se puede llevar a cabo por medios visuales (por ejemplo, coloración con bromuro de etidio de un gel). Como alternativa, la detección puede involucrar una identificación indirecta del producto por medio de quimioluminiscencia, centellografía radioactiva de una marca redioactiva o una marca fluorescente o aun por medio de un sistema que utiliza señales de impulsos eléctricos o térmicos (Affymax Technology; Bellus, 1994). Después de la detección, se pueden comparar los resultados observados en una planta dada con un grupo de referencia estadísticamente significativo de plantas control no tansformadas. Habitualmente, las plantas control no transformadas tendrán antecedentes genéticos similares a los de la planta transformada. De esta manera es posible detectar diferencias en la cantidad o el tipo de proteína detectado en varias plantas tanformadas. Se contempla una variedad de ensayos diferentes para el rastreo de plantas resistentes a glifosato en la presente ¡nvención y elementos exógenos asociados. Esta técnicas pueden emplearse, en algunos casos, para detectar tanto la presencia de genes particulares como los reordenamientos que se pudieron haber producido en la construcción genética. Dichas técnicas incluyen, pero sin limitaciones, hibridización fluorescente in situ (FISH), secuenciación directa de ADN, análisis PFGE, transferencia Southern o Northern, análisis de conformación de cadena simple (SSCA), ensayo de protección de ARNasa, oligonucleótidos específicos de laelos (ASO), análisis de transferencia puntual, electroforesis sobre gel con gradiente desnaturalizante, RFLP y PCR-SSCP. (i) Cebadores y sondas El término cebador, como se define en la presente documentación, pretende abarcar cualquier ácido nucleico capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico incipente en un proceso dependiente de templados. Habitualmente, los cebadores son oligonucleótidos de diez a veinte pares de bases de longitud, pero también se puede emplear secuencias más largas. Los cebadores se pueden proveer en la forma de cadena simple o cadena doble, si bien se prefiere la forma de cadena simple. Las sondas se definen de otra manera, si bien pueden actuar como cebadores. Las sondas, si bien son capaces de cebar, se diseñan para unirse al ADN o ARN blanco y no es necesario emplearlos en un proceso de amplificación. En realizaciones preferidas, las sondas o los cebadores se marcan con especies radioactivas (32P, 14C, 35S, 3H u otra marca), con un fluoróforo (rodamina, fluoresceína) o un quimiolumiscente (luciferasa). (ii) Métodos de amplificación dependientes de templados Existe una cantidad de procesos dependientes de templados disponibles para amplificar la secuencias marcadoras presentes en una * 10 muestra de templado dada. Uno de los métodos de amplificación mejor - conocidos en la reacción en cadena de la polimerasa (denominado PCR™) que se describe detalladamente en las patentes de los EE.UU. No. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, cuyos contenidos se incorporan por completo a la presente a modo de referencia. 15 En resumen, en la PCR se preparan dos secuencias cebadoras que son complemetarias a regiones en cadenas compementarias opuestas de la secuencia marcadora. Se añade un exceso de dosoxinucleósidos trifosfatos a la mezcla de reacción junto con una ADN polimerasa, por ejemplo la Taq polimerasa. Si la secuencia marcadora está presente en la muestra, los cebadores se unirán al marcador y la polimerasa hará que los cebadores se extiendan junto con la secuencia marcadora por adición continua de nucleótidos. Aumentando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán del marcador para formar los productos de reacción, los cebadores en exceso se unirán al marcador y a los productos de reacción y se repite el proceso. Se puede efectuar un procedimiento de amplificación por PCR con transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Los métodos de transcripción inversa de ARN en ADNc son bien conocidos y están descritos en Sambrook y otros, 1989. Los métodos alternativos para una transcripción inversa emplean ADN polimerasas dependientes de ARN, termoestables. Estos métodos se describen en la publicación WO 90/07641 , depositada el 21 de diciembre, 1990. Las metodologías de reacción en cadena de la polimerasa son bien conocidas en el arte. Otro método de amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR"), descrita en la publicación EPO No. 320 308, cuyo contenido se incorpora por completo a la presente a modo de referencia. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias y, en presencia de la secuencia blanco, cada par se unirá a la cadena complementaria opuesta del blanco de manera tal que quedan enfrentadas. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se ligarán para formar una sola unidad. El empleo de ciclos de temperatura, como en la PCR, permitirá que las unidades ligadas unidas se disocien del blanco y luego sirvan como "secuencias blanco" para la ligación de pares de sondas en exceso. En la patente de los EE.UU. No. 4,883,750 se describe un método similar a la LCR para unir pares de sondas a una secuencia blanco.

También se puede emplear la replicasa Qbeta, descrita en la solicitud de patente PCT No. PCT/US87/00880, como otro método de amplificación más en la presente ¡nvención. En este método una secuencia de replicación de ARN que posee una región complementaria a la del blanco se añade a la muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia de replicación que después puede ser detectada. Un método de amplificación isotérmica, en el cual se utilzan endonucleasas de restricción y ligasas para lograr la amplificación de las moléculas blanco que contienen 5'-[alfa-t¡o]-trifosfatos de nucleótidos en una cadena de un sitio de restricción, también puede ser dé utilidad en la amplificación de los ácidos nucleicos de la presente invención, Walker y otros, (1992). La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) es otro método para llevar a cabo una amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que abarca rondas múltiples de síntesis y desplazamiento de cadena, es decir, traducción nick. Un método similar, denominado reacción de reparación en cadena (RCR), comprende el alineamiento de varias sondas a lo largo de una región que constituirá el blanco de la amplificación, seguido de una reacción de reparación donde solamente dos de las cuatro bases están presentes. Las otras dos bases pueden agregarse como derivados biotinilados para una detección fácil. Un enfoque similar se utiliza en el SDA. También se pueden detectar secuencias blanco específicas utilizando una reacción cíclica con sondas (CPR). En la CPR, se hibridiza una sonda que posee secuencias 3' y 5' de un ADN no específico y una secuencia media de ARN específico como ADN presente en la muestra. Durante la hibridización, la reacción se trata con ARNasa H y los productos de la sonda se identifican como productos distintivos que son liberados después de digestión. El templado original se alinea con otra sonda de ciclación y se repite la reacción. Aún otros métodos de amplificación se describen en la solicitud de patente GB No. 2 202 328 y en la solicitud de patente PCT No.

PCT/US89/01025, cuyos contenidos se incorporan por completo a la presente a modo de referencia, y se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. En la primera solicitud, se utilizan cebadores "modificados" en una síntesis dependiente de enzimas y templados tipo PCR. Los cebadores se pueden modificar por marcación con una porción de captura (por ejemplo, biotina) y/o una porción detectora (por ejemplo, una enzima). En la segunda solicitud, se añade un exceso de sondas marcadas a la muestra. En la presencia de la secuencia blanco, la sonda se une y se diva catalíticamente. Después del clivaje, la secuencia blanco es liberada intacta para ser unida por un exceso de sonda. El clivaje de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia blanco. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen los sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), incluyendo la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) y 3SR (Kwoh y otros, 1989; Gingeras y otros, solicitud de patente PCT WO 88/10315, cuyo contenido se incorpora por completo a la presente a modo de referencia). En la NASBA, los ácidos nucleicos se pueden preparar para la maplificación por extracción estándar en fenol/cloroformo, desnaturalización por calor de una muestra clínica, tratamiento con buffer de lisis y columnas minispin para el aislamiento de ADN y ARN o extracción de ARN con cloruro de guanidinio. Estas técnicas de amplificación involucran el alineamiento de un cebador que posee secuencias blanco específicas.

Después de la polimerización, los ADN/ARN híbridos se degieren con ARNasa H en tanto las moléculas de ADN de cadena doble se vuelven a desnaturalizar. En cualquiera de los casos el ADN de una sola cadena se vuelve completamente de doble cadena por adición de un segundo cebador blanco específico, seguido de polimerización. Las moléculas de ADN de cadena doble se transcriben después varias veces con una ARN polimerasa, tal como T7 o SP6. En una reacción cíclica isotérmica, los ARN se transcriben inversamente en ADN de una sola cadena, que luego se convierte en ADN de cadena doble y después se vuelve a transcribir con una ARN polimerasa, como la T7 o SP6. Los productos resultantes, ya sean truncadas o completas, indican secuencias blanco específicas. Davey y otros, EPO No. 329 822 (cuyo contenido se incorpora por completo a la presente a modo de- referencia) describen un proceso de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden la síntesis cíclica de ARN de cadena simple ("ARNcs"), ADNcs y ADN de cadena doble (ADNcd), que se puede utilizar de acuerdo con la presente ¡nvención. El ARNcs es un templado para un primer cebador oligonucleotídico, que es elongado por la transcriptasa inversa (ADN:ARN resultante por acción de la ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa específica para ARN en dupla con ADN o ARN). El ADNc resultante es un templado para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de la ARN polimerasa (ejemplificado por la ARN polimerasa T7) 5' con respecto a su homología con el templado. Este cebador es extendido entonces por una ADN polimerasa (ejemplificado por el fragmento grande de "Klenow" de la ADN polimerasa b de E. coli, resultando en una molécula de ADN de cadena doble ("ADNcd"), cuya secuencia es idéntica al ARN original entre los cebadores y que posee adicionalmente, en un extremo, una secuencia promotora. Esta secuencia promotora puede ser utilizada por la ARN polimerasa apropiada para efectuar muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden entonces volver a ingresar en el ciclo lo cual conduce a una amplificación muy suave. Si se efectúa una elección apropiada de enzimas, esta amplificación se puede llevar a cabo isotérmicamente sin la adición de enzimas en cada ciclo. Dada la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia incial puede elegirse en la forma de ADN o ARN. Miler y otros, solicitud de patente PCT WO 89/06700 (cuyo contenido se incorpora por completo a la presente a modo de referencia) describen un esquema de amplificación de una secuencia de ácido nucleico basado en la hibridización de una secuencia promotora/cebadora con un ADN blanco de una sola cadena ("ADBcs") seguido de transcripción de muchas copias de la secuencia de ARN. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen nuevos templados a partir de los transcriptos de ARN. Otros métodos de amplificación ¡ncluyen "RACE" y "PCR unilateral" (Frohman, M.A., En: PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, N.Y., 1990; Ohare y otros, 1989; cada uno de los cuales se incorpora por completo a la presente documentación a modo de referencia). Los métodos basados en la ligación de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de un ácido nucleico que posee la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, con lo cual se amplifica el di-oligonucleótido, también se pueden utilizar en el paso de amplificación de la presente invención. Wu y otros, (1989), cuyo contenido se incorpora por completo a la presente a modo de referencia. (¡ii) Transferencia Southern/Northern Las técnicas de tranferencia son bien conocidas por los expertos en el arte. La transferencia Southern involucra el uso de ADN como blanco, en tanto la tranferencia Northern comprende el uso de ARN como blanco. Cada uno provee diferentes tipos de información, si bien la transferencia con ADNc es análoga, en muchos aspectos, a la transferencia de especies de ARN. En resumen, se utiliza una sonda para buscar como blanco a una especie de ADN o ARN que ha sido inmovilizada sobre una matriz adecuada, a menudo un filtro de nitrocelulosa. Las deferentes especies se deben separar parcialmente para facilitar el análisis. Esto se logra a menudo por electroforesis sobre gel de especies de ácido nucleico seguido de "transferencia" al filtro.

A continuación, el blanco transferido se incuba con una sonda (habitualmente marcada) bajo condiciones que promueven la desnaturalización y rehibridización. Dado que la sonda está diseñada para aparearse con las bases del blanco, la sonda se unirá a una porción de la secuencia blanco bajo condiciones re natura I izantes. Luego se elimina la sonda sin unir y la detección se lleva a cabo como se describió anteriormente. (iv) Métodos de separación Habitualmente resulta conveniente, en una etapa u otra, separar el producto de la amplificación del templado y el exceso de cebador con el fin de determinar si se ha producido una amplificación específica. En una realización, los productos de la amplificación se separan por electroforesis sobre gel de agorasa, agorasa-acrilamida o poliacrilamida utilizando los métodos estándar. Véase Sambrook y otros, 1989. Como alternativa, se pueden emplear técnicas cromatográficas para efectuar la separación. Existen muchos tipos de cromatografía que se pueden utilizar en la presente invención: adsorción, partición, intercambio iónico y tamizado molecular y muchas técnicas de uso especializado, incluyendo cromatografía sobre columna, papel, capa delgada y gaseosa (Freifelder, 1982). (v) Métodos de detección Los productos se pueden visualizar con el fin de confimar la amplificación de las secuencias marcadoras. Un método de visualización típico comprende la coloración del gel con bromuro de etidio y la visualización bajo luz UV. Como alternativa, si los productos de amplificación se marcan íntegramente con nucleótidos marcados radioactiva o fluorimétricamente, ios productos de amplificación pueden entonces exponerse a película de rayos X o se visualizan bajo un espectro estimulante apropiado, después de separación. En una realización la visulización se logra de forma indirecta.

Después de la separación de los productos de amplificación, la sonda de ácido nucleico marcado se pone en contacto con la secuencia marcadora amplificada. La sonda se conjuga, con preferencia, con un cromóforo pero también se pueden marcar radioactivamente. En otra realización, la sonda se conjuga con un asociado de unión, tal como un anticuerpo o biotina, y el otro miembro de la asociación lleva una porción detectable. En una realización, la detección se efectúa con una sonda marcada. Las técnicas involucradas son bien conocidas por los expertos en el arte y se pueden encontrar en muchos libros estándar sobre protocolos moleculares. Véase Sambrook y otros, 1989. Por ejemplo, las sondas o cebadores cromóforos o marcas radioactivas identifican el blanco durante o después de la amplificación.

Un ejemplo de lo mencionado se describe en la patente de los EE.UU. No. 5.279.721 , cuyo contenido se incorpora por completo a la presente documentación a modo de referencia, en la cual se describe un equipo y un método para una electroforesis automática y la transferencia de ácidos nucleicos. El equipo permite efectuar la electroforesis y la transferencia sin manipulación externa del gel y resulta ideal para llevar a cabo los métodos acordes con la presente ¡nvención. Además, los productos de amplificación que se describieron anteriormente pueden ser sometidos a análisis de secuencia para identificar tipos específicos de variaciones utilizando técnicas estándar de análisis de secuencia. En ciertos métodos, se lleva a cabo un análisis exhaustivo de los genes mediante análisis de secuencia utilizando juegos de cebadores diseñados para una secuencia óptima (Pignon y otros, 1994). La presente invención provee métodos con los cuales se pueden utilizar todos estos tipos de análisis. El uso de las secuencias descritas en la presente documentación permite diseñar cebadores oligonucleotídicos que permiten la amplificación de secuencias de todos los sucesos de transformación GA21 , GG25, GJ1 1 y FU 17, así como las regiones flanqueadoras, que después se pueden analizar por secuenciación derecta. (vi) Diseño y consideraciones teóricas para una RT-PCR cuantitativa relativa La transcripción inversa (RT) de ARN en ADNc seguido de PCR cuantitativa relativa (RT-PCR) puede emplearse para determinar las concentraciones relativas de especies de ARNm específicas aisladas de plantas. La determinación del hecho que la concentración de una especie de ARNm específica varía, demuestra que el gen que codifica dicha especie de ARNm específica se expresa de un modo diferencial. En la PCR, la cantidad de moléculas del ADN blanco amplificado aumenta en un factor que se aproxima a dos con cada ciclo de reacción hasta que algún reactivo se vuelve limitante. A continuación, la tasa de amplificación desmunuye cada vez más el incremento hasta que ya no se produce un aumento del blanco amplificado entre ciclos. Si se traza un gráfico con el número de ciclos sobre el eje X y el log de la concentración del ADN blanco amplificado sobre el eje Y, se forma una línea curva con una forma característica uniendo los puntos graficados. Comenzando con el primer ciclo, la pendiente de la línea es positiva y constante. Esta se conoce como la porción lineal de la curva. Después que un reactivo se vuelve limitante, la pendiente de la línea comienza a disminuir y eventualmente llega a cero. En este momento la concentración del ADN blanco amplificado se vuelve asintótica hacia un valor fijo determinado. Esta se conoce como la porción estacionaria o plateau de la curva. La concentración del ADN blanco en la porción lineal de la amplificación por PCR es directamente proporcional a la concentración inicial del blanco antes del comienzo de la reacción. La determinación de la concentración de los productos amplificados del ADN blanco en las reacciones por PCR que han completado la misma cantidad de ciclos y se encuentran en sus rangos lineales, permite determinar las concentraciones de la secuencia blanco específica en la mezcla original de ADN. Si las mezclas de ADN son ADNc sintetizadas a partir de ARN aislado de diferentes tejidos o células, se pueden determinar las abundancias relativas del ARNm específico de las cuales derivaron las secuencias blanco para los tejidos o células respectivos. Esta proporcionalidad directa entre la concentración de los productos de la PCR y las abundancias relativas de ARNm solamente es válida para el rango lineal de la reacción de PCR. La concentración final del ADN blanco en la porción estacionaria o plateau de la curva está determinada por la disponibilidad de reactivos en la mezcla de reacción y es ¡ndependiente de la concentración original del ADN blanco. Por ello, la primera condición que se debe cumplir antes de poder determinar las abundancias relativas de especies de ARNm por TR-PCR para una agrupación de poblaciones de ARN, es que se deben tomar muestras de las concentraciones de los productos amplificados por PCR cuando las reacciones de PCR se encuentran en la porción lineal de sus curvas. La segunda condición que se debe cumplir para poder determinar exitosamente las abundadas relativas de una especie particular de ARNm con un experimento de RT-PCR es que las concentraciones relativas de ADNc amplificable deben normalizarse con algún estándar independiente. La finalidad de un experimento de RT-PCR es determinar la abundada de una especie de ARNm con relación a la abundancia relativa de todas las especies de ARNm presentes en la muestra.

La mayoría de los protocolos para una PCR competitiva emplean estándares de PCR internos que son casi tan abundantes como el blanco.

Estas estrategias son efectivas si se toman muestras de los productos de las amplificaciones por PCR durante sus fases lineales. Si se toman muestras de los productos cuando las reacciones se están aproximando a la fase estacionaria o plateau, entonces el producto menos abundante se vuelve algo sobre-representado. Las comparaciones de las abundadas relativas de muchas muestras de ARN diferente, como es el caso cuando se examina la expresión diferencial del ARN de las muestras, se distorsionan de tal manera que las diferencias en las abundancias relativas de los ARN parecen menores de lo que realmente son. Este no es un problema significativo si el estándar interno es mucho más abundante que el blanco. Si el estándar interno es más abundante que el blanco, entonces se pueden efectuar comparaciones lineales entre las muestras de ARN. La discusión anterior trata de las consideraciones teóricas para un ensayo de RT-PCR con tejidos vegetales. Los problemas inherentes a las muestras de tejidos vegetales son su cantidad variable (haciendo que una normalización sea problemática) y su calidad variable (porque necesitan la coamplificación de un control interno confiable, con preferencia de mayor tamaño que el blanco). Ambos problemas se resuelven si la RT-PCR se lleva a cabo como una RT-PCR cuantitativa relativa con un estándar interno, siendo dicho estándar interno un fragmento de ADNc amplificable que es mayor que el fragmento de ADNc blanco y en la cual la abundancia del ARNm que codifica dicho estándar interno es aproximadamente 5-100 veces mayor que el ARNm codificador del blanco. Este ensayo mide la abundancia relativa, no la abundancia absoluta de al especie de ARNm respectiva. Se pueden efectuar otros estudios utilizando un ensayo RT-PCR cuantitativo relativo más convencional con un protocolo de estándar externo.

Estos ensayos trabajan con muestras de los productos de PCR en la porción lineal de sus curvas de amplificación. La cantidad de ciclos de PCR óptima para la toma de muestras debe determinarse empíricamente para cada fragmento de ADNc blanco. Además, se deben normalizar cuidadosamente los productos de la transcriptasa inversa de cada población de ARN aislada de varias muestras de tejido con concentraciones ¡guales de ADNc amplificable. Esta consideración es muy importante dado que en este ensayo se mide la abundancia absoluta de ARNm. La abundancia absoluta de ARNm solamente se puede utilizar como una medida de al expresión génica diferencial en muestras normalizadas. En tanto la determinación empírica del rango lineal de la curva de amplificación y la normalización de las preparaciones de ADNc son procesos tediosos y que consumen tiempo, los ensayos RT-PCR resultantes pueden ser superiores a aquellos que derivan de los ensayos de RT-PCR cuantitativos relativos con un estándar interno. Uno de los motivos de esta ventaja es que sin el estándar interno/competidor, todos los reactivos pueden convertirse en un solo producto de PCR en el rango lineal de la curva de amplificación, incrementando así la sensibilidad del ensayo. Otro motivo es que con un solo producto de PCR, la visualización del producto sobre un gel electroforético, o empleando otro método de visualización, se vuelve menos compleja, presenta menos ruido de fondo y es más fácil de interpretar. (viii) Tecnologías chip Los inventores de la presente contemplan específicamente las tecnologías de ADN basadas en chips, tales como las descritas por Hacia y otros (1996) y Shoemaker y otros (1996). En resumen, estas técnicas involucran métodos cuantitativos para analizar grandes cantidades de genes de forma rápida y precisa. La marcación de genes de oligonucleótidos o el uso de conjuntos de sondas fijas, permite emplear la tecnología chip para segregar las moléculas blanco como conjuntos de gran densidad y rastrear estas moléculas sobre la base de hibridización (Véase también, Pease y otros (1994); Fodor y otros (1991 ).

IX. Regeneración de plantas a partir de células transformadas Para su utilización en la agricultura, la transformación de células in vitro solamente se encuentra a un paso de la utilización comercial de estos métodos nuevos. Las plantas se deben regenerar a partir de las células transformadas y las plantas regeneradas se deben desarrollar en plantas completas capaces de crecer como cultivos a campo abierto. Con este fin, se requieren planta de maíz fértiles.

Durante el desarrollo de cultivos en suspensión, se forman pequeños agregados celulares (10-100 células), aparentemente a partir de agrupaciones más grandes, otorgándole al cultivo un aspecto disperso. Al plaquear estas células sobre un medio sólido, se puede inducir el desarrollo de embriones somáticos y estos embriones se pueden hacer madurar, germinar y cultivar en plantas que llevan semillas fértiles. Como alternativa, se puede inducir que células de callos que crecen sobre un medio de cultivo sólido formen embriones somáticos a partir de los cuales se pueden desarrollar plantas que lleven semillas fértiles. Las características de la embriogenicidad, capacidad de regeneración y fertilidad de la planta se pierden gradualmente en función del tiempo en los cultivos en suspensión. La crioconservación de las células en suspensión detiene el desarrollo del cultivo e impide la pérdida de estas características durante el período de crioconservación.

X Esterilidad masculina inducida con glifosato en GJ1 1 y GG25 Como se demuestra más adelante, las aplicaciones específicas del glifosato se pueden utilizar para inducir esterilidad masculina en plantas de maíz que contienen uno o más de un suceso de transformación particular, como por ejemplo, los sucesos de transformación GJ1 1 o GG25. Se puede emplear una variedad de parámetros diferentes de la aplicación de glifosato y aún inducir esterilidad masculina en plantas que poseen un suceso de transformación GG25, GJ1 1 u otro similar, mientras que mantiene la fertilidad femenina. El tratamiento tendrá lugar, con preferencia, en la etapa V4 del desarrollo o en una etapa posterior, y puede efectuarse en cualquier momento hasta la liberación del polen y aun durante la misma (etapa VT). Los tiempos específicos del desarrollo que se pueden emplear incluyen, por ejemplo, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V1 1 , V12, V13, V14m V15, V16, V17, V18, y cualquier etapa posterior previa a la liberación del polen. En realizaciones particulares, se prefieren los rangos V12-V14, V15-V17 y V18VT. También se contempla que puede resultar conveniente efectuar más de una aplicación de glifosato, por ejemplo las aplicaciones de glifosato pueden efectuarse en las etapas V12 y V15. Las tasas de aplicación pueden variar. En la invención actual serán de utilidad los equivalentes de una tasa de aplicación de superficie entre, e incluyendo, 8 onzas por acre y 96 onzas por acre de glifosato (por ejemplo ROUNDUP ULTRA ™). Específicamente se contempla el uso de todas las concentraciones entre 8 y 96 onzas aproximadamente por acre, incluyendo 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92 y 96 onzas por acre. Las concentraciones que se consideran de particular utilidad incluyen, por ejemplo, 32, 64 y 96 onzas por acre aproximadamente. Como alternativa, se contempla el uso con éxito de otras concentraciones de glifosato con la invención actual; sin embargo, el uso de dichas aplicaciones serán menos preferidas con las presente invención. (i) Utilización de la esterilidad masculina inducida con herbicida en los programas de cría o mejoramiento El maíz presenta una fase diploide que significa que dos condiciones de un gen (dos alelos) ocupan cada locus (posición en el cromosoma). Si los alelos son iguales en el locus, se dice que existe homocigocidad. Si son diferentes, se dice que hay heterocigocidad. En una planta completamente endogámica, todos los loci son homocigotas. Dado que cuando muchos loci son homocigotas resultan nocivas para la planta, en particular porque conducen a una reducción en el vigor, en menos granos, en un crecimiento débil y/o pobre, el granjero prefiere evitar el uso directo de endogámicos. Bajo ciertas condiciones, la ventaja de la heterocigocidad de algunos loci impide de forma efectiva la perpetuación de la homocigocidad. En general, el maíz híbrido demostrará un mayor vigor que los endogámicos. Por ello, la producción de híbridos será de gran interés para el criador y el productor. Una aplicación importante de la esterilidad masculina inducible de los sucesos de transformación de la ¡nvención actual será la producción de semillas de maíz híbrido. Para este uso, se siembran plantas progenitoras en proximidad de polinización entre sí en filas alternantes, en bloques o según cualquier otro patrón de siempre que resulte conveniente. Una de las plantas, la progenitora femenina, típicamente va a contener el suceso de transformación GG25 o GJ11 o un suceso de transformación similar que demuestre la esterilidad masculina; en tanto la planta utilizada como progenitor masculino será resistente a glifosato y va a contener, preferentemente, un suceso de transformación GA21 , FU 17 o uno similar que confiere fertilidad masculina y femenina después de la aplicación de glifosato.

Un progenitor masculino preferido contiene el suceso de transformación GA21 . Para la producción de híbridos los progenitores femenino y masculino son típicamente endogámicos de élite diferentes derivados de distintos antecedentes heteróticos en los cuales se han retrocruzado uno o varios sucesos de transformación apropiados. Las plantas de ambos progenitores se cultivan entonces hasta el momento de la floración. Durante este momento del cultivo y antes de la liberación del polen, se efectúa una o más aplicaciones de glifosato, induciendo de esa manera la esterilidad masculina en plantas que comprenden el suceso de transformación GG25, GJ1 1 o uno similar. Resulta ventajoso, durante esta etapa del crecimiento, tratar las plantas en general con fertilizantes y/u otras substancias químicas de aplicación en la agricultura que fueran consideradas apropiadas por el productor. Después de la esterilización, tiene lugar la hibridización y la fertilización. Las plantas de maíz (Zea Mays L) se pueden cruzar mediante técnicas naturales o mecánicas. La polinización natural en el maíz ocurre cuando el viento lleva el polen desde la espiguilla hasta los pistilos que protruyen por los extremos superiores de la mazorca incipiente. Se puede efectuar una polinización dirigida artificialmente ya sea controlando los tipos de polen que pueden llegar hasta los pistilos o bien, mediante una polinización manual. En los esquemas de cría o mejoramiento de plantas convencionales, en el momento de la floración, típicamente se retiran todas las espiguillas de las plantas progenitoras que se emplean como progenitores femeninos. Esto se puede llevar a cabo manualmente o con máquinas, según necesidad. Esta técnica, si bien es efectiva, es extremadamente laboriosa e incrementa enormemente el costo global de la producción de semillas híbridas. Como alternativa, se pueden utilizar sistemas de esterilidad masculina o citoplasmático o nuclear, pero, en general, dichos sistemas complican los esfuerzos por perpetuar líneas endogámicas específicas. En la invención actual, las plantas progenitoras femeninas van a contener un suceso de transformación GC25 o GJ1 1 u otro suceso con propiedades similares y serán tratadas con glifosato en la etapa V5 o en una etapa posterior, lo cual causará esterilidad masculina en dichas plantas y de esa manera se evita la necesidad de retirar las espiguillas. Este tratamiento se puede llevar a cabo en plantas individuales, pero con mayor preferencia será un tratamiento de superficie en todo el campo de plantas progenitoras femeninas y masculinas. En este caso, será necesario que ambas plantas progenitoras masculina y femenina sean resistentes al glifosato y de fertilidad masculina, y femenina, respectivamente, bajo las condiciones de aplicación de glifosato utilizadas para provocar la esterilidad masculina. Un progenitor masculino apropiado será, por lo tanto, totalmente fértil bajo las condiciones de aplicación de glifosato que se utilizan para inducir esterilidad masculina en el progenitor femenino. Como alternativa, el progenitor masculino puede ser excluido del tratamiento con glifosato y por ello potencialmente es posible utilizar cualquier planta de maíz como progenitor masculino. Los ejemplos de progenitores masculinos que pueden ser tratados con glifosato son las plantas de maíz que contienen un suceso de transformación GA21 o FU 17, siendo más preferido el GA21. Se permite que las plantas continúen creciendo y la polinización cruzada se produce como resultado de la acción del viento, que es normal en la polinización de pastos, inclusive el maíz. Como resultado de la esterilidad * 10 masculina inducida en la planta progenitora femenina, todo el polen de la * planta progenitora masculina se encuentra disponible para la polinización porque las espiguillas, y con ello las partes en floración que llevan polen, fueron esterilizadas previamente en todas las plantas que se utilizan como fracción femenina de la hibridización. Por supuesto, durante este procedimiento de hibridización, las variedades progenitoras se cultivan de manera tal que son aislados de otros campos de maíz a fin de minimizar o impedir cualquier contaminación accidental con polen proveniente de fuentes extrañas de campos no tratados con glifosato. Estas técnicas del aislamiento son de conocimiento general para el experto en este tema. 20 Se puede dejar que ambas plantas de maíz endogámicas progenitoras continúen creciendo hasta la madurez o se pueden destruir las filas masculinas una vez completada la floración. Solamente se cosechan las plantas endogámicas progenitoras femeninas para obtener las semillas de una nueva F1 u otro tipo de híbrido. Las nuevas semillas híbridas producidas pueden entonces sembrarse en la siguiente estación de crecimiento, donde se pueden lograr las características deseables en términos de plantas de maíz híbrido que proveen mayores rendimientos de granos y otras características deseables descritas en la presente documentación. Por lo tanto, las semillas recogidas representan un valioso producto comercial que puede ser vendido a granjeros, empleado en otros programas de cría o mejoramiento, sembrado directamente en el campo por el criador o procesado. En una realización, las semillas de maíz preparadas por un proceso tal es la primera generación de semillas capaces de crecer dando una planta de maíz híbrido F1 , que se obtuvo por un proceso donde tanto la primera como la segunda planta de maíz progenitora son plantas de maíz endogámico en los cuales los sucesos de transformación de la invención actual fueron retrocruzados. En otra realización una o las dos primera y segunda plantas de maíz progenitoras pueden ser híbridos que contienen los sucesos de transformación apropiados. Cuando se cruza una planta de maíz endogámica que contiene un suceso de transformación GG25, 1 1 u otro suceso de transformación de fenotipo similar con otra diferente, se producen semillas de maíz endogámico capaces de crecer dando una primer generación (F1 ) de plantas de maíz híbrido. Estas semillas F1 , las plantas de maíz híbrido F1 obtenidas a partir de ellas y las semillas de esa planta de maíz híbrido F1 son consideradas como aspectos de la presente invención. La meta de un proceso para producir un híbrido F1 es manipular el complemento genético del maíz con el fin de generar nuevas combinaciones de genes que interactúan para dar características nuevas o mejoradas (características fanotípicas). El proceso de producción de un híbrido F1 comienza típicamente con la producción de una o más plantas endogámicas. Dichas plantas son producidas por cruzamiento repetido de plantas de maíz relacionadas ancestralmente para tratar de concentrar ciertos genes en dichas planas endogámicas. Por ello, cualquier endogámico que contenga un suceso de transformación de la invención actual también forma parte de la invención. En una realización preferida, el cruzamiento comprende los pasos de: (a) sembrar, en proximidad de polinización, semillas de una primera y segunda planta de maíz progenitora, donde se prefiere que la primera planta de maíz progenitora sea un endogámico que contenga el suceso de transformación GG25, GJ11 , u otro suceso de transformación que confiera un fenotipo similar, y que el segundo progenitor contenga el suceso de transformación FU 17, GA21 u otro suceso de transformación que confiera un fenotipo similar; (b) cultivar las semillas de la primera y segunda planta de maíz progenitora; (c) aplicar 8 a 96 onzas por acre de glifosato (ROUNDUP ULTRA™) a las plantas de maíz progenitoras entre las etapas V8 y VT del desarrollo; (d) permitir la polinización cruzada entre la primera y la segunda planta de maíz progenitora; (e) cosechas las semillas producidas en la primera planta, y, cuando se deseara; (f) cultivar las semillas cosechadas hasta obtener una planta de maíz. La utilidad de los métodos y de los sucesos de transformación de la invención actual también se extiende a los cruzamiento con otras especies. Habitualmente, las especies adecuadas pertenecerán a la familia Graminaceae, y en especial los géneros Zea, Trípsacum, Coix, Schierachne, Polytoca, Chionachne y Trilobachne, de la tribu Maydeae. En todos ellos los más preferidos son Zea y Tripsacum. Pueden también ser potencialmente adecuados para los cruzamientos con plantas de maíz que contengan los sucesos de transformación de la invención actual las distintas variedades sorgo en grano, Sorghum bicolor (L.) Moench. (¡i) Uso de aplicaciones con herbicida para la pureza de semillas La invención actual también se puede utilizar para provocar o asegurar la pureza genética en los protocolos de cría o mejoramiento. Se contempla específicamente que el tratamiento de un campo con glifosato, producirá la esterilización de granos de polen que no posean un alelo que contenga un suceso de transfomación GA21 , FU 17 o uno similar. Así, el uso apropiado de los tratamientos con glifosato en plantas transgénicas específicas, permitirá mejorar la pureza de las semillas obtenidas en cuanto a este alelo de resistencia. Esto se podría emplear para acelerar la incorporación de un suceso de transformación GA21 , FU 17 u otro suceso de transformación que provea polen con resistencia a un herbicida particular, con antecedentes genéticos particulares. La eliminación efectiva de granos de polen que no poseen las características de resistencia a herbicida permitirá eliminar los alelos no resistentes del cruzamiento. El resultado neto es que es que se puede hacer que una planta hemicigota para un alelo en particular actúe como un homocigota en cruzamiento con respecto a la característica de resistencia. Esto puede acelerar la incorporación de la característica en una línea genética particular y también puede reducir el tiempo que se necesita en la cría o mejoramiento de plantas, eliminando la necesidad de producir alelos homocigotas para la resistencia a herbicidas en la producción de híbridos. Además, por medio de la aplicación de glifosato a las plantas provenientes de las semillas producidas también se puede determinar la proporción relativa, y por consiguiente la pureza genética, de semillas que heredaron por lo menos un primer suceso de transformación de resistencia a herbicida. A fin de utilizar glifosato para obtener selectivamente polen que no posee el suceso de transformación de resistencia a herbicida deseado y que no tienen la capacidad de fertilizar estructuras reproductoras femeninas, se podrá utilizar un protocolo similar al empleado para la producción de híbridos auxiliada por esterilidad masculina inducible. Más específicamente, se puede aplicar de 8 a 96 onzas de glifosato, en la superficie, a plantas que posen por lo menos una copia del alelo de resistencia. La sincronización de los tratamientos será previa a la liberación de polen, entre las etapas V5 y VT del desarrollo. Una vez producidas las semillas resistentes a herbicidas, se mide la pureza de las mismas tratando una cantidad de plantas seleccionadas provenientes de dichas semillas con el herbicida. A través de las determinaciones de la cantidad de plantas que son sensibles o resistentes al herbicida, es posible determinar la pureza de las semillas. Potencialmente, se puede emplear cualquier herbicida y el alelo de resistencia a herbicidas correspondiente con este fin. Los ejemplos específicos incluyen un gen EPSPS mutante, el gen de la fosfinotricin acetil transferasa que confiere resistencia a glufosinato, un gen mutante de la acetolactato sintetasa (ACS) que confiere resistencia a los herbicidas imidazolinona o sulfonilurea, el gen neo que codifica resistencia a kanamicna y G418, el gen de la nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo y el DHFR que confiere resistencia al metotrexato. (iii) Campo de aplicación de la esterilidad masculina inducida por herbicidas Los inventores contemplan específicamente que la esterilidad masculina inducible de la ¡nvención actual puede ser de utilidad con especies distintas de maíz y con alelos de resistencia a herbicias distintos de EPSPS.

En particular, se cree que la naturaleza inductora de esterilidad masculina del glifosato en plantas que poseen los sucesos de transformación GG25 y GJ1 1 con relación a la falta de esterilidad masculina en las plantas GA21 y FU 17 es el resultado de la función del promotor para la expresión de la proteína de resistencia, en este caso una EPSPS mutante. Se cree que el promotor de actina del arroz en las FU 17 y GA21 dirige con mayor eficiencia la expresión del gen EPSPS mutante en el polen que el promotor de histona de maíz y el promotor de histona de Arabidopsis-CaMV 35S de las GG25 y GJ1 1 , respectivamente. El resultado es que el polen de las FU 17 y GA21 exhiben una tolerancia al glifosato substancialmente mayor con relación al polen de las plantas GG25 y GJ11 , o de las plantas que no poseen el alelo EPSPS mutante. Se puede entonces, mediante la selección de un promotor que se expresa pobremente en polen, manipular intencionalmente por ingeniería genética las plantas resistentes a herbicidas en los cuales se puede inducir esterilidad masculina por medio de aplicaciones de herbicidas. Se puede además, utilizando el mismo gen de resistencia pero que está ligado operativamente a un promotor constitutivo que se expresa con mayor eficiencia en polen, obtener también especies vegetales con resistencia al mismo herbicida pero que no son afectadas por la esterilidad masculina inducible. Las especies distintas del maíz para las cuales ésta técnica es considerada particularmente adecuada incluyen sorgo, cebada, avena, trigo, arroz y soya. Los alelos de resistencia a herbicidas distintos del gen EPSPS que es considerado especialmente útil para este fin incluyen el gen de la fosfinotricin acetil transferasa que confiere resistencia a glufosinato, un gen mutante de la acetolactato sintetasa (ACS) que confiere resistencia a los herbididas ¡midazolinona o sulfonilurea, el gen neo que codifica la resistencia a kanamicina y G418, el gen de la nitrilasa que confiere resistencia al bromoxinilo y el gen DHFR que confiere resistencia al metorexato.

XI. Definiciones Tolerancia reproductora femenina a herbicidas: una planta que exhibe esta característica permanecerá fértil para en su porción femenina luego del tratamiento de dicha planta con una aplicación de un herbicida capaz de producir esterilidad femenina en aquellas plantas que no presentan dicha característica. Polen no viable: polen que no es capaz de fertilizar una planta para producir semillas. Tolerancia reproductora masculina a herbicidas: es una característica por la cual es posible tratar una planta con una aplicación de herbicida y permanecer fértil para su porción masculina, siendo el herbicida capaz de causar esterilidad masculina en las plantas que no presentan dicha característica de tolerancia. Esterilidad masculina: una planta con esterilidad masculina es aquella que no es capaz de autofertilización o de fertilización de otras plantas con el fin de producir semillas. Tolerancia vegetativa a herbicidas: una planta que exhibe esta característica puede ser tratada y eliminada con una tasa de aplicación de un herbicida que por el contrario tiene la capacidad de eliminar una planta correspondiente que no presenta tolerancia vegetativa al herbicida.

XII. Información de los depósitos 5 Se efectuó un depósito de semillas que contiene los sucesos de transformación GJ11 , FU 17, GG25 y GA21 con la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., 20852. La fecha del depósito fue el 14 de mayo, 1997. Los números de acceso ATCC de las semillas de plantas de maíz que contienen los sucesos de transformación * 10 GJ1 1 , FI1 17, GG25 y GA21 son: ATCC 209030, ATCC 209031 , ATCC 209032 * t ATCC 209033, respectivamente. Se han retirado todas las restricciones del depósito y dicho depósito cumple con todos los requerimientos de 37 C.F.R. S 1.801-1.809. El depósito permanecerá vigente por un período de años, o 5 años después de la última solicitud, o por el tiempo de vigencia de la patente, cualquiera de ellas que sea mayor y será substituido según necesidad durante ese período.

XII. Ejemplos EJEMPLO 1 Iniciación y mantenimiento de la línea de células ATX24 En este ejemplo se describe la iniciación y el mantenimiento de la línea de células AT824, que se ha utilizado comúnmente en los experimentos de transformación. Se recortaron embriones inmaduros (0.5 -1.0 mm) de la línea endogámica AT derivada de la B73 y se cultivó sobre medio N6 con nitrato de plata 100 µM, dicamba 3.3 mg/l, sacarosa 3% y prolina 12 mM (2004). Seis meses después de la iniciación se transfirieron callos tipo I a medio 2008. Dos meses más adelante se transfirieron callos tipo I a un medio con una concentración inferior de sacarosa (279). Se identificó un sector de callo tipo II 17 meses más tarde y se transfirió a medio 279. Esta línea de células es de naturaleza uniforme, desorganizada, de crecimiento rápido y embriogénico. Este cultivo era deseable en el contexto de esta ¡nvención ya que es de fácil adaptación para cultivos en medios líquidos o sólidos. Los primeros cultivos en suspensión de la AT824 fueron iniciados 31 meses después de la iniciación del cultivo. Los cultivos en suspensión pueden ser iniciador en diversos medios de cultivo, incluyendo medios que contienen 2, 4-D así como dicamba como fuente de auxinas, por ejemplo los medios denominados 210, 401 , 409, 279. Los cultivos se mantienen por transferencia de aproximadamente 2 ml de volumen celular empaquetado a 20 mi de medio de cultivo fresco con intervalos de 32 días. La línea AT824 puede transferirse rutinariamente entre medios de cultivo líquido y sólido sin que esto afecte el crecimiento o la mofología. Los cultivos en suspensión de la AT824 se crioconservaron inicialmente 33-37 meses después de la iniciación del cultivo. La tasa de sobrevida de este cultivo mejoró cuando era crioconservado después de tres meses en cultivo en suspensión. Los cultivos AT824 en suspensión fueron crioconservados y reiniciados a partir de dicha crioconservación a intervalos regulares desde la fecha inicial del congelamiento. Los ciclos repetidos de congelamiento no afectaron el crecimiento o la capacidad de transformación de este cultivo.

EJEMPLO 2 Generación de la línea GA21 resistente a qlifosato por bombardeo con microproyectiles de células AT824 Se introdujo el gen EPSPS de maíz mutante en un cultivo en suspensión de células AT824 por medio del bombardeo con microproyectiles, esencialmente como se describe en la Patente de EE.UU. no. 5.554.798 y en la Solicitud de Patente de los EE.UU. no. 08/1 13.561 , depositada ei 25 de agosto, 1993, cuyos contenidos se incorporan específicamente a la presente documentación a modo de referencia. En este ejemplo, el gen EPSPS de maíz mutante fue derivado del plásmido pDPG434 (figura 3). El plásmido pDPG434 contiene un gen EPSPS de maíz con dos cambios de aminoácido.

Thr por lie en la posición 102 y Pro por Ser en la posición 106. Para la transformación se utilizó un fragmento de restricción Not\ de 3.4 kb aproximadamente que contenía el cassette de expresión EPSPS de maíz mutante del pPDG434. El cassette de expresión EPSPS de maíz mutante contiene el promotor de actina de arroz y el extremo 3'-nos. El cultivo en suspensión AT824 (descrito en el ejemplo 1 ) se subcultivó en medio 409 fresco 3 días antes del bombardeo de partículas. Las células se plaquearon sobre medio 279 sólido 0-8 horas antes del bombardeo (0.5 ml aproximadamente de volumen celular empaquetado por filtro). El ADN fue precipitado sobre partículas de oro de la siguiente manera. Se preparó una solución madre de partículas de oro añadiendo 60 mg de partículas de oro de 0.7 µm o 1 µm a 1000 µm de etanol absoluto y se incubó durante por lo menos 3 horas a temperatura ambiente seguido de almacenamiento a -20°C. Se centrifugaron veinte a treinta y cinco µl de partículas de oro en una microcentrífuga durante 1 min. Se retiró el sobrenadante y se añadió un ml de agua estéril al tubo, seguido de centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos. Las partículas de microproyectiles se volvieron a suspender en 30 µl de una solución de ADN que contenía de 10-20 µg del cassette de expresión EFSPS mutante pDPG434 restringido con Notl. Se añadieron doscientos veinte microlitros de agua estéril, 250 µl de CaCI2 2.5 M y 50 µl de espermidina. Se mezcló todo cuidadosamente y se colocó sobre baño de hielo, seguido de vortexeo a 4Cdurante 10 minutos y centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y el pellet se volvió a suspender en 600 µl de etanol absoluto.

Después de la centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos el pellet se volvió a suspender en 36 µl de etanol absoluto y se dejó que asentara durante 4 minutos. Se dispersaron diez µl de la preparación de partículas sobre la superficie del disco volador y se dejó que el etanol se secara por completo.

Las partículas fueron aceleradas por una ráfaga de helio de 1100 psi aproximadamente utilizando un dispositivo de bombardeo de partículas DuPont Biolistics PDS1000He. Después del bombardeo con las partículas de oro recubiertas con el cassette de expresión pDPG434, se cultivaron células AT824 sobre medio 279 (Cuadro 2) durante cuatro días. A continuación las células fueron devueltas al medio 401 líquido (Cuadro 2), con una densidad de 2 ml aproximadamente de volumen de células empaquetadas (PCV) por cada 20 ml, y se cultivaron durante cuatro días. Las células fueron transferidas entonces, con una densidad de 2 ml de PCV/20 mi, a medio 401 fresco que contenía bialafos 1 mg/l (por accidente se utilizó bialafos en lugar de glifosato en esta etapa) y se cultivaron durante cuatro días. Se repitieron los subcultivos, esta vez en medio 401 más glifosato 1 mM, y después de cuatro días las células se plaquearon con una densidad de 0.1 ml aproximadamente de PCV por cada caja de petri de 100 X 20 mm que contenía medio 279 más glifosato 1 mM. Seis a ocho semanas después del bombardeo, se retiraron las colonias resistentes a glifosato de las placas de selección y se subcultivaron sobre medio 279 fresco más glifosato 1 mM. Se recuperaron treinta y cinco líneas de callos resistentes al glifosato en este ejemplo. Se regeneraron aproximadamente 96 plantas a partir de 18 de las líneas de callos transgénicas EJEMPLO 3 Transformación estable de células AT824 por electroporación Se trataron enzimáticamente células de maíz en cultivo en suspensión y fueron sometidos a electroporación utilizando las condiciones descriptas en Kryzak y otros. (Patente de los EE.UU. N°: 5,384,956). Tres días después del subcultivo, las células AT824 en cultivo en suspensión se filtraron a través de un mesh de acero inoxidable de 1000 µm y se lavaron 1.5 ml de células empaquetadas por cada 10 ml, en buffer de incubación (manitol 0.2 M, albúmina de suero bovino 0.1 %, cloruro de calcio 80 mM y ácido 2-(N-morfolin)-etan sulfónico 20 mM, pH 5.6). Las células fueron tratadas después durante 90 minutos en buffer de incubación que contenía pectoliasa 0.5% e Y-23 (Seishin Pharmaceutical, Tokio, Japón) con una densidad de 1.5 ml de células empaquetadas por cada 5 ml de solución de enzima. Durante el tratamiento con enzima, las células fueron incubadas en oscuridad a 25°C aproximadamente en un agitador rotatorio a 60 rpm. Después del tratamiento con pectoliasa, las células se lavaron una vez con 10 ml de buffer de incubación seguido de tres lavados con buffer de electroporación (HEPES 10 mM, manitol 0.4 mM) las células se volvieron a suspender en buffer de electroporación con una densidad de 1.5 ml de células empaquetadas en un volumen total de 3 mi. Se añadió ADN plásmido alineado, aproximadamente 60 µg del cassette de expresión EPSPS recortado con Notl del pDPG427 (GG25) o del pDPG443 (GJ1 1 ); o 100µl de ADN plásmido completo del pDPG165 y pDPG434 (FD17) (50 µg de cada plásmido), a alícuotas de 0.5 ml de buffer de electroporación. El ADN/buffer de electroporación fue incubado a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A estas alícuotas se les añadieron 0.5 ml de células en cultivo en suspensión/buffer de electroporación (que contenía aproximadamente 0.25 ml de células empaquetadas). Las células y el ADN en el buffer de electroporación fueron incubados a temperatura ambiente durante 10 minutos aproximadamente. La mitad de las alícuotas de esta mezcla fue transferida a la cámara de electroporación (Puite, 1985) que se colocó en una caja de petri estéril de 60 X 15 mm. Las células fueron sometidas a electroporación con pulsos de 70, 100 o 140 voltios descargados de un capacitor de 140 microfarad (µf). Aproximadamente 10 minutos después de la electroporación, las células se diluyeron con 2.5 ml de medio 409 que contenía manitol 0.3 M. Las células se separaron entonces de la mayor parte del medio líquido aspirado la suspensión en una pipeta y expulsado el medio con la punta de la pipeta colocada contra la caja de petri para retener las células. Las células, y unas pequeña cantidad de medio (0.2 ml aproximadamente) fueron distribuidas sobre un filtro (Whatmann #1 ,4.25 cm) que cubría medio 279 sólido (Cuadro 2) que contenía manitol 0.3 M. Una vez transcurridos cinco días aproximadamente, el tejido y los filtros transferidos a medio 279 que contenía manitol 0.2 M. Después de seis días, el tejido y los filtros fueron transferidos a medio 279 sin manitol.

EJEMPLO 4 Regeneración de transformantes AT824 Se produjeron transformantes como se describió en el ejemplo 2 y en el ejemplo 3. Para la regeneración, se mantuvo el tejido sobre medio de mantenimiento (279) que contenía glifosato 1 mM o bialafos 1 mg/I. A continuación los transformantes se subcultivaron una a tres veces, pero habitualmente dos veces sobre medio 189 (un primer pasaje en la oscuridad y un segundo pasaje con poca luz) y una o dos veces sobre medio 101 en cajas de petri antes de ser transferidos a medio 501 o 607 en Plant Cons. Las variaciones en el protocolo de regeneración habitualmente se basan en el progreso de la regeneración de plantas. Entonces Algunos de los transformantes fueron subcultivados rutinariamente primero sobre medio de mantenimiento, seguido de dos veces sobre medio 189, uno o dos sobre medio 101 , seguido de transferencia a medio 501 o 607 en Plant Cons. A medida que se desarrollan los brotes sobre el medio 101 , se incrementaba la intensidad de la luz ajustando lentamente la distancia de las placas de la fuente de luz localizada por encima del área. Todos los intervalos de subcultivo eran de 2 semanas aproximadamente a 24°C. Las plantas transformadas que desarrollan brotes con raíces fueron transferidas a tierra. Se incubaron plántulas en tierra en una cámara de crecimiento iluminada y las condiciones se ajustaron lentamente para adaptar o acondicionar las plántulas a las condiciones más secas y más iluminadas del invernadero. Después del acondicionamiento de adaptación en la cámara de crecimiento, las plantas se transfirieron individualmente a macetas de 5 galones de tierra en el invernadero.

EJEMPLO 5 Regeneración de la línea FU 17 resistente a glifosato utilizando selección con bialafos Las células de la línea AT824 fueron sometidas a electroporación con los plásmidos pDPG165 y pDPG434 65 descritos en el ejemplo 3. En este caso, la cotransformación con el plásmido pDPG165 que contenía el gen bar permitió una selección con bialafos. Después de la recuperación y después que el tejido hubiera crecido durante cuatro días aproximadamente sobre medio 279, se transfirió el tejido de cada filtro a un frasco que contenía 20 mi aproximadamente de medio 401 líquido que contenía bialafos 1 mg/L Cuatro días más tarde, se transfirió el tejido de cada frasco a un frasco nuevo que contenía 20 ml aproximadamente de medio 401 fresco que contenía bialafos 1 mg/l. Tres días más tarde las células se plaquearon con una densidad de 0.1 ml aproximadamente de PCV por cada caja de petri de 100 x 20 mm que contenía medio 279 más bialafos 1 mg/l. Se seleccionaron aproximadamente 34 líneas de callos resistentes a bialafos en este ejemplo, con una frecuencia de 17 líneas de callos por electroporación. Se regeneraron aproximadamente 48 plantas a partir de 18 líneas de callos. A continuación se llevó a cabo el rastreo de plantas con resistencia a glifosato como se describe en el ejemplo 6.

EJEMPLO 6 Rastreo de plantas transgénicas con resistencia a glifosato Se cruzaron plantas regeneradas a partir de las líneas de callos GA21 , GG25, GJ1 1 y FU 17 (generación R0), cada una de las cuales contenía el gen EPSPS mutante, con las plantas endogámicas no transgénicas en invernadero. Se esperaba que la progenie de estos cruzamientos segregara 1 :1 para la característica de resistencia a herbicidas. La resistencia a glifosato fue evaluada en la progenie de cruzamientos R0 (generación R1 ) en invernadero mediante aplicación de glifosato de marca Roundup™ (Monsanto) con una relación de 16 oz./acre. Se seleccionaron las líneas transgénicas que inhibían resistencia a glifosato y nuevamente fueron cruzadas con una línea endogámica no transgénica. Se rastreó entonces la progenie resultante por resistencia a glifosato en las pruebas a campo. A partir de estas pruebas, se seleccionaron los sucesos de transformación GA21 , FU 17, GG25 y GJ11 para un estudio posterior basado en el fenotipo de resistencia a glifosato.

EJEMPLO 7 Aislamiento de ADN genómico de maíz Las líneas de maíz resistentes a glifosato GA21 , FU 17, GG25 y GJ1 1 fueron cruzadas con varias líneas endogámicas para facilitar el desarrollo de híbridos como se describe en el ejemplo 14. El ADN genómico utilizado para los análisis de transferencia Southern fue aislado de las plantas que segregaban 1 :1 la inserción GA21 , FU 17, GG25 o GJ1 1. Se identificaron segregante GA21 positivos y negativos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores de oligonucleótidos específicos para el fragmento del pDPG434 utilizado para la transformación. Los segregantes negativos servían como plantas de control no transgénicas. Los cebadores para PCR utilizados para el análisis abarcaron la unión nos-EPSPS mutante y generaron un fragmento de 192 pb. La secuencia del cebador superior ubicado en el gen EPSPS mutante es 5'-ACGTACGACGACCACAGGATG-3'. La secuencia del cebador inferior localizado en ei nos es 5'-GCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'. Se aisló ADN genómico de plantas positivas y negativas como se describe en la publicación de Dellaporta y otros, (1983). Se aisló ADN de plantas que crecieron en invernadero y a campo.

EJEMPLO 8 Preparación e hidridización de la sonda de ADN Los fragmentos de ADN utilizados para la preparación de la sonda fueron aislado por purificación sobre gel de digestiones de restricción de ADN plásmido o fueron generados por PCR. El fragmento de PCR EPSPS mutante utilizado como sonda fue generado utilizando cebadores que producen un fragmento de 324 pb interno del gen EPSPS. Este fragmento comienza aproximadamente 400 pb hacia el extremo 3' con respecto al codón de inicio. Las secuencias de cebador utilizadas para generar este fragmento son: 5'-TTTGGCTCTTGGGGATGTG-3' (superior) y 5'- TTACGCTAGTCTCGGTCCAT-3' (inferior). Las sondas se marcaron con 32P utilizando un método de cebado aleatorio (Boehringer Mannheim) y se purificaron utilizando columnas spin Quik-Sep® (Isolab Inc., Akron, OH). Los transferidos fueron prehibridizados a 65°C durante 1-2 horas e hibridizadas con la sonda desnaturalizada durante 18 horas aproximadamente a 65°C. La solución de prehibridización y de hibridización consistía de SCP 5X, solución de Denhardt 2X, Tris 0.05 M, pH 8.0.SDS 0.2%, EDTA 10 mM, sulfato de dextrina 100 mg/l y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 125 µg/ml. Después de la hibridización, los transferidos se lavaron 4 veces durante 10 min en 0.25X SCP/SDS 0.2%. Las membranas se transfirieron secas y se visualizaron por autoradiografía. Para volver a analizar con sonda a los transferidos, las sondas se limpiaron, tratando los transferidos en 0.05 M NaOH/SDS 0.2% durante 10 min seguido de neutralización en Tris 0.2 M, pH 7.5; 10.2% SDS/SCP 0.1X durante 20 minutos a 25°C aproximadamente. Se utilizaron 10 µg aproximadamente de ADN genómico para cada digestión de restricción. El ADN fue digerido con las enzimas de restricción de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). El ADN fue separado sobre geles TAE (Tris-acetato 0.04 M, EDTA 0.001 M) que contenía agarosa 0.8%. La transferencia Southern (Southern, 1975) se llevó a cabo utilizando una membrana Magnacharge TM (Micron Separations Inc., Westborough, MA) y el ADN fue entrecruzado con la membrana utilizando luz UV y las membranas se cocieron durante 2 hrs en un horno de vacío a 80°C.

EJEMPLO 9 Cantidad de copias e integridad del transgen EPSPS mutante en GA21 Se analizó la línea GA21 de maíz para determinar la cantidad de inserciones del fragmento EPSPDS Noti pDPG434 utilizado para la transformación. El ADN genómico GA21 fue digerido con una enzima de restricción que no efectúa cortes dentro del fragmento Noti EPSPS utilizado para la transformación y analizado con sonda con todo el fragmento Noti EPSPS. Para este análisis, se dirigió ADN GA21 y ADN control no transformado con EcoRV y se analizaron con sonda utilizando el fragmento Noti EPSPS del pDPG434. El pDPG434 digerido con Noti se incluyó como control positivo a nivel de una copia aproximadamente por genoma. Para la GA21 , se hibridizó una sola banda de aproximadamente 15 kb con la sonda, lo cual era indicativo que había una sola inserción del fragmento de ADN plásmido utilizado para la transformación (FIG. 5A). Se observó alguna hibridización adicional en la GA21 y en el ADN control no transformado; este resultado no era esperado dado que la sonda utilizada contenía la secuencia del péptido de tránsito (que incluye ADN de maíz) y el gen EPSPS mutante de maíz. Se esperaba que ambas secuencias se hibridicen con el ADN de maíz no transformado debido a la presencia de secuencias endógenas con homología con la secuencia de la sonda. Para aclarar aun más la presencia de una sola inserción del fragmento plásmido pDPG434 en GA21 , se eliminó la sonda del transferido que se muestra en la FIG. 5A y se volvió a hibridizar el transferido utilizando un pequeño fragmento de ADN interno del gen EPSPS mutante. La sonda EPSPS de 324 pb se hibridizaba fuertemente con la misma banda de 15 kb aproximadamente en GA21 , lo cual indica la presencia de una sola inserción del fragmento EPSPS Noti utilizando para la transformación (FIG. 5B). Utilizando la sonda EPSPS de 324 pb, se observó la hibridización de dos bandas de menor peso molecular en el ADN GA21 y control no transformado, lo cual indica la presencia de copias endógenas del gen EPSPS nativo. A fin de determinar si el gen EPSPS mutante en la línea de maíz GA21 resistente a glifosato estaba intacto para estimar la cantidad de copias, se dirigió ADN genómico proveniente de un transformante GA21 , ADN control no transformado y pDPG434 con EcoRl/Xbal y se analizó con sonda utilizando la sonda EPSPS de 324 pb. La digestión con esta enzima de restricción libera un fragmento de 1.8 kb aproximadamente del pDPG434 que contiene la secuencia OTP y el gen mutante (FIG.3). El pDPG434 digerido con EcoRl/Xbal se corrió sobre gel hasta aproximar una copia de la secuencia EcoRl/Xbal OTP-EPSPS por genoma. Se encontró que la sonda EPSPS mutante de 324 pb se hibridizaba con un fragmento de 1.8 kb aproximadamente en las digestiones GA21 y pDPG434, pero no en las digestiones del ADN control no transformado (FIG. 6). Este resultado demuestra que el fragmento OTP-EPSPS de 1.8 kb presente en el pDPG4344 está intacto en línea de maíz GA21 resistente a glifosato. La comparación entre la intensidad de hibridización de la digestión pDPG434 con la digestión del ADN GA21 indica la presencia de dos copias aproximadamente de la secuencia de la secuencia OTP-EPSPS en GA21 (FIG. 6).

EJEMPLO 10 Falta de secuencias estructurales del plásmido en GA21 A fin de confirmar la falta de secuencias estructurales del plásmido que contienen el origen de replicación ColEI y el gen bla que codifica la b-lactamasa, se dirigió ADN proveniente de una línea de maíz transgénico que contenía una sola copia de bla, ADN proveniente de una planta GA21 y ADN plásmido con BglW y se analizó con sonda utilizando un fragmento SsplAfílll de 1.7 kb del pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) que contenía ColEI y bla. El plásmido utilizado, pDPG427, es idéntico al pDPG434 pero contiene un promotor de histona de maíz en lugar que el promotor de actina de arroz. Tal como se esperaba, se observó hibridización con el ADN GA21. En cambio, como también se esperaba, no se observó hibridización con el ADN GA21. En cambio, como también se esperaba, se observó hibridización con una banda de 5 kb aproximadamente en el ADN proveniente de la planta bla positiva y del pDPG427 (FIG.7).

EJEMPLO 11 Construcción de los plásmidos pDPG165, pDPG434 y pDPG443 Se construyeron segmentos de ADN que codifican el gen bar en el plásmido pDPG165 (FIG.1 ) esencialmente como se describe en la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 08/113.561 , depositada el 25 de agosto, 1993, cuyo contenido se incorpora específicamente en la presente documentación a modo de referencia. El gen bar se clonó de Streptomyces hygroscopicus (White y otros., 1990) y existe como un fragmento Smal de 559 pb en el plásmido plJ4101. La secuencia de la región de codificación de este gen es idéntica al de la publicada (Thompson y otros, 1987). A fin de crear el plásmido pDPG165, el fragmento Smal del plJ4104 se ligó en un vector basado en el pUC19 que contenía el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (CaMV) (derivado del pB1221 .1. provisto por R.Jefferson, Planta Breeding Institute, Cambridge, Reino Unido), un poliligador y el extremo 3' del transcripto 7 (Tr7) de Agrobacterium tumefaciens (el extremo 3' provisto por D.Stalker, Calgene, Inc., Davis, CA). Los plásmidos pDPG434 (FIG. 3) y pDPG443 (FIG. 4) se construyeron clonando los promotores respectivos en el pDPG425 alineado con Smal (FIG. 14). Los vectores alineados se trataron con fosfatasa alcalina de ternero para impedir la recircularización antes de la ligación. El promotor e intrón de actina de arroz fueron aislados como un fragmento Hind\\\ de 1.5 kb del pDPG421 (pDM302; Cao y otros., Plant Cell Rep (1992) 1 1 :586-591 ). El promotor de histona de Arabidopsis/35S 2X se aisló como un fragmento EcoRl/HindW del pDPG405 (FIG. 15). Los fragmentos de promotores mencionados fueron tratados con la ADN polimerasa T4 con el fin de crear extremos pegajosos antes de la ligación en el pDPG425 alineado con Smal (Rhone Poulenc Agrochimie). El cuarto plásmido utilizado, pDPG427 ( FIG. 2), se obtuvo de Rhone Poulenc Agrochimie. En el cuadro 4 se muestra una lista de los plásmidos utilizados en la invención actual, así como los componentes de los plásmidos. En el cuadro 5 se muestra una lista de los componentes del pDPG434.

EJEMPLO 12 Efecto de la aplicación de glifosato sobre el crecimiento y la fertilidad de los híbridos DK580 v DK626 de FU 17, GA21 , GG25 y GJ11 Se produjeron híbridos BC4 de las líneas DK580 y DK626 que contenían los sucesos de transformación FU 17, GA21 , GG25 o GJ1 1 como se describe en el ejemplo 14. Las comparaciones del efecto de la aplicación de glifosato sobre el crecimiento (altura promedio de la hoja extendida) y la fertilidad masculinas se efectuaron en las etapas V4 y V8 del desarrollo. La escala de desarrollo que se utilizó para calificar las plantas de maíz es bien conocida en el arte y está descrita en el informe Especial N° 48, Universidad de Ciencia y Tecnología del Estado de lowa, Cooperative Extensión Service, Ames, IA. Cada uno de los híbridos fueron estudiados en las dos etapas V4 y V8 utilizando glifosato OX (es decir, agua sola), glifosato 1X o glifosato 4X (el nivel 1X corresponde a 16 onzas/acre de ROUNDUP ULTRA™). Las pruebas se diseñaron de cuatro filas, 3 rep., fracción-fracción-lote con lotes principales como híbridos, sublotes como fuentes de transformantes (es decir, GA21 , GG25, FU 17 y GJ1 1 ) y sublotes como combinación de la tasa de sincronización (FIG. 12). Los métodos estadísticos para el diseño y análisis de los datos derivaron de lotes experimentales a campo como se describe en Gómez y Gómez, (1984). Las pruebas se llevaron a cabo en Dekalb, Illinois y Thomasboro, Illinois durante 1996. Todas las filas se sembraron con una intensidad de siembra normal doble, es decir, 60 semillas por fila, porque los híbridos segregaban 1 :1 la característica de resistencia a glifosato. Las plantas rociadas fueron entresacadas hasta 30 plantas por fila no antes de los 7 días después de la aplicación del Roundup en un momento donde era posible identificar las plantas susceptibles a Roundup. Los lotes no rociados fueron entresacadas hasta 30 plantas por fila en el mismo momento. A los 5-10 días después de la aplicación del herbicida, se recogieron los siguientes datos en cada fila; cantidad de plantas muertas, cantidad de plantas dañadas y cantidad de plantas normales. Después del entresacado, se midió la altura promedio de la hoja extendida en 10 plantas resistentes por lote. Durante el resto de la estación de crecimiento se recogieron los siguientes datos agronómicos: cuenta de cosecha temprana en pie, altura de la planta, altura de la mazorca, integridad, soporte verde, cantidad de plantas estériles, cantidad de plantas de esterilidad masculina, cantidad de mazorcas caídas, cantidad de plantas con vuelco de raíces, cantidad de plantas con vuelco de tallos, peso de granos pelados, porcentaje de humedad de los granos en el momento de la cosecha y peso de prueba. Los resultados demuestran que los cuatro sucesos de transformación dieron una resistencia significativa a glifosato en los dos niveles de aplicación 1X y 4X (FIGS. 7A, 7B). Con todo, el suceso de transformación GA21 dio la resistencia más eficaz, por cuanto en el nivel de aplicación 4X, 3 de los 4 tratamientos GA21 (FIGS. 7A, 7B) presentaban los mayores valores de altura promedio de hoja extendida. Además, los 4 tratamientos GA21 dieron plantas con esterilidad masculina. En la etapa V8 de la aplicación, solamente los tratamientos GJ1 1 y GJ25 dio plantas con esterilidad masculina (FIG. 8B), en tanto en la etapa V4 de la aplicación todas las plantas presentaban fertilidad masculina (FIG. 8A) EJEMPLO 13 Efecto en el rendimiento de la aplicación de glifosato sobre los híbridos DK580 y DK626 con los sucesos de transformación FU 17, GA21 , GG25 y GJ11 Se probaron a campo cuatro híbridos DK580 y cuatro DK626, cada una de las cuales contenía diferentes transgenes EPSPS mutantes de uno de los sucesos de transformación GA21 , FU 17, GJ1 1 o GG25, por los posibles efecto sobre el rendimiento con la aplicación de glifosato como se describió en el ejemplo 12, con tratamientos como se describen en la FIG.12. Los híbridos se produjeron como se describe en el ejemplo 14. Las estimaciones de rendimiento se calcularon utilizando los pesos de granos pelados, ajustados a un 15.5% de humedad. El análisis de los datos se efectuó utilizando los procedimientos SAS PROC MIXED y PROC SUM. Solamente se compararon con híbridos a los cuales no se les aplicó glifosato con el fin de eliminar cualquier efecto de la tasa de aplicación del herbicida y/o competencia con malezas sobre el rendimiento de los granos. La discusión en la presente documentación se concentra en los resultados relacionados con el rendimiento de granos.

En la FIG. 9A se muestra que cuando se aplica glifosato en la etapa V4, no se observa una disminución significativa en el rendimiento en 3 de los 4 híbridos DK580. Además, en el caso del suceso de transformación GA21 , el grupo de tratamiento presentaba un rendimiento más alto, si bien la diferencia no esta estadísticamente significativa. Las diferencias en el rendimiento entre híbridos DK580 con el suceso de transformación EPSPS mutante con relación a híbridos sin dicho suceso solamente era significativo para el suceso FU 17. En este caso, los híbridos resistentes a glifosato presentan un rendimiento mayor que el correspondiente híbrido no resistente. Los resultados demuestran que se puede aplicar glifosato a tres de los cuatro híbridos DK580 en la etapa V4 del desarrollo sin una disminución correspondiente en el rendimiento. En la fig. 9B se muestran las comparaciones del efecto de la aplicación de glifosato sobre el rendimiento de cada uno de los híbridos DK626 en la etapa V8 del desarrollo. Los resultados demuestran que aun en la etapa V8, no se observa una pérdida significativa en el rendimiento con una tasa de aplicación de glifosato de 4X en cualquiera de los híbridos DK626 que incorporaron GA21 o FU 17. Además, el híbrido GA21 nuevamente presentó una ganancia en el rendimiento con relación a los controles no tratados con el mismo antecedente genético.

EJEMPLO 14 Incorporación de GA21 , FU 17, GG25 y GJ11 en endogámicos de élite e híbridos de maíz Se puede emplear la retrocruza para mejorar una planta endogámica. La retrocruza transfiere características deseables específicas de una fuente endogámica a otra que no posee esta característica. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un primer cruzamiento de un endogámico superior (A) (progenitor recurrente) con un endogámico donante (progenitor no recurrente), que lleva el o los genes apropiados gen(s) para la característica en cuestión. De la progenie resultante de este cruzamiento se selecciona primero la progenie con la característica que se desea transferir de la planta no recurrente, luego se vuelve a cruzar la progenie con el progenitor recurrente superior (A). Después de cinco o más generaciones de retrocruza con selección para la característica deseada, la progenie es hemicogota para los loci que controlan la característica que está siendo transferida, en este caso un transgen EPSPS mutante, pero es como el progenitor superior para la mayoría o casi todos los demás genes. La última generación de retrocruza que va a autocruzar para dar una progenie de línea pura para el o los genes que están siendo transferidos, es decir, un suceso de transformación GA21 , GG25, GJ11 y/o FU 17. Por ello, a través de una serie de manipulaciones de mejoramiento se puede mover el gen seleccionado que codifica una EPSPS mutante de una línea de maíz a una línea de maíz completamente diferente sin la necesidad de ninguna manipulación recombinante adicional. Los transgenes introducidos son valiosos por cuanto se comportan genéticamente como cualquier otro gen de maíz y se puede manipular mediante técnicas de mejoramiento de manera idéntica a cualquier otro gen de maíz. Los ejemplos de procedimiento de esta naturaleza fueron llevados a cabo con éxito por los inventores. En estos estudios de retrocruzamiento, cada uno de los transformantes GA21 , FU 17, GG25 y GJ1 1 fue incorporado en las líneas endogámicas de élite FBLL (Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 08/181.708, depositada el 14 de enero, 1994) y NL054B (Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 081595.549, depositada el 6 de febrero, 1996) por retrocruza, si bien la conversión en muchos endogámicos más está actualmente en progreso. Utilizado estos endogámicos como progenitores femenino, se produjeron dos de tales ejemplos de híbridos, DK626 y DK580. Se probó a campo el rendimiento y otras características agronómicas de estos híbridos, así como la tolerancia a herbicidas. Los endogámicos de élite FBLL y NL054B se retrocruzaron cada uno cuatro veces con los transformantes GA21 , FU 17, GJ1 1 y GG25. En cada generación de retrocruza se identificaron plantas que contenían el gen EPSPS mutante basado en la resistencia a la aplicación 1X de glifosato. Después de cuatro generaciones de retrocruza con un progenitor endogámico de élite recurrente, se anticipa que la línea transformada contará con un antecedente genético que es por lo menos un 93% idéntico al progenitor recurrente (FBLL o NL054B). Después de la conversión por retrocruza, las plantas se autopolinizaron dos veces con el fin de identificar plantas homocigotas para el gen incorporado de interés, es decir, los sucesos de inserción GA21 , FU 17, GJ11 y GG25. Se produjeron híbridos por cruzamiento de los progenitores endogámicos FBLL y NL054B, que contenían uno de los sucesos de inserción GA21 , FU 17, GJ1 1 o GG25, con un progenitor masculino endogámico no transformado. Se produjeron híbridos DK580 pro cruzamiento RO de la FBLL con MBZA (Solicitud de Patente de los EE.UU. No 08/182.616, depositada el 14 de enero, 1994) e híbridos DK626 por cruzamiento de la NL054B por MM402A (Solicitud de Patente de los EE.UU. No: 08/181.019, depositada el 13 de enero, 1994), con lo cual se obtuvieron híbridos que eran hemicigotas para el respectivo suceso de transformación.

EJEMPLO 15 Cría o mejoramiento asistido por marcadores La identificación de líneas de maíz criadas por su mayor resistencia a glifosato puede ser asistida fácilmente utilizando un suceso de integración del gen EPSPS mutante de los sucesos de transformación GA21 , GG25, FU 17 o GJ1 1. Las técnicas para aislar ácidos nucleicos y proteínas son bien conocidas por los expertos en el arte (Sambrook et al., 1989) y puede ser empleadas junto con los sucesos de integración de la presente invención para segregar selectivamente plantas que presentan una mayor resistencia al glifosato. Se contempla que los sucesos de integración del gen EPSPS mutante serán de utilidad como sondas de ADN para un mejoramiento asistido por marcadores. En el proceso de mejoramiento asistido por marcadores se utilizan secuencias de ADN para efectuar un seguimiento de las características agronómicas deseables (Tanksley et al, 1989) en el proceso de fitomejoramiento. Por ello, los ensayos que indican la presencia de uno de los sucesos de integración EPSPS mutante de la invención actual se pueden emplear en la identificación de plantas con una mayor resistencia a glifosato. El mejoramiento asistido con marcadores utilizando un suceso de integración del gen EPSPS mutante se lleva a cabo de la siguiente manera. Se siembran semillas de plantas con el rendimiento deseado en tierra en invernadero o en el campo. El tejido de las hojas se cosecha de la planta para la preparación de ADN en cualquier momento del crecimiento en que se puede retirar aproximadamente un gramo de tejido de hojas de la planta sin comprometer la viabilidad de la misma. Se aisla el ADN genómico utilizando un procedimiento modificado de Shure et al. (1983). Se liofiliza aproximadamente un gramo de tejido de hoja de una plántula durante toda la noche en tubos de polipropileno de 15 ml. El tejido secado por congelamiento se muele hasta obtener un polvo en el tubo utilizando una varilla de vidrio. El tejido pulverizado se mezcla cuidadosamente con 3 mi de buffer de extracción (urea 7.0, NaCI 0.35 M, Tris-HCl 0.05 M pH 8.0, EDTA 0.01 M, sarcosina 1 %).

El homogenato del tejido en el buffer se extrae con 3 ml de fenol/cloroformo.

La fase acuosa se separa por centrifugación y se precipita dos veces utilizando 1/10 volumen de acetato de amonio 4.4 M pH 5.2 y un volumen igual de ¡sopropanol. El precipitado se lava con etanol 75% y se vuelve a suspender en 100-500 µl TE (Tris-HCl 0.01 M, EDTA 0.001 M, pH 8.0). El ADN genómico se digiere con un exceso de 3-veces de enzimas de restricción, se somete a electroforesis a través de agarosa 0.8% (FMC) y se transfiere (Southerm, 1975) sobre Nytran (Scheicher y Schuell) utilizado SCP 10X (20 SCP: NaCI 2M, fosfato disódico 0.6 M, EDTA disódico 0.02 M). El experto en el arte reconocerá que muchas enzimas de restricción diferentes serán de utilidad y la elección de la enzima de restricción dependerá de la secuencia de ADN del suceso de integración del gen EPSPS mutante que se emplea como sonda y de las secuencia de ADN en el genoma de maíz que rodean al suceso de transformación del gen EPSPS mutante. Como sonda, se pueden emplear secuencias de ADN o ARN que se hibridizarán con el ADN del ADN plásmido del suceso e integración. Las combinaciones de suceso de transformación - plásmido utilizadas en la presente documentación son, por ejemplo, GA21-pDPG434, GG25-pDPG427, GJ1 1-pDPG443 y FI1 17-pDPG434 y pDPG165. Se seleccionará una enzima de restricción que produzca un fragmento de ADN después de la hibridización que sea identificable como ése suceso de integración del gen EPSPS mutante.

Se considera que se pueden emplear una o más enzimas de restricción para digerir el ADN genómico ya sea por separado o en combinaciones. Los filtros se prehibridizan en SCP 6X, sulfato de dextrano %, sarcosina 2% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 500 µg/ml y sonda marcada con 32P generada por un proceso de cebado aleatorio (Feinberg & Vogelstein, 1983). Los filtros hibridizados se lavan en SCP 2X, SDS 1% a 65°C durante 30 minutos y se visualizan por autoradiografía utilizando una película Kodak XAF.5. Los expertos en el arte reconocerán que existen muchas maneras diferentes de aislar ADN de los tejidos vegetales y que existen muchos protocolos diferentes para una hibridización Southern que permitirán obtener resultados idénticos. Los expertos en el arte reconocerán que se puede eliminar la sonda radioactiva en una transferencia Southern después de la autoradiografía y volver a analizar con sonda con una sonda de un suceso de integración diferente del gen EPSPS mutantes. De esta manera es posible identificar cada uno de los distintos sucesos de integración del gen EPSPS mutante presentes en la planta. Cada línea en la transferencia Southern representa un ADN aislado de una planta. El uso de una multiplicidad de sucesos de integración del gen EPSPS mutante como sondas con el mismo transferido de ADN genómico, permite determinar la composición de sucesos de integración de cada planta. Se han establecido correlaciones entre las contribuciones de un suceso de integración particular y una mayor resistencia a herbicidas de la planta. Solamente aquellas plantas que contienen la combinación deseada de sucesos de integración llegarán a la madurez y serán empleadas para polinización. Las sondas de ADN correspondientes los sucesos de integración del gen EPSPS mutante son marcadores útiles durante el transcurso del mejoramiento de una planta para identificar y combinar sucesos de integración particulares sin necesidad de cultivar las plantas y evaluarlas por su rendimiento agronómico.

EJEMPLO 16 Método de ensayo generales El análisis del ADN se llevó a acabo como sigue: Se aisló ADN genómico utilizando un procedimiento modificado de Shure et al., 1983. Se molió aproximadamente 1 g de tejido de callo hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido utilizando un mortero. El tejido pulverizado se mezcló cuidadosamente con 4 ml de buffer de extracción (urea 7.0 NaCI 0.35 M, Tris-HCl 0.05 M, pH 8.0, EDTA 0.01 , sarcosina 1 %). El homogenato tejido/buffer se extrajo con 4 ml de fenol/cloroformo. La fase acuosa se separó por centrifugación, se pasó a través de Miracloth y se precipitó dos veces utilizando 1/10 volumen de acetato de amonio 4.4 M, pH 5.2 y un volumen igual de isopropanol. El precipitado se lavó con etanol 70% y se volvió a suspender el 200-500 µl de TE (Tris-HCl 0.01 M, EDTA 0.001 M, pH 8.0). El tejido vegetal también se puede empleara para el aislamiento de ADN utilizando el procedimiento descripto recién.

La presencia de un gen en una célula transformada puede ser detectada mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Utilizando esta técnica se puede amplificar fragmentos específicos de ADN y detectarlos después de electroforesis sobre gel. Por ejemplo, el gen . EPSPS mutante se puede detectar utilizando PCR. Se añade dos cientos a 1000 ng de ADN genómico a la mezcla de reacción que contiene Tris-HCl 10 mM pH 8.3, MgCI2 1.5 mM, KCl 50 mM, gelatina 0.1 mg/ml, 200 µM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, cebadores de ADN directos e inversos 0.5 µM cada uno, glicerol 20% Y 2.5 unidades de ADN polimerasa Taq. Las secuencias de cebador son (superior) 5'-TTTGGCTCTTGGGGATGTG-3' y (inferior) 5'-TTACGCTAGTCTCGGTCCAT-3'. La reacción se corre en un equipo de ciclación térmica de la siguiente manera: 3 minutos a 94°C, 39 repeticiones del ciclo, 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C, 30 segundos a 72°C, seguido de 5 minutos a 72°C. Se recorren 20 µl de cada mezcla de reacción sobre un gel NuSieve 3.5% en buffer TBE (Tris-borato 90 mM, EDTA 2 mM) a 50 V durante dos a cuatro horas. Utilizando estos cebadores se amplifica un fragmento de 324 pares de bases del transgen EPSPS mutante. Para el análisis de transferencia Southern, se dirigió ADN genómico con un exceso de tres veces de enzimas de restricción, se sometió a electroforesis a través de agarosa 0.8% (FMC) y se transfirió (Southern, 1975) a Nytran (Schleicher y Schuell) utilizando SCP 10X (SCP 20X: NaCI 2 M fosfato disódico 0.6 M EDTA disódica 0.02 M). Los filtros se prehibridizaron a 65°C en SCP 6X, sulfato de dextrano 10%, sarcosina 2% y heparina 500 µg/ml (Chomet et al, 1987) durante 15 mi. Los filtros se hibridizaron durante toda la noche a 65°C en SCP 6X que contenía ADN se esperma de salmón desnaturalizado 100 µg/ml y sonda marcada con 32P. Los filtros se lavaron en SCP 2X, SDS 1 % a 65°C durante 30 min. y se visualizaron por autoradiografía utilizando una película Kodak XAR5. Par ala rehibridización, los filtros se llevaron a ebullición durante 10 min. en H20 destilada para eliminar la primera sonda y luego se prehibridizó como se describió anteriormente.

EJEMPLO 17 Control de malezas en campos de agricultura de plantas de maíz resistentes a glifosato El Roundup™ es una formulación comercial de glifosato manufacturada y comercializada por Monsanto Company. La cantidad de Roundup™ (glifosato) que se aplica al campo de cultivo en el cual se cultivan plantas de maíz resistentes a glifosato depende de la maleza o el espectro de malezas particulares presentes en el campo y para el cual se requiere control. La tasa de aplicación del herbicida puede variar típicamente en un rango de cuatro onzas de Roundup™ a 256 onzas de Roundup™ por acre (la tasa 1X es equivalente a 16 onzas por acre de Roundup™, es decir, 64 onzas/acre es 4X). Con preferencia, se aplican 8 onzas a 128 onzas por acre de Roundup™ a un campo de cultivo en el cual hay plantas de maíz resistentes a glifosato. Con mayor preferencia, se aplican de 16 onzas aproximadamente por acre de Roundup™ al campo. Una aplicación en exceso de Roundup™ de la tasa 1X, incluyendo 1X, 2X, 3X, 4X y mayor, es suficiente para eliminar plantas de maíz que no poseen una copia expresada del gen EPSPS mutante, y además eliminará un amplio espectro de malezas. Una aplicación de campo inicial de glifosato se lleva a cabo típicamente entre las etapas V3 a V5 del desarrollo y consistirá típicamente de una aplicación 2X. La tasa de aplicación puede ser incrementadas o disminuida según necesidad, basado en la abundancia y/o el tipo de malezas en tratamiento. Según la ubicación del campo y de las condiciones climáticas, que afectarán el crecimiento de las malezas y el tipo de infestación de malezas, puede resultar conveniente conducir otros tratamientos con glifosato.

La segunda aplicación de glifosato consistirá típicamente de una aplicación de glifosato 2X efectuada entre las etapas V6 y V8 de madurez. Nuevamente es posible ajustar la tasa de tratamiento basado en las condiciones del campo. Dichos métodos de aplicación de herbicidas a cultivos son bien conocidos en el arte y se resumen en general en la publicación de Anderson, (1983). El granjero también puede aplicar una combinación de herbicidas, inclusive Roundup™, a un campo con plantas de maíz resistentes a glifosato. La combinación de herbicidas se denomina en general "mezclas para tanque". Se suministra un segundo herbicida en combinación con el Roundup con el fin de complementar la actividad del Roundup e incrementar así la eficiencia del control de malezas. Por ejemplo, se puede aplicar Roundup™ a un campo de plantas de maíz resistentes a glifosato junto con un herbicida que posee actividad residual, como un herbicida de triazina, con el fin de proveer un control de malezas más prolongado. Un herbicida que puede ser particularmente útil en mezcla con glifosato es acetoclor. Se considera que el Roundup™ puede ser aplicado a un campo de cultivo que contiene plantas de maíz resistentes a glifosato junto con uno o más de los herbicidas enumerados en el cuadro 1. Se debe comprender que la lista de herbicidas en el cuadro 1 no es limitante y el experto en el arte conocerá otros productos químicos herbicidas que el granjero puede aplicar al campo en combinación con Roundup™. Un granjero puede querer aplicar glifosato a un campo para el control de malezas en cualquier momento, durante el período de crecimiento de las plantas de maíz, que el granjero quiera hacerlo. Con preferencia, el glifosato se aplica al campo durante el crecimiento vegetativo de las plantas de maíz, es decir, antes del inicio de la floración. El Roundup™ puede ser aplicado a plantas resistentes a glifosato en el campo en cualquier etapa del desarrollo, inclusive entre las etapas V1 y V10 (la escala del desarrollo se describe en, "How a Corn Plant Grows" Informe especial No 48, Universidad de Ciencias y Tecnología del Estado de lowa, Cooperative Extensión Servie, Ames, 1A) del crecimiento vegetativo. El Roundup™ se aplica con mayor preferencia al campo en las etapas V2, V3, V4, V5, V6, V7 o V8 del crecimiento vegetativo, y con mayor preferencia aún en las etapas V4, V5, V6, V7 o V8 del crecimiento de las plantas de maíz. Además, pueden resultar convenientes aplicaciones múltiples de Roundup™ con el fin de controlar el crecimiento de malezas. Por ejemplo, el Roundup™ puede ser aplicado al campo tanto en la etapa V4 de crecimiento de plantas de maíz resistentes a glifosato como en la etapa V8 del crecimiento. Aún más, el Roundup™ puede ser aplicado sobre una base de según necesidad con el fin de controlar el crecimiento de malezas particulares cuando fuera necesario.

EJEMPLO 18 Utilización de los cultivos transgénicos " 10 La meta final de la transformación de plantas es producir ¿ precisamente plantas que sean de utilidad para el hombre. En este sentido, las plantas transgénicas creadas de acuerdo con la invención actual puede emplearse para virtualmente cualquier propósito considerado de valor para el productor o el consumidor. Por ejemplo, se puede pretender cosechar las semillas de las plantas transgénicas. Estas semillas pueden a su vez emplearse para un rango amplio de propósitos. Las semillas se pueden vender a los granjeros para la siembra en el campo o se puede emplear directamente como alimento, ya sea para animales o para el ser humano.

Como alternativa, los productos se puede elaborar a partir de las mismas semillas. Los ejemplos de productos se pueden elaborar a partir de las semillas incluyen: aceite, almidón, alimentos para el hombre y animales, productos farmacéuticos y diversos productos industriales. Dichos productos se puede elaborar a partir de partes especiales de la planta o a partir de la plata entera. Un producto elaborado a partir de toda la planta, que es considerado de particular valor, es el ensilaje para forraje de animales. Los medios para preparar productos a partir de las plantas, como los que se puede elaborar con la ¡nvención actual, son bien conocidos desde los primeros tiempos de la agricultura y serán obvios para los expertos en el arte. Los métodos específicos para la utilización de cultivos se pueden encontrar, por ejemplo, en Sprague y Dudley (1988), y en Watson y Ramstad (1987).

REFERENCIAS El contenido de las referencias que se enumeran a continuación se incorpora en la presente documentación a modo de referencia hasta el grado de constituir un suplemento, una explicación, proveer un antecedente o explicar metodologías, técnicas y/o composiciones empleadas en la presente documentación. Solicitud PCT No. WO 89/06700; Solicitud PCT No. PCT U589/0 1025; Solicitud PCT No. WO 88/10315; PCT No. WO 91/02071 ; PCT No. US87/00880; Patente de los EE.UU. No: 4.769.061 ; Patente de los EE.UU. No: 4.535.060; Patente de los EE.UU. No: 4.683.195; Patente de ios EE.UU. No: 4.683.202; Patente de los EE.UU. No: 4.800.159; Patente de los EE.UU. No: 4.883.750; Patente de los EE.UU. No: 5.279.721 ; Patente de los EE.UU. No: 5.384.253; Patente de los EE.UU. No: 5.384.956; Patente de los EE.UU. No: 5.463.175; Patente de los EE.UU. No: 5.554.798; Patente de los EE.UU. No: 5.591.616. Solicitud de patente de los EE.UU. No: 08/1 13.561 , depositada el de agosto, 1993; Solicitud de patente de los EE.UU. No: 08/181 ,019, depositada el 13 de enero, 1994; Solicitud de patente de los EE.UU. No: 08/182,616, depositada el 14 de enero, 1994; Solicitud de patente de los EE.UU. No: 08/181 ,708, depositada el 14 de enero, 1994; Solicitud de patente de los EE.UU. No: 08/595,549, depositada el 6 de febrero, 1996. WO 90/07641 ; WO 95/06128.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Un método para obtener una planta masculina estéril inducible por herbicida, el cual comprende los pasos de: (i) transformar una célula vegetal con un cassette de expresión que comprende un gen que confiere tolerancia a un herbicida y un promotor activo en una planta que está enlazado operablemente al gen, produciendo así una pluralidad de células *10 transformadas; (ii) regenerar la pluralidad de células transformadas para ? producir una pluralidad de plantas regeneradas; y (iii) seleccionar de la pluralidad de plantas regeneradas una planta transformada que sea vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil después de la aplicación del herbicida. 15 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , el -cual comprende además obtener progenie de cualquier generación de la planta transformada vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el gen es un gen de tolerancia a glifosato. 20 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el gen de tolerancia a glifosato es una forma tolerante a glifosato de EPSPS. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el herbicida se selecciona del grupo que consiste de glifosato, glufosinato, imidazolinona, sulfonilurea, canamicina, G418, bromoxinilo y metotrexato. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el herbicida es glifosato. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la planta transformada es vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil, después de la aplicación de 0.59 litros por hectárea a 7.0 litros por hectárea de glifosato. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el glifosato se aplica entre las etapas de desarrollo V4 y VT. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, avena, cebada, girasol, alfalfa, sorgo y soya. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la planta es una planta de maíz. 11.- Un método para reproducir plantas que comprende los pasos de: (i) sembrar semillas próximas a la polinización capaces de convertirse en primera y segunda plantas progenitoras, en donde la primera planta progenitora comprende un cassette de expresión que contiene un gen que confiere tolerancia a un herbicida y un promotor activo en la primera planta progenitora que está enlazada operablemente al gen, en donde la primera planta progenitora es vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil, después de la aplicación del herbicida; (ii) cultivar las semillas para producir las primera y segunda plantas progenitoras; (iii) aplicar el 5 herbicida a la primera planta progenitora, haciendo así masculina estéril a la primera planta progenitora; (iv) permitir que la segunda planta progenitora polinice la primera planta progenitora; y (v) cosechar las semillas producidas por la primera planta progenitora. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , '10 caracterizado además porque la segunda planta progenitora es f vegetativamente tolerante y masculinamente fértil después de la aplicación del herbicida, el método comprendiendo además aplicar el herbicida a la segunda planta progenitora. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, 15 caracterizado además porque la segunda planta progenitora es femenina fértil después de la aplicación del herbicida. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , el cual comprende aplicar el herbicida a la primera y a la segunda planta progenitora mediante una aplicación por la parte superior. 20 15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el gen de tolerancia a herbicida es un gen de tolerancia a glifosato. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el gen de tolerancia a glifosato es una forma tolerante a glifosato de EPSPS. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el herbicida se selecciona del grupo que consiste de glifosato, glufosinato, imidazolinona, sulfonilurea, canamicina, G418, bromoxinilo y metotrexato. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el herbicida es glifosato. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el paso de aplicar el herbicida a la primera planta progenitora comprende aplicar de 0.59 litros por hectárea a 7.0 litros por hectárea de glifosato. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el paso de aplicar el herbicida a la primera planta progenitora comprende aplicar glifosato a la primera planta progenitora entre las etapas de desarrollo V4 y VT. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque las primera y segunda plantas progenitoras se seleccionan del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, avena, cebada, girasol, alfalfa, sorgo y soya. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la primera y la segunda planta son plantas de maíz. 23.- Un método para preparar una planta de maíz fértil y tolerante a glifosato, el cual comprende: (i) proveer un cassette de expresión que comprende (a) un gen que codifica una proteína EPSPS resistente a glifosato y (b) un promotor activo en maíz enlazado operablemente a dicho gen EPSPS; (ii) poner en contacto células de maíz receptoras con el cassette de expresión bajo condiciones que permitan la captación del cassette de expresión por las células receptoras; (iii) seleccionar células receptoras que comprendan un cassette de expresión incorporado cromosómicamente; (iv) regenerar plantas a partir de las células seleccionadas; y (v) identificar entre las plantas regeneradas una planta de maíz tolerante a glifosato que comprenda el cassette de expresión. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el promotor es un promotor de actina de arroz. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 23, el cual comprende además los pasos de: (vi) cruzar la planta de maíz fértil y tolerante a glifosato con una segunda planta de maíz que carezca del cassette de expresión para obtener una tercera planta de maíz que comprenda el cassette de expresión; y (vii) retrocruzar la tercera planta de maíz para obtener una planta de maíz fértil retrocruzada, en donde dicho gen EPSPS es heredado a través de un progenitor masculino. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la planta de maíz tolerante a glifosato es vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil después de la aplicación de glifosato. 27.- Un método para cultivar maíz, el cual comprende: (i) sembrar plantas de maíz fértiles y tolerantes a glifosato que comprendan un cassette de expresión que contenga (a) un gen que codifique una proteína EPSPS resistente a glifosato y (b) un promotor activo en maíz enlazado operablemente a dicho gen EPSPS; y (ii) aplicar glifosato a las plantas de maíz en una taza de aplicación que inhiba el crecimiento de malezas pero que no afecte la producción de las plantas de maíz. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el promotor es un promotor de actina de arroz. 29.- Una planta masculina estéril inducible por herbicida y semillas y progenie de la misma, que comprende un cassette de expresión que contiene un gen que confiere tolerancia a un herbicida y un promotor activo en ia planta que está enlazado operablemente al gen, en donde la planta es vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil después de la aplicación del herbicida. 30.- La planta de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque el gen es un gen de tolerancia a glifosato. 31.- La planta de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque él gen de tolerancia a glifosato es una forma tolerante a glifosato de EPSPS. 32.- La planta de conformidad con la reivindicación 29, 5 caracterizada además porque el herbicida se selecciona del grupo que consiste de glifosato, . glufosinato, imidazolinona, sulfonilurea, canamicina, G418, bromoxinilo y metotrexato. 33.- La planta de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque el herbicida es glifosato. *10 34.- La planta de conformidad con la reivindicación 33, la cual es ! vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil después de la aplicación del 0.59 litros por hectárea a 7.0 litros por hectárea de glifosato. 35.- La planta de conformidad con la reivindicación 33, la cual es vegetativamente tolerante, masculina estéril y femenina fértil después de la 15 aplicación de glifosato entre las etapas de desarrollo V4 y VT. 36.- La planta de conformidad con la reivindicación 29, la cual se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, avena, cebada, girasol, alfalfa, sorgo y soya. 37.- Una planta de maíz de conformidad con la reivindicación 36. 20 38.- Una planta de maíz fértil y semillas y progenie de la misma, que comprende un cassette de expresión que confiere tolerancia a glifosato a la planta, comprendido el cassette de expresión (i) un gen que codifica un EPSPS resistente a glifosato y (ii) un promotor activo en maíz enlazado operablemente al gen EPSPS. 39.- La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque el promotor es un promotor de actina de arroz.