MXPA99009159A - Procedimiento para inactivar patogenos, especialmente virus, en un material biologico - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento para la inactivación de patógenos, en especial de virus, en un material biológico por medio de incubación con un agente químico, que estácaracterizado porque la incubación se realiza en la presencia de una sal eleutrópica correspondiente a una concentración de NaCl de cuando menos 200 mmol/l, preferentemente cuando menos 300 mmol/l, asícomo una preparación que contiene complejo de protrombina purificada cromatográficamente.

Description

PROCEDIMIENTO PARA INACTIVAR PATÓGENOS, ESPECIALMENTE VIRUS, EN UN MATERIAL BIOLÓGICO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la inactivación de patógenos en un material biológico por medio de incubación con un agente químico. Un material biológico se deriva de organismos o bien de fluidos corporales o microorganismos. Ya que el material biológico con patógenos, como por ejemplo moléculas infecciosas o microorganismos y virus, o bien pwógpnaß, puafe estar csitapinacb, se han dtesarrallac ctLGaoaiü?S proaaclimieptas para la inactivación o reducción de patógenos o pirógenos . Ese tipo de procedimientos incluyen tratamientos físicos y/o químicos, como por ejemplo diferentes métodos de filtrado (por ejemplo nano-, dia- o uitrafiltrado) , tratamiento térmico, tratamiento con ácidos o lejía, tratamiento con detergentes y/o solventes orgánicos, así como tratamiento con luz UV o con luz láser. También han sido propuestas en el eetado de la técnica diferentes combinaciones de esos procedimientos para la inactivación o reducción de patógenos. Por ?P 0 197 554 se conoce por ejemplo un procedimiento para despirogenizar e inactivar virus en un producto biológico o farmacéutico, que abarca un tratamiento con un agente inactivante de virus o despirogenizante, como por ejemplo una substancia anfifila y despirogenizante, en una fase REF: 31315 sólida en la cual se encuentra adsorbido el producto. Después de ese tratamiento se separa el agente inactivante de virus y despirogenizante de la fase sólida, el agente adsorbido se lava y finalmente se eluye de la fase sólida. ~~ Por EP 0 131 740 se conoce el tratamiento de una composición que contiene proteína en una solución con solventes orgánicos como fosfatos de di- o triaiquilo, eventualmente en presencia de un detergente (tratamiento con solvente/detergente) , pudiéndose obtener las composiciones proteinicas libres de virus que contengan iípidos. Por AT-PS 402 151 se conoce un tratamiento térmico, en el cual el presente preparado en solución acuosa , antes de calentarlo, se le agrega un tensoactivo con una concentración de cuando menos 1% en peso . Otro procedimiento para la reducción o supresión de actividades indeseables en productos biológicos o farmacéuticos es conocido por EP 0 083 999..Esto se basa en un contacto prolongado con una solución o suspensión de un anfifilo de efecto no desnaturalizante. El producto despirogenizado se trata con un intercambiador de iones para separar el anfifilo. Una desventaja de muchos de esos procedimiento conocidos en el estado de la técnica es la frecuencia de perdidas de actividad de lae proteínas lábiles que se encuentran en las composiciones a tratar, por ejemplo de proteínas sanguíneas. En especial por la realización de una etapa de purificación cromatográfica se preeenta una inactivación de proteínas en gran medida. La destrucción de proteína puede también conducir a una activación. Así se sabe por ejemplo que el factor VII en el caeo de una purificación cromatsgráfica debido a loe procesos autocataliticos muy fácilmente se convierte en un factor Vlla. Otra desventaja coneiete en el alto gasto en tiempo y apararos, lo que reduce fuertemente su practicabilidad y por lo tanto hace muy inadecuado su uso a gran escala técnica. La presente invención se propone la tarea de presentar un procedimiento para JLa inactivación de patógenos en materiales biológicos para proteínas, en especial de proteínas sanguíneae iabilee, el cual pueda ser transferido a una gran escala técnica y que pueda realizarse económicamente. En eepecial en el procedimiento para la inactivación de patógenoe debe evitarse ia destrucción o posible activación de proteínas sensibles . La presente tarea se resuelve porque se presenta un procedimiento para inactivar patógenos en especial virus, en un material biológico por medio de incubación con un agente químico, en el cual la incubación se realiza en presencia de una sal eieutrópica correspondiente a una concentración de NaCl de cuandoXnenos 200 mmo/1, preferentemente 300 mmol/1. La inactivación de patógenos en solución ofrece frente al tratamiento de un adsorbente algunas ventajas. Así por ejemplo ía practicabiíidad de un procedimiento de ese tipo en un sistema homogéneo de una fase ee mayor y ia validación de la etapa de inactivación es mas posible. También parece que el mejor acceso a los patógenos en una fase relativamente homogénea aumenta la eficiencia de esa etapa del procedimiento. El material biológico contiene preferentemente una proteína humana y es en especial plasma o una fracción plasmática o ee deriva de un cultivo celular. Preferentemente el material biológico contiene un factor sanguíneo como el factor XII, XI, VIII, V, ei factor de von Willebrand o fibrinogeno, en especial una proteína dependiente de vitamina K como el factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C, proteína S o proteína 2. Las proteínas pueden presentarse como factores individuales preferentemente en forma purificada o en una mezcla compleja. EN una forma de realización muy especial el material biológico contiene cuando menos un factor del complejo de protrombina y es en especial una fracción que contiene un complejo de protrombina o un material que contiene factor VII, por ejemplo se obtiene después de una crioprecipitación plasmática a partir del residuo superficial o superior (crioresidu© superficial) . La preparación de acuerdo con la invención es preferentemente aquella con actividad FEIB (factor Eight Inhibitor Bypaseing Activity) , también una preparación que es adecuada para el tratamiento de pacientee con inhibición VIII. El material originario de un cultivo celular es preferentemente un material que contiene factoree sanguíneos preparados por mécodos recombinantes, entre ellos factores intrínsecos o extrínsicos de la coagulación, la fibrinoíisis, la trombosis o sus inhibidores, en especial factoree sanguíneoe dependientes de la vitamina K. Como células entran en consideración las células obtenidae para la expreeión de proteínas recombinantes, en eepecial células de mamíferoe, como por ejemplo célulae Vero, CHO o BHK. Las proteínas correspondientes pueden directamente a partir del extracto celular crudo, somecerse al procedimiento para inactivar los patógenos eventuaímente presentes sin embargo también puede trataree de una fracción celular previamente purificada. El agente químico ee especialmente un detergente (anfifilo, tensoactivo) que preferentemente está contenido en una cantidad de cuando menos 1% , preferentemente más de 5%, lo más preferentemente en más de 10%; sin embargo pueden utilizarse otros agentee químicoe de acuerdo con la invención, en eepecial aquellos que son ya conocidos por su efecto virucida, bactericida o despirogenizante, o mezclas de diferentes agentes químicos . La selección se limita sin embargo porque la natalidad dei material biológico no debe ser modificado de manera esencial . Para un procedimiento económico se selecciona una subetancia química que mantenga la actividad biológica del material en máe del 50%, en relación a la actividad antee de la incubación, preferentemente cuando menos 70%, especialmente más de 85% . Mantenimiento de la actividad biológica eignifica que las proteínas contenidas en el material biológico puedan efectuar su función o sue diferentee funciones que son naturalmente propias de ellas. Esa actividad biológica puede determinarse y expresarse dependiendo del tipo de proteína, por ejemplo por medio de una prueba estandarizada de cromogeno o una determinación de los antígenoe . Eventualmente se separa el agente químico después de la incubación. Por detergente en general debe entenderse una substancia sintética, orgánica, tensoactiva. Preferentemente en ei procedimiento de acuerdo con la invención se utiliza un detergente no iónico. Detergentes no iónicos como poiieter, en especial poliglicoléter de alquilfenol, son entre otroe productoe de la etoxilación de ácidos grasos, amidas de ácidos grasos, aminae grasas, alcoholes grasos, óxidos de amino, esteres de ácidos grasoe de poiiaicohoies y esteres de eacaroea. Un tensoactivo de ese tipo actúa sobre las proteínas de manera no desnaturalizante y se selecciona preferentemente del grupo de polisorbato y Tritón. Como polieorbato puede utilizarse por ejemplo Tween"1. Cuando se utilizan detergentes como agentee químicoe, entonces estos se utilizan de acuerdo con una forma de realización preferida sin la adición de otros agentes, en especial sin la adición de subetanciae orgánicas tóxicae o soiventee, como por ejemplo TNBP. Con esto se minimiza eí riesgo de contaminación. El material biológico de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención se incuba con un agente químico . La incubación eignifica el poner en contacto ei material biológico con una eolución, euepeneión o emulsión de un agente químico para inactivar un patógeno o pirógeno eventuaimente presente durante un período de tiempo suficientemente largo a una temperatura determinada. La puesta en contacto puede realizarse simplemente al dejar reposar la mezcla durante un período de tiempo definido. La incubación se realiza de acuerdo con la presente invención en ia presencia de una sal eleutrópica. Bajo "sal eleutrópica" debe entenderse a continuación una mezcla del agente químico o la sal de una composición compleja, con la propiedad de liberar y/o expulsar la subetancia adeorbida de adeorbentes sólidos o impregnados con líquidos o también en forma de gel . Preferentemente la sal eleutrópica se trata aquí de un agente de deeorbción, como los que se uean en loe procedimientos cromatográficos. La substancia adsorbida es entre otras cosas lo suficientemente soluble en presencia de la sal eleutrópica, esto es se seleccionan preferentemente condiciones que no precipiten el material biológico. El tipo y la concentración de la sal o de la composición se selecciona en lo general dependiendo del . adsorbente seleccionado . El efecto eluyente de una sal depende por ejemplo de ia polaridad del solvente, aumenta también por ejemplo en la secuencia etanol - acetona - metano! agua. El adeorbente puede ser una faee sólida, en especial una matriz adecuada para la cromatografía de intercambio de ionee . La compoeición contenida en la eal eieutrópica puede contener otros aditivos por ejemplo otrae sales. Preferentemente ia composición ee trata aquí de un composición acuosa con un valor de pH en el intervalo entre 6.0 a 8.0, preferentemente 7.0. En una forma de realización preferida como eal eieuotrópica se utiliza cloruro de sodio, pero también otras sales alcalinas o alcalinotérreas, entre ellas CaCl2. Como sales eleutrópicas pueden utilizarse también las llamadas caotrópicae, como por ejemplo urea, rodanuro o guanidina. La concentración de la eal es cuando menos _> 200 mmol/1, preferentemente >. 300 mmoi/'l . El limite superior de la concentración utilizada depende en especial de ia solubilidad de la sal en cuestión y se encuentra en el caso de NaCL por ejemplo en 2 mol/l. Las substancias " caotropicas como por ejemplo ureas, pueden eventualmente utilizarse en una concentración de hasta 8 mol/l . La incubación del material biológico con el agente químico se realiza para la activación de patógenos eventualmente presentes durante un período de tiempo suficientemente largo, preferentemente entre 10 minutos y 10 horae . , se prefiere entre 1 y- 5 horae. El período de tiempo requerido para el procedimiento de acuerdo con la invención puede, de acuerdo con ia invención, determinarse por medio de virus modelo como VIH, Sindbis, FSME o de hepatitis en una prueba previa. También la selección de la temperatura influye sobre el período de tiempo a utilizar. E el procedimiento de acuerdo con la invención se incuba preferentemente a la temperatura ambiente, por ejemplo en una margen de temperatura entre 15 y 45°C, en eepecial entre 20 y 30°C. En el procedimiento de acuerdo con ia invención el material biológico ee adeorbe preferentemente en un portador eólido, ee purifica y la incubación ee realiza directamente deepuée de la elueión del material purificado. La elueión y la incubación pueden realizaree consecutivamente, pueden también realizaree simultáneamente. De acuerdo con otra forma preferida de realización la incubación se realiza después de una purificación cromatográfica de un material biológico, en donde el eluato ee procesa posteriormente, por ejemplo por medio de centrifugación, filtrado u otros métodos físicos. El portador sólido es preferentemente un material adecuado para la cromatografía, en especial para la cromatografía por intercambio de iones, cromatografía hidrófoba o cromatografía de afinidad. Por ejemplo se utilizan materiales como Sepharose^, Superdez, Sephadex"", Spherodex"X Toyoperarl™' o materiales inorgánicos como hidroxilapatita. Como intercabiadores de ionee pueden utilizarse intercambiadores de aniones como por ejemplo DEAE-Sephacel"'1', D?AE-SephadexmX DEAE-Sepharosem? CL6B, DEAE-Sepharose-'Fast Flow, QAE-Sephadex?rX Q-SepharosemrFast Flow, Q-Sepharosem?'High Performance, DEAE-Tris-Acrilo, DEAE-SpherodexraX Q-yper-D (obtenible por la firma Sepracor) , DEAE-Toyopearlm? QAE-Toyopéarl"r , Fractogei" EMD-TMAE u otro material de Fractogel. Como ejemplo de materiales de cromatografía hidrófoboe deben por ejemplo nombrarse Sepharose™1' de butilo, Sepharose"11' de octilo, Sepharose1"1" de fenilo, FractogelrarTSK-butilo, soporte HIC de t-butilo o TSK-gel butilo Toyopearlr . El material biológico puede adsorberse en el portador y purificarse directamente de una mezcla compleja, a la etapa de inactivación pueden precederle o sucederle otras etapas para purificar el material, en el marco de la presente invención se prefieren las etapae de purificación cromatográficae . Por medio del procedimiento de acuerdo con la invención se inactivan patógenos . Por patógenos también se entienden fragmentos de por ejemplo virus, en especial el genoma aieíado o eue fragmento . ~~ Los patógenos pueden eer patógenos recubiertos en lípidos, como por ejemplo el virus de la hepatitis B, o patógenos no recubiertos en lípidos, como por ejemplo el virus de la hepatitis A. Procedimientos para la inactivación de virus se califican hoy en dia como efectivos cuando después de utilizar el procedimiento en una muestra de material biológico que fue mezclada con una alta dosis de un virue de prueba por ejemplo el VIH, o el virue Sinbie como virue modelo para virue de hepatitie, no puede determinarse ningún virus en la muestra y la concentración viral así fue reducida por debajo del limite determinabie . La determinación y cuantificación de los ácidoe nucleicos puede reaiizaree por ejemplo por medio de un método PCR, como el descrito en AT-PS 401 062, o por medio de titulación directa. Como medida de la inactivación se conoce el llamado factor ~de reducción, que se calcula despuée de la adición única de virus de prueba a partir de los cocientes logarítmicos decimales de la concentración inicial y final del virus . A partir de los lineamentos europeos EC III/8115/89-EN de la comisión de comunidades europeas se conoce el llamado factor de reducción total. Se calcula de la suma de los factores de reducción de medidas de inactivación individuales subsecuentes . También otra etapa independiente para la inactivación o eliminación de patógenos se realiza preferentemente. Aquí entran en consideración todos los procedimientos conocidos en el estado de la técnica para minimizar el riesgo de infección.

En especial se realiza como etapa adicional para la inactivación o eliminación, un filtrado y/o un tratamiento térmico . Como filtrado se realiza preferentemente una nanofiitración, un tratamiento térmico preferido se realiza en el material biológico sólido, por ejemplo en un liofilizado con contenido de agua controlado, por ejemplo un contenido de agua entre 5 y 8% y una temperatura entre 50 y 80°C, como se describe en EP-0 159 311. En una forma de realización preferida se prevé el tratamiento en dos etapas con un detergente como agente químico . Para esto se utiliza en una primera etapa un detergente en una cantidad de cuando menos 1%, preferentemente cuando menos 5%, lo mas preferentemente 10% . En una ^segunda etapa se utiliza otro detergente en una cantidad de cuando menos 10%, preferentemente cuando menos 12%, lo mae preferentemente 14%. El detergente utilizado puede ser el miemo para ambae etapae, pero pueden ser utilizados diferentes detergentes. En general por medio de la combinación de etapas para la inactivación de virue puede reducirse fuertemente o eliminarse el riesgo de una infección viral después de administrar ia preparación correspondiente . De" acuerdo con ia presente invención también ee presenta una preparación purificada cromatográficamente, que contiene un factor sanguíneo activable autodinámicamente con una fracción de factor sanguíneo activado menor al 50%, en relación al contenido del factor sanguíneo activado y no activado, preferentemente menos de 40%, mas preferentemente menos de 30%, aún más preferentemente menos de 20%¿ todavía más preferentemente menoe de 10%, y lo mae preferentemente menos de 1%, y un contenido de detergente. En especial la preparación se trata de una preparación que contiene complejo de protrombina con una actividad de factor Vlla menor al 50% en relación al contenido de factor VII activado y no activado, preferentemente menos de 10%, mas preferentemente menos de ?%. El contenido de detergente del preparado de acuerdo con la invención se encuentra en una cantidad farmacéuticamente aceptable, preferentemente entre 1% y el límite determinabie del detergente., Bajo el término factor sanguíneo ac ivable autodináraicamente, de acuerdo con la presente invención debe entenderse un factor sanguíneo que es activable autocataliticamente, por medio de contacto superficial, o por medio de procesos como por ejemplo procesos cromatográficos. En especial ese tipo de factor sanguíneo es aquel eeleccionado del grupo de factor VII, factor XII, factor XI y precalicreina. En otra forma de realización preferida la preparación se encuentra"" libre de inhibidores de proteaea de serina, como por ejemplo inhibidores de trombina, o los cofactores como por ejemplo heparina. En una forma de realización especial se da la ausencia de esas substancias ya durante el proceso cromatográfico . Por lo tanto la presente invención también abarca las correspondientes preparaciones que se obtienen con el procedimiento de acuerdo con la invención. En la preparación de acuerdo con la invención pueden estar contenidos también otros aditivos por ejemplo eubstancias de efecto estabilizante como por ejemplo aminácidos . Por medio de los siguientes ejemplos debe iiuetraree detalladamente la presente invención, sin limitarla a ellos. Ejepplo 1 Tratamiento con detergente de complejo de protrombina FEIBA activado en presencia de T EENmr-80 15 mg de DEAE-Sephadexrar A-50, firma Pharmacia, se incubaron a la temperatura ambiente con 1 mi de una solución de 30g/l NaCl en agua hasta que se hincharon. Despuée eí gel ee separo por medio de centrifugación del residuo superficial de hinchamiento. A continuación siguieron cinco lavados del gel con sendos 1 ml de amortiguador (9g/l Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl, pH 7.0) y otroe dos lavados con amortiguador (7 g/1 citrato Na3.2H20, 7 g/1 NaCl) igualmente por medio de resuspensión y centrifugación . 30~ml de plasma de citrato humano recién congelado se descongelo a 0 a+4°C y el crioprecipitado se separo por medio de centrifugación a +2°C. El "crioresiduo superficial" resultante se incubo con DEAE-Sephadexrar lavado, en donde se genero FEIBA y junto con los factores del -complejo de protrombina y la proteína inerte se adsorbió en el gel . Después ee eeparo la proteína inerte coadsorbida del gel DEAE por medio de lavado con un amortiguador (9g/l Na2HP04.2H20, 7 g/i NaCl) . "- El complejo de gel-proteína humedecido con el amortiguador ahora se suspendió con 1.5 ml de una eolución de 150 mg/ml TWEEN™r-80 y 30 mg/ml NaCl durante 1 hora a 26°C. Por medio del tratamiento con una solución de mayor fuerza iónica se desorbio la proteína junto con los factores del complejo de • protrombina y los patógenos eventualmente presentes . A continuación se diluyo' la suspeneión al agregarle 6.5 ml de agua y se readsorbio a la temperatura ambiente durante 1 hora, siendo readsorbido nuevamente el factor proteinico, mientras gue las partee conetitutivae del patógeno inactivado permanecieron en la eolución junto con el detergente. El complejo gel/proteína se lavo entonces cinco veces con sendos 1 ml de una solución de 7 g/1 NaCL en agua libre de detergente. Para la elusiOn se trato el gel con 0.7 ml de una solución de 30 g/1 NaCl en agua "bajo agitación. El eluato se dializo' frente a agua destilada, se congelo y liofHizo". Después de la reconstrucción del liofilizado se determino la actividad de FEIBA de acuerdo con AT-B 350 726. Como controles sirvieron igualmente preparaciones preparadas de FEIBA, sin embargo sin el tratamiento con detergente.

El análisis del preparado obtenido mostró una actividad especifica de 3.2 U FEIBA/mg proteína con un contenido de proteína de 16.6 g/ l después de la reconstitución del liofilizado y fue comparable con" la variante del procedimiento sin tratamiento con detergente, en donde se obtuvo una actividad especifica de 2.8U/mg proteína con una concentración de proteína de 16.5 mg/ml. EJ?MPLO 2: Tratamiento con detergente a una desorbción de FEIBA con un tiempo de incubación prologado: Análogamente al ejemplo 1 se adsorbió la fracción de complejo de protro bina en DEAE-Sephadexmr, ee libero por lavado de proteínae inertes, a continuación se desorbio con una eolución de TWEElsr'r-NaCl . La fracción de proteína se mantuvo en un estado de desorción durante mas de 2 o 3 horas bajo condiciones constantee . A continuación se elaboro el producto final como se describe en el ejemplo i. El análisis de esos productos mostró una actividad específica de 2.5 U FEIBA/mg proteína con un contenido de proteína de 16.6 mg/ml durante 2 horae de incubación en la presencia de TWEENKE-80 y una actividad específica de 2.3 U FEIBA/mg proteína con un contenido de proteína de 17.4 mg/ml durante 3 horae de incubación con el detergente . Aeí pudo mostrarse que también a tiempos de contacto prolongados con el detergente no están asociadas una 1 / inactivación esencial de la subetancia activa o una reducción del rendimiento . EJEMPLO 3: Tratamiento con detergente de FEIBA con readsorción en otro gel Se preparo" FEIBA como se describe en el ejemplo i.

Después del tratamiento y desorción con el detergente, la solución obtenida se transfirió a un recipiente en el cual había 15 mg de DEAE-SephadexpA50, Firma Pharmacia, ei cual había sido previamente incubado en una solución de 30 g/1 NaCl para su hinchamiento y subsecuentemente cinco lavados con sendos 1 ml de un amortiguador (9g/l Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl, pH 7.0) y otros dos lavados con un amortiguador (7 g/1 citrato Na3.2H20, 7 g/1 NaCl) igualmente por medio de resuspensión y centrifugación. Después de la adsorción durante 1 hora del complejo de proteína diluido para retirar el detergente se realizó* el procedimiento descrito en el ejemplo 1. El producto final así obtenido tenía en comparación con FEIBA preparado de acuerdo con una variante estándar esto es sin el tratamiento con detergente, un rendimiento de 95% y era comparable en ?a actividad específica. EJEMPLO 4: Tratamiento con detergente de complejo de protrombina activado FEIBA en presencia de TWEENmr-80 a temperatura elevada 15 mg de DEAE-SephadexmrA-50 Firma Pharmacia, se incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente con 1 ml de una solución de 30 g/1 NaCl en agua hasta que se hincho.

Después ee separo* ei gel por medio de centrifugación del residuo superficial de hinchamiento. A continuación siguieron cinco lavados del gel con (9g/l Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl, pH 7.0) y otros dos lavados con un amortiguador (7 g/1 citrato Na3.2H20, 7 g/1 NaCÍ) igualmente por medio de reeuspeneión y centrifugación. 30 mi de plaema de citrato humano recién congelado se descongelo a 0 a+4°C y el crioprecipitado se separó por medio de t. .3* centrifugación a +2°C. El "crioresiduo euperficial " reeultante ee incubo' con DEAE-Sephadex" lavado, en donde ee generó' FEIBA y junto con los factores del compiejo de protrombina y la proteína inerte se adsorbió en el gel . Después se separo la proteína inerte coadsorbida deí gel DEAE por medio de lavado con un amortiguador (9g/l Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCÍ) . El complejo de gel-proteína húmedo con amortiguado se euependió ahora con 1.5 ml de una eolución de 1 mg/ml de TWEEN"11"-80 y 30 mg/ml NaCÍ durante 1 hora a la temperatura ambiente, con lo cual ee desorbieron la fracción de proteína y las impurezas adsorbidae de forma no especifica. A continuación se separó' el gel por filtrado. La solución de proteínas por medio de la adición de mas TWEE]Sr-80 se llevo a una concentración de detergente de 150 mg/ml y a continuación se incubo ya sea durante una hora a 26°C o durante 1 hora a 40°C agitando para inactivar los patógenos eventualmente preeentes . A continuación se diluyo' por la adición de 6.5 ml de agua y se reeorbio un gel DEAE-Sephadex1" A-50 recién lavado preparado. A continuación por medio de cinco lavados con sendoe 1 ml de una eolución de 7 g/1 NaCÍ en agua ee elimino el detergente y se siguió trabajando exclusivamente con ei preparado como se describe en el ejemplo 1. El análisis de ambas variantes de tratamiento a 26°C y a 40_°c mostró una actividad específica del preparado FEIBA comparable con una variante estándar sin inactivación de virue . Loe rendimientos fueron en los dos casos del 75% de la variante estándar. EJEMPLO 5: Tratamiento con detergente de complejo de protrombina en presencia de TWEENmr-80 (Al momento según la solicitante la mejor manera de realizar la invención) 30 ml de plasma de citrato humana recién congelada se descongeló a 0 a +4°C y el crioprecipitado se separo'' por medio de centrifiguación a +2°C. El "crioresidus superficial" resultante se mezclo con 2 IU heparina/ml . Después se adsorbieron las proteínas del complejo de protrombina con DEAE-Sephadex~'r A-50, firma Pharmacia,~~ en una concentración de 0.5 mg/Ml . El complejo de gel proteína se separó' de la solución y se lavo' con un amortiguador 1 (4 g/1 citrato Na3.2H20, 7 g/1 NaCÍ, 9 g/1 Na2HP04.2H20, 500 IU heparina/1, pH 7.5) y a continuación con amortiguador 2 (4 g/1 citrato Na3.2H20, 7 g/1 NaCÍ, 500 IU Lheparina/1, pH 7.5).

El gei lavado se suspendió ahora para la inactivación de los patógenos con 1.5 ml de una solución que contenía 150 mg TWEEN^'-SO/ml y 30 mg de NaCl/ml, 1 hora a 26°. Por medio de ese tratamiento se desorbio la fracción de proteína junto con loe patógenos o fracción patógena eventualmente presentee y en el transcurso de la incubación con detergente se inactivaron los patógenos . A continuación se diluyó' con 6 ml de agua como se describe en ei ejemplo 1 y la fracción de proteína junto con la substancia activa se reaeorbio en la matriz intercambiadora de iones durante 1 hora a la temperatura ambiente. A continuación se lavo' cinco veces con un amortiguador (4 g/1 citrato Na3 , 7 g/1 NaCÍ, 500 IU heparina/1, pH 7.5) hasta eliminar el detergente y se eluyo con una solución de lg/1 de citrato Na3-2H20, 20 g/1 NaCÍ, 1000 IU heparina, pH 7.0. Al eluato ee le agrego' 1 IU heparina/ml . La solución que contenía el complejo de protrombina se desamortiguo con un amortiguador que contenida 4g/l de citrato Na3.2H20, 0.8g/l NaCÍ, pH 7.0 y se liofilizo". En el compiejo de protrombina liofilizado reconstituido se probaron el contenido de proteínas y el contenido de factoree de complejo de protrombina; los resultados se dan en ía tabla i. Como control se preparo' un producto sin tratamiento con TWEENmr . -Los reeuitados de análisis se dan también en la tabla 1.

Tabla i Comparación de las actividades de loe factores de complejo de protrombina después de la realización del procedimiento de acuerdo con ia invención y sin eee procedimiento Se moetró que por medio de 1 tratamiento con detergente no ee presentaron modificaciones esencialee de la compoeición del complejo de protrombina. EJEMPLO 6: Tratamiento con detergente del factor VII con TWEENrar-80 en comparación con la inactivación viral del factor VII de acuerdo con un procedimiento convencional A partir de plaema de citrato humana se separó', como se describe en el ejemplo 5, "la fracción de complejo de protrombina que contenía los factores de coagulación protrombina pequeñas partes de factor VII, factor IX y factor X. La mayor fracción del factor de coagulación VII que permaneció en el residuo superficial despuée de ia adsorción en DEAE-Sephadexmr A50, se obtuvo en hidróxido de aluminio por medio de adsorbció'n.

A esto se ie agregaron por 1 1 de residuo superficial despuée de la eéparación deí complejo de protrombina 10 ml de una suspeneión de hidrogel de aluminio al 2% y ee agito' durante 30 minutos a 4°C. A continuación ee separo' el compiejo de hidróxido de aiuminio-proteína por medio de centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos a aprox. 4°C en un Sorvall RC3B rotor H6000A, eí residuo superficial se desecho y el precipitado con 3.5% del volumen del residuo superficial de complejo de protrombina utilizado para ía adsorción se suspendió en una solución de 4g de citrato Na3.2H20/l, 7g NaCl/l pH 7.5 y se agito' durante 20 minutos . Así se desorbio la proteína inerte del hidróxido de aluminio. El factor VII que permaneció en el hidróxido de aluminio fue vuelto pelotillas por medio de nueva centrifugación como se describe antes . El reeiduo superior se desecho' y el precipitado se siguió utilizando. Para ia deeorbción de la fracción de proteína el complejo de hidróxido de aluminio-factor VII se agito durante 30 minutos con 1% vol de complejo de protrombína utilizado de 0.3 mol/l de amortiguador de fosfato, pH 8.6^(53.4 g Na2HP04.2H20/1 ee ajustaron con una solución de 41.1 g NaH2P04H20/l a un pH de 8.6) que contenía 1% de TWEEN™1'-80. A continuación para ia inactivación de los patógenos se agrego" detergente a~ una concentración final de 15% de TWEENp,r-80 y a continuación se agito' durante 1 hora a 40°C. Después se enfrió la solución a aproximadamente 22°"C y se diluyo' con 9 partes de agua destilada. La fracción de factor VII se readeorbio entoncee en i g/1 de DEAE-Sephadext'1 A 50 agitando durante 1 hora a aprox. 22 °c. A continuación se lavo' el complejo de gel-proteína hasta eliminar ei detergente sobre un embudo de einterización por medio de triple lavado con sendos 100 ml por litro de solución TWEEN^-dO utilizada diluida con un amortiguador que contenía 4g de citrato Na3.2H20/i, 7g NaCl/1, pH 7.5 y que contenía 500 IU heparina /i. La elusión de la fracción del factor VII se realizó por medio de agitación del complejo de proteína intercambiadora de iones y 100 mi/í de solución TWEEN7""-80 de una solución que contenida 85 g NaCl/1 durante 30 minutos a 22°C. En el eluato se determino cuantitativamente el contenido de factor VII con una prueba de cromogeno de factor VII (Immunochrom FGaktoir VII; Cm IMMUNO AG, Viena, medido contra el estándar internacional de complejo de protrombina) , el contenido de proteína de acuerdo con ei método de Bradford [Anal .Biochem. 72:248-254 (1976)] y el factor Vlla, de acuerdo con el método de US 683,682 (medido contra el estándar internacional el factor Vlla) . Los resultados se encuentran en la tabla 2. Para comparar se separó' el factor VII por medio de adsorción en hidróxido de aluminio y se trato' como se describe antes de otras proteínas del compiejo de protrombina y en eetado adeorbido dé acuerdo con EP Ó 197 554 con loe agentee inactivantes de virus de EP 0 131 740 con TWEEl\Tr-80 y fosfato de tri- (N-butilo) (TNBP) . Para esto el complejo de alhidrogel-proteína se agitó' en una solución acuosa de 1% de TWEE]XPr-80 y 0.3% de trifoefato de (N-butilo), durante 18 horae a 4°C con un volumen de 50 ml/1 del reeiduo euperior del complejo de protrombina. A continuación ee centrifugó como se describe antee para la separación del complejo de hidróxido de aluminio-proteína y por medio de lavado con 3x 100 mí de una solución de 4g de citrato Na3.2H20/l, 7g NaCl/1, pH 7.5, se liberó* del TWEEN?r'- -80 y trifosfato de (N-butilo; excesivoe por medio de resuspensión. Entre cada lavado se realizo' una formación de pelotillas dei complejo de hidróxido de aiuminio-proteína por medio de centrifugación. La eiusión se realizo' bajo lae mismas condiciones como en el producto paralelo de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención. Igualmente se realizaron los análisis del producto final análogamente. Loe resultádoe se dan en la tabla 2.

Tabla 2 Actividades del factor Vlla después de la realización del procedimiento de acuerdo con la" invención y despuée de la realización del procedimiento de acuerdo con EP 0 197 554.

Se mostró que utilizando este procedimiento el contenido de factor Vlla en comparación con el procedimiento de acuerdo con la invención aumento claramente, en donde a pesar del tratamiento complejo del factor VÍI no pudo determinarse activación. Además en el procedimiento de acuerdo con la invención el- producto obtenido tenía una mayor actividad específica que en el preparado comparativo.

EJ?MPLO 7: Determinación semicuantitativa del virus de hepatitis G En los productos de inactivación de patógenos de los ejemplos 1 a 6 se tomaron pruebas de los materialee de partida, dei reeiduo superior después de la crioprecipitación o de la adsorción después de la separación de los factoree de coagulación II, IX y X, aeí como preparadoe de coagulación purificados y concentrados correspondientee. 0.5 mi de eeae muestras se diluyeron 1 + 1 con amortiguador fieiológico de foefato-eai común y íoe virue eventualmente presentes recibieron forma de pelotillas por medio de ultracentrifugación. El ARN se extrajo de las pelotillas virales por medio del método de reactivo de RNAzoi (Biotecx, Houston Texas) , y se disolvieron en agua destilada. Se realizo' RT-PCR a los ácidos nucleicos de los virus de hepatitis G (HGV) con el par de cebadores NS5a 1 y NS5á 2 (Linnen, J. et al. Science 271; 505-508 (1996)) . La secuencia del cebador utilizado (obtenible de Boehringer Mannheim, Alemania) fue para NS5a 1: 5' CTCTTTGTGGTAGTAGCCGAGAGAT 3 ' y para BS5a 2; 5 ' CGAATGAGTCAGAGGACGGGGTAT 3' . Los cebadores se marcaron con un colorante fluorescente y las amplificaciones fluorescentes resultantes de acuerdo con el protocolo PCR según un procedimiento rutinario se analizaron en un ABI 377.-Sequencer de Applied Biosyetems . Para poder excluir la presencia de inhibidores RT-PCR en las muestras, se inocularon las muestras se analizaron con un imitador de 7ARN de virus de hepatitis C y en un PCR de hepatitis C realizado de acuerdo con EPO 714 988. Se coneideraron valioeoe para PCR HGV exclusivamente loe extractoe que no mostraron inhibición en el PCR HCV. La intensidad de la fluorescencia se tomo' como medida para el contenido de virus de hepatitis G. Se mostró que los materiales de partida utilizados para el fraccionado presentaban antes de la inactivación de patógenos de acuerdo con el procedimiento de ía invención, fuertes señales poeitivae, eeto es una alta concentración de amplificados de ácido nucleico de HGV, mientras que en los eluatos después de la readsorción y separación de los antes inactivantes de virus no se encontró mas ARN de HGV. En pruebas paralelas sin realizar un tratamiento con detergentes, los eluatos como los materiales de partida eran positivos en el PCR de HGV. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: l.- Procedimiento para la inactivación de patógenos, en especial de virus, en un material biológico, por la incubación con un agente químico, caracterizado porque la incubación ee realiza en la presencia de una sal eleutrópica correspondiente a una concentración de NaCÍ de cuando menos 200 mmol/1, preferentemente cuando menos 300 mmol/I .
2. 2.- — Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque como agente químico se utiliza un detergente, el cual está contenido preferentemente en una cantidad de cuando menos 1%, mas preferentemente mas de 5%, y lo mas preferentemente mas de 10%.
3. 3.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación l o 2, caracterizado porque como sal eleutrópica se utiliza cloruro de sodio.
4. 4. - — Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicación 1 a 3, caracterizado porque la incubación se realiza durante un período de tiempo entre 10 minutos y 10 horas, se prefiere entre 1 y 5 horas .
5. 5. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones l a 4, caracterizado porque como material biológico se utiliza plasma o una fracción plasmática o el material de un cultivo celular.
6. 6. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones i a 5, caracterizada porque se utiliza un material biológico que contiene un factor sanguíneo en eepeciai una proteína dependiente de la vitamina K.
7. 7. - — Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones i a 6, caracterizado porque se utiliza un material biológico que es una fracción que contiene un compiejo de protrombina .
8. 8. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones i a 7, caracterizado porque, el material biológico es adsorbido en un portador sólido, purificado y la incubación se realiza despuée de la elueión del material purificado.
9. 9.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la elusión y la incubación se realizan simultáneamente .
10. 10.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque como portador sólido se utiliza un material cromatográfico , en especial un material adecuado para la cromatografía por intercambio de iones o para la cromatografía de afinidad.
11. 11. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se realizan otras etapas para purificar el material, en especial una purificación cromatográfica.
12. 12. - Procedimiento de acuerdo con una de ias reivindicaciones l a ll, caracterizado porque se realiza otra etapa para la inactivación o eliminación de patógenos, en especial una filtración o un tratamiento térmico.
13. 13. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque como agente químico se utiliza un detergente no iónico seleccionado del grupo de Tween y Tritón.
14. 14.- Preparación purificada cromatográficamente, que contiene un factor sanguíneo activable autodinámicamente con una fracción de factor sanguíneo activado menor al 50%, en relación al contenido del factor sanguíneo activado y no activado, preferentemente menos de 40%, mas preferentemente menos de 30%, aun mas preferentemente menos de 20%i todavía mas preferentemente menos de 10%, y los mas preferentemente menos de 1%, y un contenido de detergente.
15. 15.- Preparación de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque el factor sanguíneo se selecciona del grupo formado'por el factor VII, el factor XII, el factor XI y pre-calicreina.
16. 16.- "" Preparación de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado porque contiene un complejo de protrombina con una actividad de factor Vlla menor a 50%, en relación al contenido de factor VII activado y no activado, preferentemente menos del 10%, mas preferentemente menos de 1%.
17. 17.- Preparación de acuerdo con una de lae reivindicaciones 14 a 15, caracterizado porque la preparación está libre de inhibidores de proteasa de serina o sus cofactores .
18. 18.- * Preparación de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada porque es obtenible por medio de un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones i a 13.