MXPA99009083A - Almidones semejantes a los de las plantas y metodo para hacerlos en huespedes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a huéspedes que contienen construcciones con genes de la ruta del almidón. Más típicamente la presente invención se relaciona con huéspedes bacterianos que forman almidones semejantes a los de las plantas. Adicionalmente la presente invención se relaciona con plantas huéspedes que tienen genes de la ruta del almidón. La invención además se relaciona con los almidones producidos por estos huéspedes.

Description

ALMIDONES SEMEJANTES A LOS DE LAS PLANTAS Y MÉTODO PARA HACERLOS EN HUESPEDES ANTECEDENTES - CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con huéspedes que contienen construcciones con genes de la ruta del almidón. Más específicamente la presente invención se relaciona con huéspedes bacterianos que forman almidones semejantes a los de las plantas. Adicionalmente la presente invención se relaciona con plantas huéspedes que tienen genes de la ruta del almidón. La invención además se relaciona con los almidones producidos por estos huéspedes . ANTECEDENTES - DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR El almidón usado en la industria se emplea en diversas industrias tales como los fabricantes de dulces, fabricantes de adhesivos y pinturas, fabricantes de salsas, productores de papel, etcétera. Ya que la demanda de almidón, (el cual está formado de amilosa y amilopectina) , ha aumentado en gran medida para usos de fabricación de alimentos e industriales especializados, se han hecho esfuerzos para adaptar a las necesidades la cantidad y la calidad del almidón para los usos específicos en los alimentos y las industrias. Esta industria por mucho tiempo ha buscado diferentes almidones que tengan, alta viscosidad, baja viscosidad, alta resistencia gelificante y baja resistencia gelificante, diferentes puntos de ebullición, etcétera. Cada almidón hecho a la medida para diferentes usos. La industria ha utilizado almidones mutantes que tienen menos amilopectina y almidones mutantes con más amilosa para especificaciones adaptadas al cliente. Por ejemplo, el almidón con amilosa aumentada se ha usado en el área de fabricación de dulces en jalea. Y la industria ha usado los almidones con amilopectina aumentada formada por mutantes tales como wx y wx su2 que contienen poca amilosa y la mayor parte de amilopectina para espesar los alimentos tales como budines, tartas, salsas, alimentos congelados y pastas, estofados, alimentos enlatados y alimento para bebés . Adicionalmente los almidones mutantes de diferentes tipos son útiles como adhesivos y engomados. El otro método usado para atacar las necesidades industriales de almidón adaptado al cliente es el uso de la modificación química del almidón. La derivación química del almidón se produce haciendo reaccionar químicamente el almidón con reactivos monofuncionales para introducir los sustituyentes tales como grupos fosfato, acetato, succinato para estabilizar el almidón. Desgraciadamente, estos tipos de almidones se pueden someter a reglamentación gubernamental y adicionalmente tener menos aceptación de vida generalmente al costo añadido del almidón. El almidón es la forma más importante en la cual se almacenan los carbohidratos en los sistemas biológicos. El almidón de las plantas en los cloroplastos es transitorio y el almidón de almacenamiento se acumula en órganos de almacenamiento de muchas plantas . El almidón se puede encontrar en todos los "Órganos de la mayoría de las plantas más superiores que incluyen hojas, tallos, raíces, frutas, embriones y endospermo. Además del almidón de las plantas superiores, se ha encontrado polisacárido (glicógeno) similar en bacterias. Muchas bacterias producen un polisacárido de reserva similar al glicógeno encontrado en animales. El polisacárido almacenado se ha clasificado en dos grupos, el grupo uno se almacena en el citosol de la célula y el segundo grupo dentro del plastidio. La Escherichia coli produce un polisacárido dentro del citosol. Las plantas que producen almidón típicamente almacenan el almidón en los plastidios . Las plantas típicas que tienen almidón incluyen la mandioca, papa, maíz, chícaro, arroz, trigo, cebada. El tejido principal que almacena el almidón del maíz, arroz, trigo, cebada y avena, los granos de cereal, es la endosperma. Los almidones también se clasifican por el origen de las plantas, por ejemplo los almidones de cereal son de granos de cereal tales como maíz, arroz, trigo, cebada, avena y sorgo; el almidón de tubérculos y raíces es de papas, nabos y mandioca . La ruta de la síntesis del almidón no se conoce bien. Generalmente, como se hizo notar anteriormente, el almidón de las plantas consiste en dos componentes mayores: amilosa y amilopectina. Estas se entrelazan en el granulo de almidón de las plantas. La amilosa es un polímero lineal de unidades de alfa 1-4 anhidroglucosa enlazadas mientras que la amilopectina es un polímero ramificado que comprende cadenas lineales de unidades de alfa 1-4 anhidroglucosa enlazadas con ramas que resultan de enlaces alfa 1-6 entre las cadenas lineales. Se ha sabido durante algún tiempo que se pueden expresar genes mutantes en plantas que tienen almidón y que las propiedades del almidón se pueden alterar. La proporción de los dos componentes y sus estructuras en un mutante determinan principalmente las propiedades físico-químicas del almidón. De este modo la falta de un entendimiento claro de la ruta de síntesis del almidón y la dificultad de emplear mutantes limitó a la industria al uso de almidones existentes y mutantes producibles (los cereales que contienen almidón mutante pueden mostrar una desventaja de rendimiento muy grande en el campo) o a la modificación química que podría hacerse al almidón. En la década pasada la industria ha estado estudiando los efectos de ciertos genes de almidón en plantas y bacterias intentando entender más claramente la síntesis del almidón. Desde finales de los años ochenta ha sido posible transformar plantas y bacterias para que contengan genes aislados . Como respuesta a esto la industria ha transformado papas con un gen bacteriano GS y con gen sintasa III soluble de almidón en el antisentido (formando una mutante) . Como parte de estos experimentos de almidón de papa se ha transformado la bacteria con ciertos genes de almidón de papa. Por ejemplo el gen SSSIII de papa se transformó en E. coli deficiente en el gen glgA. También se ha estudiado el efecto del glgC y de las enzimas de ramificación I y II en combinación en una E. coli mutante y se ha reportado producto parecido a glicógeno. La industria del almidón que es comercial no tiene interés particular en la producción de glicógeno el cual es el polisacárido producido por bacterias y animales (la industria de la salud puede tener algún interés en esto) . La industria no ha sido capaz de generar almidones adaptados a las necesidades a precios razonables a través de la transformación de genes de las plantas. Persiste una necesidad de la industria de encontrar nuevos almidones que son útiles debido a sus características cambiadas tales como viscosidad más baja y nuevos almidones que son útiles debido a su viscosidad más alta y nuevos métodos para producir estos almidones. La síntesis de glicógeno en E. coli y la síntesis de almidón en plantas superiores tienen rutas similares que involucran pirofosforilasa ADPGlc, sintasa de almidón (SS) o sintasa de glicógeno (GS) , y enzima de ramificación (BE) . Se ha sugerido que la pirofosforilasa ADPGlc juega un papel pivotal para regular la cantidad de almidón sintético, mientras que la sintasa de almidón y la enzima de ramificación del almidón principalmente determinan la estructura del almidón. Se han identificado múltiples formas de la SBE y SS en muchas plantas «que incluyen maíz, arroz, chícharo y papa. Además del gen waxy que codifica la sintasa de almidón de enlace de granulo (GBSS) , se han aislado tres genes que codifican las otras formas de SS a partir de la endosperma del maíz . El maíz es el único cultivo de cereal del cual se han aislado los genes que codifican las cinco formas de SS . Claramente varias de estas secuencias se han publicado y son conocidas por los expertos en la técnica. Los genes que codifican la SBE de maíz también han sido clonados y caracterizados. Informes anteriores han demostrado «que la SBEI tiene una tasa más alta de ramificación de amilosa que la SBEII y preferencialmente transfiere cadenas más largas, mientras que la SBEII muestra una tasa más alta de ramificación de amilopectina y preferencialmente transfiere cadenas más cortas . En comparación con SBE, se sabe menos acerca de las especificidades y funciones de formas múltiples de la SS . En el maíz Waxy, que carece de GBSS, sólo se sintetiza amilopectina y falta amilosa. Por lo tanto, generalmente se acepta que la GBSS, codificada por el gen waxy, es principalmente responsable de la síntesis de la amilosa. El estudio de la mutación waxy en Chlamedomonas reinhardtii ha sugerido que la GBSS también está involucrada en la síntesis de amilopectina. Aunque se ha reportado que la SSII de Chlamedomonas reinhardtii controla la síntesis de glucanos de tamaño intermedio de la amilopectina en Chlamedomonas , todavía falta evidencia directa de las funciones de la sintasa de almidón en plantas superiores . Se ha usado tecnología antisentido para estudiar las funciones de SS en la papa, sin embargo, los resultados no son concluyentes . En un artículo escrito por Hanping Guan y colaboradores, titulado "Maize Branching Enzyme Catalyzes Synthesis of Glicogen-like Polisaccharide in glg B-deficient Escherichia coli" , publicado en Proc. Natl . Acad. Sci . USA, Vol. 92, pp. 964-967, Febrero de 1995 (Plant Biology), se reporta un glicógeno específico semejante a polisacárido a partir de una E. coli transformada. Este artículo muestra la transformación de una bacteria E. coli con maíz BEI y BEII. Estas enzimas se transformaron en dos huéspedes de E. coli . Una de las huéspedes bacterianas fue del tipo natural y la otra fue una mutante. La mutación a la bacteria fue la reducción de la actividad de la enzima de ramificación de glicógeno en el AC71 (glgB-) de manera que el mutante esencialmente carecía de actividad de enzima de ramificación. El artículo analizó el alfaglucano desramificado aislado de cuatro diferentes transformantes. La primera huésped fue E. coli que contiene glgB y la segunda huésped fue la AC71 sin ningún gen transformado, luego AC71 transformado con BEII de maíz, y luego AC71 con BEI de maíz, luego AC71 con BEI y BEII de maíz. Los productos de polisacáridos resultantes se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento, por longitud de cadena y área de pico relativa y por la distribución molar de las cadenas. El estudio condujo al entendimiento de que BEII podría jugar un papel en la síntesis de las cadenas cortas de la amilopectina y BEI podría estar involucrada en las cadenas más largas de la amilopectina. El artículo también hacía notar que el huésped mutante AC71 produjo más cadenas con longitud de cadena de 6 de lo que lo hacía el tipo silvestre de E. Coli . El artículo también hacía notar que la BE de maíz y la GS del huésped NO producen polisacáridos semejantes a la amilopectina. El artículo sugirió que la acción concertada de GS con diferentes enzimas de ramificación podría jugar un papel importante para determinar la estructura final del polisacárido sintetizado. El artículo de Guan finaliza sugiriendo que su estudio ha establecido la base para estudiar las acciones concertadas de BE y SS en el sistema del modelo bacteriano. La expresión de GS (sintasas de glicógeno) de E. coli en papas mostró una gran incidencia de almidón altamente ramificado. Este resultado fue publicado en un artículo en Plant Phisiol. 104, 1159-1166 por Shewaker y colaboradores.

Esta papa no parece ser de mucho uso comercial en este momento. La industria todavía necesita la opción de producir almidones semejantes a las plantas en un proceso de fermentación a partir de bacterias y de este modo sin la necesidad de cruzar y cultivar plantas sensibles al medio ambiente; y, la opción de producir plantas que generan el almidón adaptado a las necesidades específicas a través de una planta huésped. Y la industria necesita almidones alterados y nuevos que sean semejantes a los almidones de cereal o almidones semejantes a los de raíces y tubérculos en grandes cantidades y no caras evitando de este modo el uso de la modificación química del almidón. La industria necesita un huésped que se pueda transformar fácilmente para suministrar diferentes almidones adaptados a la medida de las necesidades de la industria. Específicamente la industria necesita un huésped que suministre varios almidones diferentes que incluyen los que no son capaces de ser hechos en plantas o bacterias actualmente . OBJETOS Y VENTAJAS De conformidad con lo anterior, varios objetos y ventajas de la invención son producir almidón semejante al de las plantas a través del proceso de fermentación. Objetos y ventajas adicionales son la producción de nuevos almidones en las plantas. Todavía otros objetos y ventajas serán aparentes a partir de la consideración de la descripción que sigue y los dibujos acompañantes. Otro objeto de la presente invención es la síntesis de polisacáridos que incluyen amilosa, amilopectina en E. coli , y/o hongos y levaduras mediante enzimas que sintetizan almidón de plantas que incluyen SS, SBE, enzima de ramificación bacteriana, sintasa de glicógeno, y otras enzimas en otros organismos vivos . Todavía otro objeto de la invención es usar cada una o la combinación de estas enzimas o las enzimas modificadas estudiadas en esta patente para producir o para mejorar polisacáridos en cualquier organismo vivo incluyendo la síntesis de almidón en plantas*. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona construcciones de ADN en un huésped que incluyen la mayoría de los genes en la ruta de almidón de una planta de manera que el huésped produzca un polisacárido semejante al de las plantas. Y en una modalidad produce almidón de maíz que incluye modalidades ligeramente diferentes que hacen el almidón semejante al maíz mutante específico en un huésped que no es planta. Esta invención abarca un huésped bacteriano que contiene una combinación de dos o más de estos genes SSl, SSSIIa, SSIIb, SSSIII, GBSS, BEI y BEII cuando la combinación no forma material semejante a glicógeno. Esta invención abarca una planta huésped transformada con cualquiera de los siguientes genes de maíz o una planta huésped que tiene una combinación de dos o más de los siguientes genes de maíz SSl, SSIIa, SSIIb, SSSIII, GBSS, BEI y BEII en una planta de arroz híbrido o una de cruce interno . Adicionalmente la presente invención incluye un nuevo polisacárido producido por un huésped transformado. El huésped que tiene un tipo silvestre, que no produce el nuevo polisacárido, el huésped transformado que expresa cuando menos dos genes exógenos de síntesis de almidón, los genes se seleccionan de un grupo que consiste en genes de síntesis de almidón tales como SSl, SSIIa, SSIIb, SSIII, GBSS y opcionalmente que incluyen cuando menos uno de los genes BEI y BEII en donde el huésped transformado es capaz de producir este nuevo polisacárido. La invención también cubre un nuevo polisacárido en donde el huésped también expresa los genes exógenos seleccionados del siguiente grupo que consiste en genes que inducen glicógeno bacteriano se seleccionan del grupo glgA, glgB, glgC y cualquier mutante de los mismos. O en donde el huésped también expresa los genes exógenos seleccionados del grupo siguiente que consiste en enzimas de enlace de granulo de planta. Y el nuevo polisacárido en donde los genes de síntesis de almidón se seleccionan del grupo que consiste en BEI y BEII. La presente invención abarca de manera amplia un huésped que contiene un gen Glg C transformado y cuando menos uno de los genes de enzimas de ramificación de almidón en un huésped en combinación con cuando menos otro gen de almidón transformado en donde el huésped produce un producto polisacárido. Y un huésped que contiene un gen bacteriano transformado y cuando menos una de las enzimas de ramificación que no son de almidón seleccionada del grupo que consiste en las enzimas de desramificación y la sintasa de almidón soluble. Un método para producir polisacáridos que no son semejantes al glicógeno en un huésped que comprende transformar un huésped capaz de ser usado en un proceso de fermentación, con genes seleccionados del grupo que produce enzimas que sintetizan almidón, o enzimas que sintetizan glicógeno de manera que el huésped produce almidón no semejante a glicógeno, y que emplea el huésped en un proceso de fermentación que produce polisacáridos. El huésped es una bacteria, o un hongo o una levadura. Adicionalmente el método de esta invención incluye el uso de genes bacterianos también tales como los genes gue sintetizan glicógeno incluyendo los genes glgC, glgA, glgB. Un método en donde los genes que producen enzimas que sintetizan almidón incluye genes que codifican las sintasas solubles de almidón I, lía, Ilb y SS III (dull) . Un método en donde los genes que producen enzimas que sintetizan almidón incluyen genes que codifican enzimas de desramificación de almidón y enzimas de ramificación. La. invención cubre la.a enzimas que sintetizan el almidón modificado que incluyen las SS truncadas N-terminalmente. En otras palabras la invención cubre un huésped transformado para transportar un gen activo en la producción de glicógeno, y cuando menos un gen de ramificación, que no sea de almidón, activo en la producción de cuando menos uno de los siguientes polisacáridos : amilopectina y amilosa en su huésped original . El huésped puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea. El huésped puede ser una planta que tenga un cereal. O el huésped puede ser una bacteria. Más específicamente la invención incluye un huésped en donde cuando menos un gen que no sea de almidón activo en la producción de cuando menos uno de los siguientes polisacáridos, amilopectina y amilosa en su planta original, se selecciona del grupo que consiste en sintasa de almidón soluble de almidón I, lia, Ilb, III y el gen de enzima de desramificación (sul) , el gen GBSS, el gen sh2 y el gen bt2. Un huésped que incluye cuando menos uno de los genes de enzima de ramificación de almidón tales como el gen BEI y el gen BEII. La presente invención también se puede describir como un huésped transformado para transportar un gen activo en la producción de ADPG, y cuando menos un gen de almidón activo en la producción de cuando menos uno de los siguientes polisacáridos: amilopectina y amilosa en su huésped original en donde el huésped produce polisacáridos que son almidones semejantes a los de las plantas y no son semejantes al glicógeno. Adicionalmente el huésped se puede transformar para transportar un gen pirofosforilasa, y un gen sintasa de glicógeno. El alcance de la presente invención incluye un huésped deficiente en su capacidad para sintetizar alfa-l, 4-glucano y la capacidad de enzima de ramificación alfa-1,4-1,6 transformada para expresar cuando menos un gen sintasa soluble de almidón de plantas . Y el huésped también puede incluir ser transformado para expresar cuando menos un gen que codifica la enzima de desramificación, y/o un gen que codifica la sintasa soluble de almidón I, la enzima de sintasa soluble de almidón lia, Ilb, la enzima de sintasa soluble de almidón III. Este huésped puede incluir ser transformado para expresar cuando menos un gen que codifica la enzima de ramificación de almidón. Esta invención también incluye la producción de un material semejante a glicógeno en plantas. Anexo a la presente hay varios plásmidos descritos mediante las Figuras y mediante la Tabla uno, que son parte de la presente invención y se reclaman en la presente. Uno de estos ejemplos es el plásmido en donde el plásmido está en un huésped portador y el plásmido contiene el gen SSIIa con el N-término GENVMNVIW y en donde el gen tiene aproximadamente 1561 pares de bases de longitud. La invención incluye huéspedes mutantes tales como arroz y papas y maíz waxy semejantes a las plantas como ejemplo y en donde el huésped es una ~E. coli mutante, o un hongo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una gráfica que da el área de pico relativa en porcentaje y la longitud de la cadena de glicógeno y de sintasa soluble de almidón I (SSl) , sintasa soluble de almidón II (SSIIa) , sintasa soluble de almidón IIb (SSIIb) . De este modo esto muestra las especificidades de las sintasas de almidón de maíz en el alargamiento de la cadena. La Figura 2 muestra el plásmido pEXSC-MBEI con 7661 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y glgC y la enzima de ramificación de almidón de maíz I (MBEI) . La Figura 3 muestra el plásmido pEXSC3C con 7461 pares de bases y el promotor T7 y el gen ampicilina y el gen de sintasa soluble de almidón de maíz lía. El pEXS3c es la fracción de 1082 pares de bases Ndel-EcoRI que contiene el N-término de MSSSIIa (a partir de MSSIIa en pBSK) subclonado en los sitios Ndel-EcoRI de pEXS3a, que reemplaza el N-término de IIA-2 con el N-término lia más largo. El MSSIIa es el SSIIa de maíz maduro y tiene 2090 pares de bases de longitud. Los siguiente sitios no están contenidos en el inserto MSSIIc: Apal, BglII, EcoV, Not, Spel y Xbal. El N-término de este plásmido es AEAEAGGKD. La Figura 4 muestra el plásmido pEXSC-MBEI-MBEII con 9971 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y glgC y la enzima de ramificación de almidón de maíz I (MBEI) y la enzima de ramificación de almidón de maíz II (MBEII) . La Figura 5 muestra el plásmido pEXSC-MBEII con 7521 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y glgC y la enzima de ramificación dé almidón de maíz II (MBEII) . La Figura 6 muestra el plásmido pEXSC-3a con 7990 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y el gen glgC y el gen de sintasa de almidón truncado N-terminalmente lia (MSSIIa-2) . La secuencia N-terminal es GENVMNVI . La Figura 7 muestra el plásmido pEXSC-8 con 7079 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y el gen glgC y el gen de sintasa soluble de almidón de maíz I y la versión 1-2. (MSSI-2) , un SSl truncado N-terminalmente. La Figura 8 muestra el plásmido pEXSC-9 con 7551 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y el gen glgC y el gen de sintasa soluble de almidón de maíz Ilb (SSIIb) . La secuencia N-terminal es AAAPAGEE . La Figura 9 muestra el plásmido pEXSC-10 con 7211 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y el gen glgC y el gen de sintasa soluble de almidón de maíz I, el SSl de longitud completa. La secuencia N-terminal es CVAELSREGPA. La Figura 10 muestra el plásmido pEXSCA con 6738 pares de bases y el promotor T7 y un gen canamicina y el gen glgC y el gen glgA. La Figura 11 muestra el plásmido pEXSC9a con 7240 pares de bases y el promotor T7 y el gen ampicilina y el gen sintasa soluble de almidón de maíz IIb-2 (Maíz SS IIb-2) , un SSIIb truncado N-terminalmente. La secuencia N-terminal es MNWWASECAP .

La Figura 12 muestra el plásmido pEXS X con 6968 pares de bases y el promotor T7 y un gen ampicilina y el maíz truncado N-terminalmente WX (sintasa de almidón de enlace granular de maíz) . La secuencia N-terminal de wx es ASAGMNWFVGAEMA. La Figura 13 muestra el plásmido pEXSWX2 con 6980 pares de bases y el promotor T7 y un gen ampicilina y el maíz truncado N-terminalmente WX denominado wx2. El N-término de wx2 es MNWFVGAEMA. La Figura 14 muestra el plásmido pEXSC9 con 7780 pares de bases y el promotor T7 y el gen ampicilina y el gen glgC de E. coli y el gen de sintasa soluble de almidón de maíz IIb (Maíz SS Ilb) . La Figura 15 muestra el plásmido pEXSClOd con 7112 pares de bases y el promotor T7 y el gen ampicilina, el gen glgC de E. coli y el gen de sintasa soluble de almidón de maíz truncado N-terminalmente denominado Maíz SSI-3. El N-término del maíz SSl-3 es MSIVFTGEASPYA. La Figura 16 muestra el plásmido pEXSlO con 5300 pares de bases y el promotor T7 y el gen ampicilina y el gen de sintasa soluble de almidón de maíz de longitud completa I denominado maíz SS I. La Figura 17 muestra el plásmido pEXS8 con 7259 pares de bases y el promotor T7 y el gen ampicilina y el gen de sintasa de almidón de maíz I truncado N-terminalmente denominado SSI-2. La secuencia N-terminal es CVAELSRDLGLEPEG. La Figura 18 muestra el plásmido pEXSCAl con 5128 pares de bases y el promotor T7 y el gen ampicilina y el glgA. El pESCAl es un fragmento de 1551 pares de bases Spel-Sacl que contiene el glgA (a partir de glgA en pBSK) subclonado en los sitios Xbal- Sacl de pET-23d el cual está disponible comercialmente en Novagen en Madison, Wisconsin con el número de catálogo 69748-1 y se denomina ET-23d (+) DNA. La Figura 19 muestra el espectro del complejo yodóglucano del producto producido por el huésped que contiene el glgC y glgA, y el pEXSC9, pEXSC3 , pEXSC8 , pEXSCwx. El eje X está enlistando nm y el eje Y está leyendo absorbancia. La Figura 20 muestra el espectro del complejo yodo-glucano del producto producido por el huésped transformado con plásmidos que contienen el glgC, el BEI, los genes BEII y glgA; glgC, los genes BEI, el BEII y los genes de maíz SSl, SSI-2 y glgC, los genes BEI, BEII y los genes de maíz SSIIb, y glgC, los genes BEI, el BEII y los genes de maíz SSIIa-2, y glgC, los genes BEI, el BEII. El eje X está enlistando nm y el eje Y está leyendo absorbancia. La Figura 21 muestra el producto producido por el huésped en pequeñas botellas que incluyen el producto a partir del -huésped que contiene los genes glgC, BEI, BEII y los genes de maíz SS codificados como (C-I-II+8) ; los genes glgC, BEI, BEIL y SSI-2 y pEXSClO codificados como (C-I-II+10) ; los genes glgC, BEI, BEII y los genes de maíz SSl y pEXSC9 codificados como (C-I-II+9) ; los genes glgC, BEI, BEII y los genes de maíz SSIIb y pEXSC3a codificados como (C-I-II+3a) ; los genes glgC, BEI, BEII y los genes de maíz SSIIa-2 y pEXSCWX codificados como (C-I-II+WX) ; los genes glgC, BEI, BEII y los genes de maíz waxy y pEXSCAl codificados como (C-I-II+A1) , que contienen los genes de maíz BEI, BEII y los genes glgA de E. coli , dextrina de papa, almidón de maíz waxy, amilopectina de maíz, almidón de arroz, almidón de maíz, pEXSC8. La Figura 22 muestra el pExs-trc que tiene 4178 pares de bases con el promotor tre y el gen ampicilina. El pEXS-trc es pTrc99A-Ndel el cual ha sido mutado. (El sitio Ncol en el sitio de clonación múltiple de pTrc99A-Ndel se mutó a Ndel usando los cebadores EXS63 y EXS64) . El pEXS-trc contiene solamente un sitio Ndel y ningún sitio Ncol. Los siguientes sitios no están contenidos en pEXS-trc: BglII, Clal, Ncol, Notl, SacII, SnaBI, Spel y Xhol. La Figura 23 muestra el plásmido pEXS-trc-3 que tiene 4129 pares de bases con el promotor tre y el gen ampicilina en parcial y el gen canamicina. El pEXS-trc3 es el pEXS-trcl cortado con Bgll (relleno en) -Sea I y religado, suprimiendo la mayoría del gen ampicilina (304 nt del restante extremo 5") . Los siguientes sitios no están contenidos en pEXS-trc3 : Apal, BglII, EcoV, Ncol, Notl, SnaBI y Spel. La Figura 24 muestra el plásmido pEXS 102 que tiene 7190 pares de bases adaptado para la transformación en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I, y el gen Waxy 2 y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 25 muestra el plásmido pEXS 103 que tiene 6607 pares de bases, adaptadas para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, el gen que codifica para el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen Waxy 2 y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 26 muestra el plásmido pEXS 101 que tiene 6979 pares de bases, adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD.de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen glgB y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 27 muestra el plásmido pEXS 100 que tiene 7557 pares de bases adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I, y el gen glgB y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 28 muestra el plásmido pEXS 101 que tiene 6273 pares de bases, adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen glg A y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 29 muestra el plásmido pEXS 66 que tiene 6001 pares de bases, adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen glg C3 y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 30 muestra el plásmido pEXS 65 que tiene 6373 pares de bases, adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD.de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen waxy y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 31 muestra el plásmido pEXS 64 que tiene 7073 pares de bases, adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen de sintasa de almidón soluble lia de maíz y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 32 muestra el plásmido pEXS 63 que tiene 6473 pares de bases, adaptado para uso en plantas gue contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón I y el gen de sintasa de almidón soluble lia de maíz lia y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 33 muestra el plásmido pEXS 62 que tiene 6773 pares de bases, adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen de sintasa de almidón soluble 1-2 de maíz y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 34 muestra el plásmido pEXS 61 que tiene 7013 pares de bases, adaptado para uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, el gen que codifica el péptido de tránsito de sintasa de almidón de maíz I y el gen de sintasa de almidón soluble Il-b de maíz y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 35 muestra el plásmido pEXS 59 que tiene 6858 pares de bases adaptado para el uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de_ maíz I, y el gen glgA E.coli y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 36 muestra el plásmido pEXS 58 que tiene 7658 pares de bases adaptado para el uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I y el gen sintasa de almidón soluble lia de maíz, y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 37 muestra el plásmido pEXS 56 que tiene 6586 pares de bases adaptado para el uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I, y el gen glg Cg y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 38 muestra el plásmido pEXS 54 que tiene 7658 pares de bases adaptado para el uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I, y el gen de maíz SS lia y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 39 muestra el plásmido pEXS 53 que tiene 7058 pares de bases adaptado para el uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I y el gen de sintasa de almidón soluble IIa-2 de maíz, y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 40 muestra el plásmido pEXS 52 que tiene 7358 pares de bases adaptado para el uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I, y el gen sintasa soluble de almidón de maíz 1-2 y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 41 muestra el plásmido pEXS 51 que tiene 7398 pares de bases adaptado para el uso en plantas que contiene el promotor zeína de 10KD de maíz, y el intrón adh I de maíz, el gen de codificación para el péptido de tránsito sintasa de almidón de maíz I, y el gen sintasa soluble de almidón de maíz Ilb y el terminador nos y el gen ampicilina. La Figura 42 muestra la fotografía de once productos de almidón alterado producido con la presente invención. Los títulos se codifican C-I-II=el gen glgC y los genes BEI y BEII el siguiente número o la designación alternativa significa pEXS- y el número. De este modo C-I-II es igual al gen glgC y BEI y el BEII y el plásmido EXS-10 que contiene el gen SSl, que tiene el N-término mostrado en la Tabla 1. La Figura 43 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas del glgA que tiene 14=88 pares de bases. La Figura 44 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para glgB que tiene 2361 pares de bases. La Figura 45a muestra la secuencia de ADN para el gen zeína de 10 -kDa Zea mays que tiene 2562 pares de bases. La Figura 45b muestra la secuencia de ADN para la porción zeína de 10 -kDa Zea mays del gen usado como promotor en varios de los plásmidos mencionados en la presente. La Figura 46 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para ' glgC3 (glgCg) que tiene 1328 pares de bases que contiene dos mutaciones P295D, K296E. Este es un mutante del gen glgC del tipo silvestre. La Figura 47 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de glgC (glgC) que tiene 1328 pares de bases.

La Figura 48 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para glgCwt (glgCwt) gue tiene 1328 pares de bases . Este es el gen glgC que se encuentra en la naturaleza. La Figura 49 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas del gen waxy de maíz denotado en la presente wx. La Figura 50 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de la sintasa soluble de almidón de maíz Ilb que codifica el gen que tiene 2423 pares de bases. La Figura 51 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para la sintasa soluble de almidón de maíz lia. La Figura 52 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas de la sintasa soluble de almidón de maíz 1-2 que tiene 1749 pares de bases. La Figura 53 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para la enzima de ramificación II del maíz . La Figura 54 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas para la enzima I de ramificación de maíz . La Figura 55 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de proteínas (153) para la porción de péptido de tránsito de la sintasa I soluble de almidón de maíz.

La Figura 56, análisis de reacción de cadena de polimerasa de arroz transgénico. El ADN genómico aislado de las plantas de arroz se amplificaron mediante reacción de cadena de polimerasa usando cebadores específicos para el gen insertado. Las bandas específicas se identificaron en gel de agarosa 1% en comparación con planta de arroz no transgénica. La Figura 57. Actividad de tinción de sintasa de almidón en gel SDS-PAGE renaturalizado con solución de yodo. La tinción positiva del maíz SSI-2 indicó la expresión de maíz SSI-2 en plantas de arroz transgénicas. La Figura 58. Diagr.ama de construcciones SSI-1, SSI-2, y SSI-3. Se construyeron tres formas de SSl en el sistema de expresión pET (véase métodos) . pExslOa codifica SSI-1, el maíz SSl de longitud completa (583 amino-ácidos) . pExsd codifica un SSl truncado, SSI-2, con los amino-ácidos número 8-52 suprimidos del N-término de SSI-1. pExsld codifica la forma más truncada de SSl, SSl -3, con los primeros 93 amino-ácidos suprimidos de SSI-1. Una representación del gen waxy, que codifica GBSS, también se incluye para comparación. El motivo amino-ácido KS/TGGL, el sitio de unión presunto para ADPGlc, se indica mediante los triángulos. El motivo KS/TGGL se localiza 18 amino-ácidos desde el N-término en GBSS, mientras que el motivo está a 106 amino-ácidos desde el N-término en SSl de maíz. No está dibujado a escala. La Figura 59. Diagrama de las construcciones SSIIa-1 y SS a-2. Se construyeron dos formas de SSIIa en el sistema de expresión pET. pExs3c codifica SSIIb-1, el SSIIb de maíz de longitud completa presunto. El secuenciamiento N-terminal de SSIIa-1 reveló que la cadena de polipéptidos comenzó en el amino-ácido número uno de manera que la longitud de SSIIa-1 es de 669 amino-ácidos. pExs3a codifica una forma truncada de SSIIa, SSIIa-2, con los primeros 176 amino-ácidos N-terminales suprimidos de SSIIa (493 amino-ácidos en total) . Una representación del gen waxy, que codifica GBSS, también se incluye por comparación. El motivo de amino-ácidos KTGGL, el sitio de unión presunto para ADPGlc, se indica mediante los triángulos. El motivo KTGGL se localiza 18 amino-ácidos desde el N-término en GBSS, mientras que el motivo está a 194 aminoácidos del N-término en SSIIa de maíz. La Figura 60. Diagrama de construcción SSIIb-1 y SSIIb-2. Se construyeron dos formas de SSIIb en el sistema de expresión pET (véase métodos) . pExs9 codifica SSIIb-1, el SSIIb de maíz de longitud completa presunto. El secuenciamiento N-terminal de SSlIb-1 reveló que la cadena de polipéptidos comenzó en el amino-ácido número 1, de manera que la longitud de SSIIb-1 es de 637 amino-ácidos. pExs9a codifica una forma truncada de SSIIb, SSIIb-2, con los primeros 144 amino-ácidos N-terminales suprimidos de SSIIb (492 amino-ácidos en total) . También se incluye una representación del gen waxy, que codifica GBSS, para comparación. El motivo de amino-ácidos KTGGL, el sitio de unión presunto para ADPGlc, se indica mediante los triángulos. El motivo KTGGL se localiza 18 aminoácidos desde el N-término en GBSS, mientras que el motivo está a 158 amino-ácidos del N-término en SSIIb de maíz. Figura 61. Curvas de temperatura para las enzimas SSl. Todos los componentes de la prueba, excepto la enzima y [U- C] -ADPGlc, se mezcló y luego se pre-incubó a cada temperatura durante 3 minutos antes de la adición de la enzima y de ADPGlc. Para todas las pruebas, la concentración final de [U- C] -ADPGlc fue de 3 mM, mientras que la amilopectina fue de 6 miligramos/mililitro. Cada punto es un promedio de tres determinaciones separadas . Figura 62. Temperatura óptima de SSIIa-1 y SSIIa-2. Todos los componentes de la prueba, excepto la enzima y [U- C] - ADPGlc, se mezclaron y después se pre-incubó a cada temperatura durante 3 minutos antes de la adición de enzima y de ADPGlc. Para las pruebas en presencia de 0.5 M de citrato, se usó como cebador 5 miligramos/mililitro de amilopectina. Para los ensayos sin citrato, se usaron 10 miligramos/mililitro de amilopectina. Para todas las pruebas, la concentración de [U- 14, C] -ADPGlc fue de 3 mM. Cada punto es un promedio de tres determinaciones separadas . Figura 63. Temperatura óptima de SSIIb-1 y SSIIb-2 Todos los componentes de la prueba, excepto la enzima y [U- 4C] -ADPGlc, se mezclaron y después se pre-incubaron a cada temperatura durante 3 minutos antes de la adición de la enzima y de ADPGlc. Para todas las pruebas, la concentración de [U- C] -ADPGlc fue de 3 mM y la concentración de glicógeno fue de 40 miligramos/mililitro. Cada punto es un promedio de tres determinaciones separadas . DESCRIPCIÓN DE LA MODALIDAD PREFERIDA Gen significará la secuencia entera del gen o cualquier mutación o variedad del codón que produce la actividad deseada en el huésped o alternativamente la sección o secciones de la secuencia del gen necesarias para producir la actividad deseada en el huésped. Por ejemplo el gen glgC significará glgCjg, glgCg y otros mutantes que producen la actividad deseada en el huésped. El gen sintasa de almidón significará SS de longitud completa, SS truncado N-terminalmente o SS mutado con actividad sintasa de almidón. Semejante a glicógeno significará un material polisacárido tal como el producido como el producto principal de almidón mediante E. coli en su estado nativo y por sus huéspedes como se muestra en el artículo descrito anteriormente por Hanping Guan. No parecido a glicógeno significará material polisacárido que es semejante al de la planta y no se produce como el producto principal del almidón por E. coli en su estado natural y por los huéspedes como lo muestra el artículo descrito anteriormente por Hanping Guan. Almidón semejante al de la planta es no semejante a glicógeno. Gen transformado significará un gen que está en algún lugar en el linaje de la planta o de la bacteria introducida en la planta por medios diferentes de los naturales . De este modo la progenie del huésped transformado continuará conteniendo un gen transformado. Huésped transformado significará cualquier organismo que contenga uno o más de los plásmidos novedosos y/o una combinación novedosa de los genes sintéticos de almidón comentados en la presente. Dentro de esta solicitud se han empleado varios protocolos diferentes para designar el mismo gen o sintasa. MSS# =* sintasa de almidón soluble de maíz, SS# igualmente significará sintasa de almidón aunque no necesariamente de maíz . STS# también designará sintasa de almidón soluble. GBSS = sintasa de almidón enlazado a granulo.

SBE# = enzima de ramificación de almidón, MBE = enzima de ramificación de almidón de maíz, MSBE# = enzima de ramificación de almidón de maíz, y BE# = enzima de ramificación de almidón. La presente invención a grandes rasgos abarca transformar huéspedes tales como bacterias o plantas con genes sintéticos del almidón de plantas que producen un material no semejante al glicógeno (una bacteria que contiene BEI y BEII a partir del maíz produce un material semejante al glicógeno) .

Las plantas y los organismos que tienen almidón en adelante en la presente se denominarán los huéspedes . Uno de los aspectos primordiales de esta invención es la generación de almidón semejante al de las plantas, a partir de un huésped bacteriano y la producción de almidón alterado en un huésped de planta. La presente invención se ha ejemplificado tanto en bacterias como en plantas de arroz transformadas. El huésped puede contener aunque no es una limitación, un suministro ilimitado de ADPG a partir de la adición del gen glgC (el gen bacteriano) para la planta. Adicionalmente la presente invención abarca plásmidos que contienen los genes de maíz y/o los genes bacterianos en una construcción adaptada para su uso en una bacteria y construcciones adaptadas para su uso en una planta. Los plásmidos en la construcción vegetal preferiblemente contienen un promotor activo reconocido por la planta, un péptido de tránsito, y un sitio de disociación que permite a la proteína disociarse del péptido de tránsito cuando cruza en el amiloplasto en la planta. Los plásmidos usados en la transformación del arroz específicamente abarcaron el promotor zeína de 10 kd de maíz, y el péptido de tránsito del gen SSl de maíz en las construcciones adaptadas para el uso en plantas . La presente invención también abarca la planta que produce el almidón alterado en la sección de almacenamiento de almidón de la planta o dentro de la célula huésped y el mismo almidón alterado. Adicionalmente la presente invención abarca la combinación de varios genes de almidón en combinación que están activos en un huésped de manera que el huésped produce diferentes polisacáridos que no son glicógeno. Todavía además la presente invención abarca un método de hacer almidón semejante al de las plantas en un huésped bacteriano y el método de fabricar almidón semejante al de las plantas (alterado en relación con el tipo o cantidad de almidón que el huésped hace sin las construcciones que contienen los genes) , en una planta. Todavía otro objeto de la presente invención es la adición de un gen que codifica el sustrato de ADPG usado para formar el almidón. La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el mismo huésped que tienen un promotor adaptado para su uso en una planta y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen que codifica para sintasa de almidón I o su forma mutante . La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en una planta y opcionalmente un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen que codifica la sintasa de almidón I o su forma mutante, y cuando menos un gen que codifica la enzima de ramificación transformada en una planta huésped. La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el mismo huésped que tiene un promotor adaptado por su uso en una planta y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen que codifica para sintasa lia o su forma mutante. La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en una planta y opcionalmente un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, y un gen que codifica para la sintasa lia de almidón o su forma mutante, y cuando menos un gen que codifica para ramificar la enzima transformada en una planta huésped. La presente invención abarca un plásmido que tiene un promotor adaptado para su uso en una planta y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen que codifica para sintasa de almidón IIb y su forma mutante. La presente invención también abarca la combinación para un promotor adaptado para su uso en una planta y un gen opcional que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, y un gen que codifica para sintasa Ilb de almidón o su forma mutante y cuando menos un gen que codifica para la enzima de ramificación transformada en una planta huésped. La presente invención abarca un plásmido que tiene un promotor adaptado para su uso en una planta y un gen que codifica para pirofosforilasa, preferiblemente un gen bacteriano, y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes sintasa de almidón I, sintasa de almidón lía, sintasa de almidón Ilb, DU1. La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en una planta y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes sintasa de almidón I, sintasa de almidón lía, sintasa de almidón IIb y DU1, y cuando menos un gen que codifica para enzima de ramificación transformada en una planta huésped. La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el mismo huésped que tienen un promotor adaptado para su uso en una planta y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes sintasa de almidón I, sintasa de almidón lía, Ilb y sintasa de almidón III (DU1) . La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en una planta y un gen opcional que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes sintasa de almidón I, sintasa de almidón lia, Ilb sintasa de almidón III (DU1) , y cuando menos un gen que codifica para enzima de ramificación, y cuando menos un gen que codifica para la enzima de desramificación transformada en planta huésped. La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el huésped que tiene un promotor adaptado para su uso en una bacteria o levadura y un gen que codifi-ca para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen que codifica para sintasa de almidón I. La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en una bacteria o levadura y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen que codifica para sintasa de almidón I, y cuando menos un gen que codifica para enzima de ramificación transformada en un huésped bacteria o levadura. La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el huésped que tiene un promotor adaptado para su uso en una bacteria o levadura y un gen que codifica para pirofosforilasa, preferiblemente un gen bacteriano y un gen que codifica para sintasa de almidón lía. La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en una bacteria o levadura y opcionalmente un gen gue codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen «que codifica para sintasa de almidón lia, y cuando menos un gen que codifica para enzima de ramificación transformada en una huésped bacteria o levadura. La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el mismo huésped que tiene un promotor adaptado para su uso en bacteria o levadura, y un gen de maíz que codifica para sintasa de almidón III (DU1) . La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en una bacteria o levadura y un gen opcional que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y un gen que codifica para sintasa de almidón III, y cuando menos un gen que codifica para ramificar enzima transformada en un huésped bacteria o levadura . La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el mismo huésped que tiene un promotor adaptado para su uso en bacteria o en levadura y un gen, y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes: sintasa de almidón I, sintasa de almidón lia, Ilb, sintasa de almidón III (DU1) . La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en bacteria o en levadura y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes: sintasa de almidón I, sintasa de almidón lia, Ilb, sintasa de almidón III, y cuando menos un gen que codifica para enzima de ramificación transformada en huésped bacteria o levadura. La presente invención abarca un plásmido o combinación de plásmidos en el mismo huésped que tiene un promotor adaptado para su uso en bacteria o en levadura y un gen que codifica para pirofosforilasa ADPGlc, preferiblemente un gen bacteriano, y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes: sintasa de almidón I, sintasa de almidón lia, Ilb, sintasa de almidón III. La presente invención también abarca la combinación de un promotor adaptado para su uso en bacterias o en levadura y un gen que codifica para pirofosforilasa, preferiblemente un gen bacteriano, y genes que codifican para cuando menos uno de los siguientes genes: sintasa de almidón I, sintasa de almidón lia, IIb, sintasa de almidón III (DU1) , y cuando menos un gen que codifica para enzima de ramificación, y cuando menos un gen que codifica para enzima de desramificación transformada en una huésped bacteria o levadura. La presente invención abarca las versiones truncadas del SSl y el SSlI y el gen SSl11 que todavía proporcionan proteína que es suficiente para hacer el polisacárido. Transformando diferentes combinaciones de SS y SBE en HPG204(DE3) o G6MD3 de E. coli que carecen de GS y de GBE, obtenemos la primera evidencia de que las SSl, SSlI y SSI1I demaíz tienen diferente especificidades en el tamaño de glucanos sintetizados véase la Figura 1. En la presente, presentamos el sistema modelo para producir diferentes polisacáridos a partir de huéspedes con SS y SBE en E. coli mediante traslape metabólico. Hemos demostrado que las formas truncadas de SS tienen diferente Vmax, estabilidad de temperatura y propiedades cinéticas (Tabla, Figura) . También hemos demostrado que la transformación de sintasa de almidón y/o enzima de ramificación en E. coli dio como resultado la producción de polisacáridos que difieren en tamaño y estructura. Estos polisacáridos se pueden usar en industrias de los alimentos e industrias que no son de alimentos para reemplazar y/o complementar funcionalidades de almidón. Una gran cantidad de estos polisacáridos se pueden producir con tecnología de fermentación. La biosíntesis del almidón en plantas superiores y de síntesis de glicógeno en E. coli tienen reacciones similares las cuales usan como sustrato adenosina difosfato glucosa (ADPGlc) .

Esta similaridad nos permite usar sintasa de almidón de plantas (SS) y enzima de ramificación de almidón (SBE) para complementar las funciones de la sintasa de glicógeno (GS) y la enzima de ramificación de glicógeno (GBE) en G6MD3 de E. coli, el cual carece de GS y GBE. La transformación del gen glgC de E. coli y del gen de sintasa de almidón de maíz en G6MD3 de E. coli produjo un 1,4 glucano lineal similar a la amilosa. La co-expresión del glgC, la sintasa de almidón de maíz y la enzima de ramificación del maíz produjo polisacáridos ramificados. Sin embargo las distintas propiedades de la enzima de ramificación del almidón de plantas y de la sintasa de almidón hacen posible sintetizar diferentes polisacáridos en E. coli . Mientras que la SSl de maíz preferencialmente sintetiza cadenas cortas (dp 6 - 15) , SSII y SSIII preferencialmente transfieren cadenas largas (dp > 24) y cadenas intermedias (dp 16 - 24) respectivamente. La transformación de diferentes sintasas de almidón de maíz, sintasa de glicógeno de E. coli (glgA) y/o enzimas de ramificación de maíz en HPG96 de E. coli o G6MD3 de E. coli dio como resultado la síntesis de diferentes tamaños de polisacáridos con DP 500-4000. Estos polisacáridos sintetizados en E. coli mediante SS de maíz tienen diferentes propiedades físico químicas que los polisacáridos sintetizados en organismos naturales que incluyen el almidón de fuentes de _ plantas y de glicógeno de animales. El polisacárido se puede usar en industrias de los alimentos e industrias que no son de los alimentos para reemplazar y/o completar las funcionalidades del almidón. Una gran cantidad de estos polisacáridos se puede producir mediante tecnología de fermentación. Se emplearon los siguientes materiales en la construcción de la presente invención algo del material inicial está disponible comercialmente en Novagen en Madision Wisconsin ET-23d(+) DNA bajo el número de catálogo 69748-1 y BL21(DE3) bajo el número de catálogo 69387-1; ET-21a(+) DNA bajo número de catálogo 697401. Plantas Huéspedes Los siguientes plásmidos han sido transformados en plantas de arroz Transgénica 1, MSTSIA (pExs52) y glgCg (pExs66) , MSTSIIa y glgCg (pExs53 y pExs56) . El segundo grupo de transformantes de arroz contiene: MSTSIIc y glgCg (pExs54 y pExs56) . El tercer grupo de transformación: transgénico 5 MSTSIII y glgCg (pExs61 y pExs66) ; transgénico 6 Mwx glgCg pExs65 y pExs66) . Generalmente véanse las Figuras 25-41 para los mapas de plásmidos y las Figuras 43-55 para ver las secuencias usadas en el plásmido. Adicionalmente glgA y glgB y glgC se combinaron y se transformaron en arroz . Esto es combinar la ruta de almidón de las plantas de arroz con el gen que codifica para ADPG y los genes que codifican para cuando menos una de las siguientes enzimas SSl, SSII, SSIII, enzimas de desramificación, BEI, BEII, GBSS (wx) . Estos plásmidos podrían transformarse en otros cereales tales como maíz, trigo, cebada, avena, sorgo, mijo en sustancialmente el plásmido que se muestra en las Figuras para la planta huésped. El promotor podría ser el gen waxy que se publicó, otros promotores zeína adicionales se conocen y se podrían usar como promotor. El promotor usado en la presente se describe en las Figuras 45a y 45b. Adicionalmente estos plásmidos con poco trabajo adicional podrían transformarse en dicotiledóneos tales como papas, papa dulce, taro, camote, yuca, cacahuates, chícharos, frijol de soya, frijoles, garbanzos. El promotor podría seleccionarse para dirigirse al área de almacenamiento de almidón de los dicotolidóneos particulares (algunos son raíces y algunos son tubérculos) . Se conocen en la industria varios métodos de transformar monocotiledóneos y dicotiledóneos y los métodos para transformar los genes no es crítico para la presente invención. El plásmido se puede introducir en Agrobacterium tumefaciens mediante el método de congelación-descongelación de An y colaboradores (1988) , Binary vectors, Plant Molecular Biology Manual A3 , S.B. Gelvin y R.A. Schilperoot, eds (Dordrecht, Países Bajos: Kluwer Academic Publishers), páginas 1-19. La preparación del inoculo de Agrobacterium que lleva la construcción y la inoculación de material de plantas, la regeneración de brotes , y el enraizamiento de brotes se describe en Edwards y colaboradores (1995) . La caracterización bioquímica y molecular de una novedosa sintasa de almidón de papa. Plant J. 8, 283-294.

Adicionalmente se conocen promotores para diferentes dicotolidóneos particularmente 35sCaMV, y Monsanto también ha publicado un promotor que es útil en papas llamado un promotor patatin. Varias monocotiledóneas también son plantas que llevan almidón pero hasta aproximadamente hace una década las monocotiledóneas eran difíciles de desarrollar como transformantes. Los métodos más prominentes de transformación usados actualmente en monocotiledóneas es disparar micro proyectiles en las plantas o usar Agrobacterium y la regeneración posterior de las plantas a partir de los materiales transformados. Ahora se pueden transformar varios tejidos y células con plásmidos en huéspedes monocotiledóneas.

De hecho hay enseñanzas desde hace cuando menos cinco años sobre métodos de transformar no sólo callos sino también cotiledones. Los métodos de transformar plantas y seleccionar los transformantes ya sea con marcadores seleccionables o capaces de tamizarse también son muy conocidos. El uso del marcador en el mismo plásmido y el uso de marcadores en un plásmido separado «que se cotransforma en el huésped también son muy conocidos en la técnica por los expertos . Los métodos de biotecnología de formación de plásmidos y transformación de plantas se enlistan en el libro titulado "Short Protocols In Molecular Biology", tercera edición publicado en 1995 por John Wiley & Sons, Inc. Adicionalmente los métodos de transformación con cañón y con protoplastos se muestra en varias de las patentes otorgadas a Dekalb y Agracetus y a Ciba. OPERACIÓN DE LA MODALIDAD PREFERIDA EJEMPLO 1 Construcción del vector de expresión de E. coli El vector de expresión pExs2 se derivó de pET-23d (Novagen) y pGPl-2 (15) . Los vectores de expresión pExs-trc y pExs-trc3 se derivaron de pTrc99a (Pharmacia) y pGPl-2. El fragmento Bglll/Pstl (2192 pares de bases) que contiene el origen de réplica pBR322 se suprimió de pET-23d y se reemplazó con el fragmento BamHl/PstI (3 kb) que contiene el origen pl5A y el gen de resistencia a la canamicina de pGPl-2. Este proceso generó el plásmido pEXSl que contenía tanto genes de resistencia a la ampicilina como a la canamicina. El gen de resistencia a la ampicilina se inactivo suprimiendo el fragmento Seal / BglI (360 pares de bases, el extremo BglI se llenó y se ligó el extremo romo con el extremo Seal) . La inactivación del gen de resistencia a la ampicilina en pEXSl generó el plásmido de expresión pEXS2, que contenía el promotor T7, el terminador T7, el gen de resistencia a la canamicina y el origen de réplica pl5A. El plásmido pTrc99a fue digerido con Ndel, relleno en el fragmento kelnow y se ligó en el extremo romo para remover el sitio Ndel. Un sitio Ndel se introdujo en el sitio Ncol mediante mutagénesis para generar el plásmido pExs-trc. Los fragmentos Bgll y PvuII (2.48 kb) en pExs-trc que contenían el origen de réplica pBR322 fue reemplazado por Bgll/BamHI (relleno con fragmento de Klenow) el fragmento (3 kb) que contenía el origen pl5A y el gen de resistencia a la canamicina a partir de pGPl-2 para generar pExs-trc2. El gen de resistencia a la ampicilina se inactivo suprimiendo el fragmento Seal / Bgll (360 pares de bases, el extremo Bgll se rellenó y se ligó el extremo romo con el extremo Seal) . La inactivación del gen de resistencia a la ampicilina en pExs-trc2 generó el plásmido de expresión pExs-trc3. Construcción de los plásmidos de expresión para SS de maíz. Para la expresión de SS de maíz en E. coli , el método de reacción de cadena de polimerasa se usó para modificar el N-término de SS de maíz usando los siguientes nucleótidos: cebador Exs4 (5 ' -CAAGAATGCTGCGGGAGTC-3 ' ) , cebador Exs23 (5'-AAGTCGACATATGTGCGTCGCGGAGCTGAGCAG-3 ' ) , cebador Exs57 (5 ' -GGGCC- CCATATGAGCATTGTCTTTGTAACCGG-3 ') , cebador Exsl (5 ' -CTCGGGCCCATA-TGGGGGAGAATGTTATGAA-3 ') , cebador Exs2 (5 ' -GAGGCATCAATGAACACAAA-GTCG-3 ' ) , cebador Exs33 (5 ' -GAAGGGCCCCATATGGCTGAGGCTGAGGCCGGGG-GCAAG-3 ' ) , cebador Exsl6 (5 ' -TTGGATCCATATGGGAGCTGCGGTTGCATTGGG-3') y cebador Exsl7 (5 ' -CCTGCGGGCTCTGGCTTCACC) , cebador Exs55 (5 ' -TTGGATCCATATGAACGTCGTCGTGGTGGCTTC-3 ' ) , cebador 56 (5' -GCAT-ACCATGGAACCTCAACAGC-3 d , cebador Exs53 (5 ' -GGTACCATATGAACGTCGT-CTTCGGCG-3 ' ) , cebador Exs-54 (5 ' -GACAGGCCCGTAGATCTTCTCC-3 ' ) , cebador Exs-wx (5 ' -TTGGTACCATATGGCCAGCGCCGCCGGCATGAACG-3 ' ) . El cebador Exs4 emparejado respectivamente con el cebador Exs23 y Exs57 fue para modificar el N-término del gen SSSI de maíz para generar pExs-10 y pExs-ld. El cebador Exs2 emparejado individualmente con el cebador Exs33 y Exsl fue para modificar el N-término del SSSII de maíz para generar pExs3c y pExs3a. El cebador Exsl7 emparejado individualmente con el cebador Exsl6 y Exs55 fue para modificar el N-término del SSSIII de maíz para generar pExs-9 y pExs-9a. El cebador Exs54 emparejado individualmente con el cebador Exs-wx y Exs53 se usó para modificar el N-término del GBSS de maíz para generar pExs-wx y pExs-wx2. El N-término modificado se recombinó con el resto del gen SS en plásmido pBluescript SK. El reconstruido del SS de maíz se clonó a partir de pBluescript SK para los sitios Ndel/Notl del vector de expresión pET-21a (Novagen) , pExs-trc, pExs-trc3 (se anexan los mapas, la Tabla I muestra la secuencia N-terminal de SSS) . EJEMPLO 2 Construcción de los plásmidos de expresión para pirofosforilasa ADPGlc de E. coli, BE y SBE de maíz Se separó el gen glgB de E. coli del plásmido pOP12 (16) . El fragmento BstXl (lleno) / HindII que contenía el sitio de unión ribosoma glgB y el gen glgB de longitud completa se clonó en el sitio Smal de pBluescriptSK- (Stratagene) . El gen glgB en pBluescriptSK- se clonó posteriormente en pEXS2 en los sitios Xbal / Salí para generar el plásmido pEXSB. El cebador G (5 ' -GAAGATCTGGCAGGGACCTGCACAC-3 ' ) y el cebador H (5'-GGACTAGTGCATTATCGCTCCTGTTTAT-3 ') se usaron para reacción de cadena de polimerasa del gen glgC de E. coli que codifica para pirofosforilasa ADPGlc para el plásmido pOP12. _ Un sitio BglII y un sitio Spel introducido por reacción de cadena de polimerasa al sitio N-terminal y al C-terminal respectivamente, se usaron para clonar el producto de la reacción de cadena de polimerasa en pBluescript SK en los sitios BamHl y Spel. El gen glgC que incluye su propio sitio de unión de ribosoma se subclonó en un plásmido de expresión pEXS2 en el sitio Xbal (relleno con fragmento de Klenow) y el sitio Notl para generar el plásmido pEXSc. Los genes que codifican los SBEI y SBEII maduro de maíz junto con un sitio de unión de ribosoma se subclonaron a partir de plásmidos pET-23d-SBEI y pET-23d-SBEII en el plásmido pEXSc en el sitio Spel para formar los plásmidos pEXSc-SBEI y pEXSc-SBEII. El gen que codifica el SBEII de maíz maduro que incluye un sitio de unión de ribosoma se clonó en pEXSc-SBEI en los sitios Xbal/Notl para formar el plásmido pEXSc-SBEI-SBEII . El gen glgC de E. coli y los genes que codifican SBEI y SBEII de maíz también se clonaron en el plásmido pExs-trc y pExs-trc3 respectivamente y juntos como se describe para pExs2. EJEMPLO 3 Aislamiento del HPG204 de E. coli deficiente en actividades GBE y GS Se usó recombinación homologa para la construcción de la cepa. Esto se hizo de acuerdo con el método descrito por Hamilton y colaboradores (Journal of Bacteriology, 1989, 171:4617-4622) . Un replicón sensible a la temperatura pSClOl se usó para facilitar la selección. El gen que codifica para espectinomicina adeniltransferasa se insertó en los sitios PvuII en el plásmido pOP12 para formar el plásmido HPG9 que tiene resistencia a la espectinomicina y tiene el término C del gen glgB y el N-término del gen glgA suprimido. El fragmento de ADN B=SA= con el gen resistente a la espectinomicina insertado entre glgB y glgA truncados parciales se subclonó en el plásmido pMAK705 en el sitio Xbal que contenía el replicón sensible a la temperatura (Hamilton y colaboradores Journal of Bacteriology, 1989, 171:4617-4622) . Para formar el plásmido pMak705B=SA=. El plásmido pMak705B=SA= se transformó en la célula TGl . Después de que la célula transformada se cultivó en 3 mililitros de LB con 100 miligramos/mililitro de espectinomicina a temperatura ambiente durante la noche, las células se plaquearon en una placa de agar LB que contenía 100 miligramos/mililitro de espectinomicina y se incubaron a 44 °C durante la noche. Se inocularon colonias simples en la placa de agar LB que contenían 100 miligramos/mililitro de espectinomicina y 0.2% de glucosa y se incubaron a 4 °C y 37sC durante la noche. Las colonias a 37 °C se tiñeron con yodo. La colonia con tinción negativa se seleccionó y se cultivó en 100 mililitros de LB a 37 °C durante la noche. Las células se cosecharon y se homogeneizaron en una solución reguladora de extracción para probar las actividades de la sintasa de glicógeno y de enzimas de ramificación. La célula que carecía de actividades glgA y glgB se denominó HPG204 [F=traD36 Lacl^ D(glgBXCA) D (LacZ) M15proA+B+/SupED (hsdM-mcrB) 5 (rk" mk~ McrB") thiD (lac-proAB) , Spectinomicin , Cloranfenicol ] . El juego de lisogenización IDE3 de Novagen se usó para la integración en un sitio específico del profago IDE3 en HPG204 de E. coli para formar HPG204(DE3) de E. coli [El lisado fue preparado con Pl vir y su transducción en BL21 (DE3) de E. coli [F=traD36 Lacl^ D(glgBXCA) D (LacZ) M15proA+B+/SupED (hsdM-mcrB) 5 (rk~ mk~ McrB") thiD (lac-proAB) , SpectinomicinR, Cloranfenicol?R]p EJEMPLO 4 Expresión de SS y SBE de maíz en E. coli El plásmido pExs-2 y pExs-trc3 tiene resistencia a la canamicina y origen de réplica pl5A. Es compatible con el plásmido pET21a, pExs-trc, pTrc99A que contiene el origen pBR322. Los plásmidos de expresión pExs-2 y pET-21a se usaron para expresar SS y SBE en HPG204(DE3) de E. coli . Los plásmidos de expresión pExs-trc y pExs-trc3 se usaron para la expresión en G6MD3 de E. coli . Esto hizo posible transformar diferentes combinaciones de SS y SBE de maíz en HPG204(DE3) o G6MD3 de E. coli , que es deficiente en la actividad GS y GBE. Un cultivo durante la noche de células transformadas con SS y SBE de maíz se diluyó 1:20 (volumen/volumen) en LB fresco que contenía 0.2% de glucosa, 100 miligramos/mililitro de ampicilina y 50 miligramos/mililitro de canamicina. Las células se cultivaron a 37°C durante aproximadamente 2 horas a A600nm =0.6 antes de se indujera la expresión del SBE y/o SS de maíz añadiendo isopropilo b-D-tiogalactosida a 0.5 mM. Después del cultivo a 25 °C durante 4 horas, las células se cosecharon en una centrífuga refrigerada. EJEMPLO 5 Aislamiento de a-glucano altamente ramificado a partir de E. coli El sedimento de células (30 gramos) se resuspendió y se liso mediante sonificación en 150 mililitros de 50 mM de regulador tris-acetato (pH 7.5) gue contenía 10 mM ácido etilendiaminotetra-acético y 5 mM ditioeritritol . Después de que una fracción del homogenado se guardó para probar las actividades de STS y SBE, el homogenado se centrifugó a 20,000g durante 50 minutos a 4°C. Después de recolectar el sobrenadante, el sedimento se resuspendió en 150 mililitros de agua y se hirvió durante 15 minutos con agitación ocasional. La resuspensión se centrifugó a 20,000g durante 30 a temperatura ambiente. Después de recolectar el sobrenadante, el sedimento se lavó de nuevo con 100 mililitros de agua como anteriormente. 0.1 volúmenes de ácido triclórico al 50% (ATC) se añadieron a las fracciones combinadas . Después de almacenar en hielo durante 30 minutos, el precipitado se centrifugó a 15,000g durante 20 minutos, después se lavó con 30 mililitros de ácido triclórico al 5% y se centrifugó como anteriormente . El sobrenadante y el lavado se combinaron y se añadió un volumen de etanol absoluto. Después de almacenar en hielo durante 30 minutos, el polisacárido se recolectó centrifugando a 15,000g durante 15 minutos. El polisacárido se redisolvió en agua y se precipitó con etanol. Este paso se repitió dos veces. El sedimento se lavó dos veces con etanol, dos veces con acetona y se secó sobre gel de silicio a temperatura ambiente.

EJEMPLO 6 Aislamiento de un 1,4 polisacárido lineal a partir de E. coli Resuspender 50 gramos de sedimento de células en 250 mililitros de 50 mM de regulador tris acetato pH 7.5, que contenga 10 mM ácido etilendiaminotetra-acético y 5 mM ditioeritritol. Sonicar durante 3 minutos (45 segundos/vez, salida número 8, repetir 4 veces con 30 segundos de intervalo) . El homogenado se centrifugó a 12,000 rpm (SA1500) durante 50 minutos. El sobrenadante se verifica con tinción de yodo y se descarta. (El mismo 1 mililitro de homogenado y 1 mililitro de sobrenadante para prueba de enzima. El sedimento se resuspende y se extrae en 100 mililitros de dimetilsulfóxido. Se extrae el polisacárido calentando y agitando en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Se deja enfriar hasta debajo de 40 °C y se centrifuga a 12,000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se combina. El aglutinado se extrae dos veces más con 100 mililitros de dimetilsulfóxido . Se añade un volumen igual de etanol absoluto en el sobrenadante combinado, mezclado y almacenado en hielo durante 30 minutos. Se centrifuga a 12,000 rpm durante 30 minutos a 4°C. El sedimento se redisuelve en 20 mililitros de dimetilsulfóxido calentándolo en un baño de agua hirviendo. Se añaden 80 mililitros de agua y se mezclan bien. Después de añadir 10 mililitros de butanol a la solución, la solución se mezcla y se almacena a 0°C durante una hora (mezclando de vez en cuando) . Centrifugar a 12,000 rpm durante 30 minutos a 4°C. Repetir el paso una vez. El sedimento se redisuelve en 90 mililitros de agua caliente calentando en un baño de agua hirviendo. Los materiales insolubles se remueven inmediatamente por centrifugación a temperatura ambiente. Se añaden 10 mililitros de butanol al sobrenadante, se mantiene a 0°C durante una hora y se centrifuga a 12,000 rpm durante 30 minutos a 4°C. Repetir este paso una vez. El precipitado de amilosa se redisuelve en 90 mililitros de agua caliente calentando, y se añaden 10 mililitros de butanol a la solución. Después de almacenar a 40 °C en hielo durante una hora, se centrifuga a 4°C durante 30 minutos. Repetir el paso una vez. El sedimento se redisuelve en 100 mililitros de 10% de butanol mediante calentamiento. La amilosa se almacena a 0°C y se precipita centrifugando a 12,000 rpm durante 30 minutos a 4°C. El sedimento se lava con 25 mililitros de metanol 3 veces y con acetona una vez. Se seca sobre sílica gel. EJEMPLO 7 Pruebas de enzimas 5 mililitros de sobrenadante se usaron para probar actividades STS y SBE como se describió previamente (Preiss) con modificaciones menores. La mezcla de la reacción para STS contenía 100 mM de regulador Bicina, 10 miligramos/mililitro de glicógeno, 0.5 miligramos/mililitro de albúmina de suero bovino, 0.5 M de citrato de sodio, 25 mM de acetato de potasio, 10 mM de GSH, 3 mM [14C] ADPGlc (500 dpm/nmol) y enzima en un volumen final de 0.1 mililitro. La reacción se llevó a cabo a 25 °C durante 15 minutos y terminó por ebullición durante 2 minutos. El [14C] ADPGlc no incorporado se separó con columna de intercambio de aniones Dowex (malla 200-400, Sigma Chemical Co.) . Una unidad de actividad se define como una nmol de Glc incorporada en el a-glucano. por minuto a 25 °C. La actividad SBE se determina por prueba de estimulación fosforilasa. Una unidad de actividad se define como un mmol de Glc incorporado en el a-glucano por minuto a 30°C. EJEMPLO 8 Purificación de enzima Para la purificación de SS recombinante, el sedimento de células se resuspendió en un regulador de sonicación (50 mM Tris-acetato, pH 7.5, 10 mM ácido etilendiaminotetra-acético, y 5 mM ditioeritritol; 7 mililitros de regulador por gramo de masa celular) , y las células se lisaron usando un desmembrador sónico Fisher 550 con 5 x 1 minuto disparos con intervalos de 30 segundos. El homogenado se centrifugó a 9600 g durante 30 minutos. La SSl en el sobrenadante se precipitó añadiendo lentamente sulfato de amonio saturado neutralizado al 40% de 55 saturación. Después de agitar en hielo durante 50 minutos adicionales, las proteínas se recolectaron por centrifugación a 12700 g durante 45 minutos. El sedimento de proteína se redisolvió en un regulador A (50 mM Tris, pH 7.5, 1 mM ácido etilendiamino-tetra-acético, y 5 mM ditioeritritol) que contenía 0.1 M de KCl y se dializó contra el mismo regulador, con un cambio de regulador. Después de la diálisis, la muestra se centrifugó a 13000g durante 20 minutos para remover materiales insolubles. El sobrenadante resultante se cargó sobre una columna de afinidad de amilosa pre-equilibrada con regulador de diálisis, y se recolectó el flujo. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de regulador A que contenía 0.1 M de KCl, y luego con regulador A que contenía 0.5 M de KCl y 0.5 M de maltosa, recolectando fracciones durante ambos lavados. Las fracciones activas se combinaron y dializaron durante la noche contra el regulador A, con un cambio de regulador. El siguiente día, la muestra de columna de amilosa se filtró y aplicó a una columna mono Q 5/5 FPLC (Pharmacia) . Después de lavar con regulador A, se empleó un gradiente de 20 mililitros de 0-0.4 M de KCl. A las fracciones activas se les practicó electroforesis en Gel SDS-PAGE al 8% (31) para determinar la pureza de la SSl en esas fracciones; las fracciones fueron aparentemente homogéneas se combinaron y se concentraron usando una columna de agitación Centricón-30 (Amicón) .

Tabla 1. Expresión de sintasas de almidón de maíz en E.coli BL2KDE3) Plásmidos Genes N-término de sintasa de Proteína Actividad almidón de maíz (mg/ml) específica (U/mg- proteína)* Plásmido pET21a nativo 1.8 0.009 pEXS-3a SSIIa-2 GENVMNVIW 2.8 0.069 pEXS-3c SSIIa AEAEAGGKD 2.8 0.28 pEXS-ld SS1-3 MSIVFVTGEA 3.0 0.23 pEXS-8 SSI-2 GDLGLEPEG 1.9 0.097 pEXS-10 SSl CVAELSREG 1.2 0.043 pEXS-9 SSIIb GSVGAALRSY 1.8 0.515 pEXS-9a SSIIb-2 MNWWASEC 2.6 0.36 pEXS-wx GBSS (waxy) ASAGMNWFV 2 0.033 pEXS-wx2 GBSS (2) MNWFVGAEM 2.2 0.32 * Una unidad de actividad se define como una µmol de glucosa incorporada en un a-l, glucano por minuto a 25°C usando 5 miligramos/mililitro de glicógeno como cebador.

Tabla 2. Propiedades de polisacáridos sintetizados en E.coli Plásmido Protema Actividad Actividad BE Imax DP CL Rendimiento (mg/ml) STS(u/mg (u/mg (nm) (mg. peso seco/g célula proteína) proteína) húmeda) pExsCA 580 700 10.6 3.3 pExsC-9 585 1007 35.8 4.1 pExsC-3a 13.3 .0015 600 983 53 1.0 pExsC-8 12.6 .0032 580 435 31.8 7.4 pExsC-wx 15.2 0.002 600 836 15.6 9.1 pExsC-I-II + pExs9 7.84 0.08 4.71 480 2333 19 30 pExsC-I-II + pExs3a 13.61 0.011 1.56 530 3616 22 36 pExsC-I-II + pExsd 11.95 0.042 3.33 525 1689 17.5 131 pExsC-I-II + pExslO 8.9 .0094 3.65 500 3174 16.6 24.5 pExsC-I-II + pExswx 11.7 .007 5.4 450 2970 14.8 33.8 pExsC-I-II + pExsAl 11 0.13 4.48 475 3940 14 28.9 Tabla 3. Propiedades enlistadas por grado de DP de polisacáridos sintetizados en E.coli Plásmido Protema Actividad Actividad BE Imax DP CL Rendimiento (mg/ml) STS(u/mg (u/mg (nm) (mg. peso seco/g célula proteína) proteína) húmeda) pExsC-I-II + pExsAl 11 0.13 4.48 475 3940 14 28.9 pExsC-I-II + pExs3a 13.61 0.011 1.56 530 3616 22 36 pExsC-I-II + pExslO 8.9 .0094 3.65 500 3174 16.6 24.5 pExsC-I-II + pExswx 11.7 .007 5.4 450 2970 14.8 33.8 pExsC-I-II + pExs9 7.84 0.08 4.71 480 2333 19 30 pExsC-I-II + pExs8 11.95 0.042 3.33 525 1689 17.5 131 pExsC-9 585 1007 35.8 4.1 pExsC-3a 13.3 .0015 600 983 53 1.0 pExsC-wx 15.2 0.002 600 836 15.6 9.1 pExsCA 580 700 10.6 3.3 pExsC-8 12.6 .0032 580 435 31.8 7.4 Tabla 4. Propiedades enlistadas por grado de ?max de polisacáridos sintetizados en E. coli Plásmido Protema Actividad Actividad BE Imax DP CL Rendimiento (mg/ml) STS(u/mg (u/mg (nm) (mg. peso seco /g célula proteína) proteína) húmeda) pExsC-3a 13.3 .0015 600 983 53 1.0 pExsC-wx 15.2 0.002 600 836 15.6 9.1 pExsC-9 585 1007 35.8 4.1 pExsCA 580 700 10.6 3.3 pExsC-8 12.6 .0032 580 435 31.8 7.4 pExsC-I-II + pExs3a 13.61 0.011 1.56 530 3616 22 36 pExsC-I-II + pExs8 11.95 0.042 3.33 525 1689 17.5 131 pExsC-I-II + pExslO 8.9 .0094 3.65 500 3174 16.6 24.5 pExsC-I-II + pExs9 7.84 0.08 4.71 480 2333 19 30 pExsC-I-II + pExsAl 11 0.13 4.48 475 3940 14 28.9 pExsC-I-II + pExswx 11.7 .007 5.4 450 2970 14.8 33.8 Tabla 5. Propiedades enlistadas por grado de CL de polisasáridos sintetizados en E. coli Plásmido Proteína Actividad Actividad BE Imax DP CL Rendimiento (mg/ml) STS(u/mg (u/mg (nm) (mg. peso seco/g célula proteína) proteína) húmeda) pExsC-3a 13.3 .0015 600 983 53 1.0 pExsC-9 585 1007 35.8 4.1 pExsC-8 12.6 .0032 580 435 31.8 7.4 pExsC-I-II + pExs3a 13.61 0.011 1.56 530 3616 22 36 pExsC-I-II + pExs9 7.84 0.08 4.71 480 2333 19 30 pExsC-I-II + pExsd 11.95 0.042 3.33 525 1689 17.5 131 pExsC-I-II + pExslO 8.9 .0094 3.65 500 3174 16.6 24.5 pExsC-wx 15.2 0.002 600 836 15.6 9.1 pExsC-I-II + pExswx 11.7 .007 5.4 450 2970 14.8 33.8 pExsC-I-II + pExsAl 11 0.13 4.48 475 3940 14 28.9 pExsCA 580 700 10.6 3.3 Tabla 6. Tablas de purificación para SSI-1, SSI-2, y SSI-3 SSI-1 volumen proteína actividad unidades purificación (ml) total mg U/mg totales (veces) Homogeneizado 630 4347 0.018 76.2 1 Sobrenadante 570 2622 0.020 53.0 1.1 0-40% (NH4)2S04 48 494 0.058 28.7 3.2 Columna amilosa 17 2.6 5.03 1 1.3 279 Columna monoQ 0.27 0.26 12.2 3.2 677 SSI-2 volumen proteína actividad unidades purificación (mi) total nig. U/mg totales (veces) Homogeneizado 380 2797 0.0356 99.6 1 Sobrenadante 320 21 18 0.0340 72.0 1 0-40% (NH4)2S04 48 466 0.133 61.8 3.7 Columna de amilosa 17.5 1.2 22.6 26.5 634 Columna monoQ 1.0 0.325 17.2 5.6 483 SSI-3 volumen proteína actividad unidades purificación (ml) total mg. U/mg totales (veces) Homogeneizado 1300 16770 0.23 3900 1 Sobrenadante 1100 9790 0.31 3080 1.3 0-40% (NH4)2S04 237 2204 1.5 3294 6.5 Columna de amilosa 63 30 22.4 668 97 Columna monoQ 3.6 3.1 30.5 93 132 66 Notas : Las pruebas realizadas durante el curso de la purificación contenían 10 miligramos/mililitro de glicógeno y 3 mM de [U- C] -ADPGlc. Los ensayos se realizaron a temperatura ambiente en presencia de 0.5 M de citrato . Una unidad = 1 µmol [U- C] -glucosa transferida por minuto.

Tabla 7. Cinética de Cebador para enzimas SSl Amilopectina SSI-3 SSI-2 SSI-1 + citrato 1^ 240 ± 45 230 ± 50 150 ± 40 V,max 26.3 ± 0.5 33.4 ± 2.1 22.5 ± 0.6 citrato 230 ± 60 68 ± 3 120 ± 20 Vmax 13.2 ± 0.3 9.94 ± 0.18 7.62 ± 0.99 Glicógeno SSI-3 SSI-2 SSI-1 + citrato dVma? 43.4 ± 2.5 45.6 ± 3.3 39.0 ± 2.2 - citrato aV_,av 41.4 ± 2.9 45.5 ± 1.5 26.1 ± 1.4 Notas : Los ensayos se realizaron a 37°C como se describe en materiales y métodos . Los datos se expresaron como el promedio de tres determinaciones independientes junto con la desviación estándar. K^ se expresa como el cebador microgramo/mililitro y Vma? está en µmol/minuto/miligramo de proteína. ADPGlc = 3 mM en todas las pruebas . aDebido a que las concentraciones de glicógeno saturado no podrían obtenerse, se usó un estándar de glicógeno 20 miligramos/mililitro para comparar las velocidades de enzima para ese cebador.

Tabla 8. Cinéticas de ADPGlc para enzimas STSI. Las pruebas y la evaluación de los datos están como en la Tabla II. Kj^ se expresa como mM de ADPGlc y Vm está en micromoles/minuto/miligramo de proteína. Se usaron 5 miligramos/mililitro de amilopectina como cebador para todas las pruebas . SSI-3 SSI-2 SSI- 1 + citrato 1^ 0.33 ± 0.07 0.32 ± 0.02 0.18± 0.02 Vm, 26.4 ± 1.4 32.6 ± 0.8 18.0 ± 0.5 citrato 1^ 0.62 ± 0.04 0.25 ± 0.04 0.24 ± 0.02 Vm, 14.7 ± 1.3 11.7 ± 0.7 6.38 ± 0.88 Tabla 9. Tablas de purificación para enzimas SSIIa. Las pruebas para la purificación de SSIIa-2 contenían 10 miligramos/mililitro de glicógeno y 1.5 mM de [U- UrC] -ADPGlc (ambas están a concentraciones de saturación) . Las pruebas para la purificación de SSIIa-1 contenían 5 miligramos/mililitro de amilopectina y 3 mM de [U- 4C] -ADPGlc .

Las pruebas se realizaron a temperatura ambiente en presencia de 0.5 M de citrato. 1 unidad = a 1 micromol de [U- C] -glucosa transferida por minuto. SSIIa-2 volumen proteína actividad unidades purificación (mi) total mg. U/mg totales (veces) Sobrenadante 300 1620 0.0216 34.8 1 0-40% (NH4)2S04 53 419 0.0606 25.4 2.8 Columna de amilosa 20 9.3 0.991 9.3 45.9 Columna monoQ 0.9 0.94 4.81 4.5 222 SSIIa-1 volumen proteína actividad unidades purificación (ml) total mg. U/mg totales (veces) Sobrenadante 335 2613 0.28 737 1 0-40% (NH4)2S04 47 427 0.96 409 3.4 Columna de amilosa 25 11.5 8.04 92 28.7 Columna monoQ 1.0 4.8 9.10 44 32.5 Tabla 10. Cinéticas de Cebador para enzimas SSIIa. Se realizaron las pruebas como se describe en materiales y métodos . Los datos se expresan como el promedio de tres determinaciones independientes junto con la desviación estándar. 1^ se expresa en microgramos/mililitro y Vma? está en micromol/minuto/miligramo de proteína. ADPGlc = 3 mM en todas las pruebas. *NA = no aplicable; la enzima no se pudo saturar mediante cebador bajo estas condiciones. Amilopectina SSIIa-2 SSIIa-1 + citrato 27°C ^ 153 ± 22 182 ± 38 Vma_ 7.82 ± 0.63 24.1 ± 0.5 Vma? 15.4 ± 0.6 41.1 ± 0.2 - citrato 27°C K^ 234 ± 30 404 ± 33 Vmax 4.31 ± 0.32 10.5 + 0.3 37°C 1^ 1350 ± 220 -NA* vmax 7-84 ± °-25 ~NA* Glicógeno SSIIa-2 SSIIa-1 + citrato 27°C 1^ 50.7 ± 3.8 162 ± 17 Vmax 5.53 ± 0.44 14.2 ± 0.7 37°C KJJJ 76.9 ± 7.8 350 ± 11 vmax 11.3 ± 0.7 31.6 ± 0.8 Tabla 11. Cinéticas de ADPGlc para enzimas SSIIa. Las pruebas y las evaluaciones de datos son como en la Tabla II. La concentración del cebador en cada caso se saturó para cada enzima y se determinó mediante experimentos detallados en la Tabla II. Kj^ se expresa como mM de ADPGlc y Vma? está en micromol/minuto/miligramo de proteína. *NA = no aplicable, ya que la enzima no se pudo saturar por cebador bajo estas condiciones .

Con amilopectina como cebador SSIIa-2 SSIIa-1 + citrato 27°C Kj^ 0.17 ± 0.04 0.48 ± 0.09 Vma? 4.83 ± 0.42 23.0 ± 2.5 37°C 1^ 0.28 ± 0.01 0.83 ± 0.08 vmax 11-4 ± 0.6 49.1 ± 2.6 citrato °C Km 0.27 ± 0.02 0.46 ± 0.06 vmax 4.87 ± 0.25 12.1 ± 0.8 V, max 7.86 ± 0.53 -NA* Con glicógeno como Cebador con SSIIa-2 SSIIa-l glicógeno + citrato 27°C Km. 0.16 ± 0.03 0.19 ± 0.02 vm, ax 4.41 ± 0.21 17.1 ± 0.7 37°C Km 0.15 ± 0.03 0.37 ± 0.04 vm, ax 7.60 ± 0.94 40.1 ± 1,7 Tabla 12. Tablas de purificación para SSIIb-2 y SSIIb-1. Las pruebas realizadas durante el curso de la purificación contenían 10 miligramos/mililitro de glicógeno y 3 mM de [U- C] de ADPGlc. Las pruebas se realizaron a temperatura ambiente en presencia de 0.5 M de citrato. Una unidad = 1 micromol [U- C] de glucosa transferida por minuto. SSIIb-2 volumen proteína actividad unidades purificación (ml) total nig. U/mg totales (veces) Sobrenadante 890 9256 0.48 4450 1 0-40% (NH4)2S04 190 2660 1.24 3306 2.6 Columna de amilosa 13 31.2 50.6 1573 105 Columna monoQ 6.6 16.3 56.8 939 118 SSIIb-1 volumen proteína actividad unidades purificación (mi) total mg. U/mg totales (veces) Sobrenadante 365 2336 0.64 1533 1 0-40% (NH4)2S04 56 436 2.35 1030 3.7 Columna de amilosa 80 10.4 50.2 521 78 Columna monoQ 0.6 0.28 60.6 17.6 94 Tabla 13. Cinéticas de las enzimas SSIIb. Las pruebas se realizaron a 37 °C como se describe en materiales y métodos. Los datos se expresaron como promedio de tres determinaciones independientes junto con la desviación estándar. Para la cinética de /ADPGlc, Km se expresó en 3 mM de ADPGlc. Para cinética de cebador, Km se expresó como miligramo/mililitro de cebador, y 3 mM de ADPGlc se usaron en los ensayos. vmax est^ en micromol/minuto/miligramo de proteína. Cinéticas de ADPGlc SSIIb-2 SSIIb-1 con glicógeno K m 0.32 ± 0.04 0.71 ± 0.01 vmax 130 ± 6 76.8 ± 3.2 con amilopectina TTl 0.32 + 0.03 0.40 ± 0.02 v, max 90.9 ± 4.2 72.8 ± 2.8 Cinética de Cebador SSIIb-2 SS Ib-1 glicógeno KJQ 0.36 ± 0.02 0.43 ± 0.02 vmax 120 ± 3 79.5 ± 3.3 amilopect na KJJJ 0.26 ± 0.04 0.074 ± 0.008 Vmax 84.5 ± 2.4 67.9 ± 1.7 Tabla 14. Comparación de datos cinéticos para SS expresadas.

Los datos para SSl y SSIIa son de Imparl-Radosevich y colaboradores 1998; Imparl-Radosevich J>, Li P, McKean Al, Keeling PL, y Guan HP, presentada para publicación. K^ para amilopectina y glicógeno se expresa en miligramos por mililitro Kßß para ADPGlc está en mM ' y se determinó en la presencia de amilopectina y 0.5 M de citrato. vmax está en micromol/minuto/miligramo. El 1^ para glicógeno para SSl no pudo determinarse como concentraciones de saturación de glicógeno ya que no se pudo alcanzar para esta enzima.

P a r ám e t r o SSI-3a' SSI- SSIIa-2a SSIIa-l" SSIIb-2a SSIIb-1 cinético KJJJ para 0.24 0.15 0.13 0.15 0.26 0.07 amilopectina Km para 0.077 0.35 0.36 0.43 glicógeno Km para 0.33 0.18 0.28 0.83 0.32 0.40 ADPGlc V„,ov (con 26.3 22.5 15.4 41.1 84.5 67.9 amilopectina) Vmax (con 43.4 39.0 11.3 31.6 120 79.5 glicógeno) adenota forma de SS N-terminalmente truncada, mientras que cualquier SS con la designación SS-1 es la versión de longitud completa de la SS .

Tabla 15. Las actividades de sintasa de almidón de las enzimas quiméricas. La generación de enzimas quiméricas de sintasa de almidón de maíz: recombinación de extensiones N-terminales con dominios catalíticos C-terminales de la sintasa de almidón El gen que codifica para las extensiones N-terminales de STSI, STSIIa y STSIIb se insertaron, en la misma orientación (+) o inversa (-) de la secuencia de ADN N-terminal original, enfrente de los dominios catalíticos C-terminales de WX2, STSIIa y STSIIb, respectivamente Las enzimas quiméricas expresaron en E. coli y las actividades se probaron.

* NI: STSI extensión N-terminal; N2:STSIIa extensión N-terminal; N3 : STSIIb extensión N-terminal; WX2 : WX2 dominio catalítico C-terminal; C2 : STSIIa dominio catalítico C-terminal; C3 : STSIIb dominio catalítico C-terminal. * (+) : las extensiones N-terminales se insertaron enfrente del dominio catalítico C-terminal en la misma orientación; (-) : las extensiones N-terminales se insertaron enfrente de los dominios catalíticos C-terminales en orientación inversa. * actividad enzimática de sintasa de almidón: nmol/minuto/miligramo de proteína. * actividad residual de la sintasa de glicógeno de BL21 (DE3) es 2.6 nmol/minuto/miligramo de proteína. * NR = no recombinante .

Las fotografías enlistadas en las Figuras 42 y 21 intentan mostrar las diferencias visuales que están presentes en los almidones en comparación con aquéllos conocidos en la técnica. Descripción del almidón Almidón de maíz es un gel lechoso, ligeramente espeso que es ligeramente si lo es fluible. Almidón de arroz forma dos niveles, el nivel superior es un jarabe espeso con consistencia más fluible que la del almidón de maíz (menos pegajoso que el almidón de maíz) de color lechoso opaco (más translúcido que el almidón de maíz en este nivel) y un nivel inferior el cual es un glóbulo muy blanco que no transmite mucha luz a través de este nivel inferior de material. Este nivel inferior está formado de una masa muy espesa y no parece fluible.

Amilopectina de maíz es ligeramente menos blanca que el nivel superior del almidón de maíz y es de un color muy ligeramente opaco lechoso (más translúcido que el almidón de maíz) ligeramente menos fluible que el nivel superior del arroz . Dextrina de papa es el más transparente casi parece claro pero todavía es blanco opaco y es muy fluible pareciendo solamente menos fluible que el agua. Almidón de maíz waxy fluirá lentamente y tendrá la consistencia de la miel. El color es muy opaco transmite poca luz y el color sólo es ligeramente menos claro que el almidón de maíz . Almidón SSl hecho de plásmido pExs-8 tiene dos niveles diferentes. El nivel superior parece claro y ligeramente más espeso que la fluidez del agua. El nivel inferior aparece como un precipitado. Esta muestra se parece a los adornos que contienen pequeñas figuras y hojuelas de plástico que parecen copos de nieve. Como estos adornos cuando se voltea de cabeza la muestra parece que cae nieve. Sin embargo las hojuelas en esta muestra parecen ser ligeramente gomosas y aparecen en los primeros momentos del nivel de mezclado para formar un líguido blanco opaco. Almidón SSl hecho de un huésped que contiene los siguientes dos plásmidos pExsC BEI BEII y pExsd no es tan claro como el nivel superior del pExs-8 y parece ligeramente menos espeso que el pExs-8. Tiene más fluidez que la dextrina de papa. Almidón SSlIb hecho de un huésped que contiene los siguientes dos plásmidos pExsC BEI BEII y pExs-9 no es tan claro como el nivel superior de pExs-8 y parece ligeramente menos espeso que pExs-8. Tiene más fluidez que la dextrina de papa. Almidón WAXY hecho de un huésped que contiene los siguientes dos plásmidos pExsC BEI BEII y pExs-wx no es tan claro como el nivel superior de pExs-8 pero parece tener hebras muy pequeñas como cadenas que se asientan en el fondo y cuando se mezclan dan al material un color ligeramente más blanco y parece ligeramente menos espeso que pExs-8. Tiene aún más fluidez que la dextrina de papa. Almidón SSlI hecho de un huésped que contiene los siguientes dos plásmidos pExsC BEI BEII y pExs-3a es del color del almidón de maíz y tal vez ligeramente más blanco pero no tan blanco como el nivel inferior de pExsd y definitivamente transmite más luz a través y tiene la fluidez característica de pExs-8 cuando se mezcla. Almidón glgA parece tener un precipitado muy ligero y es comparable en color a la pectina amilosa de maíz y ExsC BEI BEII y pExs-wx. La fluidez está entre la amilosa de maíz y pExsC BEI BEII pExs-wx. Las muestras de polisacáridos enlistadas anteriores forman grupos generalmente de acuerdo con el color como sigue: el almidón de maíz waxy y el almidón de maíz y pExsC BEI BEII pExs3a y pExscd son el grupo más blanco. Las características de fluidez de este grupo son bastante diferentes . Con el almidón de maíz una masa y el almidón de maíz waxy solamente ligeramente fluible y pExsC BEI BEII y pExs-3a y pExsC-8 más como agua que jarabe. El segundo grupo contiene amilopectina de maíz y pExsC BEI BEII pExs-wx y pExsC BEI BEII y pExs-Al que son menos blancos y más claros. La fluidez de la amilopectina de maíz es menor que los otros dos miembros de este grupo pero todavía es similar. El último grupo es el menos blanco y por lo tanto el más claro. Este grupo incluye pExsC BEI BEII y pExs-8, dextrina de papa, pExsC BEI BEII y pExs-10, pExsC BEI BEII y pExs-9. La fluidez de este grupo también es similar al otro. Plantas Huéspedes . Los siguientes plásmidos se han transformado en plantas de maíz. La secuencia para el gen glgC mutante se muestra en la Figura 46. Los plásmidos se hacen sustancialmente de manera similar como se describe anteriormente para la producción del plásmido bacteriano. Claramente los mapas de plásmidos mostrados en las Figuras 25-41 y esta solicitud y los protocolos enlistados en resumen permiten que una persona con experiencia ordinaria en la técnica haga los presentes plásmidos. Las siguientes combinaciones de plásmidos se han transformado en plantas de arroz . Combinaciones adicionales del plásmido incluyen la combinación que incluye todos los genes de maíz SSl, SSlI, SSII, BEI, BEII, y GBSS en un huésped o alternativamente en dos huéspedes que se cruzan para formar un híbrido que tenga el complemento entero o genes de almidón regulados hacia arriba se están desarrollando. Claramente una persona con experiencia ordinaria en la técnica podría haber colocado las secuencias en posiciones antisentido para regular hacia abajo estos genes al grado en que los genes de maíz regulan hacia abajo los genes de arroz parcialmente homólogos . El primer grupo del transgénico es el grupo 1, que incluye los transformantes de arroz (transformados por bombardeo de microproyectiles) que contienen MSTSI-2 (pExs52) y glgC3 (pExs66) , MSTSIIa-2 y glgC3 (pExs53 y pExs56) . El segundo grupo de transformantes de arroz contiene MSTSIIa y glgCg (pExs54 y pExs56) . El tercer grupo de transformación contiene el transgénico 5 MSTSIIb y gl Cg (pExs61 y pExs66) ; el transgénico 6 de maíz wx y glgCg pExs65 y pExs66. Adicionalmente glgA y glgB y glgC se combinan y se transforman en arroz. Este último transformante es combinar la ruta de almidón de las plantas de arroz con el gen que codifica para pirofosforilasa ADPG y los genes bacterianos. La combinación de los plásmidos que codifica para cuando menos las siguientes enzimas, SSl, SSIIa, SSIIb, SSIII, enzimas de desramificación BEI, BEII, GBSS (wx) y algunas o todas de los genes de almidón bacteriano también es útil . Actualmente hay más de 300 transformantes en el invernadero. Las plantas de arroz transgénico TI han sido seleccionadas y caracterizadas (Figura 56, 57) . 12 plantas han expresado con éxito el maíz SSI-2 en semillas de arroz. 21 plantas han expresado con éxito SSIIb de maíz en semillas de arroz. Actualmente hemos seleccionado plantas de arroz reguladas hacia abajo con la expresión SS de arroz mediante la co-supresión y tenemos 400 plantas T2 en el invernadero. Sintasa de almidón de maíz y sus formas mutantes . Con el fin de caracterizar las formas múltiples de la sintasa de almidón de maíz, los genes que codifican la SS de longitud completa y sus formas N-terminalmente truncadas se expresaron en E. coli . Las enzimas recombinantes se purificaron y se caracterizaron cinéticamente. Hemos demostrado que diferentes isoformas y sus formas truncadas todas tienen propiedades diferentes (Tabla 6-14, Figura 58-63). Las actividades específicas (Vmax) de las SSI-1, SSI-2, y SSI-3 de maíz purificadas fueron 22.5, 33.4 y 26.3 mol glc/min/mg de proteína respectivamente. Los resultados claramente han indicado que el centro catalítico de SSl no se localiza en su extensión N-terminal. Sin embargo, el truncamiento N-terminal disminuyó la afinidad de la enzima para la amiloptectina, con la 1^ para amilopectina de los SSl-3 truncado siendo aproximadamente 60% a 90% mayor que el de SSI-1 de longitud completa. Los efectos del truncamiento N-terminal de SSlla dependen de las condiciones de la prueba usadas . Tanto para SSIIa-1 como para SSIIa-2, la ma? de cada enzima aumentó dos veces después de elevar la temperatura de la prueba de 27 °C a 37°C (Tablas II y III) . Sin embargo, el efecto de la temperatura en la afinidad ADPGlc fue diferente para SSlla-1 y SSIIa-2. Para SSIIa-2 truncado, el 1^ para ADPGlc no se afectó elevando la temperatura. En cambio, el I-, de ADPGlc para el SSIIa-1 de longitud completa presunto aumentó dos veces después de elevar la temperatura de la prueba de 27°C a 37 °C (Tabla III) . De manera interesante, el SSIIa-2 truncado exhibió un 1^ más bajo para ADPGlc que lo que lo SSlla-1 hizo en todas las condiciones de prueba usadas en este estudio excepto que mostraron valores similares de Km para ADPGlc cuando se usó glicógeno como un cebador a 27°C. Aunque el truncamiento de N-terminal SSIIa parece bajar el K^ de ADPGlc bajo la mayoría de las condiciones de prueba, debe notarse que la velocidad máxima del SSIIa-2 truncado disminuye aproximadamente de 2 a 4 veces en comparación con SSIIa-1. Se encontró que el SSIIb-2 truncado era más estable en temperatura que el SSIIb-1 más largo en presencia de citrato, aunque se observó poca diferencia en sus perfiles de actividad pH. Aunque el SSIIb-1 de longitud completa presunto mostró una Vma? similar usando amilopectina o glicógeno como cebador, el SSIIb-2 N-terminalmente truncado mostró un incremento del 40% en Vm„v usando glicógeno en comparación con amilopectina como cebador. El truncamiento N-terminal de SSIIb aumentó su ma? en 25% con amilopectina como cebador. También hemos demostrado que las enzimas quiméricas de sintasa de almidón de maíz (combinando el dominio C-terminal de SS con diferentes secuencias N-terminales de SS o secuencias no relacionadas produciría una enzima funcional con actividad SS y. propiedades alteradas) (Tabla 15) . Conclusiones, ramificaciones y alcance De conformidad con lo anterior, se puede ver que, de conformidad con la invención, los genes de almidón pueden producir almidón nuevo y alterado ya sea en planta huésped o bacteriano. Adicionalmente, polisacáridos muy similares al almidón de maíz se pueden producir en huésped bacteriano. Aunque la descripción anterior contiene muchas especificaciones, esto no deberá considerarse limitante del alcance de la invención sino únicamente proporcionar ilustraciones de algunas de las modalidades actualmente preferidas de esta invención. Varias otras modalidades y ramificaciones son posibles dentro de su alcance. Por ejemplo se pueden hacer diferentes combinaciones de los plásmidos en algún huésped para la producción de plantas y de granos útiles y de polisacáridos útiles. De este modo el alcance de la invención deberá determinarse por las reivindicaciones anexas y sus equivalentes legales, en vez de por los ejemplos dados. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan en la presente por completo mediante referencia.

Claims (38)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES 1. Un método para la producción de polisacáridos que no son semejantes a glicógeno en un huésped que comprende: (a) transformar un huésped capaz de ser usado en un proceso de fermentación, con genes seleccionados del grupo que produce enzimas que sintetizan almidón, enzimas que sintetizan glicógeno de manera que el huésped produce almidón que no es semejante a glicógeno, y (b) emplear el huésped en un proceso de fermentación en donde e-l proceso de fermentación produce polisacáridos .
2. 2. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 caracterizado porque el huésped es una bacteria.
3. 3. Un huésped transformado para transportar un gen activo en la producción de glicógeno, y cuando menos un gen de ramificación que no sea de almidón activo en la producción de cuando menos uno de los siguientes polisacáridos amilopectina y amilosa en el huésped original .
4. 4. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 caracterizado porque el huésped es una monocotiledónea.
5. 5. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 caracterizado porque el huésped es una dicotiledónea.
6. 6. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 caracterizado porque el huésped es una planta.
7. 7. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 caracterizado porque el huésped es una bacteria.
8. 8. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 caracterizado porque el huésped es una planta que tiene un cereal.
9. 9. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 en donde el gen bacteriano se selecciona del grupo que consiste en gen glgC, gen glgA, gen glgB.
10. 10. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 en donde cuando menos un gen de ramificación que no sea de almidón activo en la producción de cuando menos uno de los siguientes polisacáridos amilopectina y amilosa en la planta original se selecciona del grupo que consiste en genes sintasa de almidón soluble I, II, III y el gen de enzima de desramificación (de Cul) el gen CBSS, el gen SH2 y el gen BT2.
11. 11. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3 , que incluye cuando menos uno de los genes de enzima de ramificación de almidón.
12. 12. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11, que incluye el gen de enzima de ramificación de almidón BEI .
13. 13. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11, que incluye el gen de enzima de ramificación de almidón BEII.
14. 14. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 12, que incluye el gen de enzima de ramificación de almidón BEII.
15. 15. Un huésped transformado para llevar un gen activo en la producción de ADPG, y cuando menos un gen de almidón activo en la producción de cuando menos uno de los siguientes polisacáridos: amilopectina y amilosa en su huésped original en donde el huésped produce polisacáridos que son almidón semejante al de las plantas y no son semejantes al glicógeno.
16. 16. Un huésped transformado para llevar un gen pirofosfatasa, gen glicógeno sintasa.
17. 17. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el gen activo en la producción de glicógeno es un gen bacteriano.
18. 18. Un huésped deficiente en su capacidad de sintetizar alfa 1,4 glucano y capacidad de la enzima de ramificación alfa 1,4-1,6 transformada para expresar cuando menos un gen de síntesis de almidón soluble de planta.
19. 19. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18 que incluye ser transformado para expresar cuando menos un gen que codifica la enzima de desramificación.
20. 20. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizado porque el gen está codificando para la enzima sintasa soluble de almidón I .
21. 21. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizado porque el gen está codificando para la enzima sintasa soluble de almidón II.
22. 22. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizado porque el gen está codificando para la enzima sintasa soluble de almidón III.
23. 23. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18 que incluye ser transformado para expresar cuando menos un gen que codifica para la enzima de ramificación del almidón .
24. 24. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima de ramificación de almidón es BEI .
25. 25. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 23 caracterizado porque la enzima de ramificación de almidón es BEII.
26. 26. Un plásmido caracterizado porque el plásmido está en un huésped portador y el plásmido contiene el gen SSII con el N-término GENVMNVIW en donde el gen tiene aproximadamente 1561 pares de bases de longitud.
27. 27. Un plásmido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 caracterizado porque el huésped es un huésped bacteriano.
28. 28. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el huésped es una E. coli de tipo silvestre.
29. 29. Un nuevo polisacárido producido por un huésped transformado que comprende: el huésped que tiene un tipo silvestre, el tipo silvestre del huésped no produce el nuevo polisacárido, el huésped transformado que expresa cuando menos dos genes de síntesis de almidón exógenos, los genes se seleccionan de un grupo que consisten en genes de síntesis de almidón soluble tales como SSl SSII, SSIII, caracterizado porque el huésped transformado es capaz de producir el nuevo polisacárido .
30. 30. El nuevo polisacárido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 29 caracterizado porque el huésped también expresa los genes exógenos seleccionados del siguiente grupo «que consiste en genes que inducen glicógeno bacteriano.
31. 31. El nuevo polisacárido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 29, caracterizado porque el huésped también expresa los genes exógenos seleccionados del siguiente grupo que consiste en enzimas de enlace de granulo de planta.
32. 32. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el huésped es hongo.
33. 33. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 32 caracterizado porque el huésped es levadura.
34. 34. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los genes que sintetizan glicógeno incluyen los genes glgC, glgA, glgB.
35. 35. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los genes que producen enzimas de síntesis de almidón incluyen genes que codifican para las sintasas solubles de almidón I, II, III.
36. 36. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los genes que producen enzimas que sintetizan almidón incluyen genes que codifican enzima de desramificación y enzimas de ramificación.
37. 37. El nuevo polisacárido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porgue los genes gue inducen glicógeno bacteriano se seleccionan del grupo que consiste en glgC, glgA, glgB .
38. 38. El nuevo polisacárido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 29 caracterizado porque los genes de síntesis de almidón se seleccionan del grupo que consiste en BEI y BEII.