MXPA99008515A - Vectores adenovirales recombinantes y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepática, renal, pulmonar y cicatrices hipertróficas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un vector adenoviral recombinante o plásmido que contiene un genoma adenoviral con las regiones E1 y E3 deletadas, dicho vector o plásmido también contiene un gen terapéutico o una secuencia de ADN de interés regulada por promotores ubicuotos y/o promotores específicos de tejido, que codifica para una proteína terapéutica que consiste de la proteína de MMP-8 latente o activa, asítambién la invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden el vector adenoviral recombinante o el plásmido y sus usos farmacéuticos para el tratamiento de cirrosis hepática, fibrosis pulmonar y cicatrices hipertróficas.

Description

"VECTORES ADENOVIRALES RECOMBINANTES Y SU UTILIDAD EN EL TRATAMIENTO DE DIVERSOS TIPOS DE FIBROSIS HEP TICA, RENAL, PULMONAR Y CICATRICES HIPERTRÓFICAS" CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la construcción de vectores adenovirales recombinantes que portan genes exógenos que codifican para proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de cirrosis hepática y fibrosis generalizada, como fibrosis renal, fibrosis pulmonar, cicatrices hipertróficas y keloides (fibrosis de la piel), y/o en otros órganos blanco susceptibles a padecerla. Asi como un mecanismo de reconocimiento tejido-especifico de las células afectadas mediante el envió de genes "terapéuticos" a los órganos cirróticos. Asimismo, la invención proporciona una via efectiva para el tratamiento de la fibrosis mediante el empleo de los vectores adenovirales recombinantes que aqui se reclaman, asi también el proceso para preparar dichos vectores, la composición farmacéutica que los contiene, y sus usos terapéuticos en el tratamiento de la fibrosis, lo cual tiene una gran expectativa comercial en la industria farmacéutica y también presenta una importante alternativa como terapia génica experimental para el tratamiento de enfermedades crónico-degenerativas que cursan con fibrosis con gran aplicación terapéutica en el campo de la medicina. INTRODUCCIÓN FISIOPATOLOGIA DE LA CIRROSIS HEPÁTICA La cirrosis hepática es una enfermedad que resulta de un daño hepático crónico, éste puede ser tóxico (ingesta crónica de alcohol) , infeccioso (hepatitis viral, principalmente por virus de la hepatitis B y/o C) , inmunológico (cirrosis biliar primaria) , por obstrucción de vias biliares (cirrosis biliar secundaria) , metabólico (Enfermedad de Wilson) . Todas las formas de cirrosis tienen características comunes: síntesis y depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular (MEC) (principalmente colágena I y en menor cantidad, colágenas tipo IV y III) , y como consecuencia formación de nodulos de hepatocitos, vascularización anormal e hipertensión portal (Antoni PP, Ishak KG, Nayak NC, Poulsen HE, Scheuer PJ, Sobin LH . The morphology of cirrhosis: definition, nomenclature, and classification. Bulletin of the World Health Organization. 1977; 55:521-540 y Scott L. Friedman The cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies. The New Ingland Journal of Medicine 1993, vol 328 No. 25:1828-1835). Estos procesos fisiopatológicos conllevan a una alteración en el suministro sanguíneo y por ende en la nutrición de la célula hepática. Independientemente del agente etiológico y de diferencias morfológicas, todas las formas de cirrosis tienen como fin común la falla hepática _ y por ende la muerte del paciente. Como consecuencia del exceso en el depósito de proteínas colagénicas en el espacio subendotelial de los sinusoides (Espacio de Disse) , surgen diversos cambios en el microambiente hepático: pérdida de las vellosidades de los hepatoai os, aparición de una membrana basal formada por colágenas IV y I recubriendo los sinusoides y pérdida de las fenestraciones de las células endoteliales que forman los sinusoides. A todo este proceso se le conoce como "capilarización" de los sinusoides (Scott L. Friedman The cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies. The New Ingland Journal of Medicine 1993, vol. 328 No. 25:1828-1835) . Consecuentemente el higado es incapaz de mantener la concentración fisiológica de solutos en la vena hepática terminal, en otras palabras, se presenta insuficiencia hepática. Esta capilarización, con la formación de un endotelio continuo (colágena de membrana basal) y acumulo de otras proteínas colagénicas, representa una barrera al intercambio normal y bi-direccional de moléculas entre el plasma y hepatocitos, como se puede apreciar en la figura 1, en donde la cirrosis hepática se caracteriza por la acumulación de colágena tipo I en el hígado. Con el exceso en el depósito de esta proteína se impide el libre intercambio de nutrientes entre el torrente circulatorio y el hígado, así como la destoxificación de agentes nocivos realizada por este órgano, principales causas de la patofisiología de la enfermedad. Hasta el momento aún no se ha descrito ningún agente terapéutico que revierta y/o prevenga con 100% de efectividad la acumulación progresiva de la colágena hepática. Dichas alteraciones fisiopatológicas que se presentan en la cirrosis hepática son una constante en común para aquellos órganos que también la padecen, como son por ejemplo, el pulmón, corazón, riñon, piel, entre otros, los cuales no deberán ser considerados como limitativos del alcance de protección de la invención. Por lo que la metodología que aquí se está presentando para el tratamiento de la cirrosis hepática podría aplicarse también a aquellos órganos que son susceptibles a o que se ven afectados por la fibrosis .

VECTORES VIRALES Y TERAPIA GENICA HEPÁTICA Esta tecnología puede implementarse con vectores virales o no-virales. Los estudios previos incluyen plásmidos y liposomas, (DOTMA) catiónicos y aniónicos, etc.

Entre los métodos que emplean vectores virales, los más comúnmente usados han sido los retrovirales y los adenovirales.

En un buen número de protocolos se utilizan vectores retrovirales para introducir genes en hepatocitos (Douglas JT, and Curiel DT. Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53) . Sin embargo, se debe tener precaución porque estos vectores pueden generar potencialmente virus replicación-competentes . Entre las ventajas que tienen estos vectores, está su habilidad para integrar su genoma de manera estable en el genoma de la célula huésped, lo cual confiere la posibilidad de expresión, de manera indefinida, del transgen terapéutico clonado en el retrovirus. Por otro lado, hasta la fecha, ningún estudio ha reportado incidencias de mutagenesis por inserción o activación de oncogenes por la integración del retrovirus siempre y cuando, los virus usados no sean replicación-competentes. No obstante estas consideraciones, el uso de vectores retrovirales para transducir genes al hígado se limita por las siguientes consideraciones: 1) Estos vectores infectan solamente células que se dividen activamente y 2) se obtienen títulos de partículas virales muy bajos de las líneas celulares empaquetadoras usadas para amplificar estos virus (Graham FL, and Van Der Eb AJ. A New Teqnique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA. Virology 1973, 52:456-467) . Estas dos limitantes han sido exitosamente superadas en otros protocolos de Terapia Génica mediante la inducción de la proliferación de hepatocitos "in vivo" por el uso de factores de crecimiento hepático y por hepatectomía parcial, procedimiento quirúrgico mediante el cual se remueve el 70% del hígado y de esta manera se estimula la división de las células hepáticas "in vivo". El empleo de Vectores Lentivirales ha permitido la superación de manera parcialmente significativa, de estas limitaciones, pues estos pueden transducir células que no se dividen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La cirrosis hepática es una enfermedad crónica del hígado, en donde ocurre la destrucción difusa y la regeneración de las células parenquimatosas hepáticas y que resulta en el incremento difuso del tejido conectivo provocando la distorsión de la arquitectura lobular del hígado e induciendo alteraciones hemodinamicas . Por lo tanto, algunas estrategias para el tratamiento de la cirrosis hepática podría incluir la prevención y/o reversión de la fibrogénesis, estimulación de la mitosis hepática y reorganización de la arquitectura _deL. tejido hepático. Es por eso que se dan a conocer los documentos del estado de la técnica relacionados con la presente invención, los cuales se mencionan a continuación con el propósito de incluirlos tan sólo como referencias . La Patente Norteamericana No. 5,240,846, se refiere al uso de terapia génica para tratar fibrosis quística. Utiliza el envío y la expresión de un gen que se denomina CFTR, el cual induce una corrección estable de la regulación del canal de cloro. Este defecto se encuentra presente en células epiteliales. En dicha invención se utilizan vectores adenovirales recombinantes, así como vectores plasmídicos. Sin embargo, no tiene ninguna relación con los genes terapéuticos de la presente invención. Asimismo, la Patente Norteamericana No. 5,910,487, describe la utilización de vectores plasmídicos para el envío de moléculas terapéuticas, pero no existe ninguna relación con el envío de los genes de metaloproteasa o de uPA o de Smad7 o del receptor truncado de TGF-ß (Transforming Growth Factor-ß) como aquí se está presentando. La Patente Norteamericana No. 5,827,703 se relaciona con el uso de vectores adenovirales y vectores adenovirales modificados para enviar genes, sin embargo ninguno de estos vectores contienen los genes utilizados en esta invención para el tratamiento de la fibrosis. La Patente Norteamericana No. 5,770,442 reclama el uso de un adenovirus recombinante que comprende un gen que direge la expresión de una proteína denominada "fiber" o a una proteína denominada "fiber quimera", sin embargo, no menciona de manera específica cuál es el gen terapéutico. También hace referencia al método de terapia génica-, involucrando el uso de tal adenovirus y un vector de transferencia adenoviral para la generación de tales adenovirus recombinantes . Sin embargo, no se menciona absolutamente nada en relación a la utilizaci-ón de genes terapéuticos clonados e insertados en vectores adenovirales recombinantes que en la presente invención se utilizan para el envío a hígados con fibrosis, así como a otros órganos como son el riñon, pulmón y cicatrices hipertróficas y otros. Dichos genes terapéuticos son el gen que codifica para la metaloproteasa 8, MMP-8 latente y activa, el activador de plasminógeno derivado de la. uroquinasa (uPA) , Smad7 y el receptor truncado de TGF-ß, de tipo 2, que en la presente se reclaman. Por extensión se incluyen también otros miembros de la familia de genes representados . La Patente Norteamericana No. 5,166,320, se relaciona con la utilización de un sistema de envío dirigido de genes para introducir genes exógenos en células hepáticas de mamífero. Pero no hay ninguna relación con los genes- que se pretenden enviar directamente a hígados cirróticos o a ríñones o pulmones fibróticos. La Patente Norteamericana No. 5,872,154, describe un método para reducir la respuesta inmune inducida por un vector adenoviral mediante la co-administración del vector adenoviral recombinante y un modulador inmune seleccionado, que funciona inhibiendo la formación de anticuerpos neutralizantes y/o reduciendo la muerte de las células infectadas viralmente. La Patente Norteamericana No. ,871,982, divulga un vector híbrido, el cual comprende una porción de un adenovirus, junto con una porción de un vector adeno-asociado viral que contiene un transgen seleccionado, también describe un virus híbrido mediante la unión de un conjugado con un policatión a un gen red del adeno-asociado para formar una partícula simple. A diferencia de la presente invención, en la cual no se emplearon virus híbridos, sino solamente vectores adenovirales. Además, en la patente arriba citada no se menciona el gen o transgen o el gen terapéutico utilizado. En la Patente Norteamericana No. 5,856,152, se da a conocer la construcción de un vector híbrido, el cual contiene la porción de un vector adenoviral en combinación con un virus adeno-asociado y un gen seleccionado, con lo cual se producen grandes cantidades de vectores recombinantes, pero que no portan genes terapéuticos clonados como se describen en esta invención, en donde se utilizan genes terapéuticos específicos para el tratamiento de fibrosis hepática, fibrosis renal y cicatrices hipertróficas. La Patente Norteamericana 5,547,932, reclama una composición de complejos de ácidos nucleicos para transfectar células eucarióticas. Estos complejos están formados por ácidos nucleicos y otra substancia que tiene una afinidad para el ácido nucleico y opcionalmente un factor internalizador, como puede ser un virus o un componente del virus, que puede estar conjugado. Asimismo, utilizan componentes de determinados vectores adenovirales o determinados virus como el Ad2 o el Ad5, pero no mencionan los genes que internalizan en el citoplasma y eventualmente en el núcleo de estas células eucarióticas. De igual manera, la Patente Norteamericana No. 5,521,291, se relaciona con adenovirus conjugados que están unidos mediante un anticuerpo a una substancia que tiene afinidad por ácidos nucleicos, de esta manera se transportan genes recombinantes al interior de las células eucarióticas. Estos complejos conjugados y ácidos nucleicos son internalizados en la célula, pero no se mencionan de manera específica los genes terapéuticos que pueden ser enviados . En dicha patente tampoco se menciona el uso de tales adenovirus para tratar fibrosis o cirrosis hepática o cualquier otro tipo de fibrosis como se describe en la presente invención. La Patente Norteamericana No. 5,585,362, comprende un vector adenoviral mejorado y métodos para hacer y usar tales vectores . Aún cuando no se divulga el uso de vectores adenovirales en dicha patente, los vectores adenovirales descritos en la presente invención se utilizaron como vectores para el envío de genes terapéuticos. La Patente Norteamericana No. 5,756,086, reclama un adenovirus, el cual está representado por una proteína denominada "fiber", además el adenovirus incluye un ligando, que es específico para un receptor localizado en un tipo celular determinado. Este adenovirus puede tener al menos una porción de esta proteína denominada "fiber" y puede ser removida y reemplazada con un ligando, el cual es específico para un receptor en determinadas células de la economía, como por ejemplo hepatocitos. Estos adenovirus pueden incluir un gen que codifique para un agente terapéutico. En base a lo anterior, la diferencia técnica sobresaliente de la invención propuesta con respecto a lo divulgado en dicha patente, es la especificidad del agente terapéutico como metaloproteasas (MMP-8 activa y latente) , uPA (urokinase Plasminogen Activator) , el receptor truncado de TGF-ß y Smad7 para el tratamiento de diversas fibrosis. La Patente Norteamericana No. 5,895,759, reclama un vector específico de tejido (hígado) para terapia génica que puede ser usado para enviar genes a un hígado dañado. Dicho vector está acoplado a un promotor de manera química o enzimática y puede estar acoplado también a un anticuerpo empaquetado en una cubierta polipeptídica. Además el vector o el virus para ser ensayado es el virus de la hepatitis B, de manera tal que el envío de genes a hígados dañados que se describen en dicha patente, utiliza un sistema completamente diferente al que se pretende en esta invención y no existe relación con el proceso de fibrosis o cirrosis a tratar. La Patente Nortemericana No. 5,559,099, describe un vector recombinante adenoviral que comprende una proteína quimérica del adenovirus que se denomina pentona, la cual incluye a una secuencia non-pentona y un gen terapéutico para desarrollar un método de terapia génica, el cual involucra el uso de tal adenovirus, vectores adenovirales de transferencia para la recombinación de tales vectores adenovirales conteniendo un gen terapéutico. Asimismo, la Patente Norteamericana No. 5,885,808, reclama también el uso de adenovirus con moléculas de unión del adenovirus a células de la economía, cuyas moléculas han sido modificadas. Al igual que en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,846,782 y 5,712,136, en donde se emplean vectores adenovirales, los cuales han sido modificados para contener diferentes dominios peptídicos. Finalmente la Patente Norteamericana No. 5,670,488, se relaciona con vectores para terapia génica, los cuales son especialmente útiles para fibrosis quística y también menciona el desarrollo de métodos para usar estos vectores. La posible relación de la invención que aquí se está reclamando, con respecto a lo divulgado en el estado de la técnica citada, radica en el uso de vectores adenovirales, que pueden ser modificados, así como el uso de promotores inducibles para los genes que van a ser insertados en estos vectores adenovirales, sin embargo, las características técnicas de la presente invención están dirigidas a la utilización específica de genes terapéuticos para tratar fibrosis de diferentes tipos como son fibrosis hepática, renal y pulmonar, así como cicatrices hipertróficas. La importancia de la presente invención a diferencia de lo descrito en los documentos del estado de la técnica antes citados, radica en - ias características técnicas del propio invento, así como en las ventajas adicionales que se derivan del mismo, las cuales se describen con más detalle a continuación .

VECTORES ADENOVIRALES En la presente invención se han decidido utilizar VECTORES ADENOVIRALES en base a varias consideraciones: 1) Estos vectores pueden generarse a títulos muy altos de partículas infecciosas por ml : (109-1010); 2) Infectan una gran variedad de células, sin embargo, cuando son administrados por vía endovenosa la mayor parte se localiza en el órgano hepático; 3) Transfieren eficientemente genes a células que no se encuentran en divisió.n y 4) Raramente, se integran en el genoma del huésped, lo que evita el riesgo de transformación celular por mutagénesis insercional (Douglas JT, And Curiel DT . Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53 y Zern AM, And Kresina TF. Hepatic drug delivery and gene therapy (Hepatology 1997 vol. 25, No. 2, 484-491). Los adenovirus son probablemente los vehículos o vectores más prometedores para el envío de genes en los protocolos de terapia génica en humanos, ya que poseen un atributo único que los provee de gran estabilidad cuando son administrados al torrente sanguíneo. Esta característica les permite ser utilizados de manera eficiente en protocolos clínicos con una administración cómoda para el paciente por vía intravenosa (Douglas JT, And Curiel DT . Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53) . Los adenovirus son virus de ADN de doble cadena, tienen una estructura icosahedral, los cuales infectan a una gran variedad de tipos celulares de mamíferos, lo que puede reflejar la expresión ubicua de un receptor de superficie celular específico y aún no identificado. La unión a las células es mediante el componente proteico de la cápside del adenovirus y el virus entra a la célula por endocitosis mediada por receptor. Han sido identificados más de 40 diferentes serotipos humanos de adenovirus, de los cuales los tipos 2 (Ad2) y 5 (Ad5) han sido más extensamente estudiados y, por lo tanto, más utilizados en la adaptación como vectores para terapia génica. Una característica muy importante de estos 2 serotipos es que jamás se les ha asociado con procesos malignos humanos . La estrategia para la construcción de adenovirus recombinantes se basa en la organización del genoma adenoviral. La expresión de los genes adenovirales ocurre en dos fases, temprana y tardía, que se definen con respecto al tiempo de replicación del genoma adenoviral. Los genes tempranos se codifican en cuatro unidades transcripcionales distintas. El, E2 y E4 codifican para proteínas regulatonias esenciales que inducen la replicación del DNA adenoviral, el gen E3 es un gen no esencial. Los productos de los genes tardíos incluyen las principales proteínas de la cápside, las cuales se transcriben de un promotor único (Graham FL, And Van Der Eb AJ. A New Tecnique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA. Virology 1973, 52:456-467) . Los adenovirus recombinantes se generan por la introducción del gen exógeno o secuencia de ADN de interés en sustitución de regiones del genoma adenoviral requeridos para la replicación del virus. Los vectores adenovirales recombinantes sufren deleciones en las regiones El y E3 de su genoma. La generación de adenovirus recombinantes se realiza tanto por el reemplazo de las regiones El, de la E3, o bien por inserción del gen exógeno entre la región E4 y el extremo derecho del genoma viral. Los vectores basados en la inserción del gen exógeno en el extremo derecho del genoma adenoviral o por reemplazo de la región E3 conservan la capacidad de replicación. Por el contrario, el reemplazo de la región temprana El produce un vector defectuoso en su capacidad de replicación que, por lo tanto, se pueden propagar únicamente en una línea celular que abastezca en " trans " a las funciones ausentes de la región adenoviral remplazada o en la presencia de un virus colaborador. De estos, los más utilizados comúnmente como vectores de transferencia de genes son los adenovirus defectuosos en replicación (Douglas JT, And Curiel DT . Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53) . La construcción de los vectores adenovirales, así como su aplicación para el tratamiento de la fibrosis se muestran en los ejemplos que posteriormente se describen.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN A continuación se dan a conocer los objetivos y ventajas que se derivan de esta invención. Un objetivo de la presente invención es proporcionar un proceso para preparar los vectores adenovirales recombinantes pAdGFP-MMP-8 , mediante la clonación de los genes reporteros Lac-Z y GFP y el gen terapéutico de la colagenasa MMP-8 (metaloproteasa) . Otro objetivo de la invención es proporcionar un vector adenoviral recombinante con un gen exógeno o secuencia de ADN de interés que codifica a proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de la fibrosis generalizada en los órganos blancos susceptibles a padecerla.

También se proporcionan en la presente invención composiciones farmacéuticas que contienen los vectores adenovirales recombinantes en cantidades terapéuticamente efectivas de partículas virales para tratar la fibrosis generalizada. Así también, como sus usos y aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de la fibrosis. Una ventaja todavía de mayor relevancia en el tratamiento de la fibrosis generalizada, particularmente el de la cirrosis hepática, es que el envío de los genes terapéuticos se lleva a cabo mediante el reconocimiento tejido-específico por la vía de administración empleada. Otra ventaja de los usos terapéuticos de la invención, la cual está dirigida en principio al tratamiento de la cirrosis hepática, es el tratamiento de la fibrosis generalizada en otros _ órganos blancos susceptibles a padecerla, que incluyen, pero que no quedan limitados al tratamiento de la fibrosis en pulmón, corazón, piel, riñon entre otros, en animales mamíferos, incluyendo al hombre. Otro objetivo es el diseño de una tecnología para enviar eficientemente genes a hígados de animales que cursan con cirrosis, que asemejan a dos tipos de cirrosis que afecta a humanos (cirrosis por alcohol y cirrosis biliar primaria) .

Otra ventaja que resulta del tratamiento de la fibrosis es que el adenovirus recombinante no induce toxicidad letal en ninguno de los animales inyectados con los vectores . Asimismo, otro objetivo de la invención nos permite discriminar completamente la modificación de la reacción de tinción con X-Gal entre la actividad de la ß-galactosidasa endógena tisular y la ß-galactosidasa bacteriana inducida por la acción infectiva del vector adenoviral. Así como, la utilización de la proteína verde fluorescente, nos permite verificar la transducción in vivo de los órganos en las ratas para verificar si la administración del vector fue adecuada, si la expresión permanece y además de que no se sacrifica al animal se le puede dar seguimiento posterior a la cirugía.

Finalmente, todo esto nos permite sugerir que nuestro sistema constituye un vehículo eficiente para enviar genes terapéuticos como metaloproteasas MMP-8; colagenasas que degraden el exceso de colágenas depositadas y/o genes que codifiquen para proteínas estimuladoras de regeneración hepática como el uPA (urokinase Plasminogen Activator) , el receptor truncado tipo II para TGF-ß y Smad7 a hígados de ratas con cirrosis con el objeto de restablecer las funciones normales del hígado, u otros órganos afectados por la misma patología . Es así, como en la presente invención se dan a conocer el proceso de preparación de los vectores adenovirales recombinantes, composiciones farmacéuticas y usos terapéuticos para el tratamiento de la fibrosis, particularmente en el tratamiento de la cirrosis hepática.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Otras particularidades y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, de los objetivos y modalidades preferidas, de las reivindicaciones anexas y de los dibujos o figuras que se acompañan, en donde: La figura 1, muestra la fisiopatología celular de la Cirrosis Hepática; La figura 2, muestra una prueba de concepto de como la Terapia Génica funciona revirtiendo el proceso que cursa con cirrosis; La figura 3, es una representación esquemática que muestra la clonación y la producción del .vector adenoviral Ad5ß-gal; La figura 4, muestra el desarrollo esquemático del sistema AdEasy para la generación de Adenovirus Recombinantes, específicamente el pAdGFP-MMP-8 ; La figura 5, muestra el análisis de la expresión de ß-galactosidasa en células en cultivo; La figura 6, muestra la determinación de la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células en cultivo; La figura 7, muestra la expresión de la ß-galactosidasa en diferentes órganos después de la infusión con Ad5-ßgal a través de la vena ilíaca; La figura 8, muestra la determinación del tropismo del vector Ad5-ßgal a diferentes órganos de los animales de experimentación cirróticos mediante intoxicación crónica con CC14, demostrando que el principal órgano blanco es el hígado; La figura 9, muestra la determinación .del, tropismo del vector AdSßgal a diferentes órganos de los animales de experimentación cirróticos mediante ligadura del ducto biliar, demostrando que el principal órgano blanco es el hígado; La figura 10, muestra cortes histológicos de imágenes representativas de la- eficiencia de los ensayos de transducción "in vivo" del vector Ad5-ßgal en ratas cirróticas con administración crónica de CC1 ; La figura 11, muestra cortes histológicos de .imágenes representativas de la eficiencia de los ensayos de transducción "in vivo" del vector .Ad5-ßgal en ratas cirróticas por ligadura del ducto biliar común; La figura 12, muestra la determinación "in vivo" de la expresión de la proteína verde fluorescente; La figura 13, muestra la estrategia de clonación de las MMP-8 latente y MMP-8 activa; La figura 14, muestra los mecanismos de la formación de complejos con el DNA de las MMP-8s para ensayos de transfección "in vitro" en células de origen hepático (HepG2) ; La figura 15, muestra la comprobación mediante electroforesis en geles de agarosa del éxito de las clonaciones de los cDNAs de MMP-8 en los plásmidos apropiados; La figura 16, muestra la eficiencia de transfección en células HepG2 (células de origen hepático) con los plásmidos de ß-galactosidasa y pcDNA-MMP-8; La figura 17, muestra el análisis mediante la reacción en cadena de la polimerasa asociada a la transcriptasa reversa (RT-PCR) de los RNA mensajeros de MMP-8; La figura 18, muestra la determinación de la actividad colagenolítica en la proteína secretada al medio de cultivo por las células HepG2 después de ser transfectadas con los cDNAs de MMP-8 latente y MMP-8 activa; La figura 19, muestra la regulación hormonal de la expresión del gen de MMP-8 bajo el control transcripcional del promotor regulable PEPCK y La figura 20, muestra el ensayo dosis-respuesta de las diferentes dosis usadas para determinar la respuesta óptima de transducción hepática in vivo con el gen reportero de ß-galactosidasa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Existen muchos reportes en los que se demuestra que administrando por vía sistémica los vectores adenovirales recombinantes (AdR) en animales de experimentación sanos, el órgano de predilección a donde jnigran es el hígado. Hasta la fecha no se conocía si los AdR eran capaces de transducir hígados de ratas con cirrosis. Como ya se mencionó, la cirrosis hepática se caracteriza por un aumento de la fibrosis en todo el parenquima hepático principalmente alrededor de las venas central y portal, formando una barrera que impide el libre intercambio entre el sinusoide y los hepatocitos (Antoni PP, Ishak KG, Nayak NC, Poulsen HE, Scheuer PJ, Sobin LH. The morphology of cirrhosis: definition, nomenclature, and classification. Bulletin of the World Health Organization. 1977 ; 55.521-540 y Scott L. Friedman The cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies . The New Ingland Journal of Medicine 1993, vol 328 No. 25:1828-1835), motivo por el cual se diseñó este protocolo para verificar si aun con esta barrera se podía enviar genes al hígado. Por lo tanto, nuestra hipótesis es: los vectores adenovirales recombinantes que contienen los genes reporteros Lac-Z y de la GFP (Green Fluorescent Protein) , son capaces de transducir a los hígados de las ratas con cirrosis aun cuando la arquitectura lobular del órgano está alterada.

De tal forma que podríamos enviar a estos hígados, genes terapéuticos como colagenasas (MMP-8) , Urokinase-Flasminogen Activator (u-PA) , el receptor truncado de TGF-ß tipo 2 y Smadl , que degraden el exceso de proteínas colagénicas depositadas y/o que impiden la síntesis exacerbada de proteínas colagénicas, como se muestra en las figuras 2 y 18 y/o genes que codifiquen para proteínas estimuladoras de regeneración hepática como el uPA con el objeto de restablecer las funciones normales del hígado como se ejemplifica en la figura 2. Con el desarrollo de la invención que se reclama en la presente, se inicia una línea de investigación para realizar terapia génica como una alternativa para el tratamiento de enfermedades crónico-degenerativas, específicamente de la cirrosis hepática en humanos, al establecer un vehículo eficiente para enviar genes al hígado que produzcan proteínas terapéuticas que ayuden a restablecer las funciones normales del hígado, ver la figura 2, en donde se muestra como enviando de manera eficiente un gen terapéutico al hígado, en este caso una colagenasa (metaloproteasas de ma triz, MMPs) , se puede lograr la degradación de la colágena a través de la sobre-expresión de estas metaloproteasas. En la figura 3, se esquematiza la estrategia para la clonación y producción de un vector adenoviral. El plásmido p?ElsplB que contiene secuencias del adenovirus Ad5, al cual se le insertó el gen reportero. de origen bacteriano lac-Z. Este plásmido se recombinó con el pBHGlO para obtener partículas virales completas después de co-transfectarse en la línea celular 293. El vector pAdGFP se obtuvo de la siguiente manera: El gen de la MMP-8 (proveniente del plásmido PEPCK-MMP8) se clonó en el vector de envío, pAdTrack-CMV, el plásmido resultante es linearizado dirigiendo con la endonucleasa de restricción Pme I, y después es cotransformado en bacterias E. coli (BJ5183) con el plásmido pAdEasy-1, se seleccionaron las colonias recombinantes mediante resistencia a kanamicina, y la recombinación es confirmada por análisis de restricción con endonucleasas. Finalmente, el plásmido recombinante linearizado es transfectado en la linea celular empaquetadora (células 293) , los adenovirus recombinantes se obtienen dentro de 7 a 12 días como se esquematiza en la figuras 3 y 4 (TongChuan H., Shibin Z., Luis T., Jian Y., Kenneth W. and Vogelstein Bert: A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 95:2509-2514, March 1998) . Para evaluar el grado de transducción in vi tro se utilizó la línea celular HepG2 de origen hepático y con macrófagos perifonéales aislados de ratón. En la figura 5 se muestra la expresión de la ß-Galactosidasa en células en cultivo. A), B) y C) corresponden a células HepG2 (320X); D) , E) y F) son macrófagos perifonéales de ratón (100X) . En C y F se muestran las células transducidas con 1 x 108 partículas virales/ml del vector Ad5ß-Gal. Se realizaron tres técnicas para comparar el grado de incorporación del gen reportero Lac-Z, se administró a cada caja de cultivo el plásmido pPGKßGal mediante precipitación con fosfato de Calcio (Chen C, And Okayama H. Calcium Phosphate-Mediated Gene Transfer, a Highly Efficient System for Stably Transforming Cells with Plasmid DNA. Biotecniques 1988, 6:632-638), complejos de ADN-Polilisina-Lactosa (Martínez-Fong D, Mullers an JE, Purchio AF, Armendariz-Borunda J, And Martínez-Hernández A. Nonenzimatic Glycosylation of Poly-L-lysine : A new Tool for Targeted Gene Delivery. Hepatology, Vol. 20, No. 6: 1602-1608), con los vectores Ad5-ßgal y pAdGFP-MMP8. La visualización de la actividad de la ß-gal se verificó con el reactivo X-gal y la GFP en un microscopio estereoscopio de fluorescencia. Para el ensayo in vivo se estandarizó el revelado de la ß-gal utilizando diferentes pHs de la suspención de revelado con el reactivo X-gal (Weiss DJ, Ligitt D, and Clark JG . In Situ Histochemical Detection of ß-Galactosidase Activity in Lung: Assesment of X-gal Reagent in Distinguishing LacZ Gene Expression and Endogeneous ß-Galactosidase Activity. Human Gene Therapy September 1, 1997, 8:1545-1554) . Los modelos de cirrosis hepática experimental que se utilizaron son: a) intoxicación por tetracloruro de carbono (CC14) , en el que se establece la cirrosis hepática a partir de la octava semana de la administración intraperitoneal de CC14 (Mion F, Geloen A, Agosto E, And Minaire Y. Carbón Tetrachoride-Induced Cirrhosis in Rats: Influence of the Acute Effects of the Toxin on Glucose Metabolism. Hepatology 1996, vol. 23, No. 2:582-587); y b) ligadura del conducto biliar (LCB) , en el que se observa una cirrosis franca después de la semana 4 de la intervención quirúrgica (Lee SS, Girod C, Braillon A, Hadengue A, and Lebec D. Hemodynamic Characterization of Cronic Bile Duct-Ligated rats; effect of Pentobarbital Sodium. Am Journal Physiol 1986; 251:176-180; Nakano S, Harakane J, and Hasimoto H. Alteration in Bile ducts Peribiliary Microsirculation in Rats After Common Bile Duct Ligation. Hepatology, 1995, Vol. 21, No. 5 1380-1995; Dumaswala R, Berkowitz D, And Heubi JE. Adaptive Response of the Enterohepatic Circulation of Bile Acid to Extrahepatic. Cholestasis Hepatology, 1996, Vol. 23, No. 3:623-629 y Pod J. L., Estañes A., Pedraza-Chaverri J., Cruz C, Pérez C, Huberman A. y Uribe M. : Cronología de la hipertensión portal, disminución de excreción de sodio y activación del sistema Renina-Angiotensina en cirrosis biliar experimental. Rev. Invest. Clin. 49:15-23, 1997) . Se administró al mismo tiempo y con el mismo lote de Ad5ßgal a ratas controles sin cirrosis. Se sacrificaron ratas de 5 y 8 semanas de intoxicación con CC14 y ratas de 2 y 4 semanas de LCB, 72 hrs después de la administración del AdR para el análisis histológico y determinar la expresión de la proteína ß-galactosidasa (ß-gal) codificada por el AdR, para este fin se extrajeron hígado, bazo, corazón, pulmones, ríñones y cerebro, se cortaron secciones de tejido en forma de cubos de 5-6 mm, los cuales fueron embebidos en el medio para congelar Tissue-Tek O.C.T., los tejidos se congelaron a -30°C y se cortaron con un criostato para obtener secciones de 8µm. Estos cortes se colocaron en laminillas de vidrio silanizadas y fijadas con formalina equilibrada a pH 8.5, durante 15-30 min y se expusieron al reactivo X-gal por 16-18 hrs contratiñéndose con el colorante rojo neutro (Weiss DJ, Ligitt D, and Clark JG. In situ Hitichemical Detection of ß-Galactosidase Activity in Lung: Assesment of X-gal Reagent in Distinguishing lacZ Gene Expression and Endogenus ß-Galactosidase Activity. Human Gene Therapy September 1, 1997, 8:1545-1554) . El porcentaje- de células positivas fue determinado por análisis morfométrico en campos múltiples del mismo tamaño y calculando el promedio. También se realizaron cortes de los hígados de las ratas con cirrosis, los que se embebieron en parafina, se cortaron y se tiñeron con rojo sirio, el rojo sirio tiñe específicamente proteínas colagénicas (Armendariz-Borunda J, and Rojkind M. A Simple Quantitative Method for Collagen Typing in Tissue Samples: Its Application to Human Liver with Schistosomiasis . Collagen Reí. Res. 1984, Vol. 4:35-47). Con esta técnica podemos verificar el grado de fibrosis y al aumento de ductos biliares de una forma clara en el parenquima hepático. Para verificar la transducción de células in vivo con la GFP, utilizamos ratas Wistar sanas, a las cuales se les administró el vector pAdGFP-MMP8, 72 hrs, después se realizó una laparatomía media y se visualizaron los órganos expuestos en el microscopio de fluorescencia, cerrando la herida después para mantener vivo al animal. Los resultados previos que aquí se presentan acerca del estudio de la fisiopatología de la cirrosis hepática experimental, pueden ser resumidos en la figura 2. Dicha figura esquematiza la participación de citocinas pro-inflamatorias y pro-fibrogénicas producidas in vivo por las células de Kupffer, las cuales activarán en turno a las células estelares hepáticas para que produzcan colágenas en exceso y sean depositadas en el espacio subendotelial, obstruyendo el recambio entre hepatocitos y sinusoides (Armendáriz-Borunda J., Katayama K. and Seyer J.M. : Transcriptional mechanisms of type I collagen gene expression are differentially regulated by IL-lß, TNFa and TGFß into cells. J. Biol. Chem. 267:14316-14321, 1992; Armendáriz-Borunda J., Katai H., Jones C.M., Seyer J.M., Kang A.H. and Raghow R. : Transforming growth factor B is transiently enhanced at a critical stage during liver regeneration following CC14 treatment. Laboratory Investigation. 69:283294,1993 y Armendáriz-Borunda J., Roy N., Simkewich C, Raghow R., Seyer J.M. and Kang A.H.: Activation of Ito cells involves regulation of API binding proteins and induction of type I collagen gene expression. Biochemical Journal 304:817-824,1994). El grado de incorporación del gen Lac-Z en células en cultivo contrastó visiblemente al comparar las técnicas de fosfato de Calcio, complejos de ADN-Polilisina-Lactosa. y con el vector adenoviral recombinante en HepG2 y MPR (macrófagos perifonéales de ratón) siendo el grado de transducción con adenovirus de un 100% y con las otras dos técnicas aproximadamente 1% como se muestra en la figura 5. La figura 6, muestra la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células en cultivo. A) Macrófagos perifonéales de ratón transducidos con el vector adenoviral pAdGFP-MMP8, 72 hrs después de su administración (50X), B) células HepG2 transducidas con el vector adenoviral pAdGFP-MMP8, 72 hrs después de su administración (50X) y C) células HepG2 sin el vector adenoviral. Todas las imágenes fueron tomadas en un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Cabe señalar que en el revelado de la actividad de ß-galactosidasa, las células tienen que ser fijadas y mueren, en el ensayo de la GFP, las células siguen intactas y vivas.

En la figura 7, la expresión de la ß-gal en diferentes órganos después de la infisión pon Ad5ßgal vía vena ilíaca. Se utilizó la fijación, lavado y soluciones de X-gal a diferentes pHs para discriminar entre la expresión endógena y la ß-galactosidasa bacteriana exógena. En la figura A se utilizó un pH de 7.0 y en la figura B el pH fue de 8.5, esto resume los resultados de los ensayos de las diferentes condiciones experimentales y pueden apreciarse que la exposición de tejidos a la solución de X-Gal a pH 8.5, nos permitió eliminar la expresión de ß-galactosidasa endógena. Realizamos cortes por congelación de los siguientes órganos: hígado, riñon, pulmón, corazón, cerebro y bazo de ratas sanas e intoxicadas con CCI4 por cinco y ocho semanas, como se representa en la figura 8, las gráficas nos muestran claramente como el principal órgano blanco es el hígado, tanto en ratas sanas como en ratas con administración crónica de CCI4. A), cinco semanas de administración del CCI4 y B) , ocho semanas de administración del CCI4. El bazo y el pulmón presentan un grado de transducción menor al 1% por lo que en las gráficas es muy poco notorio; a las cuales se les administró una dosis de 3 x 1011 PV/ml (partículas virales por mililitro) del vector Ad5ßGal. Las ratas controles sanas presentan un total del 70% de hepatocitos transducidos, además del hígado, el bazo y el pulmón presentan menos de 1% de transducción, en los demás órganos no se encontró transducción. También se realizaron cortes por congelación de los mismos órganos de .ratas .sanas y de ratas con dos y cuatro semanas de LCB, ver en la figura 9, las representaciones gráficas que nos muestran claramente como el principal órgano blanco es el hígado, tanto en ratas sanas como en ratas con ligadura del conducto biliar (XCB¡L. A), dos semanas de LCB y B) , cuatro semanas de LCB. El bazo y el pulmón presentan un grado de transducción menor al 1% por lo que en las gráficas es muy poco notorio. Con una dosis de 3 x 1011 PV/ml del vector AddßGal . Las ratas con LCB presentan un total del 10% de hepatocitos transducidos, además del hígado, el bazo y el pulmón presentan menos de 1% de transducción, en los demás órganos no se encontró transducción. En la figura 10 se muestran los resultados histológicos con el modelo de cirrosis hepática inducida por administración crónica de CC1 , en donde A) representa un corte de hígado de una rata normal 72 hrs después de administración del Ad5ßGal vía vena ilíaca (un corte representativo de los experimentos de un total de cinco ratas) . Más de 70% de los hepatocitos son positivos a la expresión de ß-gal (200X) ; D) el mismo hígado como en la figura A) pero fueron teñidos con Rojo Sirio para observar la síntesis y depósito de colágena (200X) ; B) hígado con cinco semanas de intoxicación crónica con CC14. Aproximadamente 30-40% de los hepatocitos fueron transducidos exitosamente; E) los mismos hígados como en B) pero teñido con Rojo Sirio, el aumento de la cantidad presente de colágena es notable y la arquitectura empieza a distorsionarse (200X) ; C) hígado de ratas después de ocho semanas de intoxicación crónica con CCI4 donde se ha establecido una cirrosis típica, de nuevo, más del 40% de células hepáticas fueron positivas a la expresión de ß-gal y F) los mismos hígados como en C) pero teñidos con Rojo Sirio. Una característica muy importante es la presencia de gruesos septos de colágena que se forman entre las venas centrales y del tracto portal (200X) . En la figura 11, se muestran los resultados obtenidos en el modelo de cirrosis inducida por ligadura del conducto biliar (LCB) . A) muestra un corte de hígado de una rata normal 72 hrs después de administración del Ad5ßGal vía vena ilíaca (un corte representativo de los experimentos de un total de cinco ratas) , más de 70% de los hepatocitos son positivos a la expresión de ß-gal (200X) ; D) el mismo hígado como en A) pero se tiñeron con Rojo Sirio para observar la colágena (amplificación 200X) ; B) hígado de ratas después de dos semanas de LCB, el ensayo de ß-gal se realizó 72 hrs después de la administración del Ad5ßGal vía vena ilíaca. Aproximadamente 10% de los hepatocitos fueron transducidos exitosamente con el gen reportero; E) los mismos hígados como en B) pero teñidos con Rojo Sirio. La arquitectura empieza a distorsionarse debido a la fibrosis inducida por la La preparación de una composición farmacéutica que incluya a los vectores adenovirales recombinantes de la invención, se puede llevar a cabo mediante el empleo de técnicas estándares bien conocidas por los expertos en la materia en. combinación con cualesquiera de los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en el estado de la técnica, incluyendo pero no limitando el almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina de trigo, tiza, sílica-gel, estearato de magnesio, estearato de sodio, talco de monoestearato de glicerilo, cloruro de sodio, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones toman la forma farmacéutica de soluciones, suspensiones, tabletas, pastillas, cápsulas, polvos y formulación de liberación prolongada y los similares. La descripción anterior y los siguientes ejemplos tienen como propósito el ilustrar modos particulares de llevar a cabo la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de protección de la misma.

EJEMPLOS Ejemplo 1 METODOLOGÍA para demostrar la actividad de Metaloproteasa o Colagenasa (MMP-8) y asimismo regular su función a) Cultivo celular Se cultivaron a las células HepG2, una línea celular colestasis, así como el aumento considerable del número de ductos biliares (200X) ; C) hígado de ratas después de cuatro semanas de LCB para producir cirrosis, el ensayo de ß-gal se realizó 72 hrs después de administración del Ad5ßGal vía vena ilíaca. Nuevamente, 10% de los hepatocitos fueron transducidos exitosamente y F) los mismos hígados de C) pero teñidos con Rojo Sirio. Nóte.se el abundante depósito de proteínas de colágena y la gran proliferación de ductos biliares (200X) . En la figura 12 se muestra una laparatomía media de una rata Wistar sana a la que se le administró el vector pAdGFP-MMP8, se observa claramente la expresión de la GFP en el hígado y en cantidades insignificantes en el bazo. Un hecho importante es que la inyección de los vectores adenovirales NO indujo toxicidad letal en ninguno de los animales de experimentación tanto sanos como controles. La manera preferida de aplicar la presente invención, es mediante el suministro vía endovenosa de los vectores adenovirales recombinantes de la invención o de la composición farmacéutica que los contiene, en donde sé proporciona una cantidad terapéuticamente efectiva con un régimen de dosis unitaria conveniente a un individuo que padece de fibrosis, dicho régimen se puede ajustar de conformidad con el grado de aflicción. Generalmente, se emplea una dosis unitaria de aproximadamente 107-1014 partículas virales por individuo. de origen parenquimatoso provenientes de hepatoma humano, en cajas de cultivo de 60 mm de diámetro a 37 °C en una atmósfera húmeda con aire al 95% y C02 5% en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamax y antibióticos (100 U/ml penicilina y 100 µg/ml estreptomicina) . b) Vectores de expresión de los genes latente y activo de la MMP-8 Se utilizaron plásmidos con dos tipos de genes de la MMP-8 para transfectar a las células hepáticas: el plásmido pcDNA-MMP8 que contiene al cDNA que codifica a la MMP-8 latente (pro-MMP-8) junto al promotor viral fuerte del citomegalovirus (CMV) y el plásmido pcDNA3-MMP8 que contiene al cDNA que codifica a la MMP-8 activa junto al promotor de CMV. Este último se creó por subclonación a partir de los plásmidos pcDNA3 y PETIIa-HNC cortando con las enzimas de restricción BamHl y Xbal e insertando el producto de PCR codificante del dominio catalítico de la MMP-8 (la cual carece de los fragmentos propéptido y carboxilo terminal) , como se representa en la figura 13, el envío de genes de MMP8 latente y activa. Dos tipos de plásmidos, con el gen de la MMP8 fueron utilizados para su envío a las células hepáticas en cultivo: 1) pcDNA3-MMP8, plásmido con el fuerte promotor viral del citomegalovirus (CMV) y el cDNA que codifica a la colagenasa en su forma.

Como gen reportero se utilizó el plásmido pSV2-ß gal, el cual tiene insertado él gen que codifica a la enzima ß-galactosidasa adyacente al promotor del virus de SV40. c) Transformación, amplificación y purificación de plásmidos Para obtener una cantidad suficiente de cada uno de los plásmidos a utilizar en los diferentes ensayos, se les introdujo a bacterias E. coli de la cepa DH5a™ (proceso conocido como transformación) conforme a lo indicado en el protocolo del proveedor de estas células competentes (Life Technologies, Gaithersburg, MD) : en un tubo de reacción se utilizaron 50 µl de la cepa competente DH5a al que se le adicionó 2 µl de plásmido (1-10 ng DNA) , después de mezclarse se incubó en hielo durante 30 min y posteriormente se les aplicó un choque térmico a 37 °C durante 20 seg e inmediatamente se colocó en hielo durante 2 min, al cabo de este tiempo se le adicionó 0.95 ml del medio de cultivo bacteriano Luria Base (LB) y se agitó a 225 rpm por 1 h a 37 °C para la expresión del plásmido. Después de la expresión se tomó 50 µl de la mezcla de reacción para sembrar una placa de cultivo de agar LB con 100 µg/ml de ampicilina y se incubó a 37%°C durante una noche. Las colonias que crecen después de este período son aquellas que contienen el plásmido de interés el cual les confiere la capacidad de resistencia al antibiótico.

Para amplificar la cantidad del plásmido se tomaron de la placa de agar un paf de cßlonias para cultivarlas en 1 L de medio LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina durante 24 h a 37 °C con agitación constante a 225 rpm. Una vez que la densidad óptica del cultivo es > 0.6 se centrifuga a 6,000 rpm durante 10 min para recolectar la pastilla bacteriana. De esta pastilla de bacterias se aisló el ADN plasmídico del ADN genómico de la bacteria utilizando un kit de purificación de plásmidos (Monster-prep, BIO101, Vista, CA) el cual se basa en la lisis alcalina de la pared bacteriana, la liberación del plásmido de su interior y la separación de este ADN por medio de una resina particular. La cuantificación del ADN plasmídico se realizó midiendo espectrofotométricamente la absorbancia resultante a ?=260 nm. d) Transfecc ón de células en cultivo Uno de los métodos que más se utilizan para la introducción de genes a células eucariónticas es la transfección de ADN con fosfato de calcio, en la cual el ADN exógeno se deposita como un precipitado fino sobre la superficie de la célula, para posteriormente ser incorporado por ella e integrado transitoriamente en el ADN cromosomal. Para dirigir el ADN con mayor selectividad hacia las células hepáticas se utiliza el envío de ADN en forma de complejo con polilisina-lactosa, dada la característica de que dichas células poseen un receptor específico de galactosa en su superficie. Para ello, se cultivaron las células HepG2 a aproximadamente un 70-80% de confluencia para su transfección con los plásmidos pcDNA-MMP8, pcDNA3-MMP8 y pSV2-ß galactosidasa. La transfección se hizo tanto por el método de precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van derEb, 1973; Chen y Okayama, 1988) como por el de la formación de complejo con polilisina-lactosa (Martínez-Fong et al . , 1994). En breve: a las células en cultivo se les adiciona el precipitado recién formado, producto de la adición al ADN plasmídico de una solución de CaCl 2M y una solución de buffer HEPES pH 7.12 para el caso de la transfección con fosfato de calcio, o bien se le adiciona el complejo de ADN con polilisina-lactosa. Se incuban las células de 4 a 16 horas para permitir que el precipitado se adhiera a la superficie celular y posteriormente el ADN sea endocitado e ingrese transitoriamente al núcleo, al término de este tiempo el medio de cultivo es cambiado por uno fresco, ver figura 14, en donde se cultivó la línea celular hepática HepG2 en medio DMEM con 10 % de suero fetal bovino. Al presentar un 60-80% de confluencia se le adicionó al medio de cultivo 10 mg del plásmido con el gen de la MMP-8, tanto en su forma latente como en la activa o madura. A la vez se les envió el gen procariótico de ß-galactosidasa (ß-gal) para monitorear la eficiencia de la incorporación y expresión. El gen de MMP-8 fue enviado en diversas formas: desnudo, en complejo con CaP0 o en complejo con polilisina-lactosa. e) Formación de los complejos polilisina-lactosa y ADN:polilisina-lactosa (ADN:PL) El complejo de polilisina-lactosa se forma al reaccionar 14.8 mg de poli-L-lisina (0.1N) con 200 µl de a- lactosa 0.5N (relación lactosa-polilisina : 1.0N), después se le adiciona 20 mg del agente reductor cianoborohidruro de sodio 3M y se incuba a 37 °C por 48 h con agitación constante a 225 rpm. Al término de este tiempo se hace pasar la mezcla de reacción a través de una columna desaladora (Biorad 10-DG) previamente acondicionada con solución buffer de fosfatos (PBS pH 7.2 ) a la que se eluye con este mismo buffer. A las fracciones eluidas se les determina el contenido de carbohidratos por el método de DuBois (1956) para analizar el grado de lactosilación del complejo y el contenido de polilisina según el método de Shen y cois., (1984) el cual se toma como base para evaluar la concentración final del complejo PL. La fracción con mayor concentración de PL es utilizada para su posterior reacción con el ADN del plásmido con el gen de interés como se muestra en las figuras 14 y 16. Para evaluar la relación molar óptima de ADN:PL a utilizar en los ensayos de transfección se hizo reaccionar el ADN con diversas concentraciones de PL. Al término de 1 h de incubación se aplicaron las muestras a un gel de retardamiento de agarosa al 1.0% y se somete a electroforesis de ADN (60mV, 1.5h), en el que el complejo de ADN : PL con mayor contenido de PL recorre una menor distancia en comparación a la recorrida por el plásmido libre (0% de retardamiento). Se utilizó la relación de ADN:PL que provocaba un 80-90% de retardamiento de la migración, como se muestra en la figura 16, la incorporación y expresión de los genes exógenos de ß-galactosidasa y pcDNA-MMP8 enviados a las células en complejos con CaP04 y polilisina-lactosa. f) Ensayos de expresión transitoria usando el sistema reportero de ß-galactosidasa (ß-gal) Este sistema determina la actividad de la enzima ß-galactosidasa como una medida del nivel de expresión del gen de interés transfectado conjuntamente con el gen que codifica para esta enzima. La ß-galactosidasa es una enzima bacteriana que cataliza la conversión del sustrato incoloro X-gal a un producto de colo.ración azul. Debido a ello, la actividad de ß-galactosidasa observada en células eucariónticas sometidas a transfección indicará la exitosa incorporación del gen de interés asociado al gen bacteriano.

El ensayo de ß-gal para la tinción de células en las cajas de cultivo consiste en la fijación de las células a 4°C por 5 min con p-formaldehido 2%, el subsecuente lavado con PBS (3X) y la adición de 1 ml de una solución de tinción de PBS contiendo ferricianuro de potasio 20mM, ferrocianuro de potasio 20mM y cloruro de magnesio 2mM, seguido de la adición del sustrato X-gal a una concentración final de 0.5 mg/ml, Después de incubar a 4°C durante toda la noche (18 h) se identifican bajo el microscopio las células de coloración azul (Ausubel, 1995) . g) Extracción de ARN A las 48 hrs de la transfección se recolectaron las células para realizar la extracción del ARN por el método de Chomczynski y Sacchi (1987) utilizando el reactivo de Trizol (fi) como a continuación se describe: a cada una de las cajas se le adicionó 1 ml de solución PBS y se recolectaron las células por raspado de la caja para transferirlas a un tubo eppendorf; posteriormente se centrifugó a 1,000 rpm por 1 min y a la pastilla celular se le adicionó 500 µl de Trizol, se procedió a su homogenización e inmediatamente a su incubación por 5 min a 4°C. Se agregaron 100 µl de cloroformo y se incubaron durante 5 min a 4°C. Después de este tiempo se centrifugó a 12,000 g durante 15 min a 4°C y se transfirió la fase acuosa (superior) a otro tubo a la cual se le adicionó la misma cantidad en volumen de isopropanol y se incubó a -70°C durante 15 min para precipitar el ARN extraído. Posteriormente se centrifugó a 12,000 g durante 15 min a 4°C y se eliminó el sobrenadante decantando y secando el tubo con papel limpio y estéril. Se le adicionó 500 µl de etanol al 75% y se centrifugó a 12,000 g durante 10 min a 40°C.

Finalmente se resuspendió la pastilla con 20-50 µl de agua desionizada tratada con dietilptrocarbonato y se cuantificó la concentración de ARN obtenida en un espectrofotómetro a una longitud de onda ? de 260 mn. h) Análisis de la expresión del gen de la MMP-8 por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) asociada a la reacción de transcriptasa reversa (RT) Para determinar el grado de expresión del gen exógeno de la MMP-8 incorporado en las células se realizó la obtención del ADN complementario (ADNc) a partir del ARN previamente extraído y posteriormente se llevó a cabo la amplificación de la señal de expresión a través de la reacción en cadena de la polimerasa. Para la obtención del ADNc se utilizó el siguiente procedimiento: 2 µg de ARN total se llevaron a un volumen de 8 µl con agua desionizada estéril y se incubó a 70°C durante min. Seguido de esto se agitó la muestra en agua con hielo durante 5 min y en hielo, se adicionaron los siguientes reactivos: 4 µl buffer 5X para la enzima RT, 4 µl dNTP's mix 2.5 mM, 1 µl random primers (1 µg/µl), 1 µl inhibidor de ARNasa (lU/µl) y finalmente 2 µl de la enzima transcriptasa reversa (200 U/µl) . Se incubó la mezcla de la reacción a temperatura ambiente durante 10 min y posteriormente a 37 °C durante 1 hr. Al término de este tiempo, se colocó inmediatamente a una temperatura de 95 °C durante 10 min y finalmente se colocó en hielo con agua durante 5 min con agitación constante y se almacenó a -70°C hasta su posterior uso. Para analizar la expresión específica del gen de la MMP-8 se realizó la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los .primers u oligonucleótidos. específicos para este gen según las condiciones experimentales que a continuación se describen: en un tubo de reacción con 2 µl de ADNc se adicionaron 5 µl MgCl2 2.5 mM, 5 µl buffer 5X para la enzima polimerasa proveniente del virus de leucemia murina de Moloney (MMLV) , 2 µl dNTPs 2.5 mM, 5 µl del oligonucleótido sentido 3 µM, 5 µl del anti-sentido 3 µM, 1 µl de la enzima polimerasa (1 U/µl) y se lleva a un volumen final de 50 µl con agua desionizada (Innis y cois., 1990) . El oligonucleótido sentido específico para la MMP-8 es 5'-AGCTGTCAGAGGCTGGAGGTAGAAA-3' , y el antisentido es 5'-CCTGAAAGCATAGTT GGGATACAT-3' (Colé y cois., 1996). Después de la adición de estos reactivos, se colocó la mezcla en un termociclador durante 30 ciclos de acuerdo con el siguiente programa: desnaturalización (94°C, 5 min), alineación (60°C, 1 min) y extensión (72 °C, 1.5 min) . Al término de este tiempo, los productos de PCR son sometidos a electroforesis (60mV, 1.5 h) en un gel de agarosa al 1.5%. i) Ensayo de actividad de colagenasa El análisis de la actividad enzimática de la colagenasa se realizó para determinar la funcionalidad de la enzima producida, ya que esta proteína pudiera encontrarse enzimáticamente inactiva, lo que no se podría conocer a través de la determinación única del ARN que la codifica. Después de 24 h de mantener a las células en cultivo con medio libre de suero, el medio de cultivo se recolecta y se determina en éste la actividad de colagenasa secretada por las células por un método modificado de Hasty y cois., (1986) sometiendo a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% para identificar los productos de degradación. Brevemente: los sobrenadantes celulares conteniendo 1-1.5 µg de proteína fueron incubados a 27 °C durante 18 hrs con 5 µg de colágena nativa tipo I y 60 µl del buffer de incubación: 50mM de Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0.02% NaN3, 50 mM de arginina, Tritón X-100 1% y en ausencia o presencia de lmM APMA, pH 7.6. Finalmente se mezclaron 30 µl del producto de reacción con 30 µl de buffer de muestra para proteínas y se corrió la electroforesis de poliacrilamida desnaturalizante al 7.5% para identificar los productos de degradación alA y a2A de la colágena tipo I.

Ejemplo 2 RESULTADOS para demostrar la actividad de Metaloproteasa o Colagenasa (MMP-8) y asimismo regular su función La subclonación permitió incorporar el ADN complementario de la MMP-8 que codifica para la enzima completamente funcional en un vector apropiado a nuestras necesidades. Así, en la figura 15, se muestra la electroforesis de los fragmentos de DNA liberados al cortar los plásmidos de MMP-8 con enzimas de restricción. Carril: A) marcador de pares de bases de ADN 1 kb ladder (Gibco BRL) ; B) Perfect DNA marker (Novagen, Inc.); 1) pcDNA-MMP8 cortado con BamHl y Xbal; 2) pcDNA3-MMP8 cortado con BamHI y Xbal; C) fX174 marker (Gibco BRL) ; ? HindIII marker (Gibco BRL) , en donde los ADNc de la MMP-8 latente (carril 1) y la MMP madura (carril 2) fueron exitosamente subclonados en los vectores de expresión pcDNA y pcDNA3. Se observan claramente los insertos liberados con enzimas de restricción BamHl y Xbal. Las bandas teñidas con bromuro de etidio corresponden a cada uno de los ADNc comprendidos entre 506 y 560 pares de bases (pb) aproximadamente, para los ADNc de la MMP madura y latente, respectivamente . Para evaluar la eficiencia de la incorporación del ADNc de la MMP-8 enviado a las células HepG2 en forma de complejo con CaP04 y con polilisina-lactosa, se realizó la co-transfección de este plásmido junto con el del gen reportero de ß-galactosidasa. De esta forma, las células que se observan bajo el microscopio con coloración azul indican indirectamente que también han incorporado al plásmido de interés. La figura 16 nos muestra la expresión de ß-galactosidasa en las células HepG2 co-transfectadas con el plásmido libre, en forma de complejo CaP0 o en su forma de complejo con polilisina-lactosa. Esta figura nos muestra que el acoplamiento del ADN con polilisina-lactosa se llevó a cabo, dado que a mayor concentración de polilisina se observó un claro retardamiento del plásmido de ß-galactosidasa. La relación seleccionada para transfectar las células fue aquélla que retardó el 80% de la migración del plásmido. Una vez demostrado que las células en cultivo son capaces de incorporar y expresar genes que les han sido transfectados fue necesario corroborar que dichos genes eran transcritos por la maquinaria de las células huésped mediante los ensayos de RT-PCR. La figura 17, nos muestra un análisis mediante la reacción en cadena de la polimerasa asociada a la transcriptasa reversa (RT-PCR) de los ARNm de las MMP8 y MMP13. (Este plásmido fue utilizado como otro control positivo de transfección) ; en donde una electroforesis de ADN de los productos amplificados de PCR del ADNc de la MMP-8 enviado en su forma de complejo con CaP?4 y polisina-lactosa ha sido transcrito para ambos casos en las células HepG2 transfectadas. Se observa que la señal de los productos de PCR de la MMP8 (359 pb) fue más intensa cuando el plásmido fue enviado en complejo con polilisina-lactosa. Para demostrar que el transcrito de MMP-8 expresado por las células HepG2 era traducido en una proteína funcional se realizó el ensayo de actividad enzimática utilizando colágena tipo I como sustrato. La figura 18, muestra la actividad enzimática de degradación de colágena tipo I de la proteína secretada al medio, que fue observada en las células transfectadas con el gen de la MMP8 latente, previa activación con el agente mercurial APMA (carril 7) y con el gen de la MMP8 activa en su complejo con CaP04 (carril 9) y con polilisina-lactosa (carril 10), y su inhibición específica con EDTA 2mM. Controles negativos: colágena tipo I sin adición de sobrenadantes de células (carril 1) y con la adición de tripsina (carril 3) , colágena con sobrenadantes de células sin transfectar (carril 2) . Carriles positivos: colágena tipo I con sobrenadante de leucocitos humanos (carril 3) , colágena tipo I con adición de colagenasa bacteriana al 0.015% (carril 4); así como los productos de la degradación de la colágena nativa tipo I separados en un gel de poliacrilamida al 8% después de haberse incubado con el sobrenadante de las células transfectadas con el gen de la MMP-8 latente y activa. Se observa como en ambos casos se presenta la activad colagenolítica en presencia del agente organomercurial APMA para el caso de la primera y su inhibición por EDTA para ambos casos, lo que indica que esta actividad proteolítica corresponde a una metaloproteasa de matriz intersticial. La incubación de la colágena nativa tipo I con tripsina no mostró degradación. Por lo tanto, este experimento demuestra claramente que la acción de la MMP-8 fue específica dada la naturaleza intacta de la molécula de colágena. La figura 19, muestra la evidencia de que la actividad de las enzimas que degradan específicamente colágenas pueden ser controladas (apagadas y/o prendidas) mediante la clonación de sus cDNAs respectivos que a su vez se encuentran bajo el control transcripcional de genes regulables como el PEPCK (phosphoenol-piruvate carboxikinase) . Es claro ver que tanto la estimulación de las células en cultivo con Glucagón (carriles 5 y 6) como cAMP (carriles 7 y 8) sobreestimulan la producción del RNA mensajero que codifica para MMP-8, así como que la Insulina disminuye dicha producción (carriles 9 y 10) . Las observaciones en la actividad de ß-galactosidasa endógena sugiere que esta actividad tiende. a ser granular y más débil en color que el colorido azul denso que es el resultado de la actividad de la enzima exógena (Shimohama S., Rosenbergh M.B., Fagan A.M., Wolff J.A., Short M.P., Brakfielf XO, Friedman T. and Gage F.H.: Genetically modified cells into the rat brain: Characteristics of E. coli -galactosidase as a repórter gene. Brain Res. 5:271-278, 1989) . Se han descrito muchas modificaciones para aumentar la especificidad en el ensayo para la determinación del gen lac-Z exógeno. Así, según los datos previamente reportados por Weiss DJ, Ligitt D, And Clark JG . In Situ Histochemical Detection of ß-Galactosidase Activity in Lung. Assessment of X-gal Reagent in Distinguishing lacZ gene Expression and Endogenous ß-Galactosidase Activity. Human Gene Therapy September 1, 1997, 8:1545-1554; en la presente invención se utilizó una solución de X-Gal a un pH estable de 8.5, de esta forma, se demostró la actividad de la ß-Gal exógena mientras se minimizó la actividad endógena in vivo . Uno de los indicadores que actualmente se utilizan para monitorear in vivo la eficiencia y localización de las células transducidas con adenovirus recombinantes es la detección en la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) . Para esto, el gen que codifica a esta proteína se subclona en los vectores adenovirales de forma tal que mediante el empleo de un microscopio fluorescente, se puede observar la fluorescencia directamente sin sacrificar al animal de experimentación, al cual se le administró el vector (Rojas-Martinez A., Wyde P.R., Montgomery C.A., Chem S-H., Woo SLC and Aguilar-Cordova E.: Distribution toxicity and lack of replication of an ElA-recombinant adenoviral vector after systemic delivery in the cotton rat. Cáncer Gene Ther. 1998 y TongChuan H., Shibin Z., Luis T., Jian Y., Kenneth W. and Vogelstein Bert: A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 95:2509-2514, March 1998). Se han obtenido muchos datos en los que se demuestra que después de la administración de los adenovirus en forma intravenosa en animales sanos, las principales células blanco fueron hepatocitos. Esta observación se ha mostrado en ratones, conejos, perros y primates (Zern AM, And Kresina TF. Hepatic drug delivery and gene therapy. Hepatology 1997 Vol. 25, No. 2, 484-491), pero no en ratas con cirrosis. La inyección en vena porta probablemente sea más eficaz para que llegue a las células blanco en el hígado proporcionando un inoculo favorable de partículas virales a todo el hígado antes de diluirse en la circulación periférica. Se ha mostrado que esta ruta es muy eficaz, pero el gran inconveniente es que se requiere hacer una laparatomía. Por otro lado, la administración peritoneal es una infusión más rápida y simple, pero no favorece la transducción de hepatocitos . Los resultados de la presente invención muestran que la inyección de 3 x 1011 partículas virales por vena ilíaca en ratas Wistar de aproximadamente 200 grs de peso, produce un nivel muy alto de expresión (70% de transducción de hepatocitos) . Nuestros resultados son parecidos a un reciente informe que muestra en envío dirigido a hígado del gen reportero en primates vía vena safena, en el que se produce casi el mismo nivel de transducción y expresión del transgen en el hígado comparada con la infusión a través de la vena porta (Marie-Jean TFD, Poeters V, Lieber A, Perkins J, and Kay MA. Method for Múltiple Portal Vein Infusions in Mice: Quantitation of Adenovirus-Mediated Hepatic Gene Transfer. Biotechniques February 1996, 20:278- 285 y Zhu G, Nicolson AG, Zheng X, Strom TB, and Sukhame VP . Adenovirus-Mediated ß-Galactosidase Gene Delivery to the Liver Leads to Protein Deposition in Kidney Glomeruli. Kidney International, 1997, Vol. 52, 992-999). Además la expresión del gen reportero en nuestros animales con cirrosis inducida por la administración crónica del CCI4 fue sorprendentemente casi tan alta como los normales (40% de los hepatocitos transducidos) . Estos resultados son muy excitantes ya que nuestros animales con cirrosis difícilmente sobrevivirían al procedimiento quirúrgico exigido para poder administrar el adenovirus por vena porta. Esto debido a que las pruebas funcionales hapáticas, así como los Tiempos de Protrombina se encuentran muy elevados y el sangrado se presentaría en forma importante. Aunque las ratas con ligadura del conducto biliar mostraron una reducción sustancial en el número de hepatocitos transducidos (de 5-10%), también es importante el número de hepatocitos, los cuales pueden ser transducidos con genes terapéuticos, como las metaloproteasas (MMP-8) y/o genes que codifiquen para proteínas estimuladoras de regeneración hepática como uPA (urokinase Plasminogen Activator) y Smad7. Debe ser evidente para aquellas personas expertas en la técnica que otras variaciones no dadas a conocer específicamente en la presente invención, pero que, sin embargo, se proponen mediante la presente y que se consideran que quedan dentro del alcance y espíritu de este invento. Por lo que la invención no debe quedar limitada mediante la descripción de las modalidades específicas dadas a conocer, sino únicamente mediante las siguientes:

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un vector adenoviral recombinante que comprende un genoma adenoviral del cual se han deletado los marcos de lectura abiertos El y/o E3, pero que retiene la secuencia suficiente para que dicho vector adenoviral sea capaz de replicarse in vitro. Adicionalmente dicho vector contiene un gen terapéutico o una secuencia de AND de interés regulada por promotores ubicuotos y/o promotores específicos de tejido, que codifica para proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de la fibrosis.
2. 2.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde el promotor específico de tejido es PEPCK.
3. 3.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde el gen terapéutico o la secuencia de ADN clonada en dicho vector adenoviral se selecciona del gen de la metaloproteasa MMP-8 latente y activa; gen del activador de plasminógeno derivado de uroquinasa (uPA) , Smad7 y gen del receptor truncado tipo II de TGF-ß, que codifican para proteínas terapéuticas que degradan el exceso de proteínas colagénicas depositadas en los órganos cirróticos .
4. 4.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicacón 3, en donde el gen terapéutico es una secuencia de ADN que se selecciona del gen del factor de crecimiento para hepatocitos HGF, que codifica para proteínas estimuladoras de regeneración hepática con la finalidad de restablecer las funciones normales del hígado.
5. 5.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde las proteínas terapéuticas para el tratamiento de la fibrosis son la proteína MMP-8 latente y/o activa; uPA o mutante de ésta; TGF-ß; betaglycano; HGF y Smad7.
6. 6.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además el envío de los genes terapéuticos o secuencias de ADN que codifican para proteínas terapéuticas para el tratamiento de fibrosis en los hígados con cirrosis.
7. 7.- El vector adenoviral recambinante de conformidad con la reivindicación 6, en donde el envío de los genes terapéuticos se lleva a cabo en otros órganos con fibrosis generalizada .
8. 8.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 7, en donde el reconocimiento tejido-específico de los genes terapéuticos a los órganos con fibrosis se lleva a cabo por la vía de administración empleada .
9. 9.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 8, en donde la vía de administración es endovenosa.
10. 10.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 6, en donde los órganos con fibrosis se seleccionan de hígado, pulmón, corazón, riñon, piel y cicatrices hipertróficas.
11. 11.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 10, en donde el principal órgano blanco es el hígado.
12. 12.- Vectores recombinantes de conformidad con las reivindicaciones 1 a 11, en donde el envío de genes terapéuticos se lleva a cabo mediante el uso de vectores virales o no virales.
13. 13.- El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 12, en donde los vectores no virales se seleccionan de plásmidos y liposomas catiónicos y aniónicos.
14. 14.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 6, en donde el envío eficiente del gen de la colagenasa MMP-8 al hígado cirrótico puede lograr la degradación de la colágena a través de la sobre-expresión de metaloproteasas .
15. 15.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, del corazón, keloides y cicatrices hipertróficas, el cual no induce toxicidad letal.
16. 16.- Un proceso para preparar vectores adenovirales recombinantes mediante la clonación de genes reporteros Lac-Z y GFP y el gen terapéutico, que codifica para proteínas terapéuticas para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, del corazón, keloides y cicatrices hipertróficas .
17. 17.- El proceso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el gen terapéutico se selecciona del gen de la metaloproteasa MMP-8 latente y activa; gen del activador de plasminógeno derivado de uroquinasa (uPA) ; Smad7 y gen del receptor truncado tipo II de TGF-ß.
18. 18.- El proceso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el vector adenoviral recombinante es pAdGFP-MMP-8.
19. 19.- Una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva con un régimen de dosis unitaria de partículas virales de los vectores adenovirales recombinantes de conformidad con la reivindicación 1, para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, del corazón, keloides y cicatrices hipertróficas, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
20. 20.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, en donde la dosis unitaria es de aproximadamente 107-1014 partículas virales por individuo que padece de fibrosis.
21. 21.- El uso de vectores adenovirales recombinantes de conformidad con la reivindicación 1, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, del corazón, keloides y cicatrices hipertróficas . A continuación se dan a conocer las definiciones de la simbología empleada en las figuras que corresponden a la presente invención, en donde: Figura 1 : CEH = CÉLULA ESTELAR HEP TICA CES = CÉLULA ENDOTELIAL SINUSOIDAL CK = CÉLULA DE KUPFFER ESET = ESPACIO SUBENDOTELIAL HE = HEPATOCITOS HIDC = HÍGADO CON DAÑO CRÓNICO HIN = HÍGADO NORMAL SINU = SINUSOIDE Figura 2 : COLASA = COLAGENASA DCA = DEGRADACIÓN DE LA COLÁGENA TGE = TERAPIA GENICA EXPERIMENTAL MMPs = METALOPROTEASAS Figura 3 : CT 293 = COTRANSFECCION EN CÉLULAS 293 PG CsCl = PURIFICACIÓN CON GRADIENTES DE CsCl Figura 4 : BD = BRAZO DERECHO Bl = BRAZO IZQUIERDO CTBK = COTRANSFECTAR EN BACTERIAS Y SELECCIÓN EN KANAMICINA CUL = CULTIVAR Ll Pací = LINEARIZAR CON Pací Ll Pmel = LINEARIZAR CON Pmel PV = PARTÍCULAS VIRALES T 293 = TRANSFECTAR EN CÉLULAS 293 GENADR = GENERACIÓN DE ADENOVIRUS RECOMBINANTES Figura 7: B = BAZO CE = CEREBRO i CO = CORAZÓN %CT = % DE CÉLULAS TRANSDUCIDAS H = HÍGADO P = PULMÓN R = RIÑON SAdß-Gal = SIN EL VECTOR Adß-Gal CAdß-Gal = CON EL VECTOR Adß-Gal X-GAL7 = REACTIVO X-GAL pH 7.0 X-GAL8.5 = REACTIVO X-GAL pH 8.5 Figura 8 : B = BAZO CC145 = 5 SEMANAS DE INTOXICACIÓN CON CC14 CC148 = 8 SEMANAS DE INTOXICACIÓN CON CC14 CE = CEREBRO CO = CORAZÓN %CT = % DE CÉLULAS TRANSDUCIDAS H = HÍGADO P = PULMÓN R = RIÑON PV = PARTÍCULAS VIRALES HN = HÍGADO NORMAL Figura 9 : B = BAZO CE = CEREBRO CO = CORAZÓN %CT = % DE CÉLULAS TRANSDUCIDAS H = HÍGADO LCB2S = 2 SEMANAS DE LIGADURA DEL CONDUCTO BILIAR LCB4S = 4 SEMANAS DE LIGADURA DEL CONDUCTO BILIAR P = PULMÓN R = RIÑON PV = PARTÍCULAS VIRALES HN = HÍGADO NORMAL Figura 13 : Prot = PROTEINA APMA = ACETATO AMINOFENIL MERCÚRICO Figura 14 : ACTß-gal = ACTIVIDAD DE ß-GALACTOSIDASA CES = CÉLULAS EAC = ACTIVIDAD ENZIMATICA PL = POLILISINA PROT = PROTEINA RGAL = RESIDUOS DE GALACTOSA SNAD = SOBRENADANTE Figura 16: ADND = ADN DESNUDO GELRADN-PL = GEL DE RETARDAMIENTQ PARA LA POLILISINA Figura 18 : CA = CON APMA CACE = CON APMA Y CON EDTA CaP04 = FOSFATO DE CALCIO CE = CON EDTA COB = COLAGENASA BACTERIANA COL1 = COLÁGENA TIPO I PL = POLILISINA SA = SIN APMA SNL = SOBRENADANTE DE LEUCOCITOS ST = SIN TRANSFECCION TRIP = TRIPSINA Figura 20: %CT = % DE CÉLULAS TRANSDUCIDAS PV = PARTÍCULAS VIRALES RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se propone el uso de terapia génica para su aplicación en el tratamiento de diversas fibrosis en humanos. El objetivo es la utilización de genes "terapéuticos" específicamente dirigidos a órganos blanco para revertir y/o prevenir el desarrollo del proceso que cursa con fibrosis. La potencial aplicación de terapia génica a pacientes con fibrosis y/o cirrosis dependerá en buena parte del envío exitoso de genes que codifiquen para proteínas terapéuticas a hígados con fibrosis extensa y que estos genes que codifiquen para proteínas MMP-8, uPA (o su versión truncada), receptor truncado tipo II de TGF-ß y Smad7 sean dirigidos por adenovirus y/o otros vectores recombinantes que no transduzcan (infecten) otros órganos de la economía. Los adenovirus recombinantes (AdR) son vectores altamente eficientes para la transducción de genes terapéuticos a diversas células blanco- Hemos probado que se pueden llevar genes a hígados cirróticos. El envío de genes terapéuticos mediante dichos vectores adenovirales y otros vectores recombinantes se podrá realizar utilizando liposomas (DOTMA) catiónicos y aniónicos. Asimismo, proponemos el uso de esta patente para que de igual manera sea aplicada a: * Fibrosis renal, * Fibrosis pulmonar, * Cicatrices hipertróficas y keloides (Fibrosis de la piel) y * Otros tipos de fibrosis.