MXPA99008108A - Anhidrovinblastina para el tratamiento de cancer cervical y de pulmon - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de 3', 4'-anhidrovinblastina o una sal un medicamento para el tratamiento de un tumor sólido en un mamífero, en donde el tumor es seleccionado del grupo que consiste de linfoma, cáncer cervical, cáncer pulmonar, cáncer de pecho y cáncer de colón.

Description

ANHTDROVINBI.ASTINA PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER CERVICAL Y DE PULMÓN CAMPO TÉCNICO La presente invención por lo general se refiere a alcaloides an t i neop 1 ás t i eos de vincapervinca como agentes an t i t umo a 1 es . De manera más particular, la presente invención se refiere a proporcionar el uso de un derivado de vinblastina, an h i d r ov i n b 1 as t i na (en lo sucesivo AHVB ) , como un agente antineoplástico con propiedades terapéuticas mejoradas, el cual demuestra una dosis máxima tolerada bastante más alta y menos toxicidad que sus compuestos de origen o con los que está relacionado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Debido a un grado más alto de dificultad para predecir, las técnicas clásicas del t desarrollo de fármacos son inventivas.

Principalmente por medio de un proceso de eliminación, en busca de los efectos deseados se examinan un gran número de productos naturales y de compuestos químicos sintéticos, usando una serie de sistemas cada vez más comple os, que comienzan con sencillos ensayos in vi tro a nivel celular, 5 los cuales se llevan a animales y por último a ju.icios clínicos en humanos. Sin embargo, debido a características esenciales tales como la adsorción, distribución y metabolismo, las pruebas in vi tro iniciales que pueden tomar en cuenta estos aspectos pueden eliminar un fármaco poderoso que no tiene un buen desempeño en dichos sistemas. El fármaco se puede metabolizar en compuestos diferentes en modelos animales y en humanos, -15 los cuales también pueden demostrar distintos patrones de adsorción o dist ibución, O finalmente, los compuestos pueden verse muy pr orne t ed o res todo el tiempo hasta llegar a los juicios clínicos, pero entonces pueden demostrar efectos colaterales desagradables o un alto grado de tolerancia al usarse a gran escala en la población humana. Nunca resulta obvio cual compuesto continuará siendo prometedor conforme se inicia cada etapa de pruebas y desarrollo. Por más de 20 años se ha logrado controlar hasta cierto grado el crecimiento tumoral utilizando como agentes a n t i umo a 1 es en quimio e apia de cáncer los alcaloides oncolíticos de vincape vinca solos o en it , combinación con otros fármacos "t 5 an t i neop 1 ás t i eos . Se han extraído aproximadamente 30 alcaloides con un amplio rango de actividades farmacológicas a partir de Vincapervinca rosea ( Ca t harán th us roseus) , comúnmente conocida como hierba doncella. De estos, sólo la vinleurosina, la vinrosidina, la vinblastina y la vincristina poseen una actividad antitumoral importante. En particular, la vinblastina y la vincristina se han usado ampliamente como agentes simples o en combinación con otros fármacos an ineoplás icos en la quimio erapia de cáncer. Además de los alcaloides que surgen naturalmente, algunos análogos de alcaloide vincapervi ca se han sintetizado por medio de transformación funcional o por medio de procesos s emi s i n t ó t i eos (R.J. Cersosimo, y 3- otros, Pharmaco t herapy 3:359-274, 1983; P. Mangency, y otros, Org . Chem. 44:3765-3768, 1979: R. Maral, y otros. Cáncer Lett. 22:49- -t 25 54, 1984) . %j Químicamente, estos alcaloides de vincapervinca tienen una estructura dimórica asimétrica compuesta de 2 núcleos unidos por medio de un enlace carbono-carbono; un núcleo de dihidroindola (vindolina) ; que es el principal alcaloide contenido en la hierba 5 doncella, y el núcleo de indola de catarantina (Figura 1) . La diferencia estructural entre la vincristina y la vinblastina existe en la posición Rl mientras que la vinblastina y la vindesina difieren con respecto a los substituyentes R2 y R3. El modo de acción de los alcaloides an t i neop 1 á t i eos dé vincapervinca todavía tien que entenderse por completo. Sin embargo, se ha establecido que su actividad antitumoral se relaciona directamente con la afinidad de enlace más alta de estos compuestos con tubulina, la subunidad básica * . í de proteína de microtúbulos (R.A. Bender y B. Chabnerm En: Chabner (de) Pharmacol. Princ. •4 20 of Cáncer Treat. , Saunders, Phil, PA, p. 256, 1982; W.A. Creasy, En: Hahn (de) Antibiotica, Vol. 2, Springer, Berlín, p. 414, 1979) . El consenso es que estos agentes detienen la mitosis celular en metafase evitando la polimerización de tubulina para formar microtúbulos T induciendo la despolime ización (R.J. Owellen y C.A.

- JL Hartke, Cáncer Res. , 36:1499-1504, 1976; R.H. Himes y R N. Kersey, Cáncer Res, , 36.37 8.3806, 197 ; R.S. Camplejohn, Cell Tissue Kmet, 13:327-332, 1980=. De manera 5 que, los alcaloides de vincapervinca son agentes celulares an t i mi t ó t i eos de ciclo específico, o venenos de huso. La afinidad de enlace de los alcaloides de vincapervinca con la tubulína se correlaciona de manera escasa con la capacidad relativa de la vincpstina, la vinblastina y la vindesina para inhibir el crecimiento celular (R.S. Camplejohn, supra; P.J. Ferguson y C.E. Cass, Cáncer Res. , 45:5480-5488, 1985) . Por lo tanto, la principal diferencia en la actividad antitumoral entre estos fármacos parece relacionarse con su retención en el tejido tumoral (P. Ferguson, supra; J. . Horton y otros, Biochem. Pharmacol. 37:3995-4000, 1988) , En una vena similar, los diferentes perfiles de toxicidad de los alcaloides de vincapervinca parecen relacionarse con las JT propiedades de absorción y retención del tejido más que con la afinidad de enlace inherente de la tubulina. Por ejemplo, los estudios han demostrado que la vincristina es * más potente que la vinblastina o la vindesina -$-, en el bloqueo rápido del transporte axoplásmico en las células nerviosas (S. Ochs y R. Worth, Proc. A . Assoc. Cáncer Res. , 16:70, 1975; S.Y, Chan y otros, J. Neurobiol. 5 11: 251-264, 1980) . Además, se lleva a los nervios 4 veces más rápido que los demás fármacos (Z. Iqbal y S. Ochs, J. Neurobiol. , 11:251-264: 1980) y muestra una fase extendida de eliminación terminal de supresión de plasma, lo que sugiere una exposición más prolongada a la vincristina que a los demás alcaloides de vincapervinca (R.L. Nelson y otros. Cáncer Trear. Res. , 7:17-24, 1980) , 15 Las diferencias in vi vo e in vi tro observadas entre los alcaloides de vincapervinca dan de manera sorprendente las alteraciones químicas sutiles exhibidas por los diversos agentes relativos a su estructura molecular grande y compleja. Por ejemplo, la vincristina es muy efectiva en el tratamiento de rabd os ar comas humanos trasplantados a ratones desnudos, en tanto que, la vinblastina no está activa en este sistema (N. Bruchovsky y otros. Cáncer Res. •1* 25 : 1232-123 1965 ) Esta diferencia se obtiene simplemente como un resultado de la substitución de un grupo aldehido por un grupo metilo en la posición Rl , Además, esta substitución química conduce a un cambio en el perfil toxicológico de manera que la neuropatía periférica (en ausencia de toxicidad h ema t o 1 óg i ca ) limita la dosis de vincristina en humanos mientras que la anemia y la leucopenia por lo general limitan la dosis de vinblastina ( W.P. Brads, Proc. Int. Vin caalkal oid Symposium, 95-123, 1980; S.S. Legha, Med. Toxicol., 1:421-427, 1986) . Se ha observado un perfil terapéutico de particular interés para un nuevo alcaloide sem i s i n t ó t i co de vincapervinca nombrado navelbina (vinorelbina, 5'-noranhidroblastina) . Este compuesto es menos potente que la vinblastina y la vincristina contra la leucemia P388 y L1210 de murino pero es activo contra células derivadas a partir de cáncer pulmonar humano en tanto que los demás alcaloides de vincapervinca son inactivos (S, Cros, y otros, Seminars in Oncology, 16:15-20, 1989) . Mientras que los juicios clínicos sobre la navelbina basan su utilidad en el tratamiento de cáncer pulmonar de células no pequeñas (A. Depierre y otros, Am . J. Clin. Oncol. , 14:155-119, 1991; A. Yokoyama y otros, Am .

Soc. Clin. Oncol. , 11:957, 1992) . El perfil de toxicidad de este agente parece similar al de la vinblastina, cuando no limitan la dosis las toxicidades hema t o 1 óg i cas y los efectos colaterales no neu o 1 ób i eos . La vincristina ha probado ser par icularmente útil como un agente oncolítico administrado de manera intravenosa en combinación con otros agentes oncolíticos para el tratamiento de varios cánceres incluyendo leucemina del sistema nervioso central, enfermedad de Hodgkin, 1 i n f osar coma , sarcoma de célula reticular, rabdomi osar coma , neurob 1 as t orna y tumor Wilma. Es exclusivamente para uso intravenoso y la adminis ación intratecal es uniformemente fatal. Siguiendo dosis semanales sencillas, la reacción adversa más común es la pérdida del cabello; y la más problemática son las de origen neuromuscular. Cuando se emplean dosis semanales simples, pueden ocurrir reacciones adversas de leucopenia, dolor neurítico, constipación y dificultad para caminar. Otras reacciones adversas que se han reportado son retortijones abdominales, atazia, gota, pérdida de peso, atropía óptica con ceguera, ceguera cortical pasajera, fiebre. manifestaciones del nervio craneal, parquesia y entumecimiento digital, poliuria, disuria, ulceración oral, dolor de cabeza, vómito, diarrea y necrosis y/o perforación intestinal. La navelbina ( tartrato de vinorelbina) es un alcaloide de vinca ervinca en el quel la unidad de caterantina es el lugar de la modificación estructural. También se piensa que su actividad antitumoral se debe principalmente a su capacidad para inferferir con la actividad del microtúbulo inhibiendo así la mitosis en la metafase a través de su interacción con la tubulina. Se indica en el tratamiento de cáncer pulmonar de célula no pequeña avanzado como un agente sencillo o en combinación, únicamente administrado por vía intravenosa. Sus efectos colaterales incluyen felbitis o lesión de extravasión como un vasicante. Los estudios sobre las reacciones adversas basados en el uso de Navelbina como un agente sencillo indican la Gr n cu 1 o c i t open i a como como la principal toxicidad que limit )a la dosis, aunque por lo general fue reversible y no se acumuló con el tiempo. Las toxicidades neurológicas reportadas con mayor frecuencia son la neuropatía de suave a moderada manifestada mediante pareatesia e hipestesia, las cuales ocurren en un 10% de los pacientes. La nausea de suave a moderada ocurre escasamente en una tercera parte de los pacientes tratados con Navelbina con una fracción ligeramente menor se experimenta constipación, vómito, diarrea, anorexia y estomatitis. Falta lograr compuestos que muestren efectos tóxicos disminuidos con igual o mayor actividad quimioterapéutica. De esta manera, continúa la necesidad de proveer eficacia, antitumoral mejorada para el tratamiento del cáncer . Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proveer un método de tratamiento de cáncer que comprenda la administración a pacientes humanos que padecen de cáncer y que necesiten tratamiento, una cantidad de AHVB , efectiva para detener o disminuir de manera importante" la evolución de la en f ermed a d . Otro o eto de la presente invención es proveer un método para usar AHVB como un agente antitumoral, que comprende la cantidad terapéutica de substancia química de la presente invención para detener el crecimiento tumoral. Los anteriores y otros objetos y ventajas de la presente invención se logran por medio de la administración de un derivado de vinblastina, AHVB. Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción detallada de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige en particular al uso de un derivado de vinblastina, 3' ,4'-anhidrovinblastina (AHVB) , el cual difiere de la vinblastina porque éste posee un enlace doble en la posición 3' , 4' del núcleo de carantina en lugar del grupo hidroxilo que está presente en la estructura original, como un agente an t i neopl ás i co en el tratamiento terapéutico del cáncer. Una modalidad de la presente invención involucra el uso de 3 ' , 4 ' -anh i drovinb la t i na , o variantes de la misma, como un agente an ineoplástico en el tratamiento del cáncer. Otra modalidad de la presente invención involucra el unso de 3 ' , 4 ' -anh i dr ovi nb 1 as t i na como un agente an t i neop 1 ás t i co en el tratamiento de cáncer, cuando la concentración de 3 ' , 4 ' -anh i dr o vi nb 1 as t i na se encuentra en una concen ración máxima mayor que las concentraciones erapéu icamen e aceptables de vinblastina o navelbina para el uso en el tratamiento del cáncer. Todavía otra modadidad de la presente invención involucra el uso de 3 ' , 4 ' -a nh i r o v i n b 1 as t i na como un agente an t i n eop 1 á s t i c o en el tratamiento de cáncer de pulmón .

CUADROS Y FIGURAS El cuadro 1 muestra la c i t o t oxi c i dad relativa de la vincristina, la AHVB y la navelbina en líneas celulares de tumor. El cuadro 2 representa cálculos de dosificaciones tóxicas subagudas de sulfato de vincristina, navelbina y AHVB cuando se administran a ratas Nb machos sanas como una inyección int aperitoneal sencilla. El cuadro 3 representa el retraso del tumor sólido C - 4 , en información sobre el crecimiento.

La figura 1 representa la estructura química de algunos alcaloides de vincapervinca La figura 2 hace una comparación de los efectos de administrar una inyección intrape itoneal sencilla en una dosis subagudamen t e tóxica, de vincristma, navelbina y AHVB a ratas Nb que tienen transplantes de tumor subcutáneos sencillos bien desarrollados Nb2-U17 con el peso promedio del tumor y peso promedio de la rata como una función de tiempo. La figura 3 muestra una comparación de los efectos de administrar una inyección i n t r ap er i t o n ea 1 sencilla, en una dosis s ub a g u d ame n t e tóxica de vincristina, navelbina y AHVB a ratas Nb que tienen transplantes de tumor subcutáneos sencillos bien desarrollados Nb2-U17 con el peso promedio del tumor y peso promedio de la rata como una función de tiempo. La figura 4 muestra los cambiones en el peso medio del animal de ratones BDF1 que tienen tumores P388 i n t r ap er i t o ne a 1 es que tienen administración i.v. de solución salina, vincristina, navelbina y AHVB.

La figura 5 representa un ejemplo de curva de c 11 o t oxi ci dad usada para calcular IC50 de varios alcaloides de vincape vinca. La figura 6 muestra la actividad P388 antitumoral de formulaciones seleccionadas de alcaloides vincape vinca. La figura 7 representa una curva de respuesta a la dosis obtenida con AHVB cuando se usa para tratar ratones BDF1 que tienen tumores P388. La figura 8 representa las curvas de ci t o t oxi c i dad usadas para calcular el IC50 de AHVB en las líneas celulares SKOV3 y C-4. La figura 9 muestra el peso medio de un tumor en gramos con el tiempo (periodo de 30 días) que sigue una administ ación en los días 1, 5 y 9, de navelbina, bisulfato AHVB, ditartrato AHVB y control. La figura 10 representea el peso medio de un tumor en gramos con el tiempo (periodo de 69 dias) que sigue una admini tración en los días 1, 5 y 9 de navelbina, bisulfato AHVB, ditartrato AHVB y control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Existen muchos posibles derivados o posibles variaciones de la vinblastina. Sin embargo, no hay certeza, ni siquiera para los expertos en el área del desarrollo de fármacos" an t i can cer i g enos , de que cualquiera de dichos derivados sea tan eficaz o incluso más eficaz que el compuesto original. Esto toma muchas pruebas y experimentaciones. El término I variantes! con fines de 3 ' , 4 ' -anh i drovinb 1 as t i na significa cualquier estructura química que es un derivado de 3' , 4 ' -anh i drov i nb 1 as t i na lograda a través de substitución convervadora de grupos colaterales, que todavía muestra las mismas propiedades an i neop 1 ás t i cas o similares que 3 ' , 4 ' -anhidrovinblastina .

CARACTERIZACIÓN DE ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE AHVB GN VI TE O Los experimentos de c i t o t oxi ci dad en AHVB se realizador como comparaciones directas con vincristina y navelbina con el fin de lograr su perfil an t i n eop 1 ás t i co inherente contra una variedad de tipos de células tumorales en relación con los demás alcaloides vincapervi ca relevantes. La c i o t oxi cidad de AHVB se investigó in vi tro contra un panel de lineas celulares an t i t umor a 1 es de linaje variado con el fin de determinar la especificidad de su actividad antitumoral con respecto a l tipo d? célula. L a lineas tumorales estudiadas fueron leucemia linfocítica P388 (una leucemia linfocítica de murino) , linfoma noble de rata (Nb) U17, carcinoma humano de mama MCF7, carcinoma humano de pulmón de célula no pequeña H460, er i t r oqueu cen i a humana K562 y carcinoma humano de colon LS180 en base a .protocolos in vi tro establecidos de examinación de c i t o t oxi c i dad de nuevo fármaco anticáncer. Se utilizan ensayos de respuesta a c i t o t oxi c i dad de dosis regulares (R. Mosmass, J. Immunol. Meth, , 65:55-64; 1983) para determinar el IC50 (concentración de fármaco requerida para inducir 50% de inhibición en el crecimiento de células tumorales) para vincristina, navelbina y AHVB. Los resultados se representan en el cuadro 1. Las líneas celulares indicadas se obtuvieron a partir de ATCC o depósito de tumor NCI y se cultivaron en medio de cultivo de tejido por medio de técnicas normales bien conocidas por los expertos en la técnica, antes de la dilusión a una concentración celular definida requerida para los estudios en placas de 96 pozos . Se expusieron una amplia variedad de concent aciones de fármaco a crecimiento de col u.las tumorales en una fase larga en placas de microtítulo de 96 pozos. Las concen cione celulares dependieron de la línea celular asi como de la duración del cultivo. Comúnmente, las células P388 se pusieron en una concen ración de 30,000, 2,000 y 750 células por pozo para estudios que duraron 1, 3 y 7 días, respectivamente. Las células MCF7 se colocaron en una concentración de 7,000 y 1,500 células por pozo para estudios que duraron 3 y 7 días, respectivamente. Las células H460 se pusieron en concentraciones de 2,500 y 1,000 células por pozo para estudios que duraron 3 y 7 días, respectivamente. Las células K562 se pusieron en concentraciones de 1,500 y 10,000 células por pozo para estudios que duraron 1 y 3 días, respectivamente. Las células LS180 se colocaron en una concentración de 5,000 y 20,000 células por pozo para estudios que duraron 3 y 7 días, respec ivamente. Después de colocar en las placas todas las líneas celulares se incubaron (incubador de C02 a 37°C, 5% C02) durante 24 horas antes de agregar el agente citotóxico (Ver cuadro 1) .

CITOTOXTCTDAD RET.ATTVA D VINCRTSTINA . AHVR Y_ NAVELBINA EN LINEAS DE CÉLULAS TUMORALES Subsecuentemente las placas se incubaron durante el periodo indicado. A tiempos específicos, se lavaron las células y después se expusieron a un marcados de teñido de inclusión MTT (tetrazolio de 3-(4,5- d ime i 11 iazol - 2 - i 1 ) - 2 , 5 -d i f en i 1 o ) , el cual se acumuló en células viables. Se agregó MTT a las células al una concentración final de 50 µ por pozo. Después de una incubación de 4 horas, se quitó a las células el medio y el MTT sin reaccionar, antes de agregar DMSO el cual se necesito para solubilizar el precipitado insoluble de formazan que se formó en las células viables. Después se mezcló la mezcla pasando de una probeta a otra, el producto coloreado se midió usando un lector de placa que funciona a 570 nm . Los valores de absorbancia obtenidos por las células cultivadas en ausencia del fármaco se asumió que representan 100% de viabilidad. Se repitieron los experimentos para substancias cualesquiera diferencias que se notaran entre AHVB y otros alcaloides de vincapervinca.

CARACTERIZACIÓN DE ACTIVIDAD ANTITUMQRAL DE AHVB TN VI VQ Se continuó la evaluación c i t o t oxi c i d ad celular in vi tro por medio de estudios que toman en cuenta las actividades an t i neop 1 ás t i cas de AHVB en tres modelos de roedores in vi vo . De esta ' manera, la actividad antitumoral de AHVB se determinó usando un modero de tumor sólido de rata (linfoma U17); el modelo de tumor P388 de murino (R. Noble, y otros, Cáncer Res, , 37:1455-1460, 1977; P.W. Gout y otros.

Biochem. Cell Biol. , 64:65 -666,1986) , y un modelo de tumor H460 SC de ratón. La línea celular U17 se derivó originalmente a partir de un. linfoma maligno t ransp 1 an t ab 1 e que surgió de manera espontánea en ratas Noble macho (British Columbia Cáncer Research Centre Joint Animal Breeding Facility con pacres obtenidos de National Institutes of Health, Bethesda, MD ) . La línea celular depende de la prolactina y puede cultivarse in vi tro fácilmente. Los tumores sólidos U17 derivados se generan por medio de inyección subcutánea (mediante el método trocar) de una pequeña pieza (2mm2) de tejido tumoral obtenido de rata Noble macho. El tejido tumoral usado para implantes surge dos semanas después de inyectar subcutáneamente células U17 5xl06 (a partir del cultivo) en el cuello. Para lograr la actividad antitumoral de AHVB, a los animales que tienen tumor (tumores de 2-4gm)se les dio un sólo tratamiento de fármaco y el tamaño del tumor se midió como una función de tiempo siguiendo el tratamiento. La actividad antitumoral se logró en una serie de diferentes dosis a fin de determinar la dosis terapéutica máxima de AHVB. Se realizaron estudios comparativos entre vincristina, vinblastina y AHVB. Para estos estudios se determinó la actividad antitumoral en la dosis terpóutica máxima de cada fármaco. Los estudios an t i t umo r a 1 e s en ratones se enfocan, en un caso, en el modelo de leucemia P388. Este es un modelo regular NCI para la evaluación de nuevos agentes a n t i umor a 1 es y se ha demostrado que es sensible al tratamiento con alcaloides de vincapervinca. Este es un modelo de tumor ascítico que se generó por medio de inoculación intraperitoneal de células P388 lxl0s (derivadas a partir del cultivo, con una línea celular original obtenida del depósito de tumor NCI ) en ratones BDF1 (Charles Rivers) . Un día después de la inoculación de la célula tumoral, se trataron los ratones con una sola inyección intravenosa del fármaco. Se vigiló diariamente el peso del animal y se midió la evolución del tumor como un aumento en el peso del animal y a través del cálculo de tiempo de sobrevivencia. La terapia se describe como una disminución en la evolución tumoral y un aumento en el tiempo de sobreviví en c i a an realción con un grupo de control no tratado. Estudios iniciales establecieron la sosis terapéutica máxima para AHVB. Subsecuentemente se iniciaron estudios comparativos con vincristina y Navelbina en los que los animales se trataron con cada fármaco en la dosis terapéutica máxima. El Consejo Canadiense sobre Las Normas para el Cuidado Animal se adhirieron estrictamente a todos los protocolos animales empleados y estos fueron aprobados por los Comités para el Cuidado Animal de UBC y la BCCA . Los animales se evaluaron dos veces al día en búsqueda de cualquier signo de tensión (relacionada con el tumor o el fármaco) y si parecía que un animal sufría (pérdida o aumento excesivo de peso, letargo, pelo maltratado, etc.) entonces se sacrificaba al an ima 1.

IDENTIFICACIÓN DE LA DOSIS MÁXIMA TOLERADA DE AHVB Se realizaron el hallazgo de la escala aguda (14 días), y estudios de toxicidad de dosis única en ratas Nb macho a fin de determinar la dosis máxima tolerada de sulfato de vincristina, Navelbina y AHVB cuando se admi n istran como una sola inyección intraperitoneal en estos roedores (ver cuadro 2 ) .

Cuadro 2: Cálculo de dosificación tóxica subaguda de sulfato de vincristina, Navelbina y AHVB cuando se administran a ratas Nb macho sanas como una sola inyección intraperitoneal . Para este fin, las ratas Nb macho sanas sin tumor (escala de peso de 333-399 gramos) se dividieron en grupos de 3 animales. Casa grupo se usó para probar un fármaco en una dosis. En cada grupo, cada animal recibió una inyección i n t r a p e i t o ne a 1 en una dosis particular, como se indica en el cuadro 2. Los volúmenes dentro de los cuales se administraron los fármacos dependieron de la concentración de la solución del fármaco (en solución salina) y el peso de los animales, y variaron de 0.1-1.0 mi. Se usó la solución salina como un control. La dosis más alta de cada fármaco que permitió la sobrevivencia de todos los animales en un grupo (3 de 3) se tomó como la dosificación tóxica subaguda para el fármaco, es decir, 0.7 mg/kg para la vincristina, 2.0 mg/kg para la Navelbina y 3.0 mg/kg para AHVB. La salud de los animales se logró mediante medición diaria del peso además de indicación sobre el comportamiento por la tensión. Los animales continuaron vigilándose a lo largo de el periodo de estudio completo de 14 días. Los animales se sacrificaron en el caso de signos de tensión grave o pérdida de peso excesiva de 20%, A todos los animales se les realizó la necropsia al final del periodo de estudio o en el momento de la euta.nasia prematura. Una vez que se notaba pérdida de peso excesiva de 20% o muerte prematura del animal a un nivel de dosis, la dosis se disminuía hasta que el nadir de la pérdida de peso era menor al 20% y no se observaron muertes prematuras de animales.

ESTUDIOS EN EL MODELO DE LINFOMA Ul.7 EN RATAS Los cultivos de la línea de linfoma pre T-Nb2 no metastático desarrollados en la Universidad de Columbia Británica y designados Nb2-U17 (Anticancer Research 14:2485-2492, 1994) , están disponibles en el British Columbia Cáncer Research Centre. Las células a partir de sultivos de suspensión Nb2-U17 que crecen expo nen c i a lmen t e se inyectaron su cutáneamente en ratas Nb macho maduras an es t es i adas con metoxifurano (5 ratas; 310-380 gramos; 5xl06 células/rata en 1 mi de medio de cultivo) en el cuello usando una aguja de 1.51 calibre 20, Aproximadamente a las 3 so man as, cuando los tumo ros alcanzaron un tamaño de 4-7 cm (longitud + grosor) , se sacrificó a los animales y los tumores se usaron para transplantes como se describe a continuación. El tumor de una rata se extirpó, desmenuzó y el tejido tumoral se colocó en trocares (21 , calibre 13) . Las muestras de tejido se implantaron de manera subcutánea en el cuello de las ratas Nb macho anestesiadas con me t oxi f 1 ur ano (284-404 gramos; 1 trocar por rata) . Este procedimiento se repitió 5 veces para llegar a un total de 60 ratas con tumor para usarse en estudios sobre la eficacia de los 3 fármacos. Cuando los tumores estaban bien establecidos (1.5-2 semanas después) , se seleccionaron tres frupos de 20 ratas, tan coincidentes como fuera posible en términos de peso del tumor y peso de la rata, para la administración de tres artículos de prueba (es decir, un grupo para cada artículo de p ueba ) . Se administró vincristina a las ratas que pesaron 281-384 gramos, con tumores que pesaron 6.3-16.3 gramos. Se administró Navelbina a ratas que pesaron 274-389 gramos con tumores que pesaron 9.1-23.3 gramos. Se administró AHVB a ratas que pesaron 303-400 gramos, con tumores que pesaron 7.9-25.9 gramos. Se calculó el peso de los tumores usando el modelo h em i e 1 i p so i da 1 (peso en gramos = longitud x profundidad x p?/6 en cm ) . Los efectos oncolíticos de cada uno de los tres fármacos se estimaron en una dosis tóxica subcutáneamente, determinada para cada fármaco en estudios preliminares usando ratas Nb macho maduras sin tumor, es decir 3.0, 2.0 y 0.7 mg/kg para AHVB, Navelbina y vincristina, respectivamente como se ilustra en la figura 2. Además, cada fármaco se fijó a 50% y 25% de su dosis subcutáneamente tóxica. ST usaron cinco ratas con tumor para evaluar el efecto de cada nivel de dosis. Los fármacos se administraron de forma intraperitoneal como una pildora individual en un volumen de 0.19-0.31 mi, según lo indicaba el peso de los animales. Para este fin, las preparaciones de fármaco se diluyeron a concentraciones apropiadas usando solución salina salpicada ajustada con ácido acético a un pH de 4.2. Para cada fármaco, un de bióxido de carbono) y se sometió a necropsia. También se vigiló a los animales por lo menos diario para ver sus signos de tensión durante la duración completa del estudio. Los animales que manifestaron síntomas graves (pérdida de peso acelerada, jadeo, postura encorvada, pelaje maltratado) también se sacrificaron y se les realizó una necropsia . El sulfato de anhidrovinblastina ( 3 ' , 4 ' -desh i dr ovi nb 1 as t i na ) se obtuvo de la sección de investigación sobre fármacos de la British Columbia Cáncer Agency (BCCA) (Agencia de Cáncer de Columbia Británica) . El sulfato de vincristina (sulfato de 22-oxovi n ca 1 eu cob 1 as t i na ) se obtuvo de David Bull Laboratories Ltd. , Australia. La NavelbinaMR (tartrato de vinorelbina; 3' , 4'-d i desh i dr o-4 ' - desoxi-C'-norvincaleucoblastina-di-L-tartrato) se adquirió de Borroughs Wellcome Inc. , Canadá; la inyección de cloruro de sodio al 0.9% USP, pH 4.2 se adquirió de Baxter. El Comité Institucional de BCCA para' el Cuidado Animal (IACC) en la UBC aprobó la metodología que involucra animales antes de conducir los estudios (Certificado para el Cuidado Animal No. A94-1602) . Durante el estudio, alojamiento y uso de los animales se realizaron de acuerdo con el consejo Canadiense sobre las Normas para el Cuidado An ima 1. Los resultados de los estudios de eficacia se dan en las figuras 2-3. Las figuras 2-3 presentan promedios de datos de 5 animales o menos. En la figura 2 se demuestra el efecto que tiene administrar una dosis intraperitoneal única subcutáneamente tóxica de AHVB, NavelbinaMR y vincristina sobre el tamaño de tran plantes únicos de linfoma Nb2-U17 bien establecidos (peso promedio 10.13 gramos) y ?l peso de los animales, como una función de tiempo. En tanto los tumores en los animales de control continuaron aumentando su tamaño hasta un peso promedio de aproximadamente 40 gramos en 6 días, los tumores en los animales tratados con fármacosen cada caso tuvieron una regresión a no palpabilidad esencial dentro de 5 días de la admini tración del fármaco. Después del día 10, ocurrió una recurrencia de tumores en animales tratados con Navelbina"* y AHVB en aproximadamen e el mismo grado, En contraste, no se observó recurrencia de tumores en los animales tratados con vincristina (ni siquiera en el día 29) . La figura 2 también muestra que los animales perdieron peso después de la administración del fármaco. Sin embargo, la mayor parte del peso se recuperó después de aproximadamente 17 días. Como controles para cada fármaco, se usaron ratas Nb2-U17 con trnsplante de tumor inyectadas con solución salina. Para cada uno de los seis grupos se usaron cinco animales. Se administró sulfato de vincristina (0.7 mg/kg) en un volumen de 0.20-0.23 mi a ratas que pesaron 281-331 gramos con tumores que pesaron 7.6-14.2 gramos. Se administró NavelbinaMR (2.0 mg/kg) en un volumen de 0.24-0.31 mi a ratas que pesaron 297-389 gramos con tumores que pesaron 11.5-13.7 gramos. Se administró AHVB (3.0 mg/kg) en un volumen de 0.20-0.24 mi a ratas que pesaron 314-374 gramos con tumores que pesaron 8.2-14.2 gramos. Controles de sulfato de vincristina: se administró solución salina en un volumen de 0.21-0.26 mi a ratas que pesaron 294-370 gramos con tumores que pesaron 9.4-14.6 gramos. Controles de Navelbina": se administró solución salina en un volumen de 0.25-0.29 mi a ratas que pesaron 310-365 gramos con tumores que pesaron 9.5-18.2 gramos. Controles de AHVB: se administró solución salina en un volumen de 0.19-0.25 mi a ratas que pesaron 303-400 gramos con tumores que pesaron 7.9-16.6 gramos. La eficacias de cada fármaco se determinaron de manera separada en tres diferentes dosificaciones contra un cont ol . La figura 3 muestra los efectos an t i t umo r a 1 es de los tres fármacos en 50% de sus dosis individuales máximas toleradas. Los datos muestran que la Navelbina0 fue menos potente que la AHVB que a su vez fue menos potente que la vincristina. Las ratas Nb2-U17 con transplante de tumor inyectadas con solución salina se usaron como controles. Para cada uno de los seis grupos se usaron cinco animales. Se administó sulfato de vincristina (0.35 mg/kg) en un volumen de 0,23-0.27 mi a ratas que pesaron 327-384 gramos con tumores que pesaron 6.4-13.4 gramos. Se administró NavelbinaMR (1.0 mg/kg) en un volumen de 0.24-0.28 a ratas que pesaron 296-351 gramos con tumores que pesaron 9.1-14.1 gramos. Se administró AHVB (1.5 mg/kg) en un volumen de 0.20-0.23 mi a ratas que pesaron 308-359 gramos con tumores que pesaron 9.7-19.5 gramos. Controles de sulfato de vincristina: se administró solución salina en un volumen de 0.21-0.26 mi a ratas que pesaron 294-370 gramos con tumores que pesaron 9.4-14.6 gramos. Controles de Navelbina": se administró solución salina en un volumen de 0.25-0.29 mi a ratas que pesaron 310-365 gramos con tumores que pesaron 9.5-18.2 gramos. Controles de AHVB: se administró solución salina en un volumen de 0,19-0.25 mi a ratas que pesaron 303-400 gramos con tumores que pesaron 7.9-16.6 gramos. Las eficiencias de cada fármaco se determinaron de manera separada en tres do ificaciones diferentes contra un control. En la figura 3, se comparan los resultados de los tres fármacos en equivalentes, es decir mitad de dosificaciones subagudamente tóxicas. Los controles en la figura 3 son los mismos que en la figura 2.

ESTUDIOS EN EL MODELO P38S DE MURINQ Se generó una curva de c i t o t oxi c i dad para calcular el ICS0 de vincristina, NavelbinaMR y AHVB en la línea celular P388 de murino (ver figura 5) . En este estudio, primero se separaron de los glóbulos rojos las células P388 derivadas a partir de un crecimiento tumoral ascítico en BDF1 empleando Ficoll-Paque. Se lavaron dos veces los glóbulos blancos aislados después se colocaron dn suero que contiene medio de cultivo de tejido (1 x 105 células por mi de RPMI suplementado con L-glutamina, penicilina, es e tomicina y 10% de suero fetal bovino) y se cultivaron durante dos horas. Todas las células no adh?rent?s se recogieron y la población celular se definió como células P388 y 24 horas después se usó para ensayos citotóxicos. Los ensayos de c i t o t oxi c i d ad se realizaron como ST describe en la sección titulada Caracterización de la Actividad Antitumoral de AHVB In Vi tro. Las concentraciones de fármaco usadas se indican en el eje X. La vincristina se representa por medio de círculos rellenos, la NavelbinaMR por medio de triángulos rellenos y la AHVB por medio de cuadrados rellenos. La actividad antitumoral in vi vo de AHVB se comparó con la de la vincristina, Navelbina0 en el modelo P388 de murino BDF1 como sigue en el procedimiento. Las células P388 se derivaron a partir de ascitis de células P388 de ratones BDF1 hembra previamente inyectados (19-21 gramos) , del depósito." NCI de tumor se inocularon directamente a los ratones. Las células llegaron de NCI congelado en alícuotas de 1 mi. Estas muestras se descongelaron con rapidez a 37°C y subsecuentemen e se inyectaron (dentro de 1 hora) de modo i n r ap er i on ea 1 en dos ratones, 0.5 mi por ratón. Una semana (7 días) después de la inoculación, se recogieron las células tumorales removiendo el fluido peritoneal usando una jeringa estéril con una aguja calibre 22. Las células, combinadas de dos animales, se contaron usando un hemo c i t orne t o , se diluyeron (medio RPMI) a una concent ación de 2xl06 cólulas/ml y después se volvieron a inyectar 0,5 mi en cada uno de los dos ratones BDF1. Las células restantes se lavaron u colocaron en un medio que contiene DMSO y se congelaron (en paquetes de congelador que se enfrían a una velocidad determinada) . Este proceso se repitió cada semana durante un periodo de 2 semanas. Las células usadas para los estudios an i t umor a 1 es se recolectaron del tercer pasaje al vigésimo pasaje. Después del vigésimo pasaje las células no volvieron a usar para estudios experimentales. Células establecidas r e c i e n t ?men t T se derivaron de células congeladas preparadas como se describe a continuación. Los grupos (cinco ratones por grupo) de ratones BDF1 hembras (Charles Rivers, Canadá) ST inyectaron ( intraperitoneal ) con células P388 106 (como se describe a continuación) . Un día después de la inoculación de la célula tumoral, a los ratones se les dio una inyección intravenosa grande del fármaco indicado por medio de vena lateral del rabo. A los grupos de control se les inyectó una solución salina. Se prepararon muestras de fármaco libre en ?l día de la inyección de manera que las concen raciones finales fueran suficientes para suministrar la dosis de fármaco indicada en un volumen de 200 µl. Todas las diluciones se hicieron usando inyección USP de cloruro de sodio al 0.9%, A los ratones ST les confinó brevemente (menos de 30 segundos) durante las inyecciones intravenosas. La dilatación de la vena se logró manteniendo a los animales bajo una lámpara de calor durante un periodo de entre cinco y diez minutos. En la siguiente administración de los artículos de prueba, los animales se pesaron diariamente durante catorce días y se vigilaron los signos de tensión dos veces al día durante los primeros 14 días (una vez al día los fines de semana) y una vez al día durante el resto del estudio, Los animales gravemente tensionados se eliminaron por medio de asfixia con C02 y se registró el momento al día siguiente, aunque las titulaciones de dosis completas se completaron para cada fármaco, el dato mostrado en la figura 6 es el obtenido después de la administración de los fármacos libres en su dosis máxima tolerada. Esta fue 3, 40 y 40 mg/kg para vincristina. Nave 1 b i aMR y AHVB, respectivamente, La figura 4 presenta los resultados de un estudio que demuestra que los alcaloides vincapervinca inducen la pérdida de peso siguiendo una inyección intravenosa única del fármaco indicado en la dosis máxima tolerada (ver figura 6) . Estos datos se obtuvieron como parte del estudio detallado en la figura 6, Después de tratar a los ratones (con el tumor P388) con una dosis única del fármaco indicado, los animales se examinaron dos veces al día (una vez al día los fines de semana) , Se determinó el peso corporal promedio diario durante este periodo y los resultados se muestran en la figura 4. El aumento de peso en el control es una indicación de la evolución del tumor. Los resultados indican que AHVB, administrada a 40 mg/kg, es el menos tóxico de los tres fármacos evaluados. En la figura 7 se presenta la curva de respuesta a la dosis obtenida para AHVB cuando se usa para tratar ratones BDF1 con tumores P388. Los estudios se condujeron como se describe para la figura 6. La dosis máxima tolerada de AHVB (40 mg/kg) como se específica en estos estudios refleja una reacción tóxica muy aguda (en un lapso de 1 hora) que limita el aumento posterior de la dosis para administración í.v. de AHVB. Esto contrasta con la toxicidad más prolongada observada en Navelbina1"1 en su dosis máxima tolerada y sugiere que una capacidad para evitar la toxicidad aguda de AHVB podría conducir a aumentos importantes en su dosis máxima tolerada, En base a la observación de los estudios examinados del fármaco in vi tro, e s sorprendente que AHVB funcionara bien como un agente neoplástico para usarse en terapia de cáncer. Las pruebas in vi tro indican que AHVB TS con istentemente de 10 a 15 veces menos activa en base por molar (Cuadro 1 y figura 5) que la vincristina y la NavelbinaMR. Estos resultados sugieren que AHVB no se desempeñaría bien como un agente antitumoral. Sin embargo, en un estudio de eficacia, que también emplea la línea celular P388 (ver figura 6) , la actividad antitumoral de AHVB en la dosis máxima tolerada (40 mg/kg, inyección i.v. única) es mucho me or que la observada para la vincristina (administrada en la dosis máxima tolerada del fármaco libre d? 3 mg/kg) . La actividad antitumoral mejorada, en este caso, se mide por medio del númerode sobrevivientes a largo plazo (>60 días) . Es importante resaltar que, para este ejemplo, AHVB es aproximadamente 10 ve c e s menos tóxica (en un peso base) que la vincristina. Por lo tanto, se puede dar 10 veces más fármaco y es en esta dosis que se observaron las mejorías en la sobreviví en ci a a largo plazo de animalez con tumores P388.

Cuando se comparan con NavelbinaMR, los resultados in vi vo son incluso más sorprendentes ya que las dosis máximas toleradas de los dos fármacos en animales que tiene tumores P388 son más o menos iguales ( 40 mg/kg ) . La figura 8. muestra la citotoxicidad de AHVB en células SK0V3 y células C-4 con una incubación de tres días. El IC50 para las células SK0V3 y C - 4 fue 4.0 µM y 0.02 µM respectivamente. Ambas líneas celulares se obtuvieron a partir del ATCC y crecieron usando técnicas de crecimiento y medio regulares como se describe a continuación. Los IC50s se determinaron a través de ensayos de citotoxicidad normales descritos a continu ción, con cada pozo conteniendo aproximadamente 104 células.

ESTUDIOS EN EL MODELO DE RATÓN CON TUMOR H460 se Los cultivos d? células H460 humanas de pulmón están disponibles del British Columbia Cáncer Research Centre. ST inyectaron subcu áneamente células dos veces en ratones Rag-2 macho maduros (24 ratones, lxlO4 células/ratón) usando una aguja calibre 26. Las células H460 ST suspendieron en una solución salina d? Hank balanceada sin calcio. Se de ó que los tumores se formaran en los ratones durante 11 días. Cuando los tumores estuvieron bien establecidos se seleccionaron cuatro grupos separados de ratones para la administración de los tres artículos prueba (es decir, un grupo para cada artículo a prueba de bisulfato de AHVB, ditartrato de AHVB y Navelbina") y uno de control. El bisulfato y el ditartrado de AHVB y NavelbinaMR se so 1 u b i 1 i za r on usando dextrosa al 5% saturada con argón. Estos dos artículos estaban en una concentración de 20 mg/ml, Cualquier dilución de la dosis se hizo con d T t rosa al 5%. Los artículos se adminis raron de manera intravenosa en los días 1, 5 y 9, como los controles de dextrosa al 5%. Los pesos corporales y las medidas del tumor se tomaron diario con calibradores durante los primeros 10 días y después cada tercer día durante el resto del estudio. Continuando la, administración de los artículos a prueba, los animales; se determinó diario ?l peso y tamaño del tumor (usando calibradores) durante los primeros 10 días y después cada tercer día durante el resto d?l estudio. Si el tamaño del tumor alcanzaba 1 gramo de peso o el tumor comenzaba a ulcerarse, se sacrificaba a los animales (por medio d? inhalación de bióxido de carbono) y se sometían a una necropsia. También se vigiló a los animales por lo menos una vez al día para ver signos d? tensión durante toda la duración del estudio. También se sacrificó a los animales que manifestaron síntomas graves (pérdida acelerada de peso, jadeo, postura encorvada, pelaje maltratado) y se les realizó una necropsia. Se obtuvo el sulfato de anh i dr o vi nb 1 as t i na (3' , 4'-deshidrovinblastina) d? la sección d? investigación sobre fármacos de la British Columbia Cáncer Agency (BCCA) (Agencia de Cáncer de Columbia Británica) . La NavelbinaMR (tartrato de vinorelbina; 3 ' , 4 ' -d i desh i dr o-4 ' - desoxi-C'-norvincaleucoblastina-di-L-tar trato) se adquirió de Borroughs Wellcome Inc. , Canadá. El Comité Institucional de BCCA para el Cuidado Animal (IACC) en la UBC aprobó la metodología que involucra animales antes de conducir los estudios (Certificado para el Cuidado Animal No. A94-1602) . Durante el estudio, alo amiento y uso de los animales se realizaron de acuerdo con el consejo Canadiense sobre las Normas para el Cuidado Animal . Los resultados de los estudios d? eficacia se dan en la figura 9 y presentan promedios de los datos de 6 animales o menos. Cada ratón en un grupo de artículo dado tenía dos tumores subcutáneos en su espalda. Cada tumor se midió en longitud y grosor u ?l volumen de cada tumor se calculó por medio de (LXW) /2. Entonces se promediaron los dos volúmenes de tumor. Los promedios de volumen de todos los ratones/grupo ST promediaron para dar como resultado una media para la el punto de fecha en la gráfica en la figura 9. El cálculo se realizó cada día que se median los tumores. La desviación normal del promedio y el error normal se calcularon con las barras de erros en la gráfica en la figura 9.

ESTUDIOS EN EL MODELO DE TUMOR SÓLIDO Q^A (CERVICAL ) Los cultivos d? células C-4de carcinoma cervical humano están disponibles del British Columbia Cáncer Research Centre. ST inyectaron subcutáneamente células dos veces en ratones Rag-2 macho maduros (24 ratones, lxlO6 células/ratón) usando una aguja calibre 26, Las células C-4 se suspendieron en una solución salina de Hank balanceada sin calcio. Se dejó que los tumores ST formaran en los ratones durante 31 días. Cuando los tumores estuvieron bien establecidos se seleccionaron cuatro grupos separados de ratones para la adminis ración de los tres artículos a prueba (es decir, un grupo para cada artículo a prueba de bisulfato de AHVB, ditartrato de AHVB y Navelbina") y uno de control. El bisulfato y ?l ditartrado de AHVB y NavelbinaMR se so 1 u b i 1 i zar o n usando dextrosa al 5% saturada con argón. Estos artículos seadmi n i s t r ar on en una dosis de 20 mg/kl I.V. Cualquier dilución de la dosis se hizo con dext rosa al 5%. Los artículos se administraron de manera intravenosa en los días 1, 5 y 9, como los controles de dextrosa al 5%. Los pesos corporales y las medidas del tumor se tomaron regularmente con calibradores durante el periodo del estudio de 69 días. Continuando la administración de los artículos a prueba, los animales; se determinó regularmente el peso y tamaño del tumor (usando calibrado es) durante el periodo del estudio. Si el tamaño del tumor alcanzaba 1 gramo de peso o el tumor comenzaba a ulcerarse, ST sacrificaba a los animales (por medio de inhalación d? bióxido de carbono) y se sometían a una necropsia. También se vigiló a los animales por lo menos una vez al día para ver signos de tensión durante toda la duración del estudio. También se sacrificó a los animales que manifestaron síntomas graves (pérdida acelerada de peso, jadeo, postura encorvada, pelaje maltratado) y también ST les realizó una necropsia. Se obtuvo el sulfato de anhidrovinblastina ( 3 ' , 4 ' -desh i dr ovi nbl as t i na ) de la sección de investigación sobre fármacos de la British Columbia Cáncer Agency (BCCA) (Agencia de Cáncer de Columbia Británica) . La Navelbina" (tartrato de vinorelbina; 3' ,4'-dideshidro-4 ' - desoxi-C'-norvincaleucoblastina-di-L-tartrato) se adquirió de Borroughs Wellcome Inc. , Canadá . El Comité Institucional de BCCA para el Cuidado Animal (IACC) en la UBC aprobó la metodología que involucra animales antes de conducir los estudios (Certificado para el Cuidado Animal No. A94-1602) , Durante el estudio, el ciudado, alojamiento y uso de los animales se realizaron d? acuerdo con ?l Consejo Canadiense sobre las Normas para el Cuidado Animal. Los resultados de los estudios d? eficacia se dan en el cuadro 3 y presentan promedios de los datos de 6 animales o menos. Cada ratón en un grupo de artículo dado tenía dos tumores subcutáneos en su espalda. Cada tumor se midió en longitud y grosor y el volumen de cada tumor se calculó por medio de (LXW)2/2. Entonces se promediaron los dos volúmenes de tumor. Los promedios de volumen d? todos los ratones/grupo se promediaron para dar como resultado una media para la cada punto de fecha. El cálculo ST realizó cada día que se median los tumores, Los tumores tratados con Navelbina"" alcanzaron su 'umbral de crecimiento' observable en el día 14 y continuaron con crecimiento constante en tanto que el distartrado de AHVB alcanzó su umbral ?l día 55. El tumor tratado con bisulfato de AHVB nostro un crecimiento del tumor insignificante hasta el día 69. La Navelbina"8 tuvo un retraso de 84% en crecimiento en el tumor, el ditartrato de AHVB tuvo un retraso extendido de 106%, y el bisulfato de AHVB mostró un retraso marcado en el crecimiento tumoral de más de 209%. El crecimiento del tumor no alcanzó el umbral de crecimiento observable durante 70 día. Este dato ST encuentra en el cuadro 3 a continuación.

CUADRO 3: RETRASO DE TUMOR SÓLIDO EN DATOS DE CRECIMIENTO Tomados juntos, los resultados presentados aquí muestran que AHVB tiene propiedades farmacológicas importantes y únicas i vi vo que llevan a mejoras importantes en la eficacio antitumoral in vi vo en relación con otros alcaloides vincapervinca tales como la vincristina y la NavelbinaMR. Estos resultados son únicos y nuevos porque la actividad in vi vo de AHVB se predecía que fuera mucho menor en base a estudios citotóxicos in vi ro. La presente invención también provee composiciones farmacéuticas que contienen compuestos como los descritos en las reivindicacione en combinación con uno o más diluyentes o auxiliares farmacéuticamente aceptables, inertes o fisiológicamente activos. Los compuestos de la invención se pueden congelar en seco y, si así ST desea, combinarse con otros excipientes farmacéuticamente aceptables para preparar las formulaciones para su administración.

Estas composicione pueden presentarse en cualquier forma apropiada para la vía de administración contemplada. La vía parental e intravenosa son las vías de admini tración preferidas, Se puede administrar 3 ' , 4 ' -anh i dr ovi n b 1 as t i n a de forma oral, tópica, parental, por medio de inhalación o aspersión o rectalmente en formulaciones de unidad de dosificación que contienen agentes, auxiliares y vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. El término parental como se usa en la presente incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, int amuscular, i n t r a es t er na 1 o técnicas de infusión. Además, se provee una formulación farmacéutica que comprende 3' ,4'-anh i dr o vi nb 1 as t i na y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La 3' ,4'-anhidrovinblastina puede estar presente junto con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o auxiliares no tóxicos farmacéuticamente aceptables y si se desea otros ingredientes activos. Las compo iciones farmacéuticas que contienen 3' ,4'-anhidrovinblastina pueden estar en una forma adecuada para el uso oral, por ejemplo, como tabletas, trociscos. grageas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos o prénulos dispersables, cápsulas de emulsión dura o suave, o jarabes o elíxires. Las composiciones destinadas al uso oral se pueden preparar de conformidad con cual.quier técnica conocida para la fabricación de • composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados a partir del grupo que consiste de agentes endulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservadores con el fin de proveer preparacione farmacéuticamente elegantes y degustables. Las tabletas contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación d? tabletas. Por ejemplo, estos excipientes pueden ser diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes d? granulación o desintegración, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o acacia y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco, Las tabletas pueden estar sin revestimiento o pueden estar cubiertas por medio de técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto ga trointestinal y así proporcionar una acción sostenida durante un periodo más largo. Por ejemplo, e puede usar un material d? retraso tal como monoesterato de glicßrilo o diesterato d? glicerilo. Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas duras de gelatina en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolina, o como cápsulas suaves de gelatina en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio aceitoso, por ejemplo, aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva, Las suspensiones acuosas contienen materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, me t i 1 ce 1 u 1 osa , hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; los agentes de dispersión o emulsificación pueden ser fosfatida que surge na uralmen e, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, esterato ' de po 1 i oxi e t i eno , o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo hep t a-de cae t i 1 eneoxi ce t ano 1 , o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de po 1 i oxi e t i 1 ensor b i t o 1 , o productos d? condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados d? ácidos grasos y hexitol, por ejemplo, monooleato de pol i e t i 1 ensor b i t an . Las suspensiones acuosas pueden contener también uno o más conservado es, por ejemplo, etilo o n-propil-p-h i dr oxi benzoa t o , uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes o uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Las suspensiones aceitosas ST pueden formular suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de araquis, aceite de oliva, aceite de a onjolí o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las supensiones aceitosas pueden contener un agente espesador, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcol cetílico , Los agentes edulcorantes tal como los establecidos anteriormente, y los agentes saborizantes se pueden agregar para proveer preparaciones orales degustabl?s. Estas composiciones se pueden preservar agregando un antioxidante como ácido ascórbico. Los polvos y granulos que se pueden dispersar adecuados para prepa aciones de una suspensión acuosa agregando agua proveen el ingrediente activo mezclado con un agente de dispersión o emulsificador, agente de suspensión y uno o más conservadores. Los agentes de dispersión o emú 1 s i f i cador es y los agentes de supensión ST ejemplifican a través de los anteriormente mencionados. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes. Los jarabes y elíxires se pueden formular xon agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Tales formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservador y agentes edulcorantes y saborizantes. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en la forma de una suspensión inyectable acuosa u oleaginosa estéril. Esta suspensión también se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando aquellos agentes d i sper sador es o emú 1 s i f i cad or es y agentes de suspensión adecuados los cuales se han mencionado anteriormente. La preparación estéril inyectable también puede ser una solución o inyección inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico par en t a lmen t e aceptable, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que ST pueden emplear están agua, solución de Ringer y solución isotónica d? cloruro de sodio. Además, los aceites estériles fijos se emplean de manera convencional como un medio solvente o de suspensión. Con este fin se puede emplear cualquier aceiteblando fijo incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico pueden usar en la preparación de inyectables. También se puede administrar 3' , 4'-anh i dr ovi nb 1 as t i na en la forma de agentes edulcorantes y saborizantes. Las composiciones f rmacéuticas también pueden estar en la forma de una suspensión inyectable acuosa u oleaginosa estéril. Esta suspensión también se puede formular d? acuerdo con la técnica conocida usando aquellos agentes d i sp er sador TS o emú 1 s i f i cador es y agentes de suspensión adecuados los cuales se han mencionado anteriormente. La preparación estéril inyectable también puede ser una solución o inyección inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico par e n t a lmen t e aceptable, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites estériles fijos se emplean de manera convencional como un medio solvente o de suspensión. Con este fin se puede emplear cualquier aceiteblando fijo incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico pueden usar en la preparación de inyectables. También se puede administrar 3' , 4'-anh i dr ovi nb 1 as t i na en la forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado el cual es sólido a temperaturas comunespero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales son mantequilla de cacao y polietilenglicoles. También se puede administrar 3 ' , 4 ' -anh i d r ov i n b 1 as t i na de manera parental en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y la concentración utilizados se puede suspender o disolver eb el vehículo. Convenientemente, los auxiliares tales como agentes anestésicos, conservadores y reguladores de pH ST pueden disolver en el v?h í c u 1 o . Para los compuestos de esta invención, la dosis por administrarse, ya sea una dosis única, dosis múltiple o una dosis diaria, variará con el compuesto particular que se esté usando. Los factores que se deben considerar al decidir un régimen de dosis incluyen potencia del compuesto, vía de administración, tamaño del recipiente y la naturaleza de la condición del paciente.

La dosificación que se va a administrar no está sujeta a límites definidos, pero por lo general será una cantidad efectiva. Comúnmente será el equivalente, sobre una base molar de la forma farmacológicamente activa libre producida a partir de una formulación de . dosificación con liberación metabólica del fármaco activo libre para lograr los efectos farmacológicos y fisiológicos deseados. Un oncólogo experto en la técnica del tratamiento del cáncer será capaz de averiguar, sin experimentación inmoderada, los protocolos apropiados para la administ ación efectiva de los compuestos de la presente invención haciendo referencia a los estudios previos d? vinblastina y sus derivados . La AHVB un derivado de la vinblastina alcaloide vincapervinca ha mostrado un potencial citotóxico importante contra un panel de líneas celulares cancerosas humanas, y una actividad significativa contra xenografía del tumor de carcinoma pulmonar de células H460 no pequeñas en ratones SCID/Rag-2. Los ensayos de citotoxicidad in vi tro que utilizan el ensayo de citotoxicidad MTT con un tiempo de exposición al fármaco de 72 horas han mostrado que AHVB es un fármaco citotóxico activo con valores ICS0 que varían de 20-24 nM contra el carcinoma contra el carcinoma pulmonar de células humanas H460 no pequeñas, carcinoma cervical humano C-4m leucemia humana K562, y las líneas celulares A431 epidermoides humanas. AHVB fue aproximadamente 10 veces menos activo que la Navelbina"" cuando se probó in vi ro contra las mismas líneas celulares. Pero d? manera sorprendente, cuando se probó AHVB in vitro en experimentos de eficacia en tumor sólido ST encontró que es más potente que la NavelbinaMR. Se inocularon ratones macho SCID/Rag-2 se. con células H460 y después de 12 días de crecimiento tumoral se sumini traron iv. AHVB y Navelbina"" en dosisd? 10 mg/kg y 20 mg/kg en los días 1,5 y 9. En este modelo, AHVB provocó mayor inhibición del crecimiento tumoral y fue menos tóxica que la NavelbinaMR. Estos resultados sugieren que AHVB puede tener propiedades farmacológicamente convenientes para aplicaciones terapéuticas. Se debe entender que los ejemplos descritos con anterioridad no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Se espera que para el experto en la técnica serán obvias numerosas variantes que son parte de la presente invención, sin alejarse del espíritu de la presente invención. Las reivindicaciones anexadas, analizadas adecuadamente, forma la única limitante al alcance de la presente invención.

Claims (5)

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1 . - El uso de 3' ,4'-anhidrovinblastina, o variantes de la misma, como agente en el tratamiento del cáncer.

2. - El uso de 3' ,4'-anhidrovinblastina como un agente an t i n eo p 1 ás t i co en el tratamiento del cáncer, en el que la concent ación de 3' , 4 ' -anh i dr ovi nb 1 a s t i na está a una concentración ignificativamente más alta que las concentraciones terapéuticamente aceptables para vinblastina o Navelbina0 para usarse en el tratamiento del cáncer 3.- Una composición terapéutica que comprende (el compuesto de la reivindicación 1) 3 ' , 4 ' -anh i dr ovi nb 1 as t i na y uno o más diluyentes o auxiliares fisiológicamente inertes o activos farmacéuticamente aceptables. 4.- Una composición terapéutica que comprende (?l compuesto de la eivindicación 2) 3' ,4'-anhidrovinblastina y uno o más diluyentes o auxiliares fisiológicamente inertes o activos farmacéuticamente aceptables . 5.- El uso de la composición de las reivindicaciones 3 ó 4 para el tratamiento del cáncer. 6.- El uso d? la composición de las reivindicaciones 3 ó 4 para el tratamiento del cáncer cervical. 7.- El uso de la composición de las reivindicaciones 3 ó 4 para el tratamiento del cáncer pulmonar. 8,- El uso de 3' ,4'-anhidrovinblastina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. 9.- El uso de la composición de las reivindicaciones 3 ó 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer .