MXPA99007768A

MXPA99007768A - Analogos del factor x que tienen un sitio de segmentacion de la proteasa, modificado

Info

Publication number: MXPA99007768A
Application number: MXPA/A/1999/007768A
Authority: MX
Inventors: Himmelspach Michele; Schlokat Uwe; Dorner Friederich; Fisch Andreas; Eibel Johann
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1999-08-23
Publication date: 2000-08-01

Abstract

La presente invención se refiere a an logos del Factor X que tienen una modificación en la región del sitio de segmentación de activación del Factor Xa natural, a la modificación que representa un sitio de procesamiento de una proteasa que no se segmenta naturalmente en esta región de la secuencia del Factor X, a las preparaciones que contienen los an logos del Factor X de acuerdo con la invención, y a los procesos para la preparación de los mismos.

Description

ANÁLOGOS DEL FACTOR X QUE TIENEN ÜN SITIO DE SEGMENTACIÓN DE LA PROTEASA, MODIFICADO Campo de la Invención La invención se refiere a análogos del Factor X que tienen una modificación en la región del péptido de activación, a una preparación que contiene los análogos del Factor X de acuerdo con la invención, y a un método de preparación de los análogos del Factor X de cadena única y de cadena doble.

Antecedentes de la Invención Después que el proceso de coagulación de la sangre ha sido iniciado, la cascada de coagulación continua a través de la activación secuencial de varias proenzimas (zimógenos) en la sangre hasta sus formas activas, las' proteasas de serina. Entre ellas están, inter alia, el Factor XlI/XIIa, el Factor Xl/XIa, el Factor IX/IXa, el Factor X/Xa, el Factor VlI/VIIa y la protrombina/trombina. En su estado fisiológico, la mayoría de estas enzimas solamente son activas si están asociadas a una superficie de la membrana en un complejo. Ref.031047 Los iones de Ca están involucrados en muchos de estos procesos. La coagulación de la sangre seguirá ya sea la ruta intrínseca, en donde la totalidad de los componentes de proteína están presentes en la sangre, o la ruta extrínseca, en donde el factor del tejido de la membrana celular desempeña un papel crítico. Finalmente, la herida será cerrada por el fibrinógeno de segmentación de la trombina a la fibrina. El complejo de protrombinasa es responsable de activar la protrombina a la trombina. La trombina es una enzima importante la cual puede actuar como un procoagulante así como un anticoagulante. El complejo de protrombinasa, en el cual, inter alia, el Factor Va (como el cofactor) y el Factor Xa (como proteasa de serina) están involucrados, son ensamblados o conjuntados en una asociación dependiente del Ca en la superficie del fosfolípido. Se describe que el Factor Xa es el componente catalítico del complejo de protrombinasa. El Factor X (factor de Stuart-Prower) es una glicoproteína de coagulación dependiente de la vitamina K por el cual pueden ser activadas las cascadas de coagulación de la sangre intrínseca y extrínseca. El producto de translación primaria del Factor X (pre-pro-FX) tiene 488 aminoácidos y es sintetizado inicialmente por las células del hígado o del hepatoma humano como una proteína precursora de 75 kD de una sola cadena. En el plasma, el Factor X está ampliamente presente como una molécula de doble cadena (Fair et al., 1984, Blood 64:194-204) . Durante la biosíntesis, después de la segmentación de la presecuencia por una peptidasa de la señal (entre Ser23/Leu24) y del propéptido (entre Arg40/Ala41) , la molécula del Factor X de la cadena única es segmentada por el procesamiento y la remoción del tripéptido Argl80-Lysl81-Argl82 a la forma de cadena doble que consiste de la cadena ligera de aproximadamente 22 kD y la cadena pesada de aproximadamente 50 kD, las cuales están conectadas por medio de un puente de disulfuro (Fig. 1). Por lo tanto, el Factor X circula en el plasma como una molécula de cadena doble. Durante el proceso de coagulación de la sangre, el Factor X es convertido desde el zimógeno inactivo para activar el Factor Xa de la proteasa por la proteólisis limitada; en donde el Factor X puede ser activado al Factor Xa en cualquiera de los dos complejos asociados con la membrana: en el complejo del Factor extrínseco Vlla-factor del tejido o en el complejo del Factor Vlla-Factor IXa-fosfolípido-Ca intrínseco, o "complejo de tenasa" (Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185:647-658). Una segmentación proteolítica entre los aminoácidos Arg234/Ile235 conduce a la liberación de un péptido de activación que tiene una longitud de 52 aminoácidos desde la terminal N de la cadena pesada y por consiguiente a la formación de la enzima activa, el Factor Xa. El centro catalítico del Factor Xa está localizado sobre la cadena pesada. La activación por medio del complejo del Factor VIIa-TF (extrínseco) conduce a la formación del Factor Xaa (35 kD) y el Factor Xaß (31 kD) , con un polipéptido de 42 (kD) que se forma, también, si la concentración del Factor Vlla en el complejo es baja. El factor Xaa es formado por una segmentación en Arg234/Ile235 de la cadena pesada y representa la activación del Factor X al Factor Xa. La presentación del Factor Xaß resulta presumiblemente de una segmentación autocatalítica de Arg469/Gly470 en la terminal C de la cadena pesada del Factor Xaa y la remoción de un péptido de 4.5 kD. De manera semejante el Factor Xaa, el Factor Xaß, tienen actividad catalítica. Sin embargo, se ha mostrado que un sitio de unión del plasminógeno está formado por la segmentación del Factor Xaa al Factor Xaß, y porque el Factor Xaß tiene opcionalmente una actividad fibrinolítica o está involucrado en la fibrinólisis como un cofactor. La conversión del Factor Xaa al Factor Xaß, sin embargo, es más lento que la formación de trombina, previniendo por consiguiente la iniciación de la fibrinólisis antes de que un coágulo de sangre sea formado (Pryzdial et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:16614-16620; Prizdial et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:16621-16626) . El polipéptido de 42 kD resulta del procesamiento en la terminal C de la cadena pesada entre Arg469/Gly470 sin el procesamiento previo entre Arg234/Ile235. De manera semejante a un fragmento del Factor Xa? formado por la proteólisis en Lys370, este compuesto intermedio no tiene actividad catalítica (Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185:647-658; Pryzdial et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:16614-16620). La activación del Factor X intrínseco es catalizada por el complejo del Factor IXa-Factor Villa. Los mismos productos de procesamiento son obtenidos durante la activación, pero el producto del Factor Xaß es obtenido en una cantidad más grande que los otros productos de procesamiento del Factor X (Jesty et al., 1974, J. Biol. Chem. 249:5614). In vitro, el Factor X, por ejemplo, puede ser activado por el veneno de víbora de Russell (RW) o la tripsina (Bajaj et al., 1973, J. Biol. Chem. 248:7729-7741) o por activadores fisiológicos purificados, tales como el complejo de FVIIa-TF o el complejo del Factor IXa-Factor Villa (Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185:647-658) . Los productos del Factor X disponibles más comercialmente del plasma, contienen una mezcla del Factor Xaa y el Factor Xaß, a causa de que después de la activación del Factor X al Factor Xa se forma principalmente el Factor Xaa, el cual es, a su vez, segmentado al Factor Xaß en un proceso autocatalítico. Para producir un producto de Factor Xa uniforme que tiene una integridad estructural elevada, el documento EP 0 651 054 sugirió activar el Factor X con RW durante un período de tiempo prolongado de modo que el producto final resultante contenga substancialmente el Factor Xaß. Los subproductos, por ejemplo el Factor Xaa, así como la proteasa fueron removidos subsiguientemente por varios pasos cromatográficos. El ADNc del Factor X ha sido aislado y caracterizado (Leytus et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci., E.U.A., 82:3699-3702; Fung et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci., E.U.A., 82:3591-3595). El Factor X Humano ha sido expresado in vitro en varios tipos de células, tales como células del riñon embrional humano o células de CHO (Rudolph et al., 1997, Prot . Expr. Purif. 10:373-378; Wolf et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:13726-13730) . Sin embargo, se ha encontrado que en la expresión recombinante del Factor X humano, el procesamiento en la posición Arg40/Ala41 es ineficiente, como lo opuesto a la situación in vivo, y que las diferentes terminales N en la cadena ligera del Factor X son producidas ( olf et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:13726-13730). El Factor X Recombinante (rFX) se activó al rFactor Xa (rFXa) por RW in vitro, o rFXa se expresó directamente, con el péptido de activación que es delecionada desde el aminoácido 183 hasta el aminoácido 234 y reemplazado por rFXa de cadena doble para permitir el procesamiento directamente a una forma rFXa de doble cadena. Aproximadamente 70% del rFX purificado fueron procesados en la cadena ligera y pesada mientras que el 30% restante representó el rFX de una sola cadena de 75 kD. La expresión directa de rFXa condujo a la formación del Factor Xa activo, pero también de los compuestos intermedios inactivos. Wolf et al. (1991, J. Biol. Chem. 266:13726-13730) detectó todavía una actividad reducida del Factor X recombinante, la cual los mismos atribuyeron a la capacidad más pobre del rFX que va a ser activado por RW y a las poblaciones de proteína y polipéptido inactivas de la molécula precursora de una sola cadena. En particular, los mismos encuentran una inestabilidad de rFXa elevada cuando son expresados por células recombinantes, las cuales los mismos atribuyen a la gran velocidad de la proteólisis.

Para estudiar la función del péptido C-terminal del Factor Xaa, Eby et al. (1992, Blood 80 (Suppl. 1):1214 A) introdujo un codón de detención en la posición Gly430 de la secuencia del Factor X. Sin embargo, los mismos no encontraron una diferencia entre la velocidad de activación del Factor Xa (FXaa) y el ß-péptido o un mutante de deleción sin el ß-péptido (FXaß) . El Factor Xa es un componente importante del complejo de protrombinasa y puede ser utilizado por lo tanto para tratar pacientes que sufren de desórdenes de coagulación de la sangre, por ejemplo hemofilia. Particularmente el tratamiento de pacientes con hemofilia que sufren de una deficiencia del Factor VIII o el Factor IX con los concentrados del factor producidos a partir del plasma es complicado por la formación de anticuerpos inhibidores contra estos factores en la terapia a largo plazo. Por lo tanto, se han desarrollado varias alternativas para tratar a los hemofílicos con factores que tienen una actividad de derivación. El uso del concentrado de complejo de protrombina, el complejo de protrombinasa activada parcialmente (APPC) , el Factor Vlla o FEIBA, han sido sugeridos. Las preparaciones comerciales con la actividad de derivación del Factor VIII (FEIBA) son, por ejemplo, FEIBA® o Autoplex®. FEIBA® contiene unidades comparables del Factor II, el Factor VII, el Factor IX, el Factor V, y las trazas de los factores de coagulación activados, tales co o trombina y el Factor Xa o un factor que tiene actividad semejante al Factor X (Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Complex Concentrates . Ed. Mariani, Russo, Mandelli, pp. 77-87). Elsinger señala particularmente la inmportancia de la actividad "semejante al Factor Xa" en FEIBA®. La actividad de derivación del Factor VIII fue mostrada por Giles et al (1988, British J. Haematology 9:491-497) para una combinación del Factor Xa purificado y los fosfolípidos en un modelo animal. Por lo tanto, las proteínas del Factor X/Xa o semejantes del Factor X/Xa, ya sea solas o como un componente de un complejo de coagulación, están en una demanda creciente y pueden ser utilizadas en varios campos de aplicación en terapia de hemostasis. In vivo así como in vitro, la vida media del Factor Xa es considerablemente más breve que la vida media del zimógeno. Por ejemplo, el Factor X puede ser almacenado establemente en glicerol durante 18 meses, mientras que el Factor Xa es estable durante solamente 5 meses durante las mismas condiciones (Bajaj et al., 1973, J. Biol. Chem. 248:7729-7741) y muestra una actividad reducida en más del 60% después de 8 meses en glicerol a 4 °C (Teng et al., 1981, Thrombosis Res. 22:213-220). La vida media del Factor Xa en el suero es de solo 30 segundos. A causa de que el Factor Xa es inestable, la administración de las preparaciones del Factor X han sido sugeridas (U.S. 4,501,731). Sin embargo, si la hemorragia es tan seria que el paciente podría morir, particularmente en los hemofílicos, la administración del Factor X es inefectiva, a causa de que debido a la deficiencia del "complejo de tenasa" en la ruta intrínseca de la coagulación de la sangre, el Factor X puede no ser activado suficientemente al Factor Xa, y la activación por medio de la ruta extrínseca frecuentemente es demasiado lenta para mostrar efectos rápidamente. Además, los hemofílicos tienen cantidades suficientes del Factor X, pero su actividad de protrombinasa es 1000 veces menor que aquella del Factor Xa. En tales casos es necesario administrar el Factor Xa activado directamente, de manera opcional en combinación con fosfolípidos, como se describió en Giles et al. (1988, British J. Haematology 9:491-497) o con otros factores de coagulación, por ejemplo con la actividad de derivación del Factor VIII. En la preparación del Factor Xa a partir del Factor X, la activación se ha llevado a cabo así en su mayoría por activadores neofisiológicos de origen animal, tales como RW o tripsina, y fue necesario asegurarse absolutamente que el producto final esté, completamente libre de estas proteasas. Como se mencionó anteriormente, cuando el Factor X es activado al Factor Xa, más bien un número de compuestos intermedios, algunos de ellos inactivos, son formados (Bajaj et al., J. Bio. Chem. 248:7729-7741; Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185:647-658) . La presencia de tales compuestos intermedios conduce a una actividad específica reducida del producto y puede producir compuestos intermedios los cuales pueden funcionar como antagonistas de proteasas de serina activos. Por lo tanto, la preparación de un producto puro, uniforme, que tiene una actividad específica elevada de acuerdo con los métodos convencionales requiere procesos complejos de activación y purificación cromatográfica . Por consiguiente, el objeto de la presente invención es proporcionar una preparación que contenga un polipéptido que tenga la actividad del Factor X/Xa el cual exhiba alta estabilidad y pueda ser activado al Factor Xa sin utilizar alguna de las proteasas convencionales, particularmente aquellas de origen animal, tales como, por ejemplo, TW o tripsina. Otro objeto es proporcionar una preparación farmacéutica que tenga la actividad de derivación del Factor VIII.

De acuerdo con la presente invención, el objeto es alcanzado proporcionando un análogo del Factor X que tiene una modificación en la región del sitio de segmentación de activación del Factor Xa natural. La modificación en la región del sitio de segmentación de la activación es un sitio de procesamiento y reconocimiento novedoso para una proteasa, tal sitio no está localizado naturalmente en esta posición en el polipéptido, tal proteasa podría no segmentar usualmente el polipéptido en este sitio. El análogo del Factor X de acuerdo con la invención es modificado particularmente en el péptido de activación el cual es removido cuando el Factor X es activado al Factor Xa. Al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del Factor X es modificado. Dicha modificación está localizada particularmente en la región C-terminal del péptido de activación y representa, al menos, un intercambio de al menos un aminoácido entre las posiciones Gly228 y Arg234 de la secuencia de aminoácidos del Factor X. La posición de los aminoácidos está basada en la numeración de acuerdo con la secuencia mostrada en la Figura 1, partiendo de Metí y finalizando con Lys488. Dicha modificación en el análogo del Factor X de acuerdo con la presente invención es preferentemente un intercambio de un sitio de procesamiento del Factor VIIa/Factor IXa localizado en esta posición para un sitio de segmentación alternativo de una proteasa diferente. La modificación puede ser una substitución de al menos un aminoácido, o una inserción de una secuencia de péptidos que representa un sitio de segmentación o reconocimiento de la proteasa. En el análogo del Factor X de acuerdo con la invención, la modificación es preferentemente de tal modo que la misma represente una secuencia de detección o segmentación para una proteasa del grupo de las endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 (co o se describió en Barr et al., 1991, Cell 66:1-3 o en U.S. 5,460,950), de las serina proteasas, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor lia, Factor Xa, o de calicreina, o de un derivado de estas proteasas. Preferentemente, la modificación es seleccionada de tal modo que el procesamiento por una de estas proteasas conduzca a un polipéptido que corresponde al Factor Xa natural, el cual es substancialmente igual a la secuencia del Factor Xa natural y también exhibe la actividad del Factor Xa. Para un procesamiento óptimo, puede ser necesario en casos individuales intercambiar también el aminoácido Ile235. Preferentemente, sin embargo, la isoleucina del aminoácido terminal de NH2 de la cadena pesada todavía debe estar presente después de la activación, a causa de que este aminoácido desempeña una función esencial en la formación de la cavidad de unión del substrato (Watzke et al., 1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, ed. Katherine High & Harold Roberts) . Los análogos del Factor X de acuerdo con la invención tienen una diferencia estructural, particularmente sobre el nivel de aminoácidos, cuando se compara con una secuencia del Factor X natural, pero pueden ser activados similarmente al Factor X natural y tienen la actividad del Factor Xa después de la activación. La invención proporciona un número ejemplar de análogos del Factor X que tienen una modificación en el péptido de activación con relación a la secuencia del Factor X natural y diferente especificidad de la proteasa. Las modificaciones pueden estar localizadas en una o más posiciones en la región entre el aminoácido Gly228 y Arg234, y opcionalmente Ile235, con base en la secuencia del Factor X numerada Metí a Lys488 de acuerdo con la Figura 1. Los substituciones de los aminoácidos pueden estar en las posiciones Ile235 (Rl), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3) , Asn231 (R4), Asn230 (R5) y Asp229 (R6), con Arg234 que permanece preferentemente sin cambio. Preferentemente, los análogos del Factor X de acuerdo con la invención contienen una secuencia del Factor X con Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234, en donde Rl = lie, Val, Ala, Ser o Thr; R2 = Thr, Pro, Gly, Lys o Arg; R3 = Leu, Phe, Lys, Glu, Met, Gln, Ser, Val, Arg o Pro; R4 = Asn, Asp, lie, Ser, Met, Pro, The, Lys o Arg; R5 = Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His o Arg; y R6 = Asp, Phe, Thr, Arg, Leu o Ser. Las modalidades preferidas de los análogos del Factor X de acuerdo con la invención son análogos del Factor X que tienen una modificación con a) Rl=Val, R2=Thr, R30Phe, R4=Asp, R5=Asn y opcionalmente R6=Phe (Figura 2A) , y procesados por el Factor Xla; b) Rl=Ser, R2=Arg, R3=Thr, R4=Leu (Figura 2B) , y procesados por el Factor lia; c) Rl=Ile, R2=Pro, R3=Lys, R4=Ile, y opcionalmente R5=Lys y/o R6=Thr (Fig. 2C) , o Rl=Ile, R2=Thr, R3=Ser, R4=Thr, y opcionalmente R5=Lys y/o R6=Thr (Fig. 21), y procesados por el factor Xlla; d) Rl=Ile, R2=Thr, R3=Met, R4=Ser, y opcionalmente R5=Ser y/o R6=Leu (Figura 2D) , y procesados por calicreina; e) Rl=Ile, R2=Gly, R3=Gln, R4=Pro, y opcionalmente R5=Lys y/o R6=Ser (Figura 2H) , o Rl=Ile, R2=Thr, R3=Lys, y R4=Met (Figura 2E) , o Rl=Ile, R2=Gly, R3=Glu, y R4=Ile (Figura 2F) , y procesados por el Factor Xa; f) Rl=Ile, R2=Lys, R3=Arg, R4=Arg, y opcionalmente R5=Glu y/o R6=l g) Leu, o Rl=Ile, R2=Thr, R3=Val, R4=Arg, y opcionalmente R5=Ala y/o R6=Leu, o Rl=Ile, R2=Arg, R3=Val, R4=Arg, y opcionalmente R5=Gln y/o R6=Leu, o Rl=Ile, R2=Arg, R3=Arg, R4=Arg, y opcionalmente R5=His y/o R6=Leu, o Rl=Ile, R2=Lys, R3=Pro, R4=Arg, y opcionalmente R5=Asn y/o R6=Leu, o Rl=Ile, R2=Lys, R3=Arg, R4=Ile, y opcionalmente R5=Arg y/o R6=Leu, o Rl=Ile, R2=Lys, R3=Ser, y R4=Arg, o Rl=Ile, R2=Thr, R3=Leu, y R4=Arg (todos véanse en la Figura 2G) , con aquellos mencionados bajo f)_ que son procesados por una endoproteasa dibásica, tal como furina, PACE, kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, o por un derivado de una de estas proteasas.

La Figura 2 A-I muestra una selección posible de las modificaciones y los intercambios de aminoácidos que conducen a una especificidad de la proteasa diferente. Las modificaciones pueden ser llevadas a cabo, por ejemplo, por mutagénesis in vitro dirigida o PCR u otros métodos de ingeniería genérica conocidos del estado de la técnica los cuales son adecuados para cambiar específicamente un secuencia de ADN para los intercambios dirigidos de los aminoácidos. De acuerdo con la presente invención, el análogo del Factor X de acuerdo con la invención es activado al Factor Xa natural o un análogo del Factor Xa preferentemente por una proteasa seleccionada del grupo de las endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, el grupo de las proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, el Factor Xla, Factor Xa, Factor lia, o calicreina, o un derivado de estas proteasas. Una de las dificultades en la preparación del Factor activo . Xa es su inestabilidad, a causa de que aparte del Factor Xaa y el Factor Xaß, otros compuestos intermedios inactivos son formados por la autocatálisis . Para la preparación de las moléculas del Factor X/Xa activas, esencialmente intactas y las moléculas semejantes al Factor X/Xa, respectivamente, podría ser deseable por lo tanto obtener solamente tales proteínas las cuales conducen a productos finales estables. Se sabe bien que un sitio de segmentación preferido para el procesamiento del Factor Xaa (FXaa) al Factor Xaß (FXaß) está entre Arg469/Gly470. Con base en la búsqueda por Eby et al. (1992, Blood, Vol. 80, Suppl. 1, 1214), a continuación de un péptido con terminal de carboxi prominente (residuos de aminoácidos 476-487) del Factor X, se encuentran otros péptidos más cortos (residuos de aminoácidos 474-477) los cuales son formados por autocatálisis del Factor Xaa. Para el procesamiento dirigido al sitio del Factor X intacto al Factor Xa esencialmente activo sin obtener compuestos intermedios de procesamiento inactivos, los análogos del Factor X de la invención tienen opcionalmente modificaciones adicionales . Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad particular, el análogo del Factor X de acuerdo con la invención tiene una modificación adicional en la región C-terminal de la secuencia de aminoácidos del Factor X. De acuerdo con una modalidad, un análogo del Factor X como se describió anteriormente tiene un ' ß-péptido intacto (FXa) . El análogo del Factor X de acuerdo con la invención particularmente tiene una modificación en la región del sitio de segmentación del ß-péptido C-terminal el cual previene la segmentación del ß-péptido del Factor X después de la activación del Factor X al Factor Xa. Por consiguiente una molécula del Factor Xa es obtenida la cual puede ser aislada hasta el 100% como la molécula del Factor Xaa intacta. La modificación puede ser una mutación, deleción o inserción en la región de la secuencia de aminoácidos del Factor X entre las posiciones de los aminoácidos Arg469 y Ser476 y opcionalmente de Lys370. Sin embargo, una substitución de aminoácidos es preferida, la cual previene que el polipéptido se desdoble como una consecuencia del intercambio de aminoácidos, lo cual podría influir en la estructura y así posiblemente en la función y actividad de la proteína. De acuerdo con una modalidad, los análogos del Factor X de la invención tienen uno de los aminoácidos en la posición Arg469 y/o Gly470 intercambiada, con Arg469 que es intercambiada preferentemente por Lys, His o lie, y Gly470 que es intercambiado preferentemente para Ser, Ala, Val o Thr. Además de una mutación en la posición Arg469 y/o Gly470, los análogos del Factor X de acuerdo con la invención pueden tener otra mutación en la posición Lys370 y/o Lys475 y/o Ser476. La substitución de aminoácidos en una de estas posiciones previene el procesamiento del Factor Xaa al Factor Xaß o al Factor Xa?, respectivamente, a causa de que la(s) secuencia (s) de procesamiento natural es (son) modificadas de tal modo que una fragmentación autocatalítica ocasional del péptido con terminal de carboxi llegue a ser imposible. De acuerdo con una modalidad adicional, el análogo del Factor X de la invención tiene un ß-péptido carboxi-terminal delecionado (FXß). Tal análogo del Factor X puede ser preparado expresando un ADNc que codifica un análogo del Factor X en un sistema de expresión recombinante, clonando solamente aquellas secuencias que codifican los aminoácidos Metí a Arg469. De acuerdo con una modalidad adicional, el análogo del Factor X de acuerdo con la invención tiene una señal de detención de la translación en la región C-terminal de la secuencia del Factor X. Esta señal de detención de la translación está localizada preferentemente en una posición a continuación de un aminoácido C-terminal formado después del procesamiento natural. Por lo tanto, la señal de detención de la translación es preferentemente en la posición del aminoácido 470 de la secuencia del Factor X, de modo que el Arg469 terminal del Factor Xaß sea retenido. Para este propósito, el codón GGC que codifica el aminoácido Gly470 es substituido por T7?A, TAG o TGA. Otro aspecto de la presente invención se refiere a los análogos del Factor X los cuales son activados al Factor X natural o a los análogos del Factor Xa por el tratamiento con una proteasa inapropiada in vitro. Dependiendo del análogo del Factor X utilizado y activado, un polipéptido que corresponde al Factor Xa natural y es esencialmente idéntico, o un polipéptido que tiene la actividad del Factor Xa pero que tiene las modificaciones relativas a la secuencia del Factor Xa natural la cual, sin embargo, no limita su actividad biológica, son obtenidos. Cuando los análogos del Factor X son activados, los cuales son modificados en la región del péptido de activación en la secuencia del péptido de activación, solamente los polipéptidos que corresponden a las moléculas del Factox Xa natural son obtenidos. Si tal análogo del Factor X tiene adicionalmente una señal de detención de la translación en la región C-terminal del ß-péptido, se obtienen las moléculas homologas del Factor Xaß. Sin embargo, si el análogo del Factor X es empleado el cual tiene modificació (es) dentro de la secuencia del ß-péptido que conducen al ß-péptido que no es segmentado completamente, un análogo del Factor Xaa con un intercambio de aminoácido en la terminal C de la molécula es obtenido. Los análogos del Factor X de la invención solamente tienen modificaciones las cuales cambian la especificidad para la capacidad que va a ser activada y que no tienen influencia en la actividad. Por lo tanto, en cualquier caso, las moléculas del Factor Xa o ' los análogos del Factor Xa, activos funcional y biológicamente, son obtenidos. La activación in vitro puede ser efectuada por una proteasa seleccionada del grupo de las endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, el grupo de las proteasas de serina, tales como el Factor lia, el Factor Xlla, el Factor Xla, el Factor Xa, o la calicreina, o un derivado de estas proteasas. Esta dentro del alcance de la presente invención utilizar cualquier proteasa, excepto RW, tripsina, Factor IXa o Factor VIIA, siempre que la misma sea apta para procesar el análogo del Factor X de la invención al Factor Xa. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el análogo del Factor X contiene una modificación que permite la activación del análogo del Factor X al Factor Xa, preferentemente el Factor Xa natural, in vivo. En este contexto, el Factor Xa "natural" significa que el Factor Xa activado, derivado del análogo del Factor X de acuerdo con la invención, tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a y que es homologa con el Factor Xa natural, y tiene la actividad del Factor Xa. Dicha modificación es elegida de tal modo que el Factor X es procesado al Factor Xa por una proteasa presente in vivo, es decir en el cuerpo, preferentemente una proteasa presente en la cascada de coagulación de la sangre. La proteasa puede ser una proteasa seleccionada del grupo de las proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, Factor lia o calicreina. Los análogos del Factor X que tienen una modificación en la región C-terminal de la molécula del Factor X aparte de la modificación en el péptido de activación son activados al análogo del Factor Xa correspondiente in vivo, también, como se describió anteriormente . Aunque Wolf et al. (1991, J. Biol. Chem. 266:13726-137309), por ejemplo ha supuesto que una endopeptidasa, tal como Kex2, furina o PACE, está involucrada en el procesamiento del mutante de deleción del Factox Xa descrito por este grupo, los mismos no dan una sugerencia en cuanto a la influencia de una de estas proteasas sobre el procesamiento del Factor X. De manera similar, la Patente U.S. No. 5,660,950 describe la preparación recombinante del PACE y el uso de la proteasa para mejorar el procesamiento de las proteínas dependientes de la vitamina K. En una larga lista de los factores de la sangre, el Factor X es mencionado entre otros, pero ningún dato es provisto para verificar este fundamento. La presente invención demuestra inequívocamente para la primera vez que una proteasa necesaria para el proceso de maduración del Factor X es una endoproteasa dibásica, particularmente la furina endógena. In vivo, la endoproteasa medía principalmente la segmentación de la molécula del Factor X de la cadena única a la forma madura que consiste de la cadena ligera y pesada. In vitro, la misma también medía la segmentación de la secuencia del propéptido del Factor X (Ejemplo 2) . Los análogos del Factor X de acuerdo con la presente invención que tienen un sitio de segmentación de la proteasa para una proteasa que no existe naturalmente en una célula son segmentados por reacciones de procesamiento selectivas solamente en aquellos sitios los cuales también son segmentados en el Factor X natural. Por consiguiente, la molécula del Factor X recombinante es obtenida la cual consiste solamente de la cadena ligera de 22 kD y la cadena pesada de aproximadamente 50 kD y no tiene moléculas del Factor X inactivas como las formadas por el procesamiento no específico. De manera similar a las moléculas del Factor X natural, estas moléculas del Factor X modificadas no son activadas al Factor Xa por la proteasa intracelular. Las mismas son activadas al Factor Xa solamente después de esto por las proteasas apropiadas (es decir preferentemente la proteasa de serina o las proteasas relacionadas con subtilisina) . Por consiguiente un análogo del Factor X de doble cadena es provisto de acuerdo con una modalidad. De acuerdo con una modalidad particular, unos análogos del Factor X son provistos los cuales están presentes preferentemente en la forma purificada como moléculas de una sola cadena. Expresando los análogos del Factor X en una célula deficiente de la proteasa dibásica, el pro-Factor X es obtenido como una molécula de una sola cadena. La molécula del Factor X de una sola cadena está caracterizada por una alta estabilidad e integridad molecular. Hasta ahora, una molécula del Factor X de una sola cadena no ha podido ser aislada en la forma purificada, a causa de que es procesada rápidamente a la forma de doble cadena (Fair et al., 1984, Blood 64:194-204). Los análogos del Factor X de una sola cadena, recombinantes, pueden ser procesados por el procesamiento específico a la forma del Factor X de doble cadena y activados subsiguientemente al Factor Xa o al análogo del Factor Xa, respectivamente. Esto puede ser efectuado llevando en contacto una molécula del Factor X recombinante de una sola cadena, aislada de una célula deficiente en proteasa y una proteasa dibásica, tal como furina/PACE o Kex2, y el procesamiento a un análogo del Factor X de doble cadena. El análogo del Factor X de doble cadena puede ser activado al Factor Xa o al análogo del Factor Xa, respectivamente. Esto puede ser efectuado, por ejemplo, aislando un análogo del Factor X que tiene un sitio de segmentación específico para la purina debido a una modificación en la región del péptido de activación, desde una célula deficiente en serina como una molécula de una sola cadena y subsiguientemente procesándola a una molécula del Factor Xa activada llevándola en contacto con esta endoproteasa. De manera semejante, un análogo del Factor X de una sola cadena, aislado, que tiene una modificación en el péptido de activación el cual permite un procesamiento alternativo por una proteasa del grupo de las proteasas de serina o la calicreina, solamente puede ser segmentado para dar una molécula del Factor X de doble cadena tratándola con una endoproteasa dibásica, tal como la furina, tal molécula del Factor X de doble cadena en el curso adicional de los eventos puede ser llevada en contacto con una proteasa de serina de tal manera que ocurre la activación al Factor Xa o al análogo del Factor Xa, respectivamente. Un análogo del Factor X aislado del cultivo celular como una molécula de doble cadena puede ser tratado con la proteasa específica para la activación. Debido a la reacción de procesamiento selectiva y dirigida, un Factor X o análogo del Factox Xa así obtenido, tiene una integridad estructural y estabilidad elevada y, en particular, está libre de los compuestos intermedios del análogo del Factor X/Xa inactivos y los productos de degradación autoproteolítica. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al ADN recombinante que codifica para los análogos del Factor X de la invención. El ADN recombinante resulta después de la expresión en un análogo del Factor X con una secuencia de aminoácidos que corresponde al Factor X humano excepto para una modificación que tiene influencia en la especificidad del procesamiento y los productos del procesamiento, mientras que la actividad coagulante biológica básicamente permanece sin cambio.

De acuerdo con un aspecto adicional, también las células transformadas que contienen el ADN recombinante son provistas. Un aspecto adicional de la invención se refiere a una preparación que contiene un análogo del Factor X purificado o una proteína precursora del mismo que tiene una modificación en la región dentro del sitio de activación del Factor Xa natural. La modificación en la región del sitio de segmentación de la activación es un sitio de reconocimiento y segmentación novedoso no localizado naturalmente en esta posición en el polipéptido para una proteasa la cual usualmente no procesa el polipéptido en esta posición. La preparación puede ser una preparación purificada del análogo del Factor X de una sola cadena o de doble cadena; el polipéptido puede ser obtenido de un sistema de cultivo celular ya sea después del aislamiento del sobrenadante del cultivo celular o de un extracto del cultivo celular. Un análogo del Factor X recombinante prepurificado a partir de un sistema de cultivo celular puede ser purificado adicionalmente por métodos conocidos de la técnica previa. Los métodos cromatográficos son particularmente adecuados para este propósito, tales como la filtración con un gel, el intercambio iónico o la cromatografía de afinidad.

De acuerdo con una modalidad, la preparación de acuerdo con la presente invención contiene el análogo del Factor X como una molécula de una sola cadena en una forma aislada. Tal preparación es preparada aislando un análogo del Factor X, obtenido por la preparación recombinante, como una molécula de una sola cadena del sistema celular, preferentemente un cultivo celular de células las cuales carecen de la endoproteasa que procesa la molécula de una sola cadena en cadenas ligera y pesada. De acuerdo con un aspecto particular, la preparación contiene un análogo del Factor X de una sola cadena que tiene una modificación que permite la activación in vitro al Factor Xa por una de las proteasas seleccionadas del grupo de las endoproteasas dibásicas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7. La activación es efectuada llevando el análogo del Factor X en contacto con la proteasa, a través de la cual debido al procesamiento natural, una segmentación a la forma del Factor X maduro es efectuada, y a causa de la modificación, el péptido de activación es segmentado completamente y se forman el Factor Xa o el análogo del Factor Xa. En la preparación de acuerdo con la invención, el análogo del Factor X como una molécula de una sola cadena puede estar presente ya sea como el Factor Xa (FXa) o con una deleción del ß-péptido. La preparación contiene particularmente el análogo del Factor X en la forma enzimáticamente inactiva y tiene una pureza de al menos 80%, preferentemente de al menos 90%, particularmente en forma preferible de al menos 95%, y no contiene ningún intermediario proteolítico inactivo del análogo del Factor X/Xa. De acuerdo con una modalidad adicional, la preparación de acuerdo con la presente invención contiene el análogo del Factor X preferentemente como una molécula de doble cadena en la forma aislada. Para este propósito, el análogo del Factor X, por ejemplo, obtenido por la preparación recombinante como una molécula de una sola cadena de un sistema celular, es segmentado in vitro, es decir fuera de la célula, por una proteasa, preferentemente una proteasa dibásica, a la forma de doble cadena. Esto puede ser efectuado mezclando la proteasa directamente con el sobrenadante del cultivo de los clones que expresan los análogos del Factor X, ya sea mezclando la proteasa purificada o un sobrenadante del cultivo celular de un cultivo celular que expresa la proteasa en la forma recombinante, o por el co-cultivo del análogo del Factor X y los clones que expresan la proteasa.

De manera similar, el sobrenadante del cultivo celular que contiene el análogo del Factor X o el análogo del Factor X purificado, puede ser llevado en contacto con una proteasa inmovilizada, por lo cual ocurre el procesamiento a la forma de doble cadena. En este proceso, la proteasa está unida preferentemente a una matriz, y el sobrenadante del cultivo celular o una preparación purificada que contiene el análogo del Factor X se hace pasar sobre esta matriz. Sin embargo, también es posible inmovilizar el análogo del Factor X mientras que la proteasa está en la fase móvil. De manera similar, los reactivos (el análogo del Factor X y la proteasa) pueden ser mezclados e incubados durante un cierto período de tiempo. Subsiguientemente, la proteasa es removida de la mezcla, por ejemplo por cromatografía de afinidad. La forma de doble cadena del análogo del Factor X también puede ser obtenida coexpresando la proteasa y el análogo del Factor X directamente en una célula dada y opcionalmente purificándola. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la preparación contiene un análogo del Factor X de una sola cadena o de doble cadena que tiene una modificación que permite la activación al Factor Xa o al análogo del Factor Xa in vitro. La activación del análogo del Factor X al Factor Xa o al análogo del Factor Xa, respectivamente, puede ser llevada a cabo llevando el análogo del Factor XXX en contacto con una proteasa seleccionada del grupo de endoproteasas dibásicas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4 , PACE 4, LPC/PC7, el grupo de las proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, Factor lia o calicreina, o un derivado de estas proteasas. La proteasa puede ser inmovilizada sobre un portador. La preparación de acuerdo con la invención puede servir como un material de partida para la preparación y la producción del Factor Xa. Para una preparación a gran escala, la preparación que contiene el análogo del Factor X de una sola cadena o de cadena doble, por ejemplo, es llevada en contacto con la proteasa inmovilizada opcionalmente bajo condiciones que permiten la activación óptima del análogo del Factor X al Factor Xa, y un Factor Xa o análogos del Factor Xa son obtenidos. El análogo del Factor Xa/Xa así producido puede ser formulado subsiguientemente a una composición farmacéutica de conformidad con los métodos conocidos generalmente. De acuerdo con una modalidad particular, la preparación que contiene el análogo del Factor X de una sola cadena, o de doble cadena, purificado, contiene un portador aceptable fisiológicamente y es formulado opcionalmente como una preparación farmacéutica. La formulación puede ser efectuada de acuerdo con un método común per se, y la misma puede ser mezclada con una solución amortiguadora que contiene sales, tales como NaCl, CaCl2, y aminoácidos, tales como glicina y/o lisina, a un pH en el intervalo de 6 a 8, y formulada como una preparación farmacéutica. La preparación purificada que contiene el análogo del Factor X puede ser provista como un producto almacenable en la forma de una solución hecha fácilmente, liofilizado o congelada a una temperatura baja hasta su uso final. Preferentemente, la preparación es almacenada en la forma liofilizada y disuelta con una solución de reconstitución apropiada hasta una solución clara ópticamente. La preparación de acuerdo con la presente invención también puede ser provista como una preparación líquida en la forma de un líquido congelado a baja temperatura. La preparación de acuerdo con la presente invención es particularmente estable, es decir la misma puede ser dejada en reposo en la forma disuelta durante un período de tiempo prolongado antes de la aplicación. La preparación de acuerdo con la invención ha probado que no muestra pérdida en la actividad durante varias horas hasta días. La preparación de acuerdo con la invención puede ser provista en un dispositivo apropiado, preferentemente un dispositivo de aplicación, en combinación con una proteasa seleccionada del grupo de las endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, el grupo de las proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, Factor lia o calicreina, o un derivado de estas proteasas. La preparación de acuerdo con la invención que contiene un análogo del Factor X en combinación con una proteasa capaz de activar el análogo del Factor X al Factor Xa o al análogo del Factor Xa puede ser provista como una preparación compuesta que consiste de un recipiente que contiene una proteasa inmovilizada sobre un portador, opcionalmente en la forma de una columna pequeña o una jeringa equipada con una proteasa y un recipiente que contiene la preparación farmacéutica con el análogo del Factor X. Para la activación del análogo del Factor X, la solución que contiene el análogo del Factor X es, por ejemplo, pasada sobre la proteasa inmovilizada. Durante el almacenamiento de la preparación, la solución que contiene el análogo del Factor X preferentemente es mantenida aparte de la proteasa. La preparación de acuerdo con la invención puede estar presente en el mismo recipiente que la proteasa, con los componentes, sin embargo, que están separados espacialmente por una pared de separación impermeable la cual puede ser removida fácilmente en el caso de uso. Las soluciones también pueden ser almacenadas en recipientes individuales y llevadas en contacto solo brevemente antes de la aplicación. En una modalidad particular, la proteasa utilizada para la activación es una proteasa de serina involucrada naturalmente en la coagulación de la sangre, tal como el Factor Xlla o el Factor Xla, Xa, lia los cuales no necesitan ser separados del Factor Xa activado antes de la aplicación pero pueden ser aplicados conjuntamente con la misma. El análogo del Factor X puede ser activado al Factor Xa brevemente antes de su uso inmediato, es decir antes de la aplicación al paciente. La activación puede ser efectuada llevándola en contacto con una proteasa inmovilizada o mezclando las soluciones que contienen una proteasa y el análogo del Factor X. Por consiguiente es posible mantener los dos componentes en solución espaciados lejos entre sí, para mezclarlos por medio de un dispositivo de infusión apropiado en donde los componentes se dan en contacto entre sí mientras que pasan a través de, y por consiguiente activan la molécula respectiva con respecto al Factor Xa o el análogo del Factor Xa. El paciente recibirá una mezcla del Factor Xa y una proteasa de serina adicional la cual ha mediado la activación. Se tiene que tener especial cuidado con respecto a la dosificación, a causa de que el Factor X endógeno también puede ser activado por la administración adicional de una proteasa de serina, lo cual podría conducir a un tiempo de coagulación más breve. De acuerdo con una modalidad preferida, la preparación farmacéutica es provista en un dispositivo apropiado, preferentemente un dispositivo de aplicación, ya sea en una forma de líquido congelado o liofilizada. Un dispositivo de aplicación apropiado puede ser una jeringa de doble compartimiento como se describe en AT 366 916 o AT 382 783. De acuerdo con un aspecto de la invención, la preparación contiene un análogo del Factor X que tiene una modificación que permite la activación del Análogo del Factor X a un Factor Xa in vivo. Los análogos del Factor X de la preparación de acuerdo con la invención tienen particularmente una modificación que representa un sitio de reconocimiento/segmentación para una proteasa seleccionada del grupo de proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, Factor lia o calicreina, y son segmentados in vivo por una de las proteasas al Factor Xa natural o al análogo del Factor Xa. Particularmente para uso terapéutico, tales análogos del Factor X son ventajosos porque tienen un sitio de reconocimiento/segmentación para una proteasa la cual es independiente del complejo de tejido/Factor Vlla y el complejo de tenasa dentro de la cascada de coagulación. Por lo tanto, la preparación de acuerdo con la invención puede ser utilizada para controlar la hemorragia en pacientes con deficiencia del Factor IX y del Factor VII así como del Factor VIII. Los pacientes que sufren de un desorden de la coagulación de la sangre debido a la deficiencia del Factor XI o del Factor XII no deben ser provistos con las preparaciones farmacéuticas que contienen el análogo del Factor X el cual puede ser activado por el Factor Xlla o el Factor Xla. En el caso de la deficiencia del Factor XI, por ejemplo, el análogo del Factor X que tiene un sitio de segmentación del Factor Xlla podría ser utilizado. De acuerdo con otro aspecto de la invención, la preparación de acuerdo con la invención contiene opcionalmente un factor de la sangre en la forma de un zimógeno o una proteasa de serina activa como un componente adicional. Los componentes adicionales preferidos son los componentes que tienen ^una activación de derivación del Factor VIII. Entre ellos, en particular, el Factor II, el Factor VII, el Factor IX, el Factor VIII, el Factor V y/o las proteasas de serina activas de los mismos. Los componentes adicionales también pueden ser los fosfolípidos, los iones de Ca, etc. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la preparación de acuerdo con la invención contiene al menos un componente adicional que tiene la actividad de derivación del Factor VIII. La preparación de acuerdo con la invención puede ser provista como una preparación farmacéutica que tiene la actividad del Factor Xa como una preparación de un solo componente o en combinación con otros factores tales como la preparación de componentes múltiples. Antes del procesamiento en una preparación farmacéutica, la proteína purificada es sometida a los controles de calidad usuales y se lleva a una forma administrable terapéuticamente. En la producción recombinante, la preparación purificada es probada particularmente para verificar la ausencia de los ácidos nucleicos celulares y derivados del vector de expresión, preferentemente de acuerdo con un método como se describió en EP 0 714 987.

Como, en un principio, cualquier material biológico puede estar contaminado con agentes infecciosos, la preparación es tratada opcionalmente para la inactivación o el agotamiento de los virus para producir una preparación segura. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, una preparación que contiene el análogo del Factor Xa que tiene integridad estructural y estabilidad elevadas, es provista, la cual está particularmente libre de los compuestos intermedios del análogo del Factor X/Xa inactivo y los productos de degradación autoproteolítica, y es obtenible porque un análogo del Factor X del tipo definido anteriormente es activado y preparado para dar la preparación apropiada. Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de una preparación del tipo definido anteriormente en la preparación de un agente farmacéutico. Un agente terapéutico que contiene el análogo del Factor X o el análogo del Factor Xa de acuerdo con la invención es particularmente útil en el tratamiento de los pacientes que sufren de desórdenes de coagulación de la sangre, tales como los pacientes que padecen de hemofilia y quienes, adicionalmente, pueden haber desarrollado anticuerpos inhibitorios contra el Factor VIII y/o el Factor IX, utilizados comúnmente para el tratamiento, y, en particular, como una preparación que tiene la actividad de derivación del Factor VIII. Un aspecto adicional de la invención está relacionado con el uso de un ácido nucleico que contiene las secuencias de codificación de los análogos del Factor X de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento. Ya que el ácido nucleico tiene secuencias de control de la expresión adecuadas, el mismo puede ser aplicado como un ácido nucleico puro, integrado en un vector de expresión recombinante, o unido a un portador, ya sea un fosfolípido o una partícula viral. El ácido nucleico puede ser utilizado para la preparación de un agente terapéutico el cual es particularmente útil en el tratamiento de pacientes que padecen de desórdenes de coagulación de la sangre, tales como los pacientes que padecen de hemofilia o hemofilia y que han desarrollado anticuerpos inhibitorios. También es posible utilizar el ácido nucleico en la terapia genética. Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para la preparación del análogo del Factor X de acuerdo con la invención y a una preparación que contiene el análogo del Factor X de acuerdo con la invención. Una secuencia que codifica para el análogo del Factor X es insertada en un sistema de expresión apropiado, y las células apropiadas, preferentemente las •líneas celulares permanentes, son transfectadas con el ADN recombinante. Las células son cultivadas bajo condiciones óptimas para la expresión del gen, y los análogos del Factor X son aislados ya sea desde un extracto de cultivo celular o desde el sobrenadante de cultivo celular. La molécula recombinante puede ser purificada adicionalmente por todos los métodos cromatográficos conocidos, tales como el intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía de afinidad o inmunoafinidad o una combinación de las mismas. Para la preparación de los análogos del Factor X de acuerdo con la invención, el ADNc completo que codifica para el Factor X es clonado en un vector de expresión. Esto se hace de acuerdo con técnicas de clonación conocidas generalmente. Subiguientemente, la secuencia de nucleótidos que codifica para el Factor X es modificada de tal modo que las secuencias de codificación en la región del péptido de activación y opcionalmente también en la región del ß-péptido C-terminal, sean modificadas de tal modo que una molécula del Factor X del tipo definido anteriormente pueda ser producida. Esto es efectuado por técnicas de ingeniería genética conocidas de la técnica previa, tales como mutagénesis in vitro dirigida, específica, o la deleción de las secuencias, por ejemplo por la digestión de restricción por las endonucleasas y la inserción de otras secuencias cargadas, o por PCR. Los mutantes del Factor X así preparados son insertados entonces en un sistema de expresión apropiado para la expresión recombinante y son expresados. Los análogos del Factor X de acuerdo con la invención también pueden ser preparados por síntesis química. Los análogos del Factor X son producidos preferentemente por la expresión recombinante. Los mismos pueden ser preparados por medio de ingeniería genética con cualesquiera sistemas de expresión usuales, tales como, por ejemplo, las líneas celulares permanentes o los sistemas de expresión viral. Las líneas celulares permanentes son preparadas por la integración estable del ADN extraño o extranjero en el cromosoma de la célula huésped, por ejemplo, de Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, particularmente las células del hígado y del riñon, o por un vector episomal derivado, por ejemplo, del virus de papiloma. Los sistemas de expresión viral, tales como, por ejemplo, el virus Vaccinia, el Baculovirus o los sistemas retrovirales, también pueden ser empleados. Como las líneas celulares, en general son utilizadas las células Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, sk-Hepl, de las glándulas, del hígado y del riñon. Como sistemas de expresión eucarióticos, se utilizan las levaduras, las células de glándulas endógenas (por ejemplo las glándulas de los animales transgénicos) y también se pueden utilizar otros tipos de células. Por supuesto, los animales transgénicos también pueden ser utilizados para la expresión de los polipéptidos de acuerdo con la invención o los derivados de los mismos. Para la expresión de las proteínas recombinantes, las células de CHO-DHFR" han probado que van a ser particularmente útiles (Urlaub et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci., E.U.A., 77:4216-4220) . Para la preparación recombinante de los análogos del Factor X de acuerdo con la invención, también se pueden utilizar sistemas de expresión procarióticos. Los sistemas que permiten la expresión en E. coli o B. subtilis son particularmente útiles. Los análogos del Factor X son expresados en los sistemas de expresión respectivos bajo el control de un promotor adecuado. Para la expresión en los eucariotas, todos los promotores conocidos son adecuados, tales como SV40, CMV, RSV, HSV, EBV, ß-actina hGH o promotores inducibles, tales como, por ejemplo, hsp o el promotor de metalotioneína. Los análogos del Factor X son expresados preferentemente bajo el control del promotor de ß-actina en las células de CHO.

De acuerdo con una modalidad de la invención, el método de producción de la preparación de la invención comprende los pasos de: proporcionar un ADN que codifica un análogo del Factor X, transformar una célula con el ADN recombinante, expresar el análogo del Factor X, opcionalmente en la presencia de una proteasa, aislar el análogo del Factor X, y opcionalmente la purificación por medio de un método cromatográfico. De acuerdo con una modalidad del proceso, el análogo del Factor X es aislado como una molécula de doble cadena. El análogo del Factor X es expresado en una célula que permite el procesamiento del análogo del pro-Factor X al análogo del Factor X de doble cadena. La célula es preferentemente una célula que expresa una proteasa capaz de procesar el precursor del Factor X, por ejemplo una proteasa dibásica, tal como la furina o un derivado de la misma. Para mejorar o elevar la eficiencia del procesamiento, la célula puede ser modificada adicionalmente de tal modo que su expresión de la proteasa sea mejorada. Por ejemplo, esto puede ser efectuado por la co-expresión de una endoproteasa dibásica correspondiente, tal como furina/PACE, Kex2 o un derivado de la misma. El análogo del Factor X de acuerdo con la invención también puede ser expresado en una célula que tiene una concentración de proteasa endógena normal, es decir una concentración subóptima para el procesamiento, que conduce a un procesamiento incompleto hasta la forma de doble cadena. En este caso, ya que el análogo del Factor X de una sola cadena es secretado en el sobrenadante celular como se describió anteriormente, el procesamiento subsiguiente a una cadena ligera y pesada es efectuada cocultivando con proteasa las células de expresión o llevándolas en contacto con una proteasa inmovilizada opcionalmente. El sobrenadante de las células también puede hacerse pasar sobre una matriz portadora que tiene la proteasa unida a la misma, dando por consiguiente el análogo del Factor X de doble cadena en el eluido. Los reactivos también pueden ser mezclados en solución, incubados durante un cierto período de tiempo, y luego la proteasa puede ser removida, por ejemplo por medio de una matriz de afinidad. El análogo del Factor X de doble cadena así obtenido puede ser aislado, purificado y almacenado subsiguientemente de manera estable hasta que se use después, como se describió anteriormente. En una modalidad particular, el análogo del Factor X purificado opcionalmente, de doble cadena, es llevado en contacto in vitro con una proteasa seleccionada del grupo de endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, el grupo de las proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, Factor lia o calicreina, o un derivado de estas proteasas, bajo condiciones en las cuales el análogo del Factor X es activado al Factor Xa natural o a un análogo del Factor Xa. De acuerdo con una modalidad, la activación es lograda por un paso cromatográfico, en donde la proteasa es inmovilizada sobre un portador. El análogo del Factor X de doble cadena, purificado, se hace pasar sobre una matriz que tiene la proteasa unida a la misma, y el Factor Xa purificado es aislado del eluido. De acuerdo con otra modalidad, los componentes son mezclados, y la proteasa es removida selectivamente de la mezcla. Por supuesto, también una combinación de procesamiento del análogo del pro-Factor X de una sola cadena a la forma del análogo del Factor X de doble cadena y la activación al Factor Xa en un proceso único es posible. El análogo del Factor X de una sola cadena o un precursor del mismo es llevado directamente en contacto con una proteasa dibásica, preferentemente la furina o un derivado de la misma que permita el procesamiento a una cadena ligera y pesada y la activación al Factor Xa. El análogo del Factor X que no tiene sitio de segmentación para la furina o un derivado de la misma en el péptido de activación es llevado en contacto opcionalmente con otra proteasa, diferente de las primeras proteasas, la cual permite la activación. Las proteasas pueden estar presentes en una mezcla por ejemplo de furina y el Factor Xla. La activación también puede ser efectuada por una combinación de los dos pasos por medio de dispositivos interconectados directamente y arreglados o distribuidos secuencialmente, preferentemente portadores, tales como columnas, sobre las cuales la(s) proteasa (s) es (son) inmovilizadas. En el primer portador el Factor X es segmentado a una cadena pesada y ligera, y en el segundo portador el Factor X es activado al Factor Xa por la proteasa inmovilizada. Los portadores pueden ser acoplados o unidos conectando directamente la salida de la primera columna con la entrada de la segunda columna. Las condiciones de la reacción para la(s) reacció (es) de procesamiento y la activación pueden ser optimizadas fácilmente por una persona experta en la técnica de acuerdo con la instalación experimental y las condiciones básicas dadas. Para el tiempo de contacto, la velocidad de flujo de los presentes reactivos es de importancia particular. Idealmente la misma debe estar entre 0.01 ml/min y 1 ml/min. Los parámetros importantes adicionales son la temperatura, el valor del pH y las condiciones de elución. Después de la pasada, el Factor Xa activado puede ser purificado adicionalmente de manera opcional por cromatografía selectiva. Es particularmente ventajoso conducir el proceso con la proteasa unida a un portador, a causa de que cuando se utiliza un portador, preferentemente las columnas cromatográficas, la instalación o ajuste de la reacción permite un paso de purificación adicional. De acuerdo con un aspecto adicional de la preparación de un análogo del Factor X, el análogo del Factor X es aislado como una molécula de una sola cadena. El análogo del Factor X es expresado en una célula la cual no soporta el procesamiento de una sola cadena del Factor X en la cadena pesada-ligera. La célula es preferentemente deficiente en una endoproteasa dibásica, tal como la kexina, furina, PACE. En la fabricación de la invención, se encontró que una de las proteasas esenciales responsables de la segmentación del Factor X en la cadena ligera y pesada es la furina. A partir de tal célula mutante deficiente en la endoproteasa, el análogo del Factor X puede ser aislado como una molécula de una sola cadena. Un análogo del Factor X así aislado y purificado opcionalmente es llevado subsiguientemente en contacto con una proteasa seleccionada del grupo de las endoproteasas, tales como la kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, bajo condiciones en las cuales el análogo del Factor X de una sola cadena es segmentado a la forma del Factor X de cadena doble. Los análogos del Factor X de la invención que tienen una modificación en la región del péptido de activación que permiten la segmentación por una de estas endoproteasas puede ser activada directamente de manera opcional al Factor Xa o al análogo del Factor Xa por este método, llevándolo en contacto con la endoproteasa. Los análogos del Factor X de acuerdo con la invención que tienen una modificación en la región del péptido de activación que permiten la segmentación por una proteasa de serina o la calicreina, son llevados en contacto con una proteasa adicional, diferente de la primera, después de la preparación del análogo del Factor X de doble cadena, y son activados al análogo del Factor Xa. De acuerdo con un aspecto de la invención, en el proceso una preparación que contiene el Factor Xa activo o el análogo del Factor Xa activo es obtenida sometiendo un análogo del Factor X preparado como se describió anteriormente a un paso de activación y el procesamiento adicional del péptido activado a una preparación purificada, la cual es formulada opcionalmente como una composición farmacéutica. Con los análogos del Factor X de acuerdo con la invención los cuales son activados por un proceso como se describió anteriormente al Factor Xa, el Factor Xa purificado o el análogo del Factor Xa que tiene integridad estructural y estabilidad elevadas y que están particularmente libres de los compuestos intermedios del Factor X/Xa inactivos, son obtenidos. La invención se describe con mayor detalle por los siguientes ejemplos y Figuras, con la invención, sin embargo, que no está restringida a estos ejemplos particulares . El Ejemplo 1 ilustra la construcción y la expresión del rFactor X; el Ejemplo 2 ilustra el procesamiento del rFactor X en una cadena pesada y ligera por la furina; el Ejemplo 3 ilustra el procesamiento del pro-Factor X por medio de la proteasa inmovilizada; el Ejemplo 4 ilustra la actividad del rFactor X procesado in vitro; el Ejemplo 5 ilustra la expresión del rFactor X en las células deficientes de furina; el Ejemplo 6 ilustra la construcción de los análogos del rFactor X; el Ejemplo 7 ilustra la determinación de las terminales N de los productos de procesamiento del Factor X; el Ejemplo 8 ilustra la expresión y la caracterización del análogo del Factor X que lleva el sitio Arg-Arg-Lys-Arg/Ile de segmentación con furina (rFX1* 71) ; el Ejemplo 9 ilustra la activación in vitro de la proteína de rp?RRKR/I p?r ?os derivados de r-furina; el Ejemplo 10 ilustra la funcionalidad del rf?RRKR I del análogo de FX recombinante activado in vitro; el Ejemplo 11 ilustra la activación in vitro del análogo de rFX que lleva el sitio de segmentación Asp-Phe-Thr-Arg/Val para el Factor Xla.

Figuras: Fig. 1: secuencia de nucleótidos y aminoácidos del Factor X Fig. 2: representación esquemática de los análogos del Factor X que tienen sitios de segmentación de la proteasa modificados en la región del péptido de activación Fig. 3: representación esquemática del vector de expresión phAct-rFX Fig. 4: Análisis de manchado de Western del rFactor X expresado en las células CHO antes y después de la amplificación Fig. 5: Análisis de manchado de Western del rFactor X después de la segmentación in vitro por los derivados de furina Fig. 6: Análisis de manchado de Western de las moléculas del rFactor X expresadas en las células que contienen furina y deficientes en furina Fig. 7: representación esquemática de las construcciones del análogo de rFX/rFXA que tienen terminales C modificadas de la cadena pesada Fig. 8: representación esquemática de las terminales N de los productos de procesamiento del rFactor X de las células de CHO que contienen furina y deficientes en furina previo a y después del tratamiento adicional con furina recombinante Fig. 9: análisis de manchado de Western del rFactor FX RRKR/I expresado en células de CHO Fig. 10: análisis de manchado de Western del rFactor FX RRKR/I después de la activación in vitro con el derivado de furina Fig. 11: Análisis de manchado de Western del rFactor FXDFTR/V después de la activación in vitro con el derivado de furina. Los vectores de la expresión fueron preparados por medio de técnicas de clonación estándares (Maniatis et al., "Molecular Cloning" - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, E.U.A., 1983). La preparación de los fragmentos de ADN por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguido por los métodos generales (Clackson et al., 1991, PCR A practical approach. Ed. McPherson, Quirke, Taylor, pp. 187-214) .

Ejemplo 1 : Expresión y procesamiento del rFX de una sola cadena a la cadena ligera/pesada de rFX a. Construcción del vector de expresión de rFX Para la preparación del FX recombinante (rFX), el ADNc del FX se aisló de una biblioteca de ADNc lambda del hígado humano como se describió por Messier et al. (1991, Gene 99:291-294). Un fragmento de ADN se amplificó a partir de un clon positivo por medio de PCR con el oligonucleótido #2911 (5'- ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGGCGCCCACTG-3' ) (SEC. ID NO. 1) como el 5' -cebador y el oligonucleótido #2912 (5'-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3' ) (SEC ID NO. 2) como el 3'-cebador. Este fragmento de ADN contiene la secuencia de codificación FX de 1,467 kB y 39 pb de la región 3' no transladada, flanqueado por un sitio de segmentación Xhol en el extremo 5' y un sitio de segmentación Mfel en el extremo 3' . Además, la secuencia de ACC se incorporó en la parte frontal del ATG del FX por medio del cebador #2911 que conduce a una secuencia de iniciación de la translación de Kozac óptima. Subsiguientemente, este producto de PCR se clonó como el fragmento de Xhol/Mfel en el vector de expresión phAct segmentado con Salí y EcoRI . El plásmido de expresión resultante se designó como phAct-rFX (Fig. 3) . El vector de expresión phAct comprende el promotor 5'UTR de 78 pb de beta-actina humana y el intron, un sitio de segmentación de clonación múltiple, y el sitio de poliadenilación SV40. b. Expresión de rFX en las células de CHO Para establecer una línea de células de expresión de rFX estable, las células de CHO deficientes en dhfr fueron cotransfectadas con el plásmido de expresión phAct-rFX y el plásmido marcador de selección pSV-dhfr. Para todos los análisis de funcionamiento y expresión adicionales, las células fueron incubadas con el medio de selección libre del suero en la presencia de µg/ml de la vitamina K durante 24 horas. La expresión de rFX en los clones de las células resultantes se detectó por medio de la cantidad del antígeno (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim) , y la proteína recombinante estuvo caracterizada con SDS-PAGE (Figuras 4A y B) . Como se puede observar en el manchado de Western (Figura 4A) , en los clones y subclones iniciales de los mismos existe la proteína de FX recombinante presente en la forma de una cadena ligera (LC) de 22 kD y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 50 kD, las cuales son idénticas en tamaño con las cadenas del Factor X del plasma. Además, una banda de proteína es visible a 75 kD, la cual corresponde a la molécula de una sola cadena (SC) y la presencia de la cual en las células de CHO transfectadas de FX (Wolf et al., J. Biol. Chem. 266:13726-13730, 1991) y en el plasma humano (Fair et al., Blood 64:194-204, 1984) han sido descritas. Para la preparación de clones de expresión elevada, los clones iniciales fueron amplificados con cantidades crecientes de metotrexato y subsiguientemente se subclonaron hasta la estabilización. La expresión podría ser incrementada desde aproximadamente 200-500 ng/10 E6 células y 1 µg/ml, respectivamente, hasta 78 µg/10 E6 células y 120 µg/ml, respectivamente, por 24 horas. Los análisis de manchado de Western de estos sobrenadantes del clon celular de expresión elevada (Figuras 4B y 5A, faja 2) muestran cantidades incrementadas de la molécula de rFX de una sola cadena y la presencia de las formas adicionales de la cadena ligera. Además de la forma de 22 kD de la cadena ligera, la cual corresponde a la forma plasmática (totalmente carboxilada y sin propéptidos) , existen tres variantes de cadena ligera adicionales de aproximadamente 21 kD, 22.5 kD, y 20 kD presentes. Por medio del secuenciamiento N-terminal del material recombinante, la heterogeneidad de la cadena ligera en estos clones se atribuyó a que va a ser la segmentación incompleta del propéptído (aquí: aproximadamente 50% del material de rFX) y la hipocarboxilación (aquí: aproximadamente 50% del rFX) . La proteína de 21 kD es una forma que contiene el propéptido, hipocarboxilado, y la proteína de 20 kD es una forma libre de propéptidos, hipocarboxilada, de la cadena ligera, mientras que la banda de 22.5 kD representa el propéptido totalmente carboxilado pero que contiene la forma LC.

Ejemplo 2 : Procesamiento del rFX de una sola cadena en la cadena l±gera/pesada de rFX por los derivados de furina Debido a la similaridad de los sitios de segmentación del propéptido del Factor X/terminales N de la cadena ligera (RVTR^A) y entre la cadena ligera/pesada (RRKR>ls) a la secuencia de reconocimiento de consenso de la furina (RXK/RR X) , parece posible mejorar el procesamiento in vitro de la cadena única como del propéptido que contiene las moléculas de rFX por los derivados de rfurina. En la literatura, las proteasas son sospechosas de los dos pasos de procesamiento, los cuales, sin embargo, no son furinas (Rehemtulla et al., 1992, Blood 79:2349-2355; Wallin et al., 1994, Thromb. Res. 1994:395-403). Los sobrenadante del cultivo celular de CHO-RFX y CHO-rfurina ?TMdxHis (solicitud de patente EP 0 775 750 A2) así como CHO-rFX y el CHO no transfectado (como el control negativo) se mezclaron a una proporción de 1:1 y se incubaron a 37 °C. Las alícuotas de las mezclas de la reacción se probaron para el rFX procesado antes de la incubación (t=0) y después de varios períodos de incubación (t=2, 4, 6 horas) por el análisis de manchado de Western (Figura 5) . El rFX se detectó en los sobrenadantes del cultivo celular por medio de un antisuero de FX anti-humano (Fig. 5A) y un anticuerpo monoclonal específico para la cadena ligera de FX (Fig. 5B) . Como lo opuesto a la mezcla de CHO-rFX/CHO, la CHO-rFX/CHO-rfurina muestra el procesamiento casi completo ya después de 2 horas de incubación a 37 °C (Figura 5A, faja 7; Fig. 5B, faja 8) . El rFX de una sola cadena es ampliamente convertido en la forma de cadena ligera y pesada. En el área de la cadena ligera, solamente las formas libres de propéptido procesadas de 22 kD (forma carboxilada) y 20 kD (forma hipocarboxilada) fueron encontradas a una proporción de aproximadamente 50:50. Optimizando las condiciones del cultivo celular, esta proporción puede ser mejorada en favor de la forma carboxilada. La segmentación correcta de la pro-secuencia entre Arg-1 y Ala+1 y la homogeneidad de la terminal N de la cadena ligera fueron determinadas por el secuenciamiento de la terminal N. En el experimento de control, en donde el CHO-rFX se mezcló con los sobrenadantes de CHO, no es visible ningún cambio en la configuración de la banda de rFX aún después de 6 horas de incubación (Fig. 5A, faja 5; Fig. 5B, faja 6) . Esto provee que la rfurina en el sobrenadante de las células de CHO es biológicamente activa y puede procesar el propéptido así como la cadena pesada/ligera de rFX.

Ejemplo 3 : Procesamiento del Factor X por medio de la rfurina inmovilizada con gel con tentáculos de quelato .

Para investigar si un substrato puede ser segmentado por el derivado de rfurina unido a la columna, se llevó a cabo un estudio en cuanto a que si el gel de tentáculos de Fractogel EMD® (Merck) pueda ser utilizado en una instalación experimental alternativamente a la Ni2+-NTA agarosa, como una matriz de la columna. Cuando los iones metálicos son espaciados más lejos de la matriz de la columna actual que en la Ni2+-NTA agarosa, el acceso estérico del substrato al derivado de rfurina unido podría ser mejorado. En la presente instalación, el pro-Factor X se procesó por el derivado de rfurina unido al gel de tentáculos: el gel de tentáculos de Fractogel EMD® se cargó con iones de Ni2+ de acuerdo con las instrucciones del productor y equilibrado con el medio del cultivo celular libre de suero, fresco. Subsiguientemente, la columna se cargó con el sobrenadante del derivado de CHO-rfurina libre del suero. Los pasos de lavado se llevaron a cabo por el medio de cultivo celular libre de suero que contiene concentraciones crecientes de imidazol de hasta 40 mM. Luego el pro-Factor X se hizo pasar sobre la columna como el sobrenadante de CHO libre del suero. El procesamiento del pro-Factor X al Factor X de cadena doble se detectó en el efluente de la columna por medio del análisis de manchado de Western con el antisuero del Factor X específico.

Ejemplo 4 Actividad del Factor X recombinante procesado in vitro El precursor del Factor X recombinante se incubó con y sin rfurina a 4 °C. A diferentes intervalos de tiempo, las muestras fueron tomadas y congeladas a -20 °C. Después de que la incubación se complementó (después de 4 días), todas las muestras fueron probadas para verificar la actividad de FX utilizando el Juego o Conjunto FX Coatest (Chromogenix) . 50 µl de cada sobrenadante fueron mezclados con 50 µl de plasma humano deficiente en FX, y el rFX se activó con veneno de víbora (RW) al rFXa en la presencia de CaCl2 de acuerdo con las instrucciones del productor; el rFXa entonces se hidroliza al substrato cromogénico (S-2337) y conduce a la liberación de la paranitroanilina coloreada de amarillo. Cuando la cantidad de rFXa y la intensidad del color son proporcionales entre sí, la cantidad del sobrenadante del cultivo celular de rFX/ml la cual es activada a rFXa, puede ser determinada por medio de una línea de calibración interpolada desde los valores de una serie de diluciones del plasma. Utilizando estos resultados y la cantidad conocida del antígeno de rFX (datos de ELISA) , la proporción del rFactor X activado al Factor Xa puede ser calculada en % . Los resultados son presentados en la Tabla 1. Para excluir la actividad proteolítica, no-específica, en los sobrenadantes de CHO y CHO-rfurina, la mezcla de estos dos sobrenadantes del cultivo celular fue probada también. Aún después de 4 días, el CHO-RFX incubado con sobrenadantes de CHO (sin rfurina) como el control, no exhibió cambio substancial en la actividad de rFXa, la cual fue de aproximadamente 800 mU/ml y correspondió al 55% - 61% del rFX funcional debido a las variaciones experimentales. Cuando, en comparación, el CHO-rFX se incubó con CHO-rfurina, la actividad de rFX se incrementó gradualmente durante la incubación, elevándose desde 61% (T=0) hasta 86% (Tabla 1) . Esto prueba que en el procesamiento in vitro de CHO-rFX a partir de los clones de alta expresión que utilizan el derivado de rfurina se mejora substancialmente la proporción de rFX que puede ser activado al rFXa funcional.

Tabla 1 Ejemplo 5 : Expresión del Factor X recombinante en células deficientes en furina Como se muestra en los ejemplos previos, en el caso de la proteína precursora del Factor X, la furina medía la segmentación del propéptido así como la segmentación de la cadena única a la cadena ligera/pesada in vitro. Esto sugiere que estas segmentaciones son efectuadas endógenamente en la células por la furina adecuada con una eficiencia variable dependiendo de la cantidad del rFactor X expresado. Esto a su vez conduce a la producción de una mezcla de formas del rFactor heterogéneas. Una manera de preparar una forma de las moléculas del rFactor X la cual es tan homogénea como sea posible y también estable, es prevenir la segmentación del rFactor X por las proteasas endógenas, particularmente la furina, y por consiguiente producir el precursor del rFactor X inactivo funcionalmente (el cual puede ser transformado en sus formas funcionalmente activas posteriormente por medio del procesamiento corriente abajo, idealmente de manera directa antes de su uso) . Este método será particularmente útil en la preparación de análogos de FX que contienen un sitio de segmentación de furina en lugar del sitio de activación original. En estas construcciones, tal mutante de rFX recombinante podría ser activado in vivo por la furina endógena y conducir a la secreción de formas de rFX más inestables, activadas. La degradación de estas formas, por ejemplo bajo condiciones del cultivo celular de la lisis celular elevada por las proteasas de CHO durante el almacenamiento de los sobrenadantes del cultivo celular o el proceso de purificación, o por autoproteólisis, podría conducir a productos de degradación inactivos (Wolf et al., 1991). Este objeto puede ser logrado, por ejemplo, suplementando el medio de cultivo celular con agentes los cuales pueden reducir o prevenir la actividad de la furina intracelular. Otra manera es utilizar células las cuales son deficientes en furina a priori (Mdhring et al., 1983, Infect. Immun. 41:998-1009; Ohnishi et al., 1994, J. Virol. 68:4075-4079; Gordon et al., 1995, Infect. Immun. 63:82-87) . Para este propósito, un clon de célula de CHO deficiente en furina FDll (Gordon et al., 1995, Infect. Immun. 63:82-87) se cotransfectó con 20 µg de phAct-FX y 1 µg pUCSV-neo (que contiene el gen de resistencia de la neomicina en el vector de pUC bajo el control del promotor de SV40) . Para obtener clones estables, el medio se suplemento con 0.8 µg de G418/ml. Comparando las moléculas del rFactor X secretado en los sobrenadantes libres del suero de una furina que contiene, y un clon de CHO deficiente en, furina, el manchado de Western muestra que el precursor del rFactor X no es procesado en las células deficientes en furina y solamente el precursor del Factor X de una sola cadena está presente (Figura 6) ; por el contrario, el rFactor X es procesado completamente por las células "normales" a una expresión modesta, pero es procesado solamente a un grado muy limitado con la expresión más elevada a pesar de la furina endógena. Debido al nivel de expresión de rFX bajo del clon celular utilizado para este análisis, la cadena ligera del rFactor X no es visible en este manchado.

Ejemplo 6: Preparación de los análogos del Factor X (en el tiempo de presentación de la solicitud, el solicitante considera esto como el mejor modo de llevar a cabo la invención) . 6.1. Construcción de plásmidos de expresión para la preparación del análogo del Factor X Para la preparación del análogo del rFactor X recombinante, el sitio de segmentación de Asn-Leu-Thr-Arg/Ile (aminoácidos 231 a 235) que sirve para la activación del Factor X al Factor Xa se reemplazó por un sitio de segmentación específico para una proteasa diferente, tal como furina, FXIa, FXa, FXIIa, Fila o calicreina. Los plásmidos de expresión para estos análogos del Factor X son todos derivados del plásmido phAct-FX (descrito en el Ejemplo 1). Para simplificar la clonación de los plásmidos de expresión del Factor X, el fragmento de ADN HindlII-Nael del plásmido de expresión de phAct-FX, el cual comprende la región de codificación del Factor X desde la posición +1 hasta +1116, se insertó en el sitio de segmentación de la restricción de HindIII/Smal del plásmido pUC19. El plásmido resultante se designó como püC/FX. Por consiguiente, la secuencia del Factor X del nucleótido en las posiciones 508 a 705 (aminoácidos 160 235) podría ser removida fácilmente del plásmido de pUC/FX y reemplazada por varios fragmentos de ADN del Factor X mutado. Estos fragmentos de ADN son idénticos con la secuencia del Factor X del tipo silvestre para las posiciones 691 a 705 (aminoácidos 231 a 235) los cuales codifican para nuevos sitios de segmentación.

La secuencia del Factor X del tipo silvestre fue removida del plásmido de pUC/FX por medio de las digestiones de las restricciones Bspl20I y BstXI. La porción 3' colgante del sitio BstXI fue removida adicionalmente con la nucleasa de la semilla de ung (variedad de garbanzo del Asia tropical) (Biolab) . Los fragmentos del ADN del Factor X mutado fueron preparados por medio de PCR. El cebador 5' es idéntico para todas las clonaciones y contiene la secuencia del Factor X de las posiciones 496 a 516. Los cebadores 3' contienen una secuencia complementaria al Factor X (posiciones 676 a 690) y un extremo 5' no complementario que lleva las secuencias para un sitio de segmentación nuevo y un sitio de segmentación de la restricción. El producto de PCR amplificado se digerió subsiguientemente por la(s) enzima (s) de restricción apropiada (s) y clonadas en el vector de pUC/FX preparado (véase anteriormente) . Subsiguientemente, los fragmentos de ADN del Factor X mutado se reclonaron por medio de HindIII-Agel a partir de los plásmidos de pUC/FX en el vector phAct-FX. Las construcciones finales son representadas esquemáticamente en las Figuras 2.1 y 2.2. El tipo silvestre del Factor X se da como una construcción de referencia. Los aminoácidos se dan en la forma de un código de una letra, las posiciones imitadas están sombreadas adicionalmente. Para preparar el sitio de segmentación de FXIa de Asp-Phe-Thr-Arg/Val, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5', y el oligonucleótido #1002 (5'-ACCA GTT AAC CCT GGT GAA GTC GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC. ID. No. 4) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos de Asn, Leu e lie en las posiciones 231, 232 y 235 de la secuencia del Factor X se substituyeron por Asp, Thr y Val. El fragmento de PCR se recortó por medio de Bstl20I y Hpal (Fig. 2A) . Para preparar un sitio de segmentación de Fila de Arg/Ser, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5', y el oligonucleótido #1003 (5'-ACCA TCG CGA CCT GGT CAG GTT GTT GTC3' ) (SEC. ID. No. 5) se utilizó como un cebador 3' . Por consiguiente, el aminoácido en la posición 235 se mutó en Ser. El fragmento de PCR se recortó por medio de Bspl20I y NruI (Fig. 2B) . Para preparar un sitio de segmentación de FXIIa de Ile-Lys-Pro-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC AC GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5', y el oligonucleótido #1004 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT GGG TTT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC.

ID. No. 6) fue utilizado como el cebador 3' . Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231, 232 y 233 de la secuencia de FX se mutaron en lie, Lys y Pro. El fragmento de PCR se recortó con Bstl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2C) . Para preparar el sitio de segmentación de Ser-Met-Thr-Arg/Ile calicreina, el oligonucleótido #1001 (5'-CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como el oligonucleótido #1005 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAT GCT GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC. ID. No. 7) se utilizó como un cebador 3' . Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu en las posiciones 231, 232 de la secuencia del Factor X fueron mutados en Ser, Met. El fragmento de PCR se digerió con Bstl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2D) . Para preparar el sitio de fragmentación de FXa de Pro-Gln-Gly-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC AC GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5', y el oligonucleótido #1016 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT TCC TTG GGG GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC. ID. No. 8) se utilizó como el cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231, 232 y 233 de la proteína de FX se mutaron a Pro, Gln y Gly. El fragmento de PCR se recortó con Nstl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2H) .

Para preparar un sitio de segmentación de FXa de Met-Lys-Thr-Arg/Ile, el oligonucléotido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5', y el oligonucleótido #1014 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT CGT TTT CAT GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC. ID. No. 9) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu en las posiciones 231, 232 de la proteína de FX se mutaron a Met, Lys. El fragmento de PCR se recortó con Bstl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2E) . Para preparar un sitio de segmentación de FXa de Ile-Glu-Gly-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5', y el oligonucleótido #1015 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT TCC CTC GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC. ID. No. 10) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu, Thr en las posiciones 231 a 233 de la proteína de FX fueron mutados a lie, Glu, Gly. El fragmento de PCR fue recortado con Bstl20I y particularmente con Xmnl (Figura 2F) . Para preparar un sitio de segmentación de furina de Arg-Arg-Lys-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. IDT NO. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucleótido #1006 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEC. ID. No. 11) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231 a 233 fueron mutadas a Arg, Arg y Lys. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2G) . Para preparar un sitio de segmentación de furina de Arg-Val-Arg-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5'-CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucleótido #1007 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT CCT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEC. ID. No. 12) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231 a 233 fueron mutados a Arg, Val y Arg. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Figura 2G) . Para preparar un sitio de segmentación de furina de Arg-Arg-Arg-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5'-CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucléotido #1008 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT CCT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEC. ID. No. 13) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231 a 233 fueron mutados a Arg, Arg "y Arg. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2G) .

Para preparar un sitio de segmentación de furina de Arg-Pro-Lys-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucleótido #1009 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT TTT GGG CCT GTT CTC GCC CCT CTC-3') (SEC. ID. No. 14) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231 a 233 fueron mutadas a Arg, Pro y Lys. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2G) . Para preparar un sitio de segmentación de furina de Ile-Arg-Lys-Arg/Ile, el oligonucléotido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucleótido #1010 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEC. ID. No. 15) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231 a 233 fueron mutados a lie, Arg y Lys. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2G) . Para preparar un sitio de segmentación de furina de Arg-Ser-Lys-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC AC GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucleótido #1011 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT TTT GCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC. ID. No. 16) se utilizó como un cebador 3' . Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las posiciones 231 a 233 fueron mutadas a Arg, Ser y Lys. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Figura 2G) . Para preparar un sitio de segmentación de furina de Arg-Val-Thr-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucleótido #1012 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEC. ID. No. 17) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu en las posiciones 231, 232 fueron mutados a Arg, Val. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2G) . Para preparar un sitio de segmentación de furina de Arg-Leu-Lys-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5'-CCC AC GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5' , y el oligonucleótido #1013 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT TTT GAG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEC. ID. No. 18) se utilizó como un cebador 3'. Por consiguiente, los aminoácidos Asn y Thr en las posiciones 231 y 233 fueron mutados a Arg y Lys. El fragmento de PCR se recortó con Bspl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 2G) . Para preparar un sitio de segmentación de Thr-Ser-Thr-Arg/Ile, el oligonucleótido #1001 (5' -CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT-3' ) (SEC. ID. No. 3) se utilizó como un cebador 5', y el oligonucleótido #1017 (5' -ACC AGA ATC GAT TCT CGT GCT CGT GTT GTC GCC CCT CTC-3' ) (SEC. ID. No. 19) se utilizó como un cebador 3' . Por consiguiente, los aminoácidos Asn, Leu en las posiciones 231, 232 de la proteína de FX fueron mutados a lie, Lys. El fragmento de PCR se recortó con Bstl20I y parcialmente con Xmnl (Fig. 21) . 6.2. Construcción de los plásmidos de expresión para la preparación del análogo de FXß Estas construcciones se derivaron de las construcciones del análogo del Factor X descritas anteriormente introduciendo un codón de detención de TGA en la posición 470. Los aminoácidos desde la posición 457 hasta el codón de detención al nivel del ADNc fueron removidos por digestión de Spel y digestión parcial de BstEII y reemplazados por el par de oligonucléotidos #0003 (5' -GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3' ) (SEC. ID. No. 20) y #0004 (5' -CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3' ) (SEC. ID. No. 21). La Figura 7 es una representación esquemática de las construcciones del análogo del Factor Xß. Para simplificar la Figura, todos los análogos de Xß están representados como una construcción general en donde los aminoácidos variables en las regiones del sitio de segmentación son mostrados como una "X" sombreada. 6.3. Construcción de los plásmidos de expresión para la preparación del análogo de FXa La activación del Factor X por la remoción del péptido de activación de 4.5 kDa en el extremo N-terminal de la cadena pesada, conduce a que se genere la forma del Factor Xaa. Esta forma es convertida subsiguientemente en la forma de FXaß por la actividad autoproteolítica y la segmentación en el extremo C de la cadena pesada entre Arg469 y Gly470. Para la preparación de los plásmidos de expresión del Factor X que conducen a la producción del Factor X, los cuales estarán presentes después de la activación exclusivamente en la forma FXaa con el ß-péptido intacto, el aminoácido Arg469 se utó a Lys¡ de modo que esta región de la cadena pesada no pueda ser segmentada más. Para este propósito, la secuencia de aminoácidos C-terminal del Factor X desde la posición 1363 hasta la señal de detención se removió por la digestión con BstEII-Spel parcial y se reemplazó por ,dos pares de oligonucleótidos ligados. El oliglonucleótido #0005 (5' -GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC _GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3' ) (SEC. ID. No. 22) y el oligonucleótido #0006 (5' -TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3' ) (SEC. ID. No. 23) fueron ligados con el oligonucléotido #0007 (5'-GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3' ) (SEC. ID. No. 24) y el oligonucleótido #0008 (5' -CTA GTG GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC-3' ) (SEC. ID. No. 25) . La mutación del aminoácido Arg469 es introducida por el par de oligonucleótidos #0005-#0006. La Figura 7 muestra una representación de los análogos de FX.

Ejemplo 7 : Determinación de las terminales N del Factor X y productos de procesamiento con y sin r-furina El Factor X recombinante se expresó en las células de CHO con la furina endógena, como se describió en el Ejemplo 1, y en las células deficientes en furina, como se describe en el Ejemplo 5. El rFactor X se aisló del sobrenadante del cultivo celular de los clones de CHO-rFX que se expresan altamente, los cuales a) no se trataron, b) se incubaron a 37 °C durante unas 12 horas adicionales, c) se incubaron con el sobrenadante de CHO-rfurina a 37 °C durante un período de 12 horas, así como desde el sobrenadante del cultivo celular de los clones de CH0-FD11 los cuales d) no se trataron, y e) se incubaron con el sobrenadante de CHO-rfurina a 37 °C durante un período de 12 horas. Los aminoácidos N-terminales del Factor X y los productos de procesamiento de las mezclas de reacción individuales a) a e) se determinaron por el análisis de Edman. La Figura 8 muestra una representación esquemática de los resultados. El rFactor X de las células de CHO que se expresan altamente está presente en la forma de las cadenas ligeras y pesada, maduras, así como en la forma de una sola cadena, que contiene todavía parcialmente, el propéptido. Después de la incubación de estos sobrenadantes del cultivo celular durante 12 horas a 37 °C (b) , las terminales N defectuosas adicionales de la cadena ligera de rFX que tienen 3 aminoácidos adicionales Val38-Thr39-Arg40 son formadas, como ya se describió por Wolf et al. (1991, J. Bio. Chem. 266:13726-13730). Estos extremos crípticos son encontrados también cuando se somete a secuenciamiento el material de rFX de las células de CH0-FD11 no tratadas (d) . Esta observación muestra que la formación de estas terminales N defectuosas puede ser prevenida por condiciones optimizadas, es decir las condiciones del cultivo celular, el almacenamiento y los procesos de purificación para minimizar la proteólisis de rFX por las proteasas de CHO. Contrario al material purificado de las células de CHO (a y b) , el rFX de las células deficientes en furina (d) , no amplificadas, solamente están presentes en la forma de los precursores de una sola "cadena no procesados. Las secuencias N-terminales que corresponden a la porción del propéptido no son encontradas tampoco. Esto muestra que un precursor de rFX de una sola cadena no es procesada ya más a la cadena ligera/pesada en las células de CHO deficientes en furina (d) , lo cual sugiere un papel central de la furina de la endoproteasa en este paso de procesamiento in vivo. Además, se muestra que las moléculas de rFX que contienen el propéptido también son procesadas en las células de CHO deficientes en furina, es decir que la furina no solamente desempeña un papel esencial en este paso de procesamiento in vivo. Después de la incubación del rFX a partir de las células de CHO y de las células de CHO-FD11 (e) en la presencia de la furina, solamente se encuentran las cadenas ligera y pesada que tienen las terminales N correctas. Esto provee que los precursores de FX de una sola cadena así como las moléculas de rFX que contienen los propéptidos sean convertidos al Factor X maduro, homogéneo, por el procesamiento in vitro. Por consiguiente, el Factor X procesado en la presencia de la furina exhibe una homogeneidad e integridad estructural excepcionales.

Ejemplo 8: Expresión y caracterización del análogo de FX que tiene el sitio de segmentación de la furina Arg-Arg-Lys-Arg/Ile (rFXRRKR I) El plásmido de expresión de FX que tiene el sitio de segmentación Arg-Arg-Lys-Arg/Ile (véase el Ejemplo 6.1, Fig. 2G) y el psV/dhfr del plásmido de selección, se cotransfectaron en las células de CHO, como se describió en el Ejemplo 1, para preparar la proteína de r ?RRKR/? recombinante. El análisis de manchado de Western de los sobrenadantes del cultivo celular (Fig. 9) muestra que la proteína recombinante está presente principalmente en la forma de doble cadena. Cuando se compara con el plasma FX, la cadena pesada corre a 46 kD en lugar de 50 kD, lo cual puede ser atribuido a los cambios en la glicosilación de la proteína recombinante. Además, las cantidades pequeñas del precursor de una sola cadena (SC) y la isoforma LC4 de la cadena ligera llegan a ser evidentes, como ya se observó cuando se expresa el rFX del tipo silvestre (Ejemplo l.b.). Estas formas moleculares del análogo de rFX sugieren que el procesamiento del precursor de FX de la cadena única por las proteasas endógenas así como la ?-carboxilación de la cadena ligera son limitadas. Aunque el sitio t de segmentación introducido en el análogo de FX representa una secuencia de consenso de furina, ninguna banda de proteína es visible la cual podría corresponder a las formas activadas de la proteína (35 kD, 31 kD) . La estructura de la región del sitio de segmentación o la secuencia de aminoácidos próxima parece que representa una configuración subóptima para el procesamiento del sitio de activación modificado por la furina in vivo.

Ejemplo 9: Activación in vitro de la proteina de rFXRSKR '1 por los derivados de r-furina La capacidad del análogo de FX recombinante para que sea activado a las formas a (35 kD) y ß (31 kD) por la r-furina in vitro se probó como se describe en el Ejemplo 2 por experimentos de mezclado. Las pruebas fueron diferentes, sin embargo, en que los derivados de r-furina purificados de rfurincys-spacer-lOxHis, descrito en la solicitud de patente EP 0 775 750-A2, en hepes1 10 mM pH 7.0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 y 0.2% BSA se utilizaron en lugar de los sobrenadantes de CHO-rfurina. En el experimento de control sin r-furina, el sobrenadante del análogo de CHO-rFX fue mezclado con la solución amortiguadora 10 mM hepes pH 7.0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 y 0.2% BSA a una relación de 1:1. Las alícuotas de las mezclas de la reacción antes y des pues de un período de incubación de 6, 24, 48 y 72 horas (t=0, 6, 24, 48, 72) a 37 °C se probaron para verificar la activación de rFX por medio del manchado de Western (Figura 10). Aunque la configuración de bandas de rFXRRKR/I permaneció sin cambio en la ausencia del derivado de r-furina aún después de 72 horas de incubación (Figura 10B) , en la presencia de r-furina, una banda de prot.eína pesada de 35 kD que corresponde a la forma a del FX plasmático (Fig. 10A, faja 9) aparece ya después de 6 horas (Figura 10A, faja 5). En el curso de la incubación, esta forma a se acumula y después de 72 horas de incubación (Figura 10A, faja 8), aproximadamente 50% del material de partida (HC) ha sido convertido a la forma activada. La banda de proteína pesada de 31 kD adicional, la cual aparece después de 24 horas (Figura 10A, faja 6) y corresponde a la forma ß del plasma activado FX (Figura 10A, faja 9), muestra que la forma a generada a partir del análogo de FX recombinante tiene actividad autoproteolítica y por lo tanto es funcional. Estos resultados prueban que el sitio de fragmentación Arg-Arg-Lis-Arg/Ile de activación heteróloga en el análogo de rFX es reconocido específicamente y segmentado correctamente por los derivados de r-furina in vitro y por consiguiente está adaptado para activar el análogo de rFX a las moléculas a- y ß-FXa.

Ejemplo 10: Funcionalidad del rFXHBKR I del análogo de FX recombinante activado in vitro Las alícuotas del experimento de mezclado del Ejemplo 9 fueron probadas para verificar la actividad de FXa por medio de una prueba de cromogen . Las alícuotas fueron mezcladas con la substancia de cromogen S2337 (600 µM) en 50 mM Tris pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.1% BSA. Después de un período de incubación de 3 minutos a 37 °C, la reacción se detuvo por medio de ácido acético al 20%, y luego el OD se midió a 405 nm. La cantidad de actividad de FXa recombinante en las mezclas de la reacción se determinó por comparación con una curva de calibración, preparada por medio del FXa del plasma activado con RW. Los resultados de este análisis, las cantidades del antígeno utilizado (datos de ELISA) , y la actividad específica calculada a partir de la misma son presentadas en la Tabla 2. Para excluir las actividades amidolíticas indeseables en la solución de r-furina y el sobrenadante del cultivo celular de CHO, la mezcla de los sobrenadantes de las células de CHO no transfectadas con el derivado de r-furina purificado se probaron para verificar la actividad de FXa, también (CHO+rfurina) . En esta mezcla, exactamente como en la mezcla de la solución amortiguadora/análogo de rFX (rF?RRKR/? + solución amortiguadora) , ninguna actividad de FXa se detectó aún después de 72 horas de incubación. Por el contrario, en el caso de la reacción de rFXRRKR I/rfurina, una actividad de rFXa de 56 mU fue detectable ya después de 6 horas de incubación, la cual se incrementó constantemente en el transcurso de la incubación y se cuantificó hasta 133, mU después de 72 horas. Aunque en este punto, de acuerdo !con el manchado de Western, solamente casi la mitad del análogo de rFX se ha hecho reaccionar con las formas a- y ß- activadas (Figura 10A, faja 8), el material análogo de rFX activado in vitro mostró una actividad específica mucho más elevada de 190 U/µg que el FX del plasma completamente activado con RW (153 mü/µg) . Los incrementos medidos en la actividad corresponden a la salida de las formas a y ß en el manchado de Western (Figura 10A, fajas 5-8) . Esto prueba que los sitios de segmentación de la proteasa heteróloga pueden ser incorporados en el FX, los cuales son reconocidos y segmentados por la proteasa respectiva, y que el rFXa de alta calidad (u, opcionalmente, los análogos de rFXa que tienen actividad de FXa) en la forma funcional, pueden ser preparados por la tecnología recombinante.

Tabla 2 Ejemplo 11: Activación in vitro del análogo de rFXa que lleva el sitio de segmentación de FXIa de Asp-Phe-Thr-Arg/Val (rF?DFTR/vj por el F?ia dßl plasma Una construcción del análogo de FX se preparó por la mutagénesis de la secuencia de activación de FX a un sitio de segmentación de FXIa. Subsiguientemente, los clones de la célula de CHO estables fueron establecidos, los cuales expresan estas moléculas. El sobrenadante (del cultivo celular de CHO que contiene el rF?DFTR v se mezcló con el plasma purificado FXIa (100 µg/ml) en la presencia de 10 mM Tris pH 7.3, 150 mM NaCl, 8 mM CaCl2, PCPS y 0.1% BSA, y se incubó a 37 °C durante varios períodos de tiempo. Como el control negativo, el sobrenadante del cultivo celular se incubó solamente con la solución amortiguadora que contiene BSA. La proteína de rp?DFTRv y los productos de activación resultantes fueron analizados por el análisis de manchado de Western (Fig. 11) . Como se puede observar err la mezcla sin FXIa antes de la incubación (t=0) , la proteína recombinante (Fig. 11, faja 5) es casi idéntica al plasma FX (faja 2) en la forma de doble cadena, la única diferencia es que la cadena pesada (HC) tiene un peso molecular ligeramente menor que 50 kD, como ya se observó en el caso de rp?RRKR en e? Ejemplo 8. Durante la incubación de esta mezcla a 37 °C (Figura 11, faja 6), no aparece ningún cambio significativo en la configuración de la banda. En la mezcla del análogo de CHO-rFX/FXIa, las bandas de proteína de 35 kD y 31 kD aparecen rápidamente después de la adición del FXIa purificado, pero previo a la incubación real del sobrenadante del cultivo celular (Fig. 11, faja 3). Estas bandas corresponden por su tamaño a las formas a y ß de la cadena pesada (Fig. 11, faja 9). Estas dos formas se incrementan considerablemente después de 4 horas de incubación con FXIa (Fig. 11, fa a 4). Esto muestra que un análogo de FX que lleva el sitio de segmentación de la proteasa heterólogo para una enzima proteolítica activa en la cascada de coagulación también puede ser procesada exitosamente por esta última. Además, la actividad funcional del análogo de rFXaa resultante es demostrada exitosamente por la presentación de la banda de rFXaß, el resultado de la actividad autoproteolítica del análogo de rFXaa.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: ;i) SOLICITANTE: (A NOMBRE: INMUNO AG (B CALLE: Industriestrasse 67 (C CIUDAD: Vienna (D ESTADO: Austria (E PAÍS: Austria (F CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1220 (A NOMBRE: Michele Himmelspach (B CALLE: Breitstetten 19 (C CIUDAD: Leopoldsdorf (D ESTADO: Austria (E PAÍS: Austria (F CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 2285 (A NOMBRE: Uwe Schlokat (B CALLE: Hauptstrasse 51 (C CIUDAD: Orth/Donau (D ESTADO: Austria (E PAÍS: Austria (F CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 2304 (A NOMBRE: Andreas Fisch (B CALLE: Wiener Strasse 14 (C CIUDAD: Orth/Donau (D ESTADO: Austria (E PAÍS: Austria (F CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 2304 (A NOMBRE: Friedrich Dorner (B CALLE: Peterlinigasse 17 (C CIUDAD: Vienna (D ESTADO: Austria (E PAÍS: Austria (F CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 1238 (A NOMBRE: Johann Eibl (B CALLE: Gustav Tschermakgasse 2 (C CIUDAD: Vienna (D ESTADO: Austria (E PAÍS: Austria (F CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 1180 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Análogos del Factor X que tienen un sitio de segmentación de proteasa modificado (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 27 (iv) FORMA LEÍBLE POR LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1: ;i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1 ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG 34 [2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC 24 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3: CCCACAGGGC CCTACCCCTG T 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 37 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4 ACCAGTTAAC CCTGGTGAAG TCGTTGTCGC CCCTCTC 37 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5: ;i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico; (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: ACCATCGCGA CCTGGTCAGG TTGTTGTC 28 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico ) [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: ACCAGAATCG ATTCTGGGTT TGATGTTGTC GCCCCTCTC 39 INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7 : [i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7 ACCAGAATCG ATTCTGGTCA TGCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: ;i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8: ACCAGAATCG ATTCTTCCTT GGGGGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9: ;i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: ACCAGAATCG ATTCTCGTTT TCATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN ( genómico ) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10: ACCAGAATCG ATTCTTCCCT CGATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico] (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11: ACCAGAATCG ATTCTTTTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12 ACCAGAATCG ATTCTCCTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13 ACCAGAATCG ATTCTCCTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico! 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CCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: lí (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: lí ACCAGAATCG ATTCTTTTGA GCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19: ACCAGAATCG ATTCTCGTGC TCGTGTTGTC GCCCCTCTC 39 [2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 49 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20: GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA 49 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21: CTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGA GGAAGGCG 48 [2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22: GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG 57 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23: TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG 57 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24: GCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA 55 [2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 54 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25: CTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC 54 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1467 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..1467 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26: ATG GGG CGC CCA CTG CAC CTC GTC CTG CTC AGT GCC TCC CTG GCT GGC 48 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala' Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 CTC CTG CTG CTC GGG GAA AGT CTG TTC ATC CGC AGG GAG CAG GCC AAC 9 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe lie Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 AAC ATC CTG GCG AGG GTC ACG AGG GCC AAT TCC TTT CTT GAA GAG ATG 14 Asn lie Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 AAG AAA GGA CAC CTC GAA AGA GAG TGC ATG GAA GAG ACC TGC TCA TAC 19 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 GAA GAG GCC CGC GAG GTC TTT GAG GAC AGC GAC AAG ACG AAT GAA TTC 24 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 TGG A?T AAA TAC AAA GAT GGC GAC CAG TGT GAG ACC AGT CCT TGC CAG 288 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys G n 85 90 95 AAC CAG GGC AAA TGT AAA GAC GGC CTC GGG GAA TAC ACC TGC ACC TGT 33 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 TTA GAA GGA TTC GAA GGC AAA AAC TGT GAA TTA TTC ACÁ CGG AAG CTC 384 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 TGC AGC CTG GAC AAC GGG GAC TGT GAC CAG TTC TGC CAC GAG GAA CAG 432 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 AAC TCT GTG GTG TGC TCC TGC GCC CGC GGG TAC ACC CTG GCT GAC AAC 480 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 GGC AAG GCC TGC ATT CCC ACÁ GGG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC 528 Gly Lys Ala Cys lie Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 CTG GAA CGC AGG AAG AGG TCA GTG GCC CAG GCC ACC AGC AGC AGC GGG 576 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 GAG GCC CCT GAC AGC ATC ACÁ TGG AAG CCA TAT GAT GCA GCC GAC CTG 624 Glu Ala Pro Asp Ser lie Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 GAC CCC ACC GAG AAC CCC TTC GAC CTG CTT GAC TTC AAC CAG ACG CAG 6?; Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 CCT GAG AGG GGC GAC AAC AAC CTC ACC AGG ATC GTG GGA GGC CAG GAA 720 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg lie Val Gly Gly Gln Glu 225 230 • 235 240 TGC AAG GAC GGG GAG TGT CCC TGG CAG GCC CTG CTC ATC AAT GAG GAA 768 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu lie Asn Glu Glu 245 250 255 AAC GAG GGT TTC TGT GGT GGA ACT ATT CTG AGC GAG TTC TAC ATC CTA 816 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr lie Leu Ser Glu Phe Tyr lie Leu 260 265 270 ACG GCA GCC CAC TGT CTC TAC CAA GCC AAG AGA TTC AAG GTG AGG GTA 864 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 GGG GAC CGG AAC ACG GAG CAG GAG GAG GGC GGT GAG GCG GTG CAC GAG 912 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 GTG GAG GTG GTC ATC AAG CAC AAC CGG TTC ACÁ AAG GAG ACC TAT GAC 960 Val Glu Val Val lie Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 TTC GAC ATC GCC GTG CTC CGG CTC AAG ACC CCC ATC ACC TTC CGC ATG 1008 Phe Asp lie Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro lie Thr Phe Arg Met 325 330 335 AAC GTG GCG CCT GCC TGC CTC CCC GAG CGT GAC TGG GCC GAG TCC ACG 1056 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 CTG ATG ACG CAG AAG ACG GGG ATT GTG AGC GGC TTC GGG CGC ACC CAC 1104 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly lie Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 GAG AAG GGC CGG CAG TCC ACC AGG CTC AAG ATG CTG GAG GTG CCC TAC 1152 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 GTG GAC CGC AAC AGC TGC AAG CTG TCC AGC AGC TTC ATC' 'ATC ACC CAG 120C Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe He He Thr Gln 385 390 395 400 AAC ATG TTC TGT GCC GGC TAC GAC ACC AAG CAG GAG GAT GCC TGC CAG 1248 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415 GGG GAC AGC GGG GGC CCG CAC GTC ACC CGC TTC AAG GAC ACC TAC TTC 1296 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe , 420 425 430 '. GTG ACÁ GGC ATC GTC AGC TGG GGA GAG AGC TGT GCC CGT AAG GGG AAG 1344 Val Thr Gly ríe Val Ser Trp Gly Glu Ser Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 5 TAC GGG ATC TAC ACC AAG GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG 139 Tyr Gly lie Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp lie Asp Arg 450 455 460 TCC ATG AAA ACC AGG GGC TTG CCC AAG GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG 144 Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA 1467 Val lie Thr Ser Ser Pro Leu Lys * 485 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 489 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27: Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe lie Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn He Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met, 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 . 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 . 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 Gly Lys Ala Cys He Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Ala Pro Asp Ser He Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 15 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg He Val Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Cye Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu He Asn Glu Glµ 245 250 255 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr lie Leu Ser Glu Phe Tyr He Leu 260 265 270 20 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val He Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp He Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro He Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly He Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe He He Thr Gln 385 390 395 400 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430 Val Thr Gly He Val Ser Trp Gly Glu Ser Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445 Tyr Gly He Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp He Asp Arg 450 455 460 Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 Val He Thr Ser Ser Pro Leu Lys * 485 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en* las siguientes

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un análogo del Factor X, caracterizado porque el mismo tiene una modificación en la región del sitio de segmentación de activación del Factor Xa natural, la modificación representa un sitio de procesamiento para una proteasa que no se segmenta naturalmente en esta región de la secuencia del Factor X.

2. Un análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha ! modificación se refiere a al menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación.

3. Un análogo del Factor X de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la i modificación representa un intercambio de al menos un aminoácido entre Gly228 y Arg234, y opcionalmente Ile235, con relación al aminoácido numerado como se muestra en la Figura 1.

4. El análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el mismo contiene una secuencia del Factor X que tiene Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-Rl, en donde a) Rl es un aminoácido seleccionado del grupo de lie, Val, Ser, Thr o Ala, b) R2 es un aminoácido seleccionado del grupo de Pro, Gly, Lys o Arg, c) R3 es un aminoácido seleccionado del grupo de Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg o Pro, d) R4 es un aminoácido seleccionado del grupo de Asp, lie, Ser, Met, Pro, Thr, Arg o Lys, e) R5 es un aminoácido seleccionado del grupo de Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His o Arg, y f) R6 es un aminoácido seleccionado del grupo de Asp, Phe, Thr, Arg, Leu o Ser.

5. El análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la modificación representa un sitio de procesamiento para una proteasa seleccionada del grupo de endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteasas de serina erina, tales como el Factor lia, Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa o calicreina, o un derivado de estas proteasas .

6. El análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque tiene una modificación adicional en la región de la secuencia de aminoácidos del Factor X C-terminal.

7. El análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el mismo tiene una modificación en la región C-terminal del sitio de segmentación del péptido ß.

8. El análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la modificación es una mutación, deleción o inserción en la región de la secuencia de aminoácidos del Factor X entre las posiciones de aminoácidos de Arg469 y Ser476.

9. El análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la modificación previene que el péptido ß sea retirado por segmentación.

10. El análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el mismo tiene una deleción del péptido ß del Factor X.

11. El análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el mismo tiene una señal de detención de la translación en la región C-terminal de la secuencia del Factor X.

12. El análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el mismo tiene una señal de detención de la translación en la posición del aminoácido 470 de la secuencia del Factor X.

13. El análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la modificación en la región del péptido de activación permite la activación in vitro del análogo ' del Factor X al Factor Xa natural o un análogo del Factor Xa, respectivamente .

14. Un análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la modificación permite la activación por una proteasa seleccionada del grupo de las endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, el grupo de proteasas de serina, tales como el Factor lia, Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, o calicreina, o un derivado de estas proteasas. i

15. El -análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la modificación permite la activación in vivo del análogo del Factor X al Factor Xa natural o un análogo del Factor Xa, respectivamente.

16. El análogo del Factor X de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la modificación permite la activación por una proteasa seleccionada del grupo de proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor lia Factor Xa, o calicreina.

17. El análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el mismo es provisto como un análogo del Factor X i que tiene un péptido ß intacto o como un análogo i del Factor X que tiene un extremo C acortado.

18. El análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el mismo es provisto como una molécula de una sola cadena.

19. Un ADN recombinante que codifica para un análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque está contenido en un vector para la expresión recombinante de la proteína codificada.

20. Una preparación que contiene un análogo del Factor X purificado o una proteína precursora ¡del mismo que tiene una modificación en la región del sitio de activación del Factor Xa natural, con la modificación que representa un sitio de procesamiento de una proteasa que no se segmenta naturalmente en esta región de la secuencia del Factor X.

21. Una preparación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la modificación es un sitio de segmentación para una proteasa seleccionada del grupo de endoproteasas dibásicas, tales como la kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, proteasas de serina, tales como el Factor lia, Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa o calicreina.

22. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizada porque el análogo del Factor X es provisto como el análogo de Fxa.

23. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizada porque el análogo del Factor X es provisto como un análogo del Factor X que tiene una extremidad C acortada.

24. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizada porque la misma contiene el análogo del Factor X como una molécula de una sola cadena en la forma aislada.

25. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, caracterizada porque la misma contiene un análogo del Factor X de una sola cadena, en la forma inactiva enzimáticamente que tiene una pluralidad de al menos 80%, preferentemente 90%, particularmente de manera preferible el 95%, y porque la misma no contiene compuestos intermedios proteolíticos inactivos del análogo del Factor X/Xa.

26. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizada porque la misma contiene el análogo del Factor X como una molécula de doble cadena en la forma aislada.

27. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizada porque la misma contiene el análogo del Factor X que tiene una: modificación la cual permite la activación in vitro del análogo del Factor X al Factor Xa natural o un análogo del Factor Xa, respectivamente.

28. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, caracterizada porque la misma es formulada como una preparación farmacéutica .

29. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, caracterizada porque la misma es provista en un dispositivo apropiado, preferentemente un dispositivo de aplicación, ' en combinación con una proteasa seleccionada del grupo de endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, del grupo de proteasas de serina, tales como el Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, Factor lia o calicreina, o un derivado de estas proteasas.

30. La preparación de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque los componentes son provistos por separado.

31. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizada porque la misma contiene un análogo del Factor X que tiene una modificación que permite la activación in vivo del análogo del Factor X al Factor Xa natural o al análogo del Factor Xa, respectivamente.

32. Una preparación que contiene el análogo del Factor Xa, que tiene una integridad estructural y estabilidad elevadas, caracterizada porque está particularmente libre de los compuestos intermedios del análogo del Factor X/Xa inactivo y los productos de la degradación del Factor X autoproteolítico, obtenibles por la activación de un análogo del Factor X de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

33. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 32, caracterizada porque la misma contiene un portador aceptable fisiológicamente y es provisto en una forma almacenable establemente.

34. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizada porque la misma contiene opcionalmente un factor de la sangre o una forma activada de un factor de la sangre como un componente adicional.

35. La preparación de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la misma contiene al menos un componente que tiene la actividad de derivación del Factor VIII como un componente adicional.

36. La preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 35, caracterizada porque la misma es formulada como una composición farmacéutica y es provista opcionalmente como una preparación de compuestos múltiples.

37. El uso de una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 36, en la preparación de un agente farmacéutico.

38. El uso de un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19 en la preparación de un agente farmacéutico .

39. Un proceso para preparar una preparación que contiene el análogo del Factor X recombinante, caracterizado porque un análogo del Factor X obtenido por la preparación recombinante es aislado y purificado por medio de un proceso cromatográfico.

40. Un proceso de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el mismo comprende los siguientes pasos: - proporcionar un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19 transformación de una célula apropiada expresión del análogo del Factor X incubación opcional del análogo del Factor con una proteasa aislamiento del análogo del Factor X, y purificación del análogo del Factor X por medio de un proceso cromatográfico.

41. El proceso de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el análogo del Factor X es aislado como una molécula de doble cadena.

42. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque el análogo del Factor X de doble cadena es llevado en contacto con una proteasa seleccionada del grupo de las endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, el grupo de las proteasas de serina, tales como el Factor lia, Factor Xlla, Factor Xla, Factor Xa, o calicreina, o un derivado de estas proteasas, bajo condiciones en las cuales el análogo del Factor X es segmentado al Factor Xa natural o a un análogo del Factor Xa.

43. El proceso de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la célula es una célula que no expresa una proteasa la cual puede segmentar la cadena ligera en la cadena ligera y pesada del Factor X o el análogo del Factor X, y tal célula opcionalmente es deficiente en proteasa.

44. El _ proceso de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la célula ' no expresa una endoproteasa, tal como kexina, furina, PACE, o un derivado de la misma.

45. Un proceso de conformidad con cualquiera I de las reivindicaciones 43 o 44, caracterizado porque el análogo del Factor X es aislado como una molécula de una sola cadena.

46. El proceso de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el análogo del Factor X aislado opcionalmente, de una sola cadena, es llevado en contacto con una proteasa seleccionada del grupo de las endoproteasas, tales como kexina/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, o un derivado de estas proteasas, bajo condiciones en las cuales el análogo del Factor X de una sola cadena , es segmentado a la forma del Factor X de doble cadena.

47. El proceso de conformidad con : la reivindicación 46, caracterizado porque el análogo del Factor X de una sola cadena es activado directamente al Factor Xa o al análogo del Factor Xa, respectivamente, opcionalmente llevándolo en contacto con una proteasa.

48. El proceso de conformidad con ' la reivindicación 46, caracterizado porque el análogo del Factor X de doble cadena es llevado en contacto con otra proteasa diferente de la primera y es activada al análogo del Factor Xa o al Factor Xa natural.

49. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, caracterizado porque la proteasa es inmovilizada.

50. Un proceso de preparación que contiene el Factor Xa o el análogo del Factor Xa activo, respectivamente, caracterizado porque un análogo del Factor X preparado de acuerdo con un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 46 es sometido a un paso de activación.

51. El proceso de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque un análogo del Factor Xa purificado o Factor Xa natural que tiene integridad estructural y estabilidad elevadas es obtenido, el cual está particularmente libre de los compuestos intermedios del Factor X/Xa inactivo.