MXPA99007121A - Metodos para cultivar celulas y propagar virus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para cultivar células, y en particular a métodos para propagar virus, y más particularmente aún, a métodos pana propagar virus recombinantes para terapia de genes.

Description

MÉTODOS PARA CULTIVAR CÉLULAS Y PROPAGAR VIRUS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchas líneas de células establecidas están disponibles para varios propósitos en biotecnología. Algunas líneas de células pueden ser cultivadas como suspensiones de células individuales, pero otras líneas de células no crecen bien sin un soporte. El crecimiento de una línea de células que requiere soporte es limitado con frecuencia por el área de superficie disponible para que las células crezcan, dado que muchas líneas de células formaran sólo una capa monocelular sobre la superficie. Además, algunas líneas de células pueden tender a crecer en masa o agregados en ausencia de un soporte, lo cual es un resultado inconveniente cuando se requieren como suspensiones de células individuales, pero más especialmente cuando las células serán infectadas con un virus, o transformadas con un vector recombinante, dado que el virus o vector pueden no tener acceso a las células dentro de la masa o agregado. De esta manera, pueden haber problemas severos para ampliar en proporción el cultivo de una línea de células, en particular para proveer áreas de superficie eficientes para que las células crezcan y/o evitar el amontonamiento de las mismas. La tecnología de los microvehículos se ha usado para mantener células en cultivo. Por ejemplo, Foresten y otros (Biotech. Bioenq. 40: 1039- 1044 (1992)) describieron el subcultivo extendido en serie de fibroblastos diploides humanos sobre microvehículos usando un complemento en el medio que reducía la necesidad de suero por las células cultivadas. Además, Ohison y otros (Cvtotechnoloqy 14: 67-80 (1994)) describieron la transferencia, de gota a gota, de células de ovario de hámster chino usando microvehícuios de gelatina macroporosa. Finalmente, Hu y otros (Biotech. Bioenq. 27: 1466-1476 (1985)) describieron la propagación en serie de células de mamífero sobre microvehículos usando una técnica de tripsinización y pH para selección. Sin embargo, en vista de los problemas señalados anteriormente, existe la necesidad de mejoras en los métodos para cultivar líneas de células, en métodos para producir virus para usos clínicos y en métodos para ampliar en proporción la producción de virus para comercialización a mayor escala, especialmente virus recombinantes para terapia de genes. La presente invención satisface estas necesidades y más.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención es un método para cultivar células, que comprende: (a) cultivar las células sobre un primer lote de microvehículos hasta que las células sean substancialmente confluentes; (b) separar las células de los microvehículos sin remover los mismos de la suspensión; (c) añadir un segundo lote de microvehículos; y (d) cultivar entonces las células. Otro aspecto de la invención es un método para separar células de un primer lote de microvehículos, que comprende los siguientes pasos: (a) lavar los microvehículos y las células adheridas para remover los materiales solubles; (b) poner en contacto los microvehículos y las células lavadas con un agente quelatador; (c) remover el agente quelatador; (d) tripsinizar las células durante un período breve para separar las mismas de los microvehículos; y (e) neutralizar la tripsina mediante la adición de proteína, en donde los pasos (a) - (e) se llevan a cabo en un recipiente de cultivo individual. Un aspecto adicional de la invención es un método para la separación de células de los microvehículos sobre los cuales han sido cultivadas, pero de los cuales han sido separadas, que comprende introducir una suspensión acuosa de células y microvehículos a través de una entrada en un dispositivo de separación, el dispositivo comprendiendo: (a) una entrada; (b) una columna; (c) una salida para recoger las células y la solución acuosa; y (d) un tamiz malla; en donde los microvehícuios son retenidos en suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación, y son retenidos en dicho dispositivo mediante un tamiz malla, y en donde las células y la solución acuosa son recogidas a través de la salida. Un aspecto adicional de la invención es un sistema para separar células de los microvehículos sobre los cuales las células han sido cultivadas, el sistema comprendiendo: (a) un biorreactor en el cual las células fueron cultivadas sobre los microvehículos; (b) una trayectoria de flujo desde el biorreactor hasta un dispositivo de separación; (c) un dispositivo de separación, que comprende: (i) una entrada; (ii) una columna; (iii) una salida para recoger las células y la solución acuosa; y (iv) un tamiz malla; en donde los microvehículos son retenidos en suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación, y son retenidos en dicho dispositivo mediante un tamiz malla, y en donde las células y la solución acuosa son recogidas a través de ia salida; y (d) una bomba, en donde la bomba dirige el flujo de la solución acuosa desde el biorreactor hasta la salida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una vista lateral de un sistema de conformidad con la presente invención usado para separar medios que contienen células libres y virus, de microvehículos. La figura 2 es una vista esquemática de un dispositivo de separación de conformidad con la presente invención usado para separar medios que contienen células libres y virus de microvehículos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención destaca el cultivo a gran escala de células para la propagación de virus, especialmente virus recombinantes para terapia de genes, producción de vacunas, etc. En particular, la presente invención destaca tres aspectos del cultivo a gran escala; el uso de la transferencia, de gota a gota, de células adherentes para ampliar en proporción secuencialmente el número de células en cultivo, incluyendo el uso de tripsina para disociar células de los microvehículos en los bíorreactores, el uso de la separación de células de las gotas tal como de un lecho fluidizado durante ia cosecha, y el uso de microfiltración para disgregar ias células a fin de liberar partículas virales. El término "virus", como se usa en la presente, incluye no sólo virus que ocurren naturalmente, sino también virus recombinantes, virus atenuados, cepas de vacunas, etc. Los virus recombinantes incluyen, pero no están limitados a, vectores virales que comprendan un gen heterólogo. En algunas modalidades, alguna función auxiliar para la replicación de los virus es provista por la célula hospedera, un virus auxiliar o un plásmido auxiliar. Los vectores representativos incluyen, pero no están limitados a, los que infectarán a células de mamífero, especialmente células humanas, y se pueden derivar de virus tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus de herpes y virus avipox. Se prefieren los vectores adenovirales. Los vectores adenovirales tipos 2 y 5 son los más preferidos, siendo especialmente preferidos los vectores adenovirales de tipo 5. ACN53 es un adenovirus recombinante de tipo 5 que codifica para la proteína p53 de tipo silvestre humana supresora de tumores y se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional de PCT publicada WO 95/11984. Como se usa en la presente, el término "confluente" indica que las células han formado una capa monocelular coherente sobre la superficie (por ejemplo, el microvehículo), de modo que virtualmente se usa toda la superficie disponible. Por ejemplo, "confluente" ha sido definido (R. I. Freshney, Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Techniques, Wiley-Liss, Inc. New York, NY, 1994, p. 363) como la situación en donde "todas las células están en contacto alrededor de toda su periferia con otras células y no se deja sin cubrir substrato disponible". Para los propósitos de la presente invención, el término "substancíalmente confluente" indica que las células están en general en contacto sobre la superficie, aun cuando puedan haber intersticios, de modo que se usa más de aproximadamente 70%, de preferencia más de aproximadamente 90%, de la superficie disponible. Aquí, "superficie disponible" significa área de superficie suficiente para acomodar una célula. De este modo, los pequeños intersticios entre células adyacentes que no puedan acomodar una célula adicional, no constituyen una "superficie disponible". Los pasos de cultivo en los métodos de la presente invención se pueden llevar a cabo en un biorreactor o fermentador conocido en la técnica de aproximadamente 1 a 5000 litros equipado con entradas apropiadas para introducir las células y los microvehículos, oxígeno estéril, varios medios para cultivo, etc; salidas para remover células, microvehículos y medios; y medios para agitar el medio de cultivo en el biorreactor, preferiblemente un filtro giratorio (el cual funciona también como una salida para los medios). Ejemplos de medios se describen en la técnica; véase, por ejemplo, Freshney, Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Techniques, Wiley-Liss, Inc. New York, NY, 1994, pp. 82-100. El biorreactor tendrá también medios para controlar la temperatura, y preferiblemente medios para monitorear electrónicamente y controlar las funciones del mismo. Ejemplos de microvehículos sobre los cuales se deja que las células crezcan son conocidos en la técnica, y de preferencia están especialmente adaptados para el propósito de cultivar células. Se hace referencia general al manual Microcarrier Cell Culture - Principies & Methods. publicado por Pharmacia. Sin embargo, se debe observar que algunas líneas de células usadas en la presente invención pueden no adherirse sólidamente a la superficie de los microvehículos; está bien dentro de la capacidad del experto en ia técnica determinar una combinación adecuada de una línea de células, virus (cuando sea aplicable), microvehículo y condiciones de cultivo. El microvehículo tiene preferiblemente un tamaño de partícula en la escala de aproximadamente 100 a 250 mieras, más preferiblemente en la escala de aproximadamente 130 a 220 mieras, y debe estar formado de un material no tóxico. La mediana del tamaño de muestra está preferiblemente en estas escalas, de modo que estas escalas de tamaño son preferiblemente las de por lo menos 45% de la muestra del microvehículo. En una modalidad preferida, el microvehículo consiste de microgotas substancialmente esféricas con un tamaño medio dé partícula de aproximadamente 150 a 200 mieras, de preferencia de 170 a 180 mieras. La superficie del microvehículo se puede tratar para modificar la adhesión de las células, en particular para incrementar la adhesión de las mismas permitiendo aún su proliferación y dispersión; así, los microvehículos pueden ser recubiertos, por ejemplo, con colágena. Preferiblemente, los microvehículos son ligeramente más densos que el medio de cultivo, de modo que la agitación suave los mantendrá en suspensión, mientras que medios simples tales como sedimentación o centrifugación permiten- su separación. Es adecuada una densidad de 1.03 a 1.045 g/ml cuando los microvehículos son equilibrados con una solución estándar tal como NaCI a 0.9% (o con el medio de cultivo). Los presentes inventores han encontrado que los microvehículos Cytodex-3 de Pharmacia en general satisfarán estas necesidades, aunque los requisitos particulares que se aplican para ciertas líneas de células o virus pueden requerir la selección de un microvehículo Cytodex en particular. Las células pueden ser las de cualquier línea de células hospederas adecuadas que sean capaces de replicarse por sí mismas, y en particular sustentar la replicación del virus de interés. Una línea de células particularmente preferida es la línea de células 293 de riñon embrionario humano (número de catálogo de ATCC CRL 1573). Estas células no se adhieren fuertemente a todos los microvehícuios, y se usan preferiblemente con microvehículos Cytodex-3 de Pharmacia, los cuales son recubiertos con colágena para mejor adhesión celular. Los microvehículos Cytodex-3 tienen un tamaño medio de patícula de aproximadamente 175 mieras, teniendo 45% de la muestra un tamaño de aproximadamente 140 a 210 mieras; la densidad de dichos microvehículos cuando se equilibran con NaCI a 0.9% es de 1.04 g/ml. Las células se cultivan preferiblemente sobre dicho microvehículo en un primer paso, y entonces se aflojan del mismo y se transfieren a microvehículos adicionales para un paso de producción. La agitación se puede efectuar convenientemente no sólo mediante una paleta en el fondo del biorreactor, sino también mediante un filtro de rotación giratorio, el cual se extiende preferiblemente hacia abajo desde la parte superior del biorreactor en el volumen del medio. Las células y los microvehículos se pueden mantener en suspensión en el cultivo mediante rotación del filtro giratorio; el filtro giratorio puede estar equipado con orificios finos que permiten la remoción del medio sin pérdida de las células. E! medio se puede remover y se puede reemplazar simultánea o alternativamente; con frecuencia, es conveniente remover una fracción substancial (por ejemplo, de hasta aproximadamente 50%) del medio, y reabastecerla entonces con el medio de reemplazo apropiado mientras se remueve aún el medio, por ejemplo, mediante el filtro giratorio. Típicamente, las células son ampliadas en proporción a partir de un recipiente maestro del banco de células útiles, a través de varios tamaños de matraces en T y, de preferencia, finalmente hasta los biorreactores. Un matraz preferido es el matraz para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ (CF; NUNC), un matraz largo especialmente diseñado que tiene convenientemente varios compartimentos internos que proveen un área de superficie grande a la cual las células se pueden adherir o fijar, y sobre la cual pueden crecer. Después del cultivo hasta que sean substancialmente confluentes, las células se pueden aflojar mediante tripsinización, y son aisladas. La tripsínización se efectúa durante un período breve (preferiblemente menor de 5 minutos, de preferencia aproximadamente 3 minutos), y la tripsina es neutralizada entonces mediante la adición rápida de suero en el medio de crecimiento. Si se desea, las células se pueden centrifugar, y el medio que contiene tripsina se puede remover antes de añadir el suero. La suspensión de células resultante es entonces alimentada típicamente en un biorreactor se siembra para producción (típicamente con un volumen de 20 a 30 litros) para cultivo adicional, y en algunas modalidades, a un biorreactor de producción más grande (típicamente con un volumen de 150 a 180 litros). La relación de volumen del segundo biorreactor (más grande): el biorreactor de siembra depende del grado al cual la línea de células es propagada en el primer biorreactor, pero es típicamente de 5:1 a 10:1 , por ejemplo, en la escala de (6-8): 1. Las células se separan de los microvehículos mediante un procedimiento de tripsinización realizado en el recipiente de cultivo, preferiblemente un biorreactor, mientras los microvehículos están suspendidos. El filtro giratorio se utiliza para realizar intercambios de medio para reducir los niveles de suero y de calcio en el medio, lo cual incrementa la eficiencia de la tripsinización mientras mantiene un volumen constante en el biorreactor. Se evitan los pasos de colonización, los cuales podrían causar daño a las células sobre los microvehículos. La suspensión resultante de células/microvehículos puede ser transferida entonces a un biorreactor de producción, el cual es cargado previamente con medios de cultivo y microvehículos. Después de la transferencia de la suspensión de células/microvehículos desde el biorreactor de siembra, el biorreactor de producción (por ejemplo, de aproximadamente 200 I) se hace funcionar, por ejemplo, a aproximadamente 37°C y a un pH de aproximadamente 7.3. Una perfusión de medio fresco durante la propagación de las células se puede llevar a cabo entonces para mantener la concentración de lactato abajo de aproximadamente 1.0 g/l. Típicamente, se deja que las células crezcan sobre los microvehículos durante aproximadamente 4 a 7 días, hasta que más de 50% de los microvehículos sea completamente confluente. Preferiblemente, se inicia entonces un procedimiento de infección con virus. Un recipiente de 40 a 50 ml de inoculo viral, conteniendo típicamente aproximadamente 1.0x1013 partículas virales totales, se usa para infectar el biorreactor de producción. Se deja que el virus se replique en el biorreactor de producción durante aproximadamente 3 a 5 días hasta casi el tiempo del título máximo del virus. Típicamente, más de 90% de las células se habrán separado de los microvehículos debido a los efectos citopáticos del virus. El rendimiento final de adenovirus recombinante a partir del biorreactor de producción es típicamente de aproximadamente 8.5x109 partículas virales/ml. Esto da un rendimiento total de partículas virales de 1.4x1015 de cada lote de 160 I. En otras modalidades de la invención, el biorreactor de producción es inoculado con células cosechadas mediante tripsinización, y se usa entonces directamente para inocular el biorreactor de producción. Típicamente, se utilizan de 8 a 12 matraces para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ para lograr la densidad total de siembra de inoculo en el biorreactor de 0.6 a 1x105 células/ml. El rendimiento típico del virus en este método varía de aproximadamente 1.7 a 2.6x1010 partículas virales/ml. Por lo tanto, este método particular provee un número total de partículas virales de aproximadamente 3 a 4x1015 de cada lote de 160 I.

En algunas modalidades de la invención, se utiliza un procedimiento similar al lecho fluidizado para cosechar las células del biorreactor. Típicamente, el biorreactor es cosechado después de que aproximadamente el 90% de las células se separan de los microvehículos. Sin ser limitado a teoría alguna, el efecto citopático de la propagación viral en las células hospederas parecer ser la causa de la separación de las células. En otras modalidades, las células no infectadas se pueden separar de los microvehículos mediante el método de tripsinización de la presente invención. Después de que el biorreactor es cosechado, el caldo contiene células, microvehículos y medio de cultivo. El virus está presente en las células y en el medio. Por lo tanto, todo este material es recogido preferiblemente para procesamiento. La gravedad específica (densidad) de los microvehículos es similar a la de las células. Preferiblemente, los microvehículos se mantienen libremente suspendidos mientras se separan las células de las gotas, ya que los pasos de procesamiento que usan sedimentación hacen que las células se sedimenten con los microvehículos, lo cual da como resultado pérdidas de recuperación. En las figuras 1 y 2 se provee una modalidad preferida de un dispositivo de separación. En algunas modalidades de la invención, el dispositivo de separación se provee como parte de un sistema. Un ejemplo de sistema se muestra en la figura 2. El sistema comprende así un biorreactor 100 en el cual las células son cultivadas sobre microvehículos; una trayectoria de flujo 102 desde el biorreactor hasta el dispositivo de separación 104, el dispositivo de separación comprendiendo una columna 106, una salida 108 para recoger las células y la solución acuosa, y un tamiz malla 110. Los microvehículos son retenidos en suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación, y son retenidos en dicho dispositivo mediante el tamiz malla, y las células y la solución acuosa se recogen a través de la salida. Provista también en el sistema está una bomba 112, en donde la bomba dirige el flujo de la solución acuosa desde el biorreactor hasta la salida.

En algunas modalidades, se pueden proveer un microfiltro 114 y un ultrafiltro 116 como componentes del sistema. En la modalidad mostrada en la figura 1 , el dispositivo de separación comprende típicamente una columna 106, tal como una columna de cromatografía, teniendo una entrada 114 a través de la cual una suspensión acuosa de células y microvehículos desde un biorreactor 100 es introducida en el dispositivo de separación 104; y por lo menos una salida 108 para recoger las células y la solución acuosa; y un tamiz malla 110. Los microvehículos son retenidos en suspensión en la columna mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación, y son retenidos en el mismo mediante un tamiz malla, y en donde las células y la solución acuosa son recogidas a través de la salida. La velocidad de flujo en el dispositivo de separación es de alrededor de 1 a aproximadamente 3 cm/min. Típicamente, un flujo ascendente a través de la columna se genera bombeando una solución acuosa, tal como la suspensión de células o un regulador de pH, a través de la entrada, en donde la entrada está situada en el fondo del dispositivo y la salida está situada en la parte superior del mismo. La figura 2 es una vista esquemática ampliada de un dispositivo de separación 200, mostrando en más detalle un ensamble de salida 210, un ensamble de tamiz malla 212, una entrada 214, y una columna 216 que tiene una sección superior 218 y una sección inferior 220. La sección inferior comprende típicamente aproximadamente 20 a 50%, más preferiblemente aproximadamente 30% del volumen de la columna, y contiene la entrada. La sección inferior es preferiblemente cónica, con un ángulo preferido de alrededor de 15 a aproximadamente 45 grados. De esta manera, el caldo de fermentación del biorreactor es bombeado en la base de la columna. La velocidad de flujo es regulada para proveer un flujo ascendente suficiente para mantener suspendidas las células y las partículas virales en el medio, mientras permite la retención de los microvehículos dentro del dispositivo de separación. Preferiblemente, la velocidad de flujo es de aproximadamente 1 a 2 cm/min, dado que las células tienen una gravedad específica similar a la de los microvehículos. El caldo depurado que contiene células y virus pasa a través del tamiz malla sobre el extremo superior de la columna similar al lecho fluidizado, y es recogido para microfiltración. Para un dispositivo en la escala de 200 I, la sección inferior de la columna es preferiblemente cónica. El cono permite una reducción gradual de la velocidad lineal del caldo de fermentación que entra al cono. La velocidad de flujo de la línea de entrada se reduce para lograr un flujo lineal reducido en una distribución uniforme a través del área de sección transversal en el extremo superior del cono. Las paredes del cono están a un ángulo que permite que las gotas que se sedimentan sobre las paredes se muevan hacia abajo hacia la entrada. De esta manera, estas gotas son resuspendidas para evitar atrapar las células entre las gotas sedimentadas. El ángulo de las paredes cónicas es de preferencia de aproximadamente 30 grados. Los ángulos menores de 15 grados proveen un cono excepcionalmente largo, y los ángulos mayores de aproximadamente 45 grados pueden no dispersar eficazmente la alimentación de la entrada. La sección superior de la columna funciona como una zona en ia cual las gotas se sedimentan a una velocidad mayor que la velocidad de flujo lineal del medio de fermentación. Esta sección de la columna es de forma cilindrica. Dentro de esta zona se forma un límite, de modo que los microvehículos se acumulan en la región inferior de la columna. Un ensamble de placa terminal 222 (figura 2) de la columna funciona como un punto de colecta de los medios de fermentación depurados que contienen células y virus. Este consiste de una placa terminal 224 adaptada con un ensamble de tamiz malla. Este tamiz, preferiblemente malla de aproximadamente 50 a 120, más preferiblemente malla de aproximadamente 100, funciona como un segundo punto para la remoción de los microvehículos. La modalidad descrita anteriormente es la modalidad preferida usada en los ejemplos de la presente. Las dimensiones de la columna y la malla del tamiz se pueden hacer variar con base en el volumen de ia solución que será procesada, la concentración de gotas, el microvehícuio particular usado y la formulación de los medios (por ejemplo, gravedad específica de los medios). Una columna preferida consiste de un cono inferior hecho a ia medida fabricado de acero inoxidable que será fijado a dos tubos de sección KS370 de Pharmacia adaptados con un ensamble terminal KS370, para el cual el tamiz de distribución automática fue reemplazado con una malla de acero inoxidable (ss) (de preferencia malla de aproximadamente 50 a 120, más preferiblemente malla de aproximadamente 100). Después de que las células son recogidas, son preferiblemente usadas para liberar las partículas virales adicionales. Se pueden usar homogeneización o congelación-deshielo para liberar las partículas virales. En una modalidad preferida de la invención, se usa microfiltración para lisar simultáneamente las células que contienen virus y depurar el caldo de restos de células que de otra manera interferirían con la purificación de los virus. Por ejemplo, la microfiltración se puede llevar a cabo usando un sistema Prostak (Millipore) con una membrana hidrófila o hidrófoba de 0.65 mieras, y a una velocidad de esfuerzo cortante de 7000 l/seg. La velocidad de esfuerzo cortante es generada por el flujo de material retenido a través de los canales de flujo tangencial de la membrana. Por lo tanto, el flujo transversal se usa no sólo para evitar que la membrana se atore, sino también se puede usar para crear esfuerzo cortante suficiente para lisar las células. El tamaño de poro del filtro debe ser suficiente para permitir el paso del virus, mientras retiene los restos de células. Así, típicamente la escala de tamaño de poro es de aproximadamente 0.2-0.65 miras. La escala de velocidad de esfuerzo cortante es típicamente de aproximadamente 2000 a 10,000 l/seg, más preferiblemente de aproximadamente 7000 l/seg. Típicamente, se añade ai caldo depurado endonucleasa BENZONASE™ (American International Chemical, Inc.) para digerir los ácidos nucleicos celulares, ya que las partículas virales pueden formar complejos con dichos ácidos nucleicos. En una modalidad preferida, se usa ultrafiltración usando un sistema Pellicon (Millipore) con una membrana de celulosa regenerada Pellicon I, con límite de peso molecular nominal de un millón para concentrar el virus. El paso de ultrafiltración logra dos funciones: el virus es concentrado para purificación, y la diafiltración se lleva a cabo para intercambiar el regulador de pH, de modo que la suspensión del virus se pueda aplicar directamente a una columna de DEAE. El eluato del microfiltro contiene al virus liberado, y es concentrado preferiblemente, por ejemplo, mediante ultrafiltración. Entre cada paso de cultivo, las células pueden ser aflojadas y separadas del microvehículo medíante tripsinización, por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina. En la presente invención, se prefiere remover el suero usado en el cultivo, dado que las proteínas del suero inhiben a la tripsina; la remoción del suero permite por lo tanto que sea usada una cantidad menor de tripsina. Esto es ventajoso, dado que la adición de una cantidad mayor puede causar concentraciones altas localizadas de tripsina que pudieran dañar a las células. Con respecto al siguiente paso, los iones Ca++ son removidos, dado que la remoción de estos iones de las células tiende a aflojar las mismas, y permite usar menos tripsina. De esta manera, el aflojamiento y la separación de las células, especialmente de la línea de células 293 de riñon embrionario humano, pueden incluir convenientemente los siguiente pasos: i) lavar rápidamente las células para remover el suero y otros materiales solubles; ¡i) remover el Ca++ de las células lavadas mediante la adición de un agente quelatador; iii) remover rápidamente el agente quelatador; iv) añadir rápidamente tripsina; v) tripsinizar las células durante un período breve (preferiblemente variando de alrededor de 3 minutos a aproximadamente 15 minutos); vi) neutralizar rápidamente la tripsina mediante la adición de proteína. En el paso (i) anterior, la frase "lavar rápidamente" significa, a un volumen constante en el biorreactor, perfundir un cambio en volumen de medio a una velocidad de aproximadamente 1 a 3 litros por minuto, más preferiblemente de alrededor de 2 litros por minutos. En el paso (iii) anterior, la frase "remover rápidamente el agente quelatador" significa, a un volumen constante en el biorreactor, perfundír cambios de 1.5 volúmenes de medio a una velocidad de aproximadamente 1 a 3 litros por minuto, más preferiblemente aproximadamente 2 litros por minuto. En el paso (iv) anterior, la frase "añadir rápidamente tripsina" significa añadir el volumen apropiado de solución de tripsina (típicamente una solución a 2.5%) a una velocidad de aproximadamente 1 a 3 litros por minuto, más preferiblemente aproximadamente 2 litros por minutos. En el paso (vi) anterior, la frase "neutralizar rápidamente la tripsina mediante la adición de suero" significa añadir el volumen apropiado de suero a una velocidad de aproximadamente 1 a 3 litros por minuto, más preferiblemente aproximadamente 2 litros por minuto. Si el suero no es removido en el paso (i), entonces la adición de las cantidades grandes necesarias de tripsina puede conducir a concentraciones localmente altas de la misma, lo cual puede realmente dañar o incluso destruir a las células, más que simplemente aflojarlas. La remoción del suero en el paso (i) y de Ca++ en el paso (ii), reduce la cantidad de tripsina necesaria en los pasos (iv) y (v). Para evitar dañar realmente o incluso destruir a las células, el tratamiento con el agente quelatador y con la tripsina se debe mantener preferiblemente por poco tiempo (es decir, bastante largo para separar las células de los microvehículos, pero de preferencia no por más tiempo). Ejemplos de agentes quelatadores preferidos incluyen EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y EGTA (ácido etilen-bís(oxietilen-nitrilo)-tetraacético). El suero es removido mediante un procedimiento de intercambio de medio; por ejemplo, el medio puede ser bombeado a través de un filtro giratorio. Se añade medio de lavado libre de suero, para reemplazar el que fue bombeado, y la mezcla se agita. En forma alternativa, la adición de medio de lavado libre de suero puede ser continua con la remoción de medio a través del filtro giratorio. El procedimiento se repite hasta que la concentración de suero haya sido reducida hasta un nivel suficientemente bajo, por ejemplo, menor de aproximadamente 1.0 a 0.2%, de preferencia aproximadamente 0.2%. El agente quelatador, de preferencia EDTA, se añade en el medio quelatador libre de suero, la mezcla se agita de nuevo, y el agente quelatador es bombeado. En forma alternativa, la adición del agente quelatador en el medio libre de suero puede ser continua con la remoción del medio a través del filtro giratorio. La tripsina se utiliza preferiblemente en el paso (v) para proveer una concentración en el biorreactor de alrededor de 0.05 a 0.1%, y se deja que actué sobre las células durante 5 a 10 minutos, por ejemplo, preferiblemente una concentración de tripsina de aproximadamente 0.065% durante aproximadamente 8 minutos. La proteína, típicamente en forma de suero de bovino, se añade preferiblemente al biorreactor a una concentración final de aproximadamente 10 a 20% para inhibir a la tripsina. De esta manera, la adición de suero en el paso (vi) no sólo prepara a las células para cultivo posterior, sino también neutraliza a la tripsina residual. La secuencia completa de pasos (i) - (vi) se puede llevar a cabo in situ en el biorreactor; en algunas modalidades, la suspensión de microvehículos y células se puede transferir a un biorreactor más grande, en donde se añaden otros microvehículos para el siguiente paso de cultivo. Se deja que las células se adhieran a los microvehículos, y entonces son cultivadas. Una vez que se vuelven substancialmente confluentes de nuevo (por ejemplo, cultivo a aproximadamente 37°C durante 3 a 4 días), pueden ser llevadas a través de la siguiente etapa, la cual puede ser por ejemplo cosecha, aflojamiento para un paso posterior adicional, o inoculación con el virus. Si las células han sido cultivadas simplemente para cosecha, entonces pueden ser cosechadas en esta etapa, por ejemplo, mediante la repetición de los pasos (i) a (vi) anteriores. Si se requieren para una etapa posterior adicional, entonces los pasos (i) - (vi) anteriores pueden ser repetidos. Si han sido cultivadas para la propagación de un virus, el virus puede ser ahora inoculado en el medio. Los ejemplos de la presente sirven para ilustrar, pero de ninguna manera para limitar, la presente invención. Los vectores y hospederos seleccionados y otros materiales, la concentración de reactivos, las temperaturas y los valores de otras variables, son sólo para ejemplificar la aplicación de la presente invención, y no deberán ser considerados como limitaciones de la misma.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES 1. REPASO A. Preparación del inoculo de las células Cada lote de fermentación viral se origina de una línea de células propagada a partir de un recipiente del Manufacturers Working Cell Bank (MWCB) de células 293. Los biorreactores son inoculados con células 293 (número de catálogo de ATCC CRL 1573) mantenidas mediante propagación en matraces T y CELL FACTORY™ usando medio de crecimiento (medio 1), como se ilustra en el cuadro 1 siguiente. Cada transferencia representa un pasaje. Típicamente, los números de pasaje 4 a 30 se utilizan para la inoculación de un bíorreactor de siembra.

CUADRO 1 Composición de los medios 1 Polvo de DMEM (disponible de American Biorganics, No. de catálogo D2807): usado preferiblemente para proveer 4.5 g/l de glucosa y 0.584 g/l de L-glutamina; sin bicarbonato sodio y sin HEPES. 2 Polvo de DMEM libre de Ca++ (disponible de American Biorganics, No. de catálogo D2807403): usado preferiblemente para proveer 4.5 g/l de glucosa y 0.584 g/l de L-glutamina; sin bicarbonato de sodio, sin cloruro de calcio y sin HEPES. 3 Suero de bovino: disponible de Hyclone, No. de catálogo 2151. 4 Solución de abastecimiento de EDTA: 186.1 g/l de ETDA y 20 g/l de pellas de NaOH. 5 Solución de abastecimiento de glutamina: 29.22 g/l. Para preparar la transferencia de células de un matraz a otro durante la expansión de las células, el medio agotado se vierte, y las células en el matraz se lavan entonces con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). Se añade una solución de tripsina a la monocapa de células sobre la superficie del matraz, y las células se exponen hasta que se separan de la superficie. La acción de la tripsina es entonces neutralizada principalmente mediante la adición de medio de crecimiento (medio 1 , cuadro 1) conteniendo suero; la neutralización completa no es necesaria, dado que la tripsina residual tendrá baja actividad. Las células pueden ser recuperadas mediante centrifugación, y resuspendidas en medio de crecimiento fresco (mediol). El cuadro 2 muestra los volúmenes típicos usados.

CUADRO 2 Volúmenes típicos usados en la transferencia de células B. Preparación del inoculo del virus Se pueden preparar inóculos del virus infectando matraces para cultivo de tejidos maduros CELL FACTORY™. En este procedimiento, las células 293 son propagadas primero desde los matraces T hasta los matraces para cultivo de tejidos CELL FACTORY™. Cuando los cultivos de los matraces para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ están maduros (típicamente 80 a 90% confluentes), son infectados con un inoculo del banco de virus útiles del fabricante (MWVB). Los matraces para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ infectados se incuban hasta que las células 293 se separan de su superficie de soporte. Las células se recogen mediante centrifugación y se fracturan mediante ciclos múltiples de congelación-deshielo. Después de una centrifugación subsecuente, el virus es recuperado en el sobrenadante, y almacenado como alícuotas a -20°C o menos. Este material es el "inoculo del virus", el cual se usa para infectar a los biorreactores. Opcionalmente, el inoculo del virus se puede derivar también de la cosecha del biorreactor, la cual es esterilizada con filtro (véase "cosecha del biorreactor de producción" más adelante).

C. Preparación y funcionamiento del biorreactor de siembra Preferiblemente, se utiliza un biorreactor de siembra para preparar el inoculo de células 293 para el biorreactor de producción. El biorreactor de siembra es esterilizado con vapor y cargado con un lote de medio de crecimiento esterilizado con filtro (medio 1 , cuadro 1 anterior) para el procedimiento de suspensión de células libres. Sin embargo, para el procedimiento con microvehículos se añaden preferiblemente en esta etapa gotas de microvehículo dilatadas estériles (Cytodex 3 o equivalente). El biorreactor de siembra se inocula con las células 293 cosechadas de los matraces para cultivo de tejidos CELL FACTORY™. Las condiciones de operación se establecen como se muestra en el cuadro 3. El pH y el oxígeno disuelto (DO) se controlan rociando CO2 y oxígeno, respectivamente. Se puede añadir medio de crecimiento extra al biorreactor mediante perfusión. El crecimiento celular se monitorea mediante examen microscópico, y midiendo la producción de lactato y el consumo de glucosa. Típicamente, cuando la densidad de células en el cultivo en suspensión alcanza 1 x 106 células por mililitro en el biorreactor de siembra, está lista para inocular el biorreactor de producción. Sin embargo, la inoculación requiere otros pasos adicionales para llevar a cabo el procedimiento con microvehículos. Típicamente, cuando las células sobre los microvehículos son más de 50% confluentes, el suero y el calcio en el medio del biorreactor se eliminan usando los medios descritos en el cuadro 1. Se añade entonces rápidamente tripsina, y cuando la separación de las células alcanza un nivel típico, se añade suero para inactivar la misma. Los contenidos del biorreactor de siembra se transfieren ahora al biorreactor de producción. Opcionalmente, las células 293 cosechadas de matraces múltiples para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ se pueden usar directamente como inoculo para un biorreactor de producción. Típicamente, de 8 a 12 de dichos cultivos son cosechados y mezclados para proveer un inoculo.

CUADRO 3 Condiciones de operación del biorreactor de siembra D. Preparación y operación del biorreactor de producción El procedimiento de producción viral se ejemplifica en un biorreactor de producción de 200 litros usando medio de crecimiento (medio 1 , cuadro 1). En el procedimiento de cultivo en suspensión, el medio esterilizado con filtro se distribuye en lotes en el biorreactor. Sin embargo, en el procedimiento con microvehículos, los microvehículos son esterilizados in situ en el biorreactor de producción, o son sometidos a autoclave externamente y cargados. Estos microvehículos se acondicionan entonces en el medio de crecimiento (medio 1) antes de su inoculación con células 293.

El biorreactor de producción es inoculado con las células 293 del biorreactor de siembra. Las condiciones de operación son como se muestran en el cuadro 4. El pH y el oxígeno disuelto (DO) se controlan rociando CO2 y oxígeno, respectivamente. Opcionalmente, se puede añadir medio de crecimiento extra al biorreactor mediante perfusión. El crecimiento de las células se monitorea mediante examen microscópico y midiendo la producción de lactato y el consumo de glucosa. Se deja que las células crezcan hasta aproximadamente 1 x 106 células por mililitro. El biorreactor es inoculado entonces con el virus. Preferiblemente, se usa una multiplicidad de relación de infección (MOI) expresada como el total de partículas virales por célula de 50:1 a 150:1. El título viral se lleva a cabo típicamente usando la pueba de CLAR Resource Q. Se deja que el virus se propague hasta que la viabilidad de las células disminuya hasta aproximadamente 10%. El tipo de virus y su acción sobre las células hospederas pueden determinarse si es necesario para separar las células hospederas de los microvehículos y/o lisar las células. Casi al tiempo del título máximo del virus (con frecuencia cuando las células comienzan a separarse del microvehículo y algunas de las cuales se pueden lisar, de modo que el virus comienza a escapar), la incubación se puede detener y las células y el virus se pueden cosechar. Además, en el procedimiento con microvehículos, 80 a 90% de las células, a veces incluso más de 90%, pueden separarse de los microvehículos. Sin ser limitado a teoría alguna, el efecto citopático de la propagación viral en las células hospederas parece determinar la separación de las células. De esta manera, cuando se usa adenovirus ACN53 con células 293, las células comienzan a separarse de los microvehículos después del cultivo con el virus durante 3 ó 4 días.

CUADRO 4 Condiciones de operación del biorreactor de producción E. Cosecha del biorreactor de producción 1. Separación de células del microvehículo Durante la cosecha, los contenidos del biorreactor tienen que ser manejados en forma diferente, dependiendo de si el procedimiento utiliza suspensión libre o un microvehículo. En el procedimiento con microvehículos, se utiliza preferiblemente una columna de lecho fluidizado para separar los microvehículos de las células y el sobrenadante. Se mantiene una velocidad de flujo ascendente a fin de retener los microvehículos, mientras las células y el sobrenadante pasan a través. El lecho fluidizado se lava con medio o regulador de pH para lavado para recuperar la mayoría de las células residuales y virus, y los lavados se combinan con las células y el sobrenadante como un eluato. No se requiere la operación de lecho fluidizado para el procedimiento de suspensión de células libres. El eluato que contiene células y el virus es procesado además, ya que las células son usadas mediante alto esfuerzo cortante para liberar el virus, y el eluato es depurado entonces mediante microfiltración de flujo transversal. Típicamente, se usan membranas Durapore (Millipore) de 0.65 µm o membranas equivalentes. Hacia el final de la microfiltración, el material retenido es lavado con el regulador de pH para lavado para recuperar el virus residual en el material permeado. Después de la microfiltración, el material permeado se puede tratar opcionalmente con una nucleasa tal como la endonucleasa BENZONASE™. El material permeado de la microfiltración se concentra mediante ultrafiltración (con límite de peso molecular típicamente de 1 millón), y se lleva a cabo un intercambio de regulador de pH usando el regulador de pH para lavado. El material retenido concentrado y diafiltrado que contiene al virus se hace pasar entonces a través de un filtro final. El material filtrado resultante se almacena como "concentrado viral" en un congelador a -20°C o menos. 2. Composición y preparación de los medios El cuadro 1 anterior señala los medios usados en la preparación del inoculo viral y en ei procedimiento de fermentación. Todos estos medios de cultivo se preparan disolviendo primero el polvo de DMEM seco y otros reactivos en agua purificada. Después de disolver los polvos secos, estos medios se ajustan a pH 7.2-7.6 con ácido clorhídrico. Los medios se esterilizan entonces haciéndolos pasar a través de un filtro de 0.2 µm en un recipiente de almacenamiento apropiado. Estos medios estériles se refrigeran abajo de 10°C, y se desechan un mes después de su preparación. El cuadro 5 incluye varios reguladores de pH usados en el procedimiento.

CUADRO 5 Reguladores de pH usados en la fermentación y la cosecha El cuadro 6 resume los controles del procedimiento durante los procedimientos de fermentación y cosecha.

CUADRO 6 Controles del procedimiento CUADRO 6 (CONTINUACIÓN) verificación de la contaminantes esterilidad de la muestra Bíorreactor de Observación Crecimiento y producción microscópica, morfología celulares medición de las normales sobre los concentraciones de microvehículos, menos lactato y glucosa, de 1.2 g/l de lactato conteo de células del antes de la infección, la sobrenadante, mayoría de las células verificación de la se separan de ios esterilidad de ia microvehículos en la muestra cosecha, sin contaminantes. Lecho fluidizado Observación visual El volumen del lecho del lecho fluidizado, fluidizado será menor presión de que el volumen total de alimentación y la columna, y la presión velocidad del flujo de de alimentación debe alimentación. ser menor que el punto de fuga del ensamble de columna Microfiltración Observación y control Velocidad del flujo de del flujo de alimentación ajustada alimentación, flujo del para lograr alto material permeado, esfuerzo cortante sin presión de exceder una presión de alimentación, de transmembrana de 0.5 transmembrana y del barias. La temperatura material retenido, no debe exceder 37°C. temperatura del material retenido. Ultrafiltración Observación y control La presión de de la presión de alimentación no debe alimentación y de la exceder 1 baria. La temperatura del temperatura no debe material retenido exceder 37°C. Filtración final Observación y control La presión de de la presión de alimentación no debe alimentación exceder 2 barias II. Transferencia de gota agota del biorreactor de siembra al biorreactor de producción A. Preparación del ¡nodulo de células 293 para el biorreactor de siembra 1. Aumento progresivo del recipiente al matraz T75 Se deshielo un recipiente congelado de la línea de células 293 conteniendo un total de 2 x 107 células en un baño de agua a 37°C. Las células se lavaron con 10 ml de medio 1. Las células lavadas se resuspendieron en un volumen total de 30 ml de medio 1 , y se colocaron en un matraz para cultivo de tejidos (T75) de 75 cm2. El cultivo se colocó en una incubadora a 37°C con una atmósfera de CO2 a 5% y un nivel de humedad de 100%. Este fue el pasaje 1 del cultivo. 2. Aumento progresivo del matraz T75 al matraz T500 usando tripsinización El cultivo T75 alcanzó un nivel de confluencia de 90% en tres días. En este tiempo, el cultivo T75 fue tripsinizado de la siguiente manera. Se removieron del matraz los 30 ml del medio del sobrenadante. Se usó un volumen de 10 ml de CMF-PBS (solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio y sin cloruro de magnesio) para lavar la superficie del cultivo. La CMF-PBS del sobrenadante se removió del matraz. Se añadieron al matraz 2 ml de solución TE (tripsina cruda a 0.05% con EDTA-4Na a 0.53 mM). El matraz se movió, de modo que la solución cubriera la superficie total del cultivo. Las células se separaron de la superficie del matraz dentro de cinco minutos. Se añadieron 10 ml de medio 1 al matraz inmediatamente después de que las células se separaron de la superficie. La suspensión de células se centrifugó a 1000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente haciendo una pausa. Se removió el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 5 ml de medio 1. La suspensión de células se transfirió a un tubo estéril con 200 ml de medio 1. Los 200 ml de suspensión de células se colocaron en un matraz para cultivos de tejidos (T500) de 500 cm2. Se dejó que el líquido en el matraz T500 se equilibrara entre las cámaras antes de su colocación en posición horizontal en la incubadora. El cultivo se colocó en una incubadora a 37°C con una atmósfera de CO2 a 5% y un nivel de humedad del 100%. Este fue el pasaje 2 del cultivo. 3. Aumento progresivo y paso del cultivo T500 usando tripsinización Ei cultivo T500 alcanzó un nivel de confluencia de 90% en cuatro días. Al cuarto día, el cultivo T500 fue tripsinizado y ampliado en proporción de la siguiente manera. De desechó el medio del sobrenadante. La superficie del cultivo se lavó con 25 ml de CMF-PBS. Se añadió al matraz un volumen de 25 ml de TE. El matraz de movió, de modo que la solución de TE cubriera las tres capas de la superficie del cultivo. Las células se separaron de la superficie del matraz dentro de cinco minutos. Después de que las células se separaron, se añadieron 50 ml de medio 1 al matraz. Todas las superficies entraron en contacto con el medio al mover el matraz. La suspensión de células resultantes se vertió en un tubo de centrífuga cónico de 200 ml. Las células fueron transformadas a pellas mediante centrifugación a 1000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente haciendo una pausa. Se desechó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 5 a 15 ml de medio 1. La suspensión de células se colocó en 800 ml (200 ml por matraz T 500 nuevo) de medio 1. Se mezcló la suspensión de células. Se añadió un volumen de 200 ml de la suspensión de células a cada uno de los cuatro matraces T500. Se dejó que el nivel de líquido en cada matraz se equilibrara entre las cámaras antes de su colocación en posición horizontal en la incubadora. La relación de separación para este pasaje fue de 1 :4. Este fue el pasaje 3. El cultivo se hizo pasar de esta manera por los pasajes 4 a 13. En el pasaje 13, cuatro cultivos T500 fueron tripsinizados de la manera descrita anteriormente. Las suspensiones de células se mezclaron y se colocaron en un tubo conteniendo 1.5 litros de medio 1. Esta suspensión de células se añadió a un matraz para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ (CF) de 6000 cm2. Se dejó que el nivel del líquido en el CF se equilibrara entre las cámaras antes de su colocación en posición horizontal en la incubadora. 4. Aumento progresivo y paso de los cultivos de los matraces para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ El cultivo de CF alcanzó un nivel de confluencia de 80% en días. La tripsinización se llevó a cabo de la siguiente manera para el pasaj 15. Los 1.5 litros de medio 1 fueron drenados del cultivo de CF. Las superficies de los cultivos se lavaron con 500 (+/- 100) ml de CMF-PBS.

Después del lavado, se añadieron 250 (+/- 50) ml de la solución de TE al cultivo de CF. Se movió el CF, de modo que la solución de TE cubriera cada una de las superficies. Después de que las células se separaron de la superficie, se añadieron 500 ml de medio 1 al CF. Se movió el CF, de modo que el medio 1 entrara en contacto con cada una de las superficies. La suspensión de células resultante fue distribuida en alícuotas en cuatro tubos de centrífuga cónicos de 250 ml. Las células fueron transformadas a pellas mediante centrifugación a 1000 rpm durante diez minutos haciendo una pausa. El medio del sobrenadante se desechó de cada tubo de centrífuga. En cada tubo de centrífuga, las células fueron resuspendidas en 5 ml de medio 1. Las suspensiones de células se mezclaron en un tubo de centrífuga. Los tres tubos de centrífuga restantes se lavaron con otros 5 a 10 ml de medio 1 , el cual se añadió a la suspensión de células global. Esta suspensión de células se separó igualmente entre 6 tubos conteniendo 1.5 litros de medio 1. Cada una de las seis suspensiones de células de 1.5 litros se añadió a un CF. Se dejó que el nivel del líquido de cada CF se equilibrara entre las cámaras, antes de que el CF se colocara en posición horizontal en la incubadora. El cultivo se hizo pasar de la misma forma por el pasaje 16. Los datos del pasaje se dan en el cuadro 7.

CUADRO 7 Datos del pasaje . Preparación del inoculo de células de los cultivos de los matraces para cultivo de tejidos CELL FACTORY™ al biorreactor de siembra Los cultivos de CF alcanzaron un nivel de confluencia de 80% en días. Se usaron cuatro de los seis cultivos de CF para inocular el biorreactor de siembra de la siguiente manera. Los 1.5 litros de medio 1 fueron drenados del cultivo de CF. Las superficies de los cultivos se lavaron con 500 (+/- 100) ml de CMF-PBS. Después del lavado, se añadieron 250 (+/- 50) ml de la solución de TE al cultivo de CF. Se movió el CF, de modo que la solución de TE cubriera cada una de las superficies. Inmediatamente después de que ico células se separaron de la superficie, se añadieron 500 ml de medio 1 al CF.

Se movió el CF, de modo que el medio 1 entrara en contacto con cada una de las superficies. La suspensión de células resultante fue distribuida en alícuotas en cuatro tubos de centrífuga cónicos de 250 ml. Las células fueron transformadas a pellas mediante centrifugación a 1000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente haciendo una pausa. El medio del sobrenadante se desechó de cada tubo de centrífuga. En cada tubo de centrífuga, las células fueron resuspendidas en 5 ml de medio 1. Las suspensiones de células se mezclaron en un tubo de centrífuga. Los tres tubos de centrífuga restantes se lavaron con otros 5 a 10 ml de medio 1 , el cual se añadió a la suspensión de células global. Las suspensiones de células de cada uno de los cuatro tubos de centrífuga fueron entonces combinadas, produciendo un volumen total de 50 a 100 ml. Se añadió un volumen adicional de medio 1 para llevar el volumen total a 1000 ml. Este fue el inoculo de células. La cantidad total de células en el inoculo de células fue de 2.88 x 109 células totales y 2.84 x 109 células viables. Los 1000 ml del inoculo de células fueron transferidos a un matraz Erlenmeyer estéril, e inoculados en el biorreactor de siembra de 30 litros que contenía un volumen total de 18 litros de medio 1 con 66 g de microvehículos Cytodex 3.

B. Biorreactor de siembra 1. Preparación de microvehículos Cvtodex 3 para el biorreactor de siembra de 30 litros Se preparó un lote de 66 g de microvehículos Cytodex 3 de la manera siguiente. Los 66 g de microvehículos Cytodex 3 se colocaron en un matraz Erlenmeyer de vidrio de cinco litros. Se añadieron dos litros de CMF-PBS con 0.2 ml de Tween 80. Se dejó que los microvehículos se dilataran a temperatura ambiente durante cinco horas treinta minutos. Después de este período de dilatación, la CMF-PBS del sobrenadante se decantó el matraz, dejando la suspensión de microvehículos Cytodex 3. La suspensión de microvehículos Cytodex 3 se lavó con dos litros de CMF-PBS, y se resuspendió entonces en CMF-PBS hasta un volumen total de dos litros. El lote de Cytodex 3 se sometió a autoclave en el matraz de cinco litros a 121°C durante 3.5 horas sobre un ciclo de líquidos. El lote de Cytodex 3 esterilizado se usó al siguiente día para el biorreactor de siembra de 30 I. En el día de la adición de Cytodex 3 al biorreactor de siembra de treinta litros, se llevaron a cabo las siguientes acciones. Se decantó la CMF-PBS del sobrenadante del matraz de 5 litros. La suspensión de microvehículos se lavó con dos litros de medio 1. Después del lavado, se añadió medio 1 al matraz hasta un volumen final de 2 litros. 2. Preparación del biorreactor de siembra de 30 litros El biorreactor de siembra de 30 I que contenía un filtro giratorio, se lavó y se sanitizó con vapor. El biorreactor se esterilizó durante 50 minutos a 121 °C. Un día antes de la inoculación de las células 293, el biorreactor de siembra de 30 litros se llenó con 18 litros de medio 1. Los dos litros que contenían 66 gramos de los microvehículos Cytodex 3 con solución del medio 1 se añadieron al biorreactor de 30 I. Las condiciones de operación del biorreactor de siembra de 30 I se dan en el cuadro 8.

CUADRO 8 Condiciones de operación del biorreactor de siembra de 30 I 3. Cultivo de células 293 en el biorreactor de siembra de 30 I Las células 293 fueron propagadas sobre los microvehículos Cytodex 3 durante 5 días. Las condiciones de operación reales en el biorreactor de siembra de 30 I durante este período se dan en el cuadro 9.

CUADRO 9 Condiciones de operación en el biorreactor de siembra de 30 I En el quinto día de cultivo, 54% de la población de microvehículos contenían más de 50% de células/microvehículo, 38% contenían de 1 a 25 células, 8% no contenían células, y 8% estaban en agregados de 2 microvehículos, según se determinó mediante el examen de una muestra bajo el microscopio a un aumento de 100X. Los resultados se dan en el cuadro 10.

CUADRO 10 Resultados del examen microscópico en el cuarto día de cultivo de células 293 sobre microvehículos Cytodex en el biorreactor de 30! B. Procedimiento de transferencia de gota a gota 1. Preparación de microvehículos Cvtodex 3 para el biorreactor de producción Se preparó un lote de 420 gramos de microvehículos Cytodex 3 de la siguiente manera. Los 420 gramos de microvehículos Cytodex 3 se colocaron en un garrafón de 50 I. Se añadió un volumen de 21.5 I de CMF-PBS con 2.0 ml de Tween 80. Se dejó que los microvehículos se dilataran a temperatura ambiente durante 17 horas. Después de este período de dilatación, la CMF-PBS del sobrenadante se removió del garrafón, dejando la suspensión de microvehículos Cytodex 3. La suspensión de microvehículos Cytodex 3 se lavó con 25 litros de CMF-PBS, y se resuspendió entonces en CMF-PBS hasta un volumen total de 20 litros. El biorreactor de 200 I que contenía un filtro giratorio se lavó y se sanitizó con vapor. Se transfirió al biorreactor la suspensión de microvehículos Cytodex 3 de 20 I. Se usaron 5 litros de CMF-PBS para lavar el garrafón de 50 I, y se transfirieron al biorreactor. El biorreactor se esterilizó durante 50 minutos a 123°C. El biorreactor se mantuvo a 4°C durante la noche. Al día siguiente, se añadieron 120 I de medio 1 al biorreactor de 200 I. La solución de microvehículos se agitó a 90 rpm durante 10 minutos en el biorreactor. El volumen se redujo hasta 55 I mediante la separación del líquido a través del filtro giratorio. Se añadieron otros 110 I de medio 1 al biorreactor de 200 I. La solución de microvehículos se agitó a 90 rpm durante 10 minutos en el biorreactor. El volumen se redujo hasta 55 l mediante la separación del líquido a través del filtro giratorio. Se añadió medio 1 al biorreactor para llevar el volumen hasta 125 I. Las condiciones de operación del biorreactor se determinaron de conformidad con el cuadro 11.

CUADRO 11 Condiciones de operación del biorreactor El biorreactor de producción de 200 I estaba listo para recibir el inoculo del biorreactor de siembra. 2.Tripsinización del cultivo del biorreactor de siembra En el quinto día de cultivo de las células 293 sobre los microvehículos Cytodex 3, se llevó a cabo el procedimiento de transferencia de gota a gota. Los niveles de suero y de calcio del medio en el cultivo se redujeron perfundiendo 22 litros del medio 2 a una velocidad de 2 I por minuto usando el filtro giratorio con un volumen constante en el biorreactor de 20 I. La perfusión se continuó con 22 I del medio 3 a una velocidad de perfusión de 2 I por minuto con un volumen constante en el biorreactor de 20 I. Esto redujo además los niveles de suero y de calcio. El medio 3 contenía etilendiaminotetraacetato disódico dihidratado (EDTA), el cual quelata los cationes divalentes tales como magnesio y calcio. Se llevó a cabo una tercera ronda de perfusión usando 33 litros de medio 2, el cual fue designado para reducir aún más los niveles de suero y de calcio, y para reducir la concentración de EDTA en el medio. En este punto, el medio se aisló a través del filtro giratorio para reducir el volumen total del cultivo hasta 15.5 I. Se añadió un volumen de 480 ml de una solución de tripsina a 2.5% al biorreactor en un minuto. Mediante observación microscópica, 8 minutos después de la adición de la solución de tripsina, 90% de las células se habían separado de los microvehículos. En este punto, se añadieron 4 I de suero al biorreactor en 2 y medio minutos para inhibir la acción de la tripsina y proteger a las células del esfuerzo cortante durante el procedimiento de transferencia al biorreactor de producción. Las células tripsinizadas y los microvehículos fueron transferidos al biorreactor de producción mediante presión. La transferencia se logró en ocho minutos. Inmediatamente después de la transferencia, se añadieron 5 l de medio 1 al biorreactor de siembra como un chorro, y se transfirieron al biorreactor de producción mediante presión. Las condiciones de operación del biorreactor de siembra durante el procedimiento de transferencia de gota a gota se dan en el cuadro 12.

CUADRO 12 Condiciones de operación del biorreactor de siembra durante el procedimiento de transferencia de gota a gota C. Cultivo de células 293 en el biorreactor de producción de 200 I antes de la infección Se propagaron las células 293 sobre los microvehículos Cytodex 3 durante seis días. Las condiciones de operación reales en el biorreactor de producción de 200 I durante este período se dan en el cuadro 13.

CUADRO 13 Condiciones de o eración en el biorreactor de roducción de 200 I Se perfundió un volumen total de 115 litros de medio 1 de los días 4 a 6. Los regímenes fueron los siguientes: se perfundieron 24 litros en una hora en el día cuatro, se perfundieron 40 litros en una hora en el día cinco, y se perfundieron 50 litros en una hora en el día seis. La velocidad de captación de oxígeno medida como la disminución del nivel de oxígeno disuelto (% de saturación de aire, DO %) por minuto (disminución de DO %/min) alcanzó 1.65% por minuto en el día seis. Los resultados del examen microscópico en el sexto día de cultivo de células 293 sobre microvehículos Cytodex 3 en el biorreactor de 200 I, se dan en el cuadro 14.

CUADRO 14 Resultados del examen microscópico en el sexto día de cultivo de células 293 sobre microvehículos Cvtodex 3 en el biorreactor de 200 I Porcentaje de la población total de microvehículos >50 células 10-50 células por 1-10 células por Microvehípor microvehículo microvehículo culos vacíos microvehículo 31 % 23% 25% 21 % D. Infección de las células 293 en el biorreactor de producción de 200 I Se inoculó el cultivo del biorreactor con virus en el día 6. El inoculo viral había sido almacenado congelado a -80°C. Un volumen de 45 ml del inoculo viral, 2-2, fue deshielado en un baño de agua de 20 a 25°C. La cantidad total de virus añadida al tanque fue de 1.1 x 1013 partículas virales, medida mediante la prueba de CLAR Resource Q. El inoculo viral se mezcló y se colocó en un tubo con un litro de medio 4 (medio de Eagle modificado de Dulbecco 293-1 -R07 con L-glutamina y bicarbonato de sodio (3.7 g/l)). La solución viral se filtró a través de una cápsula de cultivo Maxi Gelman en un matraz de adición estéril de cinco litros. La suspensión viral se añadió al biorreactor de producción de 200I con conexiones estériles hechas mediante la soldadora de entubado. Las condiciones de operación del biorreactor de producción después de ia infección se dan en el cuadro 15.

CUADRO 15 Condiciones de operación del biorreactor de producción después de la infección Tres días después de la infección, 89% de los microvehículos no tenían células adheridas, y la velocidad de captación de oxígeno medida fue de 0.53% por minuto. La concentración total de células infectadas presentes en el caldo del sobrenadante fue de 1.0 x 106 células/ml. El volumen total en el biorreactor fue de 162 litros. El biorreactor fue cosechado en esta ocasión.

E. Operaciones de recuperación Se preparó un volumen de 400 litros del regulador de pH para recuperación de cosecha, y se filtró a través de un Pall Ultipor N66 (tamaño de poro 0.2 mieras), y se distribuyó en alícuotas en recipientes estériles de la siguiente manera. Se prepararon tres alícuotas de 210 litros, 130 litros y 50 litros. Se usó el volumen de 210 litros para la operación de lavado del biorreactor y la columna de lecho fluidizado. Se usó la alícuota de 130 litros durante la microfiltración. Se utilizó la alícuota de 50 litros durante el procedimiento de ultrafiltración.

F. Separación de las células de los microvehículos usando la columna de lecho fluidizado El lecho fluidizado se sanitizó usando una solución cáustica (hidróxido de sodio a 0.1 N). Se conectó un accesorio en forma de T al orificio de cosecha del biorreactor. En un lado del accesorio en forma de T se conectaron una manguera sanitaria (diámetro interior de 15.9 mm) y válvula a la columna de lecho fluidizado. Se colocó una bomba peristáltica sobre esta línea (Watson Marlow, modelo 604 S). El segundo lado del accesorio en forma de T se conectó a una manguera sanitaria (diámetro interior de 15.9 mm) y válvula, conduciendo hacia el tanque de regulador de pH. La salida de la columna de lecho fluidizado, a través de la cual se hizo pasar el caldo conteniendo las células y el virus, se conectó a un tanque usado como el recipiente de recirculación para microfiltración. El caldo del biorreactor se hizo pasar a través de la columna de lecho fluidizado a una velocidad de flujo objetivo de 2 a 3 litros por minuto. La velocidad de flujo se controló con la bomba peristáltica. La agitación se mantuvo en el biorreactor. Cuando el volumen del biorreactor fue menor de 100 litros, el filtro giratorio se apagó. Cuando el volumen del biorreactor fue menor de 30 litros, el agitador se apagó. Después de que los contenidos del biorreactor se procesaron a través de la columna de lecho fluidizado, el biorreactor se lavó con 90 litros de regulador de pH para recuperación de cosecha. Este material de lavado se procesó a través de la columna de lecho fluidizado. Al final del procedimiento, los microvehículos quedaron en la columna de lecho fluidizado y se desecharon. Los datos se dan en el cuadro 16.

CUADRO 16 Datos de una operación de columna del lecho fluidizado G. Microfiltración del caldo depurado de microvehículos - lisis de las células infectadas y tratamiento con endonucleasa BENZONASE™ El material de partida para el procedimiento de microfiltración fue el caldo de la columna de lecho fluidizado que fue depurado de los microvehículos y que contenía células y virus. Durante el paso de microfiltración, las células fueron usadas debido a la velocidad de esfuerzo cortante usada, el caldo fue depurado de desechos mayores de 0.65 mieras, y los ácidos nucleicos residuales de las células usadas fueron digeridos mediante endonucleasa BENZONASE™ (por ejemplo, 0.5 unidades de millón por lote de 200 I), una preparación enzimática. La unidad de microfiltración fue un sistema Prostak (Millipore). Contenía una membrana hidrófila Durapore de tamaño de poro de 0.65 mieras (número de catálogo SK2P446EO) con una área se superficie de 5.022 m2.

Las líneas de alimentación y de material retenido de la unidad de filtro Prostak fueron conectadas al recipiente de recirculación para microfiltración que contenía el caldo depurado de microvehículos de la columna de lecho fluidizado. Se conectó una línea usada para alimentar el regulador de pH de recuperación de cosecha al recipiente de recirculación para microfiltración. La línea de material permeado de la unidad Prostak fue conectada al recipiente de recirculación para ultrafiltración. La temperatura del caldo se mantuvo en la escala de 25-35°C. Cuando la alimentación de caldo en la unidad Prostak se redujo hasta un volumen de 10 a 30 litros en el recipiente de recirculación para microfiltración, se añadieron 50 litros del regulador de pH de recuperación de cosecha al recipiente, y se continuó la microfiltración. Este paso se repitió una vez. La microfiltración se continuó hasta que el volumen en el recipiente de recirculación para microfiltración se redujo de 10 a 30 litros. En esta ocasión, se añadieron 0.5 unidades de millón de endonucleasa BENZONASE™ al caldo depurado en el recipiente de recirculación para ultrafiltración. Los contenidos del recipiente se mezclaron bien, y el caldo se mantuvo durante dos horas antes de que la ultrafiltración se iniciara. Los datos se dan en el cuadro 17.

CUADRO 17 Datos de una operación de microfiltración H. Ultrafiltración del caldo para concentrar el virus con diafiltración para llevar a cabo el intercambio de regulador de pH El material de partida para el procedimiento de ultrafiltración en el recipiente de recirculación para ultrafiltración fue el caldo depurado tratado con endonucleasa BENZONASE™ a partir del material permeado por microfiltración. La unidad de ultrafiltración fue un sistema Pellicon (Millipore). Contenía una membrana de celulosa regenerada Pellicon II con límite de peso molecular nominal de un millón (número de catálogo P2C01 MC05) con un área de superficie de 5.022 m2. Se conectaron las líneas de alimentación y de material retenido de la unidad Pellicon al recipiente de recirculación para ultrafiltración. La línea de material permeado mediante ultrafiltración se conectó a un recipiente de desecho. Se conectó un recipiente que contenía el regulador de pH de recuperación de cosecha (base de Tris a 50 mM, cloruro de sodio a 150 mM, cloruro de magnesio hexahidratado a 2 mM y sacarosa a 2%) al recipiente de recirculación para ultrafiltración. Cuando el volumen de material retenido por uitraf iltración alcanzó 5 a 10 litros, se añadieron 15 litros del regulador del pH de recuperación de cosecha, y la ultrafiltración se continuó. Este paso se repitió una vez. La ultrafiltración se continuó, hasta que el volumen de material retenido fuera menor de 5 a 10 litros. El material retenido de la ultrafiltración contenía al virus concentrado. El material retenido fue recogido de la unidad Pelllcon. Se usó un chorro de 3 a 6 litros del regulador de pH de recuperación de cosecha para recoger todo el material de la unidad Pellicon. Este material aplicado a chorro se añadió al caldo del material retenido del ultrafiltro. Esto se filtró a través de un filtro Millipore, Durapore, de tamaño de poro de 0.45 mieras (número de catálogo CVHL71 PP3) en una bolsa estéril. El material en la bolsa estéril se almacenó congelado a -80°C. Los datos se dan en el cuadro 18.

CUADRO 18 Datos de una operación de ultrafiltración I. Comentarios generales Todos los cultivos de células 293 en los matraces para cultivo de tejidos T75, T500 y CELL FACTORY™ se mantuvieron en el medio 1 en una incubadora a 37°C, 100% de humedad y una atmósfera de C02 a 5%. Todas las operaciones expuestas se llevaron a cabo asépticamente bajo una cubierta de bioseguridad (de flujo laminar). Las saturaciones y adiciones de medio se llevaron a cabo a través de un filtro en línea Ultipor N66 PALL de tamaño de poro de 0.2 mieras instalado sobre el orificio de alimentación del biorreactor, el cual fue esterilizado con vapor durante 30 minutos a 121°C. Todas las demás adiciones a los biorreactores se llevaron a cabo usando un matraz Erlenmeyer estéril con entubado PHARMED™ que fue conectado asépticamente entre el biorreactor y el matraz de adición mediante una soldadora de entubado. Todos los reguladores de pH usados en los procedimientos de recuperación se filtraron a través de un filtro en línea Ultipor N66 PALL de tamaño de poro de 0.2 mieras (SLK7002NFP) instalado sobre un orificio del recipiente de recepción. Nótese que para las operaciones de microfiltración, se puede usar una membrana hidrófila o hidrófoba. Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en su totalidad como referencia al mismo grado como si cada solicitud de patente o publicación individual se indicara específica e individualmente para ser incorporada en la presente como referencia. Las modificaciones y variaciones de esta invención serán evidentes para los expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen únicamente a manera de ejemplo, por lo que no se deberá considerar que la invención está limitada por las mismas.

Claims (38)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para cultivar células, caracterizado porque comprende: (a) cultivar las células sobre un primer lote de microvehículos hasta que las células sean substancialmente confluentes; (b) separar las células de los microvehículos sin remover los mismos de la suspensión; (c) añadir un segundo lote de microvehículos; y (d) cultivar entonces las células. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque. el paso para separar las células del primer lote de microvehículos comprende los siguientes pasos: (a) lavar los microvehículos y las células adheridas para remover los materiales solubles; (b) poner en contacto los microvehículos y las células lavadas con un agente quelatador; (c) remover el agente quelatador; (d) tripsinizar las células durante un período breve para separar las mismas de los microvehículos; y (e) neutralizar la tripsina mediante la adición de proteína, en donde los pasos (a) - (e) se llevan a cabo en un recipiente de cultivo individual. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente quelatador es EDTA. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la tripsina se usa en el paso (d) a una concentración de alrededor de 0.05% a aproximadamente 0.1 % durante 5 a 10 minutos. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque un virus capaz de infectar a las células se añade durante el paso (d). 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el virus se añade cuando las células de vuelven substancialmente confluentes sobre los microvehículos. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el virus comprende un vector adenoviral. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el virus es ACN53. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células son células 293. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque las células se incuban durante 3 a 4 días. 11.- Un método para la separación de células de microvehículos sobre los cuales han sido cultivadas, pero a partir de los cuales han sido separadas, caracterizado porque comprende introducir una suspensión acuosa de células y microvehículos a través de una entrada en un dispositivo de separación, el dispositivo comprendiendo: (a) una entrada; (b) una columna; (c) una salida para recoger las células y la solución acuosa; y (d) un tamiz malla; en donde los microvehículos son retenidos en suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación, y son retenidos en dicho dispositivo mediante un tamiz malla, y en donde las células y la solución acuosa son recogidas a través de la salida. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la suspensión acuosa de células y microvehículos comprende además virus propagados en las células. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque las células son células 293. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el virus es un adenovirus. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la velocidad de flujo en el dispositivo de separación es de alrededor de 1 a aproximadamente 3 cm por minuto. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque las células y el medio acuoso recogidos se someten a microfiltración. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la microfiltración comprende una velocidad de esfuerzo cortante de aproximadamente 2000 - 10,000 l/seg. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el flujo ascendente se genera bombeando la solución acuosa a través de la entrada, en donde la entrada está situada en el fondo del dispositivo, y la salida está situada en la parte superior del mismo. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la columna comprende una sección superior y una sección inferior, la sección inferior comprendiendo aproximadamente 20 a 50% del volumen de la columna, y conteniendo la entrada. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la sección inferior es cónica. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el ángulo de la sección inferior es de alrededor de 15 a aproximadamente 45 grados. 22.- Un método para la liberación de un constituyente celular a partir de células cultivadas en un medio acuoso, caracterizado porque comprende someter mecánicamente a esfuerzo cortante las células exponiendo las mismas a una velocidad de esfuerzo cortante, en donde la velocidad de esfuerzo cortante para someter mecánicamente a las células a esfuerzo cortante se genera recogiendo las células en un microfiltro, y recirculando rápidamente el medio acuoso a través del mismo. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la velocidad de esfuerzo cortante es de aproximadamente 2000 - 10,000 l/seg. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque los restos de células se recogen mediante el microfiltro, y los constituyentes celulares deseados se hacen pasar a través del mismo. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el constituyente celular es un virus. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el virus en un adenovirus. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el adenovirus posee un gen heterólogo. 28.- Un sistema para separar células de microvehículos sobre los cuales las células han sido cultivadas, el sistema comprendiendo: (a) un biorreactor en el cual las células fueron cultivadas sobre los microvehículos; (b) una trayectoria de flujo desde el biorreactor hasta un dispositivo de separación; (c) un dispositivo de separación, que comprende: (i) una entrada; (ii) una columna; (iií) una salida para recoger las células y la solución acuosa; y (iv) un tamiz malla; en donde los microvehículos son retenidos en suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación, y son retenidos en dicho dispositivo mediante un tamiz malla, y en donde las células y la solución acuosa son recogidas a través de la salida; y (d) una bomba, en donde la bomba dirige el flujo de la solución acuosa desde el biorreactor hasta la salida. 29.- El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque comprende un microfiltro, en donde las células y la solución acuosa del paso (c) se someten a microfiltración. 30.- El sistema de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende un ultrafiltro, en donde el producto de la reivindicación 46 se somete a ultrafiltración. 31.- El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque las células son células 293. 32.- El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el flujo ascendente comprende bombear la solución acuosa a través de la entrada, en donde la entrada está situada en el fondo del dispositivo, y la salida está situada en la parte superior del mismo. 33.- El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la columna comprende una sección superior y una sección inferior, la sección inferior comprendiendo 20 a 50% del volumen de la columna y conteniendo la entrada. 34.- El sistema de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la sección inferior es cónica. 35.- El sistema de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el ángulo de la sección inferior es de alrededor de 15 a aproximadamente 45 grados. 36.- Un método para producir un virus recombinante para terapia de genes, el método comprendiendo: (a) cultivar las células sobre un primer lote de microvehículos hasta que las células sean substancialmente confluentes; (b) transferir las células de los microvehículos separándolas de los mismos mediante la adición de tripsina sin remover los microvehículos de la suspensión, y añadir un segundo lote de microvehículos; (c) infectar las células con un virus recombinante; (d) separar las células del paso (c) de los microvehículos sobre los cuales han sido cultivadas pero de los cuales han sido separadas, comprendiendo introducir una suspensión acuosa de células y microvehículos a través de una entrada en un dispositivo de separación, el dispositivo comprendiendo: (i) una entrada; (¡i) una columna; (iii) una salida para recoger las células y la solución acuosa; y (iv) un tamiz malla; en donde los microvehículos son retenidos en suspensión mediante un flujo ascendente en el dispositivo de separación, y son retenidos en dicho dispositivo mediante un tamiz malla, y en donde las células y la solución acuosa son recogidas a través de la salida; y (e) liberar el virus de las células recogidas del paso (d), el cual comprende someter mecánicamente a esfuerzo cortante las células exponiendo las mismas a una velocidad de esfuerzo cortante, en donde la velocidad de esfuerzo cortante para someter mecánicamente a las células a esfuerzo cortante se genera recogiendo las células en un microfiltro, y recirculando rápidamente el medio acuoso a través del mismo. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el virus comprende un vector adenoviral. 38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el virus es ACN53. 39.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque las células son células 293.