MXPA99007161A

MXPA99007161A - Proteina amiloide beta, montaje globular y usos de la misma

Info

Publication number: MXPA99007161A
Application number: MXPA/A/1999/007161A
Authority: MX
Inventors: A Krafft Grant; P Lambert Mary; E Finch Caleb; Morgan Todd; Wals Pat; Rozovsky Irina; Barlow Ann; L Klein William; A Chromy Brett
Original assignee: Northwestern University; University Of Southern California
Priority date: 1997-02-05
Filing date: 1999-08-03
Publication date: 2001-05-17

Abstract

La presente invención se refiere a ligandos de demencia derivados de amiloide beta (ADDL) que comprenden proteína amiloide beta ensamblada en estructuras oligoméricas no fibrilares, globulares, capaces de activar procesos celulares específicos. La invención también proporciona métodos para realizar ensayos de la formación, presencia, unión de proteína receptora y actividad celular de los ADDL, asícomo compuestos que bloquean la formación o actividad de ADDL, y métodos para identificar tales compuestos. La invención proporciona además métodos para utilizar ADDL y modular la formación y/o actividad de ADDL, por ejemplo en el tratamiento de trastornos de aprendizaje y/o memoria.

Description

PROTEÍNA AMILOIDE BETA, MONTAJE GLOBULAR Y USOS DE LA MISMA CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece a una nueva composición de materia, ligandos de demencia derivados de amiloide beta (ADDL) . Los ADDL comprenden al péptido amiloide beta ensamblado en estructuras oligoméricas no fibrilares globulares, solubles, que son capaces de activar procesos celulares específicos. La invención también proporciona métodos para realizar ensayos respecto a la formación, presencia, unión de proteína receptora y actividades celulares de los ADDL. También se describen compuestos que bloquean la formación o actividad de los ADDL, y métodos para identificar tales compuestos. La formación y actividad de ADDL es relevante, por ejemplo, en el aprendizaje y la memoria. La modulación de la actividad de formación ADDL de esta manera se puede utilizar de acuerdo con la invención en el tratamiento de trastornos de aprendizaje y memoria, así como en otras enfermedades, trastornos o condiciones que se deben a efectos de los ADDL.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa progresiva caracterizada por distintas REF.: 30992 patologías, que incluyen enredos neurofibrilares, placas neuríticas, atrofia neuronal, podado dendrítico y muerte neuronal. Desde una perspectiva histórica, el diagnóstico definitivo de la enfermedad de Alzheimer siempre se ha basado en la identificación de marcas patológicas específicas, específicamente los grupos neurofibrilares los cuales representan el citoesqueleto colapsado de neuronas muertas y agonizantes, y placas neuríticas, las cuales son depósitos extracelulares de diversas proteínas, lípidos, carbohidratos y compuestos de sales, el componente proteínico primario del cual es un residuo peptídico de 39-43 conocido como amiloide beta. Sin embargo, desde el punto de vista de impacto de la enfermedad, los síntomas manifiestos en la enfermedad de Alzheimer, específicamente la pérdida de memoria, la erosión de las funciones cognoscitivas y los cambios significativos en la personalidad y comportamiento, los que son más importantes. Debajo de estos cambios sintomáticos están mecanismos celulares específicos que causan que las células nerviosas funcionen mal y que finalmente degeneren y mueran. Estos mecanismos celulares indudablemente operan dentro de un ambiente de fondo que proporciona de manera variable cierto nivel de protección, o ejerce efectos contributivos y exacerbantes. El resultado es una curva de distribución de edad/incidencia muy amplia, son algunas claves a partir de estudios de población que indican causas específicas. La genética molecular representa el fondo del estudio en donde surge una imagen clara de la enfermedad de Alzheimer familiar. Como se describe con mayor detalle en lo siguiente, ahora es claro a partir de estudios que identificai mutaciones en tres proteínas diferentes, APP y las presenilinas 1 y 2, que la v?a común final que lleva a la enfermedad de Alzheimer es la producción aumentada de amiloide ß 1-42 (así como amiloide ß 1-43) , lo cual se produce en todas estas mutaciones AD familiares diferentes. Esto es particularmente notorio, debido a que los ADDL, el foco central de la invención descrita en la presente, únicamente forman entidades estables a partir de su forma más larga de amiloide, y no de la forma más prevalente, la forma corta Aß 1-40.

Amiloide ß en enfermedad de Alzheimer. En 1984, Glenner y Wong tuvieron éxito en aislar e identificar el amiloide cerebrovascular asociado con la enfermedad de Alzheimer (Glenner et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . , 120, 885-890, 1984a). Posteriormente, se identificaron los mismos péptidos residuales 39-43 ahora conocidos como amiloide ß, como el componente principal de las placas neuríticas de la enfermedad de Alzheimer (Glenner et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . , 122, 1131-1135 1984b; asters et al., EMBO J. , 4, 2757-2764, 1985a; Masters et al., Proc. Na ti . Acad. Sci . , 82, 4245-4249, 1985b) . Esta fue por primera vez una molécula discreta que ha sido relacionada con la enfermedad de Alzheimer, una enfermedad la cual hasta este punto había sido caracterizada únicamente por descripciones neuroanatómicas y neuropatológicas . También se identificó amiloide ß como el componente de placa en cerebros de individuos con síndrome de Down (Glenner et al., Biochem. Biophys . Res . Commun . , 122, 1131-1135, 1984b; Masters et al., EMBO J. , 4, 2757-2764, 1985a; Masters et al., Proc . Nati . Acad. Sci . , 82, 4245-4249, 1985b) lo que lleva a la sugerencia de que posiblemente exista un gen que codifica en el cromosoma 21. En 1987, numerosos grupos han utilizado la información de la secuencia de amiloide ß y las técnicas de genética molecular para validar esta sugerencia, identificando al gen para la proteína precursora amiloide (APP) (Kang et al., Na ture, 325, 733, 1987; Tanzi et al., Science, 235, 880-884, 1987) . El gen APP es un gen de exón múltiple, grande, que está dividido diferencialmente en numerosos APP (revisado en Selkoe, In, Annual Review of Neuroscience, Cowan (Ed) , 17, ix + 623 p, 489-517, 1994) . Las proteínas son proteínas transmembranales grandes, que ahora se sabe son procesadas de diversas maneras, una o más de las cuales pueden generar amiloide ß. Los primeros estudios de procesamiento de APP han sugerido que la formación de amiloide ß no es un proceso normal (Esch et al., Science, 248, 1122-1124 1990; Sisodia et al., Science, 248, 492-495, 1990) , aunque estudios subsecuentes en células cultivadas y análisis de suero y líquidos cefalorraquídeo han mostrado que la formación de amiloide ß se produce como un proceso normal en muchos tipos de células, aunque su formación puede no representar una vía general predominante . Los estudios genéticos fundamentales de ADN a partir de individuos afligidos con el inicio temprano de enfermedad de Alzheimer familiar muestran que las mutaciones en un solo gen, el mismo gen APP, son causantes de esta forma muy grave de la enfermedad. De manera interesante, se han encontrado diversas mutaciones diferentes en el gen APP que incluyen tres sustituciones de residuos únicos diferentes en Val 717, cuatro residuos hacia el extremo 3 ' de la parte C terminal de amiloide ß 1-42 (Goate et al., Nature, 349, 704-6, 1991; Chartier-Harlan et al., Nature, 353, 844-6 1991; Murrell et al., Science, 254, 97-9, 1991) , y dos mutaciones de residuos (670-671) inmediatamente hacia el extremo 5 ' de la parte N terminal de amiloide ß, asociados con el inicio temprano de la enfermedad de Alzheimer familiar, en una familia Sueca (Mullan et al., Nature Genetics, 1, 345-347, 1992) . Cuando un vector que codifica para el ADNc del gen mutante APP Sueco se transfecta en lineas de células para evaluar el procesamiento de APP, se ha encontrado que se forman seis a ocho veces más amiloide ß, cuando se comparan con las concentraciones de APP de tipo silvestre (Citrón et al., Nature, 360, 672-674, 1992; Cai et al., Sciences 259, 514-516, 1993) . También se ha demostrado que los extractos de tejido de cerebro que combinen actividades de proteasa de cerebro humana nativa son capaces de procesax el sustrato octapeptídico fluorogénico que abarca a la mutación Sueca a una velocidad 100 veces mayor que el sustrato correspondiente basado en la secuencia del tipo silvestre (Ladror et al., J. Biol . Chem . , 269, 18422-8, 1994) . Estos resultados sugieren que el mecanismo por medio del cual la mutación Sueca provoca el acceso temprano de la enfermedad de Alzheimer familiar involucra sobreproducción sustancial de amiloide ß. También se han llevado a cabo estudios similares respecto a la formación de amiloide en células transfectadas con el mutante 717 de APP, pero las concentraciones de amiloide ß producidas no son diferentes de las concentraciones producidas por APP de tipo silvestre. Esto es llevado a especulaciones mecanísticas de que existe otra producción patógena de amiloide ß para estas mutaciones. Una evaluación más cercana del procesamiento del mutante APP 717 y el mutante Sueco APP por Younkin y colaboradores (Susuki et al., Science, 264, 1336-1340, 1994) proporciona una imagen unificada de estos casos de enfermedad de Alzheimer genéticos. En este estudio, se evaluaron no solo las concentraciones totales de producción de amiloide ß, sino también las longitudes específicas de los péptidos de amiloide ß producidos. Los resultados confirman que la mutación 717 lleva a un exceso de duplicación de la proporción de amiloide ß 1-42 respecto a amiloide ß 1-40 (un péptido altamente soluble bajo condiciones fisiológicas) , aunque no cambien las concentraciones totales de amiloide ß . Las mutaciones de la enfermedad de Alzheimer familiares de presenilina 1 y 2 recién descubiertas en los genes que residen en el cromosoma 14 (Sherrington et al., Na ture, 375, 754-758, 1995) y en el cromosoma 1 (Levy-Lahad, et al., Science, 269, 970-973, 1995) , respectivamente, también se han relacionado con una sobreproducción significativa de amiloide ß 1-42 (Mann et al., Annals of Neurology, 40, 149-56, 1996; Schuener et al., Na ture Medi cine 2 , 864-70, 1996) . Basados en estos hallazgos, parece que el proceso patógeno mediado por estas mutaciones de enfermedad de Alzheimer familiares distintas y diferentes es la producción de niveles más elevados de amiloide ß 1-42. Esta es la forma de amiloide que se agrega más fácilmente (Snyder et al., Biophys . J. , 67, 1216-28, 1994), que inicia la agregación de amiloide ß para formar placas neuríticas (Roher et al., Neurochem . , 61, 1916-1926, 1993; Tamaoka et al., Biochem . Biophs . Res . Commun . , 205, 834-842, 1994), y, como se describe en la presente, forma la cual inesperadamente forma montajes de orden superior estables denominados "ADDL".

Componentes de placa no amiloideos en la enfermedad de Alzheimer. Amiloide ß es el componente proteínico principal de las placas, constituyendo más de 70% de la proteína total. También está presente, sin embargo, una variedad de otra proteína, que incluye antiquimotripsina al (ACT) , proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG) , apolipoproteínas E y J, butirilcolinesterasa (BChE) , S-100B y varios otros componentes de complemento. Aunque no se ha establecido la importancia de estos componentes en el inicio y progreso de la enfermedad de Alzheimer, se ha establecido la relación de las isoformas de apo E en la enfermedad, por medio de estudios genéticos de Roses y colegas (Strittmatter et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 1990, 1977-81, 1993) , quienes descubrieron que un polimorfismo en el gen de polipoproteína E, específicamente apo E4, se correlaciona con el inicio temprano de la enfermedad de Alzheimer en un gran conjunto de casos de enfermedad de Alzheimer familiar con inicio tardío. Estudios subsecuentes han confirmado que los grupos de individuos con apo E4 tienen un riesgo significativamente más elevado de enfermedad de Alzheimer y de inicio de enfermedad de Alzheimer que de alguna manera es paralelo a la dosificación del gen. para apo E4. A nivel mecanístico, los estudios han mostrado que apo E4 se une con menor afinidad a amiloide ß en comparación con apo E3 o apo E2, isoformas las cuales están asociadas con el inicio tardío de la enfermedad de Alzheimer. Se ha sugerido que estas isoformas pueden ejercer un efecto protector por medio de una eliminación más efectiva de los depósitos de amiloide ß 1-42 (Ladu et al., J. Biol . Chem. , 269, 23403-23406, 1994; Ladu et al., s. Biol . Chem. , 270, 9039-42, 1995). No está claro el papel de los otros componentes de la placa, aunque estudios recientes (Oda et al., Exp ti .

Neurology, 136, 22-31, 1995) han demostrado que apo J (clusterina) puede mejorar significativamente la citotoxicidad de amiloide ß 1-42 agregado in vi tro. También se ha reportado que HSPG mejora la toxicidad de amiloide ß 1-40 cuando se inyecta en cerebro de rata (Snow et al., Soc . Neurosci , Abstr. , 18, 1465, 1992). Wright et al. (Ann Neurol . , 34, 373-384, 1993) demostraron que las placas de amiloide de cerebro con enfermedad de Alzheimer contienen concentraciones significativas de BChE, mientras que las placas de amiloide de individuos ancianos no dementes no lo presentan. La proteína inflamatoria en fase aguda ACT también es regulada de manera ascendente en el cerebro en enfermedad de Alzheimer, y se sabe que se asocia con los _16 residuos N terminales de amiloide ß . Ma et al., (Ma et al., Na ture, 372, 92-94, 1994) han reportado que ACT puede mejorar la agregación de amiloide ß 1-42, y estos autores especulan que la agregación aumentada contribuye a su neurotoxicidad.

Respuestas celulares de amiloide ß y patología in vivo . Más allá de las placas y los enredos que son las marcas distintivas de la enfermedad de Alzheimer, es claro que se han inducido una gama de respuestas celulares, tanto en las neuronas como en las células de glia acompañantes. A nivel bioquímico, es evidente la hiperfosforilación de la proteína tau lo que resulta en la perturbación del equilibrio de cinasa/fosfatasa . A nivel transcripcional, se activan una variedad de genes para producir un espectro de proteínas normalmente no presentes o únicamente presentes a concentraciones menores en el cerebro . También existe evidencia significativa de que se han activado procesos inflamatorios. En particular, se ha documentado la fosforilación tau la cual se introduce por amiloide ß 1-42 agregada en diferentes células SH-SY5Y diferenciadas (Lambert et al., J". Neurosci. Res . 39, 377-384, 1994), y estos resultados se han confirmado en un reporte más reciente de Busciglio et al. (Neuron, 14, 879-88, 1995) , en el cual la fosforilación tau activada por amiloide ß en neuronas de hipocampo de rata en cultivo primario.

Amiloide ß fibrilar y neurodeaeneración en enfermedad de Alzheimer. El mecanismo por el cual amiloide ß 1-42 provoca la enfermedad de Alzheimer no ha sido dilucidado, pero la literatura contiene más de 200 estudios de la neurotoxicidad de amiloide ß, muchos de los cuales han sido revisados recientemente (por ejemplo, Yankner et al., Neuron, 16, 921-32, 1996; Iversen et al., Biochmical Journal , 311, 1-16, 1995) . El concepto que prevalece es que con el fin de que amiloide ß sea tóxico, debe ensamblarse en estructuras fibrilares (Pike et al., ". Neurosci . , 13, 1676-87, 1993) . Las soluciones que únicamente contienen amiloide ß monomérico repetidamente han demostrado que no tienen efecto dañino sobre las neuronas de cultivo. Además, los estudios se han correlacionado con la formación de hojas de amiloide ß que contienen fibrilla y el tiempo y extensión de toxicidad utilizando técnicas tales como dicroismo circular y microscopía electrónica (Simmons et al., Molecular Pharmacology , 45, 373-9, 1994) . Un estudio concluye explícitamente que debe existir amiloide ß en forma fibrilar con el fin de que sea tóxico (Lorenzo et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 91, 12243-12247, 1994) . Pese a este consenso respecto a la estructura y actividad de amiloide ß, continúa siendo un_ problema la capacidad de reproducción de trabajos experimentales publicados que involucren toxicidad de amiloide (Brining, Neurobiology of Agin, 18, 581-589, 1997) , y la disponibilidad ampliamente difundida de actividad obtenida con lotes diferentes de amiloide, incluso del mismo lote de amiloide manejado de maneras ligeramente diferentes, pese a la composición química idéntica (May et al., Neurobiology of Aging, 13, 1676-87, 1993) . Esto ha hecho surgir dudas respecto a las estructuras precisas de amiloide ß que son responsables de su actividad. La presente invención busca resolver los problemas de la técnica anterior. En consecuencia, un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición nueva de materia, péptido amiloide ß ensamblado en estructuras oligoméricas no fibrilares, globulares y solubles (ADDL) que inesperadamente son neurotóxicas . Estos y otros objetivos y ventajas de la presente invención, así como características inventivas adicionales, serán evidentes a partir de la siguiente descripción.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS - La figura 1 es una imagen generada en computadora de un gel de poliacrilamida teñido con plata, explorado con densitómetro, el cual muestra el corrimiento electroforético de ADDL con una banda primaria que corresponde a aproximadamente 30 kD, una banda menos abundante que corresponde a aproximadamente 17 kD, y sin evidencia de fibrillas o agregados. La figura 2 es una imagen generada en computadora de un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomassie, explorado con densitómetro el cual muestra el corriente electroforético de ADDL con una banda primaria (doblete superior) que corresponde a un tamaño de aproximadamente 17 a aproximadamente 22 kD, y con otra banda (banda oscura inferior) que indica monómero 4 kD abundante presente, probablemente un producto de descomposición. Carriles : primero, marcadores de tamaño molecular; segundo, preparación de ADDL, tercero carga más pesada de preparación de ADDL. La figura 3 es una imagen generada en computadora representativa de un análisis ADM de ADDL que contiene "fracción 3" (fraccionado en una columna de filtración de gel Superdex 75) . La figura 4 es una imagen generada en computadora de un gel de gradiente de SDS-poliacrilamida teñido con Coomassie, explorado con densitómetro de ADDL preparado con coincubación con clusterina (carril A) , o medio D12 frío (carril B) , y de los ADDL preparados por coincubación con clusterina y el cual paso a través de una membrana de corte de 10 kD Centricon (carril C) o que se retuvo por una membrana de corte de 10 kD Centricon (carril d) : MW, marcadores de peso molecular. La figura 5 es una gráfica de la concentración de ADDL medida como concentración de amiloide ß 1-42 (nM) versus % de células muertas para cortes de cerebro de ratones tratados con las preparaciones de ADDL. La figura 6 es un diagrama de barras que muestra el % de reducción de MTT para células PC12 control no expuestas a ADDL ("Cont") , células PC 12 expuesta únicamente a clusterina ("Apo J"), células PC 12 expuestas a Aß monomérico ("Aß"), células PC 12 expuestas a amiloide ß coagregado con clusterina y envejecido un día ("Aß.Apo J") . La figura 7 es una exploración FACS que muestra la intensidad de fluorescencia (0-170) versus eventos (0-300) de células B103 no expuestas a ADDL (pico no sombreado) y de células B103 unidas a ADDL etiquetados fluorescentes (pico sombreado) . La figura 8 es una exploración FACS que muestra intensidad de fluorescencia (0-200) versus vénetos (0-300) para células del hipocampo no expuestas a ADDL (pico no sombreado, "-ADDLs") y células del hipocampo unidas a los ADDL etiquetados fluorescentes (pico sombreado, "+ADDLs"). La figura 9 es un diagrama de barras del por ciento máximo de ADDL unido o de ADDL que induce muerte para células B103 que no han sido expuestas ("-") o coexpuestas (" + ") a péptidos liberados por tripsinización de células B103. La figura 10 es una gráfica de la concentración relativa de ADDL versus % de células muertas para cortes de cerebro de ratones tratados con las preparaciones de ADDL. Para determinar la concentración relativa, se utiliza una concentración inicial de proteína Aß 10 µM para las formas de ADDL con el punto de datos más elevado (punto "16") , esto posteriormente se diluye 1/2 (punto "8"), 1/4 (punto "4"). y similares.

La figura 11 es un diagrama de barras que muestra la densidad óptica que se obtiene en el ensayo de ELISA que une ADDL en donde se coincuban células B103 con ADDL y anticuerpo 6E10 (barra de "células, ADDL, 6E10"), células B103 coincubadas con ADDL y (barra de "células ADDL"), células B103 coincubadas con anticuerpo 6E10 (barra de "células 6E10"), las células B103 se incubaron solas (barra de "células"), el anticuerpo 6E10 se incuba solo (barra de "6E10"), o la densidad óptica del diluyente se lee (barra "blanco" . La figura 12 es un diagrama de barras del % de células muertas ya sea en fyn +/+ (tipo silvestre, barras con diagonales/transversales "Fyn+") o fyn -/- (carentes del gen, "Fyn-"; barras sólidas) de ratones, ya sea no tratados ("medio") o que ha tenido contacto con los ADDL ("ADDLs") . La figura 13 es una gráfica de la concentración Aß (µM) versus glia activada (número) obtenido ante la incubación de astrocitos con ADDL (triángulos negros) o Aß 17-42 (cuadros negros) . La figura 14 es una gráfica de tiempo (minutos) versüs % de amplitud pico de cuerpo de célula de línea de base para ratones control no tratados con ADDL (triángulos negros) o ratones tratados con ADDL (cuadros negros) . La figura 15 es una gráfica del tiempo (minutos) versus la amplitud de pico media para los cortes de hipocampo de rata control no expuestos a ADDL (triángulos negros) versus, cortes de hipocampo de rata expuestos a ADDL (cuadros negros) .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La invención abarca una nueva composición de material denominada ligandos de demencia derivados de amiloide ß o ligandos difusibles derivados de amiloide ß (ADDL) . Los ADDL consisten de péptido amiloide ß ensamblado en estructuras oligoméricas no fibrilares solubles que son capaces de activar procesos similares específicos. Otro aspecto de la invención consiste de métodos para ensayar la formación, presencia, unión a proteínas receptoras y actividades celulares de los ADDL. La invención abarca además métodos de ensayo y métodos para identificar compuestos que modulan (por ejemplo incrementan o disminuyen) la formación y/o actividad de los ADDL. Tales compuestos se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones debidos a efectos de los ADDL.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto que las muestras neurotóxicas de amiloide ß no solo existen como estructuras fibrilares, sino también, inesperadamente, existen algunas estructuras de proteína globular pequeñas que parecen ser las responsables de la neurotoxicidad. Utilizando métodos novedosos, se han generado y descrito en la presente muestras que contienen predominantemente estos ensamblados de proteína globular soluble sin estructuras fibrilares. En muestras heterogéneas preparados por diversos métodos, la remoción de formas fibrilares más grandes de amiloide ß por centrifugación no elimina estos montajes globulares solubles de amiloide ß en las fracciones de sobrenadante . Estas fracciones de sobrenadante muestran neurotoxicidad significativamente superior en comparación con las muestras de amiloide ß no fraccionada agregadas bajo condiciones en literatura. Estas formas globulares solubles neurotóxicas novedosas e inesperadas se denominan en la presente como "ligandos de demencia derivados de arniloide ß o ligandos difusibles derivados de amiloide ß (ADDL) . Se han "envejecido" muestras de amiloide ß bajo condiciones de literatura estándar (por ejemplo Pike et al., ". Neurosci . , 13, 1676-1687, 1993) durante más de tres semanas y pierden su neurotoxicidad, incluso aunque las muestras contengan predominantemente estructuras fibrilares con pocos o nada de ADDL. Este descubrimiento de que los ADDL _globulares son neurotóxicos es particularmente sorprendente puesto que el pensamiento actual afirma que las estructuras fibrilares son las que constituyen la forma tóxica de amiloide ß. (Lorenzo et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 91 , 122243-12247, 1994; Howlett et al., Neurodegen, 4, 23-32, 1995) . Los ADDL se pueden formar in vi tro . Cuando se diluye una solución (por ejemplo una solución de DMSO) que contiene amiloide ß 1-42 monomérico (u otro amiloide ß apropiado, como se describe adicionalmente en la presente) en medio de cultivo de tejido frío (por ejemplo medio de cultivo de células F12) y después se permite que se incube a aproximadamente 4°C desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48 horas y se centrifuga durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 14,000 g a una temperatura de 4°C, la fracción de sobrenadante contiene glóbulos oligoméricos solubles, pequeños que son altamente neurotóxicos, por ejemplo, en células neuronales y en cultivos de corte de cerebro. Los ADDL también se pueden formar por coincubación de amiloide ß con ciertos agentes apropiados, por ejemplo clusterina (una proteína de placa senil que también se conoce como apo J) . El análisis por microscopía de fuerza atómica (AFM) de tal fracción de sobrenadante demuestra números glóbulos de tamaños diferentes presentes en la fracción. Estos glóbulos se encuentran dentro del intervalo desde aproximadamente 4.7 nm a aproximadamente 6.2 nm. Pueden ser especies distintas de glóbulos que se encuentran dentro de esta intervalo. Específicamente, una ligera variación en la superficie de altura resulta en la manera en como se sedimentan estas especies particulares en la superficie de mica en el momento del análisis. Sin embargo, pese a esta ligera variación, parece haber dos tamaños predominantes de glóbulos, es decir, desde aproximadamente 4.9 nm hasta aproximadamente 5.4 nm, y desde aproximadamente 5.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm, que constituyen aproximadamente 50% de las estructuras oligoméricas en una muestra típica. También puede haber especies de tamaño diferentes de glóbulos que tengan dimensiones desde aproximadamente 5.3 nm hasta aproximadamente 5.7 nm. Parece que los glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 4.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm en AFM comprenden la forma pentamérica y hexamérica de la proteína amiloide ß oligomérica. El tamaño AFM de los glóbulos es desde aproximadamente 4.2 nm hasta aproximadamente 4.7 nm y parecen corresponder al tetrámero Aß . Los " glóbulos de tamaño desde aproximadamente 3.4 nm hasta aproximadamente 4.0 nm parecen corresponder al trímero. Los glóbulos de tamaño desde aproximadamente 2.8 nm hasta aproximadamente 3.4 nm corresponden al dímero (Robert et al., J. Biol . Chem . , 271, 20631-20635, 1996) . El tamaño del monómero Aß AFM varía desde aproximadamente 0.8 nm hasta aproximadamente 1.8-2.0 nm. El amiloide ß monomérico y dimérico no es neuxotóxico en cultivos de células neuronales o en cultivos de cortes de cerebro organotípicos . Por lo tanto, la presente invención proporciona un montaje de proteína amiloide ß no fibrilar, soluble y aislado (es decir, ADDL) , que preferiblemente comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 12 proteínas amiloide ß , y el cual de manera deseable comprende por lo menos desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6 proteínas amiloide ß. En particular, la invención proporciona un montaje de proteína amiloide ß aislado en donde el montaje preferiblemente comprende una forma oligomérica que se selecciona del grupo que consiste de trímero, tetrámero, pentámero y hexámero. El montaje de proteína de manera óptima muestra actividad neurotóxica. La estructura de orden superior de la proteína amiloide ß se puede formar no solo a partir de amiloide ß 1-42, sino también a partir de cualquier proteína amiloide ß capaz de formar de manera estable el montaje de proteína amiloide ß no fibrilar soluble. En particular, se puede utilizar amiloide ß 1-43. Amiloide ß 1-42 con biocitina en la posición 1 también se puede utilizar. También se puede utilizar amiloide ß (por ejemplo ß 1-42 o ß 1-43) con una cisteína en la parte N terminal. De manera similar, se pueden utilizar Aß truncado en la parte amino terminal (por ejemplo particularmente en donde se han perdido uno o más grupos hasta la totalidad de la secuencia de residuos de aminoácidos 1 a 8 de-Aß 1-42 o Aß 1-43) , o Aß (por ejemplo Aß 1-42 o 1-43) que tienen uno o dos residuos aminoácidos adicionales en la parte carboxilo terminal. En contraste, amiloide ß 1-40 puede formar transitoriamente estructuras similares a ADDL las cuales no pueden ser tóxicas, pero estas estructuras no son estables y no se pueden aislar en soluciones acuosas, debido principalmente a la naturaleza acortada de la proteína, la cual limita su capacidad para formar montajes de orden superior de una manera estable . De manera deseable, el montaje de proteína amiloide ß aislado de acuerdo con la invención comprende glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 4.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm medidos por microscopía de fuerza atómica. Además, de manera preferible el montaje de proteína amiloide ß aislado comprenden glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 4.9 nm hasta aproximadamente 5.4 nm, o desde aproximadamente 5.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm, medidos por microscopía de fuerza atómica. En particular, preferiblemente el montaje de proteína amiloide ß aislado de acuerdo con la invención es tal en el que desde aproximadamente 30% hasta aproximadamente 85%, incluso de manera más preferible desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 75% del montaje comprenden dos tamaños predominantes de glóbulos, específicamente, de dimensiones desde aproximadamente 4.9 nm hasta aproximadamente 5.4 nm, y desde aproximadamente 5.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm, medidos por microscopía de fuerza atómica. Sin embargo, también es deseable que el montaje de proteína comprenda glóbulos de tamaño AFM de aproximadamente 5.3 a aproximadamente 5.7 nm.

Por medio de electroforesis en gel no desnaturalizante, las bandas que corresponden a los ADDL que corren desde aproximadamente 26 kD hasta aproximadamente 28 kD. Bajo condiciones desnaturalizantes (por ejemplo, en un gel de SDS-poliacrilamida 15%) , los ADDL comprenden una banda que corre desde aproximadamente 22 kD hasta aproximadamente 24 kD, y pueden comprender además una banda que corre a aproximadamente 18 a aproximadamente 19 kD. En consecuencia, la invención preferiblemente proporciona un montaje de proteína amiloide ß aislado (es decir ADDL) que tiene un peso molecular desde aproximadamente 26 kD hasta aproximadamente 28 kD, determinado por electroforesis en gel no desnaturalizante. Preferiblemente, la invención proporciona también un montaje de p oteína amiloide ß aislado (es decir, ADDL) que corre como una banda que corresponde a un peso molecular desde aproximadamente 22 kD hasta aproximadamente 24 kD, o desde aproximadamente 18 hasta aproximadamente 19 kD, determinado por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida 15%. La invención proporciona además un método para preparar el montaje de proteína amiloide ß no fibrilar soluble aislado. Este método comprende opcionalmente las etapas de: (a) obtener una solución de proteína amiloide ß monomérica; (b) diluir la solución de proteína en un medio apropiado; (c) incubar el medio que resulta de la etapa (b) a aproximadamente 4°C; (d) centrifugar el medio a aproximadamente 14,000 g, a aproximadamente 4°C; y (e) recuperar el sobrenadante que resulta de la centrifugación como el que contiene el montaje de proteína amiloide ß. En la etapa (c) de este método, la solución de manera deseable se incuba desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 48 horas, especialmente desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 48 horas, y de manera más preferible desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 48 horas. En la etapa (d) de este método, la centrifugación preferiblemente se lleva a cabo desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 1 hora, especialmente desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 30 minutos, y de manera óptima durante aproximadamente 10 minutos. Sin embargo, generalmente esta es solo una medida precautoria para remover cualquier estructura fibrilar o protofibrilar naciente y puede no ser necesaria, particularmente cuando no es una preocupación la estabilidad a largo plazo de la preparación de ADDL. La proteína Aß se diluye en la etapa (b) deseablemente hasta una concentración final que varía desde aproximadamente 5 nM hasta aproximadamente 500 µM, de manera particular desde aproximadamente 5 µM hasta aproximadamente 300 µM, de manera especial a aproximadamente 100 µM. El "medio apropiado" en el cual se diluye la solución de proteína Aß en la etapa (b) preferiblemente es cualquier medio que, soportará, en caso de que no facilite, la formación de ADDL. En particular, se prefiere el medio T12 (el cual está disponible comercialmente también y el cual también se puede formular fácilmente en el laboratorio) para uso en este método de la invención. Similarmente, también se puede utilizar de manera deseable un "medio F12 sustituto" . El medio F12 sustituto difiere del medio F12 que está disponible comercialmente o el cual se puede formular en el laboratorio. De acuerdo con la invención, el medio F12 sustituto comprende preferiblemente los siguientes componentes: N,N-dimetilglicina, D-glucosa, cloruro de calcio, sulfato de cobre pentahidratado, sulfato de hierro (II) heptahidratado, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, fosfato ácido disódico y sulfato de zinc heptahidratado. En particular, el medio F12 sintético de acuerdo con la invención comprende opcionalmente: N,N-dimetilglicina (desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 850 mg/l) , D-glucosa (desde aproximadamente 1.0 hasta aproximadamente 3.0 g/l), cloruro de calcio (desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 mg/l") , sulfato de cobre pentahidratado (desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 40 mg/l) , sulfato de hierro (II) heptahidratado (desde aproximadamente 0.4 hasta aproximadamente 1.2 mg/l), cloruro de potasio (desde aproximadamente 160 hasta aproximadamente 280 mg/l) , cloruro de magnesio (desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 75 mg/l), cloruro de sodio (desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 9.0 g/l), bicarbonato de sodio (desde aproximadamente 0.75 hasta aproximadamente 1.4 g/l), fosfato ácido disódico (desde aproximadamente 120 hasta aproximadamente 160 mg/l) , y sulfato de zinc heptahidratado (desde aproximadamente 0.7 hasta aproximadamente 1.1 mg/l) . De manera óptima, el medio F12 sintético de acuerdo con la invención comprende: N, N-dimetilglicina (aproximadamente 766 mg/l), D-glucosa (aproximadamente 1.802 g/l), cloruro de calcio (aproximadamente 33 mg/l) , sulfato de cobre pentahidratado (aproximadamente 25 mg/l) , sulfato de hierro (II) heptahidratado (aproximadamente 0.8 mg/l), cloruro de potasio (aproximadamente 223 mg/l) , cloruro de magnesio (aproximadamente 57 mg/l) , cloruro de sodio (aproximadamente 7.6 g/l), bicarbonato de sodio (aproximadamente 1.18 g/l), fosfato ácido disódico (aproximadamente 142 mg/l) y sulfato de zinc heptahidratado (aproximadamente 0.9 mg/l) . Además, el pH del medio F12 sustituido de manera preferible se ajusta, por ejemplo, utilizando hidróxido de sodio 0.1M, de manera deseable hasta un pH desde aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente 8.5, y de manera preferible a un pH de aproximadamente 8.0.

El método anterior de manera deseable puede llevarse a cabo adicionalmente al formar un montaje de proteína de sedimentación lenta en presencia de un agente apropiado tal como clusterina. Esto se realiza, por ejemplo, al agregar clusterina en la etapa (c) y, como se establece en los ejemplos que siguen. Si los ADDL se preparan por la incorporación de amiloide ß 1-42 biotinado 10% (u otra proteína amiloide ß biotinada apropiada) , se pueden utilizar en un ensayo de unión de receptor utilizando células neurales y se puede llevar a cabo, por ejemplo, en un instrumento de clasificación de células activado por florescencia (FACS) , con marcado por un conjugado fluorescente de avidina. De manera alternativa, en vez de incorporar biotina en la proteína amiloide ß, se puede utilizar otro reactivo capaz de unir en ADDL para formar una molécula marcada fluorescentemente, y el cual ya puede ser parte del conjugado fluorescente-etiquetado. Por ejemplo, el montaje de proteína se puede formar de manera que la proteína amiloide incluya otra porción de unión, en donde el término "porción de unión" como se utiliza en la presente abarca una molécula (tal como avidina, estreptavidina, polilisina y similar) que puede ser utilizada para unirse a un reactivo para formar un compuesto etiquetado fluorescentemente o un conjugado. El "reactivo fluorescente" al cual se une el montaje de proteína no necesita fluorescer en si mismo directamente, sino que en vez de esto puede únicamente ser capaz de fluorescencia a través de unión a otro agente. Por ejemplo, el reactivo fluorescente el cual se une al montaje de proteína puede comprender un anticuerpo especifico para ß-amiloide (por ejemplo 6E10) , con fluorescencia generada por el uso de un anticuerpo secundario fluorescente. Junto con otros experimentos, el análisis por exploración de FACS en células de rata CNS B103 se realiza sin o con incubación con ADDL. Los resultados de este y otros estudios confirman que la unión de la superficie de la célula es situable, y un tratamiento breve con tripsina remueve selectivamente un subgrupo de proteínas de superficie celular y elimina la unión de ADDL. Las proteínas que se pueden separar por tratamiento breve con tripsina de la superficie de las células B103 también evita la unión de ADDL a células B103 o neuronas de hipocampo de rata primarias cultivadas. Estos resultados también apoyan el hecho de que ADDL actúen a través de un receptor de superficie celular particular, y que los eventos iniciales mediados por los ADDL (es decir, los fenómenos antes de la muerte celular) pueden ser controlados ventajosamente (por ejemplo, para tratamiento o investigación) por compuestos que bloqueen la formación y actividad (por ejemplo que incluyen la unión a receptor) de los ADDL. Por lo tanto, la invención proporciona un método para identificar compuestos que modulan (es decir, facilitan o bloquean) la unión de receptor del ADDL. Este método comprende preferiblemente : (a) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con el montaje de proteína ya sea en presencia o ausencia de contacto con el compuesto de prueba; (b) agregar un reactivo que se una al montaje de proteína, el reactivo es fluorescente; (c) analizar los cultivos de células separados por clasificación de células activado por fluorescencia; y (d) comparar la fluorescencia de los cultivos, con compuestos que bloqueen la unión de receptor al montaje de proteína que se identifican como resultantes en una fluorescencia reducida del cultivo, y compuestos que facilitan la unión del receptor que se identifique como resultante en una fluorescencia aumentada del cultivo, en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con el montaje de proteína en ausencia del compuesto de prueba. Alternativamente, en vez de agregar un reactivo fluorescente que en o en si mismo sea capaz de unirse al complejo de proteína, de manera deseable el método se lleva a cabo en donde se forma un montaje de proteína a partir de la proteína amiloide ß 1-42 (u otro amiloide ß) preparado de manera que comprende una porción de unión capaz de unir al reactivo fluorescente .

De manera similar, el método se puede utilizar para identificar compuestos que modulan (es decir, que facilitan o bloquean) la formación o unión de receptor al montaje de proteína, que comprenden: (a) preparar muestras por separado de amiloide ß que se hayan o que no se hayan mezclado con el compuesto de prueba; (b) formar el montaje de proteína en las muestras separadas; (c) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas; (d) agregar un reactivo que se una al montaje de proteína, el reactivo es fluorescente; (e) analizar los cultivos de células separados por clasificación de células activado por fluorescencia; y (f) comparar la fluorescencia de los cultivos, con compuestos que bloqueen la formación de unión de receptor del montaje de proteína que sean identificados como resultantes en una fluorescencia reducida del cultivo, y compuestos que faciliten la formación o la unión del receptor del montaje de proteína que se identifiquen como resultantes en una luorescencia aumentada del cultivo, en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con el montaje de proteína en ausencia del compuesto de prueba. Además, en vez de agregar un reactivo fluorescente que en o en si mismo es capaz de unirse al complejo de proteína, el método se puede llevar a cabo en donde se forma el montaje de proteína a partir de proteína amiloide ß preparada de manera que comprenda una porción de unión capaz de unirse al reactivo fluorescente . Opcionalmente la fluorescencia de los cultivos se compara adicionalmente con la fluorescencia de cultivos que han sido tratados de la misma manera excepto que en vez de agregar o no agregar el compuesto de prueba antes de la formación del montaje de proteína, el compuesto de prueba se agrega o no después de la formación del montaje de proteína. En esta situación, la formación de bloque del montaje de proteína se identifica como resultante en una fluorescencia reducida del cultivo, y los compuestos que facilitan la formación del montaje de proteína se identifican como resultantes en una fluorescencia aumentada del cultivo, en comparación con el cultivo correspondiente con el que se hace contacto el montaje de la proteína en ausencia del compuesto de prueba úni camente cuando el compuesto se agrega antes del montaje de proteína. En contraste, los compuestos que bloquean la unión de receptor del montaje de proteína se identifican como resultantes en una fluorescencia reducida del cultivo, y los compuestos que facilitan la unión del receptor del montaje de proteína se identifican como resultantes en una fluorescencia aumentada del cultivo, en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con el montaje de proteína en ausencia del compuesto de prueba, cuando el compuesto se agrega ya sea antes o después del montaje de proteína. De una manera similar, se puede utilizar un ensayo basado en células, particularmente un ensayo inmunosorbente unido encima (ELISA) basado en células, de acuerdo con la invención, para determinar la actividad de unión de ADDL. En particular, se puede utilizar el método para detectar la unión del montaje de proteína a un receptor de superficie de célula. Este método comprende preferiblemente: (a) formar un montaje de proteína a partir de proteína amiloide ß; (b) poner en contacto un cultivo de células neuronales con el montaje de proteína; (c) agregar un anticuerpo (por ejemplo 6E10) que une el montaje de proteína, el anticuerpo incluye una porción conjugante (por ejemplo biotina u otro agente apropiado) ; (d) eliminar por lavado el anticuerpo no unido; (e) unir una enzima (por ejemplo peroxidasa de rábano) al anticuerpo unido al montaje de proteína por medio de la porción conjugante; (f) agregar un sustrato incoloro (por ejemplo ABTS) que se separa por la enzima para proporcionar un cambio de color; y (g) determinar el cambio de color (por ejemplo espectrofotométricamente) o la velocidad de cambio de color como una medida de la unión de receptor del montaje de proteína. Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo capaz de detectar los ADDL (por ejemplo un anticuerpo dirigido a un sitio expuesto de amiloide ß) , y la porción conjugante de anticuerpo puede ser cualquier agente capaz de unir un medio de detección (por ejemplo una enzima) . La enzima puede ser cualquier porción (por ejemplo tal vez incluso diferente a una proteína) que proporciona un medio de detección (por ejemplo un cambio de color debido a la separación de un sustrato) y que además se puede unir (por ejemplo de manera covalente o no covalente) al anticuerpo unido al montaje de proteína por medio de otra porción (por ejemplo un anticuerpo secundario) . Además, preferiblemente de acuerdo con la invención, las células se adhieren a un sustrato sólido (por ejemplo plástico en un cultivo de tejido) antes de llevar a cabo el ensayo. Esta de más mencionar que la etapa (b) de manera deseable se puede llevar a cabo como se describe en la presente de manera que los ADDL sean capaz de unirse a las células. Similarmente, la etapa (c) preferiblemente se lleva a cabo durante una duración de tiempo suficiente (por ejemplo, desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 2 horas, de manera deseable desde aproximadamente 30 minutos) y bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, a temperatura ambiente, preferiblemente con agitación suave) para permitir que el anticuerpo se una a los ADDL. Además, se pueden llevar a cabo etapas de bloqueo apropiadas tales como las conocidas por aquellos familiarizados en la técnica utilizando agentes bloqueadores apropiados para reducir cualquier unión no específica del anticuerpo. Una persona familiarizada en la técnica de ELISA puede utilizar modificaciones al ensayo tales como se conocen en el arte. De manera deseable el ensayo también se puede llevar a cabo de manera que se identifiquen compuestos que modulan (es decir, que faciliten o bloqueen) la formación o unión de receptor del montaje de proteína. En este método, como en los ensayos descritos antes para compuestos de prueba, el compuesto de prueba se agrega a la preparación de ADDL, antes de el contacto con las células con los ADDL. De esta manera se puede utilizar este ensayo para detectar compuestos que modulan la formación del montaje de proteína (por ejemplo como se ha descrito previamente) . Además, se puede agregar el compuesto de prueba a la preparación de ADDL antes de que hagan contacto las células (pero después de la formación de ADDL) o a las células antes del contacto con los ADDL. Este método (por ejemplo, como se describe previamente) puede ser utilizado para detectar compuestos que modulan la unión de ADDL a la superficie de la célula. Además, se puede agregar el compuesto de prueba a una mezcla de células más ADDL. Este método (por ejemplo, como se describe previamente) puede ser utilizado para detectar compuestos que inciden sobre eventos mediados por ADDL que se presentan corriente abajo de la unión de receptor de ADDL. Se puede confirmar la especificidad de los compuestos para actuar sobre un efecto corriente abajo mediado por ADDL, por ejemplo, al simplemente agregar el compuesto de prueba en ausencia de cualquier coincubación con los ADDL. Por supuesto, se deben incluir con todos los ensayos controles apropiados adicionales (por ejemplo, como se establece en los siguientes ejemplos y como se conoce por aquellos familiarizados en la técnica) . Esta información respecto a los compuestos que modulan (es decir, facilitan o bloquean) la formación y/o actividad que incluyen la unión de receptor del montaje de proteína se pueden utilizar en la investigación y tratamiento de enfermedades, condiciones o desórdenes mediados por ADDL. Los métodos de la invención se pueden utilizar para investigar la actividad y neurotoxicidad de los ADDL mismos. Por ejemplo, cuando se inyecta una preparación de 20 ni de ADDL en la región del hipocampo en ratones adultos 60-70 minutos antes de llevar a cabo un experimento de potenciación a largo plazo (LTP) (por ejemplo Namgung et al., Brain Research, 689, 85-92, 1995), la fase de estimulación del experimento se produce de una manera idéntica a la que se produce con inyecciones control de solución salina, pero la fase de consolidación muestra una declinación continua y significativa en la actividad sináptica medida por la amplitud de pico de cuero de células, sobre las dos horas subsecuentes, en comparación con los animales control, en los cuales la actividad sináptica permanece a un nivel comparable al mostrado durante la fase de estimulación. El análisis de corte de cerebro después del experimento indican que no se ha producido muerte celular. Estos resultados, así como otros descritos en los siguientes ejemplos, confirman que el tratamiento con ADDL compromete la respuesta LTP. Esto indica que los ADDL contribuyen al aprendizaje y memoria comprometida observada en enfermedad de Alzheimer por interferencia con un proceso de señalización neuronal, en vez de por inducción de la muerte de células nerviosas .~~ Se puede obtener información adicional de los efectos de los ADDL (ya sea en presencia o ausencia de compuestos de prueba que modulan potencialmente la formación y/o actividad de ADDL) utilizando ensayos adicionales de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método para ensayar los efectos de los ADDL que comprende preferiblemente : (a) administrar el montaje de proteína al hipocampo de un animal ; (b) aplicar un estímulo eléctrico; y (c) medir la amplitud del pico de cuerpo de célula con - respecto al tiempo para determinar la respuesta de potenciación a largo plazo. Opcionalmente el método se lleva a cabo en donde se compara la respuesta de potenciación a largo plazo del animal con la respuesta de potenciación a largo plazo de otro animal tratado de la misma manera excepto que se le ha administrado solución salina en vez de montaje de lipoproteína antes de la aplicación del estímulo eléctrico. Este método puede ser utilizado adicionalmente para identificar compuestos que modulan (es decir que incrementan o disminuyen) los efectos de los ADDL, por ejemplo, al comparar la respuesta LTP en animales a los que se les ha administrado ADDL ya sea solos o junto con los compuestos de prueba. Además de estas líneas, la invención proporciona un método para identificar compuestos que modulan los efectos del montaje de proteína ADDL. El método comprende preferiblemente: (a) administrar solución salina o un compuesto de prueba al hipocampo de un animal ; (b) aplicar un estímulo eléctrico; (c) medir la amplitud de pico de cuerpo de célula con respecto al tiempo para determinar la respuesta de potenciación a largo plazo; y (d) comparar la respuesta de potenciación a largo plazo de animales que tienen solución salina administrada con la respuesta de potenciación a largo plazo de animales a los que se les ha administrado el compuesto de prueba. El método comprende de manera adicional opcionalmente administrar montaje de proteína al hipocampo ya sea antes, junto con o después de administrar la solución salina o el compuesto de prueba.

Similarmente, la presente invención proporciona un método para identificar compuestos que modulan (es_decir, que incrementan o disminuyen) la neurotoxicidad del montaje de proteína ADDL, método el cual comprende: (a) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con el montaje de proteína ya sea en presencia o ausencia de contacto con el compuesto de prueba; (b) medir la proporción de células viables en cada cultivo; y - (c) comparar la proporción de células viables en cada cultivo. Los compuestos que bloquean la neurotoxicidad del montaje de proteínas se identifica, por ejemplo, como resultado de una proporción aumentada de células viables en el cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con el montaje de proteína en ausencia del compuesto de prueba. Los compuestos que incrementan la neurotoxicidad del montaje de proteína se identifican, por ejemplo, como resultado en una producción reducida de células viables en el cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con el montaje de proteína en presencia del compuesto de prueba . También se pueden utilizar los métodos de la invención para detectar en los materiales de prueba los ADDL (por ejemplo, como parte de investigación, diagnóstico y/o terapia) . Por ejemplo, los ADDL que llevan a cabo un cambio morfológico rápido en células B103 carentes de suero y también activan la actividad de cinasa Fyn en estas células en los siguientes 30 minutos de tratamiento con ADDL (datos no mostrados) . Los ADDL también inducen formación rápida de complejos entre Fyn y una cinasa de adhesión focal (FAK; Zhang et al., Neurosci . Letters, 211, 1-4, 1996), y la translocación de varias proteínas fosforiladas y complejo Fyn-Fak en una fracción insoluble en Tritón (Berg et al., ". Neurosci . res . , 50, 979-989, 1997) . Esto sugiere que Fyn y otras vías de señalización activadas están involucradas en el proceso neurodegenerativo inducido por ADDL. Esto ha sido confirmado por experimentos en cultivos de cortes de cerebro de ratones alterados genéticamente que carecen del gen Fyn funcional, en donde la adición de los ADDL resulta en carencia de neurotoxicidad aumentada en comparación con los controles a los que se les ha administrado vehículo. Por lo tanto, los compuestos que bloquean una o más de las funciones de Fyn o la relocalización de Fyn, específicamente al incidir sobre los ADDL, pueden ser medicamentos neuroprotectores importantes para la enfermedad de Alzheimer. Similarmente, cuando se agregan ADDL a los cultivos de astrocitos primarios, los astrocitos se activan y se eleva el ARNm para varias proteínas, que incluyen IL-1, óxido nítico sintasa inducible, Apo E, Apo «J y al-antiquimiotripsina. Estos fenómenos de manera deseable se utilizan de acuerdo con la invención en un método para detectar en un material de prueba el montaje de proteína ADDL. Tales métodos comprenden opcionalmente: (a) poner en contacto el material de prueba con un anticuerpo (por ejemplo el anticuerpo 6E10 u otro anticuerpo) ; y (b) detectar la unión al montaje de proteína del anticuerpo. Similarmente, el método de manera deseable puede ser utilizado en donde: (a) el material de prueba se pone en contacto con células de neuroblastoma carentes de suero (por ejemplo células de neuroblastoma B103) ; y (b) se miden los cambios morfológicos en las células al comparar la morfología de las células contra células de neuroblastoma que no se ha puesto en contacto con el material de prueba. El método también puede ser utilizado preferiblemente en donde : (a) se pone en contacto el material de prueba con cultivos de corte de cerebro; y (b) se mide la muerte de células de cerebro en comparación contra cultivos de corte de cerebro que no han sido puestos en contacto con el material de prueba. El método de manera deseable adicionalmente se puede llevar a cabo en donde: (a) se pone en contacto el material de prueba con células de neuroblastoma (por ejemplo células de neuroblastoma B103) ; y (b) se miden los incrementos en la actividad de cinasa fyn en comparación con la actividad de cinasa fyn en las células, contra la actividad de cinasa fyn en células de neuroblastoma que no se han puesto en contacto con el material de prueba. En particular, se puede comparar la actividad de cinasa fyn haciendo uso de un equipo disponible comercialmente (por ejemplo el equipo #QIA-28 de Oncogene Research Products, Cambridge, MA) o utilizando un ensayo análogo al descrito en Borowski et al., J". Biochem. (Tokio), 115, 825-829, 1994. En otra modalidad preferida adicional del método para detectar los ADDL en el material de prueba, el método comprende deseablemente: (a) poner en contacto el material de prueba con cultivos de astrocitos primarios; y (b) determinar la activación de los astrocitos en comparación con los cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto en contacto con el material de prueba. En una variación de este método, el método comprende opcionalmente: (a) poner en contacto el material de prueba con cultivos de astrocitos primarios; y (b) medir en los astrocitos los incrementos en el ARNm para proteínas que se seleccionan del grupo que consiste de interleucina-1, óxido nítrico sintasa inducible, Apo E, Apo J y Ol-antiquimiotripsina al comparar los niveles de ARNm en los astrocitos contra los niveles correspondientes de ARNm en cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto en contacto con el material de prueba. Por supuesto, existen otros métodos de ensayo y variaciones adicionales a los descritos antes que pueden ser evidentes para aquellos familiarizados en la técnica, particularmente en vista de la descripción de la especificación en este documento. Así, es claro que los ADDL de acuerdo con la presente invención tienen utilidad in vi tro. Tales ADDL pueden ser utilizados, por ejemplo, como una herramienta de investigación en el estudio de la unión de ADDL y la interacción dentro de células, y con un método para ensayar actividad de ADDL. Similarmente, los ADDL y los estudios de formación, actividad y modulación de ADDL se pueden utilizar in vivo . En particular, los compuestos identificados utilizando los métodos de la presente invención se pueden utilizar para tratar cualquiera de numerosas enfermedades, trastornos o condiciones que resulten en deficiencias en el conocimiento o aprendizaje (es decir, debidos a una falla de memoria) y/o deficiencias en la memoria misma. Tal tratamiento o prevención se puede llevar a cabo al administrar compuestos que eviten la formación y/o actividad de los ADDL, o que modulen (es decir, que incrementen o disminuyan la actividad, de manera deseable como consecuencia de incidir sobre los ADDL) a agentes celulares con los cuales interactúan los ADDL (por ejemplo lo que se denominan eventos "corriente abajo") . Tales compuestos tienen la capacidad de incidir sobre los ADDL a los que se hace referencia en la presente como "compuestos moduladores de ADDL" . Los compuestos moduladores de ADDL no solo pueden actuar de una manera negativa, sino que también, en algunos casos, preferiblemente se utiliza para incrementar la formación y/o actividad de los ADDL. Deseablemente, cuando se utilizan in vivo, el método puede ser utilizado para proteger a un animal contra disminuciones en su conocimiento, aprendizaje o memoria debido a los efectos del montaje de proteína ADDL. Este método comprende administrar un compuesto que bloquea la formación o la actividad de los ADDL. Similarmente, en la medida en que existan deficiencias en el conocimiento, aprendizaje y/o memoria debidos con precisión a la formación y/o actividad de ADDL, las deficiencias pueden ser revertidas o restablecidas una vez que se ha bloqueado la actividad (y/o formación) de los ADDL. Por lo tanto, la invención preferiblemente proporciona un método para revertir (o restaurar) en un animal que presenta disminuciones en el conocimiento, aprendizaje o memoria debido a los efectos de un montaje de proteína de acuerdo con la invención. Este método comprende preferiblemente bloquear la formación de actividad de los ADDL.

En particular, este método de manera deseable se puede aplicar en el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o condición que se manifieste como una deficiencia en el conocimiento, aprendizaje y/o memoria y el cual se deba a la formación o actividad de ADDL, especialmente una enfermedad, trastorno o condición que se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down adulto (es decir, mayor de una edad de 40 años) y demencia senil . Además, este método de manera deseable puede ser aplicado en el tratamiento o prevención de efectos dañinos tempranos sobre la actividad celular, conocimiento, aprendizaje y memoria que pueden ser evidentes antes del desarrollo de la enfermedad, trastorno o condición mismo, efectos dañinos los cuales pueden contribuir al desarrollo de, o finalmente constituir la enfermedad, trastorno o condición misma. En particular, el método preferiblemente se puede aplicar en el tratamiento o prevención de un mal funcionamiento temprano de células nerviosas u otras células cerebrales que pueden resultar como una consecuencia de la formación o actividad de ADDL. Similarmente, el método preferiblemente se puede aplicar en el tratamiento o prevención de deficiencias de memoria focales (FMD) tales como las que se han descrito en la literatura (por ejemplo, Linn et al., Arch. Neurol . , 52, 485-490, 1995) , en el caso de que tal FMD sea debido a la formación o actividad de ADDL. De manera deseable, el método puede ser utilizado en el tratamiento o prevención de señalización neuronal aberrante inducida por ADDL, daño de habilidades de orden superior de escrituras (por ejemplo Snowdon et al., JAMA, 275, 528-532, 1996) u otras funciones cognoscitivas de orden superior, disminuciones en (o ausencia de) potenciación a largo plazo, que sigue como una consecuencia de la formación o actividad de ADDL. De acuerdo con esta invención, una "señalización neuronal aberrante inducida por ADDL" se puede medir por diversos medios. Por ejemplo, para una señalización neuronal normal (así como la observación de una respuesta de potenciación a largo plazo) , aparece entre otras cosas, que se debe activar cinasa Fyn, la cinasa Fyn debe fosforilar el canal de NMDA (Miyakawa et al., Science, 278, 698-701, 1997; Grant , J". Physiol Paris, 90, 337-338, 1996) , y Fyn debe estar presente en la posición celular apropiada (lo cual puede ser impedido por la formación del complejo Fyn-Fak, por ejemplo, como se produce en ciertas reorganizaciones citoesqueléticas inducidas por ADDL) . En base a esto, la señalización neuronal aberrante inducida por ADDL (la cual es un mal funcionamiento de señalización que es inducido por activación aberrante de vías celulares por los ADDL) y el conocimiento del mismo se puede utilizar en estos métodos de la invención, como serla obvio para una persona familiarizada en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar la señalización de célula aberrante inducida por ADDL (por ejemplo, como una consecuencia de células nerviosas en contacto con los ADDL, los cuales se pueden llevar a cabo adicionalmente en presencia o ausencia de compuestos que sean probados para actividad moduladora de ADDL, utilizando cualquiera de estas medidas, o como serían aparentes para una persona familiarizada en la técnica, por ejemplo activación de cinasa Fyn (o alteración de la misma) , formación de complejos Fyn-Fak (o alteración de los mismos) , reorganización citoesquelética (o alteración de la misma) , localización subcelular de cinasa Fyn (o alteración de la misma) , fosforilación de cinasa Fyn del canal NMDA (o alteración de la misma . Además, los ADDL en si mismos se pueden aplicar en el tratamiento. Se ha descubierto que estos montajes novedosos descritos en la presente tienen numerosos efectos no esperados sobre células que de manera concebible se pueden aplicar para terapia. Por ejemplo, los ADDL activan células endoteliales, células endoteliales las cuales son conocidas, entre otras cosas, por interactuar con células vasculares. Junto con estas líneas, se puede utilizar lo ADDL, por ejemplo, en el sanado de heridas. Además, a modo de ejemplo, la toxina de botulinio tipo A (BoTox) es un agente bloqueador de unión neuromuscular producido por la bacteria Clostridi um botulinum que actúa al bloquear la liberación del neurotransmisor acetilcolina. Se ha demostrado que BoTox es benéfico en el tratamiento de espasmos musculares inhabilitantes, incluyendo distonia. Teóricamente, los ADDL mismos pueden ser aplicados para instruir una función de células neurales o, para destruir selectivamente células neuronales objetivo (por ejemplo en casos de cáncer, por ejemplo del sistema nervioso central, particularmente de cerebro) . Los ADDL parecen ser ventajosos adicionalmente a este respecto dado a que tienen efectos muy tempranos en las células, y dado que su efecto en las células (además de su efecto destructor de células) parece ser reversible. Como se discute en lo anterior, los compuestos moduladores de ADDL de la presente invención, así como los ADDL mismos se pueden utilizar para poner en contacto células ya sea in vi tro o in vivo . De acuerdo con la invención, una célula puede ser cualquier célula y, preferiblemente, es una célula eucax±ótica. Una célula eucariótica es una célula que típicamente posee, en alguna etapa de su vida, un núcleo rodeado por una membrana nuclear. Preferiblemente, la célula eucariótica es de una especie multicelular (por ejemplo, en oposición a una célula de levadura unicelular) y, de manera incluso más preferible es una célula de mamífero (opcionalmente de humano) . Sin embargo, el método también puede llevarse a cabo efectivamente utilizando una amplia variedad de tipos de células diferentes tales como células de ave y células de mamífero que incluyen, pero que no se limitan a células de roedor, primate (tal como chimpancé, mono, mandril, gorila, orangután o gibón) , felinas, caninas, ungulados (tales como rumiantes o cerdos) así como, en particular, células humanas. Los tipos de células preferidos son células que se forman en el cerebro, que incluyen células neurales y células de glia. Un tipo especialmente preferido de célula de acuerdo con la invención es una célula neural (ya sea normal o aberrante, por ejemplo transformada o cancerosa) . Cuando se utiliza en cultivo de tejido, de manera deseable la célula neural es una célula de neuroblastoma. La célula puede estar presente como una sola entidad, o puede ser parte de una colección más grande de células . Tal "colección más grande de células" puede comprender, por ejemplo, un cultivo celular (ya sea mixto o puro) , un tejido (por ejemplo neural o de otro tejido), un órgano (por ejemplo el cerebro u otros órganos) , un sistema de órganos (por ejemplo el sistema nervioso u otro sistema de órganos) o un organismo (por ejemplo un mamífero o similar) . Preferiblemente, los órgaños/tej ido/células de interés en el contexto de la invención son del sistema nervioso central (por ejemplo, son células neurales) . Además, de acuerdo con la invención, "poner en contacto" comprende cualquier medio por el cual estos agentes tocan físicamente una célula. El método no depende de algún medio particular de introducción y no se considera de esta manera. Los medios de introducción son bien conocidos por aquellos familiarizados en la técnica y también se ejemplifican en la presente. En consecuencia, la introducción se puede llevar a cabo, por ejemplo, ya sea in vi tro (por ejemplo en un método de terapia tipo ex vivo o en estudios de cultivo de tejido) o in vivo . Otros métodos también están disponibles y son conocidos por aquellos familiarizados en la técnica. Tal "contacto" se puede realizar por cualquier medio conocido por aquellos familiarizados en la técnica, y como se describe en la presente, mediante lo cual el contacto aparente o la tangencia mutua de los ADDL y los compuestos moduladores de ADDL y la célula se puede llevar a cabo, por ejemplo, poner en contacto puede realizarse al mezclar estos elementos en un volumen pequeño de la misma solución. Opcionalmente, los elementos pueden ser unidos covalentemente, por ejemplo, por un medio químico conocido por aquellos familiarizados en la técnica u otro medio, o preferiblemente se pueden unir por medio de interacciones no covalentes (por ejemplo uniones iónicas, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals y/o interacciones no polares) . En comparación, la célula que va a ser afectada y el ADDL o el compuesto modulador de ADDL no necesariamente debe ponerse en contacto en un volumen pequeño como, por ejemplo, en casos en donde el ADDL o el compuesto modulador de ADDL se administra a un huésped, y el complejo se desplaza por la corriente sanguínea u otro fluido corporal tal como el fluido cerebrorraquídeo a la célula con el cual se une. El contacto de la célula con un ADDL o un compuesto modulador de ADDL algunas veces se realiza antes, junto con o después de que se administra otro compuesto de interés. De manera deseable, este contacto se realiza de manera que existe por lo menos cierta cantidad de tiempo en donde los agentes coadministrados ejercen concurrentemente sus efectos sobre una célula o sobre el ADDL. Una persona familiarizada en la técnica apreciará que los métodos adecuados de administración de un agente (por ejemplo un ADDL o un compuesto modulador de ADDL) de la presente invención a un animal para propósitos de terapia y/o diagnóstico, investigación o estudio están disponibles y, aunque se puede utilizar más de una vía para administración, una ruta particular puede proporcionar una reacción efectiva más inmediata y más efectiva que otra ruta. Los excipientes farmacéuticamente aceptables también son bien conocidos por aquellos familiarizados en la técnica, y están disponibles fácilmente. La elección del excipiente se determinará en parte por el método particular utilizado para administrar el agente. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas para uso en el contexto de la presente invención. Los siguientes métodos y excipientes son únicamente ejemplares y de ninguna manera limitantes .

Las formulaciones adecuadas para administración oral consisten de: (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva del compuesto disuelto en diluyentes, tal como agua, solución salina o jugo de naranja; (b) cápsulas, saquitos o tabletas, cada uno contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como sólidos o granulos; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas en tableta pueden incluir uno o más de lactosa, manitol, almidón de maíz, almidón de papa, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa de sodio, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, preservativos o conservadores, agentes saborizantes y excipientes farmacológicamente compatibles. Las formas de gragea pueden comprender el ingrediente activo en un _ sabor, habitualmente sacarosa y acacia o tragacanto, asi como pastillas que comprenden al ingrediente activo en una base inerte, tales como gelatina y glicerina, emulsiones, geles y similares que contienen además del ingrediente activo, excipientes tales como los que se conocen en la técnica. Un agente de la presente invención, solo o en combinación con otros ingredientes adecuados, se puede fabricar en formulaciones en aerosol para ser administrado por medio de inhalación. Estas formulaciones en aerosol se pueden colocar en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También se pueden formular como sustancias farmacéuticas para preparaciones no presurizadas por ejemplo en un nebulizador o en un atomizador. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral se prefieren de acuerdo con la invención e incluyen soluciones acuosas y no acuosas, isotónicas estériles para inyección, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que incluyen agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y preservativos. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o recipientes sellados de dosis múltiples, tales como ampollas y frascos, y se pueden almacenar en condición secada por congelación (liofilizada) que únicamente requiere la adición de excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, granulos y tabletas de las clases descritas previamente . La dosis administrada a un animal, particularmente un humano, en el contexto de la presente invención, variarán con _el agente de interés, la composición utilizada, el método de administración y el sitio particular y el organismo que se trate. Sin embargo, preferiblemente, se utiliza una dosis que corresponde a una cantidad efectiva de un agente (por ejemplo un ADDL o un compuesto modulador de ADDL de acuerdo con la invención) . Una "cantidad efectiva" es una que es suficiente para producir el efecto deseado en un huésped, la cual puede ser monitoreado utilizando varios puntos finales conocidos por aquellos familiarizados en la técnica. Algunos ejemplos de los efectos deseados incluyen, pero no se limitan a un efecto de aprendizaje, memoria, respuesta LTP, neurotoxicidad, formación de ADDL, unión de receptor de ADDL, unión de anticuerpo, cambios morfológicos celulares, actividad de cinasa Fyn, activación de astrocitos y cambios en las concentraciones de ARNm para proteínas tales como interleucina- 1 , óxido nítrico sintasa inducible, ApoE, ApoJ y al-antiquimiotripsina . Estos métodos descritos de ninguna manera son totalmente incluyentes, y métodos adicionales para adaptarse a aplicaciones específicas serán evidentes para una persona, habitualmente familiarizada en la técnica. Además, con aplicaciones particulares (por ejemplo ya sea in vi tro o in vivo) la dosis real y el protocolo de administración de los ADDL o los compuestos moduladores de ADDL pueden variar en base en si la composición se administra en combinación con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de las diferencias interindividuales en farmacocinética, composición del medicamento y metabolismo. Similarmente, las cantidades pueden variar en aplicaciones in vi tro dependiendo del tipo de célula particular utilizado o el medio o solución por el cual el ADDL o el compuesto modulador de ADDL se transfiere al cultivo. Una persona familiarizada en la técnica fácilmente puede hacer cualquier ajuste necesario de acuerdo con los requerimientos de la situación particular.

E e plos Las descripciones anteriores (así como aquellas que siguen), son únicamente ejemplares. Otras aplicaciones del método y constituyentes de la presente invención serán evidentes para una persona familiarizada en la técnica. Por lo tanto, los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención pero, por supuesto, no se debe considerar de manera alguna como limitante del alcance.

Ejemplo 1: Preparación de oliqómeros de amiloide ß De acuerdo con la invención, los ADDL se preparan al disolver 1 mg de amiloide ß 1-42 sólido (por ejemplo, sintetizado como se describe en Lambert et al., J". Neurosci . res . , 39, 377-395, 1994) en 44 µl de DMSO anhidro. Esta solución 5 mM después se diluye en medio F12 frío (4°C) (Gibco BRL, Life Technologies) hasta un volumen total de 2.20 ml (dilución 50 veces) y somete a vortex durante aproximadamente 30 segundos. Se permite que la mezcla se incuba desde aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 8°C durante aproximadamente 24 horas, seguido por centrifugación a 14,000 g durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 4°C. El sobrenadante se diluye por factores de 1:10 a 1.10,000 en el medio definido particular, antes de incubación con cultivo de corte de cerebro, cultivos celulares o preparaciones de proteína de unión. Sin embargo, en general, los ADDL se forman a una concentración de proteína Aß de 100 µM. Típicamente, la concentración más elevada utilizada para experimentos es 10 µM y, en algunos casos, los ADDL (medidos como concentración inicial Aß) se diluyen (por ejemplo, en medio de cultivo de células) a 1 nM. Para análisis por microscopía de fuerza atómica (AFM) , se aplica una alícuota de 20 µl de la dilución 1:100 a la superficie del disco de mica recién separado y se analiza. Otras manipulaciones se describen en lo siguiente, o como son conocidas . Alternativamente, la formación de ADDL se llevó a cabo como se describe en lo anterior, con excepción de que el medio F12 fue sustituido por un amortiguador (es decir, "medio F12 sustituto") que contiene los siguientes componentes: N,N-dimetilglicina (766 mg/l) , D-glucosa (1.802 g/l) , cloruro de calcio (33 mg/l) , sulfato de cobre pentahidratado (25 mg/l) , sulfato de hierro (II) heptahidratado (0.8 mg/l), cloruro de potasio (223 mg/l) , cloruro de magnesio (57 mg/l) , cloruro de sodio (7.6 g/l) , bicarbonato de sodio (1.18 g/l) , fosfato ácido disódico (142 mg/l) y sulfato de zinc heptahidratado (0.9 mg/l) . El pH del amortiguador se ajusta a 8.10 utilizando hidróxido de sodio 0.1M.

Ejemplo 2: Reticulación de oligómeros de amiloide ß Se ha utilizado con éxito glutaraldehído en diversos sistemas bioquímicos. El glutaraldehído tiende a reticular proteínas que están directamente en contacto, en oposición a reacción no específica con altas concentraciones de proteína monomérica. En este ejemplo, se investigó la reticulación inducida por glutaraldehído de amiloide ß . Se llevó a cabo una preparación del oligómero como se describe en el ejemplo 1, con el uso de medio F12 sustituto. El sobrenadante que se obtiene después de centrifugación (y en algunos casos, fraccionamiento) se trata con 0.22 ml de una solución acuosa 25% de glutaraldehído (Aldrich) seguido por 0.67 ml de borohidruro de sodio 0.175M en NaOH 0.1M (de acuerdo con el método de Levine, Neurobiology of Aging, 1995) . La mezcla se agita a 4°C durante 15 minutos y se suspende por adición de 1.67 ml de sacarosa acuosa al 20%. La mezcla se concentra 5 veces en un equipo SpeedVac y se dializa para remover componentes más pequeños de 1 kD. El material se analiza por SDS-PAGE. Se lleva a _cabo cromatografía en filtración de gel, de acuerdo con lo siguiente: se equilibra una columna de Superóse 75PC 3.2/3.0 (Pharmacia) con amortiguador de carbonato ácido de amonio 0.15% filtrado y desgasificado (pH = 7.8) a una velocidad de flujo de 0.02 ml/min durante el curso de 18 horas a temperatura ambiente. Se cambio la velocidad de flujo a 0.04 ml/min y se eluyeron 20 ml de solvente. Se cargaron 50 microlitros de la solución de reacción en la columna y se volvió a asumir una velocidad de flujo de 0.04 ml/min. La elusión del compuesto se monitorea vía detección UV a 220 nm, y se recolectan las fracciones de 0.5-1.0 ml durante el curso de la cromatografía. Se aisla la fracción No. 3, que corresponde al tercer pico de absorbancia UV y se demuestra por AFM que contiene glóbulos de 4.9 +/- 0.8 nm (por análisis amplio) . Esta fracción es altamente neurotóxica cuando se pone en contacto con neuronas de corte de cerebro, como se describe en los ejemplos que siguen.

Ejemplo 3; Caracterización de tamaño de los ADDL Este ejemplo establece la caracterización de tamaño de los ADDL formados como en el ejemplo 1, y que utiliza diversos métodos (por ejemplo electroforesis en gel nativo, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, AFM, fraccionamiento de flujo de campo e inmuno-reconocimiento) . La AFM se lleva a cabo esencialmente como se describe previamente (por ejemplo, Stine et al., J". Protein Chem . , 15, 193-203, 1996). Específicamente, se obtienen imágenes utilizando un microscopio de fuerza atómica de modo múltiple de Digital Instruments (Santa Barbara CA) , Nanoscope Illa Multimode Atomic utilizando un explorador J con un intervalo xy de 150 µ. Se utiliza el modo de conexión para todas las imágenes utilizando nanosondas de TESP grabadas en silicio (Digital Instruments) . Los datos de AFM se analizan utilizando elementos de programación (software) Nanoscope Illa en los elementos de programación (software) de análisis de forma de onda IGOR Pro™. Para el análisis por AFM, se llevan a cabo exploraciones de 4 µ (es decir, determinaciones de un cuadrado de 4 µm x 4 µm) . Típicamente, las dimensiones reportadas se obtienen por análisis de sección, y cuando se utiliza el análisis amplio, se especifica. El análisis por sección y amplio están en módulos de análisis separados en los elementos de programación (software) Nanoscope Illa. Generalmente, para análisis ADDL, existe una desviación sistemática entre los tamaños obtenidos por análisis de sección y aquellos obtenidos por análisis amplio. Específicamente, para un análisis de sección de exploración de 4 µ, proporciona alturas que habitualmente son de aproximadamente 0.5 nm más elevadas, lo que resulta en una desviación de aproximadamente 0.5 nm en los valores obtenidos para los tamaños de los glóbulos . El análisis por electroforesis en gel se lleva a cabo en geles de poliacrilamida al 15% y se visualiza por tinción con azul de Coomassie. Los ADDL se separan en geles de tris-glicina 4-20% bajo condiciones no desnaturalizantes (Novex) . La electroforesis se lleva a cabo a 20 mA durante aproximadamente 1.5 horas . Las proteínas se separan con SDS-PAGE como se describe en Zhang et al., J". Biol . Chem. , 269, 25247-25250, 1994. La proteína posteriormente se visualiza utilizando tinción de plata (por ejemplo como se describe en Sherchenko et al., Anal. Chem . , 68, 850-858, 1996). Las proteínas en el gel tanto de geles nativos como de SDS se transfieren a membranas de nitrocelulosa de acuerdo con Zhang et al., (J. Biol . Chem. , 269 , 25247-50, 1994). Se lleva a cabo inmunotranferencia (inmunoblots) con anticuerpos 6E10 biotinado (Senetak, Inc., St . Louis, Missouri) a 1:5000 y se visualiza utilizando ECL (Amersham) . Típicamente, los geles se exploran utilizando un densitómetro. Esto permite proporcionar imágenes generadas por computadora de los geles (por ejemplo versus fotografías de los geles mismos) . La caracterización de tamaño de los ADDL por análisis de sección de AFM (por ejemplo como se describe en Stine et al., J". Protein Chem. , 15, 193-203, 1996) o con análisis amplio (elementos de programación (software) Nanoscope III) indican que las especies predominantes son glóbulos de aproximadamente .7 nm a aproximadamente 6.2 nm a lo largo del ej e z . La comparación con proteínas globulares pequeñas (monómero Aß 1-40, aprotinina, bFGF, anhidrasa carbónica) sugieren que los ADDL tienen una masa entre 17-42 kD. Se pueden reconocer lo que parecen ser especies distintas. Estas parecen corresponder a los glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 4.9 nm hasta aproximadamente 5.4 nm, desde aproximadamente 5.4 nm hasta aproximadamente 5.7 nm, y desde aproximadamente 5.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm. Los glóbulos de dimensiones de aproximadamente 4.9-5.4 nm y de 5.7-6.2 nm parecen comprender aproximadamente 50% de los glóbulos. En concordancia con el análisis por AFM, las inmunotransferencias en SDS-PAGE de los ADDL identifican oligómeros Aß de aproximadamente 17 kD hasta aproximadamente 22 kD, con abundante monómero de 4 kD presente, probablemente un producto de separación. Consistente con esta interpretación, los geles de poliacrilamida desnaturalizantes de los ADDL muestran un monómero escaso, con una banda primaria cerca de 30 kD, una banda menos abundante a -17 kD, y sin evidencia de fibrillas o agregados. Las imágenes generadas en computadora de un gel nativo teñido con plata y un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomassie se establecen en las Figura 1 y Figura 2, respectivamente. La correspondencia entre SDS y los geles no desnaturalizantes confirma que el tamaño oligomérico pequeño de los ADDL no se debe a acción del detergente. Los oligómeros vistos en preparaciones de ADDL son más pequeños que clusterina (Mr 80 kD, 40 kD en geles desnaturalizados) , como se espera del uso de bajas concentraciones de clusterina (1/40 en relación a Aß , lo cual impide la asociación de Aß como complejos de Aß-clusterina 1:1) . Una preparación de ADDL de acuerdo con la invención se fracciona en una columna Superdex 75 (Pharmacia, columna Superóse 75PC 3.2/3.0). La fracción que comprende los ADDL es la tercera fracción de absorbancia UV que eluye de la columna y se analiza por AFM y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. En la figura 3 se muestra un análisis representativo de AFM de la fracción 3. El fraccionamiento resulta en mayor homogeneidad para los ADDL, en donde la mayor parte de los glóbulos tienen dimensiones desde aproximadamente 4.9 nm hasta aproximadamente 5.4 nm. La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de la fracción demuestra una banda inferior pesada que corresponde a la forma monomérica/dimérica de Aß . También se observa para la preparación no fraccionada de los ADDL, parece ser un producto de separación de los ADDL. Un cargado más pesado de la fracción muestra una banda amplia de mayor tamaño (tal vez un doblete) . Esto confirma adicionalmente la estabilidad de las estructuras Aß oligoméricas no fibrilares a SDS.

Ejemplo 4; Tratamiento con clusterina de amiloide ß Aunque se ha propuesto que las estructuras fibrilares representan la forma tóxica de Aß (Lorenzo et al., Proc . Nati . Acad. , USA, 91, 12243-12247, 1994; Howlett et al., Neurodegen, 4, 23-32, 1995) , las neurotoxinas novedosas que no se comportan como fibrillas sedimentables se formarán cuando se incuba Aß 1-42 con bajas dosis de clusterina, la cual también se conoce como "ApoJ" (Oda et al., Exper. Neurol . , 136, 22-31, 1995; Oda et al., Biochem. Biophys . Res Commun . , 204, 1131-1136, 1994). Para probar si estas toxinas de sedimentación lenta pueden aún contener fibrillas pequeñas o nacientes, se examinan por microscopía de fuerza atómica preparaciones de Aß tratadas con clusterina. El tratamiento con clusterina se lleva a cabo como se describe en Oda et al., (Exper. Neurol . , 136, 22-31, 1995) básicamente al agregar clusterina en la incubación descrita en el ejemplo 1. Alternativamente, al Aß 1-42 inicial se puede disolver en HCl O.l N, en vez de DMSO, y este Aß 1-42 inicial puede incluso tener estructuras fibrilares en su resultado. Sin embargo, la incubación con clusterina durante 24 horas a temperatura ambiente de 37°C resulta en preparaciones que están predominantemente libres de fibrillas, consistente con su sedimentación lenta. Esto se confirma por experimentos que muestran que la formación de fibrilla disminuye conforme se incrementa la cantidad de clusterina agregada. Las preparaciones que resultan del tratamiento con clusterina comprenden exclusivamente estructuras globulares pequeñas de aproximadamente 5-6 nm en tamaño determinado por análisis de AFM de los ADDL fraccionados en una columna de gel Superdex 75. Se obtienen resultados equivalentes por microscopía electrónica convencional. En contraste, Aß 1-42 que ha sido autoasociado bajo condiciones estándar (Snyder et al., Biophys . J. , 67, 1216-28, 1994), en ausencia de clusterina muestran principalmente especies fibrilares no difusibles y grandes. Además, las preparaciones resultantes de ADDL se hacen pasar a través de una membrana de corte de 10 kD Centricon y se analizan en un gel de gradiente de SDS-poliacrilamida. Como se puede ver en la figura 4, únicamente el monómero pasa a través del filtro Centricon 10, mientras que los ADDL se retienen por el filtro. El monómero encontrado después de la separación únicamente se puede formar a partir de especies de peso molecular más grande retenidas por el filtro. Estos resultados confirman que las preparaciones tóxicas de ADDL comprenden oligómeros fibrilares pequeños de Aß 1-42 y que los ADDL se pueden obtener por tratamiento apropiado de clusterina de amiloide ß.

Ejemplo 5; Formación fisiológica de los ADDL Las porciones tóxicas en el ejemplo 4 pueden comprender estructuras raras que contienen Aß oligomérico y clusterina. Mientras que Oda et al. ( Exper. Neurol . , 136, 22-31, 1995) reportaron que se encuentra que la clusterina incrementa la toxicidad de las soluciones de Aß 1-42, otros investigadores han encontrado que la clusterina a concentraciones estequiométricas protege contra la toxicidad de Aß 1-40 (Boggs et al., J. Neurochem . , 61 , 1324-1327, 1997) . En consecuencia, se caracteriza adicionalmente en este ejemplo la formación de ADDL en ausencia de clusterina. Cuando se mantienen soluciones monoméricas de ß 1-42 a baja temperatura en un medio apropiado, la formación de fibrillas Aß sedimentables. se bloquea casi completamente. Sin embargo, Aß se autoasocia en estas soluciones de baja temperatura, formando ADDL esencialmente indiferenciables de los que están escoltados por clusterina. Finalmente, los ADDL también se forman cuando se incuban soluciones monoméricas Aß a 37° en medio de cultivo de corte de cerebro pero a una concentración muy baja (50 nM) , indicando un potencial para su formación fisiológica. Todas las preparaciones de ADDL son relativamente estables y no muestran conversión a fibrillas durante los experimentos de cultivo de tejido de 24 horas.

Estos resultados confirman que los ADDL se forman y son estables bajo condiciones fisiológicas y sugieren que similarmente pueden formarse y ser estables in vivo .

Ejemplo 6: Los ADDL son neurotoxinas del SNC difusibles y extremadamente potentes Cuando los ADDL son inducidos por clusterina, baja temperatura o baja concentración Aß, los oligómeros estables que se forman son neurotoxinas potentes. Se examina la toxicidad en cultivos de corte de cerebro de ratón organotípicos, los cuales proporcionan un modelo fisiológicamente importante para el SNC maduro. El tejido de cerebro es soportado en una interfase de atmósfera-medio por un filtro con el fin de mantener alta -viabilidad en los controles . Para estos experimentos, se obtienen cortes de cerebro a partir de las cepas B6 129 F2 y JR 2385 (Jackson Laboratories) y se cultivan como se ha descrito previamente (Stoppini et al., J". Neurosci , Meth . , 37, 173-182, 1991), con modificaciones. Específicamente, se sacrifica un ratón adulto por inhalación de dióxido de carbono, seguido por decapitación rápida. La cabeza se sumerge en amortiguador de disección estéril frío (94 ml de solución salina balanceada de Gey, pH 7.2, suplementada con 2 ml de MgCl2 0.5M, 2 ml de glucosa 25% y 2 ml de Hepes 1.0 M) , después de lo cual se extrae el cerebro y se coloca en una placa recubierta con Sylgar estéril. Se retira el cerebelo y se realiza un corte en la línea medida para separar los hemisferios cerebrales. Cada hemisferio se corta, por separado. El hemisferio se coloca con la línea media cortada hacia abajo y se realiza un corte de 30° desde el lado dorsal para orientar el hemisferio. El hemisferio se pega con el lado cortado hacia abajo sobre la placa de plástico de un cortador de tejido Campden (previamente humedecido con etanol) y se sumerge en amortiguador estéril frío con hielo. Se realizan cortes de 200 µm de espesor desde una dirección lateral a una media, recolectando aquellos en los cuales es visible el hipocampo. Cada corte se transfiere con el extremo superior de una pipeta estéril a una caja de petri pequeña que contiene medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero bovino fetal 10%, S/P/F 2% (estreptomicina, penicilina y fungizona; Life Technologies (Gibco, BRL) , Gaithersburg, MD) , observado con un microscopio para verificar la presencia del hipocampo, y se coloca en una pieza de inserción Millicell-CM (Millipore) en un recipiente de cultivo de tejido de pozo profundo (Falcon, recipiente con 6 pozos) . Cada pozo contiene 1.0 ml de medio de crecimiento y habitualmente se colocan dos cortes en cada pieza de inserción. Los cortes se colocan en un incubador (C02 6%, humedad 100%) , durante la noche. El medio de crecimiento se remueve y los pozos se lavan con 1.0 ml de BSS de Hanks tibia (Gibco, BRL, Life Technologies) . Se agrega a cada pozo medio definido (DMEM, suplementos N2 , SPF, por ejemplo, como se describe en Bottenstein et al., Proc. Nati . Acad. Sci . , 76, 514-517, 1979) que contiene los oligómeros de amiloide ß, con o sin compuestos inhibidores, y se continua la incubación durante 24 horas . Se mide la muerte celular utilizando el equipo de ensayo LIVE/DEAD1111 (Molecular Probes, Eugene, OR) . Este es un ensayo de fluorescencia de etiqueta doble en el cual las células vivas se detectan por la presencia de una esterasa que separa calceína-AM a calceína, lo que resulta en una fluorescencia verde. Las células muertas captan homodí ero de etidio, el cual se intercala con ADN y presenta una fluorescencia roja. El ensayo se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante con homodímero de etidio 2 µM y calceína 4 µM. Se obtienen imágenes en los siguientes 30 minutos utilizando un microscopio Nikon Diaphot equipado con epifluorescencia. Se utiliza el sistema de análisis de imagen MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Philadelphia, PA) para cuantificar la cantidad y/o área de las células que muestran fluorescencia verde o roja. Para estos experimentos, los ADDL están presentes durante 24 horas a una dosis máxima de 5 µM de Aß total (es decir, el Aß total nunca es más de 5 µM en ningún experimento de ADDL) . La muerte celular, como se muestra por "tinción amarilla falsa" se confina casi completamente al estrato piramidal (CA 3-4) y al giro dentado (DG) , lo que sugiere fuertemente que las neuronas principales del hipocampo (piramidales y células granulosas, respectivamente) son los objetivos de la toxicidad inducida por ADDL. Además, la viabilidad de la glia no es afectada por un tratamiento de 24 horas con ADDL de glia de cerebro de rata primaria, determinada por exclusión de azul de tripan y ensayo MTT (Finch et al., no publicado) . Las regiones del giro dentado (DG) y CA3 son particularmente sensibles y muestran una muerte celular inducida por ADDL en cada cultivo obtenido de animales con edad p20 (animales recién destetados) a P84 (adulto joven) . Hasta 40% de las células en esta región mueren después de exposición crónica a los ADDL. El patrón de muerte neuronal no es idéntico al observado para NMDA, el cual mata neuronas en DG y CAÍ, pero escasamente en CA3. Algunos cultivos para las regiones del hipocampo DG y CA3 de animales de más de 20 días de edad se tratan con preparaciones convencionales de Aß fibrilar. Consistente con la naturaleza no difusible de las fibrillas, no es evidente muerte celular (tinción amarilla) incluso a 20 µM. El patrón de tinción para células vivas en este cultivo verifica que la región CA3/giro dentado del hipocampo es examinada. La extensión de muerte celular observada después de tratamiento convencional con Aß (es decir, preparaciones de Aß fibrilar) no son diferenciables de los controles negativos en los cuales a los cultivos se les administra medio, o medio con suplemento de clusterina. En los controles típicos, la muerte celular es menor a 5%. De hecho, se puede encontrar una viabilidad elevada en los controles incluso en cultivos que se mantienen varios días más allá de los experimentos típicos, lo cual confirma que la supervivencia celular no se compromete por condiciones de cultivo estándar. Se lleva a cabo un experimento de dosis-respuesta para determinar la potencia de los ADDL en inducir muerte celular. Se utiliza el análisis de imagen para cuantificar las tinciones de células muertas y células vivas en campos que contienen las áreas DG/CA3. La Figura 5 ilustra el % de células muertas versus concentración de ADDL medido como concentración inicial de amiloide ß 1-42. Debido a las dificultades de cuantificar cortes de cerebro, los resultados no son lo suficientemente detallados para determinar la CE50 con precisión. Sin embargo, como se puede ver en la Figura 5, incluso después de una dilución de 1000 veces ( ~5 nM Aß) , la muerte celular inducida por ADDL es más de 20%. Se observa toxicidad incluso con los ADDL 0.3 nM. Esto contrasta con resultados obtenidos con Aß envejecida convencionalmente, la cual es tóxica para neuronas en cultivos desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 µM. Estos datos muestran que los ADDL son efectivos a dosis 1000-10,000 veces más pequeñas que las utilizadas en experimentos de Aß fibrilar. Estos datos de cortes de hipocampo por lo tanto confirman la naturaleza ultratóxica de los ADDL. Además, debido a que los ADDL deben pasar a través del filtro de cultivo-soporte para provocar muerte celular, los resultados validan que los ADDL son difusibles, consistente con su tamaño oligomérico pequeño. Además, los métodos que se establecen en la presente se pueden utilizar como un ensayo para cambios mediados por ADDL en la viabilidad celular. En particular, el ensayo se puede llevar a cabo por coincubación o coadministración junto con los agentes de ADDL jque pueden incrementar o disminuir potencialmente la formación y/o actividad de los ADDL. Los resultados obtenidos con tal coincubación o coadministración se pueden comparar con los resultados que se obtienen con inclusión únicamente de los ADDL.

Ejemplo 7; Ensayo de toxicidad de tensión oxidativa MTT - células PC12 Este ejemplo establece un ensayo que puede ser utilizado para detectar un cambio de toxicidad temprana en respuesta a oligómeros de amiloide ß.

Para estos experimentos, se someten a pasaje células PC12 a 4 x 104 células/pozo en una placa de cultivo de 96 pozos y se hacen crecer durante 24 horas en DMEM + suero bovino fetal 10% + S/P/F 1% (estreptomicina, penicilina y fungizona) . Las placas se tratan con 200 µg/ml de poli-1-lisina durante 2 horas antes de la colocación en placas de las células para mejorar la adhesión celular. Un conjunto de seis pozos se deja sin tratar y se alimenta con medio fresco, mientras que otro conjunto de pozos se trata con el control de vehículo (PBS que contiene HCl 0.01 N 10%, envejecido o/n a temperatura ambiente) . Los controles positivos se tratan con Tritón (1%) y Azida de Na (0.1%) en medio de crecimiento normal. Se preparan oligómeros de amiloide ß como se describe en el ejemplo 1, o se obtienen por coincubación con clusterina, con o sin compuestos inhibidores presentes, que se agregan a las células durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se agrega MTT (0.5 mg/ml) a las células durante 2.5 horas (11 µl de un concentrado de 5 mg/ml solubilizado en PBS en 100 µl de medio) . Las células sanas reducen el MTT a un producto de formazan de color azul. Después de incubación con MTT, el medio se aspira y se agregan 100 µl de DMSO 100% para lisar las células y disolver los cristales azules . La placa se incuba durante 15 min a temperatura ambiente y se lee en un lector de placa (ELISA) a 550 nm.

Los resultados de tal experimento se muestran en la figura 6. Como se puede ver a partir de esta figura, las células control no expuestas a los ADDL ("Cont"), las células expuestas a clusterina sola ("ApoJ"), y las células expuestas a Aß monomérica ("Aß") no muestran toxicidad celular. En contraste, las células expuestas a amiloide ß coagregado con clusterina y envejecidos un día ("Aß:Apo J") muestran una disminución en la reducción de MTT, lo que evidencia un cambio temprano de toxicidad. Las últimas preparaciones de amiloide se confirman por AFM como carentes de fibrillas amiloides. Los resultados de este experimento por lo tanto confirman que las preparaciones de ADDL obtenidas a partir de coagregación de Aß mediada por clusterina tienen toxicidad aumentada. Además, los resultados confirman que la respuesta de tensión oxidativa de PC12 se puede utilizar como un ensayo para detectar cambios tempranos celulares debidos a_ los ADDL. El ensayo se puede llevar a cabo por coincubación o coadministración junto con los agentes de ADDL que potencialmente pueden incrementar o disminuir la formación y/o actividad de ADDL. Los resultados que se obtienen con tal coincubación o coadministración se pueden comparar con los resultados que se obtienen con la inclusión de los ADDL solos.

Ejemplo 8; Ensayo de toxicidad de tensión oxidativa MTT células HN2 Este ejemplo establece un ensayo adicional de cambios en células mediados por ADDL. Específicamente, el ensayo de toxicidad de tensión oxidativa por MTT presentado en el ejemplo precedente se lleva a cabo en células HN2 , en vez de células PC12. Se pueden utilizar otras células apropiadas de manera similar. Para este ensayo, se hacen pasar células HN2 a 4 x 104 células/pozo en una placa de cultivo de 96 pozos y se hacen crecer durante 24 horas en DMEM + suero bovino fetal 10% + S/P/F 1% (estreptomicina, penicilina y fungizona) . Las placas se tratan con 200 µg/ml de poli -1 -lisina durante 2 horas antes de la colocación en placa de las células para mejorar la adhesión celular. Las células se diferencian durante 24-48 horas con ácido retinoico 5 µM y se inhibe adicionalmente el crecimiento con suero 1%. Un conjunto de pozos se deja sin tratar y se le suministra medio fresco. Otro conjunto de pozos se trata con el control vehículo (DMSO 0.2%) . Los controles positivos se tratan con Tritón (1%) y azida de sodio (0.11%) . Se agregan a las células por 24 horas los oligómeros de amiloide ß preparados como se describe en el ejemplo 1, con o sin compuestos inhibidores presentes. Después de 24 horas de incubación, se agrega MTT (0.5 mg/ml) a las células durante 2.5 horas (11 µl de un concentrado de 5 mg/ml en 100 µl de medio) . Después de incubación con MTT, el medio se aspira y se agregan 100 µl de DMSO 100% para lisar las células y disolver los cristales azules. La placa se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lee en un lector de placa (ELISA) a 550 nm. Este ensayo se puede llevar a cabo similarmente por proincubación o coadministración junto con los agentes de los ADDL que potencialmente pueden incrementar o disminuir la formación y/o actividad de ADDL. Los resultados obtenidos con tal coincubación o coadministración se pueden comparar con los resultados que se obtienen con inclusión de los ADDL solos.

Ejemplo 9; Morfología celular por microscopía de fases Este ejemplo establece otro ensayo adicional de ensayo de cambios de células mediados por ADDL de la morfología celular por microscopía de fases . Para este ensayo, se hacen crecer cultivos a baja densidad (50-60% de confluencia) para iniciar el experimento. Las células se privan de suero en medio F12 durante 1 hora. Después las células se incuban durante 3 horas con oligómeros amiloide ß preparados como se describen en el ejemplo 1, con y sin compuestos inhibidores agregados a las células, durante 24 horas. Después de 3 horas, se examinan las células para determinar diferencias morfológicas o se fijan para marcado por inmunofluorescencia. Se examinan las muestras utilizando un sistema de análisis de imagen MetaMorph y una cámara de video MRI -(Universal Imagin, Inc.). Los resultados de tales ensayos se presentan en los ejemplos que siguen. En particular, el ensayo se puede llevar a cabo por coincubación o coadministración junto con los agentes de los ADDL que potencialmente pueden incrementar o disminuir la formación y/o actividad de ADDL. Los resultados que se obtienen con tal coincubación o coadministración se pueden comparar con los resultados que se obtienen con inclusión de los ADDL solos.

Ejemplo 10; Ensayo de exploración FACS para unión de los ADDL a superficies celulares Debido a que recientemente se han identificado receptores de superficie celular en células de glia para Aß preparado convencionalmente (Yan et al., Wature, 382, 658-691, 1996; El Khoury et al., Na ture, 382, 716-719, 1996), y debido a que la muerte neuronal a bajas dosis de ADDL sugiere una posible relación de los mecanismos de señalización, e llevaron a cabo experimentos para determinar si existen sitios de unión específicos en la superficie celular sobre las neuronas para los ADDL.

Para la citometría de flujo, las células se disocian con tripsina 0.1% y se colocan en placas por lo menos durante la noche sobre un plástico de cultivo de tejido a baja densidad. Las células se remueven con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) fría/EDTA 0.5 nM, se lavan tres veces y se resuspenden en PBS enfriado con hielo hasta una concentración final de 500,000 células/ml. Las células se incuban en PBS frío con oligómeros de amiloide ß preparados como se describe en el ejemplo 1, excepto que 10% del amiloide ß es un análogo de amilo¿Lde ß 1-42 que contiene biocitina en la posición 1 sustituyendo al aspartato. Los oligómeros con y sin compuestos inhibidores presentes se agregan a las células durante 24 horas. Las células se lavan dos veces en PBS frío para remover oligómeros amiloide ß libres, no unidos, resuspendidos en una dilución 1:1000 de avidina conjugada a fluoresceína, y se incuban durante una hora a 4°C con agitación suave. Alternativamente, se utilizan anticuerpos específicos para amiloide ß y anticuerpos secundarios fluorescentes, en vez de avidina, lo que elimina la necesidad de incorporar 10% de análogo de amiloide ß biotinado. Específicamente, se agrega anticuerpo monoclonal 6E10 biotinado (1 µl Senetec, Inc., St . Louis, Missouri) a la suspensión celular y se incuba durante 30 minutos. Se detecta el anticuerpo unido después de sedimentar las células y resuspender en 500 µl de PBS, utilizando estreptavidina conjugada con FITC (1:500 Jackson Laboratories) durante 30 minutos. Las células fueron analizadas por un explorador de células activadas de fluorescencia Becton-Dickinson (FACScan) . Típicamente se recolectaron 10,000 o 20,000 eventos tanto para la dispersión delantera (tamaño) como para la intensidad de fluorescencia, y los datos se analizaron por el elemento de programación (software) Consort 30 (Becton-Dickinson) . La unión se cuantifica al multiplicar la fluorescencia media por el número total de eventos, y sustraer el valor para la fluorescencia de células de fondo en presencia de 6E10 y FITC. Para estos experimentos, el análisis por exploración FACS se realiza para comparar la inmunorreactividad de ADDL en suspensiones en células de levadura en fase logarítmica (una superficie principalmente de carbohidratos) y de la línea de células neuronales del SNC B103 (Schubert et al., Na ture . , 249, 224-227, 1974). Para las células B103, la adición de los ADDL provoca un incremento principal en la fluorescencia asociada a las células, como se muestra en la Figura 7. El tratamiento con tripsina de las células B103 durante 1 minuto elimina la unión de ADDL. En contraste, las células de levadura control (datos no mostrados) demuestra que no hay unión de ADDL, verificando la selectividad de los ADDL por proteínas presentes en la superficie celular. Las suspensiones de células de hipocampo (tejido tripsinizado seguido por una recuperación metabólica de 2 horas) también unen los ADDL, pero con un número reducido de eventos de unión en comparación con las células B103, como se vuelve evidente por la intensidad de fluorescencia reducida del pico etiquetado. Esto aparece en la Figura 8 como un desplazamiento hacia la izquierda del pico etiquetado. Por lo tanto, estos resultados sugieren que los ADDL ejercen sus efectos al unirse a un receptor de superficie celular específico. En particular, la sensibilidad a tripsina de las células B103 muestra que sus sitios de unión ADDL son proteínas de la superficie celular y que la unión es selectiva para un subconjunto de dominios particulares dentro de estas proteínas . Además, el presente ensayo también se puede utilizar como un ensayo para unión celular mediada por ADDL. En particular, el ensayo se puede llevar a cabo por coincubación o coadministración junto con los agentes de ADDL que potencialmente pueden incrementar o disminuir la formación y/o actividad de ADDL. Los resultados obtenidos con tal coincubación o coadministración se pueden comparar con los resultados que se obtienen con la inclusión de los ADDL solos.

Ejemplo 11; Inhibición de la formación de ADDL por gosipol Este ejemplo establece la manera en el cual se puede inhibir la formación de ADDL utilizando, por ejemplo, gosipol. Para estos experimentos, se prepararon los ADDL como se describe en el ejemplo 1. Se agrega gosipol (Aldrich) a una concentración de 100 µM durante la incubación de la proteína Aß para formar los ADDL. Se determina la neurotoxicidad de la preparación resultante utilizando el equipo de ensayo LIVE/DEAD** como se ha descrito previamente. La cantidad de muerte celular que se produce después de 24 horas de exposición a la preparación de gosipol/ADDL es menor de 5%. Esto es comparable con el nivel de toxicidad que se obtiene para una preparación control correspondiente de DMSO (es decir 6%, o una preparación control de gosipol que no contiene ningún ADDL (es decir, 4%) . Por lo tanto estos resultados confirman que los compuestos tales como gosipol se pueden utilizar para inhibir la formación de ADDL.

Ejemplo 12; Inhibición de unión de ADDL por péptidos trípticos Debido a que se encontró que la tripsinización de las células B103 bloquea la unión subsecuente de _ ADDL, se realizaron experimentos como se establece en este ejemplo para probar si fragmentos trípticos liberados de la superficie celular retardan la actividad de unión de ADDL. Se preparan péptidos trípticos utilizando células B103 confluentes de 4 recipientes de 100 mm que se remueven por tripsinización (0.025%, Life Technologies) durante aproximadamente 3 minutos. Se agrega el inhibidor de tripsina-quimiotripsina (Sigma, 0.5 mg/ml en solución salina amortiguada de Hank) y se remueven las células vía centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se concentra (-12 ml) a aproximadamente 1.0 ml utilizando un filtro Centricon 3 (Amicon) y se congela después de que se determina la concentración de proteína. Para los experimentos de bloque, se agregan péptidos trípticos concentrados estériles (0.25 mg/ml) al corte de cerebro organotípico o a las células B103 suspendidas en el ensayo FAC al mismo tiempo que se agregan los ADDL. En los ensayos de exploración FACS, los péptidos trípticos liberados en el medio de cultivo (0.25 mg/ml) inhiben la unión de ADDL >90% como se muestra en la Figura 9. Por comparación, las células control expuestas a BSA, incluso a 100 mg/ml, no tienen pérdida de unión. Los péptidos trípticos, si se agregan después de que los ADDL ya estaban unidos a las células, no disminuyen significativamente las intensidades de fluorescencia. Esto indica que los péptidos no comprometen la capacidad del ensayo por cuantificar los ADDL unidos. Además de bloquear la unión de los ADDL, los péptidos trípticos también son antagonistas de la muerte celular inducida por ADDL. Específicamente, como se muestra en la Figura 9, la adición de péptidos trípticos resulta en una reducción de 75% en la muerte celular, p < 0.002. Estos datos confirman que las proteínas de superficie de célula particulares median la unión de ADDL, y que los péptidos trípticos solubilizados a partir de la superficie celular proporcionan actividad neuroprotectora, que neutraliza a los ADDL. Además, el presente ensayo también se puede utilizar para agentes que median la unión celular de ADDL o que afectan la actividad celular respecto a ADDL. En particular, el ensayo se puede llevar a cabo por coincubación o coadministración junto con los agentes de los ADDL que potencialmente pueden incrementar o disminuir la formación y/o actividad de ADDL. Los resultados que se obtienen con tal coincubación o coadministración se pueden comparar con los resultados que se obtienen con inclusión de los ADDL solos . Además, la adición de los agentes antes o después de la unión de los ADDL a la superficie celular se puede comparar para identificar agentes que alteran o inciden sobre tal unión, o que actúan después de qµe se ha producido la unión.

Ejemplo 13; Curva dosis-respuesta de unión celular de ADDL Este ejemplo establece los experimentos dosis-respuesta realizados para determinar si la unión de ADDL a superficie celular es saturable. Se esperaría tal saturabilidad si los ADDL de hecho interactuaran con un receptor particular de superficie celular. Para estos estudios, se incuban células B103 con cantidades cada vez mayores de los ADDL, y se cuantifica la unión de ADDL por análisis de exploración FACS. Los resultados se presentan en la Figura 10. Estos resultados confirman que se obtiene una meceta distinta para la unión de ADDL. La saturabilidad de unión de ADDL se produce a una concentración relativa Aß 1-42 (es decir, concentración de ADDL en relación a Aß) de aproximadamente 250 nm. Estos resultados por lo tanto confirman que la unión de ADDL es saturable. Tal capacidad de saturación o saturabilidad de la unión de ADDL, especialmente cuando se considera con los resultados de los estudios de tripsina, valida que los ADDL actúan a través de un receptor particular en la superficie de la célula.

Ejemplo 14; ELISA basado en célula para actividad de unión de ADDL Este ejemplo establece un ensayo basado en células, particularmente un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) basado en célula que se puede utilizar para determinar la actividad de unión de ADDL. Para estos estudios, 48 horas antes de llevar a cabo el experimento, se colocan 2.5 x 104 células B103 presentes como una suspensión en 100 µl de DMEM en cada pozo de ensayo de una placa de microtitulación de 96 pozos y se mantiene en una incubadora 37°C. A las 24 horas antes de llevar a cabo el experimento, se preparan los ADDL de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1. Para comenzar el ensayo, cada pozo de l placa de microtitulación que contiene células se trata con 50 µl de fijador (formalina 3.7% en DMEM) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Esta solución de fijador/DMEM se retira y se lleva a cabo un segundo tratamiento con 50 µl de formalina (sin DMEM) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se remueve el fijador y cada pozo se lava dos veces con 100 µl de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se agregan a cada pozo 200 µl de agente bloqueador (BSA 1% en PBS) y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de dos lavados con 100 µl de PBS, se agregan a los pozos apropiados 50 µl de los ADDL (previamente diluidos 1:10 en PBS) o PBS solo como un control, y los pozos resultantes se incuban a 37°C durante 1 hora. Se llevan a cabo tres lavados con 100 µl de PBS y se agregan 50 µl de anticuerpos 6E10 biotinados (Senetek) diluidos 1:1000 en BSA 1%/PBS, a los pozos apropiados. En los otros pozos, se agrega PBS como un control. Después de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotador, los pozos se lavan tres veces con 50 µl de PBS, y se agregan 50 µl de reactivo ABC (Élite ABC kit, Vector Labs) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en el rotador. Después de lavar cuatro veces con 50 µl de PBS, se agregan a cada pozo 50 µl de solución de sustrato ABTS y la placa se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente . Se analiza la placa para determinar la absorción cada _vez mayor a 405 nm. Únicamente cuando están presentes los ADDL, las células y 6E10, existe una señal significativa, como se ilustra en la Figura 11. Este resultado confirma adicionalmente que el ensayo de ELISA basado en células se puede utilizar como un ensayo de unión celular mediado por ADDL. En particular, el ensayo se puede llevar a cabo por coincubación o coadministración junto con los agentes de ADDL que potencialmente pueden incrementar o disminuir la formación y/o actividad de ADDL. Los resultados obtenidos con tal coincubación o coadministración se pueden comparar con los resultados que se obtienen con la inclusión de los ADDL solos.

Ejemplo 15; La eliminación del gen fvn cinasa protege contra la neurotoxicidad por ADDL Para investigar adicionalmente la relación potencial de la transducción de señal en la toxicidad de ADDL, los experimentos en este ejemplo compararon el impacto de los ADDL sobre los cortes de cerebro de animales isogénicos fin -/- y fin +/+. Fyn pertenece a la familia Src de proteínas tirosina cinasas, las cuales son centrales para señales y respuestas celulares múltiples (Clarke et al., Science, 268, 233-238) . Fyn es de interés particular debido a que es regulado de manera ascendente en neuronas afligidas con AD (Shirazi et al., Neuroreport, 4, 435-437, 1993) . También parece ser activado por preparaciones convencionales de Aß (Zhang et al., Neurosci , Letts . , 211, 187-190, 1996) las cuales subsecuentemente se ha demostrado que contienen los ADDL por AFM. Además, los ratones que carecen del gen Fyn tienen apoptosis reducida en el hipocampo en desarrollo (Grant et al., Science, 258, 1903-1910, 1992) . Para estos estudios, se trataron ratones carentes del gen Fyn (Grant et al., Science, 258, 1903-1910, 1992) en los ejemplos precedentes, al comparar imágenes de cortes de cerebro de ratones tratados o no tratados con los ADDL durante 24 horas para determinar las células muertas en el área DG y CA3. Se obtiene una comparación cuantitativa (presentada en la Figura 12) con barras de error que representan las medias +/-SEM (media de error estándar) para 4-7 cortes. En contraste con los cultivos de animales de tipo silvestre, los cultivos de animales fyn -/- muestran una muerte celular inducida por ADDL despreciable, como se muestra en la figura 12. Para los ADDL, el nivel de muerte celular en cortes fyn +/+ es más de cinco veces que en los cultivos fyn - / - . En cultivos fyn - / - , la muerte celular en presencia de los ADDL se encuentra a nivel de fondo. La respuesta neuroprotectora es selectiva; la muerte celular del hipocampo inducida por agonistas receptores de NMDA (Bruce et al., Exper. Neurol . , 132, 209-219, 1995; Vornov et al., Neurochem . , 56, 996-1006, 1991) no es afectada (no mostrado) . El análisis (ANOVA) utilizando la comparación múltiple de Tukey proporciona un valor de P <0.001 para los datos de ADDL fyn +/+ en comparación con todas las demás condiciones. Estos resultados confirman que la pérdida de cinasa fyn protege las regiones de hipocampo DG y CA3 de muerte celular inducida por los ADDL. Los resultados validan que la toxicidad de ADDL es mediada por un mecanismo bloqueado por eliminación del gen de la proteína tirosina cinasa Fyn . Estos resultados sugieren además que se pueden obtener beneficios neuroprotectores por tratamientos que abroguen la actividad de la proteína tirosina cinasa Fyn o la expresión del gen que codifica para la proteína cinasa Fyn .

Ejemplo 16; Experimentos de activación de astrocitos Para investigar adicionalmente la relación potencial de la transducción de señal en la toxicidad de ADDL, los experimentos en este ejemplo comparan el impacto de los ADDL sobre la activación de astrocitos. Para estos experimentos, se prepararon cultivos de astrocitos corticales a partir de ratas bebes Sprague-Dawley neonatales (1-2 días de edad) por el método de Levison y McCarthy (Levison et al., In: Banker et al. (Eds), Cul turing Nerve Cells, MIT press. Cambridge, MA. , 309-36, 1991), como se describe previamente (Hu et al., J". Biol . Chem . , 271, 2543-2547, 1996). Brevemente, se disecta la corteza cerebral, se tripziniza y las células se cultivan en a-MEM (Gibco, BRL) que contiene suero bovino fetal 10% /Hyclone Laboratories Inc., Logan UT) y antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina) . Después de 11 días de cultivo, las células se tripsinizan y se vuelven a sembrar en placas, en placas de 100 mm a una densidad de -6 x 105 células/placa y se hacen crecer hasta confluencia (Hu et al., J". Biol . Chem . , 271, 2543-2547, 1996) . Los astrocitos se tratan con los ADDL preparados de acuerdo con el ejemplo 1, o con Aß 17-42 (sintetizado como se indica por Lambert et al., J". Neurosci . Res . , 39, 377-384, 1994; también disponible comercialmente) . El tratamiento se realiza al tripsinizar cultivos confluentes de astrocitos y sembrar sobre cajas de cultivo de tejido de 60 mm a una densidad de 1 x 106 células/recipiente (por ejemplo, para análisis de ARN y de ELISA) , en placas de cámara de 4 pozos a 5 x 104 células/pozo (por ejemplo, para inmunohistoquímica) o en placas de 96 pozos a una densidad de 5 x 104 células/pozo (por ejemplo, para ensayos NO) . Después de 24 horas de incubación, las células se lavan dos veces con PBS para remover suero, y los cultivos se incuban en a-MEM que contiene suplementos N2 durante 24 horas adicionales antes de la adición de los péptidos Aß o el amortiguador control (es decir, amortiguador que contiene diluyente) . El examen de la morfología de los astrocitos se realiza al examinar las células bajo el microscopio invertido Nikon TMS equipado con una cámara Javelin SmartCam, un monitor de video Sony y una impresora de video a colores. Típicamente, se fotografían cuatro campos microscópicos seleccionados arbitrariamente (ampliación 20X) para cada condición experimental. La activación morfológica se cuantifica a partir de las fotografías con NIH Image al contar el número de células activadas (definidas como una célula con uno o. más procesos en por lo menos un cuerpo celular de longitud) en los cuatro campos . Se determinaron los niveles de ARNm en los cultivos con el uso de transferencia Northern (Northern blots) y transferencia de ranura (slot blots) . Esto se realiza al exponer las células a los ADDL o a amortiguador control durante 24 horas. Después de este tiempo, las células se lavan dos veces con PBS tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC) , y se aisla el ARN total por minicolumnas de purificación RNeasy (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) , como lo recomienda el fabricante. Los rendimientos típicos de ARN son de 8 a 30 mg de ARN total por recipiente. Para el análisis de transferencia Northern (Northern blot) , se separan 5 mg de ARN total por muestra en gel de agarosa-formaldehído, transferido por acción capilar a una membrana Hybon-N (Amersham, Arlington Heights IL) , y reticulado con UV. Para el análisis de transferencia en ranura (slot blot) , se transfieren 200 ng de ARN total por muestra sobre una membrana Duralon-UV (Stratagene, La Jolla CA) , bajo vacío y se retícula con UV. La confirmación de las cargas de ARN equivalente se realiza con tinción de bromuro de etidio o por hibridización y normalización con una sonda GAPDH. Las sondas se generan por digeridos de enzima de restricción de plásmidos, y subsecuente purificación en gel del fragmento apropiado. Específicamente, se preparan fragmentos de ADNc por RT-PCR utilizando ARN total de astrocitos corticales de rata. El ARN se somete a transcripción inversa con el sistema Superscript II (GIBCO/BRL) , y se realiza PCR en un controlador térmico PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA) utilizando 35 ciclos con los siguientes ajustes: 52°C durante 40 segundos; 72 °C durante 40 segundos; 96 °C durante 40 segundos. Los pares de cebadores utilizados para amplificar un fragmento de 447 pb de IL-lß de rata fueron: Directo: 5' GCACCTTCTTTCCCTTCATC 3' [SEC. DE IDENT. NO:l] . Inverso: 5' TGCTGATGTACCAGTTGGGG 3' [SEC. DE IDENT. NO: 2] . Los pares cebadores utilizados para amplificar un fragmento de 435 pb de GFAP de rata fueron: Directo: 5' CAGTCCTTGACCTGCGACC 3' [SEC. DE IDNET. NO: 3] . Inverso: 5' GCCTCACATCACATCCTTG 3' [SEC. DE IDENT. NO: 4] . Los productos de PCR se clonaron en el vector PCR2.1 con el equipo de clonación Invitrogen TA, y se verificaron las construcciones (constructos o plásmidos recombinantes) por secuenciado de ADN. Las sondas se prepararon por—digestión con EcoRI del vector, seguido por purificación en gel de los fragmentos apropiados . Los plásmidos eran el plásmido de ADNc de rata iNOS pAstNOS-4, que corresponde a las bases 3007-3943 de ADNc de iNOS de rata (Galea et al., J". Neurosci . Res . , 37, 406-414, 1994) , y el plásmido de ADNc GAPDH de rata, pTRI-GAPDH (Ambion, Inc., Austin TX) . Se etiquetaron sondas (25 ng) con 32P-dCTP mediante la utilización del equipo de etiquetado Prime-a-Gene Random-Prime (Promega, Madison Wl ) y se separan de nucleótidos no incorporados mediante el uso de columnas de empuje (Stratagene) . La hibridación se realizó bajo condiciones de restricción con solución QuikHyb (Stratagene) utilizando el protocolo recomendado para hibridación de restricción. brevemente, se llevó a cabo prehibridación a 68 °C durante aproximadamente 30 a 60 minutos, y la hibridación se lleva a cabo a 68°C durante aproximadamente 60 minutos. Las manchas después se lavan bajo condiciones de restricción y se exponen a autorradiografía o a placas de formación de fosfoimagen. Se exploran los autorradiogramas con un escaner láser BioRad GS-670, y se cuantifica la densidad de banda con el elemento de programación (software) de análisis de imagen Molecular Analys v2.1 (BioRad, Hercules CA) . Las fosfoimágenes se capturan en un sistema Storm 840 (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) , y se cuantifica la densidad de banda con los elementos de programación (sotware) de análisis de imagen Image Quant vi .1 (Molecular Dynamics) . Para la medición de NO por el ensayo de nitrito, las células se incuban con péptidos Aß o amortiguador control durante 48 horas y después se miden las concentraciones de nitrito en el medio acondicionado por la reacción de Griess como se ha descrito previamente (Hu et al., J". Biol . Chem . , 271, 2543-2547, 1996) . Cuando se utiliza el inhibidor de NOS éster metílico de N-nitro-L-arginina (L-name) o el isómero inactivo D-name, estos agentes se agregan a los cultivos al mismo tiempo que Aß . Los resultados de estos experimentos se presentan en la figura 13. Como se puede ver en esta figura, la activación de glia se incrementa cuando los astrocitos se incuban con los ADDL, pero no cuando los astrocitos se incuban" con Aß 17-42. Estos resultados confirman que los ADDL activan células gliales. Es posible que las proteínas de la glia puedan contribuir a deficiencias neuronales, por ejemplo como se presentan en la enfermedad de Alzheimer, y que ciertos efecto de los ADDL en realidad pueden ser mediados indirectamente por activación de las células gliales. En particular, las proteínas de la glia pueden facilitar la formación de los ADDL, o se pueden presentar efectos mediados por ADDL corriente abajo de la unión del receptor. Además, se sabe que la clusterina es regulada de manera ascendente en el cerebro de un sujeto con enfermedad de Alzheimer, y la clusterina se encuentra a niveles elevados únicamente en células de la glia que están activadas. En base en esto, la activación de las células gliales por un estímulo que no es ADDL y no amiloide, puede producir clusterina la cual a su vez puede llevar a los ADDL, lo cual, a su vez puede dañar las neuronas y provocar activación adicional de las células de la glia. Sin importar el mecanismo, estos resultados sugieren además que se pueden obtener beneficios neuroprotectores por tratamientos que modulen (es decir, que incrementen o disminuyan) la activación de las células de la glia mediada por ADDL. Además, estos resultados sugieren que el bloqueo de estos efectos sobre las células de la glia, además del bloqueo de los efectos neuronales puede ser benéfico. ___ Ej emplo 17 ; Ensayo LTP - los ADDL interrumpen la LTP La potenciación a largo plazo (LTP) es un paradigma en clásico para la plasticidad sináptica y un modelo para la memoria y el aprendizaje, facultades que se pierden selectivamente en las etapas tempranas de AD. Este ejemplo establece los experimentos realizados para examinar los efectos de los ADDL en LTP, particularmente LTP celular de granulo de trayectoria perforante media.

Inyecciones de animales intactos: Se anestesiaron ratones con uretano y se colocaron en un aparato esterotáxico .

Se mantuvo la temperatura corporal utilizando una almohadilla de recubrimiento con agua calentada. Se expuso la superficie del cerebro a través de orificios en el cráneo. Las posiciones Bregma y lambda para inyección en la capa molecular media del hipocampo se encuentran 2 mm posteriores al Bregma, 1 mm lateral a la línea media y 1.2-1.5 mm ventral a la superficie del cerebro. Las inyecciones de oligómero amiloide ß fueron con un colchón de nitrógeno a través de pipetas de vidrio de diámetro -10 nm. Se suministraron volúmenes de 20-50 ni de solución de oligómero amiloide ß (180 nm de amiloide ß en solución salina amortiguada con fosfato, PBS) durante el curso de una hora. Los ratones control recibieron un volumen equivalente de PBS solo. Se permitió que el animal reposara durante períodos de tiempo variables antes de que se suministrará el estímulo LTP (típicamente 60 minutos) .

LTP en animales inyectados: Los experimentos siguen el paradigma establecido por Routtenberg y colaboradores para LTP -en ratones (Namgung et al., Brain Research, 689, 85-92, 1995) . Se utilizó la estimulación de la trayectoria perforante para la corteza entorrinal, con registro desde la capa molecular de la línea media y el cuerpo de células del giro dentado. Se observó una población de potencial postsináptico excitador (por-EPSP) y un potencial de espiga de población (pop-espiga) ante la estimulación eléctrica. Se puede inducir LTP en estas respuestas por un estímulo de 3 entrenamientos de pulsos de 8 x 0.4 ms de 400 Hz/entrenamiento (Namgung et al., brain Research. , 689, 85-92, 1995) . Los registros se toman durante 2-3 horas después del estímulo (es decir, aplicado en tiempo 0) para determinar si se retiene LTP. Después se sacrifica de inmediato al animal, o se permite. que se recupere ya sea por 1, 3 ó 7 días, y después se sacrifica como en lo anterior. El cerebro se crioprotege con sacarosa 30% y después se secciona (30 µM) con un microtomo. Algunas secciones .o cortes se colocan en placas embebidas en gelatina y otras se analizan utilizando un protocolo de flotación libre. Se utiliza inmunohistoquimica para monitorear cambios en GAP-43, en los subtipos PKC, y en la fosforilación de proteína de tau (PHF-1) , paxilina y cinasa de adhesión focal. Se analizaron las formas de onda a máquina como se describe previamente (Colley et al., J. Neurosci . , 10, 3353-3360, 1990) . Un ANOVA de 2 colas compara los cambios en la amplitud de espiga entre grupos tratado y no tratado . La figura 14 ilustra el efecto de amplitud de espiga de los ADDL en animales completos. Como se puede ver claramente en esta figura, los ADDL bloquean la fase de persistencia de LTP inducido por los estímulos eléctricos de alta frecuencia aplicados a la corteza entorrinal y medidos como una amplitud de espiga de cuerpo celular en la capa molecular media del giro dentado. Después de que se realizan los experimentos de LTP, se permite que los animales se recuperen por tiempos diferentes y después se sacrifican utilizando anestésico pentobarbital sódico y perfusión con paraformaldehído 4%. Para estudios de viabilidad, se utilizaron tiempos de 3 horas, 24 horas, 3 días y 7 días. El cerebro se crioprotege con sacarosa 30% y después se corta (30 µM) con un microtomo. Los cortes se colocan en placas embebidas con gelatina y se tiñen inicialmente con violeta de cresilo. Se mide la pérdida de células al contar los cuerpos celulares en el giro dentado, CA3 , CAÍ, y la corteza entorrinal, y se correlaciona con la dosis y tiempo de exposición de los ADDL. Los resultados de estos experimentos confirman que no se produce muerte celular hasta por 24 horas después de los experimentos con LTP. Similarmente, se examina la respuesta LTP en cortes de hipocampo de ratas adultas jóvenes. Como se puede ver en la Figura 15, la incubación de cortes de hipocampo de rata con los ADDL evita LTP mucho antes de cualquier signo de reversión de degeneración celular. Los cortes del hipocampo (n = 6) expuestos a los ADDL 500 nM durante 45 minutos antes no muestran potenciación en las espigas de población 30 minutos después de la estimulación tetánica (amplitud media 99% +/-7.6) , pese a una capacidad continua para potenciales de acción. En contraste, se reduce LTP fácilmente en cortes incubados con vehículo (n = 6) , con una amplitud de 138% +/- 8.1 durante los últimos 10 minutos; este valor es comparable con el demostrado previamente en el grupo de esta edad (Trommer et al., Exper. Neurol . , 131, 83-92, 1995). Aunque está ausente LTP en los cortes tratados con ADDL, sus células son competentes para generar potenciales de acción y no muestran signos de degeneración . Estos resultados validan que tanto en animales completos como en cortes de tejido, la adición de los ADDL resulta en una interrupción significativa de LTP en menos de una hora, antes de cualquier degeneración o destrucción de células. Por lo tanto, estos experimentos soportan que los ADDL ejercen efectos muy tempranos, y la interferencia con la formación y/o actividad de ADDL de esta manera se puede utilizar para obtener un efecto terapéutico antes del avance de la enfermedad, trastorno o condición (por ejemplo enfermedad de Alzheimer) a una etapa en donde resulta la muerte de células. En otras palabras, estos resultados confirman que se produce una disminución en la memoria antes de que muera la neurona. La interferencia antes de tal muerte celular puede ser utilizada por lo tanto para invertir el progreso y potencialmente restablecer las disminuciones en la memoria Ejemplo 18; Efectos tempranos de los ADDL in vivo Este ejemplo establece los efectos tempranos de los ADDL in vivo y la manera que se puede manipular el conocimiento de tales efectos tempranos . Los síntomas primarios de la enfermedad de Alzheimer involucran deficiencias en el aprendizaje y la memoria. Sin embargo, ha sido difícil establecer la relación entre las deficiencias de comportamiento y los depósitos amiloides agregados. En ratones transgénicos, que sobreexpresan APP mutante bajo el control del promotor del factor de crecimiento derivado de plaquetas resulta en la deposición de grandes cantidades de amiloide (Games et al., Nature, 373, 523-527, 1995) . En contraste, no se han reportado deficiencias de comportamiento utilizando este sistema. Otros investigadores (es decir, Nalbantoglu et al., Na ture, 387, 500-509, 1997 y Holcomb et al., Na t . Med. , 4, 97-100, 1998) trabajan con un informe de ratones transgénicos y observan que se producen deficiencias de comportamiento y cognoscitivas importantes mucho antes de que se observe cualquier depósito significativo de amiloide agregado. Estos defectos comportacionales y cognoscitivos incluyen una falla para potenciar a largo plazo (?albantoglu et al., supra) . Estos modelos sugieren colectivamente que las formas no depositadas de amiloide son responsables de las deficiencias cognoscitivas y de comportamiento temprana que se producen como resultado de un mal funcionamiento neuronal inducido. Es consistente con estos modelos que los ADDL novedosos descritos en la presente En esta forma no depositada de amiloide que provoca los defectos tempranos cognoscitivos y de comportamiento. En vista de estos, los compuestos que modulan ADDL de acuerdo con la invención se pueden utilizar en el tratamiento y/o prevención de estas deficiencias tempranas cognoscitivas y de comportamiento, lo que resulta de un mal funcionamiento neuronal inducido por ADDL, o los ADDL mismos pueden ser aplicados, por ejemplo, en modelos animales para estudiar tal mal funcionamiento neuronal inducido.

Similarmente, en humanos viejos, se pueden presentar declinaciones cognoscitivas y deficiencias de memoria focal mucho antes de que se haga un diagnóstico de enfermedad de Alzheimer probable en etapa I (Linn et al., Arch. Neurol . , 52, 485-490, 1995). Estas deficiencias de memoria focal pueden resultar de señalización aberrante inducida en neuronas, en vez de muerte celular. Otras funciones, tales como las habilidades de escritura de orden superior (Snowdon et al., JAMA, 275, 528-532, 1996) también se pueden afectar por función neuronal aberrante que se presenta mucho antes de la muerte celular. Esto es consistente con lo que se sabe respecto a estos defectos, y la información respecto a los ADDL proporcionada en la presente, que los ADDL inducen estos defectos de una manera similar a la función LTP comprometida tal como la inducida por los ADDL. Además de estas líneas, los compuestos moduladores de ADDL de acuerdo con la invención se pueden utilizar en el tratamiento y/o prevención de esta declinación cognoscitiva temprana y deficiencia de memoria focal, y un daño de las habilidades de escritura de orden superior, lo que resulta de la formación o actividad de ADDL o los ADDL pueden ser aplicados por si mismos, por ejemplo, en modelos animales, para estudiar tales defectos. En particular, tales estudios se pueden llevar a cabo como es sabido por aquellos familiarizados en la técnica, por ejemplo al comparar sujetos pariados en edad, tratados o bien tratados con placebo.

La totalidad de las referencias mencionadas en la presente, incluyendo patentes, solicitudes de patente, publicaciones y similares se incorporan en este documento en su totalidad como referencia. Aunque la invención se ha descrito con énfasis respecto a las modalidades preferidas, será obvio para aquellos habitualmente familiarizados en la técnica que se pueden utilizar variaciones de las modalidades preferidas y que se entiende que la invención se puede llevar a la práctica de una manera diferente a la descrita específicamente aquí. En consecuencia, esta invención incluye todas las modificaciones abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención, como se define en las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Acumen Pharmaceuticals , Inc. et al. (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína amiloide beta, montaje globular y usos de la misma (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: McDonell Boehnen Hulbert Berghoff (B) CALLE: 300 South Wacker Drive (C) CIUDAD: Chicago (D) ESTADO: IL (E) CIUDAD: EUA (F) CP: 60606 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0 , Versión #1.30 (US) (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL (A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-FEB-1998 (C) DATOS DE CLASIFICACIÓN: (vií) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/796,089 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-FEB-1997 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO:l GCACCTTCTT TCCCTTCATC 20 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA. (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO : 2 TGCTGATGTA CCAGTTGGGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 3 CAGTCCTTGA CCTGCGACC 19 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO : 4 GCCTCACATC ACATCCTTG 19 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una estructura oligomérica amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, caracterizada porque comprende por lo menos 3 a 12 proteínas amiloide ß y la cual muestra neurotoxicidad.

2. La estructura oligomérica aislada, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la estructura oligomérica comprende una forma oligomérica que se selecciona del grupo que consiste de trímero, tetrámero, pentámero y hexámero.

3. La estructura oligomérica aislada, de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la estructura oligomérica tiene un peso molecular desde aproximadamente 26 kD hasta aproximadamente 28 kD determinado por electroforesis en gel no desnaturalizante.

4. La estructura oligomérica aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , caracterizada porque la estructura oligomérica tiene un peso molecular desde aproximadamente 22 kD hasta aproximadamente 24 kD, o desde aproximadamente 18 kD hasta aproximadamente 19 kD, determinado por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida 15%.

5. La estructura oligomérica aislada, de conformidad con- cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la estructura oligomérica comprende glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 4.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm medidos por microscopía de fuerza atómica.

6. La estructura oligomérica aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la estructura oligomérica comprende glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 4.9 nm hasta aproximadamente 5.4 nm, medidos por microscopía de fuerza atómica.

7. La estructura oligomérica aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la estructura oligomérica comprende glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 5.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm medidos por microscopía de fuerza atómica.

8. La estructura oligomérica aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 75% de la estructura oligomérica comprende glóbulos de dimensiones desde aproximadamente 4.9 nm hasta aproximadamente 5.4 nm, y dimensiones desde aproximadamente 5.7 nm hasta aproximadamente 6.2 nm, medido por microscopía de fuerza atómica.

9. Un método para determinar los efectos de una estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende: (a) administrar la estructura oligomérica al hipocampo de un animal ; (b) aplicar un estímulo eléctrico; y (c) medir la amplitud de espiga de cuerpo de célula sobre el tiempo para determinar la respuesta de potenciación a largo plazo, con la condición de que la administración de la estructura oligomérica no se realice para terapia.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la respuesta de potenciación a largo plazo del animal se compara con la respuesta de potenciación a largo plazo de otro animal tratado de la misma manera excepto que se le ha administrado solución salina en vez de la estructura oligomérica antes de la aplicación del estímulo eléctrico.

11. Un método para proteger a un animal contra disminuciones en el aprendizaje en la memoria debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende administrar un compuesto que bloquea la formación de la estructura oligomérica.

12. Un método para proteger a un animal contra disminuciones en el aprendizaje en la memoria debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende administrar un compuesto que bloquea la actividad de la estructura oligomérica que lleva a disminuciones en el aprendizaje o memoria.

13. Un método para invertir en un animal disminuciones en el aprendizaje o memoria debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende administrar un compuesto que bloquea la formación de la estructura oligomérica.

14. Un método para revertir en un animal disminuciones en el aprendizaje o memoria debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende administrar un compuesto que bloquea la actividad de la estructura oligomérica que lleva a disminuciones en el aprendizaje o memoria.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque se aplica en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición que se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down adulto y demencia senil.

16. Un método para proteger a una célula nerviosa contra disminuciones en la potenciación a largo plazo debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto que bloquea la formación de la estructura oligomérica .

17. Un método para proteger a una célula nerviosa contra disminuciones en la potenciación a largo plazo debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto que bloquea la actividad de la estructura oligomérica que lleva a disminuciones en la potenciación a largo plazo.

18. Un método para revertir en una célula nerviosa disminuciones en la potenciación a largo plazo debidas a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto que bloquea la formación de la estructura oligomérica.

19. Un método para revertir en una célula nerviosa disminuciones en la potenciación a largo plazo debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto que bloquea la actividad de la estructura oligomérica que lleva a disminuciones en la potenciación a largo plazo.

20. Un método para detectar en un material de prueba la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el material de prueba con el anticuerpo 6E10; y (b) detectar la unión a la estructura oligomérica del anticuerpo.

21. Un método para detectar en un material de prueba la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto el material de prueba con células de neuroblastoma carentes de suero; y (b) medir los cambios morfológicos en las células al comparar la morfología de las células contra células de neuroblastoma que no se han puesto en contacto con el material de prueba.

22. Un método para detectar en un material de prueba la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto el material de prueba con cultivos de corte de cerebro; y (b) medir la muerte de células de cerebro en comparación contra los cultivos de corte de cerebro que no han estado en contacto con el material de prueba.

23. Un método para detectar en un material de prueba la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto el material de prueba con células de neuroblastoma; y (b) medir los incrementos en la actividad de cinasa Fyn al comparar la actividad de cinasa Fyn en las células contra la actividad de cinasa Fyn en células de neuroblastoma que no se han puesto en contacto con el material de prueba.

24. Un método para detectar en un material de prueba la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto el material de jprueba con cultivos de astrocitos primarios; y (b) determinar la activación de los astrocitos comparados con los cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto en contacto con el material de prueba.

25. Un método para detectar en un material de prueba la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto el material de prueba con cultivos de astrocitos primarios; y (b) medir los incrementos de astrocitos en el ARNm para proteínas que se seleccionan del grupo que consiste de interleucina-1, óxido nítrico sintasa inducible, ApoE, ApoJ y al-antiquimiotripsina al comparar los niveles de ARNm en los astrocitos contra los niveles de ARNm correspondientes en los cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto en contacto con el material de prueba.

26. Un método para identificar compuestos que modulan los efectos de una estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende: (a) administrar ya sea solución salina o un compuesto de prueba al hipocampo de un animal ; (b) aplicar un estímulo eléctrico; (c) medir la amplitud de espigas del cuerpo de la célula con respecto al tiempo para determinar la respuesta de potenciación a largo plazo; y (d) comparar la respuesta de potenciación a largo plazo de animales que tienen solución salina administrada respecto a la respuesta de potenciación a largo plazo de animales a los que se les ha administrado el compuesto de prueba con la condición de que la administración de la estructura oligomérica no se realiza para terapia.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además administrar una estructura oligomérica al hipocampo ya sea antes, junto con o después de administrar solución salina o compuesto de prueba.

28. Un método para identificar compuestos que bloquean la neurotoxicidad de la estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con la estructura oligomérica ya sea en presencia o ausencia de contacto con el compuesto de prueba; (b) medir la proporción de células viables en cada cultivo; y (c) comparar la proporción de células viables en cada cultivo, con compuestos que bloquean la neurotoxicidad de la estructura oligomérica que se identifica lo que resulta en una proporción aumentada de células viables en el cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba .

29. Un método para identificar compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con la estructura oligomérica ya sea en presencia o ausencia de contacto con el compuesto de prueba; (b) agregar un reactivo que se une a la estructura oligomérica, el reactivo es fluorescente; (c) analizar los cultivos de células separados por clasificación de células activada por fluorescencia; y (c) comparar la fluorescencia de los cultivos con compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica que se identifica lo que resulta en una fluorescencia reducida del cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba .

30. Un método para identificar compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) formar la estructura oligomérica a partir de la proteína amiloide ß de manera que se vuelva una estructura oligomérica etiquetada o marcada que comprende una porción de unión capaz de unir un reactivo fluorescente; (b) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con la estructura oligomérica etiquetada ya sea en presencia o ausencia de contacto con el compuesto de prueba; (c) agregar un reactivo fluorescente que se una a la estructura oligomérica; (d) analizar cultivos de células separados por clasificación de células activado por fluorescencia; y (e) comparar la fluorescencia de los cultivos con compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica que se identifica lo que resulta en una fluorescencia reducida del cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.

31. Un método para identificar compuestos que bloquean la formación unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) preparar muestras separadas de proteína amiloide ß que han sido mezcladas o no con el compuesto de prueba; (b) formar la estructura oligomérica en muestras separadas ; (c) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas; (d) agregar un reactivo que se una a la estructura oligomérica, el reactivo es fluorescente; (e) analizar cultivos de células separados por clasificación de células activado por fluorescencia; y (f) comparar la fluorescencia de los cultivos con compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica que se identifica lo que resulta en una fluorescencia reducida del cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.

32. Un método para identificar compuestos que bloquean la formación de unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , el método está caracterizado porque comprende: (a) preparar muestras separadas de proteína amiloide ß que se han mezclado o no con el compuesto de prueba; (b) formar la estructura oligomérica en muestras separadas de manera que se vuelvan una estructura oligomérica etiquetada que comprende una porción de unión capaz de unir un reactivo fluorescente en cada una de las muestras separadas; (c) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas; (d) agregar un reactivo fluorescente que se una a la estructura oligomérica ; (e) analizar cultivos de células separados por clasificación de células activado por fluorescencia; y (f) comparar la fluorescencia de los cultivos con compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica que se identifica lo que resulta en una fluorescencia reducida del cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.

33. El método de conformidad con la reivindicación 31 ó 32, caracterizado porque la fluorescencia de los cultivos se compara adicionalmente con la fluorescencia de cultivos que han sido tratados de la misma manera excepto que en vez de agregar o no el compuesto de prueba antes de la formación de la estructura oligomérica, el compuesto de prueba se agrega o no después de la formación de la estructura oligomérica, con compuestos que bloquean la formación de la estructura oligomérica que se identifican como resultantes en una fluorescencia reducida del cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligoméripa en ausencia del compuesto de prueba, únicamente cuando el compuesto se agrega antes a la estructura oligomérica, y compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica que se identifican como resultantes en una fluorescencia reducida del cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba, cuando el compuesto de prueba se agrega ya sea antes o después de la estructura oligomérica.

34. Un método para detectar la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , el método está caracterizado porque comprende: (a) formar la estructura oligomérica a partir de proteína ß amiloide; (b) poner en contacto un cultivo de células neuronales con la estructura oligomérica; (c) agregar un anticuerpo que una la estructura oligomérica, el anticuerpo incluye una porción conjugante; (d) eliminar por lavado el anticuerpo no unido; (f) unir una enzima al anticuerpo unido a la estructura oligomérica por medio de la porción conjugante; (g) agregar un sustrato incoloro que se separa por la enzima para proporcionar un cambio de color; y (h) determinar el cambio de color como una medida de unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica .

35. Un método para identificar compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende : (a) preparar muestras separadas de proteína amiloide ß que se han mezclado o no con el compuesto de prueba; (b) formar la estructura oligomérica en las muestras separadas; (c) poner en contacto cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas; (d) agregar un anticuerpo que se une a la estructura oligomérica, el anticuerpo incluye una porción conjugante ; (e) eliminar por lavado el anticuerpo no unido; (f) unir una enzima al anticuerpo unido a la estructura oligomérica por medio de una porción conjugante; (g) agregar un sustrato incoloro que se separa por la enzima para proporcionar un cambio de color; (h) comparar el cambio de color producido por cada una de las muestras separadas, con compuestos que bloquean la formación o unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica que está siendo identificada lo que resulta en un cambio de color reducido producido por el cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el cambio de color producido por los cultivos se compara adicionalmente con el cambio de color producido por los cultivos que han sido tratados de la misma manera excepto que en vez de agregar o no el compuesto de prueba antes de la formación de la estructura oligomérica, el compuesto de prueba se agrega o no después de la formación de la estructura oligomérica, con compuestos que bloquean la formación de la estructura oligomérica que son identificados lo que resulta en un cambio de color reducido o producido por el cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba, únicamente cuando el compuesto de prueba se agrega antes de la estructura oligomérica, y compuestos que bloquean la unión de receptor de la estructura oligomérica que son identificados y que resultan en un cambio de color reducido que se produce por el cultivo en comparación con el cultivo correspondiente que se pone en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba, cuando el compuesto se agrega ya sea antes o después de la estructura oligomérica.

37. Un método para identificar compuestos que bloquean la formación de la estructura oligomérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende: (a) preparar muestras separadas de proteína amiloide ß que han sido mezcladas o no con el compuesto de prueba; (b) formar la estructura oligomérica en muestras separadas; (c) determinar si cualquier montaje de proteína se ha formado en muestras separadas utilizando un método que se selecciona del grupo que consiste de electroforesis, inmunorreconocimiento y microscopía de fuerza atómica; y (f) comparar la formación de los montajes de proteína en las muestras separadas, compuestos los cuales bloquean la formación de la estructura oligomérica que es identificada y que resulta en una formación disminuida de la estructura oligomérica en la muestra, en comparación con la muestra en la cual se ha formado la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.

38. Un método para preparar una estructura oligomérica amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende: (a) obtener una solución de proteína amiloide ß monomérica, la proteína amiloide ß es capaz de formar la estructura oligomérica; (b) diluir la solución de proteína en un medio apropiado hasta una concentración final desde aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 500 µM; (c) incubar los medios que resultan de la etapa (b) a aproximadamente 4°C durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 48 horas; (c) centrifugar la solución a aproximadamente 14,000 g a aproximadamente 4°C; y (d) recuperar el sobrenadante que resulta de la centrifugación como que contiene a la estructura oligomérica de amiloide ß.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el método comprende incubar el medio que resulta de la etapa (b) a aproximadamente 4°C en presencia de clusterina.

40. Una estructura oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, caracterizada porque se prepara de conformidad con la reivindicación 38 ó 39.

41. El uso de una estructura oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para alterar la respuesta de potenciación a largo plazo de una célula nerviosa, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con la estructura oligomérica.

42. El uso de una estructura oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , para alterar el aprendizaje o memoria de un animal, caracterizado porque comprende administrar la estructura oligomérica al animal .

43, El uso de una estructura oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , para provocar un cambio morfológico de una célula nerviosa, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con la estructura oligomérica.

44. El uso de conformidad con la reivindicación 3,-caracterizado porque el cambio morfológico incluye un efecto que se selecciona del grupo que consiste de destrucción celular, alteración de la actividad de cinasa Fyn, alteración de la localización subcelular de cinasa Fyn y alteración de los niveles o concentraciones de ARNm para proteínas que incluyen interleucina- 1, óxido nítrico sintasa inducible, ApoE, ApoJ y al-antiquimiotripsina.

45. El uso de una estructura oligómérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para provocar activación de astrocitos, caracterizado porque comprende poner en contacto el astrocito con la estructura oligomérica.

46. El uso de una estructura . oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para identificar compuestos de prueba que bloquean la neurotoxicidad de la estructura oligomérica, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula nerviosa con la estructura oligomérica y el compuesto de prueba.

47. El uso de una estructura oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , para identificar los compuestos de prueba que bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la estructura oligomérica, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula nerviosa con la estructura oligomérica y el compuesto de prueba.

48. El uso de una estructura oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para identificar compuestos de prueba que bloquean la formación de la estructura oligomérica, caracterizado porque comprende poner en contacto la proteína amiloide ß con el compuesto de prueba durante la incubación para formar la estructura oligomérica.

49. Un método para proteger células nerviosas contra señalización neuronal aberrante inducida por ADDL debido a los efectos de una estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto que bloquea la actividad de la estructura oligomérica que lleva a la señalización neuronal aberrante inducida por ADDL.

50. Un método para detectar en un material de prueba la estructura oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el material de prueba con una célula nerviosa; y (b) determinar si la célula muestra señalización neuronal aberrante inducida por ADDL.

51. El uso de una estructura oligomérica de amiloide ß no fibrilar, globular, soluble y aislada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para provocar señalización neuronal aberrante inducida por ADDL de una célula nerviosa, caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con la estructura oligomérica.