MXPA98010574A - Promotor sintetico de plantas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a elementos sintéticos para aumentar la expresión de genes en celulas de plantas. Esos incluyen un promotor con una secuencia"TATA para comenzar"que contiene 64%o más contenido de CG y un elemento corriente arriba que incorpora varios motivos de unión de OCS y secuencias flanqueantes novedosas.

Description

PROMOTOR SINTÉTICO DEL CORAZÓN DE UNA PLANTA Y ELEMENTO REGULADOR CORRIENTE ARRIBA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona de manera general con el campo de la biología molecular de las plantas y en particular con un elemento corriente arriba y secuencias promotoras sintéticas y su arreglo combinado dentro de una región promotora, de modo que se aumente la expresión de un gen. La invención permite la expresión aumentada o amplificada de los genes estructurales deseados en plantas monocotiledoneas y dicotiledóneas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La expresión de un gen abarca un número de pasos que van desde el patrón del ADN hasta el producto proteico o proteina final. El control y regulación de la expresión de un gen puede ocurrir a través de numerosos mecanismos. El inicio de la transcripción de un gen es generalmente a través del control predominante de la expresión del gen. Los controles transcripcionales (o promotores) están generalmente relegados a secuencias relativamente cortas incrustadas en la región flanqueante o corriente arriba 5' del gen transcrito. Existen secuencias de ADN las cuales afectan la expresión del gen en respuesta a estímulos ambientales, disponibilidad de REF. 29109 nutrientes o condiciones adversas incluyendo choques térmicos, anaerobiosis o la presencia de metales pesados. También existen secuencias de ADN las cuales controlan la expresión del gen durante el desarrollo o en un tejido u órgano en forma especifica. Los promotores contienen las señales para la ARN polimerasa para comenzar la transcripción, de modo que pueda producirse las síntesis de proteinas. La unión del ADN con las proteinas nucleares que interactúan específicamente con esas secuencias de ADN promotoras conocidas promueve la formación del complejo transcripcional y eventualmente inicia el proceso de expresión del gen. Uno de los motivos de secuencia más comunes presentes en los promotores de los genes transcritos por el sistema de la APJST polimerasa II (polll) eucariótica es el elemento WTATA" el cual reside corriente arriba del inicio de la transcripción. Los promotores eucarióticos son complejos y están comprendidos de componentes los cuales incluyen un bloque TATA en la secuencia de consenso en aproximadamente 35 pares de bases 5' en relación al sitio de inicio de la transcripción o sitio tapa o superior el cual se define como un +1. El motivo TATA es el sitio en donde la proteina de unión TATA (TB?) como parte del complejo de varios polipéptidos (complejo TFIID) se une e interactúa de manera productiva (directa o indirectamente) con factores unidos a otros elementos de la secuencia del promotor. Este complejo TFIID a su vez recluta el complejo de ARN polimerasa II para colocarlo para el inicio de la transcripción, generalmente 25 a 30 pares de bases corriente abajo del elemento TATA y promueve el alargamiento, produciendo de este modo moléculas de ARN. Las secuencias al rededor del inicio de la transcripción (designado como INR) de algunos genes polll parecen proporcionar un sitio de unión alternativo para factores que también reclutan miembros del complejo TFIID y de este modo ^acLivan" la transcripción. Esas secuencias INR son particularmente relevantes en los promotores que carecen de elementos TATA funcionales que proporcionan los sitios de unión del promotor del corazón o núcleo de la planta para la transcripción eventual. Se ha propuesto que los promotores que contienen un motivo TATA e INR funcional son los más eficientes en la actividad transcripcional. (Zenzie-Gregory et al, 1992. J. Biol. Chem. 267:2823-2830). En la raayoria de los casos se requieren elementos de secuencia diferentes del motivo TATA para una transcripción exacta. Tales elementos se localizan con frecuencia corriente arriba del motivo TATA y un subconjunto puede tener homología con la secuencia de consenso CCAAT.

Se ha encontrado que otras secuencias de ADN elevan el nivel total de expresión de genes cercanos. Uno de los elementos más ccmúnes que han sido descritos reside lejos corriente arriba del sitio de inicio y parece exhibir caracteristicas de posición y orientación independientes. ?sos elementos corriente arriba han sido designados como amplificadores. Uno de los elementos menos comunes en virtud de sus especificidades son las secuencias que interactúan con factores de unión de ADN específicos. Esos motivos de secuencia son conocidos colectivamente como elementos corriente arriba los cuales usualmente dependen de su posición y orientación. Han sido identificados muchos elementos corriente arriba en un número de promotores de planta basados inicialmente en la función y el segundo lugar sobre homologías de secuencia. Esos elementos promotores corriente arriba fluctúan ampliamente en el tipo de control: desde respuestas ambientales tales como la temperatura, humedad, hirientes, etc., señales desarrollisticas, (germinación, maduración de la semilla, floración, etc.) hasta información espacial (especificidad del tejido). Esos elementos también parecen exhibir odularidad dado que pueden ser intercambiados con otros elementos manteniendo a la vez su control característico sobre la expresión del gen. Los promotores usualmente se encuentran 5' o corriente arriba en relación al inicio de la región codificadora del gen correspondiente, y toda la región que contiene todos los elementos auxiliares que afectan la regulación o niveles absolutos de transcripción pueden estar comprendidos de menos de 100 pares de bases o a lo mucho de 1 par de kilobases. Han sido descritos en la literatura numerosos promotores, los cuales son activos en células de plantas. Esos incluyen a los promotores de nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS) (los cuales se encuentran en plásmidos inductores de tumores de Agrobacteri um tumefaciens) . También están incluidos los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) , el promotor fotoinducible de la subunidad pequeña de la bifosfato de ribulosa carboxilasa (ssRUBICSO, un polipéptido muy abundante en las plantas) , y el promotor de la sucrosa sintasa. Los promotores para utilizarse en las plantas también se describen en EP-A-0 459 643; WO-A-95 14098; y EP-A-0 342 926. Todos esos promotores han sido utilizados para crear varios tipos de constructos de ADN, los cuales han sido expresados en plantas. (Véase por ejemplo la publicación PCT WO84/02913 de Rogers et al . ) .

Los dos promotores que han sido ampliamente utilizados en transformaciones de células de plantas son aquéllos de los genes que codifican para la alcohol deshidrogenasa, Adhl y AdhlI. Ambos genes se inducen después del inicio de la anaerobiosis . El Adhl del maiz ha sido clonado y secuenciado como lo ha sido el AdhlI. La formación de un gen quimérico de Adhl, Adh-CAT que comprende el promotor Adhl se liga a las secuencias codificadoras de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y la señal 3' de la nopalina sintasa (NOS) que hace que la expresión de la CAT sea aproximadamente 4 veces más alta a bajas concentraciones de oxigeno que bajo condiciones control. También han sido identificados los elementos de secuencia necesarios para la inducción del Adh-CAT quimérico. La existencia de un elemento regulador anaerobio (ARE) entre las posiciones -140 y -99 del promotor Adhl del maiz compuesto de al menos dos elementos de secuencia en las posiciones -133 a -124 y las posiciones -113 a 99 ambas de las cuales se ha encontrado son necesarias y son suficientes para la expresión de la actividad del gen Adh-CAT a bajos niveles de oxigeno. El promotor Adh sin embargo responde a la anaerobiosis y no es un promotor constitutivo que limite drásticamente su efectividad. Otro promotor comúnmente utilizado es el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor. El promotor 35S (CaMV) es un promotor de virus de dicotiledóneas que sin embargo dirige la expresión de los genes introducidos en el protoplasma de dicotiledóneas y monocotiledóneas. El promotor 35S es un promotor muy fuerte y es considerable por su uso ampliamente difundido por el alto nivel de expresión de rasgos o características en plantas transgénicas. El promotor CaMV35S sin embargo también ha demostrado una actividad relativamente baja en varias plantas gramíneas de importancia agrícola tal como el trigo. Aunque todos estos promotores dan una alta expresión en dicotiledóneas, ninguno da los altos niveles de expresión en monocotiledóneas. Existe la necesidad de promotores sintéticos y otros elementos que induzcan la expresión en células de los protoplastos de monocotiledóneas transformadas. El objetivo principal de esta invención es proporcionar elementos reguladores sintéticos que fomenten la expresión de genes inducidos en células de plantas y tejidos de plantas. Otro objetivo de esta invención es proporcionar una molécula promotora recombinante que proporcione niveles altamente confiables de expresión de los genes introducidos en células objetivo.

Otro objetivo más de esta invención es proporcionar elementos amplificadores corriente arriba que puedan estimular aún más la actividad de cualquier promotor. Otro objetivo más de esta invención es proporcionar plantas, célulae de plantas y tejidos de plantas que contengan cualquiera o ambos del promotor recombinante o elemento corriente arriba de la invención. Otro objetivo más de la invención es proporcionar vehículos para la transformación de células de plantas incluyendo vectores virales o plasmídicos y casetes de expresión que incorporan el promotor sintético de elementos corriente arriba de la invención. Otro objetivo más de la invención es proporcionar células de bact3rias que comprendan tales vectores para el mantenimiento, reproducción y transformación de la planta. Los otros objetivos de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona una molécula sintética promotora del corazón o núcleo y el elemento corriente arriba que permitirá que aquellos expertos en la técnica obtengan niveles altamente confiables de expresión de genes estructurales introducidos en células objetivo. El promotor del corazón o núcleo comprende un bloque TATA y un inicio de la transcripción. Además, la región 'TATA para comenzar" es 64% o más rica en GC. Una modalidad es mostrada en la SEQ ID N0:1. También se describe un elemento corriente arriba novedoso, SEQ ID NO : 2 que ayuda a potenciar la transcripción. El promotor sintético del corazón o núcleo puede ser utilizado con combinaciones de secuencias de los elementos amplificador y/o corriente arriba de las regiones flanquentes 5' de los genes estructurales expresables por la planta. De manera similar el elemento corriente arriba puede ser utilizado en combinación con varias secuencias promotoras del corazón o núcleo de varias plantas. En una modalidad preferida el promotor del corazón o núcleo y el elemento corriente arriba se utilizan juntos para obtener una expresión diez veces mayor de un gen marcador introducido en plantas monocotiledóneas transgénicas obtenidas con el promotor de ubiquitina 1 del maíz. El pro'uotor del corazón o núcleo comprende un motivo TATA y una región *TATA para el inicio de la transcripción"' rica en GC (64% o más del contenido de GC que en los promotores de animal es tradicionalmente característico) • La secuencia se colocó en 5' de un gen estructural y promoverá la expresión constitutiva no específica del tejido en células de plantas transgénicas. La invención también comprende un cásete de expresión que comprende (el elemento corriente arriba) el promotor sintético del corazón o núcleo de una planta, un gen estructural, la expresión del cual se desea en células de plantas, y una señal de poliadenilación o alto. El cásete de expresión puede ser abarcado por el plásmido o vectores virales para la Transformación de células de protoplastos de plantas. La invención también abarca células de bacteria transformadas para el mantenimiento y reproducción del vector, asi como células de monocotiledóneas o dicotiledóneas transformadas y finalmente plantas transgénicas. En otra modalidad, la invención abarca un elemento corriente arriba que puede ser utilizado en combinación con el promotor sintético o con otros promotores conocidos en la técnica. El elemento corriente arriba comprende al menos 3 motivos de unión de OCS (TGACG) con una secuencia interventora novedosa. Una modalidad se describe en la SEQ ID NO: 2 y se colocó 5' a una secuencia promotora del corazón o núcleo para aumentar los niveles de transcripción del producto del gen resultante. De este modo la invención comprende un cásete de expresión que comprende el elemento sintético corriente arriba de la invención, 5' al promotor inducible de la planta el cual es 5' a un gen estructural. Este cásete de expresión puede ser incorporado en vectores y plásmidos como se describió al principio. En una modalidad preferida el elemento sintético corriente arriba se utilizó en combinación con la secuencia sintética promotora del corazón o núcleo para lograr la expresión constitutiva no específica del tejido del producto del gen, la cual es diez veces más grande que la del promotor ubil del maíz.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una descripción de un arreglo de bases nucleotídicas pico de un promotor del corazón o núcleo que contiene las secuencias de consenso de los motivos TATA e INR presentes en los promotores de plantas. A designa +1 de la región transcrita. La Figura 2 es una descripción de la Secuencia Promotora del Corazón o Núcleo Syn II con un ejemplo de un promotor de planta y ambas están alineadas en el inicio principal de la transcripción (negrillas) . El motivo TATA está subrayado. El promotor CaMV 35S se muestra con porcentajes de GC que contienen las secuencias mostrado entre paréntesis .

La Figura 3 es una secuencia de ADN del elemento corriente arriba Rsyn7. Los motivos TGACG están indicados en negrillas . La Figura 4 es un mapa del plásmido de una modalidad de la invención que comprende el promotor del Corazón o Núcleo Syn II y los elementos Rsyn7 que dirigen un constructo que contiene GUS. La Figura 5 describe varios esquemas de promotores sintéticos de acuerdo a la presente invención probados en transformantes transitorios y estables. La Figura 6 es una descripción de los datos del ensayo transitorio utilizando los plásmidos que incorporan las secuencias promotoras de la invención. La Figura 7(A). Es la actividad de Rsyn7::GUS (6086) en plantas de maíz TO. La Figura 7 (B) es un esquema de plantas de maíz en etapa VT con sitios de muestras de tejido indicados. La Figura 8 describe la actividad de la GUS en segmentos de raíz de una población segregante de semilleros transgénicos de maíz TI que contienen el constructo Rsyn7::GUS (6086) o el UBI: GUS (3953). La Figura 9 describe la expresión de la GUS de tres promotores sintéticos en plantas transgénicas de maíz TO que incluyen las secuencias promotoras de la invención como comparación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la descripción siguiente se utilizaron numerosos términos de manera extensiva. Se proporcionan las siguientes definiciones para eliminar ambigüedades sobre lo pretendido o - el alcance de su uso en la especificación y reivindicaciones para fat. litar la comprensión de la invención. Un gen estructural es una secuencia de ADN que se transcribió en ARN mensajero (ARNm), el cual es entonces traducido en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido especifico. Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente un promotor se localiza en la región 5' de un gen, próximo al sitio de inicio transcripcional de un gen estructural. Un promotor del corazón o núcleo o promotor mínimo contiene las secuencias nucleotídicas esenciales para el funcionamiento apropiado, incluyendo el bloque TATA e inicio de la transcripción. Por esta definición, un promotor del corazón o núcleo puede o no tener actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden aumentar la actividad o conferir actividad específica a un tejido. Por ejemplo, el promotor del corazón o núcleo del maíz consiste de aproximadamente entre 37 nucleótidos 5' del sitio de inicio de la transcripción del gen SGB6, mientras que el promotor del corazón o núcleo 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) consiste de aproximadamente 33 nucleótidos 5' del sitio de inicio de la transcripción del genoma 35S. ADH se refiere generalmente al gen de la alcohol deshidrogenasa expresable en plantas y específicamente al gen de la alcohol deshidrogenasa del maíz. El promotor ADH 1 se refiere al fragmento de ADN que abarca la región entre las posiciones de los nucleótidos de aproximadamente de -1094 hasta aproximadamente -106 del gen de la alcohol deshídrogenasa 1 del maíz, o el fragmento homólogo que es funcionalmente equivalente. La secuencia se numeró con el sitio de inicio de la transcripción designado como +1 de acuerdo a la corrección publicada por Ellis et al., (1987) supra. TATA para comenzar" significará la secuencia entre el motivo TATA y el inicio de la transcripción. Un ADN sintético es una secuencia de ADN creado artificialmente que no se produce de manera natural, y debe introducirse un organismo o un ancestro de ese organismo para controlar o para ser expresado.

El elemento OCS se refiere al motivo TGACG identificado del gen de la octopina sintasa, genes de histona, genes de enzima para la biosíntesis de agropina, el gen de la manopir-a sintasa, el gen 35S del CaMV, el gen de la histona H3 y el gen de la nopalina sintasa. Como se utiliza aquí el término incluye cualquier secuencia capaz de unirse al factor ASF-1 identificado en la Patente Estadounidense No. 4,990,607 de Katagiri, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia. Un amplificador es un elemento regulador del ADN que puede incrementar la eficiencia de la transcripción sin importar la distancia u orientación del amplificador en relación al sitie de inicio de la transcripción. El término expresión se refiere a la biosíntesis de un producto genético. En el caso de un gen estructural, la transcripción involucra el gen estructural en el ARNm y por lo tanto la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos. Un vector de clonación es una molécula de ADN tal como un plásmido, cósmido o fago bacteriano que tiene la capacidad de reproducirse autónomamente en una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en los cuales pueden insertarse secuencias de ADN externas en una forma determinable sin pérdida de la función biológica esencial del vector, así como un gen marcador que es adecuado para utilizarse en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina, resistencia a la higromicina o resistencia a la ampicilina. Un vector de expresión es una molécula de ADN que comprende el gen que es expresado en una célula huésped. Típicamente la expresión del gen se coloca bajo el control de ciertos elementos reguladores incluyendo promotores, elementos reguladores específicos de un tejido, y amplificadores. Se dice que tal gen está "ligado operablemente a" los elementos reguladores. Un huésped recombinante puede ser cualquier células procariótica o eucariótica que contenga un vector de clonación o un vector de expresión. Este término también incluye a aquellas células procarióticas o eucarióticas que han sido diseñadas genéticamente para que contengan los genes clonados en el cromosoma o genoma de la células huésped. Una planta transgénica es una planta que tiene una o más células de planta que contienen un vector de expresión.

Deberá comprenderse que pueden existir variaciones de secuencia menores dentro de la secuencia o fragmentos utilizados o descritos en esta solicitud. Esas variaciones pueden ser determinadas por técnicas estándar para permitir a aquellos expertos en la técnica manipular y dar utilidad a las unidades funcionales de los elementos promotores necesarios para dirigir el inicio de la transcripción' en el gen estructural seguida por una señal de terminación de la transcripción (y quizá poliadenilación) expresable en la planta. El tejido de la planta incluye tejidos o plantas diferenciadas y no diferenciadas, incluyendo pero sin limitarse a las raíces, tallos, yemas, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y varias formas de células y cultivos tales como células solas, protoplastos, embriones y tejido de callo. El tejido de la planta puede estar en la planta o en un órgano, cultivos de tejido o células. El promotor de la invención como se observa en la SEQ ID N0:1 y/o SEQ ID NO: 2, puede ser utilizada para obtener altos niveles de expresión de genes estructurales. De manera similar el elemento corriente arriba de la invención (SEQ ID NO: 2) puede ser utilizado en combinación con otros promotores o el promotor de la invención para potenciar los niveles de transcripción en plantas modificadas genéticamente. La producción de un tejido de planta modificado genéticamente que expresa un gen estructural bajo el control de los elementos reguladores de la invención combinan las enseñanzas de la presente descripción con una variedad de técnicas y expedientes conocidos en la técnica. En la mayoría de los casos existen expedientes alternativos para cada etapa del proceso total. La elección de los expedientes depende de variables tales como el sistema del vector plasmídico elegido para la clonación e introducción de la molécula de ADN recombinante, la especie de planta a ser modificada, el gen estructural particular, los elementos promotores y elementos corriente arriba utilizados. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar y utilizar las alternativas apropiadas para lograr la funcionalidad. Las condiciones de cultivo para expresar los genes estructurales deseados y las células cultivadas son conocidas en la técnica. También se conocen en la técnica numerosas especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas transformables y regenerables de modo que todas las plantas contengan y expresen los genes deseados bajo el control regulador de las moléculas promotoras y puedan obtenerse los elementos corriente arriba de la invención. Como es sabido por aquellos expertos en la técnica, la expresión en plantas transformadas puede ser específicas para los tejidos y/o específicas para ciertas etapas del desarrollo. La selección del promotor truncado y la selección del gen estructural son otros parámetros que pueden ser optimizados para lograr la expresión de la planta deseada como es sabido por aquellos expertos en la técnica y como se enseña aquí. La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del método de introducción del vector de expresión en las células huésped. Típicamente un vector de expresión contiene (1) elementos de ADN procariótico que codifican para un origen de reproducción bacteriana y un marcador de resistencia a un antibiótico para proporcionar el crecimiento y selección del vector de expresión en una célula bacteriana; (2) elementos de ADN que controlan el inicio de la transcripción tales como un promotor; (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de transcriptos tales como la terminación de la transcripcíón/poliadenilación; y (4) un gen reportero que está ligado de manera operativa a los elementos de ADN para controlar el inicio de la transcripción. Los genes reporteros útiles incluyen a la ß-glucoronidasa, ß-galactosidasa, cloranfenicol, acetil transferasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP) y similares. De manera preferible el gen reportero es cualquiera de la ß-glucoronidasa, (GUS) , GFP o luciferasa. Las descripciones generales de vectores de expresión y genes reporteros de plantas pueden encontrarse en Gruber et al., 'Vectors for Plant Transformation, en Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology" en Glinch et al., (Eds. pp. 89-119, CRC Press, 1993) . Además los vectores de expresión de la GUS y los casetes del gen de la GUS están disponibles de Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, California mientras que los vectores de expresión de luciferasa y los casetes del gen de la luciferasa están disponibles de Promega Corp. (Madison, Wisconsin) . Los vectores de expresión que contienen fragmentos genómicos o sintéticos pueden ser introducidos en los protoplastos o en tejidos intactos o células aisladas. De manera preferible los vectores de expresión se introducen en tejido intacto. Los métodos generales para cultivar tejidos de plantas se proporcionan por ejemplo en Maki et al., ?Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al., (Eds. pp . 67-88 CRC Press, 1993); y por Phillips et al., "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" en Corn & Corn Improvement, 3RA Edición Sprague et al., (Eds. pp. 345-387) American Society of Agrono y Inc. et al. 1988. Los métodos para introducir vectores de expresión en tejidos de plantas incluyen la infección directa o el cocultivo de células de planta con Agrobacteri um. turne faciens, Horsch et al., Science, 227:1229 (1985). Las descripciones de sistemas de vectores y métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber et al. supra. De manera preferible, los vectores de expresión se introducen en maíz u otros tejidos de plantas utilizando el método de transferencia genética directa tal como la liberación mediada por microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y similares. De manera más preferible los vectores de expresión se introducen en tejidos de plantas utilizando la liberación por medio de microproyectiles con un dispositivo balístico. Los vectores de la invención únicamente pueden ser utilizados para la expresión de genes estructurales pero también pueden ser utilizados para la clonación de trampas de exones, o procedimientos para atrapar promotores para detectar la expresión diferencial de genes en variedades de tejidos, K. Lindsey et al., 1993 "Tagging Genomic Sequences That Direct Transgene Expression by Activation of a Promotor Trap in Plants", Transgenic Research 2:33-47. D. Auch & Reth, et al., "Exon Trap Cloning: Using PCR elastomérica Rapidly Detect and Clone Exons from Genomic DNA Fragments" Nuclic Acids Research, Vol. 18, No. 22, p. 6743. Este promotor de la invención se basó en parte del descubrimiento de que la región "TATA para comenzar" rica en GC en una planta actúa como promotor del corazón o núcleo específico del tejido muy fuerte que induce la expresión constitutiva en células de plantas. El elemento TATA de los promotores de planta de los genes polIII generalmente tienen la secuencia TATA(A/T)A(A/T)A, SEQ ID NO: 3 mientras que el consenso del inicio de la transcripción consiste de la secuencia 5' ...TYYTCAT (A/C)AA...3' . SEQ ID NO: 3, en donde A designa la base de partida para la transcripción. La secuencia promotora de planta típica se describe en la Figura 1. Se ha demostrado que las secuencias que intervienen en el elemento TATA y el inicio de la transcripción juegan un papel significativo en la eficiencia de la activación transcripcional. Se ha demostrado que la proteína de unión TATA interactúa como una ranura menor de la unión de la doble hélice del motivo TATA doblando éste hacia el lado de la ranura mayor (Kim, et al., 1993, Nature, 365:512-520). De este modo a continuación las secuencias corriente abajo del motivo TATA que tienen impacto sobre este descubrimiento afectarán la eficiencia de la formación del complejo transcripcional estable y finalmente la expresión. Estudios de las regiones "TATA para comenzar" de promotores de plantas muestran un nivel significativamente más alto de secuencias en AT que conducen a la compresión potencial de la ranura menor (Yaurawaj et al., Biologícal Anstracts Vol. 47, Issue 8, Ref. 144712 "Consensus Sequences for Plant Mini al Pro oters" Annual Meeting of the American Society of Plant Physiologists, Julio 29-Agosto 2, 1995, Plant Physilogy 108 [2 Supp.] 1994, 114) . De manera general los promotores de animales muestran una secuencia 'TATA para comenzar" ricas en GC que conducen a una compresión de la ranura mayor, lo que sugiere que los complejos transcripcionales del promotor del corazón o núcleo de plantas y animales promedio reconoce e interactúan con un TATA un tanto diferente para comenzar la estructura con la diferencia de secuencia correspondiente. De manera muy sorprendente el solicitante ha encontrado que los promotores sintéticos de tipo animal ricos en GC trabajan muy bien en plantas . Aunque no se desea unirse a ninguna teoría, es posible que el motivo de TATA rico en AT presente en una secuencia rica en GC pueda presentarse por sí mismo de manera más prominente al complejo de unión de TATA por medio de una demarcación fina de la secuencia TATA de rica en GC a rica en AT. El motivo de TATA 'unido" podría interactuar más estrechamente con el complejo de unión de TATA. Esto podría mejorar la eficiencia del inicio de la transcripción, desviando el equilibrio de unión hacia una forma más estabilizada, mientras que la versión 'no unida", es decir que tiene más secuencia rica en AT en lugar de flanquear el motivo de TATA, podría potencialmente deslizarse o desviarse hacia abajo y reducir efectivamente la eficiencia de unión. Están disponibles pocos datos relacionados con esta región de los promotores de plantas excepto las supresiones crudas 'y algunas fluctuaciones puntuales. El diseño obvio de un promotor sintético del corazón o núcleo para la expresión de una planta podría incluir la secuencia 'TATA para comenzar" rica en AT. Sin embargo, en base al mecanismo 'unido", se postuló por el mecanismo de la invención que podría estar presente un promotor del corazón o núcleo más eficiente en un motivo de TATA incluido en una secuencia rica en GC. La Figura 2 describe la secuencia promotora del corazón o núcleo Syn II, SEQ ID NO:l de la invención con ejemplos de promotores del corazón o núcleo de la planta alineados con e.-. inicio mayor da la transcripción. Otro ejemplo de un promotor de planta 35S de CaMV (SEQ ID NO: 4) se muestra con el por ciento de secuencias ricas en GC mostrado al lado derecho entre paréntesis. La secuencia del corazón o núcleo Syn II no muestra ninguna homología de secuencia significativa con las secuencias en la base de datos pública. La secuencia sintética promotora .del Corazón o Núcleo Syn II muestra una secuencia 'TATA para comenzar" rica en GC en un 64% diferente a la secuencia rica en GC en un 40% del total presente en los promotores de plantas tradicionales (CaMV35S por ejemplo) . El promotor de corazón o núcleo UBI natural y aislado que potencia niveles muy altos de actividad muestra una secuencia 'TATA para comenzar" rica en GC en un 64% más similar a los promotores de animales. Tales ejemplos proporcionaron el ímpetu para diseñar una secuencia de 'TATA para comenzar" muy rica en GC para la transcripción eficiente en oposición al dogma actual de los promotores del corazón o núcleo de la planta. De este modo la invención comprende una secuencia sintética promotora del corazón o núcleo de la planta sintética que comprende un motivo TATA y una región 'TATA para comenzar" que es 64% más rica en GC. En una modalidad preferida el promotor puede incluir sitios objetivo de endonucleótidos de restricción para facilitar la clonación. En una modalidad más preferida la secuencia es la de la SEQ ID NO:l. Como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, pueden ocurrir varias transversiones de base dentro de la SEQ ID N0:1 las cuales mantendrán el por ciento del contenido de GC y que se pretende estén dentro del alcance de esta invención. La SEQ ID NO: 10. Por ejemplo las guaninas podrían ser reemplazadas con citosinas y viceversa sin afectar la eficacia total de promotor, en tanto el por ciento del contenido de GC se mantenga.

En otra modalidad, la invención comprende un elemento sintético corriente arriba colocado 5' a cualquier promotor natural o sintético para utilizarse en plantas, particularmente en la expresión . genética en el maíz. A partir de la actividad de numerosos promotores, han sido definidos elementos básicos (sitios de unión) . Esos incluyen por ejemplo regiones ricas en AT de promotores del choque cardiaco, y elementos del sitio de unión de ASF-1 (AS-1) presentes en la octopina sintasa (OCS) y promotores del Virus del Mosaico de la Coliflor. El AS-1 es uno de los elementos corriente arriba mejor conocidos y su secuencia de unión (elemento OCS) está presente en muchos promotores constitutivos de las plantas tales como el CaMV35S, A. tumefaciens, promotores de histona de trigo NOS y OCS. El elemento OCS fue aislado por primera vez como un elemento amplificador en el promotor del gen OCS en donde se identifico como una secuencia palindrómica de 16 pares de bases (Ellis et al-, 1987 MBOJ 6:11-16), pero ha sido reducido a sus características esenciales como un motivo TGACG. Véase la Patente Estadounidense No. 4,990,607 de Katagiri anteriormente incorporada aquí como referencia. El elemento corriente arriba de la invención tiene una homología del 71% con el elemento amplificador descrito en la Patente Estadounidense No. 5,023,179 de Lam et al. Las dos secuencias son muy diferentes en sus secuencias flanqueantes que rodean el motivo TGACG, regiones las cuales han mostrado tener impacto sobre los niveles de amplificación de la transcripción. La actividad amplificadora o mejoradora de la transcripción dei elemento OCS se correlacionó con la unión in-vitro de un factor transcripcional. También se identificaron elementos similares en las regiones promotoras de otros seis genes de ADNc involucrados en la síntesis de opina y tres promotores virales de plantas incluyendo al promotor 35S de CaMV (Bouchez et al. 1989) supra. Esos elementos mostraron unirse al factor de transcripción OCS in vi tro y aumentar la transcripción en células de planta. En el tabaco un factor de unión de ADN TGA1 mostró interactuar específicamente con el elemento AS-1 solo o en conjunto con otros elementos promotores. Katagiri et al. 1989, Nature 340:727-730. Este factor también mostró expresarse de manera preferida en la raíz de plantas de tabaco. Los promotores del corazón o núcleo con una o dos copias del elemento corriente arriba OCS tienden a potenciar la expresión del gen mientras que 4 o más repeticiones del este elemento producen más o menos actividad constitutiva aunque relativamente baja para interactuar con los promotores 35S.

De este modo la invención incorpora un elemento sintético corriente arriba el cual puede ser utilizado con el promotor del corazón o núcleo de la invención u otros promotores del corazón o núcleo para aumentar la expresión del gen. El elemento incorpora tres motivos similares al OCS y secuencias interventoras novedosas las cuales potencian la expresión de un gen. La Figura 3, SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia completa de una modalidad (Rsyn7) del elemento sintético corriente arriba el cual incorpora al menos tres motivos similares al OSC, SEQ ID NO: 5, TGACG, los cuales se indican en negrillas. Las secuencias que flaquean muchos elementos tales como el motivo de las SEQ ID NO: 5 TGACG ha mostrado tener profundos impactos sobre las afinidades de unión de los factores de unión de ADN y de este modo juegan un papel tan importante como el de los motivos' centrales en sí. (Burrows et al. 1992, Plant Molecular Biology 19:665-675, Shindler et al. 1992, Plant Cell 4:1309-1319, Foster et al. 1994, FASEBJ 8:192-200). Han sido determinadas las secuencias novedosas que flaquean los motivos TGACG en el promotor Rsyn7 se ha determinado y establecido un aumento claro de la actividad transcripcional con varios promotores, particularmente cuando se utilizan con el promotor del Corazón o Núcleo Syn II.

El elemento corriente arriba Rsyn7 ha sido clonado corriente arriba del promotor del Corazón o Núcleo GUS dirigiendo un constructo de GUS y hapotenciado los niveles de actividad de la GUS en plantas transgénicas de maíz aproximadamente diez veces más que el promotor de ubiquitina, el promotor de maíz más fuerte a la fecha. Los siguientes ejemplos son para propósitos de ilustración únicamente y se pretende que no limiten de ninguna manera el alcance o aplicación de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que pueden lograrse muchas permutaciones y de hecho se pretende que éstas estén dentro del alcance de la invención. Todas las referencias y citas a través de la especificación se incorporan aquí como referencia expresamente.

EJEMPLO 1 Se diseñaron plásmidos utilizando el sitio de clonación múltiple de pBlueScriptIIKS+ de Stratagene. (Para facilitar la clonación de la combinación diferente de elementos) . Los cligonucleótidos que contiene la secuencia de los elementos se sintetizaron con sitios de endonucleasa de restricción en los extremos. De este modo los elementos pudieron ser agregados o removidos y reemplazados según fuese necesario. La GUS y la Luciferasa se utilizaron para los genes reporteros . Para los ensayos transitorios se introdujo ADN plasmídico en semilleros de maíz de 3 días intactos por bombardeo de partículas. Después de 16 horas de incubación a 25°C en la obscuridad, se ensayó la expresión midiendo la actividad enzimática de la GUS en extractos de raíz y brote de cada semillero para determinar si podía demostrarse cualquier expresión preferida en tejidos. La actividad de la GUS se midió utilizando un equipo de ensayo con luz para la GUS de Tropix (47 Wiggins Avenue, Bedford, MA 01730) . Se introdujeron constructos que dan altos niveles de expresión en una línea celular para producir transformantes estables. Esos transformantes estables (TO) se ensayaron por PCR para determinara la presencia del gen de la GUS por ensayo de MUG (4-metilumbeliferil-glucuronido) para cuantificar el nivel de actividad de la proteína GUS que está producida. Cuando las plantas estuvieron listas para ser transferidas al invernadero fueron ensayadas histoquímicamente con X-gluc para determinar en donde comenzó a sintetizarse el producto de la GUS. Las plantas que demostraron niveles de expresión preferidos crecieron en el invernadero hasta la etapa V6.

EJEMPLO 2 Construcción de Plásmidos que Contienen el Promotor de Corazón o Núsleo Syn II Se llevaron a cabo las técnicas de biología molecular estándar de acuerdo a Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. Todos los plásmidos utilizados en la invención pueden ser preparados de acuerdo a las directrices de la especificación por un experto en la técnica sin experimentación indebida empleando los materiales ya disponibles en la técnica. Se sintetizaron los oligos N306 SEQ ID NO: 6 TCGACACTGC AGCTCTAGGG ATGGTAGCGC AGGGTCGCGTA GGACGTATT TATAGCCGCT CGAGTG-3' y N307 SEQ ID NO: 7 GATCCACTCG AGCGGCTATA AATACGTACC TACGACCCT GCGCTACCAT CCCTAGAGCT GCAGTG-3' de acuerdo a las directrices en un sintetizador de ADN automatizado (tal como el Sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc. (Modelo 380B) . Esos sintetizadores automatizados están comercialmente disponibles. Los oligos fueron entonces ligados al fragmento BamHI del plásmido pBlueScriptlIKSt que comprende el gen de la ß-glucuronidasa interrumpido por la región intrónica del intrón 1 ADH1 del maíz. Un mapa de un plásmido que incorpora ambos promotores del corazón o núcleo Syn II y el elemento corriente arriba se describe en la Figura 4. Varias otras modalidades se muestran en otros plásmidos descritos en la Figura 5. Los números de los plásmidos se muestran a la derecha de cada diagrama del promotor con la leyenda correspondiente colocada debajo de los diagramas. El diagrama superior muestra la unidad transcripcional de transplante completa con los diagramas siguientes enfocándose sobre las diferencias sobresalientes entre los promotores del Corazón o núcleo del 35S y el Syn II. La leyenda muestra el número y naturaleza de los diferentes subelementos del promotor, la secuencia si es relativamente corta, ia fuente del elemento y la posición en relación al sitio de la transcripción. La secuencia del promotor del corazón o núcleo consiste de 35 pares de bases con sitios enzimáticos corriente arriba de un bloque de TATA y un inicio de la transcripción con 10 a 15 pares de bases corriente abajo. Los elementos corriente arriba (sitios de unión de Gal 4, Rsyn, AT-GBL etc.) se fusionaron a la secuencia del corazón o núcleo con el intrón ADH1 y diferentes genes marcadores (LUC o GUS) y demostraron ser funcionales en ensayos transitorios (Figura 6) y plantas transformadas de manera estable con Rsyn (Figura 7) .

Ejemplo 3 Construcción del Elemento Corriente Arriba Rs?n7 Fusionado al Promotor del Corazón o Núcleo Syn II que da Como Resultado los Plásmidos P5903 y P6086 Los oligos para construir el subelemento promotor Rsyn7 N1965: (SEQ ID NO: 8) GATCCTATGA CGTATGGTAT GACGTGTTGTT CAAGATGATG ACTT AAACC TACCTATGAC GTATGGTATG ACGTGTGTCG ACTGATGACT TA y (SEQ ID NO: 9) GATCTAAGTC ATCAGTCGAC ACACGTCATA CCATACGTCA TAGGTAGGTT TGAAGTCATC ATCCTTGAACA CACGTCATAC CATACGTCA TAG se sintetizaron como se describió al principio y se clonaron en el sitio de BainHl del plásmido pBlueScriptIIKS+ . Los oligos se recocieron o maduraron y clonaron en un plásmido P3398 corriente arriba de la secuencia del corazón o núcleo Syn II y dieron como resultado varias versiones de la secuencia Rsyn7 original debido a supresiones espontáneas. La versión Rsyn7-2 involucró la supresión de una sola base, la cual dio como resultado un motivo TGACG reiterativo 3X corriente arriba del promotor del corazón o núcleo Syn II (Rsyn7::LUC, P5903) . La secuencia que codifica para la LUC fue reemplazada por la secuencia que codifica para la GUS para producir el constructo de Rsyn7 P6086. El P6086 fue introducido más tarde en el maíz transgénico dando como resultado altos niveles de actividad constitutiva en cuatro de los seis eventos activos examinados (Figura 7) . Se examinó la progenie de plantas TO de varios eventos de transformación y la actividad de la GUS fluctuó de l a 400 PPM (microgramos de enzima GUS/GFW en tejido de raíz de semilleros de 7 días), Figura 8. Esas plantas TO y TI generalmente produjeron una actividad de GUS 4X-10X mayor que las plantas que contienen el gen reportero ubiquitina: : GUS . De este modo partiendo de lo anterior, puede observarse que la invención logra al menos todos sus objetivos .

EJEMPLO 4 Transformación y Expresión con Promotor del Corazón o Núcleo Syn II y/o Elemento Corriente Arriba Rsyn7 Utilizando los ensayos de bombardeo transitorio se comparó la secuencia promotora del corazón o núcleo Syn II contra la secuencia del corazón o núcleo 35S ya sea solos o en conjunto con numerosos elementos del activación. La Figura 6 es una descripción de los datos del ensayo transitorio utilizando plásmidos que incorporan las secuencias promotoras de la invención y muestra la actividad de GUS o LUC transitorias en raíces de maíz de tres días o callos BMS bombardeados con constructos de promotor quimérico: : GUS o LUC. El -33 CaMV35S en las versiones del promotor del Corazón o Núcelo Syn II de los constructos de promotor sintético :: GUS (o LUC) fueron bombardeados en raíces de maíz de tres días (o callos BMS cultivados de acuerdo a lo descrito anteriormente) y se ensayaron para determinar la actividad de la enzima veinte horas después de los bombardeos. Los datos mostrados son las unidades de enzima cruda de una recopilación de al menos tres experimentos y no han sido normalizados de ninguna forma debido a la variabilidad inherente de los ensayos transitorios. Los plásmidos control 1654 .y 3537 son los constructos de LUC probados en callos bms de maíz. Existe una diferencia de aproximadamente 4 a 20 veces en la actividad transitoria entre las versiones del Corazón o Núcleo de 35S y Syn II. El eje Y está en escala logarítmica. Ambos promotores del corazón o núcleo fueron dirigidos a un constructo que contenía GUS (Figuras 4 y 5) y generaron un nivel basal de actividad (Figura 6) . Sin embargo, cuando los elementos activadores fueron colocados corriente arriba del motivo TATA, el Corazón o Núcleo Syn II proporcionó generalmente niveles más altos de actividad (2-4 veces mejor) en célula_s de maíz que cuando los elementos activadores fueron colocados corriente arriba del corazón o núcleo 35S (Figura 6) .

La secuencia del Corazón o Núcleo Syn II ha mostrado potenciar la actividad en plantas transformadas de manera estable. Además con ciertas secuencias activadoras corriente arriba los niveles de actividad del elemento TATA en plantas de maíz transformadas de manera estable alcanzaron niveles diez veces mayores que los constructos de ubiquitina de maíz los cuales producen niveles extremadamente altos de actividad. Las Figuras 7 y 8 muestran los niveles de actividad de GUS de tejidos aislados de plantas TO en la etapa VT y tejido de maíz de semilleros TI, respectivamente. Esos datos demuestran que está secuencia .del corazón o núcleo puede participar en la potenciación de niveles muy altos de actividad como un socio funcional de los promotores quiméricos activos. La Figura 7 muestra la actividad de Rsyn: :GUS (6086) en plantas de maíz TO. Las plantas en la etapa VT con mazorcas postpolinizadas de 3 a 8 días fueron disectadas y ensayadas para determinar la actividad de GUS. La Figura 7A describe la expresión de GUS en los tejidos designados. La Figura 7B describe un esquema de plantas de maíz con los sitios de medición indicados. Las plantas de los eventos TO que demostraron una gama de actividades con el promotor Rsyn7 fueron ensayadas. Nuevamente debe notarse la escala logarítmica. El intervalo de actividad para las plantas UBI:: GUS se indicó al lado derecho de la gráfica a manera de comparación. Esos datos demuestran que el promotor Rsyn7 puede potenciar la actividad hasta diez veces por encima de los niveles del promotor de ubiquitina que muestra aún poca preferencia por tejidos hacen el Rsyn7 adecuado como un promotor constitutivo fuerte. La Figura 8 describe la actividad de la GUS en segmentos de raí-: de una población segregante de semilleros transgénicos TI del maíz que contienen el constructo Rsyn7::GUS (6086) o el UBI:: GUS (3953). Se disectaron segmentos de raiz de 1 cm de semilleros de maíz transgénico de seis a siete días, se pesaron y ensayaron para la GUS utilizando el equipo de luz para GUS. La actividad se representó como partes por millón de peso fresco. La actividad de la raíz en varias plantas TI que contienen el promotor Rsyn7::GUS muestran mayor actividad que muchos de los niveles de actividad producidos por el promotor UBI. Estos es consistente con los datos de una planta transgénica TO. Los niveles de actividad en hojas jóvenes que contienen Rsyn7::GUS también son mucho más altos que los niveles de actividad de hojas jóvenes que contienen UBI:: GUS (no se muestran los dates) . La secuencia del Corazón o Núcleo Syn II mostró funcionar bien con una variedad de elementos corriente arriba incluyendo los sitios de unión de GAL 4, elementos Rsyn7, elementos GBL, etc. La Figura 9 muestra la expresión de GUS de tres promotores sintéticos en plantas transgénicas de maíz TO. Los tejidos disectados (Véase la Figura 7B) de plantas transgénicas TO ce la etapa VT que alojan los constructos de Rsyn7 (Rsyn) , Atsyn o el promotor del Corazón Núcleo Syn II (syn-corazón) los oonstructos promotor: :GUS fueron ensayados cuantitativamente para determinar la actividad de la GUS. Cada círculo representa un promedio de la actividad del tejido de plantas transgénicas de maíz de un solo evento de transformación. El motivo TGACG corresponde a la secuencia del Rsyn7 y el motivo ?t-com" se refiere al elemento compuesto similar al AT de consenso, Atcom, de W. Gurley, et al., 1993. En: Control of Plant Gene Expression, ed. por Desh Pal Verma, CRC press, Boca Ratón, FL. pp. 103-123. Syn-corazón se refiere a la secuencia promotora del Corazón o Núcleo Syn II que contiene el elemento TATA y el inicio de la transcripción.

LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Pioneer Hi-Bred International, Inc. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Promotor Sintético del Corazón de una Planta y Elemento Regulador Corriente Arriba (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 10 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: Pioneer Hi-Bred International, Inc.

(B) CALLE: 7100 N. W. 62nd Avenue, Dar in Building (C) CIUDAD: Johnston (D) ESTADO: Iowa (E) PAÍS: Estados Unidos (F) CÓDIGO POSTAL: 50131 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE: (A) NOMBRE: JERVIS, Herbert H.; SWEENEY, Patricia A.; BOBROWICZ, Donna, RAN David. (B) NUMERO DE REGISTRO: (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELFONO: 515-334-4468 (B) TELEFAX: 515-334-6883 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 72 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: GGATCCACTC GñGCGGCTAT AñATACGTAC CTñCGCACGC TGCGCTñCCA TCCCGAGCAC 60 TGCAGTGTCG AC 72 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 96 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2 GGATGCTATG CGTATGGTAG GACGTGTGTT CAAGAGGAGG ACTTCA?ACC TACCTATGAC 60 GTATGGTATG ACGTGTGTCG ACTGATGACT TAGATC 96 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO; ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: TMAWftWA-TY YTCA2M?A 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 CCTCTATATA AGCAAGTTCA TTTCATTTGG AGAGG ACG 40 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: TGAGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 66 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO : NO (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : TCGACACTGC AGCTCTAGGG ATGGTAGCGC AGGGTGCGTA GGTACGTATT TATAGCCGCT 60 CGAGTG 66 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 66 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: GATCCACTCG AGCGGCTATA AATACGTAX TACGCACCCT GCGCTACCAT CCCTAGAGCT 60 GCAGTG 66 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 92 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: GATCCTATGA CGTATGGTAT GACGTGTGTT CAAGATGATG ACTTCMñCC TACCTATGAC 60 GTATGGTATG ACGTGTGTCG ACTGATGACT TA 92 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 92 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: GATCTAAGTC ATCAGTCGAC ACACGTCATA CCATACGTCA TAGGTAGGTT TGAAGTCATC 60 ATCTTCAACA CACGTCA?AC CATACGTCAT AG 92 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 72 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GGATCCACTC GAGCGGCTAT AAATASSTAS ATASSSASSS TSSSSTASSA TCCCGAGCAC 60 TGCAGTGTCG AC 72 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar cabo la presente invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad las siguientes:

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Una secuencia promotora de planta de ADN sintético, . la secuencia se caracteriza porque comprende : un motivo TATA; un sitio de inicio de la transcripción; y una región entre el motivo TATA y el sitio de inicio que es al menos 64% rico en GC.

2. El promotor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia del promotor es la SEQ ID NO: 10.

3. El promotor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia del promotor es la SEQ ID N0:1.

4. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende : un promotor sintético que comprende un motivo TATA; un sitio de inicio de la transcripción y una región entre ellos que es al menos 64% rica en GC; un gen estructural ligado operativamente al promotor; y una señal de poliadenilación del sitio final de transcripción.

5. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia del promotor es la SEQ ID N0:1.

6. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia del promotor es la SEQ ID NO: 10.

7. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende además un elemento corriente arriba ligado operativamente al promotor de modo que se aumente o amplifique la transcripción.

8. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el elemento corriente arriba es la SEQ ID NO: 2.

9. Un vector de ácido nucleico, caracterizado porque comprende el promotor de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 ligado operativamente a un gen estructural.

10. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el vector es un vector de clonación.

11. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado .porque el vector es un vector de expresión.

12. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además un gen marcador para la selección de células transformadas.

13. El vector de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el gen marcador es un gen de resistencia a los antibióticos.

14. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además una señal de poliadenilación.

15. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el vector comprende además un elemento corriente arriba ligado operativamente al promotor .

16. El vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el elemento corriente arriba es la SEQ ID NO: 2.

17. Una célula huésped procariótica o eucariótica caracterizada porquer se transformó con el vector de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9.

18. Una planta transgénica, caracterizada porque comprende : una célula de planta o ancestro de la misma, la cual ha sido transformada con el vector de conformidad con la reivindicación 9.

19. Un elemento sintético corriente arriba, caracterizado porque tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 2.

20. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende : una secuencia promotora; un gen estructural ligado operativamente a la secuencia del promotor; un señal de poliadenilación; y un elemento sintético corriente arriba homólogo a la SEQ ID NO: 2 ligado operativamente al promotor de modo que se amplifique o aumente la expresión.

21. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia del promotor sintético es la SEQ ID NO: 2.

22. Un vector de ácido nucleico, caracterizado porque comprende el cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 20.

23. El vector de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el elemento sintético corriente arriba es la SEQ ID NO: 2.

24. Una célula huésped procariótica o eucariótica, caracterizada porque se transformó con el vector de conformidad con la reivindicación 22.