MXPA98010328A - Procedimiento de produccion de adn terapeutico - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a la preparación de ADN, particularmente plasmídico. Se refiere mas particularmente a la producción de ADN plasmídico bacteriano que esútil en terapia génica, en forma de plásmido, de minicírculo subenrollado, relajado o lineal.
Description
PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE ADN TERAPÉUTICO
La presente invención se refiere a la preparación de ADN, en particular plasmídico. Se refiere mas particularmente a la producción de ADN plasmídico bacteriano que se utiliza en terapia génica, bajo la forma de plásmido, de minicírculo subenrollado, relajado o lineal, y en el que las propiedades inmunogénicas se reducen hasta suprimirse. La invencióOn también se refiere a microorganismos útiles para la producción de ADN, así como a las composiciones farmacéuticas.
La terapia génica consiste en corregir una deficiencia o una anomalía introduciendo una. información genética en la célula o el órgano afectado. Esta información puede introducirse ya sea in. vitro en una célula extraída del órgano y en seguida reinyectada en el organismo, ya sea in vivo, directamente en el tejido enfocado. Se trata de una molécula de alto peso molecular y de carga negativa, el ADN tiene dificultades para atravesar espontáneamente las membranas celulares fosfolipídicas. Así los diferentes vectores se utilizan con el fin de permitir la transferencia del gen: los vectores virales de una parte, los vectores químicos y/o bioquímicos, naturales o sintéticos, por otra parte. Los vectores virales (retrovirus, adenovirus, virus REF.: 28909 adeno-asociados, ... ) Son muye eficaces, en particular para el paso de membranas, pero presentan cierto número de riesgos tal como la patogenicidad, la recombinación, la replicación, la inmunogenicidad, ... Los vectores químicos y/o bioquímicos permiten evitar estos riesgos (para revisiones, ver Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993) . Estos son por ejemplo los cationes (fosfato de calcio, DEAE-dextran, ... ) que se tratan en forma de precipitados con ADN, los cuales pueden ser "fagocitados" por las células. También se puede tratar de liposomas en los que el ADN se incorpora y que se fusionan con la membrana plasmídica. Los vectores sintéticos de transferencia de genes en general son lípidos o polímeros catiónicos que acomplejan el ADN y forman con él una partícula que porta cargas negativas en la superficie. Estas partículas son capaces de interactuar con las cargas negativas de la membrana celular, después de atravesarla. Se puede citar como ejemplos de tales vectores la dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, Transfectam ™) o el cloruro de N- [1- (2, 3-dioleiloxi) propil] -N,N,N-trimetilamino (DOTMA, Lipofectin™) . También se desarrollaron proteínas quiméricas; están constituidas de una parte policatiónica que condensa el ADN, ligado a un ligando que se fija sobre un receptor membranal y arrastra el complejo dentro de las células por endocitosis. Así es teóricamente posible "dirigir" un tejido o ciertas poblaciones celulares, a fin de mejorar la biodisponibilidad in vivo del gen transferido.
Los plásmidos utilizados actualmente en terapia génica portan en general (i) un origen de replicación, (ii) un gen marcador tal como un gen de resistencia a un antibiótico (canamicina, ampicilina...) Y (iii) uno o mas transgenes con las secuencias necesarias para su expresión (aumentador (es) , promotor (es) , secuencias de poliadenilación... ) . Este tipo de plásmidos se utiliza por ejemplo actualmente en terapia génica al nivel de ensayos clínicos tal como el tratamiento de melanomas, Nabel et al., 1992, o a nivel de estudios experimentales .
La utilización de ADN plasmídico en terapia génica plantea sin embargo un cierto número de problemas.
En particular, esto implica la posibilidad de producir cantidades importantes de ADN de pureza farmacológica. En efecto, en estas técnicas de terapia génica, el medicamento está constituido por el mismo ADN y es esencial de poder fabricar, en las cantidades adaptadas, los ADN que tienen las propiedades apropiadas para un uso terapéutico en el hombre. A este respecto, diferentes métodos de producción y/o purificación se han descrito en el arte anterior, permitiendo mejorar la calidad del ADN plasmídico (PCT/FR95/01468;
FR9603519) .
Por otro lado, la utilización de ADN portador de genes de resistencia a antibióticos o de orígenes de replicación funcionales también pueden presentar ciertos inconvenientes, ligados en particular a su diseminación en el organismo. También se han desarrollado diferentes enfoques para limitar estos inconvenientes (PCT/FR96/00274, FR95 10825).
Otro inconveniente de los ADN plasmídicos utilizados hasta el presente reside en su origen. Se trata en efecto de moléculas producidas esencialmente en los organismos procariotes (bacterias) o eucariotes inferiores (levaduras), que poseen potencialmente los radicales inmunogénicos en el hombre. Las propiedades inmunológicas del ADN aún son muy poco conocidas. El ADN bacteriano en ratón condujo i) a la síntesis de anticuerpos que reconocen el ADN bacteriano de doble hebra y de hebra simple que ha permitido la inmunización pero no reaccionó con el ADN de doble hebra de mamífero, ii) la estimulación de macrófagos y citocinas (D. Pisetsky "the Immunologic Properties od DNA" J. Immunol. 156 (1996) 1) . La macromolécula de ADN así se dice inmunógena. Por otro lado, una molécula también puede conducir a una estimulación del sistema inmunitario sin ser inmunógeno (por ejemplo cuerpos extraños que conducen a una respuesta inmunitaria por mediación celular) . Las primeras evidencias que sugieren que el ADN bacteriano conduce a una respuesta inmunitaria se describió por Pisetsky et coll. (1991 J. Immunol. 147 pl759) . Se ha demostrado que el ADN de tres especies bacterianas puede estimular la proliferación de linfocitos de ratones mientras que el ADN extraído de tres especies animales no conduce a esta estimulación. Después, Yamamoto et coll. (1992 Microbiol. Immunol. 36 p983) observaron que el ADN bacteriano de seis especies conduce en las células de bazo de ratón BALB/c en un aumento de la actividad NK "asesina natural" y a la inducción de la producción de interferones. Pero el ADN extraído de diez especies de vertebrados no condujo a ninguna de estas respuestas. Además, Krieg et coll. describieron en 1995 (Nature vol374 p546) que un fragmento de ADN genómico de E. coli inducía in vitro la proliferación de células B murinas y la secreción de inmunoglobulinas IgM, mientras que este mismo ADN bacteriano, tratado in vitro con una CpG metilasa, no indujo tal respuesta. Krieg et coll. también indicaron que en presencia de ADN no metilado, se produce el interferón g, y reacciona como factor coestimulante de las células B modulando la producción de IL-6 por la células B (Krieg et coll. 1996 J. Immunol. 156 p558). Además un oligonucleótido que posee un radical CpG no metilado y enmarcado en 5' por 2 purinas y en 3 ' por 2 pirimidinas condujo in vivo una secreción coordinada por las interleucinas IL-6 e IL-12, y de los interferones g por las células NK(INF-g), las células B (IL-6 e IL-12) y los linfocitos T CD4+(IL-6 e IFN-g) (Krieg et coll. 1996 Proc. Nati, Acad. Sci. USA 93 p2879) .
El ADN plasmídico utilizado hasta ahora en terapia génica se produce esencialmente en células procariotas, y presenta por consecuencia un perfil de metilación comparable al del ADN genómico bacteriano. Además se ha demostrado que el ADN plasmídico que se inyectó en el músculo o en el hígado, conservó el perfil de metilación procariote (Wolf et coll. 1992 Hum. Mol. Genet.1 p363; Malone et coll. 1995 J. Biol. Chem.269 p29903) . De hecho, el ADN plasmídico utilizado presenta un potencial de estimulación del sistema inmunitario importante.
Así sería particularmente ventajoso poder disponer de
ADN plasmídico que tiene propiedades inmunológicas reducidas, hasta suprimidas. También sería particularmente ventajoso poder disponer de un procedimiento que permita producir, una Escala compatible con una utilización industrial, de los ADN plasmídicos de este tipo.
La presente solución aporta una solución a estos problemas. La firma solicitante se interesa en efecto en las propiedades inmunógenas del ADN bacteriano. La firma solicitante ha indicado actualmente un procedimiento que permite producir ADN plasmidico de calidad farmacéutica, potencialmente desprovisto de efectos inmunógenos indeseables. La firma también ha demostrado que la metilación de ciertos residuos de ADN permitiría reducir el potencial inmunógeno de los ADN plasmídicos, sin afectar su capacidad de transfectar las células y de expresar un ácido nucleico de interés.
Un aspecto de la invención es preparar ADN, particularmente plasmídicos, de calidad terapéutica. De acuerdo a otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización en terapia génica de ADN plasmídico metilado en las citosinas de los dinucleótidos 5'-GC-3'. Un tercer aspecto de la invención es relativo a las composiciones farmacéuticas que contienen los ADN plasmídicos metilados. La invención también se refiere a un procedimiento de metilación in vivo de ADN por la expresión de una metilasa. La invención en otros aspectos, es relativa a los casetes de expresión, de los microorganismos huésped utilizables para la metilación, la preparación de composiciones terapéuticas, y los métodos de transferir genes.
Un primer objetivo de la invención se refiere por consiguiente a un procedimiento de producción de ADN útil en terapia génica caracterizado porque dicho ADN se produce en una célula que contiene un cásete de expresión de una ADN metiltransferasa que permite metilar los residuos citocina de los dinucleótidos 5'-CG-3'.
La presente invención se refiere así a la producción de ADN, particularmente plasmídico, metilado en los residuos citocina de los dinucleótidos 5'-CG-3'.
La metilación de ADN plasmídico in vitro está documentada en la literatura (Adams et coll. 1992 FEBS
Letters 309 p97 ; Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p251 ;
Komura et coll. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73) .
Mientras tanto, esta forma de metilación no se visualiza para la producción industrial del plásmido que sería utilizado en terapia génica. Un procedimiento de producción de ADN plasmídico debe permitir en efecto producir de forma reproducible cantidades importantes de plásmidos y homogenes y de purificar este ADN por los métodos aceptables para un uso farmacéutico. Está bien claro que un ADN metilado in vitro puede estar mas o menos relacionado de lote a lote
(Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p251) y que las cantidades producidas sean limitadas.
La presente invención demuestra ahora que es posible metilar un plásmido de interés directamente en el transcurso de la producción, coexpresando en la célula huésped el gen que codifica una metilasa. La presente invención también muestra que, de acuerdo a este procedimiento, que las cantidades importantes y homogenes del plásmido metilado pueden producirse y el ADN plasmídico metilado puede purificarse de acuerdo a los procedimientos ya descritos. La firma solicitante también ha demostrado, de manera ventajosa, que el ADN plasmídico así metilado conserva la capacidad de transfectar las células blanco y, de ser el caso, de que se repliquen. De forma particularmente notable, la firma solicitante también demostró que el ADN plasmídico así metilado puede, in vivo, expresar los ácidos nucleicos de interés.
Numerosos estudios refuerzan en efecto la idea de que la hipermetilación se correlaciona con la inhibición o la inactivación y que los promotores activamente transcritos a menudo son hipo o no metilados. Así, se trata de promotores virales, si el promotor tardío E2A del genoma del adenovirus de tipo 2 está completamente metilado en los dinucleótidos 5'-CG-3', en las células transformadas de hámster HE1, y no metilados en las células transformados de hámster HE2; el gen E2A es silencioso en HE1 y se transcribe en HE2 (W. Doerfler 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol.197 p207) . Otro ejemplo se describe por Kohn et coll. (1994 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 p2567) que demuestra la ausencia de expresión a partir del vector retroviral LTR traducido en las células de cepas hematopoiéticas se asocia a la metilación in vivo. La inhibición de la expresión del gen transportador, bajo el control de un promotor viral, cuando también se demostró que este gen se introduce en transfección transitoria por un plásmido metilado in vitro (Adams et coll. 1992 FEBS Letters 309 p97 ; Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p251; Komura et coll. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73) . Por otro lado, Razin et coll. (precitados) demostraron que el promotor del gen que codifica para la timidina cinasa del herpes simple de tipo I y el del gen que codifica para la metalotioneína de ratón son inactivos cuando la expresión transitoria en las células de ratón L y las células murinas de teratocarcinomas F9 si estos promotores se metilan en los dinucleótidos 5'-CG-3' .
La presente invención describe así por primera vez un procedimiento que permite la producción de ADN plasmídico metilado, homogéneo y compatible con una utilización industrial, y demuestra la posibilidad de utilizar este tipo de plásmido para la expresión de genes in vitro, ex vivo o in vivo, particularmente en las aplicaciones de terapia génica.
El procedimiento de acuerdo a la invención puede emplearse en diferentes tipos de huéspedes celulares. Se trata particularmente de toda célula no humana, esencialmente desprovista de un sistema de metilación de citocinas de los dinucleótidos 5'-CG-3*. La ausencia de metilación puede ser el resultado de la ausencia de actividad enzimática apropiada, debido ya sea a una expresión insuficiente de un gen correspondiente, ya sea a la ausencia de dicho gen. Se trata preferentemente de células procariotas o eucariotas simples.
Ventajosamente, el huésped celular es una bacteria. Entre las bacterias se puede citar mas preferentemente E. coli, B. subtilis, Streptomvces, Pseudomonas (P. putida, P. aerusinosa) , Rhizobium meliloti, Asrobacterium tumefaciens, Staohylococcus aureus, Streptomvces pristinaespiralis, Enterococcus faecium o Clostridium. También se pueden utilizar enterobacterias tal como Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerocenes, Erwinia carotovora o Serratia marcescens. Preferentemente, el huésped celular utilizado es un organismo no patógeno y permite producir cantidades importantes de ADN plasmídico y homogenes. A título de ejemplo particularmente preferido, se utiliza E. coli.
El procedimiento de la invención permite la producción de ADN de calidad terapéutica.
El ADN puede estar en toda la molécula de ADN, hebra simple o hebra doble, lineal o circular, replicante o no, integrativo o no, en la forma de plásmido, de minicírculo subenrollado, relajado o lineal. En lo sucesivo del texto, el ADN también será referido ADN plasmídico o plásmido TG (para el plásmido útil en terapia génica) .
Los plásmidos TG utilizados en general en terapia génica portan esencialmente (i) un origen de replicación, (ii) uno o mas ácidos nucleicos de interés (gen terapéutico) con las secuencias necesarias para su expresión (aumentador (es) , promotor (es) , secuencias de poliadenilación...) Y opcionalmente (iii) un gen marcador.
La elección del gen de replicación se determina principalmente por el huésped celular utilizado para la producción. Puede tratarse de un origen de replicación salido de un plásmido del grupo de incompatibilidad P (ejemplo = pRK290) que permite la replicación en las cepas de E. coli pol A. Mas en general, puede tratarse de todo origen de replicación salido de un plásmido que se replica en las células procariotas o eucariotas inferiores. Este plásmido puede ser un derivado de pBR322 (Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95), un derivado de pUC (Viera et Messing, Gene 19(1982) 259), o de otros plásmidos que se derivan del mismo grupo de incompatibilidad, es decir de ColEl o de pMBl por ejemplo. Estos plásmidos pueden escogerse por otro lado en otros grupos de incompatibilidad que se replican en Escherichia coli. Puede tratarse de plásmidos derivados de plásmidos pertenecientes a los grupos de incompatibilidad A, B, Fl, FU, FU, FIV, Hl, Hll, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z o 9 por ejemplo. Otros plásmidos también pueden utilizarse, entre los que los plásmidos no se replican en E. coli pero en otros huéspedes tal como B¿_ subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruqinosa, Rhizobium meliloti, Aqrobacterium tumefaciens , Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium o Clostridium. Un título preferencial, se utilizan los orígenes de replicación salidos de plásmidos que se replican en E. coli. De acuerdo a una variante particular, el origen de replicación puede ser un origen condicional, es decir del cual la actividad depende de factores en trans. La utilización de este tipo de origen de replicación evita la replicación del ADN plasmídico después de la administración, por ejemplo en el hombre (FR95 10825) .
Entre los genes marcadores se puede citar un gen de resistencia, particularmente e un antibiótico (ampicilina, canamicina, geneticina, higromicina, etc.), o todo gen que confiere a la célula una función que no posee (por ejemplo un gen que se eliminó del cromosoma o se volvió inactivo), el gen en el plásmido que restablece esta función.
De acuerdo a una forma de realización particular, el ADN plasmídico contiene las secuencias que permiten eliminar, después de la fase de producción, todas las regiones esencialmente no terapéuticas (Origen de replicación, gen marcador, etc.). Un enfoque particularmente ventajoso para generar este tipo de molécula (minicírculos) se describió en la solicitud PCT/FR96/00274.
El ADN plasmídico de acuerdo a la invención es preferentemente una molécula de ADN de doble hebra que contiene uno o varios ácidos nucleicos de interés con las secuencias necesarias para su expresión. De acuerdo a una modalidad preferida, se trata de una molécula circular, replicante o integrativa. Ventajosamente, el ADN plasmídico contiene esencialmente uno o varios ácidos nucleicos de interés con las secuencias necesarias para su expresión (miniplásmido) .
El ácido nucleico de interés puede ser todo ácido nucleico (ADNc, ADNg, ADN sintético o semi-sintético, etc) del que la transcripción y opcionalmente la traducción en una célula generan productos que tienen un interés terapéutico, de vacuna, agronómico o veterinario.
Entre los ácidos nucleicos que tienen las propiedades terapéuticas, se pueden citar mas particularmente los genes que codifican las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: interleucinas, interferones, TNF, etc (FR 9203120), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; las apolipoproteínas : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), la distrofina o una minidistrofina (FR 9111947), los genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX, etc, los genes suicidas: Timidina cinasa, citosina desaminasa, etc; o aún todo o parte de una inmunoglobulina natural o artificial (Fab, ScFv, etc), un ligando de ARN (W091/19813) etc. El gen terapéutico también puede ser un gen o una secuencia antisentido, de la que la expresión en la célula blanco permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm celulares. Tales secuencias pueden por ejemplo transcribirse, en la célula blanco, en ARN complementarios de ARNm celulares y bloquear así su traducción en proteína, de acuerdo a la técnica descrita en la patente EP 140 308.
El ácido nucleico de interés también puede ser un gen de vacuna, es decir un gen que codifica para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o animal una respuesta inmunitaria, desde el punto de vista de la realización de vacunas. Puede tratarse particularmente de péptidos antigénicos específicos del virus de epstein barr, del virus de HIV, del virus de hepatitis B (EP 185 573), de virus de la seudo-rabia, o aun específicos de tumores (EP 259 212) .
En general, en los plásmidos, el ácido nucleico de interés terapéutico, de vacuna, agronómico o veterinario también contiene una región promotora de la transcripción funcional en la célula u organismo blanco (p. ej . , los mamíferos, en particular el hombre), asi como una región situada en 3', y que especifica una señal de fin transcripcional y un sitio de poliadenilación. Concerniente a la regió:' promotora, puede tratarse de una región promotora naturalmente responsable de la expresión del gen considerado cuando es susceptible de funcionar en la célula u organismo referido. También puede tratarse de regiones de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas) . Particularmente, puede tratarse de secuencias promotoras de genes eucariotes o virales. Por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras salidas del genoma de la célula blanco. Entre los promotores eucariotes, se puede utilizar todo promotor o secuencia derivada que estimula o reprime la transcripción de un gen de forma específica o no, inducible o no, fuerte o débil. Puede tratarse en particular de promotores ubicuitarios (promotor de los genes HPRT, PGK, a-actina, tubulina, etc), de promotores de filamentos intermediarios (promotor de los genes GFAP, desmina, vimentina, neurofilamentos, queratina, etc) , de promotores de los genes terapéuticos (por ejemplo el promotor de los genes MDR, CFTR, Factor VIII, ApoAI, etc), de promotores específicos de tejidos (promotor del gen piruvato cinasa, vilina, proteína intestinal de unión de ácidos grasos, a-actina del músculo liso, etc) o aún de promotores que responden a un estímulo (receptor de hormonas esteroides, receptor del ácido retinoico, etc) . También, puede tratarse de secuencias promotoras salidas del genoma de un virus, tal como por ejemplo los promotores de los genes E1A y MLP de adenovirus, el promotor precoz de CMV, o aún el promotor de LTR de RSV o de MMTV, etc. Además, estas regiones promotoras pueden modificarse por adición de secuencias de activación, de regulación, o que permiten una expresión tejido-específica o mayoritaria.
Por otro lado, el gen de interés también puede contener una secuencia señal que dirige el producto sintetizado en las vías de secreción de la célula blanco. Esta secuencia señal puede ser la secuencia señal natural del producto sintetizado, pero también puede tratarse de otra secuencia señal funcional, o de una secuencia señal artificial.
De acuerdo al ácido nucleico de interés, los ADN plasmídicos metilados de la invención pueden utilizarse para el tratamiento o la prevención de numerosas patologías, incluyendo enfermedades genéticas (distrofia, fibrosis cística, etc) , enfermedades neurodegenerativas (alzheimer, parkinson, ALS, etc) , cánceres, patologías ligadas a desórdenes de la coagulación o a las dislipoproteinemias, patologías ligadas a las infecciones virales (hepatitis, SIDA, etc), o en los dominios agronómico y veterinario, etc. Son particularmente ventajosos para el tratamiento de patologías en las que se desea una expresión durable sin reacción inmunológica, particularmente en el dominio de enfermedades genéticas, neurodegenerativas y cardiovasculares .
Como se indicó antes, el procedimiento de acuerdo a la invención utiliza una célula huésped que contiene un cásete de expresión de un ADN metiltransferasa que permite metilar los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3'.
Después de la síntesis del ADN, ciertas purinas y pirimidinas se modifican químicamente, por ejemplo por metilación. Así, la 5-metilcitosina o la N6-metiladenína entran en la composición de ciertos ADN. Estas modificaciones tienen lugar con la ayuda de ADN metiltransferasas, de mantenimiento o de. novo, que transfieren un grupo metilo de la S-adenosil-L-metionina a los residuos adenina o citosina que pueden situarse en las posiciones específicas en las secuencias. Por ejemplo, en E. coli dos ADN metiltransferasas son bien conocidas, la ADN metiltransferasa dam, que metila los residuos adenosina en el seno de las secuencias 5'-GATC-3 ' , y la ADN metiltransferasas dem, que metila el segundo residuo citidina de las secuencias 5 ' -CCA/TGG-3 ' . Otras ADN metilasas se han estudiado en las bacterias, que metilan un residuo contenido en un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción. Por ejemplo la enzima M.HpalI metila el segundo residuo citosina en la secuencia 5'-CCGG-3'.
La mayor parte de los eucariotes simples y de los invertebrados contienen relativamente poca 5-metilcitosina y N6-metiladenina. Sin embargo la metilación de bases en los vertebrados es mas importante y en este caso la 5-metilcitosina es la mas frecuente de las bases metiladas. En efecto mas de 95 por ciento de los grupos que metila el ADN de vertebrados se encuentra en los residuos C de pocos dinucleótidos 5'-CG-3' (la frecuencia de 0,8 % de 5'-CG-3* en las secuencias de mamíferos es muy débil aunque el porcentaje en GC sea en promedio de 40% y que un arreglo no sesgado conducirá a una frecuencia de 4% de 5'-CG-3'). Y, mas del 50 por ciento del conjunto de dinucleótidos pueden metilarse. Diferentes evidencias sugieren que el grado de metilación de ciertas secuencias que contienen el dinucleótido 5'-CG-3' pueden ser un factor determinante en los mamíferos en la regulación de la expresión de genes particulares, la inactivación del cromosoma X, la oncogénesis (1993 eri ADN methylation: Molecular Biology and Biological Significance, Eds Jost et Saluz), y aún enfermedades hereditarias (Bates et coll. 1994 BioEssays 16 p277).
La presente invención utiliza un cásete de expresión de una ADN metiltransferasa que permite metilar los residuos citosina en los dinucleótidos 5'-CG-3'. De hecho, en el sentido de la presente invención, ADN metilado significa más particularmente el ADN metilado en los residuos citosina de los dinucleótidos 5-CG-3'. Ventajosamente, la ADN metiltransferasa utilizada metila preferentemente los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3', es decir no afecta casi los residuos adenina, ni los residuos citosina que se presentan en un contexto diferente de los dinucleótidos 5'-CG-3'. Ventajosamente, se entiende por ADN plasmídico metilado un ADN plasmídico en el que al menos 50% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' están metilados. Mas preferentemente, al menos 80%, ventajosamente 90% de dichos residuos están metilados.
La metilación del ADN plasmídico puede verificarse de diferentes formas. En particular, puede controlarse dirigiendo las preparaciones plasmídicas por las enzimas de restricción en las que el corte no es posible si el residuo citosina del dinucleótido 5'-CG-3', contenido en el sitio de corte, está metilado. Se puede citar por ejemplo las enzimas de restricción Hpa.II, AatII, BstBI. La metilación también puede determinarse por cromatografía. Así, la cantidad de plásmido no metilado presente en la preparación de plásmido metilado se cuantifico de la siguiente forma: al plásmido no metilado no digerido se añadió 1% o 5% del plásmido no metilado y totalmente digerido por Hpall. Estas muestras, así como el plásmido metilado digerido por Hpall, se analizaron por cromatografía líquida de intercambio de aniones y se detectó a 260 nm, lo que permite separar y cuantificar el ADN no digerido del ADN digerido. Se verifica que el plásmido metilado contiene menos de 5% de ADN plasmidico no metilado, de otro modo se dice que mas de 95% del ADN plasmídico está metilado.
Ventajosamente, el procedimiento de la invención se caracteriza porque la ADN metiltransferasa metila preferentemente los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' .
Ventajosamente, en el procedimiento de acuerdo a la invención, se metilan más del 50% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5--CG-3' del ADN plasmídico. Aún mas preferentemente, mas de 80%, particularmente se metilan más del 90% de los residuos citosina.de los dinucleótidos 5 ' -CG-3' del ADN plasmídico.
Se caracterizaron varias ADN metiltranferasas de mamífero que permiten metilar los residuos citosina en las secuencias que contenían todas el dinucleótido 5'-CG-3' y se clonaron los genes correspondientes, por ejemplo el de ratón
(Bestor et coll. 1988 J.Mol. Biol. 203 p971) o el de hombre
(Yen et coll. 1992 Nucí. Acids Res. 20 p2287). Estas enzimas tienen un peso molecular comprendido entre 135 y 175 kD.
Metilan el ADN semimetilado mucho mas rápido que el no metilado, sugiriendo que estas son metilasas de mantenimiento (Smith 1994 Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 49 p65) . La enzima homologa en E. coli no existe. Por el contrario la metilasa M. Sssl de Spiropiasma metila exclusivamente y complementa los residuos citosina de todo dinucleótido 5'-CG-3' con una velocidad comparable, ya sea el sustrato semimetilado o no metilado (Razin et coll. 1992 FEBS letters 313 p243; Baker et coll. 1993 Biochim. Biophys. Acta 196 ?864). Esta enzima se aisló a partir de la cepa Spiroplasma sp MQ1. Su peso molecular es de 42 kD y el gen se clonó y se subexpresó en E. coli (Razin et coll. 1990 Nucí. Acids. Res. 18 pll45 et EP0412676A1 derwent 91045812).
Preferentemente, la ADN metiltransferasa se escoge entre la metilasa M.SssI, la metilasa de ratón y la metilasa humana. Ventajosamente, se utiliza la metilasa M.SssI.
El cásete de expresión de la ADN metiltransferasa contiene en general un ácido nucleico que codifica una ADN metiltransferasa que permite metilar los residuos cítosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' bajo el control de un promotor. El promotor utilizado para este efecto puede ser cualquier promotor funcional en la célula huésped escogida. Al respecto, se puede tratar de un promotor funcional tal como el definido antes. Se trata de huéspedes celulares procariotes, se puede citar mas particularmente los promotores del operón lactosa (Plac) , del operón triptofano
(Ptrp), los promotores híbridos Plac/Ptryp, el promotor PL o
PR del bacteriófago lambda, el promotor del gen tetA (e_n
Vectors 1988 pl79 Rodriguez et Denhardt editeurs), etc.
En una modalidad de realización preferida, se utiliza un promotor diferente del responsable de la expresión del ácido nucleico de interés en el ADN plasmídico. Es particularmente ventajoso utilizar un promotor inducible, que permite controlar la expresión de la metilasa. ^El promotor inducible puede ser por ejemplo el promotor del bacteriófago T7 o el promotor Plac.
Ventajosamente, el cásete de expresión también contiene señales de fin de la transcripción (terminadores transcripcionales), tal como los terminadores ribosomales.
El cásete de la expresión de la ADN metiltransferasa puede ser portado por un vector replicador, o integrarse en el genoma de la célula huésped.
Tratándose de un vector replicador, se utiliza ventajosamente un vector compatible con el plásmido TG, es decir capaz de co-residir en la misma célula. Dos plásmidos diferentes pueden replicarse en la misma célula si el control de la replicación de cada plásmido es diferente. Así los plásmidos compatibles pertenecen a dos grupos de incompatibilidad. Ahora bien existen aproximadamente 30 grupos de incompatibilidad de plásmidos que se replican en las enterobacterias (Maas et coll. 1988 Microbiol. Rev. 52 p375). De hecho, existen numerosas posibilidades para replicar dos plásmidos en la misma célula y varios ejemplos se describen en la literatura. Se puede citar por ejemplo la correplicación de plásmidos derivados de ColEl con los plásmidos que tienen por replicón R6K o pl5A o RSF1010 o RK2; también se puede citar la correplicación de plásmidos derivados de RK2 con los plásmidos derivados de R6K o RFS1010 o pSa o ColEl (en Vectors 1988 p287 Rodríguez et Denhardt editeurs) . Esta lista no es limitativa y también se describen otros ejemplos en Vectors 1988 p287 Rodriguez et Denhardt edíteurs. Ventajosamente, el vector replicador utilizado presenta un número de copias diferentes en la célula huésped como el plásmido TG. Así, el vector que porta el gen que codifica para la metilasa, en el que la expresión puede ser inducida, es de débil número de copias (derivado por ejemplo de pACYC 184 o RK2), cuando el plásmido TG está en alto número de copias (derivado de ColEl) . También se puede clonar en el plásmido TG una secuencia que permite formar con un oligonucleótido apropiado una secuencia triple hélice de tal forma que el plásmido TG puede separarse de otro plásmido por una purificación de afinidad.
El cásete de expresión de la ADN metiltransferasa también puede integrarse en el genoma de la célula huésped. La integración puede realizarse por recombinación homologa, en la medida donde el cásete de expresión se encuadra por los fragmentos adyacentes de un gen, no esencial, del genoma del huésped y clonado en un plásmido que no puede replicarse en el huésped considerado. Este plásmido puede ser i) un derivado de ColEl en una cepa de E. coli polAt? (Gutterson et coll. 1983 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80 p4894); ii) un derivado termosensible de pSClOl en cualquier cepa de E. coli (S. Kushner et coll. 1989 J. Bacteriol. 171 p4617); iii) un vector suicida tal como M13mpl0 en las cepas de E. coli sup* (Blum el coll. 1989 J. Bacteriol. 171 p538) o aún iv) un plásmido que no contiene el origen g de R6K en cualquier cepa de E. coli desprovisto del gen pir (Filutowicz et coll. 1994 Prog. In Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48 p239) .
El cásete de expresión puede introducirse en la célula huésped antes, después o al mismo tiempo que el ADN plasmídico. Se trata de un cásete integrativo, se introduce en general antes, y las células que contienen dicho cásete se seleccionan y se utilizan para la producción del ADN plasmídico.
Un aspecto particular de la invención es expresar el gen que codifica la metilasa M.SssI en las células bacterianas
(particularmente E. coli) que contienen un plásmido TG. Como se indica en los ejemplos, dicho plásmido se metila entonces en las citosinas de los dinucleótidos 5'-CG-3'. Mas específicamente, el plásmido TG se transforma en una cepa de
E. coli mcrA mcrB D (mcrC-mmr) que ya contiene un plásmido que porta el gen que codifica la metilasa M. Sssl y es compatible con el plásmido TG. En el transcurso del crecimiento de la bacteria los dos plásmidos del callo se replican y se metilan (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol.
173 p5793) .
El ADN plasmídico o el cásete de expresión pueden introducirse en la célula huésped por cualquier técnica conocida por el experto en el arte (transformación, transfección, conjugación, electroporación, pulsación, precipitación, etc) . La transformación puede efectuarse particularmente por la técnica de transformación con CaCl2 (Dagert et Ehrlich, Gene 6 (1979) 23), o el indicado por Hanahan et al. (J. Mol. Biol. 166 (1983) 557) o cualquier técnica derivada de la misma (Maniatis et al., 1989), así como por electrotransformación (Wirth et al., Mol. Gen. Genet. 216 (1989) 175) o por TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coll. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580).
También ver las técnicas generales de Biología Molecular anteriores.
El ADN plasmídico metilado de acuerdo a la invención puede purificarse enseguida por cualquier técnica conocida por el experto (precipitaciones, cromatografías, centrifugaciones, diálisis, etc) . En el caso particular de utilizar un vector de expresión de la metiltransferasa replicante, el plásmido TG debe separarse además de dicho vector. Pueden utilizarse diferentes técnicas, basadas en las diferencias de tamaño o de masa de dos plásmidos, o en la digestión del vector al nivel de sitios de restricción presentes únicamente en el vector y no en el plásmido TG. Un método de purificación particularmente ventajoso se basa en la afinidad entre una secuencia específica presente en el plásmido TG y un oligonucleótido inmovilizado. Esta purificación de triple hélice se ha descrito en detalle en las solicitudes FR9603519 y FR94 15162, que se incorporan en la presente por referencia.
Un resultado particularmente ventajoso de la invención es que el ADN plasmídico metilado en las condiciones de la invención conduce a la expresión del gen bajo el control del promotor tan bueno como el obtenido con el ADN plasmídico no metilado. Este ADN plasmídico metilado no deberá acarrear la estimulación inmunitaria asociada con los ADN bacterianos y posee por consecuencia una cierta ventaja para utilizarse en terapia génica no viral.
Los ADN plasmídicos metilados de acuerdo a la invención pueden utilizarse en cualquier aplicación de vacunación o terapia génica y celular, por la transferencia de un gen a un organismo, un tejido o una célula dada. En particular, pueden utilizarse para una administración directa in vivo, o para la modificación de células in. vitro o ex vivo, con objeto de su implantación en un paciente. Al respecto, las moléculas de acuerdo a la invención pueden utilizarse tal cual (en forma de ADN desnudo) , o en asociación con diferentes vectores químicos y/o bioquímicos, sintéticos o naturales. Puede tratarse en particular de cationes (fosfato de calcio, DEAE-dextran, ... ) que se tratan en forma de precipitados con el ADN, los cuales pueden ser "fagocitados" por las células. También puede tratarse de liposomas en los que la molécula de ADN se incorpora y que se fusionan en la membrana plásmica. Los vectores sintéticos de transferencia de genes son en general lípidos o polímeros catiónicos que acomplejan el ADN y forman con estos una partícula que porta las cargas positivas en la superficie. Estas partículas son capaces de interactuar con las cargas negativas de la membrana celular, y después atravesarla. Se pueden citar como ejemplos de tales vectores el DOGS (Transfectam ™) o la D0TMA (Lipofectin™) . También se desarrollaron proteínas quiméricas: están constituidas de una parte policatiónica que condensa el ADN, ligado a un ligando que se fija en un receptor membranal y entra el complejo en las células por endocitosis. Las moléculas de ADN de acuerdo a la invención también pueden utilizarse para transferir genes en las células por técnicas físicas de transfección tal como bombardeo, electroporación, etc. Además, previamente a su utilización terapéutica, las moléculas de la invención pueden linearizarse opcionalmente por ejemplo por corte enzimático.
Al respecto, otro objetivo de la presente invención se refiere a cualquier composición farmacéutica que contiene un ADN plasmídico metil o tal como se definió antes. Este ADN puede estar desnudo o asociado a un vector químico y/o bioquímico de transfección. Las composiciones de acuerdo a la invención pueden formularse con objeto de administraciones por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica, etc. De preferencia, la molécula de ADN se utiliza de una forma inyectable o en aplicación. Puede mezclarse con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, particularmente para una inyección directa a nivel del sitio a tratar. Puede tratarse en particular de soluciones estériles , isotónicas, o de composiciones secas, particularmente liofilizadas, que, por adición de acuerdo al caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. Puede tratarse en particular de amortiguadores Tris o PBS diluidos en glucosa o cloruro de sodio. Una inyección directa del ácido nucleico en la región de alcance del paciente es interesante porque permite concentrar el efecto terapéutico al nivel de los tejidos afectados. Las dosis de ácidos nucleicos utilizadas pueden adaptarse en función de diferentes parámetros, y particularmente en función del gen, del vector, de la forma de administración utilizada, de la patología referida o aún de la duración del tratamiento investigado.
La presente invención se describirá mas completamente con la ayuda de los siguientes ejemplos, que deben considerarse como ilustrativos y no limitativos.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Mapa del plásmido pXL2784
Figura 2. Mapa de restricción del plásmido pXL2784
Figura 3. Perfil de digestión de los plásmidos 1-pXL2784, 2-pX12784 metilado, 3-pXL2784+pAIT2 metilados y 4-pAIT2 metilado, digeridos por las enzimas A-AatII , B-BstBI, C-HindIII, D-Hpall, E-EcoRI (M es el marcador del peso molecular de 1KB de escala) .
TÉCNICAS GENERALES DE CLONACIÓN Y DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Los métodos clásicos de biología molecular tal como la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio-bromuro de etidio, las digestiones por enzimas de restricción, la electroforesis en gel, la electroelución de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa, la transformación de E. coli, la precipitación de ácidos nucleicos etc, se describen en la literatura (Maniatis et al . , 1989, Ausubel et al . , 1987). Las secuencias nucleotídicas se determinaron por el método de terminación de cadenas siguiendo el protocolo ya presentado (Ausubel et al. , 1987) .
Las enzimas de restricción se suministraron por New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) o Amersham Ltd (Amersham) .
Para ligaduras, los fragmentos de ADN se separaron de acuerdo a su tamaño en geles de agarosa al 0.7% o de acrilamida al 8%, se purificaron por electroforesis y después electroelución, se extrajeron con fenol, se precipitaron con etanol y después se incubaron en un amortiguador Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 M, ATP 2 mM, en presencia de ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) . Los oligonucleótidos se sintetizan utilizando la química de fosforamiditas protegidas en b por un grupo cianoetilo (Sinha et aJ... , 1984, Giles 1985) con el sintetizador automático de ADN Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer utilizando las recomendaciones del fabricante.
Los medios de cultivo LB y 2XTY se utilizaron para la parte bacteriológica (Maniatis et al., 1989).
Los ADN plasmídicos también se purificaron siguiendo la técnica de lisis alcalina (Maniatis et al., 1989).
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Descripción del plásmido GT
Numerosos casetes de expresión eucariotes portados por los plásmidos replicantes en la bacteria E___ coli se conocen por el experto en el arte. Estos casetes pueden expresar los genes reporteros como el gen que codifica la b-galactosidasa de E. coli, o la cloranfenicol acetiltransferasa del transposón Tn9, o la luciferasa, o los genes de interés en terapia génica. Estos casetes contienen un promotor que puede ser viral o eucariote. Estos sistemas de expresión pueden ser tejido específico y/o inducibles o bien tener una ubicuidad de expresión. El cásete utilizado en este ejemplo comprende el gen luc , que codifica para la luciferasa de Photinus pyralis y el promotor pCMV, promotor/aumentador intermedio del citomegalovirus humano. El gen luc posee 4.78% de dinucleótidos 5'-CG-3', y el promotor viral pCMV 5%. Estos porcentajes son por consiguiente elevados con respecto a la frecuencia débil de 0.8% de 5'-CG-3' en las secuencias de mamíferos. En presencia de una metilasa (tal como la metilasa M. Sssl o las CpG metilasas endógenas en los mamíferos) , el promotor pCMV y el gen luc pueden ser así altamente metilados .
Este cásete de expresión se clonó en el plásmido replicante en E_¡_ coli pXL2784 en el que el mapa se presenta en la figura 1. El plásmido tiene un tamaño de 6390 pb y contiene 5.8% de dinucleótidos 5'-CG-3'. El plásmido pXL2784 se construyó a partir del vector pXL2675 (2,513 kb) , replicón mínimo de ColEl salido de pBluescript (ORÍ) y que tiene por marcador de selección el gen del transposón Tn5 que codifica para la resistencia a canamicina. El plásmido pXL2784 también contiene una secuencia TH (GAA)17 que puede ligarse a un oligómero (CTT)n donde n=l a 17, para generar localmente una estructura de triple hélice y permitir una purificación por afinidad. El plásmido pXL2784 posee el locus cer (382 pb) de ColEl; el locus cer contiene una secuencia de sitio específico de las recombinasas XerC/XerD y conduce a la resolución de dímeros de plásmidos (Summers et. Coll. 1988 EMBO J. 7 p851) . El transgen clonado en este plásmido pXL2784 es un cásete de expresión (3.3 kb) del gen luc que codifica la luciferasa de Photinus pyralis (que proviene de pGL2 básico de Promega) bajo control del aumentador/promotor pCMV citomegalovirus humano (que proviene de pcDNA3 de Invitrogen) .
Ejemplo 2 : Construcción de un cásete de expresión de una ADN metiltransferasa
Este ejemplo describe la estructura de un cásete de expresión de la metilasa M. Sssl de Spiroplasma sp. MQ1. Se entiende que el mismo principio puede aplicarse en la construcción del cásete de expresión de cualquier otra enzima de acuerdo a la invención.
El cásete de expresión utilizado comprende el gen que codifica la metilasa M. Sssl de Spiroplasma sp. MQ1 que se expresa bajo el control del promotor plac. Así, en presencia de IPTG (isopropiltio-b-D-galactosida) la metilasa se sintetiza y se activa (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793) .
Este cásete está presente en el plásmido pAIT2, que tiene por replicón el pACYC184 y porta además el gen del transposón Tn903 que codifica para la resistencia a la lividomicina, permitiendo la selección de células huésped transformadas .
Ejemplo 3. Producción de ADN plasmídico pXL2784 metilado en los residuos citosina de los dinucleótidos 5' -CG-3 ' .
El plásmido pXL2784 se metilo en las citosinas de todos los dinucleótidos 5'-CG-3' con la metilasa M. Sssl de
Spiroplasma sp. MQ1. La forma de metilación de acuerdo a la invención utiliza está enzima y el plásmido se metila en el transcurso de la producción en la bacteria.
Por esto, la cepa de E. coli ER 1821 en la que el genotipo es F" 1" endAl thi-1 supE44 mcrA5 D (mrr-hshRMS-mcrB)
1-: : IS10, y que porta el plásmido pAIT2, se transformó por el método TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coll.
1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580) por el plásmido pXL2784.
Las transformantes se seleccionaron en medio LB que contenía canamicina 50 mg/l y lividomicina 10Omg/l a fin de seleccionar el pXL2784 que porta el gen del transposón Tn5 que codifica para la resistencia a canamicina y el pAIT2 que porta el gen del transposón Tn903 para la resistencia a lividomicina. Cuando un transformante ER1821, pAIT2, pXL2784 se cultivó en medio LB canamicina 50 mg/l + lividomicina 100 mg/l + IPTG 2.5 mM a 37°C durante 15 horas, se metilo el ADN plasmídico extraído.
La metilación se verificó digiriendo las preparaciones plasmídicas con las enzimas de restricción Hpall, AatII, BstBl . La integridad y la presencia de dos plásmidos se verificaron digiriendo estas preparaciones con las enzimas de restricción Hinddll «y EcoRI, ver figura 2. Las enzimas de restricción Hpall, AatII, BstBl son tres enzimas en las que el corte no es posible si el residuo citosina del nucleótido 5'-CG-3', contenido en el sitio de corte, está metilado. En el promotor pCMV se localizaron cuatro sitios de reconocimiento de AatII; en el gen luc se mapearon dos sitios de reconocimiento de BstBl y once sitios de reconocimiento de Hpall; está última enzima cortó el plásmido pXL2784 en 30 fragmentos. En la fotografía de gel de agarosa coloreada con bromuro de etidio (figura 2), se verifica que con la preparación plasmídica pAIT2 + pXL2784 metilado o con la preparación plasmídica pXL2784 metilado y purificado por cromatografía de afinidad (ver ejemplo 4) ninguna digestión tiene lugar con las enzimas Hpall, AatII, BstBl cuando las digestiones por las enzimas HindIII y EcoRI conducen al perfil esperado después del mapa de restricción. Las digestiones controladas por las enzimas Hpall, AatII, BstBl del plásmido pXL2784 presentan el perfil descontado después del mapa de restricción.
Estos resultados demuestran que el ADN plasmídico extraído se metilo, en los residuos citosina del dinucleótido 5'-CG-3'. Estos resultados demuestran que la metilación se refiere a más de 90% de las citosinas.
Ejemplo 4. Utilización de plásmidos metilados para la transferencia de material genético.
Este ejemplo demuestra que el ADN plasmídico metilado de acuerdo a la invención conserva su capacidad de transfectar células, de replicarse, y de expresar un gen de interés.
A protocolo de preparación de las soluciones utilizadas para la transfección
Dos lotes de plásmidos se utilizaron para los estudi ^s comparativos:
a) el pXL2784,
b) el pXL2784 metilado.
El plásmido pXL2784 metilado se obtuvo en forma de una mezcla con el plásmido pAIT2 que aseguró la metilación después de la co-transformación bacteriana. Un fraccionamiento por cromatografía de afinidad se realizó para purificar el plásmido de interés y la técnica utilizada se describe en la solicitud N° FR 94tl5162. Una etapa de diálisis contra NaCl 0.15M pudo realizarse para eliminar el amortiguador que constituye la fase de elución de la columna.
Cuando el plásmido pXL2784 se utilizó en referencia se purificó de acuerdo al mismo protocolo que el descrito anteriormente .
En este ejemplo la vectorización del ADN se aseguro por un lípido catiónico, RPR120535A, que pertenece a una serie descrita en la solicitud de patente N° FR 95 13490. Se entiende que puede utilizarse cualquier otro vector de transferencia química o bioquímica.
Las soluciones de transfección se prepararon a partir de una mezcla volumen a volumen de ADN a 30 µg/ml y solución acuosa de lípido catiónico RPR 120535 a 90 µM, la relación lípido catiónico/ADN es por consiguiente de 3 nanomoles de lípido catiónico/µg ADN. Después de la homogeneización en el vórtex y la incubación de al menos 15 minutos a temperatura ambiente las soluciones ADN/lipofectante se distribuyen al
4.8% (V/V) final en los pozos donde las células se lavaron con medio desprovisto de proteínas (suero) y puestas en crecimiento durante el tiempo de transfección en medio desprovisto de suero.
B protocolo de transfección
Las muestras de 1.105 células [NIH3T3 (fibroblastos de ratón) y Hela (carcinoma uterino humano)] en fase exponencial de crecimiento en 2 cm2 (500µl de medio sin suero/pozo) se trataron con 25 µl de solución de transfección que corresponde al aporte de 0.375 µg de ADN/1.105 células. Después de una incubación de 2thoras a 37°C bajo 5% de C02 en atmósfera húmeda el medio de crecimiento se suplemento con suero de feto de ternero al 8% final (V/V) .
A 40 horas de post-transfección las células se lavaron con PBS y se usaron con un amortiguador que contenía Tritón X-100 a 1% y DTT 2mM. La actividad luciferasa expresada se dosificó por emisión de luz [RLU = unidad relativa de luz] en presencia de luciferina, coenzima A y ATP durante 10 segundos y se relacionó a mg de proteínas extraídas con el amortiguador de lisis.
C resultados
Los resultados obtenidos de acuerdo a las condiciones descritas anteriormente figuran en la siguiente tabla.
Actividad enzimática en RLU/10 segundos/mg proteína (coeficiente de variación % [3 experimentos de transfección por resultado]
Teniendo en cuenta los coeficientes de variación obtenidos para este tipo de experimentos se puede concluir que no existen diferencias significativas en cuanto a la expresión de los dos plásmidos utilizados en las mismas condiciones de transfección. Además la actividad luciferasa obtenida es del mismo orden de magnitud para las dos etapas de purificación consideradas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
Claims (19)
1. Procedimiento de producción de ADN útil en terapia génica, caracterizado porque el ADN se produce en una célula que contiene un cásete de expresión de una ADN metiltransferasa que permite metilar los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3'.
2. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la célula es una célula procariota.
3. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizado porque la célula es una bacteria.
4. Procedimiento de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el cásete de expresión es portado por un vector replicante.
5. Procedimiento de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el cásete de expresión está integrado en el genoma de la célula.
6. Procedimiento de acuerdo a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cásete de expresión comprende un ácido nucleico que codifica una ADN metiltransferasa que permite metilar los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' bajo el control de un promotor.
7. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible.
8. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la ADN metiltransferasa metila preferentemente los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3* .
9. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado porque la ADN metiltransferasa se escoge entre la metilasa M.SssI, la metilasa de ratón y la metilasa humana.
10. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque más del 50% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5f-CG-3' del ADN plasmídico están metilados.
11. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque más del 80% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' del ADN plasmídico están metilados.
12. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque más del 90% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' del ADN plasmídico están metilados .
13. Utilización de un ADN plasmídico para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento terapéutico o diagnóstico del cuerpo humano o animal, caracterizado porque más del 50% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' del ADN plasmidico están metilados.
14. Utilización de un ADN plasmídico para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento terapéutico o diagnóstico del cuerpo humano o animal, caracterizado porque más del 80% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' del ADN plasmídico están metilados.
15. Utilización de un ADN plasmídico para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento terapéutico o diagnóstico del cuerpo humano o animal, caracterizado porque más del 90% de los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3' del ADN plasmídico están metilados.
16. Procedimiento de preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento terapéutico o diagnóstico del cuerpo humano o animal que comprende las siguientes etapas: - la producción de ADN por cultivo de una célula que comprende dicho ADN y un cásete de expresión de una ADN metiltransferasa que permite metilar los residuos citosina de los dinucleótidos 5'-CG-3', - la recuperación de dicho ADN, y, - el acondicionamiento de dicho ADN con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizado porque el ADN es un ADN plasmídico que contiene un ácido nucleico de interés terapéutico.
18. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizado porque el ADN es un minicírculo que contiene un ácido nucleico de interés terapéutico.
19. Composición que contiene un ADN bacteriano en el que al menos 50% de los residuos citosina de los dinucleótidos '-CG-3' están metilados.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR96/08327 | 1996-07-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA98010328A true MXPA98010328A (es) | 1999-07-06 |
Family
ID=
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