MXPA98008583A

MXPA98008583A - Novedoso esteroide de planta 5alfa reductasa, det2

Info

Publication number: MXPA98008583A
Application number: MXPA/A/1998/008583A
Authority: MX
Inventors: Chory Joanne; Li Jianming
Original assignee: The Salk Institute For Biological Studies
Priority date: 1996-04-18
Filing date: 1998-10-16
Publication date: 1999-09-01

Abstract

Se provee un novedoso esteroide de planta 5 reductasa, DET2, asícomo polinucleótidos que codifican DET2. DET2 o el esteroide de mamífero 5alfa-reductasa esútil para promover rendimiento incrementado de la planta y/o biomasa incrementada de la planta. También se proveen planta modificadas genéticamente, caracterizadas por tener rendimiento incrementado, y métodos para producir tales plantas.

Description

NOVEDOSO ESTEROIDE DE PLANTA 5a REDUCTASA, DET2 Campo de la Invención La presente invención se relaciona generalmente con la ingeniería genética de plantas, y especificamente con el rendimiento de plantas genéticamente diseñadas, caracterizadas como teniendo un fenotipo de rendimiento de cosecha incrementada. Antecedentes de la Invención El crecimiento y desarrollo de la planta están gobernados por interacciones complejas entre las señales ambientales y los factores internos . La luz regula muchos procesos de desarrollo a lo largo del ciclo de vida de la planta, desde la germina-ción de la semilla hasta la inducción floral (Chory, J. Trends Genet . , 9 : 161 , 1993; McNellis y Deng, Plant Cell , 7:1749, 1995), y ocasiona cambios morfológicos profundos en plántulas jóvenes. En la presencia de luz, se inhibe el crecimiento del hipocotileo, se expanden los cotiledones, se desarrollan las hojas, se dife-rencian los cloroplastos, se producen clorofilas, y se expresan de manera coordinada muchos genes que se pueden inducir por luz. Se ha sugerido que las hormonas de plantas, de las cuáles se sabe que afectan la división, alargamiento, y diferenciación de las células, están directamente envueltas en la respuesta de las plantas a las señales de luz (P.J. Davies, Plant Hormones : Physiology, Biochemistry and Molecular Biology, páginas 1-836, 1995; Greef y Freddericq, Photomorphogenesis, páginas 401-427, 1983) . Las interacciones entre las trayectorias de la fototrans-ducción y las hormonas de la planta, sin embargo, no se entienden bien. Los brasinoesteroides son una clase única de productos naturales biológicamente activos, que poseen actividad altamente especifica y actividad de hormona esteroidal de planta. Sus concentraciones efectivas bajas para usarse en cosechas los hace ambientalmente seguros, y aquellos brasinoesteroides que se usan a gran escala generalmente no son tóxicos. Al nivel fisiológico, los brasinoesteroides producen muchos cambios y pueden representar una nueva clase de hormonas en las plantas . Los aspectos económicos de los brasinoesteroides pueden tener efectos mundiales. Los brasinoesteroides se pueden usar como protectores de la planta tanto contra plaguicidas como contra adversidad ambiental. En adición, parece que los brasinoesteroides son importantes para el control de insectos. Además, los brasinoesteroides pueden regular alguna etapa del ciclo reproductivo en las plantas, y otras especies, proporcionando mediante lo mismo los medios para incrementar o disminuir el proceso reproductivo. Por ejemplo, en ciertas cosechas hortícolas pudiera ser deseable eliminar el proceso de florecimiento para asegurar el rendimiento continua de otros tejidos tales como hojas, bulbos, y otros órganos de almacenamiento. Esta modulación del proceso reproductivo puede ser importante en el control de ciertas malas hierbas que contie-nen semillas, en donde la suspensión del ciclo de florecimiento elimina las siguientes generaciones . Parece que los brasinoesteroides también estimulan el crecimiento de la raiz, y la aplicación externa no ocasiona ninguna deformidad de las plantas . Los brasinoesteroides califican para clasificación como plaguicidas bioquímicos . Estos plaguicidas generalmente se distinguen de los plaguicidas químicos convencionales por sus modos de acción únicos, concentración efectiva baja, especies objetivo, y especificidad. Históricamente, los brasinoesteroides no se han usado en aplicaciones agrícolas reales debido al gasto envuelto en producirlos, así como a la dificultad en su purificación. Compendio de la Invención Aunque las hormonas esteroides son importantes para el desarrollo animal, el papel fisiológico de los esteroides de plantas es mayormente desconocido. La presente invención se basa en el descubrimiento del gen DET2, el cuál codifica una proteína que comparte identidad de secuencia significativa con el esferoide 5?f-reductasa de mamífero, y está envuelto en la trayectoria biosintética del brasinólido. Una mutación del glutamato 204, que se requiere para la actividad de la reductasa esferoide humana, suprime la actividad in vivo del DET2, y conduce a defectos en el desarrollo regulado por luz. Estos defectos se pueden mejorar mdiante la aplicación del esferoide de planta, brasinólido. En una primera modalidad, la invención proporciona el polipéptido DET2 y las secuencias de polinucleótidos que codifican a DET2. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta genéticamente modificada, caracterizada porque tiene un rendimiento incrementada en comparación con una planta de tipo silvestre. El método incluye transferir cuando menos una copia de un polinucleótido que codifique a DET2, o un polinucleótido que codifique a otro esferoide 5 -reductasa (por ejemplo, de mamífero) asociado de manera operable con un promotor a una célula de planta, para obtener una célula de planta transformada, y producir una planta a partir de la célula de planta transformada. Estas plantas genéticamente modificadas pueden exhibir un rendimiento incrementada de cosecha o una biomasa incrementada, por ejemplo. En todavía otra modalidad de la invención, se proporciona un método para producir una planta caracterizada porque tiene un rendimiento incrementada por medio del contacto de la planta que tiene un gen DET2 nativo enlazado de manera operable a su promotor nativo, con una cantidad que induce al promotor de un agente que induce la expresión del gen DET2, en donde la inducción de la expresión del gen DET2 da como resultado el rendimiento de una planta que tiene un rendimiento incrementada en comparación con una planta que no se pone en contacto con el agente de inducción. En consecuencia, se pueden usar factores de transcripción o agentes químicos para incrementar la expresión del DET2 en una planta, con el objeto de proporcionar un rendimiento incrementada . Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una ilustración esquemática del análisis de clonación y secuencia del gen DET2. La Figura 1A muestra un compendio de la clonación posicional. Se identificaron tres clases de ADNc de una genoteca de ADNc de Arabidopsis con el cósmido 217-61 como una sonda, y se indican sus posiciones relativas y direcciones transcripcionales (5' —* 3 ' ) . La Figura IB muestra un mapa de la estructura genética del DET2 y las mutaciones en el gen DET2. Las líneas gruesas indican los exones, y el cuadro abierto denota un intrón. Las posiciones de las mutaciones son relativas al codón de iniciación. Z, codón de detención. La Figura 1C muestra el nucleótido y la secuencia de amino ácidos deducida de DET2 (SEQ ID NO:l y 2, respectivamente) . La Figura 2 muestra una foto de plántulas que crecieron por luz, de 12 días de edad (Figura 2A) , y plántulas que crecieron en la oscuridad de 10 días de edad (Figura 2B) , después de la complementación de det2 mediante el gen DET2 de tipo silvestre. (De izquierda a derecha en cada panel) Col-0 tipo silvestre, det2-l, y det2-l transgenético que contiene el cósmido 217-61. La Figura 3 muestra una comparación de secuencias del DET2 con 5a-reductasas esferoidales de mamífero. La Figura 3A es la secuencia de amino ácidos deducida del gen DET2 alineado con 5a-reductasas esferoidales de rata (rS5Rl y rS5R2) y de humano (hS5Rl y hS5R2) . Los guiones indican separaciones introducidas para maximizar el alineamiento, y los residuos conservados en cuando menos dos de las cinco secuencias están sombreados . La flecha indica el glutamato mutado en los alelos det2-l y det2-6. (La abreviatura de una sola letra para los residuos amino ácidos son como sigue: A, Alta; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, lie; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, The; V, Val; , Trp; e Y, Tyr) . La Figura 3B muestra un análisis filogenético de la relación entre la proteína DET2 y las 5a-reductasas esferoidales de mamífero. La escala mide la distancia relativa entre las secuencias. La Figura 4A muestra la función propuesta de la proteína DET2 en la trayectoria biosintética del brasinólido. El asterisco (*) indica seis pasos intermedios (Fujicka, y colabora-dores, supra) . La Figura 4B muestra plántulas de Arabadopsis que crecieron en la oscuridad, de 10 días de edad, y la Figura 4C muestra plántulas que crecieron a la luz, de 12 días de edad. De izquierda a derecha se muestran en cada panel plantas de tipo silvestre, det2-l, y det2-l tratadas con brasinólido. La Figura 4D muestra un alargamiento del hipocotíleo inducido mediante el brasinólido de las plántulas que crecieron en la oscuridad y plantas tipo silvestre que crecieron a la luz. Los datos representan el término medio ±SE obtenido a partir de determinaciones en triplicado, cada una con un tamaño de muestra promedio de 12 plántulas . La Figura 5 muestra las reacciones químicas catalizadas mediante 5 -reductasas esferoidales de mamífero (panel A) y el DET2 de Arabidopsis (panel B) . La Figura 6 muestra que el DET2 de Arabidopsis tiene actividad de 5 -reductasa esferoidal. Se muestra el análisis de cromatografía de capa delgada de los esteroides producidos mediante la incubación de 64 nM de [14C] progesterona con células embriónicas 293 humanas transfectadas con un plásmido de expre-sión pCMV5 que contiene ADNc de 5a-reductasa esferoidal humana tipo 1 (carril 1), ningún inserto (carril 2), DET2 tipo silvestre (carril 3), o det2-l (carril 4) . La Figura 7 muestra la caracterización bioquímica de la actividad de 5a-reductasa esferoidal del DET2. La Figura 7A es un diagrama Lineweaver-Burk para la [14C] testosterona . La Figura 7B es un diagrama Lineweaver-Burk para la [14C] progesterona. La Figura 7C muestra la inhibición competitiva de la actividad de la enzima de DET2 mediante 4-MA. Se hicieron ensayos sobre la actividad de la 5a-reductasa esferoidal en la presencia de la concentración indicada de 4-MA, y ya sea 0.34 mM ó 0.68 mM de [14] progesterona . La intersección de las dos líneas define la K± (Dixon, M. y Webb, E.C., (1979) Enzymes Academic, Nueva York) . La Figura 7D muestra un perfil de pH de la actividad de 5c¿-reductasa esferoidal del DET2 usando [14C] testosterona como un sustrato. Se realizaron ensayos a los pHs indicados en la presencia de 5 mg de proteína de producto de la lisis celular, 1 J?M de [14C] testosterona, y 2.0 mM de NADPH durante 20 minutos, a 37°C. La Figura 8 muestra que la 5 -reductasa esferoidal humana puede complementar la mutación det2-l . La Figura 8A muestra las representaciones esquemáticas de los plásmidos de expresión pMD-hS5R usados para transformar los mutantes det2-l . Se hicieron dos construcciones para cada tipo de ADNc de 5 -reductasa esferoidal humana: una más corta que contiene una región truncada no trasladada en 3 ' , y una más larga que contiene ADNc humano de longitud completa. Los fragmentos de ADN indicados son 5a-reductasa esferoidal humana (hS5R) , promotor de sintasa de nopalina (NosPro) y terminador transcripcional (Nos-ter) , gen de fosfotransferasa de neomicina (NPTII) , promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (35Spro) , y múltiples sitios de clonación (MCS) . La Figura 8B-D muestra la complementación de la mutación det2-l mediante el ADNc de 5a-reductasa esferoidal humana. La Figura 8B muestra plántulas que crecieron en la oscuridad, de 7 días de edad. La Figura 8C muestra plántulas que crecieron a la luz, de 7 días de edad. La Figura 8D muestra plántulas que crecieron a la luz, de 3 semanas de edad. (De izquierda a derecha en el panel B, C, y D) Col-0 tipo silvestre, det2-l transgenético que contiene el ADNc tipo 1 de 5 -reductasa esferoidal humana de longitud comple¬ • ta, y det2-l transgenético que contiene el ADNc tipo 2 de 5o¡- reductasa esferoidal humana de longitud completa. 5 La Figura 9 muestra el efecto de 4-MA en las longitudes del hipocotíleo de plantas de det2-l , de tipo silvestre y det2-l transgenético. Los datos representan el término medio ±SE obtenido a partir de 25 plántulas de cada genotipo. La Figura 10 muestra que el nivel de expresión del ADNc l^L de 5a-reductasa esferoidal humana está correlacionado con el fenotipo en plantas de det2-l transgenético. La Figura 10A muestra la longitud del hipocotileo de plántulas que crecieron en la oscuridad de Col-0 tipo silvestre, det2-l y la progenie de segregación de plantas de det2-l transge- 15 nético primarias. Los datos representan el término medio ±SE obtenido a partir de una población con un tamaño promedio de muestra de 60 plántulas. La Figura 10B muestra un análisis de mancha Northern de expresión de transgen. Cada carril contenía 20 miligramos de ARN 0 de planta total. La Figura 10C muestra la morfología de plántulas que crecieron a la luz, de 14 días de edad. (De izquierda a derecha en cada panel), 1, det2-l ; 2, hS5Rl-l .3kb ( 04 ) ; 3, hS5Rl- 1.3kb(08); 4, hS5Rl-2. lkb (04) ; 5, hS5Rl-2. lkb (17 ) ; 6, tipo 5 silvestre; 7, hS5R2-0.8kb (01) ; 8, hS5R2-0.8kb (12 ) ; 9, hS5R2-0.8kb(15); 10, hS5R2-2.4kb ( 04 ) ; 11, hS5R2-2.4kb ( 05 ) ; 12, hS5R2- 2.4kb(12) . Descripción de las Modalidades Preferidas La presente invención proporciona un novedoso esferoide 5 -reductasa, DET2, que está envuelto en la síntesis de la hormona esferoidal de planta, brasinólido. La sobreexpresión de la reductasa DET2 o el esferoide 5 -reductasa de mamífero (por ejemplo, humano, mono, rata, ratón) en plantas transgenéticas ocasiona que esas plantas se vuelvan significativamente más largas y más robustas que sus contrapartes de tipo silvestre, incrementando de esta manera las producciones de las plantas. Como se usa en la presente, el término "rendimiento" o "rendimiento de la planta" se refiere al crecimiento incrementado de la planta, el crecimiento incrementado de la cosecha, y/o la producción incrementada de biomasa. En una primera modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido DET2 sustancialmente puro. El polipéptido DET2 se ejemplifica mediante la secuencia de amino ácidos que se muestra en la Figura 1C y la SEQ ID NO: 2. El polipéptido DET2 se caracteriza como teniendo un peso molecular predicho de 31 kDa, según se determina mediante electrofóresis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio, que tiene actividad de 5a-reductasa esferoidal, y funcionando en la trayectoria biosintética del brasinólido. La secuencia de amino ácidos deducida del gen DET2 es similar a aquella de las 5 -reductasas esferoidales de mamífero, con 38 a 42 por ciento de identidad de secuencia. La similitud de secuencia se incrementa a 54 a 60 por ciento cuando se toman en cuenta sustituciones conservadoras. Se han aislado dos isozimas (tipos 1 y 2) de 5a-reductasa esferoidal en ratas y humanos (Wilson, y colaboradores, Endocr. Rev. , 1.4:577, 1993; Russell y Wilson, Annu . Rev. Biochem . , 63.:25, 1994). El análisis filogené-tico muestra que el DET2 está cuando menos tan cercanamente relacionado con las enzimas tipo 2, como las enzimas tipo 2 están relacionadas con las enzimas tipo 1. El término "sustancialmente puro" como se usa en la presente, se refiere al polipéptido DET2 que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuáles éste está naturalmente asociado, ün experto en la técnica puede purificar el DET2 usando técnicas estándares para la purificación de proteínas. El polipéptido sustancialmente puro rendirá una sola banda mayor de aproximadamente 31kD en un gel de poliacrilamida de desnaturalización. La pureza del polipéptido DET2 también se puede determinar mediante análisis de secuencia de amino ácidos con terminal amino. La invención incluye el polipéptido DET2 funcional, y los fragmentos funcionales del mismo. Como se usa en la presente, el término "polipéptido funcional" se refiere a un polipéptido que posee función o actividad biológica que se identifica a través de un ensayo funcional definido, y que está asociado con una alteración biológica, morfológica, o fenotípica particular en la célula. El término "fragmentos funcionales del polipéptido DET2", se refiere a todos los fragmentos del DET2 que retienen la actividad del DET2, por ejemplo, actividad de 5 -reductasa 5 esferoidal. Los fragmentos biológicamente funcionales, por ejemplo, pueden variar en tamaño desde un fragmento de polipéptido tan pequeño como un epítopo capaz de fijar una molécula de anticuerpo, hasta un polipéptido grande capaz de participar en la inducción o programación característica de cambios fenotípicos lft adentro de una célula. La actividad de 5a-reductasa esferoidal del DET2, y el papel de éste en la trayectoria biosintética del brasinólido, se pueden utilizar en bioensayos para identificar fragmentos biológicamente activos del polipéptido DET2 o los polipéptidos rela- 15 donados. Por ejemplo, el DET2 puede catalizar la conversión del campesterol al campestanol, por lo tanto, se puede realizar un ensayo para detectar la actividad enzimática del DET2. Se pueden utilizar inhibidores del DET2 para ocasionar la pérdida de la función del DET2, dando como resultado, por ejemplo, plantas 0 masculinas estériles, estatura reducida, etcétera. Por ejemplo, la inhibición del DET2 es útil en horticultura para crear variedades enanas . Modificaciones menores de la secuencia primaria de amino ácidos del DET2 pueden dar como resultado proteínas que 5 tienen actividad sustancialmente equivalente al polipéptido DET2 descrito en la presente en la SEQ ID NO: 2 (Figura 1C) . Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. Todos los polipéptidos producidos mediante estas modificaciones están incluidos en la presente siempre y cuando esté presente la actividad biológica del DET2, por ejemplo, la actividad de 5a-reductasa esferoidal está presente para promover el rendimiento y/o biomasa incrementados de la planta o la cosecha. Además, la supresión de uno o más amino ácidos también puede dar como resultado una modificáción de la estructura de la molécula resultante, sin alterar significativamente su actividad. Esto puede llevar al desarrollo de una molécula activa más pequeña que puede tener utilidad más amplia. Por ejemplo, pudiera ser posible remover los amino ácidos con terminal amino o carboxi que se requieren para la actividad de DET2. El polipéptido DET2 incluye secuencias de amino ácidos sustancialmente iguales a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. El término "sustancialmente igual" se refiere a las secuencias de amino ácidos que retienen la actividad del DET2 como se describe en la presente, por ejemplo, actividad de 5a-reductasa esferoidal. Los polipéptidos DET2 de la invención incluyen variaciones conservadoras de la secuencia de polipéptidos. El término "variación conservadora" como se usa en la presente, denota el reemplazo de un residuo amino ácido por otro residuo, biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico tal como isoieucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina, y similares. El término "variación conservadora" también incluye el uso de un amino ácido sustituido en lugar de un amino ácido madre no sustituido, con la condición de que los anticuerpos que surjan para el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido. Las proteínas de la invención se pueden analizar mediante electrofóresis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfa-to de sodio estándar y/o análisis de inmunoprecipitación y/o análisis de mancha Western, por ejemplo. En adición, se puede usar el ensayo de proteina sintetizada in vi tro (IVS) , como se describe en los presentes ejemplos, para analizar el producto de la proteína DET2. La invención también proporciona una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 2. Se ha mapeado el gen DET2 a un intervalo de 150-kb en el cromosoma 2 de Arabidopsis . El transcrito DET2 contiene un solo marco de lectura abierto largo que codifica una proteína de 262 amino ácidos. El término "aislado" como se usa en la presente, incluye polinucleótidos sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuáles éstos están naturalmente asociados . Las secuencias de polinucleótidos de la invención incluyen secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican a DET2. Se entiende que en la presente se incluyen los polinucleótidos que codifican todas las porciones o porciones variables de DET2, siempre y cuando codifiquen un polipéptido con actividad de DET2. Esos polinucleótidos incluyen polinucleótidos que ocurren naturalmente, sintéticos, e intencionalmente manipulados, asi como variantes de empalme. Por ejemplo, se pueden alterar las porciones de la secuencia de ARNm debido a patrones de empalme de ARN alternos, o al uso de promotores alternos para la transcripción de ARN. Por otra parte, los polinucleótidos DET2 de la invención incluyen polinucleótidos que tienen alteraciones en la secuencia de ácidos nucleicos que todavía codifican al DET2 funcional. Las alteraciones en el ácido nucleico de DET2 inclu-yen, pero no están limitadas, a mutaciones intragenéticas (por ejemplo, mutación de punto, sin sentido (detención), anti-sentido, sitio de empalme y cambio de marco) y supresiones heterócigas u homócigas . La detección de esas alteraciones se puede hacer mediante métodos estándares conocidos para aquellos de experien-cia en la técnica, incluyendo análisis de secuencia, análisis de mancha Southern, análisis basados en reacción de cadena de polimerasa (por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa múltiple, sitios etiquetados de secuencia (STSs) ) e hibridación in situ . Las secuencias de polinucleótidos de la invención también incluyen secuencias anti-sentido. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que se degeneran como un resultado del código genético. Hay 20 amino ácidos naturales, la mayoría de los cuáles se especifican mediante más de un codón. Por lo tanto, en la invención se incluyen todas las secuencias de nucleótidos degeneradas, siempre y cuando la secuencia de amino ácidos del polipéptido DET2 codificado mediante esas secuencias de nucleótidos retenga la actividad de 5?f-reductasa esferoidal de DET2. Un "polinucleótido funcional" denota un polinucleótido que codifica un polipéptido funcional como se describe en la presente. En adición, la invención también incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de una secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 2, y que tiene cuando menos un epítopo para un anticuerpo inmunorreactivo con el polipéptido DET2. Como se usa en la presente, los términos secuencias de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la invención se refieren a secuencias de ADN, ARN y ADNc. El polinucleótido que codifica a DET2 incluye la secuencia de nucleótidos en la Figura 1C (SEQ ID NO:l), así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias para esa secuencia. Una secuencia complementaria puede incluir un nucleótido anti-sentido. Cuando la secuencia es ARN, los desoxirribonucleótidos A, G, C y T de la Figura 1C se reemplazan por los ribonucleótidos A, G, C y U, respectivamente. En la invención también están incluido fragmentos ("sondas") de las secuencias de ácidos nucleicos descritos anteriormente que tienen cuando menos 15 bases de longitud, lo cuál es suficiente para permitir que la sonda hibridice selectivamente a ADN que codifica la proteína de la Figura 1C (SEQ ID NO : 2 ) . "Hibridación selectiva" como se usa en la presente se refiere a la hibridación bajo condiciones fisiológicas moderadamente estringentes o altamente estringentes . (Vea, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y colaboradores, 1989 Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., incorporado a la presente como reférencia) , que distingue las secuencias de nucleótidos de DET2 relacionadas de las no relacionadas. En las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones que se usan para lograr un nivel particular de estringencia variarán dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridizando . Por ejemplo, se pueden considerar la longitud, el grado de complementaridad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC v. AT) , y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN y ADN) de las regiones de hibridación de los ácidos nucleicos, al seleccio-nar las condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, en un filtro. Un ejemplo de condiciones de estringencia progresivamente más elevadas es como sigue: 2 x SSC/0.1% SDS a aproximada-mente la temperatura ambiente (condiciones de hibridación); 0.2 x SSC/0.1% SDS a aproximadamente la temperatura ambiente (condiciones de baja estringencia); 0.2 x SSC/0.1% SDS a aproximadamente 42°C (condiciones de estringencia moderada); y 0.1 x SSC a aproximadamente 68°C (condiciones de alta estringencia) . El lavado se puede realizar usando solamente una de estas condiciones, por ejemplo, condiciones de alta estringencia, o se pueden usar cada una de las condiciones, por ejemplo, durante 10-15 minutos cada una, en el orden enlistado anteriormente, repitiendo cualquiera o todos los pasos enlistados. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, las condiciones óptimas variarán, dependiendo de la reacción de hibridación particular envuelta, y se pueden determinar empíricamente. En la presente se describe específicamente una secuencia de ADNc para DET2. La Figura 1C muestra las secuencias de proteína de ADNc completa y deducida (SEQ ID NO : 1 y 2, respectivamente) . Las secuencias de ADN de la invención se pueden obtener mediante muchos métodos. Por ejemplo, se puede aislar el ADN usando técnicas de hibridación o basadas en computadora que son bien conocidas en la técnica. Esas técnicas incluyen, pero no están limitadas a: 1) hibridación de genotecas genómicas o de ADNc con sondas para detectar secuencias de nucleótidos homologas; 2) clasificación de anticuerpos de las genotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas; 3) reacción de cadena de polimerasa (PCR) en ADN o ADNc genómico, usando cebadores capaces de templado a la secuencia de ADN de interés; 4) búsquedas por computadora de las bases de datos de la secuencia para secuencias similares; y 5) clasificación diferencial de una genoteca de ADN sustraída. 5 Los procedimientos de clasificación que dependen de la hibridación de ácido nucleico, hace posible aislar cualquier secuencia de genes de cualquier organismo, con la condición de que esté disponible la sonda apropiada. Las sondas de oligonucleótidos, que corresponden a una parte de la secuencia de DET2 lft que codifica la proteína en cuestión, se pueden sintetizar químicamente. Esto requiere que se conozcan los alargamientos cortos del oligopéptido de la secuencia de amino ácidos . La secuencia de ADN que codifica la proteína se puede deducir a partir del código genético, sin embargo, se debe tomar en cuenta la degeneración del código. Cuando la secuencia es degenerada es posible realizar una reacción de adición mezclada. Esto incluye una mezcla heterógena de ADN de doble cadena desnaturalizado. Para esta clasificación, la hibridación se realiza de preferencia sobre ya sea ADN de una sola cadena o ADN de doble cadena desna- 0 turalizado. La hibridación es particularmente útil en la detección de clones de ADNc derivados a partir de fuentes en donde está presente una cantidad extremadamente baja de secuencias de ARNm relacionadas con el polipéptido de interés. En otras palabras, mediante el uso de condiciones de hibridación estringentes 5 dirigidas para evitar la fijación no específica, es posible, por ej emplo, permitir la visualización autorradiográfica de una clona de ADNc específica mediante la hibridación del ADN objetivo a esa sonda individual en la mezcla que es su complemento completo (Wallace, y colaboradores, Nucí . Acid Res . , 9.:879, 1981). De manera alternativa, una genoteca que tiende a disminuir, como se ilustra en la presente, es útil para la eliminación de clonas de ADNc no específicas. Entre los procedimientos estándares para aislar las secuencias de ADNc de interés está la formación de genotecas de ADNc que contienen plásmido o fago, que se derivan a partir de la transcripción inversa de ARNm que es abundante en células donadoras que tienen un alto nivel de expresión genética. Cuando se usan en combinación con tecnología de reacción de cadena de polimerasa, se pueden clonar hasta productos de expresión raros. En aquellos casos en donde se conocen porciones significativas de la secuencia de amino ácidos del polipéptido, se puede emplear la producción de secuencias de sondas de ADN o ARN de una sola cadena o doble cadena etiquetados, que duplican una secuencia putativamente presente en el ADNc objetivo, en los procedimientos de hibridación de ADN/ADN que se realizan en copias clonadas del ADNc que se ha desnaturalizado a una forma de una sola cadena (Jay, y colaboradores, Nucí . Acid Res . , 1.1:2325, 1983) . Se puede clasificar indirectamente una genoteca de expresión de ADNc, tal como lambda gtll, para los péptidos DET2, usando anticuerpos específicos para DET2. Estos anticuerpos se pueden derivar ya sea policlonalmente o monoclonalmente, y usarse para detectar el producto de expresión que indica la presencia de ADNc de DET2. Las secuencias de ADN que codifican a DET2, u otras 5a- 5 reductasas, se pueden expresar in vitro mediante la transferencia de ADN a una célula anfitriona adecuada. Las "células anfitrio- nas" son células en las que se puede propagar un vector y su ADN expresado. El término también incluye cualquier progenie o material de injerto, por ejemplo, de la célula anfitriona sujeto. 1f0 Se entiende que toda la progenie pudiera no ser idéntica a la célula madre, puesto que pueden haber mutaciones que ocurran durante la réplica. Sin embargo, se incluye esa progenie cuando se usa el término "célula anfitriona". En la técnica se conocen los métodos de transferencia estable, queriendo decir que el ADN 15 extraño se mantiene continuamente en la anfitriona. En la presente invención, se puede insertar el polinucleótido DET2 u otras (por ejemplo, 5a-reductasa esferoidal de ^ mamífero) secuencias, dentro de un vector de expresión recombinante. Los términos "vector de expresión recombinante" o "vector de expresión" se refieren a un plásmido, virus u otros vehículo conocido en la técnica que se haya manipulado mediante la inserción o incorporación de la secuencia genética de DET2. Estos vectores de expresión contienen una secuencia promotora que facilita la transcripción eficiente de la secuencia de DET2 insertada. El vector de expresión típicamente contiene un origen de réplica, un promotor, así como genes específicos que permiten la selección fenot.ípica de las células transformadas. Se pueden usar métodos que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, para construir vectores de expresión que contengan la secuencia de codificación de DET2, o por ejemplo, para la secuencia de codificación de 5a-reductasa esferoidal de mamífero, y señales de control transcripcional/ traslacional apropiadas. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y técnicas de recombinación/genéticas in vivo . Se puede utilizar una diversidad de sistemas de vectores de expresión del anfitrión para expresar la secuencia de codificación del DET2. Estos incluyen, pero no están limitados, a microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido, que contienen la secuencia de codificación del D?T2; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen la secuencia de codificación de DET2; sistemas celulares de planta infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor; virus de mosaico de coliflor; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen la secuencia de codificación de DET2; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia de codificación de DET2; o sistemas celulares animales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, vaciniavirus) que contienen la secuencia de codificación de DET2, o sistemas celulares animales diseñados para expresión estable . Dependiendo del sistema de anfitrión/vector que se utilice, se puede usar cualquiera de un número de elementos de transcripción y traslación adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos mejoradores de transcripción, terminadores de transcripción, etcétera, en el vector de expresión (vea, por ejemplo, Bitter y colaboradores, 1987, Methods in Enzymology 153 : 516-544 ) . Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como pL del bacteriófago ?, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. Cuando se clona en sistemas celulares de mamífero, se pueden usar promotores derivados a partir del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor metalotioneina) o a partir de virus de mamífero (por ejemplo, la repetición terminal larga del retrovirus; el promotor tardío del adenovirus; el promotor de 7.5K de vacciniavirus) . También se pueden usar los promotores producidos mediante técnicas de ADN recombinante, o sintéticas para permitir la transcripción de la secuencia de codificación del DET2 insertado. El aislamiento y purificación del polipéptido expresado de manera recombinante, o los fragmentos del mismo, proporcionados mediante la invención, se puede realizar mediante medios convencionales que incluyen cromatografía de preparación y separaciones inmunológicas que envuelven anticuerpos monoclonales o policlonales . La invención también incluye anticuerpos inmunorreacti-vos con el polipéptido DET2 o fragmentos antigenéticos del mismo. Se proporciona el anticuerpo que consiste esencialmente de anticuerpos monoclonales agrupados con diferentes especificidades epitópicas, así como distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales están hechos a partir de antígeno que contiene fragmentos de la proteína, mediante métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica (Kohler, y colaboradores, Na ture, 256: 495, 1975). El término "anticuerpo" como se usa en esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv que son capaces de fijarse a un determinante epitópico presente en el polipéptido DET2. Estos fragmentos de anticuerpo retienen alguna habilidad para fijarse de manera selectiva con su antígeno o receptor. En la técnica se conocen los métodos para hacer estos fragmentos. (Vea por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988), incorporado a la presente como referencia) . Como se usa en esta invención, el término "epítopo" se refiere a un determinante antigenético en un antígeno al cuál se fija el parátopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como amino ácidos o cadenas laterales de azúcar, y usualmente tienen características estructurales específicas tridimensionales, así como características de carga específicas . Los anticuerpos que se fijan al polipéptido DET2 de la invención se pueden preparar usando un polipéptido intacto o fragmentos que contengan péptidos pequeños de interés como el antígeno de inmunización. Por ejemplo, pudiera ser deseable producir anticuerpos que se fijen específicamente a los dominios con terminal N o C de DET2. El polipéptido o péptido que se usan para inmunizar un animal, el cuál se deriva a partir de ADNc trasladado o químicamente sintetizado que se puede conjugar a una proteína portadora, si se desea. Estos portadores comúnmente usados que se acoplan químicamente al péptido de inmunización incluyen hemocianina limpete de orificio (KLH) , tiroglobulina, albúmina de suero bovino (BSA), y toxoide del tétanos. Los anticuerpos policlonales o monoclonales de la invención se puede purificar más, por ejemplo, mediante fijación a, y lixiviación a partir de una matriz a la cuál se fija el polipéptido o un péptido para el cuál surgieron los anticuerpos . Aquellos de experiencia en la técnica conocerán diferentes técnicas comunes en la técnica de la inmunología para la purifi-cación y/o concentración de anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (Vea por ejemplo, Coligan, y colaboradores, Unidad 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscien-ce, 1994, incorporado como referencia) . También es posible usar tecnología de anti-idiotipo para producir los anticuerpos monoclonales de la invención que imitan un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-idiotípico hecho para un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de fijación en la región hipervariable que es la "imagen" del epítopo fijado mediante el primer anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta genéticamente modificada, caracterizada como teniendo un rendimiento incrementado en comparación con una planta que no se ha modificado genéticamente (por ejemplo, una planta tipo silvestre) . El término "rendimiento" se ha definido previamente en la presente. El método incluye los pasos de poner en contacto una célula de la planta con cuando menos un vector que contenga cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un esferoide 5 -reductasa, por ejemplo, DET2, o una enzima de mamífero (por ejemplo, esferoide 5a-reductasa tipo 1 o tipo 2 humano) , en donde la secuencia de ácidos nucleicos está asociada de manera operable con un promotor, para obtener una célula de planta transformada; producir una planta a partir de la célula de planta transformada; y después de ésto, seleccionar una planta que exhiba rendimiento incrementado.

El término "modificación genética" como se usa en la presente, se refiere a la introducción de una o más secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, por ejemplo, la secuencia que codifica a DET2 o la 5 -reductasa tipo 1 o tipo 2 humana, dentro de una o más células de planta, lo cuál puede generar plantas viables completas, sexualmente competentes. El término "genéticamente modificada" como se usa en la presente, se refiere a una planta que ha sido generada a través del proceso mencionado anteriormente. Las plantas genéticamente modificadas de la invención son capaces de autopolinizarse o polinizarse por cruza con otras plantas de la misma especie, de tal manera que se pueda insertar o reproducir el gen extraño, contenido en la línea germinal, dentro de variedades de plantas agrícolamente útiles. El término "célula de planta" como se usa en la presente, se refiere a protoplastos, células de producción de gametos, y células que se regeneran en plantas completas . De conformidad con lo anterior, en la definición de "células de planta" se incluye una semilla que comprenda múltiples células de planta capaces de regeneración en una planta completa. Como se usa en la presente, el término "planta" se refiere a ya sea una planta completa, una parte de la planta, una célula de planta, o un grupo de células de planta, tales como tejido de planta, por ejemplo. Dentro del significado de "planta" también están incluidas las plántulas . Las plantas incluidas en la invención son cualesquiera plantas dispuestas a aceptar técnicas de transformación, incluyendo angiospermas, gimnospermas, monocotiledoneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas monocotiledoneas incluyen, pero no están limitados a, espárrago, maíz para forraje y dulce, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo de perla, centeno y avena. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen, pero no están limitados a, tomate, tabaco, algodón, nabina, frijoles de campo, frijoles de soya, pimientos, lechuga, arvejas, alfalfa, trébol, cosechas de col o Brassica olerácea (por ejemplo, repo-lio, brócoli, coliflor, coles de bruselas) , rábano, zanahoria, remolachas, berenjena, espinaca, pepino, chayóte, melones, melón cantaloupe, girasoles y diferentes plantas ornamentales. Las especies de madera incluyen álamo, pino, secoya, cedro, roble, etcétera . El término "secuencia de ácidos nucleicos heteróloga" como se usa en la presente, se refiere un ácido nucleico extraño para la planta receptora anfitriona o, nativo para la anfitriona si el ácido nucleico nativo está sustancialmente modificado de su forma original. Por ejemplo, el término incluye un ácido nucleico que se origina en las especies anfitrionas, en donde la secuencia está enlazada de manera operable a un promotor que difiere del promotor natural o de tipo silvestre. En el método amplio de la invención, cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a DET2 u otro esferoide 5a-reductasa (por ejemplo, enzima de mamífero) está enlazado de manera operable con un promotor. Pudiera ser deseable introducir más de una copia de DET2 u otro polinucleótido de esferoide 5a-reductasa dentro de una planta, para la expresión mejorada del polipéptido correspondiente. Por ejemplo, múltiples copias del gen DET2 tendrían el efecto de incrementar la producción de DET2 en la planta. Se debe entender que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el esferoide 5o¡-reductasa se refiere a DET2, 5a-reductasa tipo 1 o tipo 2 humana, y otras 5?í-reductasas esferoidales. El método de la invención también incluye cualquier combinación de estas enzimas. Las plantas genéticamente modificadas de la presente invención se producen por medio de poner en contacto una célula de planta con un vector que incluya cuando menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifique a DET2. Para que sea efectivo una vez introducido en las células de planta, la secuencia de ácidos nucleicos de DET2 debe estar asociada de manera operable con un promotor que sea efectivo en las células de planta, para ocasionar la transcripción de DET2. Adicionalmente, también se puede emplear una secuencia de poliadenilación o secuencia de control de transcripción, también reconocida en las células de planta. Se prefiere que el vector que alberga la secuencia de ácidos nucleicos que se va a insertar también contenga uno o más genes marcadores que se puedan seleccionar, de tal manera que se puedan seleccionar las células transformadas a partir de células no transformadas en cultivo, como se describe en la presente.

El término "asociado de manera operable" se refiere al enlace funcional entre una secuencia promotora y la secuencia de ácidos nucleicos de DET2 regulada por el promotor. El promotor enlazado de manera operable controla la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de DET2. La expresión de los genes estructurales empleados en la presente invención se puede impulsar mediante muchos promotores. Aunque se puede utilizar el promotor endógeno, o nativo de un gen estructural de interés para la regulación transcripcional del gen, de preferencia, el promotor es una secuencia reguladora extraña. Para los vectores de expresión de la planta, los promotores virales adecuados incluyen los promotores ARN 35S y ARN 19S de virus de mosaico de coliflor (Brisson, y colaboradores, Na ture, 310:511, 1984; Odell, y colaboradores, Na ture, 313:810, 1985) ; el promotor de transcrito de longitud completa de Virus de Mosaico de Escrofularia (FMV) (Gowda, y colaboradores, J. Cell Biochem . , 13D: 301, 1989) y el promotor de proteína de cubierta para TMV (Takamatsu, y colaboradores, EMBO J. 6:307, 1987) . De manera alternativa, se pueden usar promotores de planta tales como el promotor inducible por luz a partir de la pequeña subunidad de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa (ssRUBISCO) (Coruz-zi, y colaboradores, EMBO J. , 3 : 1671, 1984; Broglie, y colaboradores, Science, 224 : 838 , 1984); promotor de sintasa de manopina (Velten, y colaboradores, EMBO J. , 3.:2723, 1984); promotores de sintasa de nopalina (NOS) y sintasa de octopina (OCS) (contenidos en plásmidos de inducción de tumor de Agrobacterium tumefaciens) o promotores de choque de calor, por ejemplo, soya hspl7.5-E ó hspl7.3-B (Gurley, y colaboradores, Mol . Cell . Biol . , 6 : 559, 1986; Severin, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 1_5:827, 1990). 5 Los promotores útiles en la invención incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles, así como promotores diseñados. Los promotores de virus de mosaico de coliflor son ejemplos de promotores constitutivos. Para ser más útil, un promotor inducible debe 1) proporcionar baja expresión í(j^ en la ausencia del inductor; 2) proporcionar alta expresión en la presencia del inductor; 3) usar un esquema de inducción que no interfiera con la fisiología normal de la planta; 4) no tener ningún efecto sobre la expresión de otros genes. Los ejemplos de promotores inducibles útiles en plantas incluyen aquellos induci- 15 dos mediante medios químicos, tales como el promotor de etalo- tioneína de levadura que se activa mediante iones de cobre (Mett, y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . , U. S. A. , .90.:4567, 1993); las secuencias reguladoras In2-1 e In2-2 que se activan mediante bencensulfonamidas sustituidas, por ejemplo, aseguradores herbi- 0 cidas (Hershey, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , .17:679, 1991); y las secuencias reguladoras GRE que se inducen mediante glucocorticoides (Schena, y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . , U. S. A. , £8:10421, 1991). Para aquellos de experiencia en la técnica serán conocidos otros promotores, tanto constitutivos 5 como inducibles.

El promotor particular seleccionado debe ser capaz de ocasionar suficiente expresión para dar como resultado la producción de una cantidad efectiva de producto genético estructural, por ejemplo, DET2, para ocasionar rendimiento incrementado y/o biomasa incrementada. Si se desea, se pueden modificar los promotores que se usan en las construcciones del vector de la presente invención, para afectar sus características de control. En la presente invención también se pueden utilizar promotores específicos de tejido. Un ejemplo de un promotor específico de tejido es el promotor activo en meristemas de disparo (Atanassova, y colaboradores, Plant J. , 2_:291, 1992). Para aquellos de experiencia en la técnica serán conocidos otros promotores específicos de tejido útiles en plantas transgenéticas, incluyendo el promotor cdc2a y el promotor cyc07. (Vea por ejemplo, Ito, y colaboradores, Plant Mol . Biol . , 24 : 863, 1994; Martínez, y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 89 : 7360, 1992; Medford, y colaboradores, Plant Cell , 3:359, 1991; Terada, y colaboradores, Plant Journal , 3 : 241, 1993; Wissenbach, y colaboradores, Plant Journal , 4_ : 411 , 1993). Opcionalmente, un marcador que se puede seleccionar puede estar asociado con la secuencia de ácidos nucleicos que se va a insertar. Como se usa en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o la clasificación para, una planta o célula de planta que contiene el marcador. De preferencia, el gen marcador es un gen de resistencia antibiótica mediante el cuál se puede usar el antibiótico apropiado para seleccionar para las células transformadas de entre las células que no están transformadas. Los ejemplos de marcadores que se pueden seleccionar adecuados incluyen de aminasa de adenosina, reductasa de dihidro-folato, B-fosfotransferasa de higromicina, quinasa de timidina, fosfo-ribosiltransferasa de xantina-guanina y 3 ' -O-fosfotransfe-rasa II de aminoglucósido (canamicina, neomicina y resistencia G418) . Para aquellos de experiencia en la técnica serán conocidos otros marcadores adecuados. Aunque las siguientes descripciones describen el DET2, se entiende que ésta es una 5a-reductasa ejemplar, y en las siguientes descripciones también se incluyen 5a-reductasas de mamífero u otras. El (os) vector (es) empleado (s) en la presente invención para la transformación de una célula de planta incluye (n) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a DET2, asociada de manera operable con un promotor. Para comenzar un proceso de transformación de conformidad con la presente invención, primero es necesario construir un vector adecuado e intro-ducirlo apropiadamente dentro de la célula de planta. Los de«ta-lles de la construcción de los vectores utilizados en la presente son conocidos para aquellos expertos en la técnica de ingeniería genética de plantas. Las secuencias de ácidos nucleicos de DET2 utilizadas en la presente invención se pueden introducir en las células de planta usando plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, plásmidos de inducción de raíz (Ri) , y vectores de virus de plantas. (Para revisiones de esas técnicas vea, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic 5 Press, NY, Sección VIII, páginas 421-463; y Grierson y Corey, 1988, Plant Molecular Biology, Segunda Edición, Blackie, Londres, Capítulos 7-9, y Horsch, y colaboradores, Science, 227 : 1229, 1985, incorporados a la presente como referencia) . En adición a los vectores de transformación de plantas derivados a partir de HL los plásmidos Ti o de inducción de raíz (Ri) de Agrobacterium, métodos alternativos pueden envolver, por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la captación de ADN libre, transformación usando virus o polen, y el uso de microproyección. 15 Alguien experto en la técnica podrá seleccionar un vector apropiado para introducir la secuencia de ácido nucleico codificador DET2 en una condición relativamente intacta. De esta ^^ manera, debería ser suficiente cualquier vector que produjera una planta que porta la secuencia de ADN introducida, se esperaría que hasta el uso de una pieza desnuda de ADN confiriera propiedades de esta invención, guiadas típicamente por el método seleccionado de transformación. Se puede realizar la transformación de plantas de conformidad con la invención e esencialmente cualesquiera de las diferentes maneras conocidas por aquellos expertos en la técnica de la biología molecular de las plantas. (Vea, por ejemplo, Methods of Enzymology, volumen 153, 1987, Wu y Grossman, editores, Academic Press, incorporado a la presente como referencia) . Como se usa en la presente, el término "transformación" significa la alteración del genotipo de una planta anfitriona mediante la introducción de la secuencia de ácido nucleico DET2. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia de ácido nucleico DET2 dentro de una célula de planta utilizando la Agrobacterium tumefaciens que contiene el plásmido Ti, como se ^ mencionó de manera breve anteriormente. Al usar un cultivo de A. tumefaciens como un vehículo de transformación, es de lo más ventajoso usar una cepa no oncogénica de la Agrobacterium como el portador del vector de manera que sea posible la diferenciación no oncogénica de los tejidos transformados. También se prefiere que la Agrobacterium albergue un sistema binario del plásmido Ti. Este sistema binario comprende 1) un primer plásmido Ti que tiene una región de virulencia esencial para la introduc- ción del ADN de transferencia (ADN-T) dentro de las plantas, y 2) un plásmido quimérico. Este último contiene cuando menos una región límite de la región del ADN-T de un plásmido Ti de tipo silvestre que flanquea el ácido nucleico que se va a transferir. Los sistemas binarios del plásmido Ti se han mostrado eficientes para transformar las células de plantas (De Framond, Biotechno- J-ogy, JL:262, 1983, Hockema y colaboradores, Nature, 303 : 179, 1983) . Se prefiere este sistema binario debido a que no requiere la integración dentro del plásmido Ti de la Agrobacterium, lo cual es una metodología más antigua. Los métodos que incluyen el uso de la Agrobacterium en la transformación de conformidad con la presente invención, incluyen, pero no están limitados a: 1) cultivo conjunto de la Agrobacterium con protoplastos cultivados aislados; 2) transformación de células o tejidos de planta con la Agrobacterium; o 3) transformación de las semillas, ápices o meristemas con la Agrobacterium. Además, se puede lograr la transferencia del gen mediante la transformación in planta mediante la Agrobacterium, como lo describió Bechtold y colaboradores, ( C. R . Acad. Sci . París, 316:1194, 1993) y como se ejemplifica en los Ejemplos en la presente. Este planteamiento se base en la infiltración al vacío de una suspensión de células de Agrobacterium. El método preferido para introducir ácido nucleico codificador DTE2 dentro de las células de la planta, es infectar estas células de planta, una explantación, un meristema o una semilla, con la Agrobacterium tumefaciens transformada, como se describió anteriormente. Bajo las condiciones apropiadas conocidas en la técnica, se cultivan las células transformadas de la planta para formar retoños, raíces, y se desarrollan adicionalmente dentro de la planta. De manera alternativa, se pueden introducir secuencias de ácido nucleico codificador DTE2 dentro de una célula de planta usando medios mecánicos o químicos. Por ejemplo, se puede transferir de manera mecánica el ácido nucleico dentro de la célula de la planta mediante microinyección, usando una micropipeta. Alternativamente, se puede transferir el ácido nucleico dentro de la célula de la planta usando glicol de polietileno el cual forma un complejo de precipitación con material genético que es tomado por la célula. También se pueden introducir secuencias de ácido nucleico codificador DTE2 dentro de una célula de planta mediante electroporación (Fromm y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . , E. U. A. , 82.:5824, 1985, la cual se incorpora a la presente como referencia) . En esta técnica, se someten a electroporación los protoplastos de la planta en la presencia de los ácidos nucleicos que contienen las secuencias relevantes de ácido nucleico. Los impulsos eléctricos de resistencia elevada de campo, permebeali-zan de manera reversible las membranas, permitiendo la introducción de los ácidos nucleicos. Los protoplastos de la planta que se pasaron por electroporación reforman la pared celular, dividen y forman un callo de planta. Se puede conseguir la selección de las células transformadas de la planta con el gen transformado usando marcadores fenotípicos, como se describe en la presente. Otro método para introducir el ácido nucleico DET2 dentro de una célula de planta, es la penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico que se va a introducir contenido ya sea dentro de la matriz de estas partículas, o en la superficie de las mismas (Klein y colaboradores, Nature, 327 : 70 , 1987). También se describen los métodos de transformación por bombardeo en Sandford y colaboradores ( Techniques 3 : 3-16, 1991) y en Klein y colaboradores (Bio/ Techniques, 1_0:286, 1992). Aunque, típicamente únicamente se requiere una sola introducción de una secuencia nueva de ácido nucleico, este método proporciona de manera particular para múltiples introducciones . También se puede usar el virus de mosaico de la coli-flor (CaMV) como un vector para introducir ácido nucleico dentro de las células de la planta (patente de los Estados Unidos No. 4,407,956). Se inserta el genoma de ADN viral del virus de mosaico de la coliflor dentro de un plásmido bacteriano madre, creando una molécula de ADN recombinante la cual se puede propa-gar en la bacteria. Después de la clonación, se puede clonar nuevamente el plásmido recombinante y modificarse adicionalmente mediante la introducción de la secuencia deseada de ácido nuclei-co . Después se extirpa la porción viral modificada del plásmido recombinante del plásmido bacteriano madre, y se usa para inocu-lar las células de la planta o las plantas. Como se usa en la presente, el término "poner en contacto" se refiere a cualesquier medios de introducción del DET2 dentro de una célula de planta, incluyendo medios químicos y físicos, como se describió anteriormente. De preferencia, poner en contacto se refiere a la introducción del ácido nucleico o vector dentro de las células de la planta (incluyendo una explantación, un meristema o una semilla) , mediante la Agrobacterium tumefaciens transformada con el ácido nucleico codificador DET2, como se describió anteriormente. 5 Normalmente, una célula de planta se regenera para obtener una planta completa a partir del proceso de transformación. Se hace referencia al producto inmediato de la transformación como un "transgenote" . El término "cultivar" o "regeneración" como se usa en la presente, significa cultivar una planta H completa a partir de una célula de planta, un grupo de células de planta, una parte de planta (incluyendo las semillas) , o una pieza de planta (por ejemplo, a partir de una parte de protoplas- to, callo, o tejido) . La regeneración a partir del protoplasto varia de especie a especie de plantas, pero generalmente primero se hace una suspensión de protoplastos. En algunas especies, se puede inducir entonces la formación del embrión, a partir de la suspen- ^^ sión del protoplasto, hasta la etapa de maduración y germinación como los embriones naturales. El medio de cultivo contendrá generalmente diferentes aminoácidos y hormonas, necesarios para el crecimiento y la regeneración. Los ejemplos de las hormonas que se utilizan, incluyen auxinas y citoquininas . Algunas veces es ventajoso agregar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para las especies de planta tales como maiz y alfalfa.

La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del cultivo. Si se controlan estas variables, se puede reproducir la regeneración. La regeneración también ocurre a partir del callo, explantaciones, órganos o partes de la planta. Se puede realizar la transformación en el contexto de la regeneración del órgano o parte de la planta. (Vea Methods in Enzymology, volumen 118 y Klee y colaboradores, Annual Review of Plant Physiology, 38.: 467, 1987) . Cuando se utiliza el método de disco de hoja-transformación-regeneración de Horsch y colaboradores, Science, 227 : 1229, 1985, se cultivan los discos en un medio selecto, seguido por la formación de retoño en aproximadamente 2-4 semanas . Se extirpan los retoños que se desarrollan de los callos y se trasplantan a un medio selecto apropiado inductor de raíz. Se trasplantan las plántulas a la tierra tan pronto como sea posible después de que aparece la raíz. Se pueden poner en macetas nuevamente las plántulas según sea necesario, hasta que alcancen la madurez. En las cosechas que se propagan de manera vegetativa, las plantas transgénicas maduras se propagan por medio de utili-zar cortes o técnicas de cultivo de tejidos para producir múltiples plantas idénticas . Se hace la selección de transgenotes deseables y se obtienen variedades nuevas y se propagan de manera vegetativa para su uso comercial. En las cosechas que se propagan por semilla, se pueden cruzar consigo mismas las plantas transgénicas para producir una planta endogámica homocigótica. La planta endogámica que resulta, produce semilla que contiene el (los) gen (es) introducidos recientemente. Estas semillas se pueden cultivar para producir plantas que producirían el fenotipo seleccionado, por ejemplo, producción incrementada. Las partes que se obtienen de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, raíces, frutos, y similares se incluyen en la invención, siempre y cuando estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico introducidas. Se pueden seleccionar las plantas que exhiben producción o biomasa en comparación con las plantas de tipo silvestre mediante' observación visual. La invención incluye las plantas producidas mediante el método de la invención, así como tejido y semillas de la planta. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una célula de planta modificada de manera genética, de manera que una planta que se produce a partir de esta célula produce rendimiento incrementado en comparación con una planta, de tipo silvestre. El método incluye poner en contacto la célula de la planta con una secuencia de ácido nucleico DET2 para obtener una célula transformada de planta; el cultivo de la célula transformada de planta bajo condiciones de formación de planta para obtener una planta que tenga producción incrementada. Las condiciones tales como condiciones ambientales e inductoras de promotor varían de especie a especie, pero deberán ser las mismas dentro de una especie. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una planta caracterizada porque tiene producción incrementada mediante el contacto de una planta susceptible con una cantidad inductora de promotor DET2 de un agente que induce la expresión del gen DET2, en donde la inducción en comparación con una planta que no se ha puesto en contacto con el agente. Una "planta susceptible" se refiere a una planta a la que se puede inducir para utilizar su gen D?T2 endógeno para conseguir una producción incrementada. El término "cantidad inductora de promotor" se refiere a la cantidad de un agente, necesaria para elevar la expresión del gen DET2 por encima de la expresión de DET2 en una célula de planta que no se ha puesto en contacto con el agente. Por ejemplo, se puede usar un factor de transcripción o un agente químico para elevar la expresión del gen a partir del promotor DET2 innato, induciendo de esta manera el promotor y la expresión del gen DET2. En todavía otro aspecto de la invención, se contempla que la expresión incrementada del DET2 o de otros esteroides 5?í-reductasas (por ejemplo, mamífero) en una célula de planta o en una planta, aumenta la resistencia de aquella célula/planta a las plagas de la planta o a los patógenos de la planta. Por ejemplo, los estudios de campo han demostrado que los brasinólidos son efectivos como plaguicidas, por lo tanto, la expresión incremen-tada del DET2 o de otras 5oí-reductasas resultaría en cantidades incrementadas de brasinólido en la planta. En adición, la expresión incrementada del DET2 o de otras 5o¡-reductasas puede provocar también resistencia a los plaguicidas (aseguradores) . Por lo tanto, el DET2 u otras 5a-reductasas, protegen a las plantas contra las plagas, así como contra los plaguicidas. La descripción anterior describe de manera general la presente invención. Se puede obtener un entendimiento más completo mediante la referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales se proporcionan para propósitos de ilustración sola-mente y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Eiemplos Previamente, se han aislado los mutantes de Arabidopsis que tengan las características de las plantas de cultivo por luz aún cultivadas en la obscuridad. Se han identificado cuando menos 11 de estos lugares de gen, conocidos como det, cop y fus (Bowler y Chua, Plant Cell , 6 : 1529, 1994) . Los análisis de mutantes dobles con diferentes mutantes fotorreceptores sugieren que DET1, COPl, y COP9 actúan en una trayectoria de transducción de señal, mientras que DET2 actúa en una trayectoria diferente (Bowler y Chua, supra ) . DETl, COPl, y C0P9 codifican las proteínas localizadas nucleares la manera de actuar de las cuales todavía no se entiende (Bowler y Chua, supra ) . Las mutaciones de pérdida-de-función en el DET2 tienen efectos pleiotrópicos (Chory y colaboradores, ibid, 3.: 445, 1991) . En la oscuridad, los mutantes det2 son cortos, tienen hipocótilos gruesos, acumulan antocianinas, tienen cotiledóneos abiertos, expandidos, y desarrollan yemas de hoja primarias. Estos cambios morfológicos están acompañados por una depresión de 10 a 20 partes de diferentes genes responsivos a la luz. En la luz, los mutantes det2 son más pequeños y de un verde más oscuro que el tipo silvestre, muestran tamaño celular reducido en los tejidos que se examinaron (hipocótilo, cotiledóneos, y hojas), y tienen predominio apical reducido y fertilidad masculina . Las mutaciones det2 también afectan las respuestas fotoperiódicas y provocar un retraso en el florecimiento, un acortamiento del período circa-diano de la expresión del gen CAB (proteínas de fijación por clorofila a/b) , regulación inapropiada del día y la noche de la expresión del gen, y un retraso de la senectud de la hoja y el cloroplasto. (Chory y colaboradores, supra ; chory y colaborado-res, Plant physiol . , 104 :339, 1994; Millar y colaboradores, Science, 267 : 1163, 1995). Estas diferencias de fenotipo muestran que el DET2 desempeña un papel importante a través de todo el desarrollo de la Arabidopsis . Ejemplo 1 Se mapeó el gen DET2 a un intervalo de 150-kb sobre un cromosoma 2 de Arabidopsis (Figura 1A) . La Figura 1 es una ilustración esquemática de la clonación y el análisis de secuencia del gen DE 2 . La Figura 2A muestra un resumen de la clonación posicional. Se cruzó el mutante del homocigoto det2-l (Col-0) con ya sea el No-0 o el La-er de tipo silvestre (designaciones geográficas aisladas) . Se preparó el ADN de las siembras F2 det2 (Deilaporta y colaboradores, Plant Mol . Biol . Rep. , .1:19, 1983) para los polimorfismos de longitud de secuencia simple (SSLPs por sus siglas en inglés) (Bell y Ecker, Genomic, 19:137, 1994) y las secuencias polimórficas amplificadas adheridas (CAPS por sus siglas en inglés) (Konieczny y Ausubel, Plant J. , 4.:403, 1993). Se aislaron las clonas de superposición del cromosoma artificial de levadura (YAC por sus siglas en inglés) , a partir de tres genotecas separadas de cromosoma artificial de levadura de Arabidopsis (Ward y Jen, Plant Mol . Biol . , 14.: 561, 1990; J.R. Ecker, Methods, 1:186, 1990; Grill Y Somerville, Mol . Gen . Genet . , 226:484, 1991) . Se realizó un análisis fino de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción con las plantas F2 det2 con puntos de rompimiento de recombinación, ya sea en la región m323-ZE2'2 (68 recombinantes, dos poblaciones de mapeo), o en el intervalo DET2-ng& 168 (31 recombinantes) . Se usó el marcador molecular nga 168 en el punto de inicio para identificar 8 clonas de superposición del cromosoma artificial de levadura que cubrían ~ 800 kb del ADN genómico de la Arabidopsis . Se convirtieron los marcadores nuevos de las secuencias polimórficas amplificadas adheridas directamente a partir de los extremos de los insertos del cromosoma artificial de levadura o derivados a partir de las clonas de fago de una genoteca genómica de la Arabidopsis aislada con sondas de extremo del cromosoma artificial de levadura. El análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, delimitó el sitio de DET2 a una región de 150 ~kb entre el extremo izquierdo de yUP2C12 e yUPSElO el cromosoma 2 de la Arabidopsis. Se ensambló un contiguo cósmido dentro de esta región a partir de las clonas de cósmido y fago aislados de las dos genotecas genómicas de la Arabidopsis (Olszewski y colaboradores, Nucleic Acids Res . , 1_6: 10765, 1988) mediante hibridación con yUP2C12, yUPSElO y las sondas de extremo del cromosoma artificial de levadura, o sondas derivadas de cósmido. Se transformaron los ADNs de cósmido en plantas det2-l mediante un método modificado de infiltración al vacío (Bechtold y colaboradores, Acad. Sci . Paris, 316 : 1194 , 1993; Bent y colaboradores, Science, 265 : 1856, 1994) para identificar los cósmidos que contienen el gen DET2 . Tres cósmidos, 2C12-19, 2C12-21, y 217-61, fenotipos mutantes del det2 rescatados. Se identificó un fragmento genómico 20-kb que puede rescatar los fenotipos del det2. La Figura 2 muestra una fotografía de plántulas de 12 días de edad cultivadas en luz (Figura 2A) y de plántulas de 10 días de edad cultivadas en la oscuridad (Figura 2B) después de la complementación del det2 mediante el gen DET2 de tipo silvestre. (De izquierda a derecha en cada panel) Col-0 de tipo silvestre, det2, y det2-l transgénico que contiene el cósmido 217-61. Se usaron fragmentos del cósmido 217-61 etiquetados Eco Rl como sondas para clasificar clonas de ~2 x 106 de una genoteca de ADN suplementario (ADNc) de Arabidopsis construida en lambda ZAPII (Kieber, y colaboradores, Cell , 72.:427, 1993). Se convirtieron las clonas positivas en plásmidos mediante la extirpación in vivo de conformidad con el protocolo del fabricante (Stratagene) y se secuenciaron con cebadores específicos de gen. El fragmento 20 kb da origen a cuando menos tres transcritos (Figura 1A) , uno de los cuales se altera en todos los alelos del det2 analizados y se deriva a partir del gen DET2 (Figura IB) . El transcrito DET2 contiene un marco de lectura único, de abertura larga que codifica una proteína de aminoácido 262. Se determinaron las secuencias genómicas correspondientes de 8 alelos del det2, todas las cuales tienen fenotipos mutantes similares. Se amplificó la región transcrita del gen DET2 mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) a partir de los ADNs genómicos de Col-0 de tipo silvestre y ocho alelos del det2, subclonados dentro del vector pGEM-t (Promega), y se secuenciaron. Para minimizar los errores de la reacción de cadena de polimerasa, se agruparon para la secuenciación cuando menos cuatro clonas diferentes a partir de dos fragmentos amplificados de manera independiente. Cuatro alelos contienen supresiones de cambio de marco, y otras dos mutaciones provocan la terminación prematura de la proteína del DET2 . Los dos alelos restantes tienen una sustitución no conservativa de lisina para el glutamato en la posición 204 (Figura IB) . La Figura IB muestra un mapa de la estructura de gen del DET2 y las mutaciones en el gen DET2 . Las líneas gruesas indican exones, y el cuadro abierto denota un intrón. Las posiciones de las mutaciones son relativas al codón de iniciación. Z, codón de interrupción. La Figura 1C muestra el nucleótido y la secuencia deducida de aminoácidos del DET2 (SEQ ID N0:1 y 2, respectivamente) . La Figura 3 muestra una comparación de secuencia del DET2 con 5a-reductasas de esferoide de mamífero. La Figura 3A muestra la secuencia deducida de aminoácido del gen DET2 alineada con las 5 -reductasas de esferoide a partir de rata (rS5Rl y rS5R2) y humano (hS5Rl y hS5R2) . Los guiones indican espacios libres introducidos para maximizar el alineamiento, y se sombrean los residuos conservados en cuando menos dos de las cinco secuencias. La flecha indica el glutamato mutado en los alelos de det2-1 y det2. (Las abreviaturas de una sola letra para los residuos de aminoácidos son como sigue: A, Alta; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, lie; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, The; V, Val; W, Trp; y Y, Tyr) . La Figura 3B muestra un análisis filogenético de la rela-ción entre la proteína del DET2 y las 5 -reductasas de esferoide de mamífero. La escala mide la distancia relativa entre las secuencias . La secuencia deducida de aminoácidos del gen DET2 es similar a aquella de las 5a-reductasas de esferoide de mamífero, con 38 a 42 por ciento de identidad de secuencia. (La investiga- ción de la base de datos se realizó en el U.S. National Center for Biotechnology Information con el programa BLAST (Altschul y colaboradores, J. Mol . Biol . , 215 : 403, 1990). El alineamiento de la secuencia y el análisis filogenético se realizaron con el 5 programa Megalign (DNAStar) mediante el método de J. Hein (Hig- gins y Sharp, Comput . Appl . Biosci . , 5_:151, 1989)). La similitud de la secuencia aumenta a desde 54 hasta 60 por ciento cuando se toman en cuenta las sustituciones conservativas. Se han aislado dos isozimas (tipos 1 y 2) de la 5 -reductasa de esferoide en ratas y humanos (Wilson y colaboradores, Endocr. Rev. , 14 : 577 , 1993; Russel y wilson, Annu . Rev. Biochem . , 63.:25, 1994). El análisis filogenético muestra que el DET2 está cuando menos tan cercanamente relacionado con las enzimas del tipo 2, como las enzimas del tipo 2 lo están con las enzimas de tipo 1 (Figura 3B) . El ochenta por ciento de los residuos conservados de manera absoluta en las enzimas de mamífero se encuentra en la proteína del DET2 predicho. Las 5 -reductasas de esferoide de mamífero catalizan el fosfato dinucleótido de la adenina de 20 nicotinamida (reducido) conversión dependiente de (NADPH) de testosterona a dihidrotestosterona, lo cual es un paso clave en el metabolismo del esferoide y es esencial para el desarrollo ' embrionario de los genitales externos masculinos y la próstata (Wilson y colaboradores, supra) . La importancia de esta reacción 25 es evidente a partir de ciertas formas hereditarias de seudoher- mafroditismo masculino en humanos, provocado por la deficiencia de la 5a-reductasa de esferoide. El análisis de la secuencias del gen del tipo 2 de la 5 -reductasa de esferoide de familias afectadas, identifica una mutación de sentido equivocado que 5 provoca una sustitución conservativa del aspartato para Glu197 (Wilson y colaboradores, supra) , que corresponde a Glu204 en el DET2 . en los alelos de det2-l y det2-6, se cambia este glutamato a lisina, indicando que este glutamato tiene una función crítica similar que en la 5a-reductasa de humano. Debido a que una 1^ sustitución conservativa en esta posición provoca la desactivación de la enzima humana (Wilson y colaboradores, supra) , se predice que el cambio no conservativo de glutamato-a-lisina elimina completamente la actividad del DET2 . Esto podría explicar los fenotipos severos de los dos alelos de sentido equivocado.

Tomados juntos, los datos sugieren que la enzima del DET2 pueden catalizar una reacción bioquímica similar a la reacción que cataliza la enzima humana. f ^^ Ejemplo 2 Se han identificado muchos esteroides en las plantas 20 (J.M.C. Geuns, Phytochemistry, 17.: 1, 1978), pero solamente los brasinosteroides (BRs por sus siglas en inglés) tiene una distribución amplia a través de todo el reino vegetal y actividad biológica única en el crecimiento de las plantas cuando se aplican de manera exógena (N.B. Mandava, Annu . Rev. Plant 25 Physiol . Plant Mol . Biol . , 39:23, 1988; R.N. Arteca, (2), 206- 213) . Recientemente se ha propuesto una trayectoria para la biosíntesis del brasinólido, el brasinosteroide más activo, sobre la base de la evidencia a partir de los cultivos de suspensión celular y los experimentos de siembra completa (Fujioka y 5 colaboradores, Biol . Sci . Biotechnical . Biochem . , 5_9:1973, 1995). Aunque la bíosíntesis del brasinólido incluye muchos pasos de oxidación, solamente dos pasos involucran la reducción. Uno ocurre temprano en la trayectoria en donde se reduce una unión doble en el campesterol para formar campestanol. Esta reacción es H similar a aquella que se cataliza mediante las 5o¡-reductasas de esferoide de mamífero, sugiriendo que el DET2 podría catalizar la conversión del campesterol a campestenol. Debido a que el genoma de Arabidopsis no contiene ninguna otra secuencia que esté relacionada de manera cercana al DET2 , una posibilidad es que el fenotipo del det2 se deba a la reducción o eliminación de la biosíntesis del brasinosteroide. Para probar esta hipótesis, se trataron las plántulas ^^ del det2 con brasinólido exógeno . La Figura 4A muestra la función propuesta de la proteína del DET2 en la trayectoria biosintética del brasinólido. El asterisco (*) indica los pasos intermedios (Fujioka y colaboradores, supra ) . La Figura 4B muestra las plántulas de 10 días de edad cultivadas en la oscuridad y la Figura 4C muestra las plántulas de 12 días de edad cultivadas en la luz. Las plantas de tipo silvestre, det2-l , y las tratadas con brasinólido det2-l , se describen de izquierda a derecha en cada panel. Se germinaron las semillas en papeles de Whatman húmedos colocados en medio MS (sales de 0.5xMS (Gibco) , lx vitaminas B5 de Gamborg (Sigma) , fitagar al 8 por ciento, y sacarosa al 1 por ciento de pH 5.7) durante 2 días, y se transfirieron a placas 5 frescas complementadas con concentraciones diferentes de auxina (IAA, 0 a 10-5 M) , brasinólido (0 a 10~6 M) , y giberelinas (GA1 y GA4 , 0 a 10"5 M) . Se filtraron en estéril las hormonas dentro de medio MS de enfriamiento. Para las plántulas cultivadas en la oscuridad, se expusieron las semillas a un tratamiento de dos horas de luz antes de que se envolvieran sus placas con tres capas de papel aluminio y que se transfirieran las plántulas bajo luz de seguridad verde. Se midieron las longitudes del hipocótilo de las plántulas emblanquecidas de 10 días de edad y de las plantas de tipo silvestre cultivadas en la luz. La Figura 4D muestra una respuesta a la dosis del alargamiento del hipocótilo inducido por brasinólido de las plántulas cultivadas en la oscuridad y del tipo silvestre cultivado en la luz. Los datos F ^^ representan el SE ± medio que se obtuvo a partir de las determinaciones triplicadas, cada una con un tamaño promedio de muestra de 12 plántulas . Aunque la adición del brasinólido al 10"6 M al medio de cultivo no tuvo efecto en las plántulas de tipo salvaje en la oscuridad, se rescató el fenotipo del hipocótilo corto de las plántulas del det2 cultivado en la oscuridad (Figuras 4, B y D) .

De manera similar, cuando se agregó al 10"7 M, el brasinólido no tuvo efecto en los peciolos y las hojas de las plántulas de tipo silvestre, pero suprimió completamente los fenotipos enanos de estos órganos en las plantas del det2 cultivadas en la luz (Figura 4C) . En contraste, ninguna de las giberelinas aplicadas 5 (GA1 ó GA4, 10~8 a 10"5 M) , ni las auxinas (1A,A 10~6 y 10~5 M) rescataron los defectos del det2. El tratamiento de brasinólido invirtió la inhibición del alargamiento del hipocótilo provocado ya sea por la mutación de detl o por la luz (Figura 4D) , pero no complementó los fenotipos mutantes de ninguna de las plántulas HL cultivadas en la oscuridad o en la luz del betl , apoyando los estudios genéticos previos de que el DETL y el DET2 actúan sobre trayectorias separadas que controlan los procesos regulados por luz . Ejemplo 3 15 Los mutantes de la Arabidopsis det2 son enanas pequeñas verde oscuro que despliegan defectos pleiotrópicos en el desarrollo regulado por luz durante las múltiples etapas del ciclo de ^^ vida de la planta. El gen DET2 codifica una proteína que comparte identidad de secuencia del ~40 por ciento con las 5- -reductasas de esferoide de mamífero y que se implica en la síntesis de una clase de esteroides de planta, los brasinosteroides . El siguiente ejemplo muestra que la proteína del DET2 , cuando se expresa en las células renales embriónicas humanas 293, cataliza la 5o¡- reducción de diferentes sustratos de esferoide animal y tiene propiedades cinéticas similares a las de las enzimas de la 5?£-reductasa de esferoide de mamífero. Por otra parte, las 5a-reductasas de esferoide humano que se expresan en las plantas mutantes del det2 pueden sustituir el DET2 en la biosíntesis del brasinosteroide. Estos datos indican que el DET2 es un ortólogo de las 5 -reductasas de esferoide de mamífero y proporcionan evidencia adicional de que los brasinosteroides desempeñan un papel esencial en el desarrollo de planta regulado por luz. La Figura 5 muestra las reacciones químicas catalizadas mediante las 5a-reductasas de esferoide de mamífero (A) y el DET2 (B) de la Arabidopsis. 1. Materiales de la planta y condiciones de cultivo: El genotipo estándar de tipo silvestre que se usó, fue la Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) . Se ha descrito el mutante del det2-l que se usó en este estudio (Chory, J. Nagpal, P. & Peto, C.A. (1991) Plant Cell 3 , 445-459) . Se trabajaron en la superficie las semillas esterilizadas mediante lavado durante 1 minuto en etanol al 95 por ciento, seguido por 12 minutos en una solución de 1:3 de blanqueador (Clorox) que contenía Tween-20 (v/v) al 0.02 por ciento. Después se lavaron las semillas 3 veces con agua destilada esterilizada, y se volvieron a suspender en fitagar al 0.08 por ciento (Gibco BRL). Después del tratamiento durante 2 días a 4°C para inducir la germinación, se sembraron las semillas en cajas de Petri que contenían medio (pH 5.7) de 0.5X MS (Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Physiol . Plant . 15, 473-497), complementado con sacarosa al 1 por ciento, fitagar al 0.8 por ciento, y IX vitaminas B5 de Gamborg (Sigma) y se mantuvo en cámaras de cultivo a 21°C con un fotoperíodo de 16 horas. Se cultivaron las plantas en la oscuridad mediante la envoltura de las placas con tres capas de papel aluminio. Para todos los experimentos, el det2 y todas las plantas de tipo silvestre Col-0 se cultivaron lado a lado bajo las mismas condiciones de luz y humedad. 2. Expresión del ADNc de DET2 en Células renales embriónicas humanas 293: Se ligó un fragmento 948-bp a partir de una clona de ADNc del DET2 que contenía 18 bp de secuencia 5' no traducida, un marco de lectura abierto de 786 bp y 154 bp de la secuencia 3' no traducida, dentro del vector de expresión de pCMV5 (Anderson, S. Davis, D.L., Dahlback, H., Jornvall, H. y russel, D.W. (1989), J. Biol . Chem . , 264, 8222-8229) . Como un control, también se expresó un proteína del det2 mutante en el vector de pCMV5 (pCMV5-det2) . Esta construcción, la cual contiene una mutación simple de nucleótido (G-A) que cambia el Glu204 en Lys204, se hizo mediante el reemplazo de la secuencia de tipo silvestre DET2 con el mismo fragmento de restricción que se derivó del ADN genómico del det2-1 amplificado por reacción de cadena de polimerasa. Después se digirió el plásmido resultante con EcoRI/BglII y se clonó dentro del vector de expresión de pCMV5. Se transfectaron cinco miligramos del plásmido de expresión que contenía ya sea el DET2 de tipo silvestre, o el ADNc mutado del det2-l, dentro de las células renales embriónicas humanas 293 (ATCC CRL1573) mediante un procedimiento de precipitación de fosfato de calcio, como se ^B describió anteriormente (Normington, K. y Russel, D.W. (1992) J. Biol . Chem . 267, 19548-19554). Dieciséis horas después de la transfección, se ensayó la actividad de la 5a-reductasa de esferoide en cualesquiera de la células intactas o lisatos de célula, como se describió (Anderson, S., Bishop, R.W. y Russell, D.W. (1989), J. Biol . Chem . , 264, 16249-16255; Thigpen, A.E. y Russell, D.W. (1992), J. Biol . Chem . , 267, 8577-8583). 3. Transformación de los mutantes del det2-l: Se clono un ADNc humano que codifica la 5a-reductasa de esferoide, ya sea del tipo 1 o del tipo 2, dentro de un vector pMDl, un derivativo del pBI121 (Clontech) , el cual contiene el promotor del virus de mosaico 35S de la coliflor (CaMV) y un terminador transcripcional de la sintasa de la nopaline (Nos- ter) , para generar plásmidos de pMDl-hS5R (5a-reductasa de esferoide humano) (Figura 8A) . Se usó la cepa de la Agrobacterium GV3101, transformada con una construcción de pMDl-hS5R para transformar los mutantes del det2-l mediante el método de infil- 0 tración al vacío, como se describió anteriormente (Bechtold, N., Ellis, J. y Pelletier, G. (1993) C. R . Acad. Sci . Paris 316, 1188- 1193) . Se seleccionaron os transformantes (TI) sobre un medio de 0.5X MS (H 5.7) ( supra) , y 25 miligramos/mililitros canamicina. Se transfirieron las plántulas resistentes a la canamicina a la 5 tierra, se mantuvieron a 23° bajo un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, permitiendo que se polinice a sí misma, y se recolectaron semillas T2. 4. Tratamiento de plántulas blanqueadas con 4-MA. Se germinaron las semillas sobre medio (pH 7.5) de 0.5X MS ( supra ) complementado con sacarosa al 1 por ciento, vitaminas B5 de IX Gamborg, fitagar al 0.8 por ciento, y concentraciones variables de 4-MA ( 17b- (N, N-dietil) carbamoil-4-metil-4-aza-5a-androstán-3-ona, un obsequio de Merck Sharp & Dohme Research Laboratories) . Después de un tratamiento de 2 horas de luz, se envolvieron las placas con tres capas de papel aluminio y se mantuvieron a 21° en una cámara de cultivo. Se midieron las longitudes del hipocótilo de las plántulas blanqueadas de 10 días de edad. 5. Análisis de ADN y de ARN. Se aisló el ADN de la Arabidopsis como se describió anteriormente (li, J. y Chory, J., (1996) en Methods in Molecular Biology: Arabidopsis Protocols, editores Martínez-Zapater, J.M. y Salinas, J. (Humana, ••, NJ) , en imprenta) . Para la amplificación de un fragmento de DET2 genómico, se usó 1 mililitro (10-20 ng) de ADN de planta, como una plantilla en una mezcla de reacción de 50 mililitros que contenía 5 mililitros de regulador de pH de polimerasa de 10X Taq (Stratagene) , 200 mililitros mM de trifosfatos de deoxinucleósido (dNTPs) , 125 ng de cebadores de avance y de reversa, y 2.5 unidades de polimerasa de Taq. Se condujeron las reacciones de amplificación en un termociclador (ERICOMP) mediante la desnaturalización de la plantilla de ADN durante 10 minutos a 95°C, seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 45 segundos, templando a 50°C durante 45 segundos, extensión a 72°C durante 90 segundos, y un período final de extensión de 10 minutos a 72°C. Para los ADNc ' s de la 5a-reductasa de esferoide humano en las plantas det2-l transgénicas, se agregó DMSO al 10 por ciento en la reacción de cadena de polimerasa (para superar el problema que causó el alto contenido de GC de los ADNc's), junto con los cebadores que se derivan a partir del promotor de CaMV 35S y cada uno de los ADNc's. Se aisló el ARN total a partir de plántulas de 2 semanas de edad mediante el método de Napoli y colaboradores (Napoli, C, Le-mieux, C, y Jorgensen, R. (1990) Plant Cell 2, 279-289) y se realizaron las hibridizaciones de mancha de gel del ARN como se describió anteriormente (Chory, J. , Nagpal, P. y Peto, C.A. (1991) Plant Cell 3, 445-459) . Para determinar si el sitio DET2 de la Arabidopsis codifica una 5o¡-reductasa de esferoide funcional, se clonó un ADNc de DET2 de longitud completa dentro de un vector de expre-sión de mamífero, pCMV5 ( supra) y se introdujo dentro de células renales embriónicas humanas 293 mediante un protocolo de transfección mediado por CaP04 ( supra ) . Dieciséis horas después de la transfección, se agregaron los esteroides etiquetados con radio, al medio celular y se verificó su conversión a formas de 5a-reductasa mediante cromatografía de capa delgada (Normington, K. y Russell, D.W. (1992) J. Biol . Chem . 267, 19548-19554. Como se muestra en la Figura 6, las células transfectadas con un vector de expresión pCMV5 que carece de un inserto de ADNc, no mostró visualmente actividad de la 5a-reductasa de esferoide que se 5 pudiera medir, mientras que la introducción de un vector de expresión pCMV5 que contenía un ADNc de la 5a-reductasa de esferoide ya sea humano de tipo 1, o de la Arabidopsis DET2, dio como resultado la reducción de la progesterona etiquetada con radio a la 4-5-dihidroprogesterona. En consistencia con nuestra predicción previa (Li, J. , Nagpal, P., Vitart, V., McMorris, C.T. y Chory, J. (1996) Science 272, 398-401), la mutación Glu204Lys del det2-q, desactivó totalmente la actividad de la 5a-reductasa de esferoide del DET2, ya que las células 293 que se transfectaron con el ADN del det2-l no pudo convertir la progesterona etiquetada con radio a su forma de 5a-reducida (Figura 6) . Al igual que las 5 -reductasas de esferoide de mamífero (Russell, D.W. y Wilson, J.D. 1994 Annu . Rev. Biochem . , 63, 25-f ^^ 61) , el DET2 de Arabidopsis puede catalizar la 5a-reducción de muchos esteroides con una estructura de 3-oxo-D4,5, incluyendo la 20 testosterona y la androstenediona . Ya que los sustratos hipotéticos del DET2 de Arabidopsis en la biosíntesis del brasinosteroide es campesterol o sus análogos (sitosterol o estigmasterol) , el cual contiene una estructura de 3b-hidroxil-D5, 6, medimos la actividad de la 5a-reductasa del DET2 hacia diferentes esteroides 25 etiquetados con radio incluyendo esta estructura colesterol, pregnenolona, y dehidroepiandrosterona . En linea con los resultados que se obtuvieron con las 5 -reductasas de esferoide de mamífero (Hsia, S.L. y Voigt, W. (1974) J. Invest . Derma tol . 62, 224-227), las células 293 que se transfectaron con un ADNc de la 5a-reductasa de esferoide ya sea humano de tipo 1, o del DET2 no pudo 5a-reducir estos sustratos (no se muestran los datos), implicando que las plantas requieren la presencia de una enzima adicional para convertir el campesterol en 3-oxo-D4,5 -campesterol, antes de la 5a-reducción mediante la enzima de DET2. Propiedades cinéticas de la proteína expresada del DET2. Se usó un ensayo in vitro ( supra) para estudiar las cinéticas de la enzima de la proteína de DET2 expresada por la célula renal 293. Se determinó que el valor Km aparente para la testosterona era de 2.5 mM con un Vmax de 0.2 nmol/ (min-l*mg-l) (Figura 7A) , mientras que el valor Km aparente para la progesterona fue de 0.4 mM con un Vmax de 0.5 nmol/ (min-l*mg-l) (Figura 7B) . Estos valores se comparan de manera favorable con aquellos que se calcularon para la isozima humana del tipo 1 (Km = 1.7 mM para la testosterona y Km = 1.3 mM para la progesterona) . Al igual que las enzimas de los mamíferos, la actividad de la 5a-reductasa del DET2 requiere NADPH más bien que NADH, como un cofactor y la reacción catalizada fue irreversible. Los 4-azasteroides son una clase de inhibidores selectivos y potentes de las isozimas de 5 -reductasa de esferoide de mamífero. Para determinar si la enzima del DET2 se inhibió también mediante estos fármacos, se incubaron lisatos celulares que contenían el DET2 recombinante, con la progesterona como el sustrato y diferentes cantidades del 4-azasteroide, 4-MA. El aumento de la concentración del 4-MA en la mezcla de reacción reveló un modo competitivo de inhibición con Ki aparente calculado de 300 nM. En los experimentos que no se muestran, los otros dos inhibidores de las isozimas de 5 -reductasa, la finasterida (un 4-azasteroide) y la LY191704 (una benzoquinolinona no esferoidal) , no afectaron la actividad del DET2 recombinante. Las isozimas tipo 1 y tipo 2 de la 5a:-reductasa de esferoide de mamífero se distinguen mediante su óptimo de pH. En todas las especies que se han examinado hasta ahora, la isozima de tipo 1 tiene un óptimo de pH alcalino (Vmax a aproximadamente un pH de 8.0) , y la isozima de tipo 2 tiene un óptimo de pH ácido (Vmax a un pH de 5.0-5.5) ( supra) . Se midió el óptimo de pH de la enzima de la planta para determinar a cuál isozima de mamífero se parecía más la enzima del DET2, con respecto a este parámetro bioquímico. Los datos de la Figura 7D muestran que el pH contra la curva de actividad de la enzima que se obtuvo con los lisatos celulares que contenían la proteína de DET2 recombinante, era simétrica con un óptimo a un pH de 6.8, el cual está entre el óptimo de pH de las dos isozimas de mamífero. Los ADNc ' 2 de 5 -reductasa de esferoide humano complementan la mutación del det2-l de la planta. Si el DET2 es un homólogo funcional de las 5a-reductasas de esferoide humano, entonces la expresión de una u otra de las enzimas humanas deberá complementar la mutación de det2 en las plantas, y rescatar los fenotipos mutantes. Para probar esta hipótesis, introdujimos de manera estable ADNc's que codifican la 5o¡- reductasa de esferoide humano, ya sea del tipo o del tipo 2, dentro de los mutantes del det2-l usando la transformación mediado por Agrobacterium ( supra) . En estos experimentos, se prepararon dos construcciones con ya sea un ADNc de longitud completa o un ADNc con una región truncada 3 ' no traducida para cada tipo de ADNc de 5a-reductasa de esferoide humano. Estos se clonaron dentro de un vector binario, pMDl, el cual contiene un promotor de virus de mosaico 35S de coliflor y una secuencia de sintasa de nopalina 3' no traducida (Figura 8A) . En un conjunto de experimentos de transformación, se obtuvieron 64 plantas transgénicas. Entre éstas, 57 desplegaron visualmente fenotipos de tipo silvestre y las 7 líneas restantes desplegaron visualmente los fenotipos intermedios entre det2-l y las plantas de tipo silvestre (Tabla 1) . Como se muestra en las Figuras 8B-8D, la presencia de cualquier ADNc de 5a-reductasa de esferoide humano en el medio del mutante del det2-l, rescató los fenotipos tanto de oscuridad como de luz de la mutación. Se probaron todas las 64 líneas transgénicas para la inserción de un ADNc humano dentro de sus genomas mediante la reacción de cadena de polimerasa usando cebadores de oligonucleótido derivados a partir del promotor de CaMV 35S y un ADNc de 5a-reductasa. Se amplificaron los productos de la reacción de cadena de polimerasa del tamaño esperado para cualquier tipo de ADNc de 5a-reductasa de esferoide humano, a partir de los ADNs genómicos de todas las plantas transgénicas (resumidos en la Tabla 1), mientras que los controles no transformados del tipo silvestre o heterocigoto del det2-l y las plantas homocigotas, no produjeron señales positivas de amplificación. Ya que la mutación del det2-l provoca una transición G-A, llevando a la eliminación de un sitio de restricción Mnll, existe un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP por sus siglas en inglés) de Mnll entre los mutantes del det2-l y las plantas de tipo silvestre. Se usó un análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción basado en reacción de cadena de polimerasa, para confirmar que cada una de las 64 líneas transgénicas todavía contenían la mutación det2-l (Tabla 1) , eliminando mediante lo mismo la posibilidad de que la normalización fenotípica que se observó se haya debido a una introducción accidental de un gen DET2 de tipo silvestre dentro de sus genomas o a la inversión del sitio mutado.

Tabla 1 Resumen de las plantas det2-l transsénicas que portan ADNc's de la 5 -reductasa de esferoide humano Número de Plantas Construcciones Mostrando resis- Conteniendo Teniendo mutaDesplegando fenotencia a la canami- ADNc de hS5R ción del det2-l tipo de tipo silvescina tre hS5Rl-1.3kb 8 8 8 8 hS5Rl-2.1kb 18 18 18 18 hhSS55RR22--00..88kkbb 1 188 1 188 18 16 hS5R2-2.4kb 20 20 20 15 Se obtuvieron las plantas transgénicas de cada construcción a partir de dos experimentos independientes de transformación. Observe la descripción anterior y la Figura 8A para una descripción de las construcciones. Para probar que la normalización fenotípica que se observó fue provocada mediante la expresión de un ADNc de la 5OÍ-reductasa de esferoide humano en las plantas transgénicas, se recolectaron las semillas germinadas a partir de dos líneas transgénicas representativas, que contenían ADNc humano, ya sea del tipo 1 o del tipo 2, sobre un medio de cultivo sintético con concentraciones diferentes de 4-MA, un inhibidor de las 5 -reductasas de esferoide de mamífero. La Figura 9 muestra el efecto de las concentraciones aumentantes de 4-MA en el alargamiento del hipocótilo de plantas cultivadas en la oscuridad. Mientras que las concentraciones aumentantes de 4-MA tuvieron poco efecto en el alargamiento del hipocótilo de las plántulas, ya sea del tipo silvestre o del det2-l, el fármaco provocó una disminución significativa del crecimiento del hipocótilo en las dos líneas transgénicas. Los efectos diferenciales del 4-MA en el det2-l, el tipo silvestre y las dos líneas transgénicas que se observaron en estos experimentos, fueron consistentes con las propiedades bioquímicos de las 5a-reductasas de esferoide humano y el DET2. El Ki para el 4-MA de la 5a-reductasa de esferoide humano tipo 1 (8.0 nM) , es el doble de aquel de la enzima de tipo 2 (4.0 nM) ( supra) , mientras que el Ki para el 4-MA del DET2 es cuando menos 30 partes más elevado (300 nM) que aquellos de las isozimas de humano (Figura 7C) . La segunda línea de evidencia de que la expresión de los ADNc's de la 5o¡-reductasa de esferoide humano rescató los fenotipos mutantes del det2-l, viene de las observaciones de que la progenie de algunos de los transformantes individuales se veía más parecida a los mutantes del det2-l que a las plantas de tipo silvestre, aunque sus líneas parentales exhibieron un fenotipo de tipo silvestre completo. Sospechamos que este fenómeno se debió a la pérdida de la expresión del transgen en la generación de T2, la cual se había observado previamente en diferentes líneas transgénicas con el vector binario del pMDl . Por lo tanto, se examinaron los niveles de expresión de los ADNc's humanos en diferentes líneas transgénicas mediante manchado de ARN. El nivel de estado estable del ARNm de la 5a-reductasa de esferoide humano que se expresó en las plantas det2-l transgénicas (Figura 10B) , estuvo correlacionada con el grado de rescate mutante, como lo indica tanto la longitud del hipocótilo de las plántulas cultivadas en la oscuridad (Figura 10A) , como la morfología total de las plantas cultivadas en la luz (Figura 10C) . Las plantas que mostraron el nivel más elevado de los transcritos humanos entre todas las líneas examinadas, exhibieron estatura completa de tipo silvestre en la luz y sus hipocótilos fueron aun más largos que aquellos de los controles de tipo silvestre en la oscuridad. En contraste, las líneas que mostraron los niveles más bajos de ARNm's de humano, se veían más como los mutantes del det2-l que como las plantas de tipo silvestre en la luz y tuvieron longitudes intermedias de hipocótilo en la oscuridad. Basados en estos resultados, concluimos que los ADNc's de humano puede rescatar los defectos del det2-l y que la expresión de los ADNc's de la 5a-reductasa de esferoide humano en las plantas det2-l transgénicas se correlacionan con el grado de rescate de sus fenotipos mutantes . Ejemplo 4 Se transformó el arroz con dos construcciones, una de las cuales permitió la sobreexpresión y otra la subexpresión (antisentido) del DET2. Se usaron vectores de expresión de Standard Agrobacterium, en los cuales la secuencia de codificación del DET2 se expresó en orientación inversa a partir del promotor del virus de mosaico 35S de la coliflor (Metzlaff y colaboradores, Cell 8.:845, 1997). Las plantas antisentido tuvieron fenotipos similares a los de los mutantes de det2, es decir, eran pequeños con fertilidad masculina reducida y predominio apical reducido. Las líneas con sobreexpresión moderada fueron más largas que el tipo silvestre y con base en unas cuantas líneas, tuvieron un aumento en la producción de aproximadamente el 15 por ciento (la masa de las semillas es 15 por ciento mayor que las semillas de tipo silvestre) . Los sobreexpo-sitores elevados no son sanos, lo cual es consistente con la idea de que demasiada hormona es perjudicial. Aunque se ha descrito la invención con referencia a las modalidades que se prefieren actualmente, se deberá entender que se pueden hacer diferentes modificaciones sin alejarse del espíritu de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención está limitada solamente por las siguientes reivindicaciones .

ISTADQ DE SECUENCIAS NÚMERO DE SECUENCIAS: 7 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 974 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: ( AATTCCATAA CCCGAAAAAT GGAAGAAATC GCCGATAAAA CCTTCTTCCG ATACTGTCTC 60 CTCACTCTTA TTTTCGCCGG CCCACCAACC GCCGTCCTTC TGAAATTCCT CCAAGCTCCT 120 TACGGTAAAC ACAACCGTAC CGGATGGGGT CCCACCGTAT CTCCACCGAT TGCTTGGTTC 180 GTCATGGAGA GCCCAACCTT GTGGCTCACT CTCCTCCTCT TCCCCTTTGG TCGTCACGCT 240 CTCAACCCTA AATCTCTACT TCTATTCTCT CCTTATCTCA TTCATTACTT CCACCGCACC 300 5 ATCATTTACC CTCTTCGCCT CTTCCGCAGC TCCTTCCCCG CCGGTAAAAA CGGATTTCCG 360 ATCACCATCG CCGCCTTGGC TTTCACCTTT AATCTCCTCA ATGGTTATAT CCAGGCGAGG 420 TGGGTTTCGC ATTACAAGGA TGACTACGAA GACGGAAACT GGTTCTGGTG GCGGTTTGTT 480 ^ ATCGGTATGG TGGTTTTCAT AACCGGCATG TATATAAATA TCACGTCGGA CCGCACTTTG 540 GTACGATTGA AGAAAGAGAA CCGGGGAGGT TATGTGATAC CGAGAGGAGG CTGGTTCGAG 600 0 TTGGTAAGCC GTCCGAATTA TTTTGGAGAG GCGATTGAGT GGTTGGGCTG GGCTGTTATG 660 ACTTGGTCTT GGGCCGGTAT TGGATTTTTT CTGTACACGT GTTCCAATTT GTTTCCGCGT 720 GCACGTGCGA GTCACAAGTG GTACATTGCC AAGTTCAAGG AAGAGTATCC CAAGACTCGT 780 AAAGCTGTTA TTCCTTTTGT GTACTGAGAA TTGAGAAAGT TGAAAACTAG TTTATCATAT 840 GTTATGTGTC AATTTGTTTC CAAACTACCT TTGTCAAAAT TTCCAGTAAC CGGTTTAATT 900 CCAACACGGT TTAGATCTTA TGTTGGTATC TTCAACAATG CACAACAAAC TGTGTATTCT 960 TTAGACAAAT TTTA 974 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 262 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: irrelevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: u Thr Leu lie Phe Ala Gly Pro Pro Thr Ala Val Leu Leu Lys Phe Leu Gln 20 25 30 Ala Pro Tyr Gly Lys His Asn Arg Thr Gly Trp Gly Pro Thr Val Ser 15 35 40 45 Pro Pro lie Ala Trp Phe Val Met Glu Ser Pro Thr Leu Trp Leu Thr 50 55 60 ^^ Leu Leu Leu Phe Pro Phe Gly Arg His Ala Leu Asn Pro Lys Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Phe Ser Pro Tyr Leu lie His Tyr Phe His Arg Thr lie lie 85 90 95 Tyr Pro Leu Arg Leu Phe Arg Ser Ser Phe Pro Ala Gly Lys Asn Gly 100 105 110 Phe Pro lie Thr lie Ala Ala Leu Ala Phe Thr Phe Asn Leu Leu Asn 25 115 120 125 Gly Tyr lie Gln Ala Arg Trp Val Ser His Tyr Lys Asp Asp Tyr Glu 130 135 140 Asp Gly Asn Trp Phe Trp Trp Arg Phe Val lie Gly Met Val Val Phe 145 150 155 160 lie Thr Gly Met Tyr lie Asn lie Thr Ser Asp Arg Thr Leu Val Arg 165 170 175 Leu Lys Lys Glu Asn Arg Gly Gly Tyr Val lie Pro Arg Gly Gly Trp 180 185 190 Phe Glu Leu Val Ser Arg Pro Asn Tyr Phe Gly Glu Ala lie Glu Trp Gly Phe Phe 210 215 220 Leu Tyr Thr Cys Ser Asn Leu Phe Pro Arg Ala Arg Ala Ser His Lys 225 230 235 240 Trp Tyr He Ala Lys Phe Lys Glu Glu Tyr Pro Lys Thr Arg Lys Ala 245 250 255 Val He Pro Phe Val Tyr 260 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 3: 0 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 246 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: irrelevante (D) TOPOLOGÍA: lineal 5 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: Leu He Phe Ala Gly Pro Pro Thr Ala Val Leu Leu Lys Phe Leu Gln 1 5 10 15 Ala Pro Tyr Gly Lys His Asn Arg Thr Gly Trp Gly Pro Thr Val Ser 20 25 30 Pro Pro He Ala Trp Phe Val Met Glu Ser Pro Thr Leu Trp Leu Thr 35 40 45 Leu Leu Leu Leu Pro Phe Gly Arg His Ala Leu Asn Pro Lys Ser Leu 50 55 60 Leu Leu Phe Ser Pro Tyr Leu He His Tyr Phe Leu Arg Thr He He • 65 70 75 80 Tyr Pro Leu Arg Leu Phe Arg Ser Ser Phe Pro Ala Gly Lys Asn Gly 85 90 95 Phe Pro He Thr He Ala Ala Leu Ala Phe Thr Phe Asn Leu Leu Asn 15 100 105 110 Gly Tyr He Gln Ala Arg Trp Val Ser His Tyr Lys Asp Asp Tyr Glu 115 120 125 ^^ Asp Gly Asn Trp Phe Trp Trp Arg Phe Val He Gly Met Val Val Phe 130 135 140 20 He Thr Gly Met Tyr He Asn He Thr Ser Asp Arg Thr Leu Val Arg 145 150 155 160 Leu Lys Lys Glu Asn Arg Gly Gly Tyr Val He Pro Arg Gly Gly Trp 165 170 175 Phe Glu Leu Val Ser Arg Pro Asn Tyr Phe Gly Glu Ala He Glu Trp 25 180 185 190 Leu Gly Trp Ala Val Met Thr Trp Ser Trp Ala Gly He Gly Phe Phe 195 200 205 Leu Tyr Thr Cys Ser Asn Leu Phe Pro Arg Ala Arg Ala Ser His Lys 210 215 220 Trp Tyr He Ala Lys Phe Lys Glu Glu Tyr Pro Lys Thr Arg Lys Ala 225 230 235 240 Val He Pro Glu Val Tyr 245 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 239 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: irrelevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Gly Phe Met Ala Phe Val Ser He Val Gly Leu Arg Ser Val Gly Ser 1 5 10 15 Pro Tyr Gly Arg Tyr Ser Pro Gln Trp Pro Gly He Arg Val Pro Ala 20 25 30 Arg Pro Ala Trp Phe He Gln Glu Leu Pro Ser Met Ala Trp Pro Leu 40 45 Tyr Glu Tyr He Arg Pro Ala Ala Ala Arg Leu Gly Asn Leu Pro Asn 50 55 60 Arg Val Leu Leu Ala Met Phe Leu He His Tyr Val Gln Arg Thr Leu 65 70 75 80 Val Phe Pro Val Leu He Arg Gly Gly Lys Pro Thr Leu Leu Val Thr 85 90 95 Phe Val Leu Ala Phe Leu Phe Cys Thr Phe Asn Gly Tyr Val Gln Ser 100 105 110 Arg Tyr Leu Ser Gln Phe Ala Val Tyr Ala Glu Asp Trp Val Thr His 115 120 125 Pro Cys Phe Leu Thr Gly Phe Ala Leu Trp Leu Val Gly Met Val lie 130 135 140 Asn He His Ser Asp His He Leu Arg Asn Leu Arg Lys Pro Gly Glu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Lys He Pro Arg Gly Gly Leu Phe Glu Tyr Val Ser Ala 165 170 175 Ala Asn Tyr Phe Gly Glu Leu Val Glu Trp Cys Gly Phe Ala Leu Ala 180 185 190 Ser Trp Ser Leu Gln Gly Val Val Phe Ala Leu Phe Thr Leu Ser Thr 195 200 205 Leu Leu Thr Arg Ala Lys Gln His His Gln Trp Tyr His Glu Lys Phe 210 215 220 Glu Asp Tyr Pro Lys Ser Arg Lys He Leu He Pro Phe Val Leu 225 230 235 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 243 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: irrelevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Ala Tyr Leu Gln Cys Ala Val Gly Cys Ala Val Phe Ala Arg Asn Arg 1 5 10 15 Gln Thr Asn Ser Val Tyr Gly Arg His Ala Leu Pro Ser His Arg Leu 20 25 30 u Pro Ser Leu Ala Leu Pro Leu Tyr Gln Tyr Ala Ser Glu Ser Ala Pro Arg Leu Arg 50 55 60 Ser Ala Pro Asn Cys He Leu Leu Ala Met Phe Leu Val His Tyr Gly 65 70 75 80 His Arg Cys Leu He Tyr Pro Phe Leu Met Arg Gly Gly Lys Pro Met 85 90 95 ^^ Pro Leu Leu Ala Cys Thr Met Ala He Met Phe Cys Thr Cys Asn Gly 100 105 110 20 Tyr Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Ser His Cys Ala Val Tyr Ala Asp Asp 115 120 125 Trp Val Thr Asp Pro Arg Phe Leu He Gly Phe Gly Leu Trp Leu Thr 130 135 140 Gly Met Leu He Asn He His Ser Asp His He Leu Arg Asn Leu Arg 145 150 155 160 Lys Pro Gly Asp Thr Gly Tyr Lys He Pro Arg Gly Gly Leu Phe Glu 165 170 175 Tyr Val Thr Ala Ala Asn Tyr Phe Gly Glu He Met Glu Trp Cys Gly 180 185 190 Tyr Ala Leu Ala Ser Trp Ser Val Gln Gly Ala Ala Phe Ala Phe Phe 195 200 205 Thr Phe Gly Phe Leu Ser Gly Arg Ala Lys Glu His His Glu Trp Tyr 210 215 220 Leu Arg Lys Phe Glu Glu Tyr Pro Lys Phe Arg Lys He He He Pro 225 230 235 240 Phe Leu Phe (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 238 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: irrelevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Leu Ala Thr Met Gly Thr Leu He Leu Cys Leu Gly Lys Pro Ala Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Lys His Thr Glu Ser Val Ser Ser Gly Val Pro Phe Leu Pro 20 25 30 Ala Arg He Ala Trp Phe Leu Gln Glu Leu Pro Ser Phe Val Val Ser 35 40 45 Val Gly Met Leu Ala Trp Gln Pro Arg Ser Leu Phe Gly Pro Pro Gly 50 55 60 Asn Val Leu Leu Ala Leu Phe Ser Ala His Tyr Phe His Arg Thr Phe 65 70 75 80 He Tyr Ser Leu Leu Thr Arg Gly Arg Pro Phe Pro Ala Val Leu Phe 85 90 95 Leu Arg Ala Thr Ala Phe Cys He Gly Asn Gly Leu Leu Gln Ala Tyr 100 105 110 Tyr Leu Val Tyr Cys Ala Glu Tyr Pro Glu Glu Trp Tyr Thr Asp Val 115 120 125 Arg Phe Ser Phe Gly Val Phe Leu Phe He Leu Gly Met Gly He Asn 130 135 140 He His Ser Asp Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Arg Lys Pro Gly Glu Val 145 150 155 160 He Tyr Arg He Pro Arg Gly Gly Leu Phe Thr Tyr Val Ser Gly Ala 165 170 175 Asn Phe Leu Gly Glu He He Glu Trp He Gly Tyr Ala Leu Ala Thr 180 185 190 Trp Ser Val Pro Ala Phe Ala Phe Ala Phe Phe Thr Leu Cys Phe Leu . 195 200 205 Gly Met Gln Ala Phe Tyr His His Arg Phe Tyr Leu Lys Met Phe Lys 210 215 220 Asp Tyr Pro Lys Ser Arg Lys Ala Leu He Pro Phe He Phe 225 230 235 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 241 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: irrelevante (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Leu Val Ala Leu Gly Ala Leu Ala Leu Tyr Val Ala Lys Pro Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ser Gly Tyr Gly Lys His Thr Glu Ser Leu Lys Pro Ala Ala Thr 25 30 Arg Leu Pro Ala Arg Ala Ala Trp Phe Leu Gln Glu Leu Pro Ser Phe 40 45 Ala Val Pro Ala Gly He Leu Ala Arg Gln Pro Leu Ser Leu Phe Gly 50 55 60 Pro Pro Gly Thr Val Leu Leu Gly Leu Phe Cys Val His Tyr Phe His 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Tyr Ser Leu Leu Asn Arg Gly Arg Pro Tyr Pro Ala 85 90 95 He Leu He Leu Arg Gly Thr Ala Phe Cys Thr Gly Asn Gly Val Leu 100 105 110 Gln Gly Tyr Tyr Leu He. Tyr Cys Ala Glu Tyr Pro Asp Gly Trp Tyr 115 120 125 Thr Asp He Arg Phe Ser Leu Gly Val Phe Leu Phe He Leu Gly Met 130 135 140 Gly He Asn He His Ser Asp Tyr He Leu Arg Gln Leu Arg Lys Pro 145 150 155 160 Gly Glu He Ser Tyr Arg He Pro Gln Gly Gly Leu Phe Thr Tyr Val 165 170 175 Ser Gly Ala Asn Phe Leu Gly Glu He He Glu Trp He Gly Tyr Ala 180 185 190 Leu Ala Thr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Phe Ala Phe Phe Ser Leu 195 200 205 Cys Phe Leu Gly Leu Arg Ala Phe His His His Arg Phe Tyr Leu Lys 210 215 220 Met Phe Glu Asp Tyr Pro Lys Ser Arg Lys Ala Leu He Pro Phe He 225 230 235 240 Phe

Claims

REIVINDICAC ONES 1. Un polipéptido DET2 sustancialmente purificado.
2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde DET2 es caracterizado como: a) teniendo un peso molecular de aproximadamente 31 KD, como se determina por SDS-PAGE; b) teniendo actividad 5a-reductasa esferoide; y c) funcionando en la trayectoria biosintética de brasinólido.
3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína es sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos señalada en la SEQ ID NO: 2 (figura 1C) .
4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína es sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos señalada en la SEQ ID NO: 2 (figura 1C) .
5. ün polinucleótido aislado que codifica el polipéptido DET2 de la reivindicación 1.
6. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 5, teniendo una secuencia de nucleótidos como se señala en la SEQ ID NO: 1 (figura 1C) , o variaciones de ésta que codifican la misma secuencia de aminoácidos, pero empleando diferentes codones para algunos de los aminoácidos, o secuencias de nucleó-tidos variantes de empálmente de las mismas.
7. Un vector de expresión recombinante que contiene una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 5.
8. Una célula anfitriona que contiene el vector de la reivindicación 7.
9. Un anticuerpo que liga la proteína de la reivindicación 1, o fragmentos antigénicos de dicha proteína.
10. Un método de producir una planta genéticamente modificada, caracterizada por tener un rendimiento incrementado en comparación con una planta tipo salvaje, dicho método comprendiendo: poner en contacto una célula de planta con al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un 5a-reductasa esferoide, dicha secuencia de ácidos nucleicos asociada operati-vamente con un promotor, para obtener una célula de planta transformada; producir una planta a partir de dicha célula de planta transformada; y seleccionar una planta que exhibe dicho rendimiento incrementado.
11. El método de la reivindicación 10, donde el 5o¿-reductasa esferoide es una enzima de planta.
12. El método de la reivindicación 11, donde el 5a-reductasa esferoide es DET2.
13. El método de la reivindicación 10, donde el 5a-reductasa esferoide es 5a-reductasa esferoide es una enzima de mamífero.
14. El método de la reivindicación 10, donde el 5a-reductasa esferoide es seleccionado del grupo que consiste en 5 -reductasa esferoide humano, de rata, de ratón y de mono tipo 1 o tipo 2.
15. El método de la reivindicación 10, donde la puesta en contacto es por medios físicos .
16. El método de la reivindicación 10, donde la puesta en contacto es por medios químicos .
17. El método de la reivindicación 10, donde la célula de planta es seleccionada del grupo que consiste en protoplastos, células productoras de gametos, y células que se regeneran en plantas enteras.
18. El método de la reivindicación 10, donde el promotor es seleccionado del grupo que consiste en un promotor constitutivo y un promotor inducible.
19. Una planta producida por el método de la reivindicación 10.
20. Tejido de planta derivado de una planta producida por el método de la reivindicación 10.
21. Una semilla derivada de una planta producida por el método de la reivindicación 10.
22. Un método para modificar genéticamente una célula de planta tal que una planta, producida a partir de dicha célula, produzca un rendimiento incrementado en comparación con una planta tipo salvaje, dicho método comprendiendo: ^ poner en contacto dicha célula de planta con el polinucleótido de la reivindicación 5 o un polinucleótido que codifica 5 un 5a-reductasa esferoide de mamífero para obtener una célula de planta transformada; y cultivar la célula de planta transformada bajo condiciones de formación de planta para obtener una planta que tiene rendimiento incrementado.
23. El método de la reivindicación 22, donde inducir íü un crecimiento incrementado es logrado induciendo la expresión de J 5a-reductasa esferoide en la planta.
24. El método de la reivindicación 22, donde el 5a- reductasa esferoide es una enzima de planta.
25. El método de la reivindicación 24, donde el 5a-15 reductasa esferoide es DET2.
26. El método de la reivindicación 22, donde el 5a- reductasa esferoide es una enzima de mamífero. /
27. El método de la reivindicación 26, donde el 5o¡- reductasa esferoide es seleccionado del grupo que consiste en 0 5a-reductasa esferoide humano, de rata, de ratón y de mono tipo 1 o tipo 2.
28. Un método de producir una planta caracterizada por tener rendimiento incrementado, dicho método comprendiendo: poner en contacto una planta susceptible con una 5 cantidad inductora del promotor DET2 de un agente necesario para elevar la expresión del gen DET2 sobre la expresión de DET2 en una planta no contactada con el agente. J ~
29. El método de la reivindicación 28, donde el agente es un factor de transcripción.
30. El método de la reivindicación 28, donde el agente es un agente químico.