MXPA98008578A - Inhibidores antisentido de expresion de factor decrecimiento endotelial vascular (vegf/vpf) - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la inhibición de expresión de factor de crecimiento endotelial vascular con oligonucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención se considera que ligan a ARNn objetivo en una forma específica de secuencia y evitan expresión del gen codificado. Modificaciones químicas de los oligonucleótidos para incrementar su estabilidad y eficiencia de unión, se describen. Estas modificaciones incrementan la estabilidad y eficiencia de los oligonucleótidos contemplados en esta invención. Composiciones de oligonucleótidos pueden emplearse en terapias ex vivo para el tratamiento de macrófagos o terapias in vivo por inyección, inhalación, tratamiento tópico u otras rutas de administración.

Description

INHIBIDORES ANTISENTIDO DE EXPRESIÓN DE FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEsF/VPF) REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud depende de la prioridad sobre una solicitud provisional co-pendiente que tiene número de serie de patente de los E.U.A. 60/015,752 presentada en abril 17, 1996. DECLARACIÓN RESPECTO A DESARROLLO O INVESTIGACIÓN AUSPICIADA FEDERALMENTE No aplica. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se refiere a inhibición celular de expresión de factor de crecimiento endotelial vascular con oligunucleótidos . Los oligunucleótidos de la presente invención se considera que ligan ARNm objetivo en una secuencia de manera específica y evitan expresión del gen VEGF codificado. Modificaciones químicas de los oligonucleótidos se describen para incrementar la estabilidad y eficiencia de unión de los oligonucleótidos. Las presentes composiciones de oligonucleótidos pueden emplearse en terapias ex vivo para tratamientos de macrófagos o en terapias in vivo por inyección, inhalación, tratamiento tópico u otras rutas de administración. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF = Vascular endothelial growth factor) también conocido como factor de permeabilidad vascular, comprende una familia de glicoproteínas secretorias homodiméricas en la gama de tamaños de 34 a 46 kilodaltons. Se secreta por una variedad de tipos de células en respuesta a hipoxia y ciertos factores regulatorios . Cuatro isotipos de VEGF se conocen. Surgen por separación alterna de ARNm de un solo gen (Keck y colaboradores, 1989; Leung y colaboradores, 1989; Connolly y Plander 1989; Tischer y colaboradores, 1991) . VEGF es necesario para la formación de vasos sanguíneos (angiogénesis) durante los procesos de crecimiento y desarrollo, y para reparación de tejidos (Ferrera y colaboradores, 1996; Carmeliet y colaboradores, 1996; Thomas, 1996; Dvorak y colaboradores, 1995a, ; Folkman, 1995; Ferrera y colaboradores, 1992) . Este factor de crecimiento induce permeabilidad vascular es un quimiotáctico para monocitos y osteoblastos y es un mitógeno selectivo para células endoteliales. Las proteínas receptoras para VEGF (KDR y Flt-1 en humanos) pertenecen a la familia de cinasa tirosina transmembrana (Terman y colaboradores, 1992; de Vries y colaboradores, 1992) . La activación del receptor inicia una cascada de eventos que conducen a velocidades marcadamente mejoradas de proliferación de célula endotelial vascular y eventual neovascularización. VEGF es más selectivo para inducir proliferación celular endotelial que cualquier otro factor de proteína involucrado en angiogénesis. Desgraciadamente, bajo ciertas condiciones la presencia de VEGF puede tener efectos nocivos a la salud. Concentraciones anormalmente elevadas de VEGF se asocian con enfermedades caracterizadas por un alto grado de vascularización o permeabilidad vascular. Ejemplos de estas afecciones incluyen retinopatia diabética, cánceres agresivos, psoriais, artritis reumatoide y otras condiciones inflamatorias. (D'Amore, 1994; Dvorak y colaboradores 1995 a,b; Folkman, 1995) . Se re-quieren composiciones y métodos para disminuir selectivamente concentraciones de VEGF anormalmente elevadas a fin de reducir la neovascularización mediada por VEGF. Estos métodos y composiciones pueden emplearse para frenar el avance de enfermedades caracterizado por vascularización y permeabilidad vascular. Un método para reducir concentraciones de VEGF involucra el uso de oligonucleótidos anti sentido (Wagner 1994) . La ventaja central de esta técnica es la especificidad por la cual se puede lograr la inhibición. Oligonucleótidos útiles se considera que ligan secuencias específicas de ARNm e interfieren con la expresión de los genes codificados. La expresión de proteina reducida puede resultar de la inhibición de función de ribosoma, concentraciones reducidas de ARNm de substrato traducible u otros mecanismos. Además, oligonucleótidos pueden reducir concentraciones de ARNm por un incremento mediado por oligonucleótido en la velocidad de degradación de moléculas de ARNm. En general, oligonucleótidos de aproximadamente 15 bases son suficientes para proporcionar unión específica de secuencia a objetivos ARNm pretendidos, aunque en ocasiones ligan oligonucleótidos más cortos.

(Uhlmann y Peyman, 1990) . Sin embargo, oligonucleótidos antisentido que tienen entre 11-30 bases se han empleado para reducir expresión de proteína en experimentos in vitro. (Revisado por Uhlmann y Peyman, 1990) . Una cantidad de obstáculos debe de superarse antes de que puedan lograrse las ventajas potenciales de la estrategia de tratamiento antisentido para tratar enfermedad. Por ejemplo los oligonucleótidos antisentido son grandes compuestos hidrofílicos (~ 3,000 a 10,000 D) y deben cruzar membranas celulares hidrofóbicas antes de ligar sus objetivos en el núcleo o citosol. (Uhlmann y Peyman, 1990; Milligan y colaboradores, 1993) . De esta manera, se requieren métodos para facilitar transporte de oligonucleótidos antisentido VEGF a través de membranas celulares. Oligonucleótidos terapéuticos también no deben ser tóxicos y no deberán interferir con el metabolismo normal celular. Para minimizar estos efectos no específicos, deben ligarse a sus secuencias connatas con alta especificidad y afinidad. Oligonucleótidos con una estructura principal fosfodiéster natural son altamente susceptibles a suero y nucleasas celulares. Secuencias de oligonucleótidos con longitud de 17 bases aleatorias, tienen vida media inferior a tres minutos en suero (Bishop y colaboradores, 1996) . Oligonucleótidos con incrementadas estabilidades se requieren antes de que puedan emplearse como terapéuticos en el tratamiento de enfermedad neovascular. Substitución del grupo fosfodiéster con fosforotioatos para incrementar vidas medias de oligonucleótidos. Deberán ser químicamente inertes y resistentes a nucleasa en una variedad de ambientes químicos. Sin embargo, estos oligonucleótidos previamente no han mostrado que inhiben expresión de VEGF en una forma selectiva. Una desventaja de los fosforoditioato oligonucleótidos previamente conocidos es que requieren concentraciones sobre 1 micromolar (µM) para reducir expresión de VEGF. (Norara y colaboradores, 1995; Robinson y colaboradores, 1996) . A estas concentraciones, aquellos oligonucleótidos son tóxicos (Woolf y colaboradores, 1992; Stein y Cheng, 1993; Stein y Kreig, 1994, Wagner, 1994; Fennewald y colaboradores, 1996) y los efectos observados probablemente son el resultado de esta toxicicidad no específica (Fennewald y colaboradores, 1995) . Inhibidores de oligonucleótidos novedosos se requieren que demuestran un efecto antisentido real al inhibir expresión de VEGF a concentraciones no tóxicas. Estos oligonucleótidos probablemente tendrán superiores constantes de asociación y/o una especificidad incrementada para sus secuencias ARNm objetivo que los oligonucleótidos antisentido VEGF previos. Hay varias explicaciones posibles para la efectividad limitada de los oligonucleótidos antisentido VEGF. Una posibilidad es que las secuencias ARNm objetivo puedan confinarse en estructuras macromoleculares que bloquean estéricamente la unión de oligonucleótidos. Por ejemplo, proteínas de unión de ARNm y complejos de traducción de proteína pueden bloquear la unión de oligonucleótidos. En forma alterna, los oligonucleótidos pueden no ser capaces de ligar conformaciones desfavorable de ARNm. Además, la aplicación de las frecuencias objetivo efectivas es variable. Secuencias objetivo efectivas pueden localizarse en cualquier parte en las transcripciones ARNm objetivo y oligonucleótidos objetivo a codones de iniciación de traducción o a las regiones 5' no traducidas, no son siempre efectivos. ( agner y colaboradores 1993; Fenster y colaboradores 1994).

Interacciones no específicas entre oligonucleótidos y otras moléculas tales como proteínas, también pueden conducir a actividad biológica variable (Woolf y colaboradores, 1992; Stein y Cheng, 1993) . Además, los propios oligonucleótidos pueden adoptar estructuras terciarias y cuaternarias inesperadas que ligan ADN en sitios inesperados. Esta unión aberrante tiene el potencial por producir efectos biológicos indeseables (Chaudhary y colaboradores, 1995) . Otras dificultades también se han encontrado en la búsqueda de oligonucleótidos antisentido eficaces . La afinidad de oligonucleótidos por sus objetivos ARN, se incrementa con la longitud y con el contenido G-C incrementado. Sin embargo, más largos oligonucleótidos tienden a ligar ARN secuencias no específicamente y oligonucleótidos. Aún más, oligonucleótidos con un alto contenido G tienden a formar cuartetos G, reduciendo la cantidad de la forma de bobina libre de oligonucleótido que se considera requiere para unión de antisentido (Bishop y colaboradores, 1996) . De esta manera se requieren oligonucleótidos que son cortos y tienen alta afinidad por sus secuencias objetivo que no forman cuartetos G a pesar de tener un alto contenido G. Como se anotó previamente, los oligonucleótidos son grandes compuestos hidrofílicos que deben cruzar membranas celulares hidrofóbicas antes de que liguen sus objetivos en el citosol o núcleo. (Uhlmann y Peyman, 1990; Milligan y colaboradores, 1993) . Sin embargo, debido a su gran tamaño, su naturaleza hidrófilico y carga negativa, los oligonucleótidos no cruzan eficientemente membranas celulares. En la ausencia de mejoradores de absorción celular, los oligonucleótidos tienden a acumularse en compartimientos endosomales perinucleares de las células tratadas (Fisher y colaboradores, 1993; Guy-Caffey y colaboradores, 1995) . En casos, el transporte de oligonucleótidos a través de la membrana de plasma o las membranas de los compartimientos endosomales limitan su velocidad de internalización y su actividad. Por lo tanto, se requieren nuevas composiciones y métodos para mejorar la velocidad en la que las oligonucleótidos cruzan las bi-capas lípidas. Una clase de mejoradores de absorción de lípidos incluye un grupo de cabeza cargado positivamente que liga ácidos nucleicos, y una cola interactiva de membrana que se considera interactúa con componentes de membrana. Estas composiciones pueden facilitar la penetración de oligonucleótido de la célula, supuestamente al romper en forma transitoria las membranas celulares. Desgraciadamente, la actividad de muchas preparaciones lípidas catiónicas tales como LipofectinMR, una mezcla liposomal 1:1 (masa) del lípido catiónico DOTMA y el lípido fusogénico dioleil fosfotidiletanola ina (DOPE) (Life Technologies, Inc.; Gaithersburg, MD) , son altamente sensibles a factores tales como la composición y cantidad de ácido nucleico, el tipo de célula objetivo y la concentración de suero en el medio de crecimiento celular. Además, algunas preparaciones en sí son citotóxicas. Estas restricciones limitan severamente la utilidad de muchos de sus compuestos como agentes de suministro de oligonucleótidos para uso terapéutico en sistemas animales . Sistemas de suministro mejorados que son compatibles con oligonucleótidos deben ser identificados. En resumen, el avance de muchas enfermedades se asocia con angiogénesis incrementada y permeabilidad vascular provocada por la sobre expresión de VEGF. Nuevas composiciones y métodos para reducir específicamente expresión de VEGF serán útiles en el tratamiento de estas enfermedades. Tratamiento de oligonucleótido antisentido es un enfoque atractivo debido a su selectividad potencial . Desgraciadamente, muchos de los oligonucleótidos antisentido VEGF conocidos solo trabajan a concentraciones que son tóxicas para las células y exhiben solo efectos no específicos. Además, oligonucleótidos antisentido previos son química y biológicamente lábiles y aquellos que son más estables tienden a tener afinidades inaceptablemente bajas para sus secuencias objetivo y no penetran fácilmente las membranas celulares y por lo tanto tienen dificultad en alcanzar sus objetivos biológicos. Finalmente, oligonucleótidos con alto contenido G tienden a formar cuartetos G. Nuevas composiciones de oligonucleótidos antisentido se requieren que no son tóxicas y tienen afinidad incrementada por sus secuencias objetivo ARNm. Estas composiciones deberán tener estabilidad biológica mejorada, incluyendo resistencia incrementada a degradación por nucleasas . Además, oligonucleótidos útiles no deberán agregarse independientemente de sus secuencias . También se requieren nuevas composiciones que facilitan el transporte de oligonucleótidos a través de membranas celulares . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para frenar el avance de enfermedades asociadas con incrementada angiogénesis y permeabilidad vascular. Las presentes composiciones de oligonucleótido antisentido son marcadamente superiores a oligonucleótidos previos para inhibir selectivamente la expresión de VEGF por células productoras y se pretenden para utilizar en el tratamiento de estas enfermedades . La selectividad de la presente invención se proporciona por oligonucleótidos antisentido que específicamente ligan moléculas ARNm, VEGF y bloquean la expresión de VEGF.

La presente invención proporciona oligonucleótidos y métodos para producirlos y utilizarlos, con modificaciones químicas para incrementar su afinidad y especificidad para secuencias ARNm objetivo. Los presentes oligonucleótidos tienen mejorada estabilidad biológica y altas afinidades para sus secuencias objetivo. Los oligonucleótidos son relativamente inertes a ataques químicos y biológicos tanto en ambientes hidrofóbicos como hidrofílicos y resisten agregación independientemente de su secuencia. La presente invención proporciona oligonucleótidos antisentido VEGF que son tanto eficaces como no tóxicos. Específicamente, esta invención es para nuevas composiciones de oligonucleótido que, cuando se utilizan para tratar células a concentraciones inferiores a 1 micro molar, provocan un decremento en la producción celular de VEGF. A estas concentraciones, los presentes oligonucleótidos anti sentido no son tóxicos y no interfieren con metabolismo celular. La invención proporciona composiciones y métodos que permiten que oligonucleótidos penetren fácilmente a las membranas celulares para alcanzar sus objetivos biológicos. Esto se logra al proporcionar métodos para producir y utilizar oligonucleótidos antisentido con mejoradores de absorción celular. Los mejoradores de absorción celular no son tóxicos, son compatibles con oligonucleótidos antisentido VEGF y facilitan la penetración eficiente de oligonucleótidos a través de las membranas celulares . Para propósitos de esta invención, el término "oligonucleótido" incluye polímeros de ácidos nucleicos y estructuras químicas que semejan polímeros de ácidos nucleicos . Equivalentes de ribosa o de oxiribosa pueden substituirse en las estructuras siempre que las porciones base conectadas a la estructura puedan mantener los enlaces de hidrógeno requeridos para unión específica con las secuencias objetivo. Similarmente, oligonucleótidos pueden contener equivalentes químicos de la estructura principal fosfodiéster tales como enlaces fosfodiéster. Además, oligonucleótidos pueden incluir porciones base que son modificadas químicamente. Específicamente, oligonucleótidos pueden incluir pero no están limitados a (propinil o hexinil) uridina con 5 átomos de carbono o residuos citidina, 6-aza-uridina o residuos citidina y pirimidinas tanto con modificaciones de 5 átomos de carbono como 6-aza. El término "VEGF", se pretende que incluya todas las proteínas en la clase conocida como factores de crecimiento endotelial vascular. El término VEGF incluye al menos 4 isótopos humanos conocidos que se consideran surgen a la escisión alternativa de ARNm y cualquier proteína homologa que tenga función biológica similar. Las proteínas conocidas incluyen aquellas que están codificadas a partir de especies ARNm conocidas en la técnica como VEGF 206, VEGF 185, VEGF 165 y VEGF 121. Oligonucleótidos antisentido de la presente invención se preparan como sigue . Una secuencia de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos y de preferencia de aproximadamente 19 nucleótidos, se identifica en un ARNm que codifica VEGF. Las secuencias de moléculas ARNm VEGF se conocen en la técnica. La secuencia ARN puede estar en cualquier parte en cualquier ARNm que codifica cualquier proteína en la familia de proteínas VEGF. Más se prefieren oligonucleótidos antisentido que son complementarios a el ARNm que codifica VEGF 206, VEGF 185, VEGF 165 y VEGF 121 humanos. Se prefieren más oligonucleótidos que ligan secuencias encontradas en todos los ARNms VEGF (Ver Tabla 1) .

TABLA 1 Oligonucleótidos Anti-VEGF I.D. Descripción Secuencia Modificación T3051S. antisentldo a ARNm 18S •203+ S'-f*c*g* *l:*g*** *«*3•i»*c*a*t*c*c***t*g-3, total KT (fosforotioato) ADN X30S39s var. de T3ß«iS S*-f«C*g*C*$*g***U»**3*a*c*a*ü*c*C*a*tr* -?« total ?T, C5-propir.il pirimidina ADN fies-t?f sec. ARNm 2»* -222 5l -C*g*a*«*tf*g*g***0*g*g*C***9*tJ*«*g*C«:-3« total vr, C5 propínii pirimidinas »0S l! sec. ARNm 2.13-25$ 5- -0**^*tf*c*C*ff»g*a*a*«*g *{?*3*0*C*C*?t-3* total BT, C5-propinil pirimidinas 3CW4*?! var de T3f 63S 5« .p*c*§*c*B*g-**W**-g-a*C*a-a*C»C«»*0«-g-3 ' * BD enlaces 10 T3ß84f « var. de igtfjji 5' -3*C*g-C»0-f-a*0**-g-a*e**-rjf*C*C***s*g--3» S Pí> enlaces * 3 S«s t var. de T3«SJ S* .9^«g*C*D*g-.**!í**«g-**C*a*l?*C*C*«*0*0-3' 2 KB enlaces «0S?fii sec. ARNm 224 -2*2 S«-3«*****g***lf*f*£f*C»C*a*C*C***g«g*g«tf*C-3 ' total i*T, CS« propinil plrímídinas T30Í77: sec. ARNm «Sßg-424 5*-**^*g*»*a*g*C*W*C»a*ü*c*0*C*Ü*C*C*ü**--3' total W« CS- proplnil pirimídinas T3087Í. sec. ARNm 522-54.0 S» -tf«**C*a*C*9*W*C*ll*a*C*s*g***0*C*«*0*g*-3 » total ST, CS- propinil pirimidinas T30i7S? sec. ARNm 5*5-533 5' *tl*a*«*C»tf»€*a*«*g*C*ÍJ*g!*C*C*U*C*gs*C*C*-3i« total ST, CS- propln¡l pirimidinas «D8fß; sec. ARNm 171-189 5« -C«C*»*0*g*a***C*e*W«c***C*C*?,*Cí*í?*«J*fl-3' Setal SET» CS- propínil pirimidinas 15 T30l87? sec. ARNm 17C-1Í4 S'-g»»*C*a*£l*C*C***s*er***a*c*t*t*C*a*ß«c-3» total PT. CS- propínil pirimidinas T30ÍS8. sec. ARNm 119-217 5»-g*gr*a*u*g*g*c*«*f*ü*a* *C*D«g*C*g*C*s-3' total ?t, CS-propini! pirimidinas •n ssí sea ARNm 195-213 S*-g« *C*a*s*O*a*s*C*O*er*C*e(*C*W*0*»**ü*a-3< total PT, C5*propini! pirimldlnas 30SSO; var. de T3M3§ 5'-g*C*g*C*t*ga'*«e*a*f***C***l:* *C*** *g-.3, total PT, CS- propinil solo C :- T3M>1 ; var. de T30S39 total i?T, CS -propinil solo U t30íí52i var. de T3063S» S' -g*s*g*c*t*3*a*0*a«g***c*a*U*C*«***t«f-3' total PT, 4 CS- propinü pirimidinas W06I3: var. de T30OS 5«-g*C*g*e*ir*g*«*ü*#*g*»»C***t*C*c***a*g-3' total STt S CS- propinil plrimidinas 20 Sí»«-S2»« i var. de T30(539 S ' -g«C*g*C*O-g-a-O*a-g-»-C*??-Uí«C-C*»*«»0-3« [JU -I>ip- l ß POÍ CS-propinilos, extremo lipido S96-S297 : var. de Y30Í3Í* S « -g*.C*s*C*0-§-a-tl**-3-*-C**-y«C-C*a*lJ*g-3( M«l - PÍreno S « ; CS-propinilos. extremo píreno T3fi$ftß . var. de T30S15 S , -g*C*g*C*O*a«U*3***C*a*rj*C*C***lí*0-3 » total PT, CS - hexinil piri idlnas ADN T386« ¡ 2- no apareamiento S« -g*C*g*C*0*»*C*a* *a*C*a*1l*íJ*C*A*lJ*g-3 ' total P?, CS-propinil pirimídinas, ADN versión de T30.f39> T3d8d7: ADN 'sentido de TXMíS 5 ' «c*a*t *g*§* a*t *g*t*c*t*«**t*c*a*g*c*g*c~3 ' total fosfodiéster, ADN T30807 * ARN 'sentido' de TS߀?S S , -c«a*e*g*g*a*t*f*c*c*t«a*t*c**»9*c«g*c-3 ' total fosfodíésier, ARN 25 + Secuencia ARNra VEGF humana de Leung y colaboradores, Science, 246:1306, 1989. Codón iniciador en base 57. * Enlace fósforotioato - Enlace fosfodiéster 1 C, U representan bases modificadas Se prepara una serie de oligonucleótidos complementarios o "antisentido" . Para propósitos de esta invención, "antisentido" significa que los oligonucleótidos tienen secuencias complementarias a secuencias ARNm de manera tal que ligarán aquellas secuencias a través de patrones de unión de hidrógeno específicos. Sin embargo, un oligonucleótido antisentido puede tener faltas de correspondencia o patrones de unión de hidrógeno imperfectos, siempre que el oligonucleótido tenga actividad anti-VEGF a concentraciones por debajo de 1 micromolar. Oligonucleótidos antisentido que se contemplan en esta invención incluyen modificaciones que mejoran su estabilidad biológica. La estabilidad biológica se mejora al incorporar enlaces resistentes a nucleasas tales como enlaces fosforotioato entre diversos o todos los residuos nucleótidos. Los presentes oligonucleótidos también incluyen bases químicamente modificadas en diversos o todos los sitios pirimidinas . Estas bases modificadas incluyen C5-propinil pirimidinas, C5-hexinil pirimidinas o 6-aza-pirimidinas o combinados derivados C5 y 6-aza pirimidinas y además pueden estabilizar los oligonucleótidos de la presente invención. Oligonucleótidos antisentido que se contemplan en esta invención incluyen modificaciones que mejoran su afinidad para unión a las secuencias objetivo. La afinidad para unión se mejora al incorporar diversas porciones químicas en base de pirimidinas . Los presentes oligonucleótidos incluyen bases químicamente modificadas en diversos o todos los sitios de pirimidina. Estas bases modificadas incluyen C5-propinil pirimidinas, C5-hexinil pirimidinas o combinados derivados de C5 y 6-aza-pirimidina . La unión de oligonucleótido antisentido puede ser a ARNm actual o a secuencias de ARN químicamente sintetizadas que son idénticas a las secuencias encontradas en ARNms VEGF. Esta unión puede demostrarse en una variedad de formas . Un método para observar unión se describe en el Ejemplo III. Este método involucra mezclar oligonucleótidos anti sentido con secuencias ARN químicamente sintetizadas de la misma longitud, permitiendo que el oligonucleótido antisentido por recocido en una etapa inicial de calentamiento y enfriamiento, y observar el cambio de absorbancia de la mezcla a 260 nm al calentar. La unión también puede medirse por otros métodos tales como experimentos de protección de nucleasa, experimentos de extensión de oligonucleótido, RMN, electroforésis en gel u otras técnicas bien conocidas por aquellos con destreza en la especialidad. Para propósitos de esta invención "afinidad de unión mejorada" o "estabilidad" significa que el oligonucleótido tiene una superior temperatura de fusión (Tm) , cuando se ensaya con su secuencia ARN objetivo que un oligonucleótido sin la modificación. Ensayos de punto de fusión como se describe en el Ejemplo III, se emplean para esta determinación. Modificaciones químicas que incrementan la afinidad de unión de los dúplex de secuencia objetivo ARNm/oligonucleótido antisentido, se contemplan para utilizar por la presente invención. En general, se contemplan oligonucleótidos antisentido que tienen una Tm sobre 45°C en el ensayo descrito. Se prefiere en particular oligonucleótidos que tienen una Tm sobre 50°C. Ciertos oligonucleótidos de la presente invención incluyen modificaciones químicas que mejoran su actividad frente a oligonucleótidos antisentido VEGF previamente conocidos. Actividad mejorada significa que menores concentración de oligonucleótidos se requieren para inhibir expresión VEGF in vivo . Aunque la invención no se pretende limitada por el modo de acción de estas modificaciones, afinidad de unión incrementada y estabilidad biológica se consideran cuando menos responsables parcialmente por la actividad incrementada de los oligonucleótidos actualmente contemplados. Modificaciones químicas específicas como se estableció anteriormente, se emplean para incrementar la actividad de los presentes oligonucleótidos. Oligonucleótidos antisentido que se contemplan en esta invención tampoco son tóxicos a concentraciones inferiores a aproximadamente 1 µM. Toxicicidad se mide de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo V. Oligonucleótidos antisentido de la presente invención reducen producción de VEGF en células tratadas . En un método, las células se tratan al colocarlas en contacto directo con las composiciones de oligonucleótido, de manera tal que el oligonucleótido puede internalizarse en la celda y alcanzar su secuencia ARNra objetivo. Antes de tratamiento, el oligonucleótido se disuelve o suspende en un líquido o incorpora en un sólido. Formulaciones líquidas y sólidas convenientes se conocen en la técnica y pueden seleccionarse por métodos bien conocidos . Oligonucleótidos formulados se colocan en contacto directo con células. En otros métodos, los oligonucleótidos formulados se colocan de manera tal que oligonucleótidos pueden alcanzar sus celdas objetivo a través de difusión, dispersión o medios semejantes. La presente invención no requiere que la formulación de oligonucleótido contacte directamente las células objetivo. La invención solo requiere que el oligonucleótido alcance las células objetivo. Por ejemplo, un oligonucleótido puede introducirse en la corriente sanguínea pero difundirse fuera de la sangre antes de alcanzar células de tumor objetivo, células artríticas o semejantes. En forma alterna, el oligonucleótido puede mezclarse en un polvo que se aplica directamente a la piel y difunde a las células subyacentes . Células tratadas con oligonucleótidos antisentido presentes producen a lo más, aproximadamente 90% de VEGF que se produce por células no tratadas bajo las mismas condiciones . Este efecto se observa cuando concentraciones de solución de oligonucleótido están por debajo de aproximadamente 1 micro molar (µM) . Un método para medir producción de VEGF celular reducida se describe en el Ejemplo VI. Sin embargo, pueden emplearse otros métodos para detectar la reducción en producción de VEGF, si son tan sensibles como el método descrito en el Ejemplo V. El por ciento de VEGF producido por las células tratadas se determina al medir la cantidad de VEGF producido por células sin tratar y células tratadas. El porcentaje es igual a la cantidad producida por las células tratadas dividido por la cantidad producida por las células sin tratar multiplicado por 100. Las células no tratadas y tratadas se pretenden aproximadamente idénticas en todos los aspectos excepto con respecto a la presencia o ausencia de formulaciones de oligonucleótidos. De esta manera, las células empleadas en el ensayo son del mismo tipo, número de pasaje, fenotipo y están en la misma etapa de crecimiento. Las células se desarrollan bajo condiciones idénticas incluyendo medios idénticos (excepto por cambios debido a la presencia o ausencia de la propia formulación de oligonucleótido) temperatura y atmósfera. Bajo estas condiciones, células tratadas con los oligonucleótidos antisentido contemplados por esta invención producen a lo mejor, aproximadamente 90% del VEGF como se produce por células sin tratar idénticas, cuando se emplean oligonucleótidos antisentido a concentraciones de hasta 1 µM en soluciones o un porciento molar similar si se emplea en formulaciones sólidas . Oligonucleótidos preferidos incorporan ciertas modificaciones químicas que aumentan su resistencia a degradación no nucleolítica. Modificaciones químicas contempladas en estas modalidades son modificaciones de las químicas de origen natural común que se encuentran en oligonucleótidos . Ciertas porciones químicas contempladas en esta invención incluyen enlaces fosforotioato. Estos pueden colocarse entre algunos estados los residuos nucleósido. El oligonucleótido más preferido contiene 10 enlaces fosforotioato y 8 fosforodiéster . Además de enlaces nucleótido, las modificaciones químicas a las porciones base pueden incrementar resistencia a degradación de nucleasa . Más específicamente, se contemplan modificaciones a anillos piridina incluyendo grupos C5-propinilo o hexinilo y/o modificaciones 6-aza piridina. Un método para medir resistencia de nucleasa es al determinar la vida media de oligonucleótidos en suero de sangre . Esto se logra por métodos standard bien conocidos en la técnica. Para propósitos de la presente invención, una porción química disminuye la velocidad de degradación de oligonucleótidos antisentido por nucleasas, si el oligonucleótido tiene más larga vida media de suero con la porción que tendría sin la porción. Oligonucleótidos que contienen fosforotioato tienen vidas medias de más de 24 horas, mientras que sus contra partes que solo contienen enlaces fosfodiéster tienen vida media en suero de menos de 3 horas . Se contemplan oligonucleótidos que contienen modificaciones químicas en sus anillos pirimidinas. Oligonucleótidos preferídos contienen ya sea C5- propinil pirimidinas, C5 -hexinil pirimidinas y/o 6-aza pirimidina. Estas modificaciones incrementan su estabilidad biológica Tms y su actividad. Las síntesis de precursores nucleótido que contienen estas modificaciones se describen en el Ejemplo I. La síntesis de oligonucleótidos a partir de estos ciertos nucleótidos protegidos es por química fosforoamidita standard bien conocida en la especialidad. Ciertas modalidades de la presente invención se dirigen a composiciones para mejora de absorción celular que mejoran la actividad de oligonucleótido. En general, estas composiciones mejoran el transporte de un líquido a través de la bi-capa del líquido. En algunas modalidades, el olígomero se conjunga covalentemente a una molécula lipofilica. Esto mejora la asociación de membrana oligonucleótido y las propiedades de permeabilidad, tales como colesterol, ácidos grasos y otros extremos lipofílicos. Estas moléculas pueden enlazarse químicamente a oligonucleótidos por métodos standard bien conocidos en la técnica. En otras modalidades, los mejoradores de absorción tales como lípidos catiónicos o preparaciones liposomales pueden emplearse. Estos agentes son atractivos debido a su versatilidad. Estas modalidades tienen la ventaja de que el mismo vehículo de suministro puede emplearse para administrar una mezcla de oligonucleótido. Una modalidad específicamente contempla el uso de la preparación liposomal CellfectinMR. Otras modalidades incluyen una clase de mejoradores de absorción de poliamino lípidos, incluyendo espermidina-colesterol (SpdC) . Este último compuesto tiene la ventaja de funcionar particularmente bien, incluso en la presencia del suero. Composiciones y métodos para preparar oligonucleótidos antisentido con mejoradores de absorción celular se describen en los ejemplos IV, VI y VII. Ciertos oligonucleótidos contemplados en la presente invención están en forma de sal . Una forma sal es aquella en la que el oligonucleótido se asocia con átomos o moléculas cargados positivamente (catiónicos) . Adecuados cationes incluyen aunque no están limitados a sodio, potasio, amonio, espermidina o poliaminoalípidos tales como espermidina-colesterol y semejantes. Ciertas modalidades contempladas en la presente invención comprenden un liposoma. Adecuados liposomas son bien conocidos en la técnica. Ciertas composiciones de liposoma específicamente contempladas por la presente invención incluyen CellfectinMR. Otras composiciones incluyen espermidina-colesterol mezclados con DOPE. Preparaciones liposomales se elaboran por métodos bien conocidos en la especialidad. Ciertas modalidades de la presente invención contemplan suministros de sus composiciones oligonucleótidos a través de sistemas de suministros sostenido, incluyendo aunque no limitados a dispositivos de liberación polímerica, por ejemplo policaprolactona o mezclas de policaprolactona con metoxipolietilen glicol.

Métodos y composiciones para incorporar los presentes oligonucleótidos antisentido en sistemas de suministro sostenidos son bien conocidos en la técnica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Bases modificadas representativas de la invención que se emplean para reemplazar las bases naturales en la síntesis de oligonucleótidos antisentido. Figura 2. Esquema sintético para la preparación de 5- (1-hexinil o propinil) -6-aza-2 ' -deoxiuridina fosforamidita (ver también Figura 1) . Figura 3. Efectos de oligonucleótidos antisentido en producción de VEGF por queratinocito humano normal en cultivo. Figura 4. Efecto de oligonucleótido (ID DE SEC NO. 2) administrado con o sin CellfectinMR en la expresión VEGF por queratinocitos. Figura 5. Efecto de oligonucleótido (ID DE SEC NO. 27) administrado con o sin CellfectinMR en expresión de VEGF por queratinocitos . Figura 6. Efecto de mejoradores de absorción • celular diferentes en la actividad de T30639 (ID DE SEC NO. 2) con queratinocitos. Figura 7. Exposición celular a corto plazo a formulaciones de oligonucleótido de la invención e inhibición de largo plazo de expresión VEFG.

Figura 8. Exposición celular de corto plazo a formulaciones de oligonucleótido de la invención e inhibición de largo plazo de expresión VEFG. Figura 9. Exposición celular de largo plazo a formulaciones de oligonucleótido de la invención e inhibición de largo plazo de expresión VEFG. Figura 10. Efecto de oligonucleótidos antisentido VEGF quiméricos, modificados en extremo en expresión VEGF, en la presencia o ausencia de mejorador de absorción. DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES PREFERIDAS La modalidad preferida incluye un oligonucleótido antisentido que liga una secuencia común a múltiples moléculas de ARNm que codifican VEGF y evita la expresión de VEGF in vitro . Oligonucleótidos preferidos contienen enlaces fosforotioato en vez de varios enlaces fosfodiéster y otras modificaciones químicas que incrementan la afinidad del oligonucleótido por su secuencia ARNm objetivo. En las composiciones preferidas, se formulan oligonucleótidos como mejoradores de absorciones celular que mejoran su habilidad para cruzar la membrana celular. Oligonucleótidos de la presente invención pueden estar en la gama de longitud desde aproximadamente 17 residuos a 30 residuos de largo. Oligonucleótidos preferidos son de 19 nucleótidos de largo. Sus secuencias se eligen con base en su complementareidad a las moléculas ARNm que codifican los genes de VEGF. La región de la molécula ARNm que es complementaria al oligonucleótido se denomina la secuencia objetivo. Oligonucleótidos antisentido preferidos son complementarios a secuencias objetivo que se encuentran en cada una de cuatro moléculas ARNm, VEGF conocidas incluyendo VEGF 206, VEGF 185, VEGF 165 y VEGF 121. Se contemplan oligonucleótidos que contienen modificaciones químicas que mejoran su afinidad de unión a ARNm objetivo. Oligonucleótidos preferidos contienen ya C5 -propinil pirimidinas, C5 -hexinil pirimidinas y/o 6-aza-pirimidinas . Modificaciones preferidas incrementan la temperatura en la cual el oligonucleótido se disocia de su secuencia objetivo. La síntesis de precursor de nucleótido que contiene estas modificaciones se describe en el ejemplo I . La síntesis de oligonucleótido de nucleótidos protegidos es por química fosforamidita standard y es bien conocida en la especialidad. Oligonucleótidos preferidos incorporan ciertas modificaciones químicas que incrementan su resistencia a degradación nucleolítica. Aunque la invención no se limita por el mecanismo por esta resistencia, se considera que los nucleótidos químicamente modificados resisten digestión de nucleasa al interferir con unión de oligonucleótido en la cavidad de unión de substrato de nucleasa. Los oligonucleótidos resistentes a nucleasa preferidos contienen enlaces fosforotioato entre al menos algunos de los resiuos nucleótidos. El oligonucleótido más preferido contienen 10 enlaces fosforotioato y 8 fosfodiéster. En las composiciones preferidas, los oligonucleótidos de la presente invención se formulan o mezclan con mejoradores de absorción celular que incrementan su capacidad para penetrar membranas celulares . Los mejoradores de absorción celular contemplados para utilizar en . esta invención incluyen dioleil fosfotidiletanolamina, CellfectinMR, espermidina-colesterol y semejantes. Se prefiere en particular una mezcla 1:1 por masa de espermidina- colesterol y dioleíl fosfotidiletanolamina. Esta formulación se mezcla con concentraciones 10 nanomolar a 1 micro molar de oligonucleótido, de acuerdo con métodos standard bien conocidos en la especialidad. Composiciones oligonucleótido contempladas por la presente invención se eligen con base en actividad in vivo . Composiciones preferidas no son substancialmente citotóxicas para células con concentraciones de oligonucleótido hasta 1 micro molar. Ensayos de citotoxicidad standard como se describe en el Ejemplo I se emplean para efectuar esta determinación. Las presentes composiciones también deben demostrar una capacidad por reducir la producción de VEGF celular a concentraciones inferiores a 1 micro molar. La presente invención se ha descrito en términos de modalidades particulares que se encuentran o proponen que comprenden modos preferidos para la práctica de la invención. Se apreciará por aquellos con destreza en la especialidad que, a la luz de la presente descripción, pueden efectuarse numerosas modificaciones y cambios en las modalidades particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance pretendido de la invención. Todas estas modificaciones se pretenden incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . EJEMPLOS Ejemplo I: Método para la preparación de bases modificadas para incorporación en oligonucleótidos sintéticos: Las bases modificadas que incrementan la afinidad de unión y/o especificidad de los oligonucleótidos sintéticos se ilustran en la Figura 1. El esquema sintético para preparar 5- (1-hexinil o propinil) -6-aza-2 ' -deoxiuridina fosforamidita se ilustra en la Figura 2. Esta síntesis proporicona el bloque de construcción para preparar los olinucleótidos antisentido que contienen 6-aza-U. Esquemas similares se han empleado para sintetizar C-aza-C. La metodología sintética detallada para la preparación de 5- (1-hexinil) -6-aza-2 ' -deoxiuridina fosforamidita, se describe a continuación. En una forma similar, derivados 5-propinilo se preparan a partir del 5-yodo derivado 7. 3 ', 5 ' -Di-0-p-toluoil-5-yodo-6-aza-2 ' -deoxiuridina (7A) : Clorotrimetilsilano (0.5 ml) se agrega a una suspensión de 5-yodo-6-azauracil (5.8 g, 33.47 mmol) en 1, 1, 1, 3 , 3 , 3-hexametildisilazano (HMDS, 80 ml) y la mezcla se calienta a reflujo por 6 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y HMDS evapora al vacío. El residuo se seca con alto vacío por 4 horas . Los derivados sililo secos se disuelven en diclorometano (60 ml) . l-cloro-2-deoxi-3 , 5-di-O-p-toluoil-b-D-e?ri tro-pentofuranosa (6, 16.3 g 42 mmoles) y cloruro de zinc (.046 g, 3.35 mmol) se agregan a esta solución y la mezcla se agita bajo atmosfera de argón por 24 horas. La mezcla de reacción se diluye con diclorometano (250 ml) y la solución de diclorometano se lava con solución de NAHC03 acuosa saturada (100 ml) . La capa acuosa se extrae con diclorometano (4 x 100 ml) y la capa orgánica combinada se seca Na2S04) y evapora. El residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice (4 x 15 cm) y el producte se eluye en diclorometano que contiene 0-5% de metanol. El producto anomérico seco pesa 15 g. Anómero b puro se obtiene al triturar con una mezcla de diclorometano y metanol (4:1, 200 ml) . El sólido se recolecta por filtración y evaporación. 10.5 de anómero b puro se otiene después de repetir este proceso de trituración, p.f. 204-205°C. 1H RMN en (DMSO-de) : d 2.35, 2.37 (2s, 6 H, 2 CH3) , ' 2.80 (m, 2, H, C2,H y C2„H) , 4.43 (s, 3 H, C4,H, C5,H2), 5.55 (br s, 1 H, C3,H) , 6.39 (t, J = 6.0 Hz, 1 H, C±, ?.) , 7.28 (t, 4 H, Tol), 7.85 (t, 4 H, Tol), 12.42 (br s, 1 H, NH) . Anal . cale, para C24H24IN307: C, 48.58; H, 4.08; N, 7.08. Encontrado: C, 48.85; H, 3.80; N, 6.92. 3 ' , 5' -Di-Q-p-toluoil-5- (1-hexinil) -6-aza-2' -deoxiuridina (8A) : 3' , 5' -Di-toluoil-5-yodo-6-aza-2' -deoxiuridina (7, 3.84 g, 6.5 mmol) se seca por co-evaporación con DMF seco (25 ml) y disuelve en DMF (30 ml) al cual Cul (0.25 g, 1.3 mmoles), trietilamina 1.82 ml , 13 mmoles), 1-hexino (2.23 ml, 19.5 mmoles) y tetrakis (trifenilfosfina) paladio (0.75 g, 0.65 mmol) se agregan bajo atmosfera de argón. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente por 18 horas y 0.5 g adicional de tetrakis (trifenilfosfina) paladio se agrega. Después de 48 horas el solvente se evapora y el residuo se co-evapora con tolueno. El residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de silice y el producte se eluye en diclorometano que contiene 0-5% de etil acetato para dar 0.9 g del compuesto titular p.f. 198-200°C.

^-H RMN en (DMSO-d6) : d 0.87, (t, 3 H, CH3) , 1.45 (m, 4, H, 2, CH2) , 2.37, 2.39 (2s, 6 H, 2 CH3) , 2.45 (m, 3 H, CH2 y C2„H) , 2.84 (m 1H, C2,H) , 4.45 (s, 3 H, C4,H, C5,H2) , 5.59 (br s, 1 H, C3,H) , 6.49 (t, J = 6.3 Hz , 1 H, C?,H) , 7.31 (dd, 4 H, Tol) , 7.88 (dd, 4 H, Tol) , 12.40 (br s, 1 H, NH) .

Análisis calculado para C30H33N3O7: C, 65.80; H, 6.07; N, 7.68. Encontrado: C, 65.61; H, 5.73; N, 7.29. 6-Aza-5- (1-hexinil) -2 ' -deoxiuridina (9a) : Una mezcla de 3 ' , 5 ' -Di-O-p-toluoil-5- (1-hexinil) -2 ' -deoxiuridina (8a, 0.8 g, 1.47 mmoles), metanol (55 ml) y metóxido de sodio (25% en solución en metanol, 1.28) se ajusta a temperatura ambiente por 2 horas. La reacción se neutraliza por adición de resina Dowex 50X8 (H+) . La resina se retira por filtración y el filtrado se evapora. El residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice utilizando diclorometano que contiene 0-4 % en metanol como eluyente pada dar 0.38 g (84%) del compuesto titular, como un sólido muy higroscópico. -"-H RMN en (DMSO-ds) : d 0.88, (t, 3 H, CH3) , 1.47 (m, 4, H, 2, CH2) , 2.02, (m ÍH, C2„H) 2.33 (m ÍH, C2,H) 2.46 (m, 2 H, CH2), 3.40 (m, 2 H, C5,, H2) , 3.68 (m, 1 H, C4,H, ) , 4.21 (br s, 1 H, C3,H) , 4.61 (t, 1 H, C5,0H) , 5.17 (d, 1 H, C3,0H) , 6.49 (dd, 1 H, C?,H) , 12.27 (br s, 1 H, NH) . 5' -0- (4-4' -Dimetoxitritil) -6-aza-5- (1-hexinil) -2 ' -deoxiuridina (10a) : 4,4' -dimetoxitritil cloruro (0.51 g, 1.5 mmoles) se agrega a una solución de 5- (1-hexinil) -6-aza-2' -deoxiuridina (0.38 g 1.24 mmoles) en piridina seca (10 ml) . Después de agitar por 6 horas, a 0.5 g adicional de DMT-C1 se agrega y la mezcla de reacción se agita durante la noche. La mezcla de reacción se diluye con diclorometano (100 ml) y la solución orgánica se lava con agua (20 ml) . La capa acuosa se extrae con diclorometano y la capa orgánica combinada se seca (Na2S04) y evapora. El residuo se co-evapora con tolueno (10 ml) y purifica por cromatografía sobre una columna de gel de sílice (2 x 10 cm) . El producte se eluye con diclorometano que contiene 0-1.5% de metanol. Rendimiento 0.45 g. E RMN en (DMSO-d6) : d 0.85, (t, 3 H, CH3) , 1.37 (m, 4, H, 2, CH2) , 2.08, (m, 3 H, CH2„H) , 2.37 (m 3H, CH2 y C2,H) 3.06 (m, 2 H, C5,H2) , 3.72 (s, 6 H, 2 OMe), 3.87 (m, 1 H, C4,H) , 4.20 (m, 1 H, C3,H) 5.23 (d, 1 H, C3,OH) , 6.35 (dd, 1 H, C-^H) , 6.83 (m, 4 H, DMT), 7.16-7.25 (m, 9 H, DMT), 12.30 (br s, 1 H, NH) . 5' -0- (4-4' -Dimetoxitritil) -6-aza-5- (1-hexinil) -2 ' -deoxiuridina-3 ' -0- (2-cianoetil) - N,N-diisopropilfosforamidita (lia) : 9 5'-0-(4-4' -Dimetoxitritil) -6-aza-5- (1-hexinil) -2 ' -deoxiuridina (10a) ante reacción con 2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita en diclorometano en la presencia de N,N-diisopropiletilamina proporciona la fosforamidita lia por métodos bien conocidos . Ejemplo II Diseño v Síntesis de oliaonucleótido: Se eligieron secuencias del oligonucleótido antisentido que pueden ligar secuencias objetivo de ARNm complementarias compartidas por todas las variantes escindidas de ARNms VEGF. La secuencia de oligonucleótidos sintéticos ejemplares se ilustra en la Tabla 1. Para mejorar su afinidad de unión para objetivos ARNm, los oligonucleótidos se sintetizaron con pirimidinas que tienen grupos C5-propinilo o C5-hexinilo, como se ilustra en la figura 1 ( agner y colaboradores) . Otras bases modificadas incluyendo 6-aza-dU y 6-aza-dC, también se contemplaron.

(Fi«gura 2) . Combinaciones de estas modificaciones también se contemplaron. Oligonucleótido T30691 (ID DE SECUENCIA NO. 27) que era complementario al oligonucleótido antisentido (ID DE SECUENCIA NO. 2) se emplea como un control en los siguientes experimentos. Fue el mismo tamaño y contiene la misma estructura principal y modificaciones base que T30639 (ID DE SECUENCIA NO. 2) . Ejemplo III: Análisis Tm de interacción heterodúplex ARN-oligonucleótido antisentido: La temperatura (Tm) de duplexes ARN oligonucleótido anti sentido se emplea para estimar afinidad de unión. El T se mide en un espectrofotómetro de conjunto de diodos equipado con un soporte de células controlado por temperatura (Hewlett Packard Modelo 8452) . El oligonucleótido antisentido se mezcla con ARN sintético objetivo del mismo tamaño (cada uno a 1 µM) en un amortiguador que contiene 2 mM de fosfato de sodio, pH 7.0, 18 mM NaCl y mM EDTA. La solución, preparada en una celda de espectrofotómetro se calienta a 90°C por 10 minutos, enfria a 20 °C durante 10 minutos y equilibra por 10 minutos para permitir formación de dúplex. Para medir la temperatura de fusión (Tm) del dúplex, la celda se calienta lentamente de 20°C a 80°C a una velocidad de l°C/min y la absorbancia a 260 nm se mide como una función de la temperatura. Un aumento en absorbancia señala la fusión o separación del dúplex en olígomeros de hebra sencilla. La Tm de formación dúplex se obtiene a partir de los datos de curva de fusión utilizando ecuaciones descritas por métodos standard. (Puglisi y Tinoco, 1989) . Los datos Tm se ilustranen la Tabla 2. Incorporación de bases modificadas con C5-propino o bases modificadas con C5-hexinilo en oligonucleótidos de fosforotioato, conduce a incrementos marcados en valores Tm sobre oligonucleótidos no modificados. Esto fue indicativo de una mejora significante en la afinidad del oligonucleótido antisentido por su secuencia objetivo. Tabla 2 T30807 (ADN/Antisentido) T30615 T30639 (no modificada) (Propinilo) Tm(°C) 43 53 AG a 37°C (Kcal/mol) -11.5 -13.4 Ah (Kcalmol) -13.6 -91.6 AS (eu) -402 -252 T30808 (ARN* antisentido) T30615 T30639 Tm(°C) 43 57 AG a 37°C (Kcal/mol) -11.0 -14.3 AH (Kcallmol) -128 -88.3 AS (eu) -378 -239 Tabla 2 (cont) T30807 (ADN/Antisentido) T30688 T306?2 (hexinil) (Propinilo no corresp. ) Tm(°C) 49 345 AG a 37°C (Kcal/mol) -11.9 -8.1 Ah (Kcalmol) -79.8 -103 AS (eu) -219 -306 T30808 (ARN antisentido) T30688 T30692 tm(°c) 53.5 43.5 AG a 37°C (Kcal/mol) -13.5 -11.3 AH (Kcalmol) -90.7 -119 AS (eu) -249 -347 Ejemplo IV: Preparación de mejoradores de a so: La absorción no asistida de oligonucleótidos antisentido por células fue baja (Fisher y colaboradores, 1993; Guy-Caffey y colaboradores, 1995) . Para mejorar la penetración en células, una cantidad de mejoradores de absorción comercialmente disponibles asi como formulaciones de polia inolípidos novedosos sintetizados por los inventores se emplea (Gao y colaboradores, 1989; Guy-Caffey y colaboradores 1995) . Ejemplo V: ensayos de citotoxicidad: Se sembraron células a una densidad de 500 células/pozo en una placa de 96 pozos. Un día después de revestimiento, las células se expusieron a formulaciones de oligonucleótidos diluidas en serie (4 pozos por dilución) . Después de 1 o 4 días de exposición, se del efecto en viabilidad celular etermina con un sistema de ensayo no radioactivo (ensayo de proliferación celular acuosa Cell Titer 96, Promega Corp.) . No se observa toxicidad por los presentes oligonucleótidos estuvieron a concentraciones inferiores a 1 µM. Ejemplo VI Prueba Celular de oligonucleótidos : La actividad de oligonucleótidos antisentido, sus contrapartes modificadas y diversas formulaciones se evaluaron utilizando queratinocitos humanos cultivados, una linea celular que secreta VEGF bajo condiciones de cultivo normal (Ballaun y colaboradores, 1995; Frank y colaboradores, 1995) . Se revistieron células en placas de 48 pozos a una densidad de 50-100,000 células/pozo/0.5 ml de medio KGM (Clonetics) . Un sistema de ensayo de proteína basado en ELISA (R&D Systems) se emplea para medir los niveles de proteína VEGF en el sobrenadante celular. Mediciones preliminares muestran que cuando células NHEK se desarrollan en el medio recomendado, 50,000 células revstidas en 0.5 ml de medio producen aproximadamente 150-200 pg de VEGF en 15 horas (es decir -300-400 pg/ml en el sobrenadante de pozos de control no tratados) . También se se incubaron células por 15 horas con la formulación de oligonucleótido. Tres de cuatro oligonucleótidos anti-VEGF demuestran actividad en la gama a 0.2 µM, en la presencia de 10 µg/ml de CellfectinMR. El oligonucleótido sentido de control no tiene efecto (no mostrado) . El resultado se ilustra en la Figura 3.

Para la evaluación del efecto antisentido, se administraron oligonucleótidos a células en la presencia o ausencia de mejoradores de absorción. En experimentos preliminares, fosforotioato oligonucleótidos sin modificación base fueron efectivos a concentraciones inferiores a 1 µM y no hubo efecto significante observado en la ausencia de portadores (datos no mostrados) . A concentraciones sobre 1 µM, los oligonucleótidos tienden a inhibir la expresión VEGF no específicamente (datos no mostrados) . Estos efectos no específicos se conocían en la técnica (Stein y colaboradores, 1993; Wagner, 1994) . Para evitar estos efectos no específicos, se mezclaron oligonucleótidos con mejoradores de absorción. CellfectinMR, una preparación liposomal de tetrapalmi t ilespermina (TM-TPS) con dioleíl fosfotidietanolamina (DOPE) (TM-TPS/D0PE en una proporción en masa 1:1.5 de Life Technologies, Inc.), fue más eficaz y menos tóxica que otros agentes de suministro comercialmente disponibles probados . Oligonucleótidos formulados con preparaciones liposomales del poliaminolípido SpdC (Guy-Caffey y colaboradores, 1995; SpdC/DOPE, 1:1 por masa) , incluso fueron más efectivas. En experimentos de cultivo celular típicos, se disolvieron oligonucleótidos (10 nM a 1 µM) en agua -20-40 µl de una solución acuosa de mejorador de absorción a temperatura ambiente e incubaron por aproximadamente 10 minutos. Esta solución se mezcló con 0.5 ml de medio de crecimiento caliente y agregó a células. Las células se incubaron por 15 horas en la presencia del oligonucleótido. Después de incubación, el sobrenadante se recolecta y ya se emplea inmediatamente para ELISA o guarda a -80°C para análisis futuro (no se observó diferencia significante en niveles de VEGF entre muestras de sobrenadante nunca congeladas, o congeladas y descongeladas) . Como se ilustra en la Figura 4, el oligonucleótido antisentido T30639 (ID de secuencia No. 2) fue más activo en la presencia de CellfectinMR, mientras que los oligonucleótido de "sentido" de control T30691 (ID DE SECUENCIA NO. 27) tuvo poco efecto excepto a la concentración más alta empleada como se ilustra en la Figura 5. La Figura 6 muestra el efecto de administrar 0.1 µM o 0.2 µM oligonucleótido (ID DE SECUENCIA NO. 2) con diversas formulaciones de lípido catiónico SpdC, espermidina-colesterol (Guy-Caffey y colaboradores, 1995) ; DC-Chol (Gao y Huang, 1991) ; CS, colato-esper idina; DCS, deoxicolato-espermidina; cf, CellfectinMR (Life Technologies, Inc.). Preparaciones liposomales de cada lípido catiónico se prepararon al mezclar con el lípido fusogénico DOPE (proporción en masa 1:1) y se almacenaron después de la utilización hasta usar. Los liposomas se resuspendieron en dextrosa al 5% (a 1 mg/ml) antes de uso y almacenan a 4°C para utilizar en dos semanas. Se mezclaron oligonucleótidos con las preparaciones liposomales catiónicas justo antes del tratamiento celular como se describió anteriormente. Las Figuras 7 a 9 muestran los resultados de incubación de celulares con concentraciones variantes de los oligonucleótidos antisentido T30639 (ID DE SECUENCIA NO. 2), o su versión fosfodiéster fosforotioato T30848 (ID DE SECUENCIA NO. 6) . (Ver Tabla 1) . La Figura 7 muestra el efecto 0.1 µM de oligonucleótido, la Figura 8 muestra el efecto de 0.2 µM de oligonucleótido y la Figura 9 fue para 0.4 µM de oligonucleótido. En cada experimento se trataronm células por 4 horas en medio suplementado con el oligonucleótido antisentido pre-mezclado con SpdC/DOPE. Luego se reemplaza el medio con medio sin suplementar fresco. La gráfica 1 muestra la inhibición porcentual en producción de VEGF, 16 horas después que la composición oligonucleótido se lava del cultivo, la gráfica es 40 horas después de lavado del oligonucleótido y la gráfica 3 es 64 horas después del lavado del oligonucleótido. La cantidad de nivel VEGF en el medio cosechado luego se determina. La morfología de células al final del período de incubación de aproximadamente 3 dias fue normal . Los efectos a largo plazo del oligonucleótido en producción de VEGF se establecen en las Figuras 7 a 9. En las gráficas, el símbolo (?) es para 0.1 µM T30848 (ID DE SECUENCIA No. 6) . El símbolo () es para 0.1 µM T30639 (ID DE SECUENCIA No. 2) . La Figura 10 muestra los resultados en experimentos similares con oligonucleótidos derivatizados con grupos lipofílicos. S96-5296 (ID DE SECUENCIA NO. 20) se modifica en el extremo 3' por un grupo lípido C16 y contiene enlaces 8 fosfodiéster y 11 fosforotioato. S96-5297 (ID DE SECUENCIA NO. 21) tiene la misma estructura principal y se modifica en extremo con una porción 3 ' -pireno. Estas porciones hidrofóbicas ayudan en la absorción y actividad de los oligonucleótidos cuando se mezclan con CellfectinMR y los enlaces fosfodiéster incrementan la actividad de los oligonucleótidos. El símbolo ( ) es para S96-5296 (ID DE SECUENCIA NO. 20) , el Símbolo ( ) es para S96-5296 (ID DE SECUENCIA NO. 20) con 10 ug/ml de CellfectinMR, el símbolo (o) es para S96-5297 (ID DE SECUENCIA NO. 21) con 10 ug/ml de CellfectinMR, el símbolo ( ) es para símbolo (o) es para S96-5297 (ID DE SECUENCIA NO. 21) con 10 ug/ml de CellfectinMR, el símbolo (??) es para 0.2 µM T30639 (ID DE SECUENCIA NO. 12) con 10 ug/ml de CellfectinMR. Ejemplo VII Actividad anti-VEGF de oligonucleótidos antisentidos: Fosforotioato que contiene oligonucleótidos antisentido sin modificaciones base, parece no tener efecto significante en la producción celular de VEGF, excepto por alguna inhibición no específica independiente de secuencia a concentraciones que exceden 1 µM (datos no mostrados) . Los resultados fueron consistentes con otros estudios que muestran que bajas dosis sub-micromolares de fosforotioato oligonucleótidos simples, fueron inhibidores ineficaces y a altos niveles, los mismos oligonucleótidos pueden ejercer efectos no específicos en metabolismo celular (revisado por Stein y Cheng, 1993; agner, 1994) . Sin embargo, oligonucleótidos que contienen fosforotioato contienen pirimidinas que comprenden C5-propina (Wagner, 1993) inhiben específicamente la producción celular de VEGF. Ver Figura 3. Estos oligonucleótidos modificados tienen temperaturas de fusión que fueron aproximadamente 15 °C superiores que sus contrapartes no modificadas. Ver tabla 2. Esto sugiere que los oligonucleótidos modificados ligan sus objetivos con mayor afinidad que las formas no modificadas . Oligonucleótido óptimo a proporción de CellfectinMR: La absorción celular de la mezcla de líquido catiónico-oligonucleótido, se determina parcialmente por naturaleza química de cada componente en la formulación, parcialmente por su concentración y proporciones de masa relativas y parcialmente por las propiedades endocíticas de la célula objetivo. Con T30639 (ID DE SECUENCIA NO. 2) coadministrado con CellfectinMR a células NHEK, la proporción de oligonucleótido a TMTPS 1:3 (en masa), resulta en actividad óptima. En un experimento relacionado, la concentración del oligonucleótido se altera mientras que se mantiene la proporción del lípido catiónico y oligonucleótido y el efecto de la expresión VEGF se mide respecto al control "sentido" T30691 (ID DE SECUENCIA NO. 27) . Oligonucleótido T30639 (ID DE SECUENCIA NO . 2 ) mostró actividad anti-VEGF especifica, mientras que el oligonucleótido de control no tuvo efecto (ver Figuras 4 y 5) . Efecto de formulaciones de esper idina-colesterol+DOPE o DC-chol-+DOPE (preparaciones liposo ales; 1:1 en peso) en eficacia de oligonucleótidos: Una cantidad de mejoradores de absorción se emplea con terapéutica de ácido nucleico (Behr, 1994; Guy-Caffey y colaboradores, 1995, Lewis y colaboradores, 1996) . Uno de estos compuestos fue conjugado esperimidina-colesterol (SpdC) (Guy-Caffey y colaboradores, 1995) . Este compuesto no fue tóxico para células a concentraciones bastante mayores que las requeridas por esta invención y no fue tóxico para roedores cuando se tratan por hasta una semana. Otro lípido catiónico, DC-Chol (Gao y Huang, 1991) , se aprueba para uso terapéutico en terapia de genes y fue relativamente no tóxico al sistema celular. Preparaciones liposomales de prueba de SpdC/DOPE y DC-Chol/DOPE (spdC o DC-Chol con dioleoil fosfotidilcolina) a proporciones en masa en la gama de 1:05, 1:1, 1:1.5, y una proporción 1:2 a 1:1 parece más efectiva en ensayos anti-VEGF con células NHEK. Ver Figura 5. Composiciones con reactivos catiónicos parecen ser 20-40 más activas que aquellas con CellfectinMR (Figura 6) . Corta duración de exposición a formulación de oligonucleótido es suficiente para observar efecto inhibitorio en largo plazo en producción VEGF: Expresión VEGF se reduce después de exposiciones relativamente breves a las composiciones descritas en esta invención. Por ejemplo, incubaciones" de 4 horas demuestran más actividad anti-VEGF que lo que se observa con exposición de oligonucleótido durante la noche. Ver Figuras 7 a 9. De manera sorprendente, el efecto duró al menos 3 días, toda la duración del experimento, Figuras 7 a 9. Otros experimentos mostraron que oligonucleótidos anti sentido con estructuras principales y médicas fosforotioato-fosfodiéster fueron inhibidores potentes de expresión VEGF. En particular, las variantes quiméricas de T30639 (ID DE SECUENCIA NO. 2) que contienen 10 enlaces fosforotioato y 8 fosfodiéster y modificaciones de extremo lípido S96-5296 (ID de secuencia No. 20) y S96-5297 (ID de secuencia No. 21) demostraron excelente actividad en la presencia de SpdC/DOPE. (Figura 7) . Inhibición de VEGF duró más de tres días después de solo una incubación de cuatro horas (Figura 7) . En la ausencia de SpdC, las estructuras principales de oligonucleótido quimérico no afectan la expresión VEGF. De esta manera, oligonucleótidos con menores enlaces fosforotioato pueden tener eficacia mejorada y reducidos efectos no específicos. Absorción parece crucial a la eficacia del oligonucleótido. Ejemplo VIII Inhibición VEGF Jn Vivo A. Objetivos específicos Expresión incrementada de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor) se ha implicado en el avance de neovascularización ocular asociado con retinopatía diabética proliferativa, glaucomas neovasculares y muchas otras condiciones cegadoras. Isquemia retinal conduce , a síntesis incrementada de la proteína angiogénica VEGF, que dispara la proliferación de células endoteliales vasculares, resulta en la formación de un número anormalmente grande de vasos sanguíneos en la retina, nervio óptico e iris. Hasta el momento, no hay tratamientos terapéutico aceptado para esta condición. Nuestro objetivo total es aplicar un diseño racional y procedimientos de prueba para identificar inhibidores de oligonucleótidos antisentido potencialmente terapéuticos, novedosos, de expresión de VEGF, con el objetivo de tratar isquemia retinal asociada a neovascularización en humanos . Nuestros recientes datos in vi tro en sistemas de cultivo celular en humanos indican que podemos preparar formulaciones oligonucleótido específicas que inhiben la expresión celular de VEGF en más de 50% en la gama de concentración subraicromolar . Nuestra meta este propósito es extender nuestros hallazgos in vi tro en un modelo de rata de neovascularización asociada con VEGF. Nuestros objetivos específicos son: 1.- Sintetizar una "biblioteca" de oligonucleótidos antisentido dirigidos contra ARNm VEGF de ratas . Hay tres variantes de escición principales y 1 menor de VEGF. Diez oligonucleótidos serán objetivos para secuencias en la versión común de ARNs. También contendrán estructuras principales resistentes a nucleasa y bases modificadas para mejorar la afinidad de unión con ARNms . 2.- Establecer monocapa de células de rata y modelos esferoides para evaluar la actividad y toxicicidad de los oligonucleótidos anti sentido y sus formulaciones. La linea celular C6-glioma se empleará para esto debido a que se ha usado ampliamente para estudiar la función VEGF. El esferoide (masa de células) será útil para estimar si nuestros oligonucleótidos son capaces de penetrar capas celulares . 3. - Evaluar la eficacia de oligonucleótidos utilizando diversos mejoradores de absorción celular. Compuestos desarrollados en Aronex, se compararán con agentes comercialmente disponibles. 4.- Desarrollar un ensayo a prueba-de-concepto para obtener datos para soportar el mecanismo antisentido. De esta manera, un experimento in vi tro se diseña para probar si podemos hacer específicamente objetivo justo un isótopo de VEGF, para responder la pregunta si nuestros olinucleótidos están verdaderamente trabajando por el modo pronosticado. Esto ayudará en el diseño futuro de oligonucleótidos antisentido. 5. - Uso de un modelo de rata in vivo de neovascularización de iris para probar los compuestos antisentido más promisorios. Estos estudios se efectuarán en colaboración con el Doctor Anthony Ada is en Harvard. Al terminar los estudios propuestos, esperamos tener información cuantitativa respecto a la eficacia in vivo de 1-2 oligonucleótidos. Algo de información respecto a dosificación, mecanismo de acción potencial, disponibilidad celular y toxicidad potencial también se conocerán. Si cualquiera de los oligonucleótidos reduce vascularización y/o expresión de VEGF en 20% in vivo, consideraríamos que sería un desarrollo positivo y procederíamos a estudios más detallados en modelos animales durante la fase 11 de la investigación. Se elige oligonucleótido, el riesgo de unión no específica a otros ARNs sería inaceptablemente alto y elegir una secuencia con alto contenido G puede conducir a formación de cuarteto G indeseable, lo que reduce la disponibilidad de forma de bobina libre disponible por unión (Bishop y colaboradores, 1996) . Un enfoque alterno, que proponemos tomar, es utilizar oligonucleótidos modificados selectivamente que contienen C-propinil pirimidinas, una modificación que conduce a unión muy eficiente sin toxicidad significante (Wagner y colaboradores, 1993; Fenster y colaboradores, 1994). Recientemente hemos mostrado que la modificación de propinilo parece trabajar especialmente bien (ver resultados preliminares) . Enfoques para mejorar la resistencia a nucleasa de oligonucleótido: Oligonucleótidos con una estructura principal fosfodiéster natural, son altamente susceptibles a suero y nucleasas celulares . Hemos determinado que un oligonucleótido base 17 de secuencia aleatoria tiene una vida media inferior a 3 minutos en suero (Bishop y colaboradores, 1996) . Una alternativa es utilizar oligómeros con estructura principal fosforotioato (Stein y colaboradores, 1991), una modificación que mejora marcadamente la vida media de suero de oligonucleótidos en un día o más . El uso de enlaces fosforotioato se considera que dirige algunos efectos no específicos a altos niveles, pero como se discutió anteriormente, proponemos sintetizar oligonucleótidos especialmente modificados que trabajan a muy bajas concentraciones, reduciendo de esta manera el riesgo de interacción no específica. Oligonucleótidos con estructuras principales alternas se han probado pero todos han tenido efectos bastante más no específicos que oligonucleótidos fosforotioato. Enfoques para mejorar la absorción celular de oligonucleótidos : Estudios de distribución subseclular muestran que las células tratadas con oligonucleótidos fluorescentes, se acumulan en compartimientos endosomales perinucleares (Guy-caffey y colaboradores, 1995) . La etapa limitadora de velocidad en el proceso de internalización parece ser transporte de oligonucleótidos a través de la membrana de plasma o las membranas de los compartimientos endosomales. Hay dos formas potenciales para mejorar el transporte de oligonucleótidos a través de la bicapa lípido de membrana. En el primer enfoque, el oligómero se conjuga covalentemente con un compuesto que mejora sus propiedades de permeabilidad y asociación de mebrana, por ejemplo, al conjugar a colesterol (Letsinger y colaboradores, 1989) .

Hemos identificado recientemente una modificación de propiedades novedosa, un extremo ferroxeno (tether) lipofílico (ver diseño experimental) que parece mejorar marcadamente la eficacia de oligonucleótidos antisentido. En forma alterna, mejoradores de absorción tales como lípidos catiónicos o preparaciones de fosforo normales, pueden emplearse. Estos agentes son atractivos debido a su versatilidad-el mismo vehiculo de suministro puede coadministrarse con una variedad de oligonucleótidos . El diseño de estos lípidos catiónicos incorpora un grupo de cabeza cargado posteriormente que se liga al ácido nucleico y una cola interactiva de membrana que se propone interactua con lípidos fusogénicos y/o desestabiliza las membranas celulares. La actividad de muchas preparaciones de lípidos catiónicos (tales como lipofectin) se incluencian por factores tales como composición y cantidad de ácido nucleico, tipo de célula y la concentración de suero en el medio de crecimiento celular. Además, algunas preparaciones son citotóxicas. Estas restricciones limitan severamente la utilidad de muchos de estos compuestos como agentes de suministro para oligonucleótidos terapéuticos en sistemas animales, y continua habiendo una tremenda demanda por mejoradores de absorción efectivos. Hemos sintetizado un vehículo de suministro novedoso, espermidina-colesterol (SpdC) que mejora la absorción celular y permeabilidad de membrana de oligonucleótidos, incluso en la presencia de suero (Gay-Caffey y colaboradores, 1995) . Formulaciones que utilizan este compuesto se evaluarán como parte de los estudios propuestos . Nuestro objetivo es identificar formulaciones antisentido que inhiben expresión VEGF por células en el ojo, con reducción concomitante en angiogénesis asociada a enfermedad. Estos estudios fueron señalados por nuestro reciente descubrimiento de que los oligonucleótidos antisentido modificado químicamente pueden tener actividad inhibidora potente a dosis sub-micromolares . Además el desarrollo de un modelo animal de neovascularizacoón asociada con VEGF por el Doctor Adamis, nos permitirá probar los compuestos más eficaces in vivo . Resultados Preliminares: Compendio: El objetivo de nuestra serie en curso preliminar de experimentos ha sido descubrir y/o probar principios y enfoques generales para mejorar la actividad de oligonucleótidos antisentido en modelos basados en célula de expresión de VEGF. Primordialmente, nuestro objetivo ha sido: ° Desarrollar ensayos de clasificación basados en celdas cuantitativos, para inhibir el efecto de oligonucleótidos antisentido en niveles de proteínas VEGF.

° Sintetizar oligonucleótidos que contienen modificaciones estructurales que conducen a mejorar la afinidad de unión para ARNm objetivo, mayor resistencia a nucleasa y mayor especificidad. ° Formulaciones de prueba utilizando mejoradores de absorción novedosos (algunos desarrollados en Aronex) para incrementar la internalización celular y penetración de membrana del oligonucleótido administrado. Diseños de oligonucleótidos : Debido a que esperamos que uno de nuestros compuestos se pruebe eventualmente en humanos, ese trabajo se inición utilizando oligonucleótidos antisentido dirigidos contra ARNms VEGF humanos. Para lograr máxima inhibición de expresión, elegimos oligonucleótidos antisentido que son complementarios a secuencias compartidas por todos los ARNms VEGF (Tabla 3) . Oligonucleótidos antisentido: (Codón AUG iniciador en secuencia ARNm 57) T30638: ARNm sec . 87-105 5 x -a*g*a*g*C*a*g*C*a*a*g*C*g*a*g*g*C*t-3 T30639: ARNm sec. 185-023 5 v -g*C*g*C*U*g*a*U*a*g*a*C*a*U*C*C*a*U*g-3 T30640: ARNm sec . 204-222 5 -C*g*a*U*U*g*g*a*U*g*g*C*a*g*U*a*g*C*t-3 T30641: ARNm sec . 232-250 5 ? -U*a*C*U*C*C*U*g*g*a*a*g*a*U*g*U*C*C*a-3 Estructura de fosforotioato total (*) para conferir resistencia a nucleasa. C-5 propinil pirimidinas para mejorar afinidad de unión a objetivo ARN. Tabla 3 Oligonucleótidos antisentido dirigidos contra VEGF de humano. En coincidencia con reportes iniciales (Wagner y colaboradores, 1993) encontramos que las substituciones base de C-5 propinil pirimidina, incrementan Tm de formación dúplex, un indicador de la afinidad de las hebras entre si, desde -60 °C para un oligonucleótido no modificado a más de 80 °C. Para utilizar como controles, sintetizamos un oligonucleótido "sentido" del mismo tamaño y modificaciones T30691. Prueba celular de oligonucleótido: La actividad de oligonucleótidos antisentido, sus contrapartes modificadas y diversas formulaciones, se evaluó utilizando queratinocitos humanos cultivados, una linea celular primaria que secreta de VEGF. Se repitieron células a una densidad de 50,000 células/pozo de una placa de 46 pozos en 0.5 ml de medio KGM (Clonetics) . El nivel de VEGF secretado en el medio de crecimiento se mide por un ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA) (R&D Systems) . El ensayo es lineal sobre la gama 5 a 1000 pg/ml. Nuestras mediciones muestran que cuando se desarrollan las células NHEK en el medio recomendado, 100,000 células revestidas en 0.5 ml en el medio, producen aproximadamente 150 pg de VEGF 15 horas (aproximadamente 300 pg/ml en el control sin tratar de sobrenadante) . La mayoría de los ensayos basados en células se efectuaron utilizando una formulación del liposoma catiónico comercialmente disponible, distribuido en el mercado como agente de transfección para suministro de genes de células (Cellfectin, de Life Technologies) . Otras preparaciones comerciales de agentes de transfección se encuentran ya sea tóxicas o relativamente ineficaces (7 probadas) . Un efecto curioso de Cellefectin es que cuando solo se administran células, como un control, actualmente mejora la producción de VEGF. La razón para esto no se conoce. Más recientemente, hemos empezado a emplear formulaciones de espermicida-colesterol (Guy-Caffey y colaboradores, 1995) . En los primerísimos experimentos, utilizando oligonucleótidos antisentido, fosforotioato sin modificaciones 5-propinilo, no observamos efecto en niveles de VEGF (hasta 5 µM de concentración extracelular, en la presencia o ausencia de mejoradores de absorción) . A superiores niveles, hubo una pequeña cantidad de lo que parece ser inhibición no específica (datos no mostrados) . Cuando pirimidinas que contienen 5-propino (Wagner y colaboradores, 1993) se sustituyen por citosinas y timidinas, hubo una mejora de 20° en el Tm medido in vivo, indicando que el oligonucleótido puede ligarse a su obejtivo ARN sintético con mucho mayor afinidad que la variante no modificada (datos no mostrados) . Probamos el efecto de estos oligonucleótidos en la presencia o ausencia de mejoradores de absorción, y también se varió la relación de mejorador de absorción a oligonucleótido, en un esfuerzo por identificar una formulación óptima, Observamos que diferentes oligonucleótidos tienen diferentes efectos en los niveles de VEGF.

Figura 3. Tres de cuatro oligonucleótidos tuvieron actividad en la gama de 0.2 µM, en la presencia de 10 µg/ml de CellfectinMR. El oligonucleótido sentido de control no tuvo efecto (no. mostrado) . El más potente de los oligonucleótidos de prueba, T30639, desde entonces se ha empleado para subsecuentes estudios de optimización. Una relación óptima de oligonucleótido a mejorador de absorción: En un experimento de seguimiento, mantuvimos la relación de oligonucleótido (T30639 antisentido y T30691 sentido de control) al componente lípido catiónico de cF a relación en masa 1:3 y se midió el efecto en producción de VEGF. De nuevo, T30639+cF mostró específica actividad anti-VEGF mientras que el oligonucleótido de control no tuvo efecto, Figura 11.

Figura 11. Efecto de formulación de oligonucleótido Cellfectin (1 : 3) en expresión de VEGF. A elevadas concentraciones, parece haber efectos no específicos (no mostrados) . Es importante notar que no hemos hecho intento alguno por separar el mejorador de absorción libre del material ligado. Esto probablememte sucede de facto cuando cambiamos las relaciones relativas de uno al otro. Efecto del tamaño de oligonucleótido: En el siguiente experimento, preguntamos si sería factible el reducir el tamaño de oligonucleótido mientras que se mantiene la actividad anti-VEGF específica. Más cortos olígomeros también son más baratos de sintetizar. Sin embargo, utilizando el mismo ensayo NHEK, encontramos que el oligonucleótido de base 19, era más eficaz que los derivados base 16 o 14, todos los oligonucleótidos administrados con 10 µg/ml de Cellfectin. Cambiar la proporción de Cellfectin a oligonucleótido no altera la actividad relativa (no mostrado) . Efectos de formulaciones de espermidina-colesterol+DOPE o DC-Chol+DOPE (preparaciones liposomales; 1:1 en peso) en eficacia de oligonucleótidos: Recientemente hemos empezado a explorar alternativas a Cellfectin, que puede ser algo tóxico a células después de exposición de largo plazo. Un mejorador de absorción, conjugado de espermicida-colesterol, (SpdC) (Guy-Caffey y colaboradores, 1995), han encontrado que no es tóxico para células a los niveles empleados, y que no hay toxicidad detectable en rodeores tratados po toda la semana. Se ha probado de ese lípido catiónico-Chol (Gao y colaboradores, 1991) , para pruebas clínicas de terapia de genes, y tiene muy bajo nivel toxicidad en sistemas celulares. Los datos preliminares indican que formulaciones de estos lípidos novedosos fueron 20 a 40% más potentes que Cellfectin en experimentos paralelos . Una corta duración de exposición a formulación de oligonucleótido es suficiente para observar efecto inhibitorio de largo plazo en producción de VEGF: En todos los experimentos anteriores, hemos estado incubando las células con el mejorador de absorción más oligonucleótido durante la noche. Luego preguntamos si una más corta duración de exposición de células al oligonucleótido puede lograr el mismo nivel de actividad anti-VEGF. Descubrimos que sin duda, un lavado después de cuatro horas y retorno a medio no suplementado fresco no disminuye la actividad ante-VEGF (Figura 12) . Aún más, el efecto duró por hasta tres días (duración del experimento) .

Tiempo (horas) después de adición de 0.2 µM T30639+10 µg/ml cF. Figura 12. Tratamiento por cuatro horas de oligonucleótido+cF, luego reemplazo con medio simple. La inhibición continua por casi tres días . No hubo inhibición significante por el oligonucleótido sentido de control (no mostrado) . De hecho, el nivel de inhibición en relación al control (sin oligonucleótido) fue mucho mejor que el observado previamente. Una razón para esto puede ser que en el experimento de incubación simple, la proteína -VEGF continua sintetizándose de ARNm pre-existente (aún no bloqueado por el oligómero antisentido) y acumulado en el medio. Al reemplazar el medio a cuatro horas, esta fuente de VEGF de "fondo" se elimina. Estos datos tienen una implicación importante en el sistema de prueba in vivo, debido al efecto antisentido de largo plazo sugiere que la droga no tiene que administrarse frecuentemente. Este aspecto tendrá que verificarse en los ensayos compuestos in vitro e in vivo . Oligonucleótido conjugado-ferroceno : Recientemente hemos descubierto que un oligonucleótido modificado con metaloceno formulado con un mejorador de absorción es el inhibidor VEGF más eficaz en nuestros ensayos in vi tro, con muy poca toxicidad en el rango de concentación empleado (Figura 13) . El oligonucleótido formulado con Cellfectin tiene actividad anti-VEGF específica a concentración 20 µm. El extremo ferroceno se ha diseñado para mejorar la asociación de membrana del oligonucleótido (D. Mulvey, Aronex, com. personal) . Aún más, postulamos que la porción hierro lipofílico puede ayudar en ser objetivo celular y movimiento de transmembrana del oligonucleótido, probablemente al explotar el sistema de transporte activo de la célula. Manejar trabajo del mecanismo por el cual la modificación está más allá del alcance de este hecho y es la materia de un estudio separado. Sin embargo, el hecho de que hemos observado alta actividad con oligonucleótidos modificados con ferroceno, sugiere que esta avenida deberá explorarse conforme probamos oligonucleótidos para prueba en el modelo in vivo .

Figura 13. El efecto antisentido potente de la variante conjungada-ferroceno de antisentido T0639 Como se describe en detalle en la sección de diseño experimental, el modelo de rata adulto de neovascularización de iris proporciona un medio para probar la actividad de los oligonucleótidos antisentido de manera cuantitativa. En este ensayo, se colocan ratas en una cámara hipóxica por 1 a 21 días, y el incremento en la vascularización del iris se cuantifica por formación de imagen digital. Como muestran los datos (igual a 14, hay clara progresión en el grado de vasculatura con longitud incrementada de incubación. El nivel de ARN retinal también asciende pero no en la misma proporción (Figura 15) . Estimulados por nuestros datos preliminares y la disponibilidad del modelo de rata, datos, ahora proponemos obtener una prueba similar de concepto en un modelo in vivo de angiogénesis.

C. Experiencia Relevante El investigador principal, Nilabh Chaudhary, Doctor en Filosofía, tiene experiencia de base amplia en biología celular y molecular. Recibió su_ doctorado en bioquímica de la University of Western Ontario, London, Canadá, 1984. Subsecuentemente se le otorgó una Beca de Graduado del Damon Runyon-Walter Winchell Cáncer Fund para continuar sus estudios de Post-doctorado en Biología Celular en el Laboratorio del Doctor Gunters Biobel en la de Rockefeller University, New York, . En 1986 se nombró asociado del Howard Hughes Medical Institute en el mismo laboratorio. El doctor Chaudhary se reunió con Triplex (recientemente renombrada Aronex) en 1992 como un científico investigador para iniciar un programa en Biología Celular dirigido al desarrollo de técnicas para mejorar la absorción nuclear y celular de terapias de ácido nucleico. Ha colaborado cercanamente con un equipo de químicos orgánicos para diseñar, sintetizar y probar numerosas modificaciones de oligonucleótidos y en reactivos para mejora resolución. El doctor Chaudhary ha sido coautor en documentos científicos en la relación función-estructura de oligonucleótidos potencialmente terapéuticos y ha diseñado enfoques para mejorar su internalización celular y eficacia. Tiene experiencia del diseño de sistemas de ensayo basados en células, técnicas inmunoclínicas, micro cuantificación de proteínas, purificación de ácidos nucleicos y técnicas de clonación molecular, fraccionación sub-celular, aislamiento de lípido y proteína de membrana, y icrocospía de fluorescencia. Anthony P. Adamis, M.D., es un colaborador y consultor en este proyecto. Es profesor asistente en el Departamento de Oftalmología en la Harvard Medical School y un investigador asociado en el Departamento de Cirugía en el Children's Hospital de Boston. En 1994, el Dr. Adamis y sus colegas demostraron por primera vez un enlace causativo entre niveles de VEGF ocular incrementados, angiogénesis, y avance de retinopatía diabética proliferativa, una causa primaria de ceguera. En estudios conducidos dsde entonces, el ha confirmado el papel fisiológico de hipoxia para estimular la expresión VEGF, loque conduce a neovascularización en el ojo. Su alcance de experiencia de investigación abarca estudios clínicos en pacientes, desarrollo de modelos de roedores de diseño enfermo de ensayos de prueba de concepto basados en célula y empleo de biología molecular y técnicas de clonación y biología molecular. Ha publicado más de 20 documentos con 10 en el campo de angiogénesis. D. Métodos y diseño experimental Resumen de enfoque: Nuestro objetivo en esta propuesta es demostrar la eficacia de compuestos antisentido anti-VEGF en un modelo animal de angiogénesis. En preparación para esto, proponemos llevar a cabo una serie de experimentos in vi tro que nos guiarán a la formulación antisentido más promisoria para prueba in vivo . Empezaremos a clasificar una "biblioteca" de 10 oligonucleótidos antisentido candidatos (19 bases) dirigidos al ARNm de VEGF de rata. Los oligonucleótidos contendrán C5-propinil pirimidina para mejorar afinidad de unión de ARNm objetivo, y enlaces internucleótido fosforotioato para conseguir resistencia a nucleasa. Para pruebas celulares, planeamos utilizar las células de ratas C6 (glioma) que responden a hipoxia al producir cantidades copiosas de ARNm VEGF y proteínas . Ensayos realizados en un formato de 96 pozos se utilizarán para clasificar la actividad de las diversas preparaciones de oligonucleótido de control o antisentido. El curso de tiempo de su efecto en el nivel de VEGF secretado en el medio extracelular se verificará por ELISA. Para mejorar la absorción celular, se co-administrarán oligonucleótidos con mejoradores de absorción novedosos. Diferentes proporciones de ácido nucleicos y lípidos se aprobarán. Además, las dos "mejores" secuencias antisentido se elegirán para conjugar a un ferroceno extremo 3'-lipofílico, una modificación que puede contribuir a la entrada celular del oligonucleótido antisentido. También, el efecyo de los dos mejores oligonucleótidos (o sus formulaciones) en niveles de ARNm VEGF se determinarán por manchado Northern (y comparar con el efecto de los controles apropiados) . En un esfuerzo por proporcionar evidencia para el mecanismo antosentido, una serie separada de experimentos in vitro se planea. Células C6 se tratarán con oligonucleótidos antisentido, especialmente diseñados para ser isotipo específicos VEGF, es decir hacer objetivo solo una o dos especies de ARNm VEGF (tres mayor uno menor en la rata) . Ensayo de protección de ARNasa se empleará para medir los efectos relativos de cada especie de ARNm VEGF . En principio, si el efecto antisentido verdaderamente es específico de secuencia, solo la expresión del isotipo objetivo será desregulada. Oligonucleótidos de diferentes secuencia serán ineficaces . La toxicidad celular de los compuestos antisentido más eficaces se ensayará en dos diferentes líneas celulares, y las dos formulaciones menos tóxicas se probarán en modelos de célula esferoide C6, diseñados para determinar si los oligonucleótidos pueden penetrar a través de capas de células . Los niveles de ARNm VEGF en capas sucesivas de células en el esferoide se determinaran en hibridización in si tu . La utilidad de mejoradores de absorción y extremos también se verificarán en este modelo . La actividad anti-angiogénica de oligonucleótido anti-VEGF más eficaz luego se valora enanimales utilizando un modelo de ojo de rata de neovascularización de iris. Ratas albinas se colocarán en cámaras de bajo contenido de oxígeno (hasta dos semanas) y la vascularización en el iris verificado por un procedimiento de formación de imagen digital cuantitativa no invasivo. En este modelo, es notable vascularización incrementada después de solo 1 a 2 días de hipoxia. El oligonucleótido (o formulaciones de prueba), se introducirá directamente en un ojo de la rata, con el otro ojo que ve como un no tratado como control. Después de hasta una semana de exposición, cualquier efecto en el crecimiento vascular se cuantificará. Cambios en los niveles de proteínas VEGF (en el vitreo de ser posible) y niveles de ARNm en la retina, se verificarán por ELISA y manchado Northern, respectivamente. Cualquier efecto secundario se anotará. Dependiendo de los resultados iniciales, se intentará un experimento de dosis múltiples. Efectos de oligonucleótidos de control también se verificarán. La formulación menos tóxica, más efectiva (mayor a 20% de inhibición de neovascularización) luego se probará en una serie prolongada de pruebas en animales, como parte de la fase II de estos estudios. La selección de oligonucleótidos antisentido de control: Para lograr bloqueo máximo de expresión VEGF, sintetizaremos oligonucleótidos antisentido que ligan 10 de la región común de todos los isotipos VEGF en la rata (Conn y colaboradores 1990) . 10 oligonucleótidos seleccionados esencialmente al azar, sin motivos de horquilla o tramos ricos en G, se sintetizarán para prueba en la primer vuelta de clasificación. 5 serán específicos de rata y 5 secuencias se elegirán para ligar a ARNm humano por igual . No es claro si los sitios conservados a manera evolutiva son objetivos antisentido "buenos" o "malos" aunque la evidencia más reciente sugiere que no hay ubicación pronosticable preferida para objetivos de encendido. Todos los oligonucelotidos sintéticos contendrán de 5 -propinil pirimidinas (para mejorar la afinidad de unión para objetivo) y enlaces fosforotioato (resistencia a nucleasa) (Wagner y colaboradores, 1993; Fenster y colaboradores, 1994) . Ya tenemos varios oligonucleótidos "irrelevantes" que utilizamos como controles, pero de ser necesario, sintetizaremos un oligonucleótido de control del mismo tamaño y composición base que la secuencia antisentido. Los oligonucleótidos se sintetizarán, purificarán (más de 95% por HPLC) y caracterizarán por The Oligonucleotide Synthesis Group en Aronex. Oligonucleótidos para estudios de mecanismo de acción: Para obtener datos que soportan el mecanismo de acción antisentido, se prepararán varios oligonucleótidos (aproximadamente 4, dependiendo de la eficacia) específicos de isotipo 20-mero. Un oligonucleótido dirigido contra una secuencia que solo se encuentra en ARNm VEGF-165 no ligará a ARNm VEGF-120. Similarmente, un oligonucleótido de base 20 complementario a la unión de escición de VEGF-120 (es decir 10 bases por exon) no deberá ser capaz de ligarse bien a VEGF-165. Para uso como control, oligonucleótidos con secuencias invertidas se sintetizarán (dos mitades se invertirán) . El efecto de estos oligonucleótidos en la expresión VEGF se determinará por la comparación de los niveles relativos de los diversos ARNms. Utilizaremos los nivles de protección de ARNsa para cuantificar los niveles relativos de cada ARNm (Ambión, Austin, TX) . Las sondas para hacer esto (en la gama de largo aproximadamente de 150 a a 250 bases) ya se han preparado utilizando imprimadores específicos de secuencias de ARNm de rata y tecnología RT-PCR (Perkin-Elmer) . Cultivo celular: La clasificación biológica se realizará en células C-6 glial derivadas de glioma de rata.

Las isoformas predominantes de VEGF en esta línea celular son VEGF-165 (amino ácidos) y VEGF-120 (46% cada una) , mientras que VEGF-188 solo representa aproximadamente 8% (Bacic y colaboradores, 1995) . Esta línea celular se ha empleado ampliamente para investigar estructura y función de VEGF. Para inducir síntesis de VEGF al estimular con hipoxia, se colocaron células en una cámara de bajo oxígeno (cámara de cultivo anaeróbico GasPak Plus) (BBL Microbiology Systems) con catalizador de paladio e hidrógeno para retirar todo el oxígeno (Stein y colaboradores, 1995) . Tiempos de incubación típicos estarán en la gama de 6 a 18 horas. En forma alterna, los cultivos se expondrán a cloruro de cobalto 100-300 µM, que interfiere con el sistema de respuesta a hipoxia dependiente de heme y activa un factor de respuesta de hipoxia que induce la transcripción de ARNm VEGF . Evaluación de la actividad oligonucleótica antisentido in vi tro . - Células C-6, derrolladas en monocapas, se mantendrán en medio Dubelcco con suero bobino fetal al 5% y antibiótico. Para la prueba preliminar de oligonucleótidos anti-VEGF, se revestirán células a una densidad de 10,000 o 20,000 células/pozo, en un plato de 96 pozos. Después de un día de recuperación, las células se tratarán con oligonucleótido (en .25 ml de medio) . Dos tipos de medio se probarán, el medio C6 que contiene solo regular Opti en (Life Technologies) , el medio de suero reducido que a menudo se emplea para mejorar la eficiencia de transfección, al reducir la interferencia por componentes de suero. Después de periodos variantes de incubación en la cámara de hipoxia, el sobrenadante se transferirá a un plato fresco para mayor análisis por ELISA. Como regla, cuando se prueban nuevas formulaciones, examinamos la morfología celular a través de un microscpio para buscar cambios no usuales o cualquier signo evidente de toxicidad. Para análisis del ARN, una gran cantidad de células (>2xl06 a 107 células en matraz T75)'se tratará con un número selecto de formulaciones . Después de tratamiento oligonucleótido (y exposición a hipoxia, etc.) el sobrenadante de nuevo se guardará para ELISA, y se aislará ARN y analizará utilizando métodos descritos a continuación . Ensayo ELISA VEGF: No hay equipo comercial disponible aún para sistemas de roedores, de manera tal que estamos diseñando uno que utiliza anticuerpos que se conoce reaccionan bien con VEGF de rata (RD1-1020 o RD1-4060 de Research Diagnostics, Inc., y otro de R&D Systems) . Otros antisueros a VEGF también están disponibles, de manera tal que elegiremos la mejor combinación, reactivos ELISA (segundo anticuerpo enlazado a enzima, substrato) se han adquirido de Pierce . Extracción de ARN, manchados Northern, ensayos de protección de ARNsa y sondas de hibridización: tamaño ARNm VEGF está en la gama de 3.8 a 4 kilobases, primordialmente debido a la larga región no traducida. Para análisis de ARN, ARN total se tratará de células tratadas o no tratadas por el método RNAzol (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX) . Para utilizar como sondas, segmentos específicos de VEGF correspondientes a la región común y sondas específicas de isotipo ya se ha generado por combinación de reacción en cadena polimerasa-transcriptasa inversa (equipo RT-PCR, Perkin Elmer) utilizando imprimadores específicos de VEGF y ARN C6 seguido por selección de tamaño de ADNcs que se originan diferentes ARNms, y amplificación selectiva utilizando imprimadores específicos de isótopo. EStas sondas se clonarán en vectores de clonación de plásmido PCRII (Invitrogen) y la secuencia se confirmará por secuenciado (secuenase, USB) . El vector PCRII permite la producción dependiente de polimerasa ARN de sondas ARN radio etiquetadas para utilizar en ensayos de protección ARNsa (equipo de Ambion, Austin TX) . Una sonda beta-actin se emplearán para normalizar los niveles de ARN. Para manchados Northerm, ARN (hasta 20 µg) se fraccionará en geles de formaldehído, transferirán a nylon, y sondeará con sondas radio etiquetadas de acuerdo con procedimientos estándar, con beta-actina para normalizar los niveles de ARN. En todos los ensayos de ARN, se empleará formación de imagen con fósforo (Fuji Phosphorimager) para cuantificar los niveles relativos de radioactividad. Experimentos para soportar el mecanismo de acción antisentido: Los oligonucleótidos antisentido en este estudio son complementarios a la secuencia ARNm que codifica ARNm VEGF. Sin embargo, su efecto inhibitorio en sistema biológico no necesariamente prueba un mecanismo de acción antisentido. De hecho, recientes análisis indican que muchos oligonucleótidos pueden interferir en forma no específica con el metabolisomo celular, especialmente concentraciones sobre 1 µM (revisado por Stein y Cheng, 1993) . Prueba de mecanismo antisentido es decepcionantemente difícil, y no se ha mostrado realmente excepto por evidencia circunstancial . Nuestro actual experimento, aunque es indirecto, se ha diseñado para obtener evidencia de mecanismo antisentido probable . En breve, hemos sintetizado oligonucleótidos antisentido "específicos de isotipo" que se emplearán en un ensayo basado en células de rata para inhibir selectivamente la expresión de una variante VEGF simple . Células C6 de rata (origen de glioma) producen tres tipos principales de isotipos VEGF. Ensayos de protección de ARNsa han mostrado que aproximadamente 45% de VEGF en linea celular C6 es variante de 120 amino ácidos, 45% es variante a 165aa, y el resto es variante 188aa (Bacic y colaboradores, 1995) . Células se tratarán con oligonucleótido antisentido específico para uno o más isotipos, y luego la transcripcción ARNm se estimulará por hipoxia o por la adición de cloro de cobalto 200 µM, que imita la hipoxia. Después de 9 horas de exposición, niveles celulares de ARNm VEGF se verificarán por ensayo de protección ARNsa (Ambion, Austin, TX) . Muy importante, sondas específicas de isotipo (longitud de aproximadamente 100 a 200 bases) que ya hemos generado por técnicas RT-PCR se emplearán para cuantificar el nivel de cada especie ARNm gf y niveles se normalizarán respecto a beta-actina. Si el mecanismo antisentido es operativo, y se emplea oligonucleótido específico tipo sencillo, solo la expresión de VEGF se reducirá respecto a otras. Por otra parte, un oligonucleótido complementario a una reacción común de todos los VEGFs habrán de reducir la expresión de todo VEGF. Síntesis de oligonucleótidos conjugados con ferroceno: Después de la primer vuelta de clasificación, el oligonucleótido más activo con los menos efectos secundarios se conectará a través del extremo 3 a un extremo ferroceno, con la esperanza de incrementar adicionalmente la absorción y actividad específica del oligonucleótido (ver los resultados preliminares; T30781 (+ferroceno) vs .' T30639 (no modificado)) . De ser efectiva, la actividad de este oligonucleótido se comparará con aquel de un control de secuencia aleatorio que contiene el mismo extremo. Se supone que la porción ferroceno puede permitir que el oligonucleótido explote el transporte activo o sistema de permeación (hierro?) de la célula, pero el mecanismo aún no se ha estudiado. Uso de mejoradores de absorción: En la mayoría de los casos, para facilitar la entrada celular, los oligonucleótidos se admninistrarán a células en la presencia de reactivos del lípido catiónico. Revelados como agentes de transfección para suministrar gen, muchos lípidos catiónicos ahora están disponibles comercialmente, pero solo se encuentran Cellfectin (Life Technologies) como consistentemente efectivo en nuestro ensayo (de 7 lípidos principales probados) . Cellfectin es una mezcla liposomal 1:15 (peso/peso) de poliaminolípido tetrapalmitil-spermidina y el fosfolípido dioleil fosfotidil etalonamina (DOPE) . Otro lípido en el que estamos trabajando es DC-Chol, desarrollado por Leaf Huang (Gao y Huang, 1991), y aprobado para pruebas clínicas para terapia de genes (Rgene Therapeutics, The Woodlands, TX) . Además, hemos diseñado y sintetizado (Guy-Caffey y colaboradores, 1995) una serie de novedosos mejoradores de absorción poliaminolípidos, que incrementan marcadamente la absorción celular de oligonucleótidos, incluso en la presencia del suero y sin toxicidad asociada significante. El más eficaz de estos es SpdC (espermidina-colesterol) . Cuando se inyectan i.v. en ratones, SpdC mejora el suministro de oligonucleótido a muchos tejidos y no se observa toxicidad cuando se inyecta SpdC en ratones a concentraciones tan altas como 100/mg/kg/día por una semana (datos no mostrados) . Hemos elaborado preparaciones liposomales de SpdC/DOPE y DC-chol/DOPE (SpdC o DC-chol con dioleil fosfotidilcolina) en proporciones en masa en gama de 1:0.5, 1:1, 1:1.5, y 1:2. La proporción que trabaja más eficazmente en nuestros ensayos previos anti-VEGF en células NHEK fue 1:1, para ambos lípidos catiónicos. Proponemos investigar la utilidad de estas preparaciones para mejorar la actividad de oligonucleótidos anti-VEGF en la línea celular C6, en C6 esferoides y eventualmente en el modelo de ojo. El mecanismo exacto por el cual estos métodos de absorción funcionan aún es controversial . Mezclar el lípido catiónico con el ácido nucleico, casi siempre produce" micro-precipitados que entran a las células eficientemente. Para mantener consistencia, y probablemente para descubrir un principio subyacente, verificaremos el tamaño de las partículas al utilizar un aparato de dimensionamiento de partículas Coulter. Formulaciones para inyección in vivo .- Hemos empleado el térmico formulación holgadamente en esta propuesta para transportar el mensaje de utilizar una mezcla de multicomponentes para suministrar droga. Sin embargo, conforme nos acercamos la etapa de prueba in vivo, sería prudente diseñar formulación óptima para inyección en el ojo, especialmente si se involucran mejoradores de absorción. Otros parámetros a considerar sería la cantidad de antisentido y concentración, salinidad, tamaño de partículas, pH y vehículo. El Dr. Joe Wyse nos ayudará en elegir y preparar la formulación óptima. Ensayos de citotoxicidad: Células se sembrarán a una densidad de 500 células/pozo en una placa de 96 pozo. Un día después de cubrir, las células se expondrán a formulaciones de oligonucleótidos diluidas en serie (4 pozos por dilución) . Después de un día o cuatro días de exposición, el efecto de viabilidad celular se verificará utilizando un sistema de ensayo no radioactivo (Ensayo de proliferación celular acuoso Cell Titer 96 de Promega Corp.) . Para el oligonucleótido más potente, este ensayo se realizará en tres líneas celulares separadas (incluyendo C6, NHEK, y línea celular de fibroblastos) . Evaluación de actividad antisentido en esferoides: células C6, normalmente desarrolladas en monocapas (4.5 g de glucosa/1, DMEM, FCS al 5% más antibióticos) puede inducirse para crecer en esferoides o agregados de células de aproximadamente 0.4 a 0.8 mm. Sería informativo el saber si nuestros oligonucleótidos antisentido formulados con lípidos o de otra forma pueden pasar a través de las capas de células de un esferoide y aún tener actividad biológica. Para preparar esferoides, el método descrito por Stein y colaboradores (1995) , se empleará. Células C6 se transferirán desde cultivos confluentes a platos bacteriológicos no adherentes, y desarrollarán por 48 horas. Los esferoblastos emergentes se transferirán a matraces de centrifugado, se cultivarán por 10 días adicionales (80 rpm) , y los esferoides se clasificarán en tamaño uniforme por sedimentación a través de una pipeta de 10 ml . Se continuará el crecimiento por seis semanas adicionales, con un cambio de medio cada día salteado. El matraz se lavará por arrastre cada día con 95% de aire + 5% de C02 para asegurar oxigenación adecuada y pH. Los esferoides se tratarán con formulaciones antisentido o controles apropiados, expondrán a hipoxia para inducir síntesis de VEGF por hasta 1 día, y luego el nivel de ARNm VEGF en secciones esferoides, se examinará por hibridización in situ. Para esto, los esferoides se fijarán con 4% de paraformaldehído, congelarán, seccionarán en porciones con espesor de 10 µm, y procesarán para hibridización in situ con sondas ARN o ADN etiquetadas con 35S para VEGF generado como se describió previamente. La sección procesada se someterá a colorante de contraste con hematoxilina y manchado o teñido cosin. Después de varios días de autoradiografía (Guy-Caffey y colaboradores) las placas se examinarán (fotografiarán) por iluminación de campo obscuro y campo brillante. La distribución de ARN VEGF indica el grado de inhibición logrado por el oligonucleótido antisentido. Idealmente, todas las capas mostrarán bajo nivel de ARNm VEGF. Más probablemente, las capas superficiales tendrán menos VEGF, ya sea debido a que la droga no penetra en las capas de las células o debido a que las células fueron más hipóxicas al centro y produjeron más VEGF. Si el suministro solo es en las capas superficiales, intentaremos diseñar nuevos enfoques de suministro. Evaluación de la actividad anti-angiogénica de oligonucleótidos antisentido VEGF in vivo . El modelo de roedor adulto y neovascularización de iris asociada con VEGF: Ratas adultas en una atmósfera hipóxica, estimulan nuevo crecimiento de vasos sanguíneos en el iris. La neovascularización se correlaciona en tiempo con la regulación ascendente de niveles de ARNm VEGF de la retina. La secuencia de eventos oculares reproduce cercanamente aquellos vistos en el modelo de simio de rubeosis iridis y neovascularización de iris humano, en donde se conoce VEGF retinal isquémico que es causal en el desarrollo de neovascularización de iris. Es nuestra intención utilizar este modelo para probar la actividad de compuestos antisentido que pueden reducir angiogenésis . La experimentación con animales, que se realiza en el laboratorio Adamis, involucra manejo de animales y cirugía, fotografía, cuantificación por computadora y análisis Northern de ARNm VEGF. Ratas Sprague-Dawley (albinas) de colonia Kingston, 350 a 400 gramos adultas (hembra) , se colocan en cámaras hipóxicas (1% de oxígeno) por 1-21 días. Examen biomicroscópico y fotografía de cámara con rendija estandarizada se realizan antes y después del período de incubación. Signos de tortuosidad y dilatación de vasos de iris progresivas así como incrementado desarrollo de densidad vascular en la atmósfera hipóxica. Los vasos de iris claramente son visibles en los animales albinos . Fotografías estandarizadas de los iris se exploran o digitalizan en un programa de computadora (Imagen NIH, soporte lógico 1.54D) y el área de neovascularización se cuantifica en una forma enmascarada a través de análisis de pixeles. La vascularidad de iris muestra un incremento progresivo hasta el día 14. Inmunotinción de Factor VIII y proliferación de antígeno nuclear celular (PCNA) ha confirmado proliferación celular endotelial empezando el día 2 ; lo que demuestra que la vascularidad incrementada representa angiogénesis. Retinas aisladas se preparan para tinción o manchado Northern, muestran que los animales hipóxicos incrementan los niveles de ARNm VEGF de estado estable en la retina. En resumen, ratas adultas en una atmósfera hipóxica estimulan nuevo crecimiento de vaso en el iris. Es nuestra intención utilizar este modelo para probar el efecto de formulaciones anti-VEGF candidatas. El experimento para determinar efecto de hipoxia interrumpida en neovascularización: El modelo de rata anterior solo se ha empleado para exposición continua a hipoxia. Debido a que el modelo puede demostrar ser más útil si puede interrumpirse la hipoxia, por ejemplo para administración repetida de drogas, quisiéramos caracterizar el grado de neovascularización de iris para animales retirados de hipoxia por cortos períodos de tiempo en una base diaria. Especulamos que la remoción sinergizará la neovascularización ya que ratas neonatales tratadas de esta manera tienen una mayor respuesta neovascular en comparación con animales con oxígeno constante (Reynaud y Dorey, 1994) . La reoxigenación de retina hipóxica produce intermediarios de oxígeno reactivo que se conoce incrementan en proteína ARNm VEGF retinal (Kuroki y colaboradores, 1995). Se colocarán ratas en cámaras hipóxicas (10% de oxígeno) por 1, 3, 5, 7, 14 y 21 días (n=3 por punto! en tiempo, 18 total) . Se retirarán por una hora por día y expondrán a oxígeno normal ambiente (21%) . Al final del período de incubación, se tomarán fotografías de iris standard. Los animales se sacrificarán y la mitad anterior del ojo se prepara por tinción PCNA y microscopía de luz. Las retinas se aislarán y prepararán para tinción Northern con una sonda etiquetada-prima aleatoria ADNc VEGF 558 bp marcada 32 . La regulación ascendente de ARNm VEGF retinal se correlacionará con la documentación fotográfica inmunohistoquímica para neovascularización de iris sobre el período de tiempo de 21 días. El área de vascularidad se cuantificará a partir de las fotografías estandarizadas y comparará con animales colocados en hipoxia no interrumpida. De este experimento, seremos capaces de estimar el número máximo de tiempos que el animal puede tomar de la cámara hipoxia y dosificar sin comprometer el efecto epóxico. Evaluación del efecto antisentido in vivo -. En el día 0, se tomarán fotografías de línea base. Un ojo de un animal anestesiado será aleatorizado para recibir una inyección intravitreal sencilla del compuesto antisentido VEGF. El otro ojo se dejará sin tratar. Se giarán dosis por los estudios in vitro pero se administrarán en 20 µl o menor. Los animales se colocarán en hipoxia sin interrupción por 7 días. En el primer ensayo, se trasladarán los animales por formulación (4 formulaciones: oligo solo; oligo+extremos ; y cada uno con mejorador de absorción) . El objetivo será ver si estos compuestos tienen cualquier efecto agudo. Si hay reducción notable en vascularización, una gran cantidad de animales se empleará.

La tabla a continuación resume el raciocinio estadístico por la cantidad que pueda requerirse. En total, se espera que se utilizarán aproximadamente 20 ratas por tratamiento. Tabla 1. Número de ratas requeridas : Noventa por ciento de las ratas en este modelo desarrollan neovascularización. Considerando un nivel de significancia de 0.05 (alfa=0.05) y una potencia de 0.8 (l-beta=0.80) , el número de ojos por grupo de tratamiento puede determinarse para la efectividad variante de un agente bloqueador de angiogenésis.

Grupo Grupo de Número de 0j os de Control Tratamiento Requeridos 90 40 38 90 50 24 90 60 17 90 70 12 La inhibición de neovascularización para estos experimentos, se definirá como un decremento en 20% en el área de vascularización en los ojos tratados contra los de control . Si la efectividad considerada de un agente en particular es alta, el porcentaje de ojos que desarrollan neovascularización del iris que está en este grupo de tratamiento será bajo, y el número de ojos requeridos para la significancia estadística disminuirá dramáticamente. En el día siete, los animales se fotografiarán y sacrificarán. Las retinas se reolectarán y prepararán para manchado Northern (individualmente) . ARNm de estado estable VEGF se cuantificará después de normalización a la señal de ARN ribosomal 285, utilizando un Phosphorimager (Molecular Dynamics) . La vascularidad de iris se cuantificará y comparará entre ojos tratados y de control. F. Procedimiento de manejo de Animales vertebrados : Todos los procedimientos con animales se realizarán en Children's Hospital, Harvard Medical School, seguido por las líneas establecidas por la Resolución de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología en el uso de animales para investigación y guías en el uso de animales para investigación y lineas guía establecidas por el Massachussetts Eye and Ear Infirmary Animal Care Commitee (Comité para Atención de Animales de Enfermería de Oídos y Ojos de Massachussetts) . En total, se emplearán 120 ratas Sprague Dawley de clonia Kingston hembras albinas. Se anestesiarán e inyectarán intravitralmente con 20 µl de oligonucleótido o formulación de control, utilizando una aguja calibre 30. Sulfato de Gentaminicina se aplicará siguiendo la inyección. Los animales se mantendrán por hasta 30 semanas en una atmosfera al 10% de oxígeno. Siguiendo la terminación del tratamiento, se sacrificarán por inhalación de C02. Todos los experimentos son consistentes con las guías OPRR. I . Literatura Citada Adamis, A.P. y col., 1994, Arch. Ophthalmol. 118:445-450 Adamis, A.P. y col., 1993, Biochem. Biphys . Res. Comm., 193:631-638. Adamis, A.P. y col., 1996, Arch. Ophthal . 114:66-71 Bacic, y col., 1995, Pharm. News 2:V, (abst) Bishop, y col., 1996, 3. Biol. Chem. 271:5698-5703. Conn., (3, y col., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2628-2632.

DvAmore, P.A., 1994, Investigative Ophthal. Vis. Sci. :3974-3979. deYries, C, y col., 1992, Science, 255:989-991. Fenster, S.D. y col., 1994, Endocrine reviews, 13:18-31. Ferrera, N. , y col., 1992, Endocrine Reviews 13:18-31 Guy-Caffey y col., 1995, J. Biol. Chem. 270:31391-31396 Gao, X., y Huang, L. 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285 Miller, J. y col., Am. J. Pathol. 145: 574-584. Milligan, J.F., y col., J. Med. Chem., 36. 1923-1937. Píate, K.H. y col., 1992, Nature 359: 845-848. Shima, D.T. y col., 1995, Molecular Med. 2: 64-75 Shweiki y col., 1992, Nature 362: 841-844. Stein, C.A. y Cheng, Y.C., 1993, Science 261: 1004-1012. Ter an y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579-1586. Uhlmann, F., y Peyman, A., 1990, Chem. Rev. 90:543 Wagner, R.W. y col., 1993, 260: 1510-1513. Wagner, R.W., 1994, Nature 372: 333-335. REFERENCIAS CITADAS Las siguientes referencias en la proporción que ofrecen detalles de procedimiento a los establecidos aquí, se incorporan específicamente aquí por referencia. Ballaun, C, Weninger, W., Uthman, A., Weich, H., Tschachler, E. (1995) J. Invest Ital . Dermatol. 104, 7-10.

Behr, J. (1994) Ital, Bioconjugate Chem. 5,382-389 Bishop, J. S., Guy-Caffey, J.K. , Ojwang, J.O., Smith, S.R., Hogan, M.E., Cossu , P.A., Rando, R.F., Chaudhary, N. (1996) J. Biol. Chem 271, 5698-5703 Carmeliet, P., Ferreriera, V., Breier, G., Pollefeyt, S., Kieckens, L., Gertsenstein, M., Fahrig, M. , Vandenhoeck, A., Harpal, K., Eberhardt, C, Declercq, C, Pawling J. , Moons, L., Collen, D., Risau, W., Nagy, A, (1996) Nature 380, 435-439 Chaudhary, N. , Bishop, J. S., Jayaraman, K., Guy- Caffey, J.K., in Delivery Strategies For An isense Oligonucleotide Therapeutics, S. Akhtar, Ed (CRC Press, Boca Ratón, 1995) pp. 39-60. Connolly, D. T., Plander, J.V. (1989) J. Biol. Chem. 264, 20017-20024 D'Amore, P.A. (1994) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 3974-3978 de Vries, C, Escobedo, J.A. Ueno, H. , Houck, K., Ferrera, N., Williams, L.T. (1992) Science 255, 989-991 Dvorak, H.F., Brown, L.F., Detmar, M. , Dvorak, A.M. (1995a) Am. J. Pathol. 146, 1029-1039 Dvorak, H.F., Detmar, M. , Claffey, K.P., Nagy, J.A., van der Water, L., Senger, D.R. (1995b) Int. Arch. Allergy Immunol . 107, 233-235 Fenster, S.D., Wagner, R.W., Froehler, B.C., Chin, D.J. (1994) Biochemistry 33, 8391-8398 Ferrera, N. , Houck, K., Jakeman, L., Leung, D.W. (1992) Endocr, Rev. 13, 18-32 Ferrera, N. , Carver-Moore, K. , Chen, H. , Dowd, M. , Lu, L., O'Shea, K.S., Powell-Braxton, L., Hillan, K.J., Moore, M.W. (1996) Mature 380, 439-442 Fisher, T.L., Terhorst, T., Cao, X., Wagner, R.W. (1993) Nuc. Acids Res. 21,3857 Folkman, J. (1995) Nat. Med. 1, 27-31 Frank, S., Hubner, G., Breier, G., Longaker, M. T., Greenhalgh, D.G., Werner, S. (1995) J. Biol. Chem. 270, 12607-12613 Gao, X., Huang, L. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285 Gao, X., Huang, L. (1991) Biochem, Biophys. Res. Commun. 179, 280-285 Guy-Caffey, J.K., Bodepudi, V., Bishop, J.S., Jayraman, K. , Chaudhary, N. (1995) J. Biol. Chem. 270, 31391-31396 Keck, P. J., Hauser, S.D., Krivi, G. , Sanzo, K. , Warren, T., Feder, J., Connolly D.T. (1989) Science 246, 1309-1312 Ledley, F. (1994) Curr. Opin. Biotechol. 5, 626-636 Leung, D. W., Chachianes, G., Kuang, W.J., Goedddel, D.V., Ferrera, N. (1989) Science 246, 1306-1309 Lewis, J. G. , Lin, K,Y., Kothavale, A., Flanagan, W.M., Matteucci, M.D., DePrince, R.B., Mook, J., R.A., Hendren, R.W., Wagner, R.W. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 3176-3181 Milligan, J.F., Matteucci, M.D., Martin, J. C. (1993) J. Med. Chem 36, 1923-1937 Nomura, M., Ya agishi, S., Harada, S., Hayashi, Y., Yamashima, T., Yamashita, J., Yamamoto, H. (1995) J. Biol. Chem. 270, 28316-28324 Puglisi, J, D., Tinoco, J. , I. (1989) Methods Enzymol . 180, 304-325 Robinson, G.S., Pierce, E.A., Rook, S.L., Foley, E., Webb, R., Smith, L.E.H. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 4851-4856 Stein. C.A., Cheng, Y.-C (1993) Science 261, 1004-1012 Stein, C.A., Kreig, A.M. (1994) Antisense Res . Dev. 4.67-69 Ter an, B.I., Dougher-Vermazen, M. , Carrion, M.E., Dimitrov, D., Armellino, D.C., Gospodarowicz, D., Bohlen, P. (1992) Biochem Biophys. res. Commun. 187, 1579-1586 Thomas, K.A. (1996) J. Biol. Chem. 271, 603-606 Tischer, E., Mitchell, R. , Hartman, T., Silva, M., Gospodarowicz, D., Fiddes, J.C., Abraham, J.A. (1991) J. Biol. Chem 266, 11947-11954 Uhlmann, E., Peyman, A. (1990) Chemical Reviews 90, 543-584 Wagner, R.W., Matteucci, M. D., Lewis, J. G., Gutiérrez, A.J., Moulds, C . , Froehler, B.C. (1993) Science 260, 1510-1513 Wagner, R.W. (1994) Nature 372, 333-335 Winternitz, C.I., Jackson, J.K., Oktaba, A.M., Burt, H.M. (1996) Pharm. Res. 13, 368-375 Woolf, T.M. Melton, D.A., Jennings, C.G.B. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 7305-7309 LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Chaudhary, Nilabh Rao, T. Sudhakar Revankar, Ganapathi R. Cossium, Paul A. Rando, Robert F . Peyman, Anusch Uhlmann, Eugen (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: INHIBIDORES ANTISENTIDO DE EXPRESIÓN DE FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEgF/VPF) (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 21 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Conley Rose & Taylor, P.C. (B) CALLE: 600 Travis, Suite 1850 (C) CIUDAD: Houston (D) ESTADO: texas (E) PAÍS: E.U.A. (F) CP: 77002-2912 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC COMPATIBLE CON IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: Wind?WS95 (D) PROGRAMA (SOFTWARE): Microsoftword 7.0a (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DE AGENTE/ABOGADO : (A) NOMBRE: McDaniel , C. Steven (B) NUMERO DE REGISTRO: 33,962 (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: 1472-07200 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: 713/38-8010 (B) FAX: 713/238-8008 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (E) ANTI-SENTIDO: SI (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre cada residuo" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC. : 1 GCGCTGATAG ACATCCATG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre cada residuo C5 -propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 2 GCGCUGAUAG ACAUCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre cada residuo C-5 propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 3 CGAUUGGAUG GCAGUAGCCT 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre cada residuo C5-propinilpirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 4 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= , "enlace fosforotioato entre cada residuo C5-propinilpirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 4 UACUCCUGGA AGAUGUCCA 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 6-7; 9-10; 10-11; 13-14 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre los residuos indicados" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC. : 5 GCGCUGAUAG ACAUCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 3-4; 5-6; 6-7; 9-10; 10-11; 13-14 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre los residuos indicados " (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 6 GCGCUGAUAG ACAUCCAUUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERISTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 6-7; 10-10 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre los residuos indicados " (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC. : 7 GCGCUGAUAG ACAUCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC: 8 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre ttodos los residuos, C5 -propinil pirimidinas " (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 8 GAAGAUGUCC ACCAGGGUC 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 9 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlace fosforotioato entre los residuos indicados, C5 -propinil pirimidinas " (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 9 AGGAAGCUCA UCUCUCVCUA 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato C5 -propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC: 10 UACACGUCUG CGGAUCUUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 11 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato C5-propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 11 UAACUCAAGC UGCCUCGCC 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC . : 12 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato; C5-propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC: 12 CCAUGAACUU CACCACUUC 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 13 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) AN I-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 -propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 13 GACAUCCAUG AACUUCACC 19 (2 ) INFORMACIÓN PARA NO . DE ID DE SEC . : 14 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 -propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 14 GGCUGGCAGU AGCUGCGCU 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC . : 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: , (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 -propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 15 GGAUGGCAGU AGCUGCGCU 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 16 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) AN I-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : mise feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 -propinil C residuos" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 16: GCGCTGATAG ACATCCATG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 17 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 -propinil U residuos" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 17: GCGCUGAUAG ACAUCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC . : 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 propinil pirimidinas en residuos 8, 12, 14 y 15" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 18: GCGCTGAUAG ACAUCCATG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC . : 19 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 propinil pirimidinas en residuos 2,5 8, 12, 15 y 18" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 19: GCGCUGAUAG ACATCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC . : 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 propinil pirimidinas extremo 3 enlazado a extremo (tether lípido" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 20: GCGCUGAUAG ACAUCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC: 21 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioat entre residuos 1-5, 8-9, 12-13, 14-15, y 16-19; 3'-termina pireno; C5-propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 21: GCGCUGAUAG ACAUCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 22 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5 hexinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 22: GCGCUGAUAG ACAUCCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC: 23 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5-propinil pirimidinas" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 23: GCGCUGACAG ACAUUCAUG 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 24 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 24: CATGGATGTC TATCAGCGC 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC.: 25: CATGGATGTC TATCAGCGC 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5-propinil pirimidinas residuos C" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 26: AGAGCAGCAA GGCGAGGCT 19 (2) INFORMACIÓN PARA NO. DE ID DE SEC.: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares base. (B) TIPO: ácido nucleico sintético (C) HEBRA: Sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (iv) ANTI-SENTIDO: SI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) UBICACIÓN: 1-19 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "enlaces fosforotioato, C5-propinil pirimidinas residuos C" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO. DE ID DE SEC . : 27: CAUGGAUGUC UAUCAGCGC 19

Claims (48)

1. REIVINDICACIONES 1.- Oligonucleótido antisentido que reduce producción d VEGF celular, en células tratadas con el oligonucleótid antisentido a concentraciones inferiores a aproximadamente micromolar,- las células tratadas no producen más d aproximadamente 90% del VEGF que se produce por células si tratar.
2. 2. - El oligonucleótido antisentido de conformidad con l reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid antisentido liga a secuencias ARN que se encuentran en ARNm qu codifica VEGF.
3. 3. - El oligonucleótido antisentido de conformidad con l reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid antisentido liga a una secuencia ARN que se encuentran en al meno uno de dos de los ARNms que codifican VEGF.
4. 4. - El oligonucleótido antisentido de conformidad con l reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid antisentido liga a una secuencia ARN encontrada en ARNm VEGF 205
5. 5. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado por«que el oligonucleótid antisentido liga a una secuencia ARN encontrada en ARNm VEGF 185
6. 6. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid antisentido liga a una secuencia ARN encontrada en ARNm VEGF 165
7. 7.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid antisentido liga a una secuencia ARN encontrada en ARNm VEGF 121
8. 8.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una porció química que disminuye la velocidad de degradación de oligonucleótido antisentido por nucleasas .
9. 9. - El oligonucleótido antisentido de conformidad con l reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid comprende un grupo fosforotioato y un grupo fosfodiéster.
10. 10. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un par d residuos adyacentes conectados a través de una porción química qu resiste degradación por nucleasas.
11. 11.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 8, caracterizado porque comprende la porción qu disminuye la velocidad de degradación del oligonucleótid antisentido por nucleasas es un grupo fosforotioato.
12. 12. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 8, caracterizado porque cada residuo de oligonucleótido se enlaza a través de un grupo fosforotioato.
13. 13. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid comprende un residuo nucleótido seleccionado del grupo qu consiste de C5-propinil uridina, C5-propinil citidina, C5-hexini uridina, C5 hexinil citidina, 6-aza uridina y 6-aza citidina.
14. 14.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótid comprende un grupo fosforotioato y un residuo nucleótid seleccionado del grupo que consiste de C5-propinil uridina, C5 propinil citidina, C5-hexinil uridina, C5 hexinil citidina, 6-az uridina y 6-aza citidina.
15. 15. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo C5 propinil uridina .
16. 16.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo C5 propinil uridina y un grupo fosforotioato.
17. 17. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo C5 propinil citidina.
18. 18. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo C5 propinil citidina y un grupo fosforotioato.
19. 19. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo C5 hexinil citidina y un grupo fosforotioato.
20. 20.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo C5 hexinil citidina.
21. 21.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo C5 hexinil citidina y un grupo fosforotioato.
22. 22.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo 6 aza-deoxi uridina.
23. 23.- El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo 6 aza-deoxi uridina y un grupo fosforotioato.
24. 24. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo 6 aza-deoxi uridina.
25. 25. - El oligonucleótido antisentido de conformidad co la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un residuo 6 aza-deoxi uridina y un grupo fosforotioato.
26. 26.- Una composición caracterizada porque comprende u oligonucleótido antisentido que reduce la producción de VEG celular, en células tratadas con el bligonucleótido antisentido concentraciones inferiores a aproximadamente 1 micromolar y la células tratadas producen como máximo aproximadamente 90% del VEG que se produce por células sin tratar, la composición ademá comprende un mejorador de absorción celular.
27. 27.- La composición de conformidad con l reivindicación 26, caracterizada porque el mejorador de absorció celulares una porción lipofílica.
28. 28.- La composición de conformidad con l reivindicación 27, caracterizada porque la porción lipofílic comprende colesterol .
29. 29.- La composición de conformidad con l reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido ademá comprende un enlace iónico con un catión para formar una sal .
30. 30.- La composición de conformidad con l reivindicación 29, caracterizada porque el catión es un lípid catiónico.
31. 31.- La composición de conformidad con l reivindicación 30, caracterizada porque el lípido catiónico es u poliaminolípido .
32. 32.- La composición de conformidad con l reivindicación 31, caracterizada porque el poliaminolípido e espermidina-colesterol .
33. 33. - La composición de conformidad con l reivindicación 26, caracterizada porque el mejorador de absorció celular comprende un liposoma.
34. 34. - La composición de conformidad con l reivindicación 33, caracterizada porque el liposoma comprend CellfectinMR.
35. 35.- La composición de conformidad con l reivindicación 33, caracterizada porque el liposoma comprend espermidina-colesterol en mezcla con DOPE.
36. 36.- Un oligonucleótido antisentido que liga ARNm VEG y comprende un grupo fosforotioato y un residuo nucleótid seleccionado del grupo que consiste de C5-propinil uridina, C5 propinil citidina, C5 -hexinil uridina, C5 hexinil citidina, 6-az uridina y 6-aza citidina, en donde el oligonucleótido antisentid tiene una temperatura de fusión dúplex de al menos aproximadament 5°C sobre la temperatura de fusión de un oligonucleótid antisentido idéntico que carece residuos pirimidina modificado químicamente; el residuo oligonucleótido antisentido reduc producción de VEGF celular en células tratadas con e oligonucleótido antisentido a concentraciones inferiores aproximadamente 1 micro molar, las células tratadas no produce más de aproximadamente 90% del VEGF que se produce por células si tratar.
37. 37.- Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que liga ARNm VEGF, que comprende un grup fosforotioato y un residuo nucleótido seleccionado del grupo qu consiste de C5-propinil uridina, C5-propinil citidina, C5-hexini uridina, C5 hexinil citidina, 6-aza uridina y 6-aza citidina, e donde el oligonucleótido antisentido tiene una temperatura d fusión dúplex de al menos aproximadamente 5°C sobre la temperatur de fusión de un oligonucleótido antisentido idéntico, que carec de residuos pirimidina modificados químicamente; el residu oligonucleótido antisentido reduce producción de VEGF celular, e células tratadas con el oligonucleótido antisentido concentraciones inferiores a aproximadamente 1 micro molar, la células tratadas no producen más de aproximadamente 90% del VEG que se produce por células sin tratar; la composición tambié comprende un compuesto de liberación sostenida polimérico.
38. 38.- En un oligonucleótido antisentido que contien enlaces fosforotioato y liga a ARNm que codifica VEGF, una mejor caracterizada porque incluye un residuo nucleótido en e oligonucleótido antisentido seleccionado del grupo que consiste d C5-propinil uridina, C5-propinil citidina, C5-hexinil uridina, C hexinil citidina, 6-aza uridina y 6-aza citidina, en donde l mejora incrementa la temperatura de fusión dúplex de u oligonucleótico antisentido por al menos aproximadamente 5°C.
39. 39.- Un método para reducir producción VEGF celular e una célula, que comprende contactar una célula con u oligonucleótido antisentido de conformidad con la reivindicació 1, la célula produce como máximo aproximadamente 90% del VEGF qu se produce por una célula sin contactar, la concentración de oligonucleótido es menos que aproximadamente 1 micro molar.
40. 40.- Un oligonucleótido antisentido que se elige de grupo que consiste de los números de secuencia ID 2 a 22..
41. 41.- Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 2.
42. 42. - Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 3.
43. 43. - Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 4.
44. 44.- Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 6.
45. 45. - Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 10.
46. 46.- Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 20.
47. 47.- Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 21.
48. 48.- Una composición que comprende un oligonucleótid antisentido que tiene un ID de secuencia No. 22.