MXPA98008006A - Novedoso factor de transcripcion, tfiib, del candida albicans, secuencia de acidos nucleicos que codifican al mismo, y metodos de clasificacion selectiva de inhibidores del crecimiento del candida albicans - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un novedoso factor de transcripción del Candida albicans, el TFIIB, a una secuencia deácidos nucleicos que codifica el TFIIB, y a métodos de clasificación selectiva de inhibidores del crecimiento del Candida albicans mediante el TFIIB como blancou objetivo.

Description

NOVEDOSO FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN - TFIIS, DEL Candida. aZLbi.ca.ns, SECUENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN AL MISMO, Y MÉTODOS DE CLASIFICACIÓN SELECTIVA DE INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO DEL Candida a bieaps CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere, en general, a factores de transcripción y a métodos para la selección de agentes ant i f úngicos . La invención fue realizada, en parte, usando fondos gubernamentales, concesión NIH No. GM46498, y por lo tanto el gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La levadura Candi da albi can s (C. albi can s ) es uno de los patógenos fúngicos más penetrantes en los humanos. Tiene la capacidad de infectar oportunistamente un diverso espectro de huéspedes comprometidos, y de invadir tejidos muy diversos en el cuerpo humano. En muchos casos puede evadir el tratamiento con REF. : 28479 antibióticos y al sistema inmunológico. Aunque el Candi da albi can s es un miembro de la flora normal de las membranas mucosas de los tractos r esp ira-corio , gastrointestinal, y genital femenino, en esos sitios puede tener dominio y estar asociado con condiciones patológicas. Algunas veces produce una- enfermedad sistémica progresiva en pacientes debilitados - o inmunosupr imidos , particularmente si se encuentra deteriorada la inmunidad mediada por las células. Se puede presentar la sepsis en pacientes con inmunidad celular comprometida, por ejemplo los que reciben quimioterapia contra el cáncer o aquéllos con linfoma, SIDA, u otras condiciones. El Candi da puede producir la invasión al torrente sanguíneo, tromboflebitis, endocarditis, o infección de los ojos y virtualmente cualquier órgano o tejido cuando se introduce intravenosamente, por ejemplo, via tubitos, agujas, abuso de narcóticos, etc. Se ha demostrado que el Candi da a lbi cans es diploide con letales equilibrados y por lo tanto probablemente no pasa a través de una fase sexual o ciclo meiótico. Parece que esta levadura es capaz de cambiar," a una alta frecuencia y de manera expontánea y reversible, entre al menos siete fenotipos generales. Se ha demostrado que los cambios ocurren no solamente en cepas estándares de laboratorio, sino que también en cepas aisladas de la boca de individuos sanos. La Nistatina, el ketoconazol, y la anfotericina B son fármacos que se han usado para tratar infecciones orales y sistémicas por Candi da . Sin embargo, la nistatina administrada oralmente está limitada al tratamiento dentro de los intestinos y no es aplicable al tratamiento sistémico. Algunas infecciones sistémicas son susceptibles al tratamiento con ketoconazol o con anfotericina B, pero estos fármacos pueden no ser efectivos en ese tratamiento al menos que sean combinados con fármacos adicionales. La anfotericina B tiene un Índice terapéutico relativamente estrecho y se presentan numerosos efectos colaterales indeseables al igual que la toxicidad, inclusive a concentraciones terapéuticas. Aunque el ketoconazol y otros agentes antifúngicos de - azol exhiben una toxicidad significativamente baja, su mecanismo de acción, la inactivación del grupo prostético del citocromo P450 en ciertas enzimas, algunas de las cuales se encuentran en" los humanos, imposibilita el uso en pacientes que estén recibiendo simultáneamente otros fármacos que 5 sean metaboli zados por las enzimas del citocr-omo P450 del cuerpo. Además, la resistencia a estos compuestos está surgiendo y puede plantear un serio problema en el futuro. En la técnica existe la necesidad de un tratamiento efectivo de las infecciones oportunistas causadas por el Can di da al bi cans . Por lo tanto un objetivo de la invención es proporcionar ensayos de selección. para la identificación de inhibidores potenciales del crecimiento del Candi da a lbi can s . Otro objetivo de la invención es proporcionar ensayos de selección e identificar inhibidores potenciales del crecimiento del Candi da albi cans , que se basen en la inhibición de la transcripción en -20 este organismo. La síntesis del mARN en las eucariotas requiere d-e la ARN polimerasa II y de factores de transcripción adicionales, algunos de los cuales son generales y actúan en su mayoría, si no del 5 todo, como promotores, y otros de los cuales confieren especificidad y control. Cinco factores generales, a, b, d, e, y g, han sido purificados ha-sta homogeneidad a partir de la levadura S . c ere vi si a e , y han sido identificados como contrapartes de los factores de ratas o humanos, TFIIE, TFIIH, TFIID, ~ TFIIB y TFIIF, respectivamente. Estos factores se juntan a un promoto-r "en un complejo con ARN polimerasa II para iniciar la transcripción. Los estudios de enlazamiento han demostrado que el orden de la reunión del complejo de iniciación sobre el ADN del promotor comienza con el factor d (TFIID), es seguido por el f-actor e (TFIIB) , y luego por la polimerasa y los factores restantes. S n embargo, los factores b (TFIIH), e (TFIIB), e (TFIIB) y g (TFIIF) , se enlazan directamente a la polimerasa II, y tanto como cuatro de los "cinco factores pueden juntarse con la polimerasa en una holoenzi a antes del enlazamiento del promotor. El significado funcional de las interacciones reveladas por los estudios de enlazamiento no es claro- debido a que solamente un pequeño porcentaje de los complejos de iniciación pueden dar lugar a transcriptos. Muchos aspectos de la t anscripción por la ARN polimerasa II son conservados entre la levadura y las eucariotas superiores. Por ejemplo, existe una extensiva similitud en las secuencias de aminoácidos, entre las subunidades más grandes de la levadura, polimerasa de- -Drosophila y de mamífero. Otros componentes del aparato de transcripción", tales como el enlazamiento TATA y los factores intensificadores del enlazamiento, son en algunos casos intercambiables entre sistemas de enlazamiento o de transcripción, in vitro, de levadura y mamíferos. No obstante, existen diferencias signi icativas entre los dos sistemas. Los elementos TATA están ubicados de-s-de 40 a 120 o más pares de base corriente arriba del sitio de iniciación de un promotor del S. cerevísiase, y en donde se presentan estos elementos se requieren para la expresión g n ti Candi da albi ans El hecho de que los genes del C. albicans funcionan en el S. cerßvisíase sugiere que también usa el espaciamiento de 40 a 120 pares de bases entre el elemento TATA y el sitio de iniciación. En contraste, los elementos TATA de mamífero (asi como los del S. pombe) y los sitios de inicio de la transcripción, se encuentran separados por solamente de 25 a 30 pares de bases, y la eliminación de un elemento TATA no siempre reduce la frecuencia de la iniciación de la transcripción, aunque puede alterar el sitio de iniciación. Tambal én- existen grados variables de homología entre las secuencias del factor de transcripción de la levadura y de fuentes de mamíferos. Los TFIIB de humano y de mamífero tienen una identidad de la secuencia de aminoácidos del 50 al 60%, y tampoco son especies intercambiables para soportar el crecimiento celular. Algunos de los factores de subunidades múltiples, tales como la ARN polimerasa II, el TFIIF y el TrTTD, contienen diferentes números de subunidades en humanos y en levadura. Los pesos moleculares -de los polipéptidos correspondientes difieren en los humanos y en la levadura, y se encuentran presentes secuencias en un factor dado de la levadura que no están presentes en su contraparte humana, y vice versa. La substitución operativa del mismo factor de transcripción, en sistemas de transc ipción de diferentes cepas de levadura, no se puede predecir. Esto es cierto a pesar de que exista un alto grado de identidad de las secuencias de aminoácidos entre algunos factores de transcripción de diferentes cepas de levaduras. Por ejemplo, no se puede predecir la capacidad de un factor de transcripción dado para soportar la transcripción, eficiente y exacta, en una cepa de levadura, heteróloga. Li et al. (1994, Science 263:805) 'analizó la inter cambiabi 1 idad de los factores de transc ipción del S . c e e vi si a e y del 5. po-n.be, in vítro, y reportan que muchos componentes del S. cerevi sl a e no pueden sustituir individualmente los factores de transcripción a, e, o ARN polimerasa II, del S_. pomb?j_ pero que combinaciones de estos componentes fueron efectivas. En un caso, la transcripción activa no pudo ser reconstituida cuando el TFIIB derivado del 5. c ere vi sl a e fue la única sustitución en un conjunto de factores con reducción o agotamiento del TFIIB, del 5. pombe . Una combinación de TFIIB-ARN polimerasa II, del S . cer-evi si a e , fue capaz de la sustitución, lo cual indicó que la interacción funcional de estos dos componentes no es únicamente importante, sino que también la actividad puede ser dependiente de los determinantes específicos de la especie que no pueden ser complementados por cualquier otro componente derivado de un organismo diferente- La impr edecibilidad en la realización de las sustituciones de un factor dado entre diferentes cepas de levadura es también evidente en que esas sustituciones no son recíprocas; es decir, las sustituciones de fracciones del 5. pombe en un sistema de t anscripción del S . cererisiae son menos efectivas que las sustituciones inversas (Li et al., supra) . La levadura Candida al bi can s difiere de la mayoría de las cepas de levaduras en que no usa el mismo código genético que el que usa la mayoría de los organismos, ya sea mamífero o levadura. Santos et al. (1995, Nucleic Acids Research, 23:1481) reporta que el codón CUG, que en el código universal se lee como una leucina, se descodifica como una serína en el Candi da . Por lo tanto, cualquier codón CUG que sea descodificado en el Candi da a l bi can s como una serina, sería des codi f icado como una leucina en el S . ce e vi si a e transformado. Cualquier gen que contenga un codón CUG sería traducido por lo tanto como secuencias diferentes de aminoácidos en el Candida albicans y en el 5. cerevisiae . Esa traducción errónea puede producir una proteína inactiva, dado que los aminoácidos serina y leucina tienen propiedades químicas marcadamente diferentes y se conoce que la serina es un residuo esencial en el sitio activo de algunas enzimas. El reemplazo de la leucina por serina en los residuos codificados CUG es un serio problema en el uso de muchos sistemas reporteros (por ejemplo, la Beta-galactosidasa, la Cloranf enicol acetil trans fe asa, el Flux) en el Candida albi cans . Experimentos previos han mostrado --que la traducción del CUG por el Candida, como una serina en lugar de leucina a menudo ha dado por resultado la producción de proteínas reporteras inactivas . Otro objetivo de la invención es proporcionar un ensayo de selección de la inhibición selectiva del crecimiento y/o viabilidad del Candida albicans . Aún otro objetivo de la invención es proporcionar un blanco molecular para la inhibición de la transcripción o iniciación de la transcripción, del Candida albicans .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención comprende un ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el TFIIB del Candida albicans . La invención también comprende un vector que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el TFIIB del Candi da albi cans , y una célula huésped transformada que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica "para el TFIIB del Candida albicans . La invención también " comprende un polipéptido recombinante que comprende al TFIIB del Candida albicans , y un fragmento del TFIIB del Candida albicans , y el fragmento está caracterizado porque inhibe la actividad biológica del TFIIB del Candida albicans en la iniciación de la transcripción, o previene el crecimiento del Candida albícans . La invención también comprende un método para producir TFIIB del Candida albicans , recombinante, el cual comprende cultivar una célula huésped transformada con un ácido nucleico que codifique para el TFIIB del Candida albicans bajo las -condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico que codifique para el TFIIB del Candida albicans, y aislar el TFIIB del Candida albicans . La invención también comprende un método -d-e clasificación selectiva para identificar un inhibidor del crecimiento del Candida albicans, el cual comprende detectar la inhibición de la transcripción del mARN en un ensayo de transcripción i n vi tro que comprende un patrón de ADN, ARN polimerasa II, TFIIB del Candida albicans , recombinante, y un inhibidor candidato, en donde la producción de un mARN transcripto, complementario del patrón de ADN, se presenta en la ausencia del inhibidor candidato. Preferentemente el ensayo incluirá también TBP del -Candida albicans. La invención también comprende un método de clasificación selectiva para identificar un inhibidor del crecimiento del Candida albicans , el cual comprende detectar, en la presencia de un inhibidor candidato, la inhibición de la formación de un complejo que comprenda TFIIB y TBP del Candida albicans , recombinante , del patrón de ADN, en donde en la ausencia del inhibidor candidato, ocurra la formación del complejo. La invención también comprende un método de clasificación selectiva para la identificación de un inhibidor del crecimiento del Candida albicans , el cual comprende detectar, en la presencia de un inhibidor candidato, la inhibición de la formación de un complejo que comprenda TFIIB del Candida albicans y TBP del Candida albicans , en donde, en la ausencia del inhibidor candidato, ocurra la formación del complejo. Preferentemente, el complejo incluirá un patrón de ADN. La invención también comprende un método de clasificación selectiva para la identificación del crecimiento del Candida albi cans , el cual comprende detectar, en la presencia de un inhibidor candidato, la inhibición de la formación de un complejo que comprenda ARN polimerasa II, TBP del Candi da albi ans , y TFIIB del Candida albicans, en donde, _ en la ausencia del inhibidor candidato, ocurra la formación del complejo. Preferentemente, el complejo puede incluir también un patrón de ADN; y ARN polimerasa del Candida albicans .

En los métodos de examen arriba mencionados, la detección puede realizarse en la presencia de una pluralidad de inhibidores candidatos. En los métodos de examen de la invención, que involucran el examen de una pluralidad de inhibidores candidatos, ~~ la pluralidad de inhibidores se puede examinar conjuntamente en un solo ensayo o individualmente mediante el uso de pasos de detección individual, simultánea, múltiple. La invención también comprende un método para prevenir el crecimiento del Candi da a lbi cans en cultivo, el cual comprende poner en contacto el cultivo con un inhibidor que inhiba selectivamente la actividad biológica del TFIIB del Candi da albí cans . La invención también comprende un método para prevenir el crecimiento del Candi da a lbi cans en un mamífero, el cual comprende poner en contacto el mamífero con un inhibidor que inhiba selectivamente la actividad biológica del TFIIB del Can di da albí cans . Como se usa en la presente, "inhibición" se refiere a una reducción en el parámetro medido, ya sea el crecimiento o viabilidad del Candida albicans , la transcripción mediada por el TFIIB del Candida albicans , o la formación de un complejo de transcripción del TFIIB del Candida albícans . La cantidad de esa reducción se mide con relación a un patrón (control) . Debido a las múltiples interacciones del TFIIB del Candida albicans en la iniciación de la transcripción, el producto blanco u objetivo para la detección varía con respecto al ensayo dé examen, particular, empleado. Tres productos de detección preferidos, presentados en esta descripción, son; a) mARN recientemente transcrito, b) un complejo de ADN-TFIIB, y c) un complejo de TBP-TFI IB-ARN polimerasa. "Reducción" se de-fine en la presente como una disminución de al menos 25% con relación a un control, preferentemente de al menos 50%, y en la forma más preferente de al menos 75%. Como se usa en la presente, "crecimiento" se refiere al patrón de crecimiento normal del Candida albicans , es decir, a_ un tiempo de duplicación celular de 60 a 90 minutos. "Viabilidad" se refiere a la capacidad del Candida albícans para sobrevivir en el cultivo por 48 horas.

"Actividad biológica" se refiere a la capacidad del TFIIB para formar un complejo de transcripción con un patrón de ADN u otras proteínas del complejo de transcripción, o para interactuar con otros componentes de la transcripción, a fin de pemitir la iniciación de la transcripción. "Patrón de ADN" se refiere a ADN de doble hebra y, en donde se indique, mediante- el ensayo de' enlazamiento particular, ADN de una sola hebra, al menos una longitud de 10 nucleótidos, que pueden estar super enrrollados negativamente, poseen una región promotora, y contiene una región de consenso TATA de la levadura, corriente arriba del promotor. Las plantillas de ADN útiles en la presente contienen preferentemente una secuencia TATA que está localizada de 40 a 120 o más pares de bases corriente arriba del sitio -de iniciación (distancia medida desde la primera T del elemento TATA hasta el sitio de más iniciación 5' ) . Un patrón de ADN especialmente eficiente, para el uso en los métodos de la invención que involucran la transcripción está desprovisto de residuos de guanosina, y por lo tanto se prefiere un cartucho "G-menos" o "G-inferior" (Sa dago y Roeder, 1985, PNAS 82:4394-4398) . "transcripto de mARM" se refiere a un transcripto de longitud completa, así como a transcriptos truncados, transcriptos de oligonucleótidos y ARN de dinucleó t idos . "Formación de un complejo" se refiere al enlazamiento del TFIIB a otros factores de transcripción (es decir, enlazamiento proteína-proteína) así como al enlazamiento del TFIIB a un patrón de ADN; ese enlazamiento será, por supuesto, una asociación no covalente. Otras características y "ventajas de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la descripción, a partir de las modalidades preferidas de la misma, de los dibujos, y de las reivindicaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 presenta las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del factor— de transcripción TBP del Candi da albi cans .

La figura 2 presenta secuencias de nucleótidos y aminoácidos del factor de transcripción TFIIB del Can di da albí can s .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en " el descubrimiento de una nueva proteína, el TFIIB del Candi da albi can s , y en el aislamiento del -ADN recombmante que codifica para el factor de transcripción TFIIB del Can di da albi can s . Debido a que el TFIIB es esencial para la viabilidad de la célula, se espera que un compuesto que bloquee la actividad biológica de la proteina tenga propiedades fungicidas. Por lo tanto, la invención se basa también en el desarrollo de ensayos para el examen de inhibidores del TFIIB.

Aislamiento y Caracterización de los Genes del TBP y TFIIB del Candi da albi cans Dada la impredi cibilidad con respecto a las sustituciones operativas de un factor de transcripción dado entre diferentes cepas de levaduras, no se puede asumir qué estrategias funcionarán para el clonado del gen que codifica un factor de transcripción dado, que estén basados en la función del factor, tal como la complementación genética. Otras estrategias de clonado, que no requieren de la complementación funcional, tales como aquéllas basadas en la homología en el nivel del ácido nucleico, pueden utilizarse en un intento por circunvenir un requerimiento para la función factor. Por ejemplo, la hibridación Southern de secuencias específicas para una biblioteca portada en E . col i y la amplificación PCR de regiones potencial y altamente homologas de un gen son dos estrategias que se han usado exitosamente para clonar genes homólogos de diferentes organismos. Para indagar la probabilidad de éxito de estos métodos o de métodos similares, se realizó un experimento de hibridación Southern en donde una sonda radiomarcada que contenía toda la secuencia de codificación del TBP (SPT15) del 5. cerevisi a e se hibridó en preparaciones de ADN genómico de S . c e evi si a e y Can di da albí can s que fueron digeridos con varias enzimas de restricción. A baja exactitud (0.2 X SSC, hibridación a temperatura ambiente) la sonda hibridó eficientemente, como se esperaba, a bandas de restricción en el material digerido del S . cerevisiae, pero no hibridó detectablemente a alguna banda de restricción del material digerido del Candida albicans . Las s e_cuencias del Saccharomyces se pudieron detectar en un autoradiógr afo con menos de 10 minutos de exposición. Por contraste, inclusive con una semana de exposición, no hubo hibridación detectable de la misma sonda para el ADN del Candida albi cans . La conclusión de estas observaciones es que es probable que la secuencia de ADN del gen del Candida albicans haya divergido en forma bastante significativa de la secuencia del S . cere vi siae , y por lo tanto no es probable que la hibridación Southern, las estrategias PCR u otros métodos de clonación basados en la hibridación de las secuencias de ácidos nucleicos complementarios, conduzcan a la clonación del homólogo del SPT15 del Candi da albi cans . La aproximación usada para clonar el homólogo del TFIIB del Candida albicans involucró la complementación genética de las cepas mutantes del 5. cerei-isiae. Se introdujo una biblioteca de secuencias genómicas del Candida albicans , en una cepa de ? . cere vi si a e que contenia un gen TFIIB mutado ( SUA7 ) . Esta cepa mutante fue capaz de crecer a 30°C, pero no fue viable a 37°C, debido a la mutación sensible a la temperatura, en el gen TFIIB. Siguiendo la transformación de la biblioteca en la cepa, las células se cultivaron a 37°C, y las colonias que crecieron a esta temperatura no permisible se estudiaron adicionalmente como portadoras potenciales de un homólogo de Candi da a l bi cansz del gen defectuoso. Los plásmidos se purificaron a partir de varios aislados que fueron viables a 37°C. Después de que los clones candidatos se aislaron por crecimiento a la temperatura no pe-en-i si va , se recuperó el plásmido de la biblioteca, de la célula, y se volvió a hacer el análisis para confirmar que las secuencias del C. al bi can s en el plásmido estuvieron sustituyendo el gen del S. c ere vi si a e . Los subclones de las secuencias del C. a l bí cans se construyeron a través de métodos estándar de clonación, y se ordenó, usando métodos estándar, la secuencia mínima del ADN del Can di da . La digestión de estos plásmidos reveló un fragmento común de ADN de aproximadamente 1.35 kb de longitud, que cuando se subclonó la pRS316 probó complementar múltiples cepas independientes SUA7 del S. cerevisiae . Este fragmento de ADN se ordenó en secuencia, y confirmó la homología de la secuencia del SUA7 del C. albicans con el SUA7 del S. cerevisiae . La secuencia de nucleótidos que codifican el TBP del Candida albicans y la secuencia predicha del aminoácido, de la proteina codificada, son como se presentan en la Figura 1 (No. ID. SEC.: 1 y 2) . La secuencia---- de nucleótidos que codifica el TFIIB del Candida albl cans y la secuencia predicha de aminoácidos de la proteína codificada se --presentan en la Figura 2 (No. ID. SEC.: 3 y 4) .

Métodos para el Examen de Inhibidores Potenciales del Crecimiento y/o Viabilidad del Candida albicans Debido a que el TFIIB es esencial para la iniciación de la transcripción del gen del TFIIB del Candida albicans , recombinante, y la proteina recombinante codificada por este gen, pueden utilizarse en ensayos de examen para inhibidores del crecimiento y viabilidad del Candida albicans . Los ensayos de clasificación selectiva de inhibidores del crecimiento y viabilidad del Candi da a lbi cans . Los ensayos de clasificación selectiva de esta invención detectan la inhibición de la iniciación de la transcripción mediada por el TFIIB del Candi da a l bí c an s , ya sea a través de la medición de la inhibición de la transcripción, la iniciación de la transcripción, o la formación del complejo de iniciación, o mediante el ensayo de la formación de un complejo de proteína/ADN o proteina/proteína . 10 EJEMPLO 1 Clasi icación Selectiva de Inhibidores d-e la Transcripción a) Componentes del Ensayo de la Transcripción. i* Se puede usar un ensayo de transcripción in vitro que consiste de los componentes mínimos necesarios para sintetizar un transcripto de mARN de un patrón de ADN, para clasificar o analizar la inhibición de la producción de mARN. Los elementos de ese ensayo consisten de, a) un patrón de ADN, b) ARN polimerasa II, c) TFIIB del Can di da albi can s , recombinante, y d) un TBP que es preferentemente el « TBP del Candi da a l bi can s . Para _ incrementar la eficiencia de la transcripción, se pueden incluir componentes adicionales -del complejo de transcripción, según se desee; por ejemplo, TFIIE, 5 TFIIF, TFIIH, etc. Parvin y Sharp (Cell 73, 533-540, 1993) han reconstituido la transcripción genética in vi tro con una reacción mínima que contiene un patrón de ADN, ARN polimerasa II, TFIIB, y TBP. Para la * 10 transcripción eficiente bajo condiciones mínimas, el patrón de ADN (a) se superenrrolla, y (b) posee una región promotora que contiene una región de consenso de TATA. Adicionalmente, Lúe et al. (Science 246, 661-664, 1989) han determinado que la transcripción puede ser determinada de la manera más eficiente con un patrón de ADN desprovisto de residuos de guanosina (un cartucho G-menos o G-inferior) . La dependencia del promotor se demuestra por la pérdida de la señal, cuando las secuencias del promotor carente de plásmidos se utilizan como un patrón. La iniciación correcta se demuestra por la producción de una banda con una movilidad que sea consistente con el tamaño del producto esperado sobre geles para electrofóresis a base de poliacrilamida desnaturalizante.

Como se mencionó anteriormente, el TFIIB del Candida albicans forma un complejo de iniciación de la transcripción con la ARN polimerasa II. Por lo tanto, se desea que un ensayo de transcripción i_n vi tro, de conformidad con la invención, contenga ARN polimerasa II. Aunque es posible realizar un ensayo de clasificación selectiva del inhibidor, usando ARN polimerasa II de una cepa de levadura, diferente al Candida albícans , por ejemplo el S. cerevisiae, lo más deseable es usar un ensayo homólogo en el cual los componentes del complejo de transcripción sean del Candida albicans . Un método para la purificación del ARN pol III del 5. cerevisiae se describe en Edwards et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2122-2126 (1990)) . Alternativamente, la ARN polimerasa II del Candi da albi cans , altamente purificada, se proporcionó como sigue. La actividad de la ARN polimerasa se midió en reacciones que contenían 50mM de Tris-Cl, pH 7.9 (4°C), 50 mM de (NH,)2S0«, 2.5 M de MnCl2, 0.1 mM de EDTA, 5 M de 'DTT, 100 µg/ml de BSA, 0.6 mM de ATP, CTP y GTP, 25 µM de UTP (2.5 µCi) [a-32P]UTP y 100 µg/ml de ADN de timo de ternero desnaturalizado con calor, en un volumen final de 50 µl . Las reacciones se incubaron por 60 minutos a 30°C y se finalizaron mediante la adición de 50 µl de ácido tricloroacético al 15% (p/v) . La radioactividad insoluble en ácidos se reunió por filtración a través de filtros de fibra de vidrio y se cuantificó mediante espectrofotometría de escintilación de líquidos. Una unidad de actividad de la ARN polimerasa cataliza la incorporación de 1 pmol de UTP en el material soluble en ácido, en 60 minutos, bajo las condiciones descritas anteriormente . El Can di da albi can s se obtuvo de^ la American Type Culture Collection (ATCC 10231) y se cultivó en medio YPD (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 13, Sup. 19 (1989)) a 30°C con agitación vigorosa y aereación. Todos los procedimientos se llevaron a cabo a 4 °C usando cultivos de 18 litros. Las células -se recolectaron por centrifugación (5000 rpm, 10 min., rotor Sorval H6000), se lavaron una vez con aproximadamente 1 litro de agua desionizada enfriada con hielo y se volvieron a reunir en una pelotilla como anteriormente. La pelotilla de células (200-300 g en peso húmedo) se volvió a suspender completamente en un volumen del Amortiguador A (50 mM de Tris-HCl, pH 7.9, 4°C, 10% de glicerol, lmM de EDTA, 5 mM de MgCl2, e inhibidor de proteasa) con un contenido de 300 mM de (NH()2S0( equivalente al volumen empacado de células (determinado en peso, asumiendo una densidad de 1 g/mol de células) . Las células que se volvieron a suspender se procesaron inmediatamente como se describe posteriormente, o se congelaron manipulándolas con pipeta en N_. líquido y almacenándolas a -80°C. Las células congeladas se descongelaron sobre hielo antes de continuar. Seguido de la adición de NP-40 hasta una concentración final de 0.1%, las células se rompieron por molienda con 1 ml de cuentas de vidrio lavadas con ácido/ml de suspensión de células (Sigma, 400-625 µM) usando 12 irrupciones de 30 segundos cada una, en un aparato para la ruptura por el choque con cuentas (BioSpec) . Las cuentas de vidrio se dejaron reposar y el sobrenadante se centrifugó a 30,000 x g durante 40 minutos . Se - adicionó (NH-iJíSO-i sólido, lentamente, hasta una concentración final de 0.4 g/ml de sobrenadante y el precipitado resultante se convirtió en una pelotilla mediante centrifugación a 100,000 x g, durante 30 minutos. La pelotilla se volvió a suspender con un volumen del Amortiguador A suficiente para producir una conductividad equivalente a la del Amortiguador A con un contenido de 75 iaM de (NH4)2S04. Después de la centrifugación de la resuspensión, a 10,000 x g durante 10 minutos, este 5 sobrenadante (aprox. 1-1.5 mg de proteina/ml) se cargó a una columna de 300 ml, DE-52' DEAE-celulósa, equilibrada con el Amortiguador A con un contenido de 75 mM de (NH4)2S04. Después del lavado con 5 volúmenes del de la columna, de Amortiguador A con 75 mM de (NH4)2S0 , y 5 volúmenes del de la columna, de Amortiguador A con 0.15 M de (NH4)2S04, la ARN polimerasa II se eluyó con 5 volúmenes del de la columna, de Amortiguador A con 0.4 M de (NH4)2S04. Se recolectaron fracciones que contenían el valor máximo de proteina, determinado por la absorbancia a 280 nm y se retiraron. La fracción retirada se dializó contra el Amortiguador A que contenia 20% de glicerol, durante 3 horas, a 4°C. El eluato de 0.4 M de (NH4)2S04, de la DEAE-celulosa (261 mg de proteína, 290 ml) se diluyó con suficiente Amortiguador A para disminuir la conductividad hasta el equivalente del Amortiguador A conteniendo 0.15 M de (NH4)2S04, se centrifugó a 10,000 x g, durante 10 minutos y el sobrenadante se cargó con un flujo de 30 ml/h sobre una columna de ml de DEAE-celulosa, equilibrada con Amortiguador A conteniendo 0.15 M de (NH )2S04, la columna se desarrolló con un gradiente lineal de 200 ml, de 0.15-0.4 M de (NH4)2S04 en el Amortiguador A, con un flujo de 45 ml/h. Se retiraron fracciones del único pico o valor máximo de la actividad de la ARN polimerasa, sensible a la a anitina, eluyendo alrededor de 0.22 M de (NH4)2S04 (21.1 mg de proteina, 45 ml) y se cargaron directamente sobre una columna de 5 ml de Heparina agarosa, equilibrada con el Amortiguador A el cual contenía 0. M de (NH4)2S04. La columna se lavó con 3 volúmenes del de la columna, de Amortiguador A que contenía 0.2 M de (NH4)2S04, y se desarrolló con un gradiente lineal de 80 ml de 0.2 - 0.6 M de (NH4)2S04 en el Amortiguador A. Las fracciones activas, que eluyeron a aproximadamente 0.42 M de (NH4)2S04, se retiraron (2.0 mg de proteína, 15 ml ) , se congelaron en alícuotas de 300 µl, en N2 líquido, y se almacenaron a -80°C, en donde la actividad fue estable por al menos 6 meses. La purificación de los factores de iniciación de las proteínas, usados en el ensayo, se realiza a través de métodos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, cromatografía en fosfocelulosa seguida de la filtración en gel), como se describe en (Nature 346, 387-390 (1990)) . Para la clasificación selectiva de la inhibición de la transcripción mediada por el TFIIB del Candida albicans , se reconstituye un ensayo de transcripción, usando TFIIB de Candida albicans , recombinante. El TFIIB del Candida albícans se expresa alli y se purifica a partir del E. coli, tal como se describe en Burato ski, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci: 90:5633. Se purifica ADN de plásmido, superenrollado , el cual contiene e-l promotor CYC1 unido al cartucho G-inferior descrito por Lúe et al. (Science 246, 661-664 (1989) ) , a través de métodos estándar para la purificación de ADN circular superenrrollado (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 13, Sup. 19 (1989)). Se adicionan de 10 a 100 ng de TFIIB del Candida albicans , de 10 a 100 ng de TBP del Candida albicans, de 10 a 100 ng de ARN polimerasa II del Candida albicans , y 1 µg de ADN de plásmido, a 50 µl de mezclas de reacción que contienen 50 mM de HEPES, pH 7.5, 10% de glicerol, 90 mM de glutamato de potasio, 0.75% de polietilenglicol (peso molecular de 3350) , 10 M de acetato de magnesio, 5 M de EGTA, 5 mM de DTT, 0.4 mM de ATP, 0.4 mM de CTP, µM [a-32P]UTP, 0.2 M de 3 ' -O-metil-GTP , y que contienen o carecen de una molécula inhibidora candidata. Las reacciones se incuban a 30°C por un tiempo de 30 a 60 minutos y la síntesis del ARN se detecta como se describe a continuación. b) Detección del ARN Transcrito. La detección del ARN recientemente transcrito se logra a través de métodos estándar (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 4.10, Sup. 24 (1989)) . Como un ejemplo, la síntesis del ARN se puede detectar como_ la incorporación de un nucledtido marcado radioactivamente o fluorescentemente, en productos del ARN de mayor peso molecular, determinado por uno de los siguientes métodos: 1) material marcado insoluble en ácido,, cuantificado a través del método apropiado (por ejemplo, recuento de la escintilación para precursores r dioactivos, fluorometria para precursores fluorescentes); 2) producto de reacción marcado que híbrida a oligonucleótidos complementarios al transcripto correctamente iniciado (es decir, el análisis del northern blot); 3) la presencia de una banda marcada con la movilidad apropiada detectada por autoradiograf ia , sobre geles para electrofóresis a base de poliac ilamida desnaturalizante: 4) cualquier otro método que discrimine mononucleótidos de polinucleótidos, en donde los polinucleótidos son el producto del ARN deseado. Esos métodos pueden utilizar una o 'más técnicas de biología molecular bien conocidas (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 13, Sup. 19 (1989)), por ejemplo; análisis por UV; sistemas de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad, filtración en nitrocelulosa, sistemas de b io tina/es treptavidina , inmunoafinidad) (Current Protocols en Molecular Biology, Vol. 2, 13, Sup. 19 (1989)); y cromatografía de líquidos de alta resolución. La inclusión de una molécula inhibidora que interfiera a la actividad biológica del TFIIB del Candi da albi cans , inhibe_ la transcripción.-- En este ensayo la inhibición se mide como una reducción en la cantidad del transcripto de mARN producido con relación a la cantidad del transcripto de mARN producido en la ausencia "del inhibidor (el control positivo) . Una disminución en la cantidad del transcripto del mARN es indicativo de un inhibidor. La determinación de niveles efectivos de inhibición del transcripto de mARN se describe a continuación".

EJEMPLO 2 Clasificación Selectiva de la Inhibición de- la Formación del Complejo de ADN-Protelna Se puede usar un ensayo de enlazamiento de ADN-proteína, que consista de los mínimos componentes necesarios para permitir que ocurra la asociación del TFIIB del Candida albicans-RON , para clasificar la inhibición de la formación del complejo ADN-TBP-TFI IB del Candida albicans, durante la inhibición de la transcripción. Los componentes de ese ensayo incluyen: a) un patrón de ADN, b) TFIIB del Candida albícans , recombinante, c) preferentemente del Candida albicans , ?_ opcionalmente d) un inhibido --del TFIIB del Candida albí cans , candidato. La inclusión de una molécula inhibidora que interfiera con la interacción entre el TFIIB_del Candida albicans y el patrón de ADN, inhibe la iniciación de la transcripción. El inhibidor puede interactuar directamente con la proteína TFIIB del Can di da al bi can s , y/o puede interactuar con el T3P y/o con el patrón de ADN en el sitio del enlazamiento TFIIB/TBP. En este ensayo la inhibición se mide como una reducción en la cantidad 5 del complejo ADN-TBP-TFII producida con relación a la cantidad del complejo ADN-TBP-TFI IB producida en la ausencia del inhibidor (el control positivo) . Una disminución en la cantidad del complejo de ADN-TBP- TFIIB es indicativa de un inhibidor. La determinación de niveles efectivos de la inhibición del ADN-TBP-TFIIB se describe a continuación. Un ensayo de enlazamiento del ADN se construye como sigue. Una cantidad de 10 a 100 ng de TFIIB del Candi da albi can s , expresado y purificado en E . Coli como se describió anteriormente, se incuba con 0.5 ng de oligonucleótido marcado (por ejemplo, marcado radioactivamente o fluorescentemente) el cual contiene un elemento TATA tal como el descrito por Buratowski et al. (Cell 56, 549-561 (1989) y una cantidad de 10 a 100 ng de TBP de Candi da a lbi can s , en reacciones que contienen de 10 a 20 mM de HEPES (o equivalente), pH 7.5-8.0, 5 mM de MgCl2, 12% de glicerol, 10 mM de ditiotreitol (DTT), 100 µg/ml de BSA, 5-20 µg/ml de poli (dG- 5 dG) : (dG-dC) y un inhibidor candidato de la formación del complejo. Las reacciones se incuban a 30°C por un tiempo de 30 a 60 minutos. La formación del complejo de ADN-TBP-TFIIB puede detectarse como la retención de ADN marcado (el marcado se detecta a través de una metodología apropiada tal como el recuento de la escintilación, para ADN radiomarcado, o fluorometría para ADN marcado fluorescentemente) utilizando métodos de afinidad conocidos para la inmovilización de proteínas (por ejemplo, biotina/estreptavidina, filtración en nitrocelulosa, cromatografía de afinidad, inmunoafinidad) . La no retención del ADN marcado, debida a la falla en la formación del complejo de TFIIB-TBP-ADN del Candi da albi can s es indicativa de un inhibidor efectivo. La formación del complejo también se puede detectar como la retención del TFIIB del Candi da a l bi ca n s marcado (por ejemplo, radioactivamente, fluorescentemente! utilizado métodos conocidos para inmovilizar el ADN. Lá no retención del TFIIB del Candi da albi cans marcado, debido a la falla en la formación del complejo de TFIIB-TBP-ADN del Can di da al bi c an s , es indicativa de un inhibidor efectivo. Los dos métodos precedentes son convenientes para aplicaciones de ? análisis de bibliotecas con compuestos químicos en grandes volúmenes, tales como las que se usan comúnmente en el descubrimiento de fármacos. Un tercer ejemplo para detectar la 5 formación del complejo de ADN/proteina involucra la detección de un desplazamiento en la movilidad electroforética del ADN marcado en geles de poliacrilamida al 4% que contienen 5% (v/v) de glicerol, 25 mM de Tris, 100 mM de glicina, lmM de # 10 EDTA, 5 mM de MgCl2, pH 8.3, en la presencia del TFIIB y TBP del Candi da albí cans . La posición del oligonucleótido marcado se detecta a través de métodos apropiados (por ejemplo, autoradiografí a, para un oligonucleótido radioactivo) . La ausencia o desviación del desplazamiento esperado en la movilidad, debido a la formación del complejo de ADN-TFIIB del Candi da albi can s , es indicativo de un inhibidor efectivo. Finalmente, se pueden usar otros métodos para detectar o separar "complejos de ADN-proteína, incluyendo el análisis de reticulación por UV, cromatografía de líquidos de alta resolución, tecnología de exhibición de fagos (Patente Norteamericana No. 5,403,484. Virus que Expresan el Enlazamiento Quimérico de Proteínas), y resonancia de plasmón superficial (Biacore, Pharmacia Biosensor, North America) como se describe posteriormente .

EJEMPLO 3 Clasificación Selectiva de la Inhibición de- la Formación del Complejo de Proteina-Proteina -Se puede usar un ensayo de enlazamiento protelna-proteína que consista de los mínimos componentes necesarios para permitir que ocurra el enlazamiento del TBP del Candida albicans-TFIIB del Candi da a Ib i cans , _ para clasificar selectivamente la inhibición de la formación del complejo TBP del Candida albicans-TFII del Candida albicans , durante la iniciación de la transcripción. Los elementos de " un ensayo como ése consisten de; a) TFIIB del Candida albicans , recombinante, b) TBP, preferentemente un TBP del Candida albicans , recombmante, y opcionalmente c) un inhibidor de enlazamlento , candidato. La inclusión de una molécula inhibidora que interfiera con la interacción entre el TBP del Candida albicans y el TFIIB del Candida alibi cans inhibe la iniciación de la transcripción. El inhibidor puede interactuar con la proteína TBP o TFIIB del Candida albicans e induce así a un cambio configuracional que previene el enlazamiento, o puede inhibir directamente la interacción de las proteínas TFIIB y TBP del Candida albicans . En este ensayo, la inhibición se mide como una reducción en la cantidad producida del complejo TBP-TFIIB del Candida albicans , con relación a la cantidad producida del complejo TBP-TFIIB del Candida albi cans en la ausencia del inhibidor (el control positivo) . Una disminución en la cantidad del complejo TFIIB-TBP es indicativa de un inhibidor. La determinación de los niveles efectivos de inhibición del enlazamiento TBP-TFIIB del Candi da albi cans se describe a continuación. Un ensayo para la formación del complejo TBP-TFIIB del Candida albicans es como sigue. Se expresan, de 10 a 100 ng de TFIIB del Candida albicans y de 10 a 100 ng de TBP del Candida albicans , en E . Coli, y se purifican en el mismo, como se describió anteriormente, y se adicionan a reacciones que contienen de 10 a 20 M de HEPES (o equivalente), pH 7.5-8.0, 5 M de ? MgCl2, 12 de glicerol, 10 mM "de di t io tr elto 1 (DTT) 100 µg/ml de BSA, y un inhibidor candidato. Luego se incuba la mezcla a 30-°C durante un tiempo de 30 a 60 minutos. 5 La formación de un complejo que comprenda TBP del Candida albicans y TFIIB del Candida albicans se puede detectar a través _del desplazamiento de la movilidad electro fo ética del TBP o TFIIB radiomarcado (por ejemplo, # 10 radiactivo o fluorescente) en geles de poliacrilamida que contengan 5% (v/v) de glicerol, 25 mM de Tris, 100 M de glicerina, 1 mM de EDTA, 5 mM de MgCl2, pH 8.3, en la presencia del acompañante no marcado. La posición del acompañante marcado se detecta a través de métodos apropiados (por ejemplo, la t autoradiograf ía para el oligonucleótido radioactivo) . La ausencia o derivación del desplazamiento esperado de la movilidad debido a la formación del complejo TFIIB-TBP del Candida albicans es indicativa de un inhibidor efectivo. La formación de un complejo que comprenda TBP del Candida albicans y TFIIB -del Candida albicans puede detectarse como la retención del TBP marcado, utilizando métodos de afinidad conocidos para la inmovilización de la proteína TFIIB del Can di da albi cans (por ejemplo, bio tina/es trept avidina, filtración con nitrocelulosa, cromatografía de afinidad, inmunoafinidad) . La falla en la formación del complejo de TFIIB-TBP del Candi da a lbi can s es indicativa de la inhibición, y está indicada por la no retención del TBP marcado. Alternativamente, el elemento inmovilizado puede ser el TBP del Can di da a l bi can s y el acompañante marcado el TFIIB del Ca n di da a l bí can s . En el ejemplo anterior se puede conferir una señal más fuerte en la presencia, tanto del TBP como del TFIIB y, además, un patrón de ADN que contenga un elemento TATA. El complejo se cuantifica entonces mediante autor adiogra fía , tecnología de formación de imágenes con fósforo, o recuento de es cinti laciones para factores marcados radioacti amente, flúorometría para factores marcados fluorescentemente, luminometría para factores marcados con ligandos que se detectan usando metodologías de sondeo quimioluminiscente o fosforescente, u otros métodos de detección similares, o materiales marcados como se describió anteriormente, que son estándares en la técnica. Se pueden usar otros métodos para detectar o separar complejos de proteína-proteína, los cuales incluyen el análisis de reticulación por UV, cromatografía de líquidos de --alta resolución, tecnología de exhibición de fagos, y resonancia de plasmón superficial, tal como se describió en la presente .

EJEMPLO 4 Ensayo para la Formación del Complejo de TBP-TFIIB-ARN Polimerasa I I -ADN Se conoce que la formación del complejo de TBP, TFIIB, ARN polimerasa II, ADN, está notablemente estimulada por la adición de otro factor, el TFIIF. Los datos previos indican que el TFIIF del S . c ere vi si a e puede funcionar en especies relacionadas tan distantemente como el Sc iz osa ccharomyces pombe y humanos, lo cual sugiere -fuertemente que este factor puede reemplazar funcionalmente su Can di da a lbí can s homólogo. Por consiguiente este factor se purifica a partir del 5. cerevisiae a través de métodos publicados (Sayre, 1992, J. Biol. Chem. 267:23383) y se usa para reconstituir la formación de un complejo que contiene el TBP, el TFIIB, y la ARN polimerasa II, del Candi da 5 a lbí a n e , y un promotor que contiene ADN tal como el que se describe para la reconstitución del complejo TFI IB-TBP-ADN . La formación del complejo se lleva a cabo en reacciones que contienen, por ejemplo, de 10 a 100 ng de TBP del Ca n di da al bi cans , de 10 a 100 ng de TFIIB del Candi da albi can s , de 10 a 100 ng de ARN polimerasa II del Candi da albi can s , de 10 a 100 ng del TFIIF del 5. c ere vi sí a e , 0.5 g de oligonucleótido que contiene el elemento TATA de doble hebra (el mismo que se usa para el ensayo del complejo TFI IB-TBP-ADN) , de 10 a 20 mM de HEPES (o equivalente), pH de 7.5 a 8.0, 5 mM de MgCl2, 12% de glicerol, 10 mM de ditiotreitol (DTT), 100 µg/ml de BSA, de 5 a 20 µg/ml de poli (dG-dC) ; (dG-dC) y compuesto (s) que se van a analizar respecto a su actividad inhibitoria. Después de la incubación a 30°C durante un tiempo de 30 a 60 minutos, los complejos se detectan a través de los métodos descritos anteriormente para el complejo TBP-TFI IB-ADN. El complejo de TBP-TFIIB-ARN polimerasa I I -ADN tiene una movilidad electroforética menor que la del complejo de TBP-TFI IB-ADN identificado a través del uso del método electrof oré tico . Además, la formación del complejo puede detectarse como una-retención, dependiente del TBP y TFIIB, de la actividad de la ARN polimerasa II (medida mediante la incorpo ación de precursores núcleo tidico s marcados, al producto insoluble en ácidos, usando el ensayo para la actividad de la ARN polimerasa descrito en el protocolo para la purificación de la ARN polimerasa II mencionado anteriormente) en una matriz con elemento TATA enlazado y que contiene ADN. La IC50 de los compuestos inhibitorios será determinada mediante titulación en reacciones reconstituidas, como se describió anteriormente. La IC_¡0 de estos compuestos contra reacciones reconstituidas con TBP, TFIIB y ARN polímerasa II, humanos, se determinará también a través del mismo método- La ARN polimerasa II y el TFIIB, humanos, se purifican como se describió previamente (Flores et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:5629-5634; Reinberg et al., J. Biol. Chem 262:3310-3321) . Los compuestos cuyas IC5o, contra reacciones que contienen factores del Candi da albí cans , es menor o igual que su ICB0 contra reacciones reconstituidas con factores humanos, se analizarán respecto a su capacidad para inhibir el crecimiento del Can di da a l bi ca n s , como se describirá posteriormente.

EJEMPLO 5 Clasificación Selectiva del Inhibidor mediante Exhibición de Fagos Además de las técnicas estándar mencionadas anteriormente, se pueden utilizar otras tecnologías para la identificación molecular, en la identificación de las moléculas inhibidoras. Una de estas tecnologías es la tecnología de exhibición de fagos (Patente Norteamericana No. 5,403,484. Virus que Expresan Proteínas de Enlazamiento Quimérico) . La exhibición de fagos permite la identificación de una proteína de enlazamiento contra un blanco seleccionado. La exhibición de fagos es un protocolo de clasificación selectiva molecular que utiliza bacteriófagos recombinantes. La tecnología involucra transformar bateriófagos con un gen que codifique un ligando apropiado (ep este caso, un inhibidor candidato) capaz de enlazarse a la molécula blanco d-e interés. Para los propósitos de esta descripción, la molécula blanco puede ser el TFIIB del Can di da al bi c an s , o un complejo ADN-proteína o proteína-proteína formado usando TBP y/o TFIIB, como se describe en la presente. El bacteriófago transformado (que preferentemente está sujetado a un soporte sólido) expresa el inhibidor candidato y lo exhibe sobre su recubrimiento de fago. Las células o virus que portan al inhibidor candidato, que reconocen la molécula blanco," se aislan y amplifican. Luego se caracterizan los inhibidores exitosos. La tecnología de exhibición de fagos tiene ventajas sobre las tecnologías estándar de clasificación selectiva con ligandos de afinidad. La superficie del fago exhibe el ligando de microproteína en una disposición tridimensional, que se asemeja más cercanamente a su configuración natural. Esto permite - un enlazamiento más específico y de mayor afinidad para propósitos de clasificación selectiva.

EJEMPLO 6 Análisis de Interacción Bioespeci f ica Una segunda tecnología de clasificación selectiva, relativamente nueva, que se puede aplicar a los ensayos de clasi icación selectiva de inhibidores, es el análisis de interacción bioespecífica (BIAcore, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) . Esta tecnología la describe con detalle Jonsson et al. (Biotechniques 11:5, 620-627 (1991) ) . El análisis de interacción bioespecífica utiliza resonancia de plas ón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) para inspeccionar la adsorción de complejos biomoleculares sobre una pastilla de circuitos integrados detectora. La SPR mide los cambios en el índice de refracción de una luz polarizada dirigida a la superficie de la pastilla detectora. Los ligandos específicos (es decir, -los inhibidores candidatos) capaces de enlazarse a la molécula blanco de interés (es decir, el TFIIB del Can di da a l bi ca n s o un complejo de proteína-proteína "o de proteína-ADN, que contiene TFIIB) son inmovilizados en la pastilla detectora. En la presencia de la molécula blanco se presenta el enlazamiento específico al ligando inmo ilizado. El incipiente complejo de ligando-molécula blanco causa un cambio en el índice de refracción de la luz polarizada y es detectado por un arreglo de diodos. El análisis de interacción bioespeci f ica proporciona las ventajas de; 1) permitir estudios sin necesidad de marcado, de la formación de- un complejo molecular; 2) estudiar las interacciones moleculares en tiempo real cuando el ensayo se hace pasar por la pastilla detectora; 3) detectar las concentr ciones superficiales por abajo de 10 pg/mm2; detectando las interacciones entre dos o más moléculas; y 4) se completamente automatizado (Biotechniques 11:5, 620-627 (1991) ) .

EJEMPLO 7 Clasificación Selectiva en Grandes Volúmenes, de Inhibidores Potenciales De conformidad con la invención se contempla que los métodos de clasificación selectiva descritos en la presente abarcan las clasificación selectiva de múltiples muestras de manera simultánea, a lo cual también se hace referencia en la presente como clasificación selectiva "en grandes volúmenes". Por ejemplo, en la clasificación selectiva en grandes volúmenes se pueden clasificación selectiva, desde varios centenares hasta varios miles de inhibidores candidatos, en un solo ensayo. Un ejemplo de ensayo de clasificación selectiva en grandes volúmenes, de conformidad con la invención, es como sigue . Se genera una proteína de fusión de proteína A 8pA)-TFIIB del Can di da a l bi can s , insertando la secuencia de codificación del TFIIB en la estructura corriente abajo de la secuencia de codificación de la pA del plasmipRIT2T (Pharmacia Biotech) . Se induce el constructo de fusión y la proteína recombinante resultante se extrae y purifica de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. Este procedimiento también se puede llevar a cabo para la preparación de una proteína de fusión de pA-TBP del Candi da al bi cans excepto que la secuencia de codificación de corriente abajo es la de la proteína del TBP; todos los otros pasos permanecerían tal cual. Una placa Dynatech Microlite, de 2 microlitros, o placa equivalente de gran capacidad para el enlazamiento de proteínas, se recubre con 1 µg/pozo de IgG humano de 300 µl de 3.33 µg/ml de IgG humano (Sigma) en amortiguador para recubrimientos (carbonato de sodio 0.2 M, pH 9.4) en el pozo, por un tiempo de 4 a 12 horas, a una temperatura de 4°C. Luego se decanta el amortiguador para ecubrimientos y los pozos se lavan cinco veces con 300 µl de PBS. Se adicionan 300 µl de amortiguador de bloqueo (amortiguador de bloqueo SuperBlo kMR; Pierce) que contienen pA-TFIIB o pA-TFIIB, a razón de 3.33 µg/ml, y la placa se incuba durante 4 horas o más, a 4'C-las placas se pueden almacenar en esta forma a 4°C hasta que estén listas para su uso- Cuando están listas las placas se lavan cinco veces con 300µ"l de PBS. El compuesto de análisis, a una concentración final de 20 a 200 µM y TFIIB o TBP marcado (es decir, proteína que no es de fusión), siempre que no se adicionen durante el paso de recubrimiento, y de 10 a 1000 fmol de ADN que contenga una secuencia TATA, se suspenden en amortiguador HEG el cual contiene 200 µg/ml de BSA en un volumen total de 150 µl y se adicionan, y la reaccidn se incuba a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 minutos- Luego se lava la placa cinco veces con PBS usando un lavador de placas Dynatech o un dispositivo equivalente. La proteína marcada y enlazada se cuantifica adicionando 250" µl de Microscint (Packard) por pozo y se hace el recuento en un espectrofotómetro de escint i laciones , compatible con la placa de microtitulación. Como una alternativa, la fusión de la proteina A y la segunda proteína que no es de fusión, se pueden incubar en la presencia del compuesto de prueba, en placas de microtitulación de polipropileno, bajo el mismo amortiguador y bajo las mismas condiciones de incubación descritas anteriormente. Luego se transfiere la mezcla de reacción hacia los pozos de una placa de microtitulación recubierta con IgG humano (el cual se prepara como se describió ante iormente, y se almacena en el amortiguador de bloqueo y se lava cinco veces con 300 µl de PBS inmediatamente antes de su uso) y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. La retención de la proteína radioactiva se 9 cuantifica como anteriormente. La interacción del TBP y del TFIIB, la cual se mide como la retención de la radioacti idad en la placa, es dependiente del 5 IgG humano que recubre la placa, y del TBP o TFIIB del Candi da albi cans tipo silvestre, uno de los cuales debe fusionarse al pA. Los inhibidores candidatos o extractos que inhiben la retención ^| de la radioactividad por más del 30% -son identificados, y la actividad inhibitoria se purifica adicionalmente si es necesario . "luego se identifican los inhibidores, como se describió anteriormente, respecto a su capacidad para inhibir la transcripción dependiente del TFIIB del Can di da aljbi ca n s , en un sistema _ de transcripción in ví t ro tal como el que se JB describió en la presente, y también se pueden analizar respecto a su capacidad para inhibir el crecimiento del Candi da a l bi can s . 20 Otros sistemas de proteínas de fusión o modificadas, que se contemplan, incluyen, aunque no están limitados a, la gluta t iona-S- transferasa, la proteína de enlazamiento a la maltosa, la hemaglutinina del virus de la influenza; el FLAGM y las fusiones de la hexahist idina al TBP del Candi da a l bi can s o_ al TFIIB del Can di da albi cans , que se preparan, expresan y purifican a través de métodos publicados, o TBP o TFIIB del Cán di da a lbi can s tratados con biotina, que se preparan usando precursores reactivos de la biotina que se encuentran disponibles comercialmente. La proteína de fusión o modificada, purificada, se inmoviliza en una placa de microtitul ción que contiene el ligando apropiado para cada proteína de fusión (por ejemplo, glutationa, amilosa, anticuerpo CA157, etc., respectivamente), el ensayo se lleva a cabo y los resultados se evalúan esencialmente en la misma manera que se describió anteriormente.

EJEMPLO Inhibidores Candidatos Un "inhibidor candidato", tal como se usa en la presente, es cualquier compuesto con un potencial para inhibir la iniciación de la transcripción mediada por el TFIIB del Candi da a lbi can s , o para inhibir la formación de un complejo. Un inhibidor candidato se analiza en un intervalo de concentraciones que depende del peso molecular de la molécula y del tipo de ensayo. Por ejemplo, para la inhibición de la formación del complejo de proteína/proteína o de proteína/ADN, se pueden analizar pequeñas moléculas (como se define posteriormente) en un intervalo de concentraciones de lpg-100 µg/ml, preferentemente a aproximadamente 100 pg - 20 µg/ml; las moléculas grandes, por ejemplo, péptidos, se pueden analizar en el intervalo de 10 ng - 100 µg/ml, preferentemente 100 ng - 10 µg/ml . Los inhibidores del crecimiento o viabilidad del Candi da al bi can s pueden hacer blanco en el novedoso factor pde transcripción descrito en la presente, el TFIIB, o pueden hacer blanco en una proteína o ácido nucleico que interactúe con el novedoso factor de transcripción, para prevenir la " interacción biológica natural que ocurre i vi vo y_ conduce a la iniciación de la transcripción en el Candida. Así, un inhibidor identificado como se describe en la presente poseerá dos propiedades: 1) a cierta concentración inhibirá el crecimiento o <?, viabilidad del Can di da a lbi cans ; y 2) al a misma concentración, no afectará significativamente el crecimiento de las células de un mamífero, particularmente de humanos. 5 Los candidatos inhibidores incluirán inhibidores peptídicos y polipeptídicos que tienen una secuencia de aminoácidos basada en las secuencias del novedoso TFIIB des cr ito aquí. Por t ejemplo, un fragmento de TFIIB puede actuar como un inhibidor competitivo con respecto al enlazamiento del TFIIB a otras proteínas involucradas en la transcripción del Candida, por ejemplo, la ARN polimerasa II, el TBP, o con respecto al enlazamiento del complejo de transcripción al patrón de ADN. Uno de esos fragmentos candidatos es un fragmento de TFIIB JjÉ que contiene un motivo (secuencia) clásico de dedo de zinc. Este fragmento se extiende por una región de 35 aminoácidos definida por los residuos 22-46 de la secuencia del TFIIB. Los compuestos inhibidores candidatos de bibliotecas grandes de compuestos sintéticos O- naturales pueden se clasificados selectivamente. Comúnmente se usan numerosos medios para " la síntesis directa y aleatoria de sacáridos, péptidos, y compuestos basados en ácidos nucleicos. Las librerías de compuestos sintéticos se encuentran disponibles come cial ente en cierto número de empresas las cuales incluyen la Maybridge Chemical Co . (Trevillet, Corn all, UK), Comgenex (Princeton, NJ) , Brandon Associates (Merri ack, NH), y Microsource (New Milford, CT) . Una rara biblioteca se encuentra disponible en Aldrich (Milwaukee, Wl) . Las librerías combinatorias se encuentran disponibles y pueden ser preparadas. Alternati amente, las librerías de compuestos naturales, en la forma de extractos de bacterias, hongos, plantas y animales, se encuentran disponibles, por ejemplo, en Pan Laboratories (Bothell, WA) o MycoSearch (NC), o se pueden producir fácilmente. Adicional ente, las bibliotecas y compuestos, producidos en forma natural y sintética se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos, convencionales. Se pueden encontrar compuestos útiles en numerosas clases químicas, aunque típicamente son compuestos" orgánicos, y preferentemente pequeños compuestos orgánicos. Los compuestos orgánicos pequeños tienen un peso molecular mayor de 50 pero menor de aproximadamente 2,500 daltons, preferentemente menor que aproximadamente 750, en forma más preferente menor que aproximadamente 350 daltons. Las clases ejemplares incluyen los compuestos he ter ocícl icios , péptidos, sacáridos, esteroides, y similares. Los compuestos se pueden modificar para aumentar su eficacia, su estabilidad, su compatibilidad farmacéutica, y propiedades similares.- La identificación estructural de un agente se puede utilizar para identificar, generar, o clasficar selectivamente agentes adicionales. Por ejemplo, en donde se identifican los agentes peptídicos, éstos se pueden modificar en una variedad de formas para aumentar su estabilidad, tal como el uso de un aminoácido no natural, tal como un D-aminoácido, particularmente la D-alanina, funciona 1 i zando la terminación amino o carboxílico, por ejemplo para el grupo amino, la acilacidn o la alquilación, y para el grupo carboxilo, la esterificación o la amidi ficacidn, o similares. Otros métodos -de estabilización pueden incluir la encapsulación, por ejemplo, en liposomas, etc.

EJEMPLO 9 . - Medición de la inhibición efectiva La cantidad de la inhibición realizada por un inhibidor candidato se cuantifica usando la siguiente fórmula la cual describe reacciones reconstituidas con una porción marcada radioactivamente: Positivo - CPMMußßtra) Inhibición Porcentual = X 100 (CPMcontrol Positivo) en donde CPMcontroi p siti o es el promedio del cpm en complejos o en moléculas de ARN formadas en reacciones que carecen del inhibidor candidato, y CPMMu«st-._- es el cpm en complejos formados en reacciones que contienen, ya sea el TFIIB del Candida albícans o el TFIIB humano (expresado en E. colí y purificado a partir del mismo, usando los clones recombinantes existentes (Peterson et al., Science 248, 1625-1630, 1990; Kao et al., Science 248, 1646-1650, 1990; Hoff an, "et al., Nature 346, 387-390, 1990, y se analizaron como se describió anteriormente) y su IC50, con respecto al TFIIB humano y del Candida albicans , determinada a partir de gráficas de la concentración del compuesto vs . el % de inhibición. La ICBo está definida como la concentración que da por resultado una inhibición del 50%. Los inhibidores candidatos para los cuales la IC5o, contra reacciones que contienen el TFIIB del Candida albicans, es menor o igual que 1/5 de la IC_o contra reacciones que contienen TFIIB humano, se analizan adicionalmente respecto a su capacidad para inhibir el crecimiento del Candida albicans en cultivos, como se describe posteriormente.

EJEMPLO 10 Medición de la inhibición del crecimiento -del Candida albícans en cultivos- Una vez que se identifica el inhibidor en uno o más de los ensayos de enlazamiento o transcripción descritos aquí, puede desearse determinar el efecto del inhibidor en el crecimiento y/o viabilidad del Candida albicans en cultivos. Se analiza la capacidad de un inhibidor candidato para inhibir el crecimiento de las células del Ca n di da a l bí can s en cultivos, como sigue. Los métodos para realizar las pruebas de la inhibición del crecimiento en cultivos son bien conocidos en la técnica. Uno de esos procedimientos se basa en el método NCCLS M27P (The National Committee for Clinical Laboratory Standards, Método de Referencia para la Prueba de Susceptibilidad Antifúngica, de Levaduras, con Dilución del Caldo de Cultivo; norma propuesta, 1992), como sigue. Se preparan diluciones en serie (pasos de dos a tres veces iniciando de una concentración máxima de 100 a 200 µg/ml) del inhibidor candidato, usando medio RPMI-1640 como diluyente y se adiciona, una alicuota de 100 µl de cada dilución, a cada una de las placas de microtitulación de poliestireno, "de 96 pozos- Se suspenden cinco colonias de Can di da a l bi can s , tomadas de una placa con Dextrosa Sabouraud Agar inoculada de 14 a 20 horas previamente con la cepa de Can di da a l bi c an s de análisis (Número de Catálogo 10231 del Catálogo de Levaduras del American Type Culture Collection), se suspenden con medio RAMI-1640 de tal manera que la densidad de células sea de 10,000 a 30,000 células/ml. Se adicionan 100 µl de la suspensión de células a cada uno de los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos que contiene el inhibidor candidato diluido y el medio de control. Los cultivos se mezclan con agitación y se incuban a 35°C por 48 horas sin agitación, después de lo cual se verifica el crecimiento celular por inspección visual por la formación de turbidez - y/o de colonias micélicas. La concentración mínima del inhibidor candidato a la cual no se detecta crecimiento celular por este método se define como la concentración inhibitoria mínima (CIM) para ese compuesto. Ejemplos de las CIM para compuestos antifúngicos conocidos, obtenidos al usar esta técnica, son de 0.125 a 0.5 µg/ml para el fluconazol y de 0.25 a 1.0 µg/ml para la anfotericina B (The National Committee for Clinical Laborato y Standards, Método de Referencia para la Prueba de Susceptibilidad Antifúngica, de Levaduras, con Dilución del Caldo de Cultivo; norma propuesta, 1992) . Un inhibidor identificado por los métodos descritos aqui tendrá una CIM que es equivalente o menor que las CIM para el fluconazol o para la anfotericina B.

EJEMPLO 11 Contraclasificación selectiva de la Inhibición de la Transcripción, Usando TFIIB Humano Un compuesto identificado como un inhibidor del Can di da a lbi can s , de conformidad con uno o más de los ensayos descritos en" la presente se puede analizar en forma adicional con el fin de determinar su efecto en el organismo huésped. En el desarrollo de compuestos antifúngicos útiles para la terapia en humanos, es deseable que esos compuestos actúen como agentes efectivos en la inhibición de la viabilidad del patógeno fúngico y que a la vez no inhiban significativamente los sistemas celulares humanos. Específicamente, los inhibidores del Candi da al bi can s identificados en cualesquiera de los ensayos descritos anteriormente, se pueden someter a una clasificación selectiva inversa para la inhibición del TFIIB humano. El TFIIB humano recombinante se puede obtener a partir de fuentes existentes y purificarse a través de métodos conocidos (por ejemplo, ver Peterson et al., Kao et al., y Hoffman et al., supra) y se puede poner- en contacto con el inhibidor candidato en ensayos tales como los que se describieron anteriormente usando un sistema humano. La efectividad de un inhibidor del TFIIB del Can di da albi can s , como agente terapéutico humano, se determina como una que exhibe un bajo nivel de inhibición contra el TFIIB humano, en relación al nivel de inhibición con respecto al TFIIB del Ca ndi da a l bi can s . Por ejemplo, se prefiere que la cantidad de inhibición provocada por un inhibidor del TFIIB humano dado, en un sistema humano, no sea mayor que el 20% con respecto al a cantidad de inhibición del TFIIB del Can di da albi can s , en un sistema del Can di da , cuando se analiza en cualesquiera de los ensayos descritos anteriormente .

Dosificación y Formulaciones Farmacéuticas Para usos terapéuticos, los inhibidores identificados como se describió en la presente, se pueden administrar como una formulación farmacéuticamente compatible/biológicamente compatible. Por ejemplo, en la forma de una crema, ungüento, loción o rociador, para el uso tópico, o en la forma de una solución fisiológica, tal como una solución salina, para la administración interna. La cantidad de inhibidor administrada se determinará de acuerdo al grado de infección patogénica y dependiendo de si la infección es sistémica o localizada, y se encontrará típicamente en el intervalo desde aproximadamente 1 µg hasta 100 mg/kg de peso corporal. En donde el inhibidor es un péptido o un polipéptido, se administrará en el intervalo desde aproximadamente 100 hasta 500 µg/ml por dosis. De conformidad con la invención se contempla una dosis única del inhibidor o dosis múltiples del mismo, diariamente, semanalmente o inte mi tentemente. La ruta de administración será escogida por el médico, y puede ser tópica, oral, transdérmica, nasal, rectal, intravenosa, intramuscular, o subcutánea.

Depósito conforme al Tratado de Budapest El 15 de Septiembre de 1995 se depositó, en un centro internacional de depósito, el A.T.C.C., Rockville, MD, bajo el número de acceso 69900, una E . c o l i transformada con un plásmido que cotiene el gen que codifica el TBP del Can di da a lbi ca n s . El 15 de Septiembre de 1995. se depositó, en un centro internacional de depósito, ' el A.T.C.C., Rockville, MD, bajo el número de acceso 69899, una E . col i transformada con un plásmido que contiene el gen que codifica el TFIIB del Can di da al bí can s . Los Números 69900 y 69889 del A.T.C.C. estarán disponibles al público al concederse una patente que describa los números de acceso junto con la invención descrita en la presente. Los depósitos fueron realizados bajo el Tratado de Budapest, y se encontrarán disponibles después de la vida que se puede exigir para la patente para la cual se realizó el depósito, y se mantendrá por un periodo de al menos 30 años a partir de la fecha del depósito y al menos 5 años después de que la A.T.C.C. reciba la solicitud más reciente de suministro de una muestra del depósito. Deberá entenderse que la disponibilidad de estos depósitos no constituye una licencia para llevar a la práctica la invención en cuestión en derogación de los derechos de patente concedidos para la invención en cuestión por acción gubernamental .

OTRAS MODALIDADES Los ejemplos precedentes demuestran los experimentos realizados y contemplados por los inventores de la presente, al realizar y llevar a "cabo la invención. Se cree que estos experimentos incluyen una descripción de las técnicas que sirven tanto para valorar la técnica de llevar a la práctica la invención como para demostrar su utilidad. Los experimentados en la técnica podrán apreciar que las técnicas y modalidades descritas en la presente son modalidades preferidas solo que, en general, se pueden emplear numerosos métodos y técnicas equivalentes para conseguir el mismo resultado. Todas las referencias identificadas ante iormente en la presente se encuentran incorporadas expresamente en la misma, como referencia, hasta el grado de lo que describen, y lo divulgado proporciona una base para posibilitar las composiciones y/o métodos que puedan ser importantes para llevar al a práctica uno o más modalidades de la presente invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por ~ la solicitante para llevar a la práctica la citada invención," es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: (i) SOLICITANTE: SCRIPTGEN PHARMACEUTICALS, INC. (Ü) TITULO DE LA INVENCIÓN: NOVEDOSO FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN TFIIB DEL CANDIDA ALBICANS... (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: ARBY £ ARBY P.C. (B) CALLE: 805 Third Avenue (C) CIUDAD: New York (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: Estados Unidos de América (F) CP: 10022-7513 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: Compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ Versión 1.5 (vi) DATOS COMUNES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 08/625,377 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-ABRIL-1996 (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/MANDATARIO: (A) NOMBRE: S. PETER LUDKING, ESQ. (B) NUMERO DE REGISTRO: 35,351 (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: 0342/2C488-WO (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (212) 527-7700 (B) TELEFAX: (212) 753-6237 (C) TELEX: (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC No. 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 219 aminácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (Üi) HIPOTÉTICA: NO (iv) SENTIDO INVERSO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No. I: 11= t-lu Asp Thr Thr 5 30 Asp Thr Leu sln Asn 45 He Leu Lys Thr lie Ala Arg phe Ala Ala S5 80 Val Leu lie phe Ala 95 Ser Asp Ser Lys no Leu Leu sly Phe Asn 125 Ala Gly Ser Thr Asp Val Ala Hls Gly Thr 145 160 Phe lie Tyr Arg Met 175 Val Gly Lys lie Val 25 190 Leu Ala Phe Glu Ser 205 *-•£- He (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC No. 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 344 aminoácidos 3S (B) TIPO: aminoácidos (C) HEBRAS : única ( D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptldo 4 0 ( lü ) HIPOTÉTICA: NO (IV) SENTIDO INVERSO : NO (v) TI PO DE FRAGMENTO : interno (vi ) FUENTE ORIGINAL : 4 5 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No . 2 : Met Ser Pro Ser Ti-r Ser Thr Ala Val Gln Glu Tyr lie Gly Pro Asn 1 S 10 15 50 Leu Asn Val Thr Leu T r Cys Pro Giu Cys Lys lie Phe Pro Pro Asp 20 25 30 Leu Val Glu Arg Pl-e --ex Glu Gly Asp He Val ys Oly Ser Cys Gly 35 40 45 Leu Val Leu Ser Asp Arg Val Val Asp Thr Arg Ser Glu Trp Arg Thr 55 50 55 SO Phe Ser Asn Asp Asp Gln Asn Gly Asp Asp pro ser Arg val aly Asp 55 70 75 80 Ala Gly Asn Pro Leu Leu Asp Thr Glu Asp Leu Ser Thr MeC lia Ser 85 90 95 Í0 Tyr Ala Pro Asp Ser Thr Lys Ala sly Arg alu Leu Ser Arg Ala Gln loo ios lio Ser Lys Ser Leu Val Asp Lys Lys Asp Asn Ala Leu Ala Ala Ala Tyr 115 120 123 He Lys He Ser ola Mee Cys Asp Oly Tyr Gl-- Leu Pro Lys He Val 65 130 135 140 Ser Asp Gly Ala L s Glu Val Tyr Lys Mae Val Tyr A=p Glu Lys Pro 145 150 155 ISO ys a sn u e rp a 180 185 190 5 Lys Thr f--n Val Pro Arg Lys slu He Gly Lys Val he Lys He Mee 135 200 205 Asp Lys He He Arg olu Lys Asn Ala Ala Asn Pro Asn Ala Ala Tyr 210 215 220 Tyr aly aln Asp Ser He aln Thr Thr sln Thr Ser Ala Glu Asp Leu 10 225 230 235 240 He Arg Arg Phe Cys Ser His Leu Gly Val Asn Thr sln Val Thr Asn 245 250 255 aly Ala Glu Tyr He Ala Arg Arg Cys Lys slu Val sly Val Leu Ala 250 265 270 15 sly Arg Ser Pro Thr Thr He Ala Ala Thr Val He Tyr Mee Ala Ser 275 280 285 Leu Val Phe Gly Phe Asp Leía Pro Pro Ser Lys He Ser Asp Lvs Thr 290 295 300 sly Val Ser Asp Oly Thr He Lys T r Ser Tyr Lys Tyr Mee Tyr alu 20 305 310 315 320 Glu Lys alu aln Leu He- Asp Pro Ser Trp He Olu Ser Cly Lvs Val 325 330 335 Lys Leu Glu Ly3 He Pro Lys Asn 340 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC No. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 657 pares de bases 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal -_ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) SENTIDO INVERSO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FUENTE ORIGINAL: 40 (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No.3: ATGAAOTCAA TAGAGGAAGA TGAAAAAAAT AAAGCCGAA5 ATTTGGATAT TATAAAAAAC SO aAAaATATTG ATGAACCTAA ACAAGAAsAT ACCACTGATA GTAATGGTGG TGGAGGTATT 120 S GGTATAOTOC CCACATTACA AAATATTCTT GCTACGGTGA ATCTTGATTG TCGACTTOAT 130 AAAACAATTG CTTTACATGC TAGAAATGCC OAATATAATC CAAAACGTTt TGCTGCGsTs 240 ATTATGAOAA TTAsAaATCC AAAAACTACO OCATTAATCT TTGCTTCGOa GAAAATGGTT 300 aTGACTGGGG CTAAATCCGA AGACGATTCC AAGTTGGCTT CAAGAAAGTA TGCTAOAATC 350 ATTCAAAAGT TGGGGTTCAA TGCTAAATTT TGTGATTTTA AAATTCAAAA TATAGTGGGO 420 TCAACAGATG TTAAGTTTGC TATTAGATTA GAAGOCTTAO CTTTTGCTCA TOGTACTTTT 480 TCTTCATATG AACCAOAATT ATTTCCTGGa TTAATTTATA GAATOOTOAA ACCAAAAATT 540 GTTTTACTTA TATTTOTTTC TGaGAAAATT OTTTTGACsG sTaCCAAAAA OACAGAAGAA 600 ATTTATGATG CATTTOAACT OATTTATCCO OTTTTAAATO AATTTCaTAA AAATTGA 657 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC No. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1095 pares de base SO (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRAS: (D) TOPOLOGÍA: (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi ) FUENTE ORIGINAL : (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No . 4 : TAAGCTTGTA TTACTAAGCA TATTATGTCG CCATCAACAT CTACGGCAGT ACAsGAGTAT 60 ATTGGACCAA ACTTGAATGT TACATTAACA TGTCCTGAGT GTAAGATATT TCCACCTOAT 120 TTGOTAGAsA aaTTCAGCGA AGGTGACATT GTCTGTGaCA GTTGTGGGCT AOTATtGAGT 180 aATCGTGTTG TGGATACGAG ATCAsAATGa AGAACTTTCA GTAACGATGA CCAAAATGGT 240 GATGATCCTT CTCGTGTTaa TGATGCAGOT AACCCTTTAT TAGACACAGA ssACTTGTCC 300 ACAATGATTT CTTATGCTCC TOATACTACC AAAGCAGGAA GAGAGTTAAG CCGAGCCCAA 360 TCTAAATCTC TAGTCGATAA AAAAOACAAT aCATTaGCTa CAGCATATAT CAAGATTTCT 420 CAAATGTGCG ATGGTTATCA ATTGCCTAAA ATAGTTCTGO ATGOaaCCAA COAAOTCTAC 480 AAAATsGTTT ATGACGAGAA ACCATTGCGA GGAAAATCAC AAGAGAGTAT CATsOCAsCT 540 TCTATCTTTA TTssTTsCAG AAAGGCCAAT GTTsCTCGTT CATTCAAAsA O TATsGGCA so o AAGACTAATs TACCTCGTAA aGAAATTGGT AAAGTGTTCA AGATCATsGA CAAGATCATT 6S0 CGTGAAAAGA ATOCAGCCAA CCCTAATGCT OCATATTACG CTCAAGACAs CATTCAAACC 720 ACCCAAACTT CGGCCGAGGA TTTGATTAGA AGATTCTGTT CTCACTTGGG TG TAACACA 780 CAAGTTACAA ATGsTGCsaA ATACATAGCC AOAAaATGTA AaaAAGTCGG GGTTTTAaCA 840 GOTAGATCGC CAACTACAAT TaCTOCAACT GTAATTTACA TOGCTTCACT AGTGTTTGGA 900 TTTGACTTAC CTCCATCCAA aATATCTGAT AAAACTGGTO TCAGTGATGa TACTATCAAA 960 ACTTCATACA AGTACATGTA CGAGsAGAAA GAACAATTGA TTGATCCATC TTOGATAOAA 1020 AaTGGTAAAG TAAAATTGGA AAAAATACCA AAAAACTAAT ACAGCGGAGT CGCCACTGTT 1080 AATCCTITAC CCTCT 1095

Claims (15)

1. Un ácido nucleico recombinante, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que codifica el factor de transcripción, TFIIB, del Candida albicans .

2. Un vector, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos- que codifican el TFIIB del Candida albicans .

3. Una célula huésped transformada, caracterizada porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifican el TFIIB del Candida albícans .

4. Un polipéptido recombinante, caracterizado porque comprende el TFIIB del Candida albícans .

5. Un fragmento del TFIIB del Candida albi cans , caracterizado porque este fragmento inhibe la actividad biológica del TFIIB del Candi da albi cans en el inicio de la transcripción.

6. Un fragmento del TF1IB del Candida albi cans , y este fragmento esta caracterizado porque previene el crecimiento del Candida albi cans . 5

7. Un método para producir el TFIIB del Candida albicans r ecombinante, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 3, bajo 10 condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico que codifica el TFIIB del Candida albicans, y aislar el TFIIB del Candida albicans . 15

8. Un método de clasificación selectiva para identificar un inhibidor del crecimiento del Candida albicans , el método esta caracterizado •^^ porque comprende detectar la inhibición de la transc ipción del mARN en un ensayo o análisis de 20 transcripción in vitro que comprende un patrón o plantilla de ADN, ARN polimerasa II, TFIIB del Candida albicans recombinante, y un inhibidor candidato, en donde la producción de un transcripto del mARN del patrón de ADN ocurre en 25 la ausencia del inhibidor candidato.

9. Un método de clasificación selectiva para identificar un inhibidor del crecimiento del Candida albicans , caracterizado porque comprende detectar, en la presencia de un inhibidor candidato, la inhibición de la formación de un complejo que comprende un patrón de ADN y TFIIB del Candida albicans recombinante, en donde, en la ausencia del inhibidor candidato, ocurre la formación di complejo.

10. Un método de clasificación selectiva para identificar un inhibidor del crecimiento del Candida albicans , caracterizado porque comprende detectar, en la presencia de un inhibidor candidato, la inhibición de la formación de un complejo que comprende el TFIiB del Candida albicans y el TBP del Candi da albi cans , en donde, en la ausencia del inhibidor candidato, ocurre la formación del complejo.

11. Un método de clasificación para identificar un inhibidor del crecimiento del Candida albicans , caracterizado porque comprende detectar, en la presencia de un inhibidor candidato, la inhibición de la formación de un complejo que comprende ARN polimerasa II, TBP del Ca n di da a l bi cans , y PFII del Candi da a lbi can s, en donde, en la ausencia del inhibidor candidato, ocurre la formación del complejo. 5

12. El é todo de clasificación selectiva, de conformidad con la reivindicación 8, 9, 10, u 11, caracterizado porque la detección se realiza en la presencia de una pluralidad de a 10 inhibidores candidatos de tal forma que la inhibición es indicadora de la inhibición causada por un inhibidor candidato de esa pluralidad de inhibidores . 15

13. El método de clasificación selectivo de conformidad con la reivindicación 8, 9, 10, u 11, caracterizado porque se llevan a * cabo múltiples pasos de detección, en forma simultánea, usando una pluralidad de inhibidores 20 candidatos, en donde la detección de la inhibición a causa de cualquier inhibidor candidato se puede detectar de manera independiente de la pluralidad.

14 Un método para prevenir el crecimiento del Candida albicans en cultivos, caracterizado porque comprende poner en contacto el cultivo con un inhibidor que inhibe selectivamente la actividad biológica del TFIIB del Candí da albi cans .

15. Un método para prevenir el crecimiento del Candida albícans , en un mami fero , caracterizado porque comprende poner en contacto al mamífero con un inhibidor que inhibe selectivamente la actividad biológica del TFIIB del Candi da albícans .