MXPA98007702A - Peptidos de union del locus hla-a2.1 y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención provee los medios y métodos para seleccionar péptidos inmunogénicos y las composiciones de péptidos inmunogénicos capaces de unirse específicamente a glicoproteínas codificadas por el alelo HLA-A2.1 e inducir la activación de células T en células T restringidas por el alelo A2.1. Los péptidos sonútiles para evocar una respuesta inmune contra un antígeno deseado.

Description

PEPTIDOS DE UNION DEL LQCUS HLA-A2.1 Y SUS USOS La presente solicitud es una continuación en parte de USSN SO/013,980, relacionada con las siguientes solicitudes de patente, USSN 08/589,108, USSN 08/454,033 y USSN 08/349,177, que es una continuación en parte de USSN 08/159,184, continuación en parte de USSN 08/073,205, que a su vez es una continuación en parte de 08/027, 146. También está relacionada con USSN 08/205,713. Todas las cuales se incorporan en la presente por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compos ciones y métodos para prevenir, tratar o diagnosticar varios estados patológicos. tales como enfermedades virales y cánceres. En particular, provee péptidos novedosos capaces de unirse con moléculas seleccionadas del complejo de histocompat bi 1 i dad mayor (MHC) e induc r una respuesta inmune.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las moléculas del MHC se clasifican como moléculas clase I o clase II. Las moléculas de MHC clase II se expresan principalmente sobre células implicadas en la iniciación y sostenimiento de respuestas inmunes, tales como l nfocitos T, linfocitos B, macrófagas y similares. Las moléculas de MHC clase II son reconocidas por linfocitos T auxiliares e inducen la prol feración de linfocitos T auxiliares y la amplificación de la respuesta inmune hacia el péptido inmunogénico particular que se despliega. Las moléculas de MHC clase I se expresan en casi todas las células nucleadas y son reconocidas por l foc tos T c otó icos (CTL) que entonces destruyen a las células que llevan el antígeno. Los CTL son particularmente importantes en el rechazo de tumores y en el combate contra infecciones virales. Los CTL reconocen al antígeno en la forma de un fragmento de péptido unido a las moléculas MHC clase I, más bien que al antígeno extraño intacto por si solo. El antígeno deber ser normalmente sintetizado endógenamente por la célula, y una porción la proteína ant gen ca es degradada en fragmentos pequeños de péptido en el citoplasma. Algunos de estos pépt?dos pequeños se trasladan hacia un compartimiento pre-Golgi, e interaccionan con cadenas pesadas clase I para facilitar el pliegue y la asociación apropiados con la subunidad G2 de icroglobul na. Entonces el complejo péptido-MHC clase I es dirigido hacia la superficie celular para expresión y reconocimiento potencial por CTL específicos. Las investigaciones de la estructura de cristal de la molécula de MHC clase I humana, HLA-A2.1, indican que se crea una ranura de unión de péptido mediante el pliegue de los dominios ocl y a2 de la cadena pesada clase I (BjorKman y otros., Nature 329:SOS (1937). Sin embargo, en estas investigaciones no fue determinada la identidad de los péptidos enlazados a la ranura. Buss y otros, Science 242:iOß5 (1988) describieron primero un método para elución acida de péptidos unidos al MHC. Subsecuentemente, Ra ensee y sus colaboradores (FalK y otros., Nature 351:290 (1991) han desarrollado un enfoque para caracterizar péptidos procesados naturalmente, unidos a moléculas clase I. Otros i vestigadores han logrado acertadamente dirigir la secuenciación de aminoácidos de los péptidos más abundantes en varias fracciones de HPLC mediante secuenciación automática convencional de péptidos eluidos de moléculas clase I del tipo B (JardetzKy y otros., Nature 353:326 (1991) y del tipo A2.1, por medio de espectrometría de masas (Hunt y otros., Science 225:1261 (1992). Ha sido presentada una revisión de la caracterización de péptidos procesados naturalmente en MHC clase I, por parte de Rotzschke y FalK (RotzschKe y FalK, Im unol . Today 12:447 (1991). Sette y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3296 (1989) mostraron que pueden usarse motivos específicos de alelo de MHC para predecir la capacidad de unión a MHC. Schaeffer y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA BS:4S49 (1989) mostraron que la unión a MHC estaba relacionada con la i munogem'c dad. Varios autores (De Bruijin y otros, Eur. J. I unol . , 21:2963-2970 (1991); Pamer y otros, 991 Nature 353:952-955 (1991)) han provisto evidencia preliminar de que motivos de unión de clase I pueden aplicarse a la identi icación de péptidos inmunogénicos potenciales en modelos de animal. Aun no se han descrito motivos de clase I específicos para varios alelos de humano de un isotipo dado de clase I. Es conveniente que las frecuencias combinadas de estos alelos diferentes deban ser lo suf cientemente altas para cubir una gran fracción, o quizás la mayor parte» de la población humana de razas mixtas. A pesar de los desarrollos en la técnica, la técnica anterior aún no ha provisto una vacuna ni agente terapéutico a base de péptidos que sea útil para el humano, en base a este trabajo. La presente invención provee estas y otras ventajas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee péptidos inmunogénicos que tienen motivos de unión para moléculas del locus A2.1 de leucocitos humanos (HLA-A2.1). Los péptidos nmunogénicos, que se unen al alelo apropiado de MHC» son preferi lemente de 9 a 10 residuos de longitud y comprenden residuos conservados en ciertas posiciones tales como las posiciones 2 y 9. Además» los péptidos no comprenden residuos negativos de unión, como se definen en la presente» en otras posiciones tales como las posiciones 1» 3» 6 y/o 7 en el caso de péptidos de 9 aminoácidos de longitud» y posiciones 1, 3» 4, 5, 7, 8 y/o 9 en el caso de péptidos de 10 aminoácidos de longitud. La presente invención define posiciones dentro de un motivo que permiten la selección de péptidos que se unen eficientemente a HLA A2.1. Usando los péptidos de la invención, se pueden identificar epítopes sobre varias proteínas blanco i munogénicas. Los péptidos pueden prepararse en base a secuencias de proteínas antigénicas provenientes de patógenos (v.gr., patógenos virales, patógenos fúngicos, patógenos bacterianos, patógenos de protozoarios» y similares), o de antígenos asociados con cáncer. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de cáncer de próstata (PSA), antígenos de superficie y de núcleo de hepatitis B (HAVc, HBVs), antígenos de hepatitis C» antígeno del virus Epste n-Barr, y antígenos de virus de ?nmunode c eñei a humana tipo 1 (VIHl) y del virus de papiloma. Los péptidos, o ácidos nucleicos que los codifican» son útiles en composiciones farmacéuticas para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas tanto vivo como ex vivo.

Defi iciones El término "péptido" se usa intercambiablemente con "oligopéptido" en la presente especificación para designar una serie de residuos» típicamente L-ami oác dos» unidos uno al otro típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-a ino y carbonilo de aminoácidos adyacentes. Los ol igopéptidos de 1 a invención son de menos de aproximadamente 15 residuos de longitud y usualmente consisten de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos» de preferencia 9 o 10 residuos. Un "péptido nmunogénico" es un péptido que comprende un motivo específico de alelo» de tal manera que el péptido se unirá a una molécula de MHC e inducirá una respuesta de CTL. Los péptidos inmunogénicos de la invención son capaces de unirse a una molécula apropiada de HLA—A2.1» e inducir una repuesta de células T citotóxicas contra el antígeno del cual se deriva el péptido inmunogén co. Los péptidos inmunogénicos son identif cados convenientemente usando los algoritmos de la invención. Los algoritmos son procedimientos matemáticos que producen una puntuación que permite la selección de péptidos i munogénicos. Típicamente» uno utiliza la puntuación algorítmica con un "umbral de unión" para permitir la selección de péptidos que tienen una alta probabilidad de unirse a una cierta afinidad, y que a su vez serán inmunogénicos. El algoritmo se basa en los efectos sobre la unión a MHC de un aminoácido particular en una posición particular de un péptido» o en los efectos que tiene sobre la unión una substitución particular en un péptido que contiene motivo. La relación entre la afinidad de unión a moléculas de MHC clase I y la inmunogen cidad de epítopes discretos de péptido ha sido analizada en dos diferentes enfoques experimentales (Se e y otros» J. I munol . , 153:5586-5592 (1994)). En el primer enfoque, se analizó la in unogenicidad de epítopes potenciales que varían en afinidad de unión a MHC sobre una escala de 10.000 veces en ratones transgénicos HLA— A*0201. En el segundo enfoque» se determinó la antigeni cidad de aproxi adamente 100 diferentes epítopes potenciales derivados del virus de la hepatitis B (HBV). llevando todos ellos motivos de unión A*0201» util zando PBL de pacientes con hepatitis aguda. En ambos casos, se encontró que un umbral de afinidad de aproximadamente 500 nM (de preferencia 500 nM o menos) determina la capacidad de un epítope de péptido para evocar una respuesta de CTL. Estos datos se correlación bien con las mediciones de afinidad de unión de la clase I, ya sea de péptidos procesados naturalmente o de los epítopes de células T previamente descritos. Estos datos indican la importante función de la selección de determinantes en la conformación de respuestas de células T. Un "residuo conservado" es un aminoácido que se presenta en una frecuencia signif cati amente más alta de la que podría esperarse por distribución aleatoria en una posición particular en un moti o de péptido. Típicamente, un residuo conservado es uno en el cual el péptido inmunogénico puede proveer un punto de contacto con la molécula de MHC. De 1 a 3, preferi lemente 2» residuos conservados dentro de un péptido de longitud definida» definen un motivo para un péptido inmunogénico. Estos residuos están típicamente en estrecho contacto con la ranura de unión de péptido» con sus cadenas laterales enterradas en cavidades específicas de la ranura misma. Típicamente, un péptido inmunogénico comprenderá hasta tres residuos conservados, más usualmente dos residuos conservados. Como se usa en la presente, "residuos negativos de unión" son aminoácidos que si están presentes en ciertas posiciones (por ejemplo las posiciones 1, 3 y/o 7 de un nonámero), darán como resultado un péptido que es un no enlazador o un enlazador deficiente, y a su vez no será inmunogén co» es decir no inducirá una respuesta de CTL. El término "motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida» usualmente de alrededor de 8 a apro adamente 11 aminoácidos» que es reconocido por un alalo particular de MHC. Los motivos de péptido son típicamente diferentes para cada alelo del MHC humano y difieren sn el patrón de los residuos altamente conservados. El motivo de unión para un alelo puede definirse con grados crecientes de precisión. En un caso, todos los residuos conservados están presentes en las posiciones correctas en un péptido y no hay residuos negativos en las posiciones 1» 3 y/o 7. Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está substancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente son acompañantes como se encuentra en su estado natural. De esta manera, los péptidos de esta invención no contienen materiales asociados normalmente con su medio jjn si tu » por ejemplo» moléculas I de MHC sobre células que presentan el antígeno. Aun cuando una proteína ha sido aislada hasta una banda homogénea o dominante» existen trazas de contaminantes en la escala de 5 a 10% de proteína natural que se purifican junto con la proteína deseada. Los péptidos aislados de esta invención no contienen esta proteína endógena purificada conjuntamente. El término "residuo" se refiere a un aminoácido o un imitador de aminoácido incorporado en un oligopéptido por medio de un enlace am?do o enlace similar a a ido.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se refiere a la determinación de motivos de péptido específicos de alelo» para subtipos de alelos humanos de MHC clase I (algunas veces referidos como HLA), en particular, motivos de péptido reconocidos por alelos HLA-A2.1. Estos motivos se usan entonces para definir epítopes de células T de cualquier antígeno deseado, particularmente los asociados con enfermedades virales humanas» cánceres o enfermedades autoinmunes» para los cuales se conoce la secuencia de aminoácidos de los blancos potenciales de antígeno o autoantígeno. De esta manera pueden identif carse epítopes de varias proteínas blanco potenciales. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA)» antígenos de superficie y de núcleo de hepatitis B (HBVc. HBVs). antígeno de hepatitis C. antígenos del virus Epstein— Barr» antigenos de melanoma (v.gr. MAGE—1), antigenos del virus de inmunodeficienc a humana (VIH) y antígenos del virus de pap loma humano (HPV). Los trastornos autoinmunes asociados» para los cuales puede emplearse los péptidos de la invención para al viar los síntomas y tratar o prevenir la ocurrencia o recurrencia» incluyen por ejemplo esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA)» síndrome de Sjogren, escleroderma, pol imiositis» dermatomiasi tis» lupus eritematoso general» artritis reumatoide juvenil» espondilitis anquilosante, miastemia gravis (MG), pénfigo buloso (anticuerpos contra la membrana basal en la unión de dermis-epidermis), pénfigo (anticuerpos contra el complejo de proteína y ucopol isacárido o substancia de cemento intracelular)» glo erulonefri tis (anticuerpos contra la membrana basal glo erular), síndrome de Goodpasture» anemia he olítica autoin une (anticuerpos contra eritrocitos), enfermedad de Hashimoto (anticuerpos contra la tiroides)» anemia perniciosa (anticuerpos contra el factor intrínseco), púrpura tromboci topénica idiopática (anticuerpos contra plaquetas), enfermedad de Grave, y enfermedad de Addison (anticuerpos contra tiroglobul ina) , y similares. Se han identificado los autoantígenos asociados con varias de estas enfermedades. Por ejemplo» en enfermedades autoinmunes inducidas experimentalmente, se han caracterizado antígenos impl cados en la patogénesis: en artritis de rata y ratón es identificado colágeno natural tipo II en artritis inducida por colágeno» y proteína de choque cardiaco icobacter ano en artritis adyuvante; se ha identificado tiroglobul ina en tiroiditis alérgica experimental (EAT) en ratón» receptor de acetilcolina (AChR) en iastenia gravis alérgica experimental (EAMG); y proteína básica de mielina (MBP) y proteína proteo! ípida (PLP) en encefalomiel i tis alérgica experimental (EAE) en ratón y rata. Además» se han identificado antígenos blanco en humanos: colágeno tipo II en artritis reumatoide humana; y receptor de acetilcolina en miastenia gravis. Se sintetizan péptidos que comprenden los epítopes de estos antígenos» y después se prueban para determinar su capacidad de unión a las moléculas de MHC apropiadas en análisis que utilizan» por ejemplo» moléculas clase I purificadas y péptidos radioyodados y/o células que expresan moléculas vacías en clase I» por ejemplo» tinción munofluorescente y micro luoro etría de flujo» pruebas de ensamble de clase I dependientes de péptido» e inhibición del reconocimiento de CTL por competencia de péptido. Aquellos péptidos que se unen a la molécula clase I son evaluados adicionalmente para determinar su capacidad para servir como blancos para CTL derivados de individuos infectados o inmunizados» así como para determinar su capacidad para inducir respuestas primarias de CTL n vitro o in vivo que puedan producir poblaciones de CTL capaces de reaccionar con células blanco infectadas viralmente o células de tumor, como agentes terapéuticos potenciales. Los antígenos de MHC clase I son codificados por los locus HLA-A, B» y C. Los antígenos de HLA—A y B son expresados en la superficie de la célula a densidades aproximadamente iguales, mientras que la expresión de HLA-C es significati amente inferior (probablemente hasta 10 veces inferior). Cada uno de estos locus tiene un número de alelos. Los motivos de unión de péptidos de la invención son relati amente específicos para cada subtipo de alelo. Para vacunas basadas en péptidos, los péptidos de la presente invención comprenden de preferencia un motivo reconocido por una molécula MHC I que tiene una amplia distribución en la población humana. Puesto que los alelos de MHC están presentes en frecuencias diferentes dentro de diferentes grupos étnicos y razas» la elección del alelo de MHC blanco puede depender de la población blanco. El cuadro I muestra la secuencia de varios alelos en los productos del locus HLA—A entre diferentes razas. Por ejemplo» la mayoría de la población caucásica puede ser cubierta por péptidos que se unan a cuatro subtipos del alelo HLA-A» específicamente HLA— A2.1» Al» A3.2» y A24.1. De manera similar, la mayoría de la población asiática es abarcada con la adición de péptidos que se unan a un quinto alelo HLA-A11.2.

CUADRO I Alelo A/Subtipo N(69)* A(54) C(502) Al 10.1(7) 1.8(1) 27.4(138) A2.1 11.5(8) 37.0 ( 20 ) 39.8(199) A2.2 10.1(7) 0 3.3(17) A2.3 1.4(1) 5.5(3) 0.8(4) A2.4 A2.5 A3.1 1.4(1) O 0.2(0) A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108) All.l O 5.5(3) O A11.2 5.7(4) 31.4(17) 8.7(44) A11.3 O 3.7(2) O A23 4.3(3) 3.9(20) A24 2.9(2) 27.7 ( 15 ) 15.3(77) A24.2 A24.3 A25 1.4(1) 6.9(35) A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30) A26.2 7.2(5) 1.0(5) A26V 3.7(2) A2S.1 10.1(7) 1.6(8) A2B.2 1.4(1) 7.5(38) A29.1 1.4(1) 1.4(7) A29.2 10.1 ( 7 ) 1.8(1) 5.3(27) CUADRO I (CONTINUACIÓN) A30.1 8.6(6) - 4.9(25) A30.2 1.4(1) - 0.2(1) A30.3 7.2(5) - 3.9(20) A31 4.3(3) 7.4(4) 6.9(35) A32 2.8(2) - 7.1(36) AW33.1 B.S(6) - 2.5(13) AW33.2 2.8(2) 16.6(9) 1.2(6) A 34.1 1.4(1) AW34.2 14.5(10) - 0.8(4) Aw36 5.9(4) Cuadro compilado de B. DuPont, Immunobiology of HLA» Vol. I, Histocompat i 1 ty Testing 19878, Spr nger-Verlag, New YorK 1989. *N - Negroide; A = Asiático» C = Caucásico. Los números entre paréntesis representan el número de individuos incluidos en el análisis.

La nomenclatura usada para describir compuestos de péptido sigue la práctica convencional» en la que el grupo amino es presentado a la izquierda (el extremo N) y el grupo carboxilo a la derecha (el extremo O de cada residuo de aminoácido. En las fórmulas que representan modalidades específicas seleccionadas de la presente invención» los grupos terminales amíno y carbox lo» aunque no se muestra especificamente » están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológico, a menos que se especifique de otra manera. En las fórmulas de estructura de aminoácido, cada residuo está representado generalmente por designaciones estándar de tres letras o de una sola letra. La forma L de un residuo de aminoácido está representado por una sola letra mayúscula o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la forma D- para aquellos aminoácidos que tienen formas D, está representada por una sola letra minúscula o un símbolo de tres letras minúsculas. La glicina no tiene átomo de carbono asimétrico y es referida simplemente como "Gly" o G. Los procedimientos usados para identificar los péptidos de la presente invención, por lo general siguen los métodos descritos en Falk y otros» Nature 351:290 (1991), que se incorporan en la presente por referencia. Brevemente» los métodos incluyen aislamiento a gran escala de moléculas MHC clase I» típicamente por medio de in unoprecipi tación o cromatograf a de afinidad» a partir de la célula o línea celular apropiada. Ejemplos de otros métodos de aislamiento de la molécula de MHC deseada, igualmente conocidos para el técnico, incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de lectina, exclusión de tamaño, cromatografía de ligando de alto rendimiento, y una combinación de todas las técnica anteriores. En el caso típico, se usa in unoprecip tación para aislar el alelo deseado. Puede usarse varios protocolos, dependiendo de la especificidad de los anticuerpos usados. Por ejemplo, pueden usarse reactivos de Ab específicos de alelo para la purificación por afi idad de las moléculas de HLA-A, HLA—B y HLA-C. Se tienen disponibles varios reactivos de mAb para el aislamiento de moléculas HLA-A. El BB7.2 monoclonal es adecuado para aislar moléculas de HLA-A2. Se usan, con buen éxito. las columnas de afinidad preparadas con estos mAbs utilizando técnicas estándar, para purificar los respectivos productos del alelo HLA—A. Además de los mAbs específicos de alelo, pueden usarse mAbs anti-HLA-A, B» C» ampliamente reactivos» tales como WS/32 y B9.12.1» y un mAb an —HLA-A-B.CB1.23.2, en protocolos de purificación de afinidad alternat os, como se describe en la sección de ejemplo más adelante. Los péptidos unidos a la ranura de unión de péptido de las moléculas de MHC aisladas, son eluidos típicamente usando tratamiento con ácido. También pueden disociarse los péptidos de las moléculas clase I mediante una variedad de medios desnaturalizantes estándar tales como calor, pH» detergentes» sales» agentes caotrópicos» o una combinación de los mismos. Las fracciones de péptido se separan adicionalmente de las moléculas de MHC mediante cromatograf a de líquidos de alto rendimiento (CLAR) de fase inversa y se determina su secuencia. Los péptidos pueden separarse mediante una variedad de otros medios estándar bien conocidos par el técnico» incluyendo filtración» ul trafi 1 tración, electrofóresis» cromatogra ía de tamaño, precipitación con anticuerpos específicos, cromatogra ía de intercambio iónico, isoelectroenfoque y sim lares. La secuenciación de los péptidos aislados puede realizarse de acuerdo con las técnicas estándar tales como degradación de Edman (HunKapiller M.W. , y otros, Methods Enzymol » 91, 399 C1993.I). Otros métodos adecuados para secuenc ación incluyen secuenciación de espectrometría de masas de pép idos individuales» como se describió anteriormente (Hunt, y otros, Science 225:1261 (1992), que se incorpora en la presente como referencia. La secuenciación de aminoácidos de péptidos heterogéneos voluminosos (por ejemplo fracciones recolectadas de CLAR) de diferentes moléculas clase I» revela típicamente un motivo de secuencia característico para cada alelo de clase I. La definición de motivos específicos para diferentes alelos de clase I, permite la identificación de epítopes potenciales de péptido de una proteína anti genica cuya secuencia de aminoácidos se conoce. Típicamente, la identif cación de epítopes potenciales de péptido se lleva a cabo inicialmente usando una computadora para escudriñar la secuencia de aminoácidos de un antígeno deseado en relación a la presencia de motivos. Entonces se sintetizan secuencias epitópicas. La capacidad de unirse a moléculas MHC clase I se mide en una variedad de formas diferentes. Un medio es una prueba de unión molecular clase I, como se describe por ejemplo en las Solicitudes relacionadas, indicadas anteriormente. Otras alternativas descritas en la l teratura incluyen inhibición de presentación de antígeno (Sette y otros, J. Im unol, 141:3893 819919). pruebas de ensamble in vi ro (Townsend y otros» Cell 62:285 (1990)) y pruebas a base de FACS usando células utadas» tales como RMA.S (Melief y otros» Eur. J. Inmmunol . 21:2963 C19913 ) . Después, los péptidos que resultaron positivos en la prueba de unión a MHC clase I» se prueban para determinar la capacidad de los péptidos para inducir respuestas específicas de CTL in vitro. Por ejemplo, pueden analizarse células que presentan antígeno que han sido incubadas con un péptido, para determinar la capacidad de inducir respuestas de CTL en poblaciones de células respondedoras. Las células que presentan antígeno pueden ser células normales tales co o las células mononucleares de sangre periférica o células dendríticas ( Inaba y otros. J. Exp. Med.. 166:182 (1987); Boog. Eur. J. Inmmol . 18:219 1119883). Alternati amente. se usan convenientemente l neas celulares mutantes de mamífero que son deficientes en su capacidad para cargar moléculas clase I con péptidos procesados internamente, tales como las líneas de células de ratón RMA-S (Karre y otros» Nature» 319:675 (198S) ; Ljunggren y otros» Eur. J. Inmmol. 21:2963-2970 (1991)), y el hibridoma de células T somático humano, T-2 (Cerundolo y otros, Nature 345:449-452 (1990)), que han sido transfectadas con los genes apropiados de clase I humana, cuando el péptido se agrega a ellas, para probar la capacidad del péptido para inducir respuestas primarias de CTL n vitro. Otras líneas de células eucarióticas que pueden usase incluyen varias l neas de células de insecto tales como larvas de mosquito (líneas de células ATCC CC1 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), de gusano de seda (ATCC CRL 8851), de gusano de esciaria (ATCC CRL 1711), polilla (ATCC. CCL 80) y líneas de células de Drosophila, tal como una línea de células Schneider (véase Schneider J. Embryol » Exp. Morphol » 27 :353-365 C19271 ) . Los linfocitos de sangre periférica se aislan convenientemente después de venipunción simple o leucaferesis de donadores normales o pacientes y se usan como las fuentes de células respondedoras de precursores de CTL. En una modalidad» las células apropiadas que presentan antígeno se incuban con 10-100 µM de péptido en medio libre del suero durante 4 horas bajo condiciones de cultivo apropiadas. Las células que presentan antígeno cargadas con el péptido se incuban después con las poblaciones de células respondedoras i vitro durante 7 a 10 días bajo condiciones de culti o optimizadas. La activación positiva de CTL puede determinarse probando los cultivos para determinar la presencia de CTL que destruyen a células blanco radio arcadas » tanto blancos impulsados por péptidos específicos como células blanco que expresan la forma endógenamente procesada del antigeno relevante de virus o tumor a partir de la cual se deriva la secuencia del péptido. La especifici ad y restricción de MHC de los CTL se determina probando contra diferentes células blanco de péptido que expresan MHC clase I humana apropiadas o inapropiadas. Los péptidos que resultan positivos en las pruebas de unión de MHC y producen respuestas específicas de CTL. son referidos en la presente como péptidos inmunogénicos. Los péptidos inmunogénicos pueden prepararse sintéticamente» o por medio de tecnología de ADN recombinante. o a partir de fuentes naturales tales como virus completos o tumores. Aunque el péptido preferi lemente estará substancial ente libre de otras proteínas y fragmentos de proteínas de la célula huésped que se presentan naturalmente» en algunas modalidades los péptidos pueden ser conjugados sintéticamente con fragmentos o partículas naturales. Los pol péptidos o péptidos pueden ser de una variedad de longitudes» ya sea en sus formas neutras (sin carga) o en formas que son sales, y libres de modificaciones tales como glicos lac ón» oxidación de cadena lateral o fosforilac ón, o bien conteniendo estas modificaciones, siempre que la modificación no destruya la actividad biológica de los pol péptidos como se describe en la presente. Convenientemente, el péptido será tan pequeño como sea posible, mientras que mantenga substancialmente toda la actividad biológica del péptido grande. Cuando sea posible, puede ser conveniente optimizar los peptidos de 1 a invención hasta una longitud de 9 a ÍO residuos de aminoácidos, con ensurada ente en tamaño con pépt?dos virales procesados endógenamente o péptidos de células de tumor que se unen a moléculas de MHC clase I sobre la superficie de la célula. Los péptidos que tienen la actividad deseada pueden modificarse conforme sea necesario para proveer ciertos atributos deseados, por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, siempre que aumente o por lo menos retenga substancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para unirse a la molécula de MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo» los péptidos pueden ser sometidos a varios cambios, tales como subst tuciones, ya sea conservativas o no conservat vas» en donde dichos cambios pueden proveer ciertas ventajas en su uso» tal como unión mejorada de MHC. Por substituciones conservativas se entiende el reemplazo de un residuo de aminoácido con otro que es biológicamente y/o químicamente similar» por ejemplo. un residuo hidrofóbico por otro, o un residuo polar por otro. Las substituciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val» lie» Leu» Met; Asp» Glu; Asn» Gln; Ser, Thr; Lys» Arg; y Phe, Tyr. El efecto de substituciones de un solo aminoácido puede ser sondeado también utilizando D-a inoácidos. Dichas modificaciones pueden hacerse usando procedimientos bien conocidos de síntesis de péptidos, como se describe por ejemplo en Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany y Merrifield, The peptides» Tross y Meienhofer, eds. (N.Y. Academic Press) p. 1-284 (1979); y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Illinois» Pierce), 2a- Ed. (1984), incorporadas aquí por referencia. Los péptidos también pueden ser modificados extendiendo o reduciendo la secuencia de aminoácidos del compuesto, por ejemplo, mediante la adición o supresión de aminoácidos. Los péptidos o análogos de la invención también pueden ser modificados alterando el orden o composición de ciertos residuos, apreciándose fácilmente que ciertos residuos aminoácidos esenciales para la actividad biológica. por ejemplo, aquellos en los sitios de contacto críticos o residuos conservados, no pueden ser alterados generalmente sin un efecto adverso sobre la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no necesitan ser limitados a los que ocurren naturalmente en las proteínas, tales como L-a-a noácidos, o sus isómeros D—, pero pueden incluir también ami oácidos no naturales, tales como ß- -5—aminoácidos, así como muchos derivados de L—o<-am noácidos. Típicamente, se emplea una serie de pépt?dos con substituciones de un solo aminoácido para determinar el efecto de la carga electrostática» carácter hidrofóbico» etc.» sobre la unión. Por ejemplo» se hace una serie de subst tuc ones de aminoácidos cargados posit vamente (v.gr., Lys o Arg) o cargados negati amente (v.gr.» Glu) a lo largo de la longitud del péptido, revelando diferentes patrones de sensibilidad hacia varias moléculas MHC y receptores de células T. Además, puede emplearse substituciones múltiples usando entidades pequeñas relativamente neutras tales como Ala, Gly, Pro, o residuos similares. Las substituciones pueden ser de homo— oligómeros o h tero-ol igomeros. El número y tipos de residuos que son substituidos o agregados depende de la separación necesaria entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que se buscan (por ejemplo carácter hidrofóbico contra carácter hidrof íl ico) . La afinidad de unión incrementada para una molécula de MHC o un receptor de células T puede lograrse también mediante tales substituciones» en comparación con la afinidad del péptido original. En cualquier caso» dichas subst tuciones deben emplear residuos de aminoácidos u otros fragmentos moleculares elegidos para evitar. por ejemplo, interferencia estérica y de carga que pudiera romper el enlace. Las substi uciones de aminoácidos son típicamente de residuos ind viduales. Pueden combinarse substituciones, supresiones» inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a un péptido final. Las variantes substi tucionales son aquellas en las cuales por lo menos un residuo de un péptido ha sido removido y un residuo diferente ha sido insertado en su lugar. Dichas subst uciones generalmente se hacen de conformidad con el siguiente Cuadro 2, cuando se desea modular finamente las características del péptido.

CUADRO 2 Residuo Original Substitución E.iemplar Ala Ser Arg Lys» His Asn Gln Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Lys ; Arg lie Leu; Val Leu He; Val Lys Arg; His Met Leu; lie Phe Tyr. Trp Ser Thr Thr Ser Trp Tyr; Phe Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Pueden hacerse cambios substanciales en función (v.gr., afinidad por moléculas de MHC o receptores de células T), seleccionando substituciones que son menos conservati as que las del Cuadro 2» es decir, seleccionando residuos que difieran más significativamente en su efecto en el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto del péptido en el área de substitución. por ejemplo como una conformación laminar o helicoidal. <b) la carga o carácter hidrofóbico de la molécula en el sitio blanco o (O el volumen de la cadena lateral. Las substituciones que en general se espera que produzcan los cambios mayores en las propiedades del péptido, serán aquellas en las cuales (a) un residuo hidrofílico» por ejemplo ser lo, substituya a (o sea substituido por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, f ni lalani lo» val i lo o alanilo» (b) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo» lisilo. arginilo» o histidilo» substituya a (o sea substituido por) un residuo electronegativo» por ejemplo gluta ilo o aspartilo» o (c) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo» fenilalanina» substituya a (o sea substituido por) uno que no tiene una cadena lateral» por ejemplo» glicina. Los péptidos también pueden comprender isósteros de dos o más residuos en el péptido i munogénico. Un isóstero como se define en la presente» es una secuencia de dos o más residuos de aminoácidos que pueden substituir a una segunda secuencia, porque la conformación estérica de la primera secuencia se ajusta a un sitio de unión específico para la segunda secuencia. El termino incluye específ camente modif caciones en el esqueleto del péptido bien conocidas para el experto en la materia. Tales mod ficaciones incluyen modificaciones en el nitrógeno de amida, el carbono a, amidacarboni lo» reemplazo completo del enlace a ido, extensiones» supresiones o entrelazamientos del esqueleto. Ver, en general, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids» Peptides and Protein, Vol. VII (Weinstein ed., 1983). Las modificac ones de péptidos con varios imitadores de aminoácidos o aminoácidos no naturales, son particularmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido i_n vivo. La estabilidad puede determinarse en diferentes formas. Por ejemplo, se han usado peptidasas y varios medios biológicos tales como plasma y suero humano para probar la estabilidad. Ver, por ejemplo, Verhoef y otros, Eur. J. Drug Metab. PharmacoKin 11:291—302 (1986). La vida media de los péptidos de la presente invención se determina convenientemente utilizando una prueba con suero humano al 25% (v/v). En términos generales, el protocolo es como sigue. Suero humano recolectado (tipo AB, no inact vado con calor) es des! ipidizado mediante centrifugac ón antes de su uso. Después, el suero se diluye hasta 25% con medio de cultivo de tejidos RPMI» y se utiliza para probar la estabilidad del péptido. A intervalos predeterminados, se retira una pequeña cantidad de la solución de reacción y se agrega a ácido tricloroacético acuoso al &% o bien a etanol . La muestra de reacción turbia se enfría (4°C) durante 15 minutos y después se hace girar para hacer pella las proteínas séricas precipitadas. Después se determina la presencia de los péptidos mediante CLAR de fase inversa usando condiciones de cromatogra ía específicas para estab lidad. Los péptidos de la presente invención o análogos de los mismos que tienen actividad estimuladora de CTL, pueden ser modificados para proveer atributos deseados, aparte del mejoramiento de la vida media en suero. Por ejemplo, puede incrementarse la capacidad de los péptidos para inducir actividad de CTL mediante su unión a una secuencia que contiene por lo menos un ep tope que es capaz de inducir una respuesta de células T auxiliares. Los conjugados inmunogénicos particularmente preferidos de péptidos/auxi 1 iares T son ligados por una molécula separadora. El separador está comprendido típicamente de moléculas neutras relati amente pequeñas, tales como aminoácidos o imitadores de aminoácidos, que substanc al ente no tienen carga bajo condiciones fi iológ cas. Los separadores se seleccionan típicamente de, por ejemplo, Ala; Gly, u otros separadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el separador presente opcionalmente no necesita estar comprendido de los mismos residuos y por lo tanto puede ser un hetero—ol igomero o un ho o-ol omero. Cuando está presente, el separador será usualmente de por lo menos uno o dos residuos, usualmente tres a seis residuos. Alternativamente, el péptido de CTL puede ser unido al péptido de auxiliar T sin un separador.

El péptido inmunogénico puede ser ligado al péptido auxiliador T, ya sea directamente o mediante un separador en el extremo amino o carboxilo del péptido de CTL. El extremo amino ya sea del péptido in unogém'co o del péptido de auxil ador T. puede estar ac lado. En algunas modalidades, puede ser conveniente incluir en las composiciones armacéuticas de la invención» por lo menos un componente que prepare CTL. Se han identificado lípidos como agentes capaces de preparar CTL in vivo contra antígenos virales. Por ejemplo, pueden fijarse residuos de ácido palmítico a los grupos alfa y épsilon amino de un residuo de Lys» y después ligarse» por ejemplo, mediante uno o más residuos de unión tales como Gly» Gly-Gly-» Ser» Ser-Ser, o similares, con un péptido inmunogénico. El péptido unido con lípido puede entonces ser inyectado directamente en una forma micelar» incorporado en un liposoma o emulsionado en un adyuvante» por ejemplo» adyuvante incompleto de Freund. En una modalidad preferida» un i unógeno particularmente efectivo comprende ácido palmítico unido a grupos amino alfa y épsilon de Lys» que es unido mediante enlace» por ejemplo v.gr. Ser-Ser, al extremo amino del péptido inmunogénico. Como otro ejemplo de preparación de respuestas de CTL por lípido» pueden usarse 1 ipoproteínas de E. col i tales como tri 1palmitoi 1-S—gl cen" Ic steinl isen" 1-seri na (P^CSS) , para preparar CTL específicos de virus cuando se les une covalentemente a un péptido apropiado. Véase» Deres y otros» Nature 342:561—564 (1989). incorporada en la presente como referencia. Los péptidos de la invención pueden acoplarse con P3CSS» por ejemplo» y el l popéptido administrarse a un individuo para preparar específicamente una respuesta de CTL para el antígeno blanco. Además» como la inducción de anticuerpos neutral zantes puede ser preparada también con P3CSS conjugado con un péptido que exhibe un epítope apropiado» las dos composiciones pueden combinarse para evocar más efectivamente respuestas tanto humorales como mediadas por célula contra la infección. Además» pueden añadirse aminoácidos adicionales a los extremos de un péptido para proveer facilidad de unión de péptidos uno con el otro, para acoplar a un soporte de vehículo, o un péptido más grande, para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido y ol gopéptido, o similares. Pueden introducirse aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico» o similares, en el extremo C- o N- del péptido u oligopéptido. La modificación en el extremo C» en algunos casos, puede alterar las características de unión del pépt?do. Además» las secuencias del péptido u oligopéptido pueden diferir de la secuencia natural al ser modificadas por acilación NH^-terminal » por ejemplo» mediante alcanoil ( ^- -a,-,) o tioglicolil acetilación» amidación de carboxilo terminal, por ejemplo, amoniaco, met lamina, etc. En algunos casos, estas modificaciones pueden proveer sitios de unión para un soporte u otra molécula.

Los peptidos de la invención pueden prepararse en una amplia variedad de formas. Debido a su tamaño relat vamente corto» los péptidos pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de conformidad con las técnicas convencionales. Se tienen disponibles varios si tetizadores automáticos y pueden utilizarse de conformidad con los protocolos conocidos. Véase» por ejemplo» Stewart y Young» Sol id Phase Peptide Synthesis» 2a- ed.» Pierce Chemical Co. (1984)» véase anteriormente. Alternativamente, puede emplearse tecnología de ADN recombinante. en donde una secuencia de nucleótido que codifica un péptido inmunogénico de interés es insertada en un vector de expresión. transformada o transfectada en una célula huésped apropiada y cultivada bajo condiciones adecuadas para su expresión. Estos procedimientos son conocidos generalmente en la técnica» como se describe» en términos generales» en SambrooK y otros» Molecular Cloning» a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), que se incorpora en la presente como referencia. De esta manera, pueden usarse proteínas de fusión que comprenden una o más secuencias de péptido de la invención para presentar el epítope apropiado de células T. Como la secuencia codificadora para los péptidos de la longitud contemplada en la presente» puede sintetizarse por medio de técnicas químicas» por ejemplo, el método de fosfotr éster de Matteucci y otros, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981), puede hacerse modificación simplemente substituyendo la base o bases apropiadas por aquéllas que codifican la secuencia del péptido natural. Puede proveerse entonces la secuencia codificadora con ligadores apropiados y ligarse en vectores de expresión disponibles comunmente en la técnica, y los vectores usarse para transformar huéspedes adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Actualmente se tienen disponibles varios de estos vectores y sistemas de huésped adecuados. Para la expresión de las proteínas de fusión, la secuencia codificadora será provista con codones de iniciación y paro ligados operativamente, regiones de promotor y ter inador y usualmente un sistema de repl icación para proveer un vector de expresión para la expresión en el huésped celular deseado. Por ejemplo, se proveen secuencias promotoras compatibles con los huéspedes bacterianos en plás idos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de la secuencia codificadora deseada. Los vectores de expresión resultantes son transformados en huéspedes bacterianos adecuados. Desde luego» pueden usarse también huéspedes de levadura o células de mamífero» empleando vectores y secuencias de control adecuados. Los péptidos de la presente invención y las composiciones farmacéuticas y de vacuna de la invención son útiles para su administrac ón a mamíferos» particularmente a humanos» para tratar y/o prevenir infección viral y cáncer. Los ejemplos de enfermedades que pueden tratarse utilizando los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen cáncer de próstata» hepatitis B» hepatitis C» SIDA, carcinoma renal, carcinoma cervical» linfoma» CMV y condilo a acuminado. Para composiciones farmacéuticas» los péptidos inmunogénicos de la invención se administran a un individuo que ya sufre de cáncer o está infectado con el virus de interés. Pueden tratarse aquéllos en la fase de incubación o en la fase aguda de infección con los péptidos inmunogénicos» separadamente o en conjunto con otros tratamientos» según sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para evocar una respuesta efectiva de CTL contra el antígeno del virus o de tumor y para curar o por lo menos impedir parcialmente los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto, se define como "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán por ejemplo, de la composición particular administrada, el modo de administración» la etapa y severidad de la enfermedad tratada» el peso y estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe» pero generalmente varía para la inmunización inicial (esto es» para administración terapéutica o profiláctica) de aproximadamente 1.0 µg a apro imadamente 5000 µg de péptido para un paciente de 70 kg» seguido por dosificaciones de refuerzo de aproximadamente 1.0 µg a aproximadamente 1000 µg de péptido en cumplimiento con un régimen de refuerzo por semanas a meses» dependiendo de la respuesta y condición del paciente» midiendo la actividad específica de CTL en la sangre del paciente. Debe tenerse en cuenta que los péptidos y las composiciones de la presente invención pueden emplearse generalmente en estados patológicos serios, es decir» situaciones que ponen en peligro la vida» o que potencialmente pueden poner en peligro la vida. En tales casos» en vista de la reducción al mínimo de substancias extrañas y la naturaleza relativa no tóxica de los péptidos» es posible» y puede ser conveniente, que el médico tratante administre un exceso substancial de estas composiciones de péptido. Para uso terapéutico» la administración debe comenzar al primer síntoma de infección viral» o a la detección o remoción quirúrgica de tumores» o recién después del diagnóstico en el caso de infección aguda. Esto es seguido por dosis de refuerzo hasta que por lo menos los síntomas sean substancialmente abatidos» y durante un período posterior. En infección crónica, pueden requerirse dosis de carga seguidas por dosis de refuerzo. El tratamiento de un individuo infectado con las composiciones de la invención puede acelerar la resolución de la infección de individuos infectados agudamente. Para aquellos individuos susceptibles (o predispuestos) a desarrollar infección crónica, las composiciones son particularmente útiles en métodos de prevención de la evolución de la infección aguda a la crónica. Cuando los individuos susceptibles son identificados antes o durante la infección, por ejemplo, como se describe en la presente» la composición puede ser dirigida a ellos» reduciendo al mínimo la necesidad de administración a una población más grande. Las composiciones de péptido pueden usarse también para tratamiento de infección crónica y para estimular el sistema inmune para eliminar células infectadas con patógeno en portadores. Es importante proveer una cantidad de péptido in unopotenciador en una formulación y modo de administración que sea suficiente para estimular efectivamente una respuesta citotóxica de células T. De esta manera» para el tratamiento de infección crónica» una dosis representat va está en la escala de aproximadamente 1.0 µg a aproxi adamente 5000 µg» de preferencia aproximadamente 5 µg a 1000 µg, para un paciente de 70 kg por dosis. Puede requerirse dosis inmunizantes seguidas por dosis de refuerzo a intervalos establecidos, por ejemplo de l a 4 semanas» posiblemente durante un período prolongado para inmunizar efectivamente a un individuo. En el caso de infección crónica» la administración debe continuar hasta que por lo menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que ha sido eliminada» o substancialmente abatida» la infección viral y durante un período posterior. Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico están destinadas para administración parenteral» tópica» oral o local. De preferencia, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo» intravenosamente» subcutáneamente» i tradérmicamente o intramuscul ármente. De esta manera» la invención provee composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disuel os o suspendidos en un vehículo aceptable» de preferencia un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos» por ejemplo» agua» agua amortiguada» solución salina al 0.8%» solución de glicina al 0.3%» ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden ser ester lizadas por medio de técnicas de esterilizac ón convencionales bien conocidas, o pueden filtrarse de manera estér l. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para usarse como tales o 1 iofi 1 izarse» siendo combinada la preparación liofi Tizada con una solución estéril antes de su administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sea requerido, para aproximarse a las condiciones f siológicas, tales como agentes ajustadores y amort guadores de pH, agentes ajustadores de tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, onolaurato de sorbitán» oleato de trietanol amina » etc. La concentración de péptidos estimuladores de CTL de la invención en las composiciones farmacéuticas puede variar ampliamente» es decir» de menos de aproximadamente 0.1%. usualmente a» o por lo menos aproximadamente 2%, hasta 20 a 50% o más en peso, y serán seleccionadas principalmente por los volúmenes de fluido, viscosidades, etc.» de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los péptidos de la invención pueden ser admin strados también mediante liposomas» que dirigen los péptidos hacia un tejido celular particular, tal como tejido linfo de. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles» cristales líquidos» dispersiones de fosfolípido» capas laminares y similares. En estas preparaciones, el péptido a liberar es incorporado como parte de un liposoma, solo o en conjunto con una molécula que se une por ejemplo a un receptor prevaleciente entre células linfoides, tales como anticuerpos monoclonal es que se unen al antígeno CD45 o con otras composiciones terapéuticas o n unogénicas. De esta manera» los liposomas llenos con un péptido deseado de la invención» pueden ser dirigidos al sitio de las células linfoides, en donde los liposomas liberan entonces las composiciones seleccionadas de péptido terapéutico/in unogénico. Los liposomas para utilizarse en la invención se forman de lípidos normales formadores de vesícula» que incluyen generalmente fosfolípidos neutros y cargados negativamente» y un estero! tal como colesterol. La selección de lípidos es guiada generalmente por la consideración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la sensibilidad al ácido y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Se tienen una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe por ejemplo en Szoka y otros, An. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1989). patentes de los E.U.A. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369, incorporadas en la presente como referencia. Para dirigirlo a las células inmunes, un ligando por incorporar en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos» específicos para determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmune deseado. Puede administrarse una suspensión de liposoma que contiene un péptido intravenosamente» localmente, tópicamente, etc., en una dosis que varía de acuerdo a, entre otras cosas. la manera de administración» el péptido' or liberar y la etapa de enfermedad por tratar. Para composiciones sólidas» pueden usarse vehículos sólidos no, tóxicos convencionales que incluyen» por ejemplo, grados armacéuticos de manitol» lactosa» almidón» estearato de magnesio» sacarina de sodio, talco. celulosa» glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para administración oral» una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como los vehículos enlistados anteriormente» y por lo genera! ÍO a 95% del ingrediente activo, esto es» uno o más péptidos de la invención, y muy preferiblemente en una concentración de 25 a 75%. Para administración en aerosol» los péptidos inmunogénicos se surten preferiblemente en forma finamente dividida junto con un agente tensioactivo y propulsor. Los porcentajes típicos de los péptidos son 0.01% - 20% en peso» de preferencia 1% - 10%. Por supuesto» el agente tensioactivo debe ser no tóxico y de preferencia soluble en el propulsor. Representativos de tales agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono» tales como ácidos caproico» octanoico» Táurico, palmítico. esteárico. linoleico, linolénico. oTestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse esteres mixtos tales como glicéridos mixtos o naturales. El agente tensioactivo puede constituir 0.1% - 20% en peso de la composic ón» de preferencia 0.25 - 5%. El resto de la composición es» ordinariamente» propulsor. Puede incluirse también un vehículo según se desee como con» por ejemplo, lecit na para liberación intranasal. En otro aspecto» la presente invención está dirigida a vacunas que contienen como ingrediente activo una cantidad inmuno! ógica ente efectiva de un péptido inmunogénico como se describe en la presente. El péptido o péptidos pueden ser introducidos en un huésped, incluyendo humanos, ligarse a su propio vehículo o como un homopolímero o heteropol ímero de unidades de péptido activo. Dicho polímero tiene la ventaja de reacción inmunológica incrementada y, cuando se usan diferentes péptidos para hacer el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determ antes antigénicos de los virus o las células de tumor. Los vehículos útiles son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo» tiroglobul ina, albúminas tales como seroaTbumina humana, toxoide deT t tanos, pol iaminoacidos tales como pol ( 1 sina:ácido glutámico), proteína de núcleo de los virus de influenza, hepatitis B, vacuna recombinante del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener también un diluyente isiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua» solución salina amortiguada de fosfato, o solución salina» y típicamente incluyen además un adyuvante. Son bien conocidos en !a técnica materiales adyuvantes tales como adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre. Y, como se mencionó anteriormente, las respuestas de CTL pueden ser preparadas conjugando péptidos de la invención con l pidos, tales como P3CSS. Después de inmunización con una composición de péptido como se describe en la presente» mediante inyección» aerosol, administración oral» transdérmica u otra vía» el sistema inmune del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL específicos para el antígeno deseado, y el huésped se hace por lo menos parcialmente inmune a infección posterior, o resistente para desarrollar infección crónica. Las composiciones de vacuna que contienen los péptidos de la invención se administran a un paciente susceptible o en riesgo de infección viral o cáncer para evocar una respuesta inmune contra el antígeno y así incrementar las capacidades de respuesta inmune del propio paciente. Dicha cantidad está definida como una "dosis inmunogém'camente efectiva". En este uso, las cantidades precisas nuevamente dependen del estado de salud y peso del paciente, del modo de adm strac n, la naturaleza de la formulación, etc.» pero por lo general varían de aproxi adamente 1.0 µg a apro imadamente 5000 µg por paciente de 70 kg, más comúnmente de apro imadamente 10 µg a apro imadamente 500 µg mg por 70 kg de peso corporal . En algunos casos» puede ser conveniente combinar las vacunas de péptido de la invención con vacunas que induzcan respuestas de anticuerpo neutralizante para el virus de interés» particularmente para antígenos de envoltura virales. Para propósitos terapéuticos o de inmunización» los péptidos de la invención pueden expresarse también por medio de huéspedes virales atenuados» tales como vaccinia o epitelioma contagioso. Este enfoque implica el uso de virus de vacuna como un vector para expresar secuencias de nucleótido que codifican los péptidos de la invención. Después de la introducción en un huésped infectado agudamente o crónicamente o en un huésped infectado» el virus de vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y con ello evoca una respuesta de CTL en el huésped. Los vectores de vacuna y los métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen por ejemplo en la Patente de los E.U.A. No. 4,722,848, incorporada en la presente como referencia. Otro vector es BCB (Bacilo Cal ette Guerin). Se describen vectores de BCG en Stover y otros (Nature 351:456-460 (1991)) que se incorpora en la presente como referencia. Serán evidentes para el experto en la materia una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo» vectores de Salmonella Typhi y similares, a partir de la descripción presente. También pueden administrarse al paciente ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos de la invención. Este enfoque se describe por ejemplo en Wolff y otros» Science 247: 1465—1468 (1990)» así como las patentes de los E.U.A. Nos. 5,580» 859 y 5,589,466. Un medio preferido de administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención, uti Tiza construcciones de minigen que codifican epítopes múltiples de la invención. Para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopes de CTL seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopes son traducidas inversamente. Se usa una tabla de uso de codón humano para guiar la elección de codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican el epítope son asociadas directamente, creando una secuencia continua de polipéptido. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad» pueden incorporarse elementos adicionales en el diseño del minigen. Ejemplos de secuencias de aminoácidos que podrían ser traducidas inversamente e incluidas en la secuencia del minigen incluyen: epítopes de linfocitos T auxiliares, una secuencia guía (señal), y una señal de retención en retículo endoplásmico. Además, la presentación de epítopes de CTL a MHC puede ser mejorada incluyendo secuencias lanqueadoras de origen natural o sintético (por ejemplo polialanina) adyacentes a los epítopes de CTL. La secuencia de minigen es convertida a ADN ensamblando ol gonucleótidos que codifican las cadenas más y menos del minigen. Se sintetizan, fosforilan, purifican y fijan bajo las condiciones apropiadas, ol igonucléotidos de traslape (30 a 100 bases de largo) usando técnicas bien conocidas. Los extremos de los ol igonucléotidos se unen usando ADN ligasa T4. Este minigen sintético, que codifica el poTipéptido de epítope de CTL, puede 3er clonado después en un vector de expresión deseado. Secuencias reguladoras estándar bien conocidas para el experto* en la materia son incluidas en e! vector para asegurar la expresión en las células blanco. Se requieren varios elementos de vector: un promotor con un sitio de clonación hacia el extremo 3' para inserción del min gen; una señal de pol iadel inación para terminación de transcripción eficiente; un origen de repl icación de E. col ; y un marcador seleccionable de E. col i (por ejemplo, resistencia a ampicilina o Kanamicina). Para este propósito, pueden usarse varios promotores, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus humano (hCMV). Véase, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,580,859 y 5,589,466 para otras secuencias de promotor adecuadas. Pueden ser convenientes modificaciones adicionales de vector para optimizar la expresión del minigen y su inmunogenicidad. En algunos casos se requieren intrones para expresión eficiente del gen. y pueden incorporarse uno o más intrones de origen natural o sintético en la región transcrita del minigen. Puede considerarse también la inclusión de secuencias de estabil zación de ARN para aumentar la expresión del minigen. Se ha propuesto recientemente que las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) desempeñan una función en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Pueden incluirse estas secuencias en el vector, fuera de la secuencia modificadora del minigen» si se encuentra que incrementa la inmunogenicidad. En algunas modal dades, puede usarse un vector de expresión bicistrónico, para permitir la producción de los epítopes codificados por el minigen y una segunda proteína incluida para incrementar o reducir la inmunogenicidad. Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que pueden incrementar benéficamente !a respuesta inmune si son coe?presadas, incluyen citocinas (v.gr.» IL-2» IL12» GM-CSF) . moléculas inductoras de citocinas (v.gr.. LelF) o moléculas coestimuladoras. Los epítopes de auxiliares (HTL) pueden unirse a señales de dirección intracelular y expresarse separadamente de los epítopes de CTL. Esto podría permitir la dirección de los epítopes de HTL hacia un compartimiento celular diferente al de los epítopes de CTL. Si se requiere, esto podría facilitar la entrada más eficiente de epítopes de HTL en la ruta de MHC clase II. mejorando con ello la inducción de CTL. En contraste con la inducción de CTL. en ciertas enfermedades puede ser benéfico reducir específicamente la respuesta inmune mediante coexpresión de moléculas inmunosupresoras (v.gr. TGF-ß). Una vez seleccionado el vector de expresión» el minigen es clonado en la región pol adaptadora hacia el extremo 3' del promotor. Este plásmido es transformado en una cepa apropiada de E. col i » y se prepara ADN utilizando técnicas estándar. La orientación y la secuencia de ADN del minigen» así como de todos los elementos incluidos en el vector» son confirmadas utilizando apeo de restricción y análisis de secuencia de ADN. Pueden almacenarse células bacterianas que hospedan en plásmido correcto como un banco maestro de células y un banco de células de trabajo. Se producen cantidades terapéuticas de ADN plas ídico mediante fermentación en E. col i, seguido por purificación. Se util zan alícuotas del banco de células de trabajo para inocular e! medio de fermentación (tal como el caldo Terrific) y desarrollarlas hasta la saturación en matraces agitados o un biorreactor de acuerdo con técnicas bien conocidas. Puede purificarse el ADN plasmídico utilizando tecnologías estándar de bioseparación» tales como las resinas de intercambio aniónico en fase sólida provistas por Quiagen. Si se requiere» puede aislarse ADN super-enrollado de las formas circular abierta y lineal utilizando electrofóresis en ge! u otros métodos. Puede preparase ADN plasmíd co purificado para inyección» utilizando una variedad de formulaciones. La más simple de estas es la reconst tución de ADN liofil izado en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Este enfoque» conocido como "ADN descub erto" se usa actualmente para administración intramuscular (IM) en pruebas clínicas. Para aumentar al máximo los efectos inmunoterapéuticos de las vacunas de ADN de minigen» puede ser conveniente un método alternativo para formular ADN plasmídico purificado. Se han descrito una variedad de métodos» y se han hecho disponibles técnicas nuevas. Pueden usarse también lípidos catiónicos en la formulación (véase» por ejemplo» como se describe en Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Manni oy Gould-Foge i te (1988) BioTechm'ques 6(7): 682-691; Rose, Patente de E.U.A. No. 5»279» 833; Brigham (1991) WO 91/06309» y Felger y otros (1987) Proc. Nati. Acad. Sei. E.U.A. 84:7413-7414). Además, también se pueden formar complejos con gl icol ípidos, liposomas fusogénicos, péptidos y compuestos referidos colectivamente como protectores, interactivos, no condensantes (PINO, con el ADN plas ídico purificado para afectar las variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular» o tráfico hacia órganos o tipos celulares específicos. Los ácidos nucleicos pueden adm strarse también ut l zando liberación balística como se describe por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 5» 204» 253. Pueden adm istrarse partículas comprendidas únicamente de ADN. Alternativamente» e! ADN puede ser adherido a partículas, tales como partículas de oro. Puede usarse sensibil zación de células objetivo como una prueba funcional para expresión y presentación de los epítopes de CTL codificados por el minigen para MHC clase I. El ADN plasmídico es introducido en una línea celular de mamífero que es adecuada como el blanco para pruebas estándar de liberación de cromo de CTL. El método de transfección usado dependerá de la formulación final. Puede utilizarse electroporación para ADN "descubierto", mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa n vi ro. Puede co-transfectarse un plásmido que expresa prote na fluorescente verde (GFP) para permitir el enriquecimiento de células transfectadas utilizando clasif cación de células activadas con luorescencia (FACS). Estas células son marcadas después con cromo 51 y usadas como células blanco para líneas de CTL específicas de epítope. La c tól sis» detectada mediante liberación de 51Cr» indica la producción de presentación de MHC de epítopes de CTL codificados por el minigen. La inmunogenicidad ±n vi o es un segundo enfoque para !a prueba funcional de formulaciones de ADN del minigen. Ratones transgénicos que expresan moléculas apropiadas de MHC humano son inmunizados con el producto de ADN. La dosis y la vía de administración dependen de la formulación (por ejemplo IM para ADN en PBS» IP para ADN en complejo con lípido). Veintiún días después de la nmunización» se recolectan esplenocitos y se reestimulan durante una semana en presencia de peptidos que codifican cada epitope por probar. Estas células efectoras (CTL) son analizadas para determinar la citólisis de las células objetivo marcadas con cromo 51» cargadas con el péptido» utilizando técnicas estándar. La lisis de las células blanco sensibilizadas por MHC que cargan los péptidos correspondientes a los epítopes codificados por el minigen» demuestra que la vacuna de ADN funciona para inducción de CTL ±n ivo. Pueden usarse péptidos antigénicos para evocar también CTL ex vivo. Los CTL resultantes pueden usarse para tratar infecciones crónicas (virales o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responden a un enfoque de terapia con vacuna de péptido. Las respuestas de CTL ex vi o hacia un patógeno particular (agente infeccioso o antígeno de tumor) son inducidas incubando en cultivo de tejidos las células precursoras de CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células que presentan e! antígeno (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente una a cuatro semanas), en el cual las CTLp son activadas y maduran y se expanden en CTL efectores, las células son infundidas de regreso hacia el paciente» en donde el mismo destruye su célula blanco específica (una célula infectada o una célula de tumor). Los pép dos de la invención pueden usarse también como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, un péptido de la 4B invención puede usarse para determinar la suscept il dad de un individuo particular a un régimen de tratamiento que emplea el péptido o los péptidos relacionados» y así puede ser de ayuda para modificar un protocolo de tratamiento existente o para determinar un pronóstico para un individuo afectado. Además» los péptidos pueden usarse también para predecir qué individuos estarán en riesgo substancial de desarrollar infección crónica. Se ofrece el siguiente ejemplo a manera de ilustración» y no a manera de l mitación.

EJEMPLO 1 Se llevo a cabo aislamiento de antigeno clase I como se describe en las solicitudes relacionadas indicadas anteriormente. Después» los péptidos procesados naturalmente se aislaron y secuenciaron como ahí se describe. Se determinaron un motivo específico de alelo» y algoritmos» y se llevaron a cabo pruebas cuant tati as de unión. Usando los motivos identificados anteriormente para el ale!o HLA-A2.1, se analizaron secuencias de aminoácidos de varias proteínas antigenicas para detectar la presencia de estos motivos. El cuadro 3 provee los resultados de estas búsquedas. Las afinidades de unión son expresadas como porcentaje de unión en comparación con un péptido estándar en las pruebas» como se describe en las solicitudes relacionadas presentadas.

Los ejemplos anteriores se proveen para lustrar la invención» pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para el experto en la materia y están abarcadas por las re vindicaciones anexas. Todas las publicaciones» patentes y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan por referencia.

CUADRO 3 CUADRO 3 (CONTINUACIÓN CUADRO 3 (CONTINUACIÓN CUADRO 3 (CONTINUACIÓN)

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico que tiene un motivo de unión de HLA-A

2.1, este péptido i unogénico tiene 9 residuos y los siguientes residuos: un primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N, seleccionado del grupo que consiste de I» V» A y T; un segundo residuo conservado en la posición C-terminal, seleccionado del grupo que consiste de V, L» I, A» y M. 2.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico que tiene un motivo de unión de HLA-A2.1» este péptido inmunogénico tiene 9 residuos: un primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N» seleccionado del grupo que consiste de L, M, I, V» A y T; un segundo residuo conservado en la posición C-terminal» seleccionado del grupo que consiste de A y M.

3.— Una composición que comprende un péptido inmunogénico que tiene un mot vo de unión de HLA-A2.1» este péptido inmunogénico tiene aproxi adamente 10 residuos: un primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N» seleccionado del grupo que consiste de L» M, I, V, A y T ; y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal, seleccionado del grupo que consiste de V, i, L, A y M; en donde el primero y segundo residuo conservados están separados por 7 residuos.

4.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico que tiene un motivo de unión de HLA-A2.1, este péptido inmunogénico se selecciona de un grupo que consiste de SEQ ID. Nos. 1 a 48.

5.- Un método . de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno prese! ecci onado en un paciente que expresa un producto de MHC de HLA—A2.1» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas de! paciente con un péptido inmunogénico que se une al producto de MHC de HLA—A2.1 con una constante de disociac ón de menos de 5 X 10-7 M e induce una respuesta de células T citotóxicas; este péptido inmunogénico tiene el motivo de conformidad con la rei ind cación 1.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 5» caracterizado porque el péptido inmunogénico se pone en contacto n vitro con las células T citotóxicas.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 5» caracterizado porque el paso de poner en contacto células T citotóxicas con el péptido inmunogém'co, se lleva a cabo administrando al paciente un ácido nucleico que codifica el péptído.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 5» caracterizado porque el péptido inmunogénico es de un antígeno viral.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el peptido in unogenico es de un antigeno de cáncer. ÍO.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente que expresa un producto de MHC de HLA-A2.1, el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une al producto de MHC de HLA-A2.1 con una constante de disociación de menos de aproximadamente 5 X 10—7 M e induce una respuesta de células T citotóxicas» este péptido inmunogénico tiene el motivo de conformidad con la reivindicación 2. 11.— El método de conformidad con la reivindicación 10» caracterizado porque el péptido inmunogém'co se pone en contacto i vitro con las células T citotóxicas. 12.— El método de conformidad con la reivindicación 10» caracterizado porque el paso de poner en contacto células T citotóxicas con el péptido inmunogénico» se lleva a cabo administrando al paciente un ácido nucleico que codifica el péptido. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 10» caracterizado porque el péptido inmunogém'co es de un antígeno viral. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 10» caracterizado porque el péptido inmunogénico es de un antígeno de cáncer. 15.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente que expresa un producto de MHC de HLA-A2.1» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une al producto de MHC de HLA-A2.1 con una constante de disociación de menos de aproximadamente 5 X 10-"7 M e induce una respuesta de células T citotóxicas; este péptido inmunogém'co tiene el motivo de conformidad con la reiv ndicación 3. 16.— El método de conformidad con la rei indicación 15» caracterizado porque el péptido inmunogénico se pone en contacto i vitro con las células T citotóxicas. 17.— El método de conformidad con la reivindicación 15» caracterizado porque el paso de poner en contacto células T citotóxicas con el péptido inmunogénico» se lleva a cabo administrando al paciente un ácido nucleico que codifica el péptido. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el pépt?do inmunogénico es de un antígeno viral . 19.- El método de conformidad con la reivindicación 15» caracterizado porque el péptido inmunogénico es de un antígeno de cáncer.