MXPA98007302A - Genes receptores de transferrina de moraxela - Google Patents

Abstract

Se proporcionan moléculas deácido nucléico purificadas y aisladas que codifican para proteínas de receptor de transferrina de Moraxella, por ejemplo M. Catarrhalis o un fragmento o un análogo de la proteína de receptor de transferrina. La secuencia deácido nucléico puede utilizarse para producir proteínas recombinantes de receptor de transferrina Tbp1 y Tbp2 de la cepa de Moraxella libre de otras proteínas de la cepa Moraxella para propósitos de diagnóstico y tratamiento médico. Además, la molécula deácido nucléico puede utilizarse en el diagnóstico de la infección.

Description

GENES RECEPTORES DE TRANSFERRINA DE MORAXEIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la clonación molecular de los genes que codifican para las proteinas receptoras de la transferrina (TfR) y, n~ particular, a la clonación de los genes receptores de la transferrina de Moraxella {Branha eXLla) catarrhalls.

REFERENCIA A IA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente norteamericana copendiente No. de serie 08/7-78,570 presentada el 3 de eneró de 1997, que por si misma es una continuación en parte de, la solicitud de patente norteamericana copendiente No. de -serie 08/613,009 presentada el 8 de marzo de 1996.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las bacterias Moraxella (Branhamela) ca tarrhalis son patógenos diplococos Gram-negativos que son portados asintomáticamente en el tracto respiratorio de los seres humanos saludables. En los años recientes, M. catarrhalis ha sido reconocido como un agente causal importante de otitis media. Además, M. catarrhalis ha sido asociado con sinusitis, conjuntivitis, e infecciones urogenitales, asi como con un número de enfermedades inflamatorias del tracto respiratorio inferior en niños y adultos, incluyendo neumonía, bronquitis crónica, traqueiti-s, y enfisema (referencias 1 a la 8) . (A todo lo _ largo de esta solicitud, se citan diversas referencias en paréntesis para describir más completamente el estado de la técnica al cual pertenece esta invención. La información bibliográfica completa para cada cita se encuentra al final de la especificación, inmediatamente precedente a las reivindicaciones. Las descripciones de estas referencias son incorporadas por referencia en la presente descripción) , Ocasionalmente, M. catarrhalis invade para provocar septicemia, artritis, endocarditis, y meningitis (referencias 9 a la 13) . La otitis media es una de las enfermedades más comunes de los niños de corta edad y aproximadamente 80% de todos los niños sufren al menos una infección ótica media antes de la edad de tres años (ref. 14) . ~La otitis media crónica ha sido asociada con deterioro auditivo y de la voz en los niños, y en algunos casos, ha sido asociada con incapacidades del aprendizaje. Los tratamientos convencionales para la otitis media incluyen administración de antibióticos y procedimientos quirúrgicos, incluyendo tonsilectomías, adenoidecto ias, y timpanocentesis. En los Estados Unidos, los costos de tratamiento para la otitis media se estima que están entre mil y dos mil millones de , dólares por año. En casos de otitis media, M. catarrhalis comúnmente es coaislado a partir del fluido del oído medio junto con Streptococcus pneumoniae y Haemophílus influenzae no tipificable, los cuales se cree que son responsables del 50% y del 30% de las infecciones de otitis media, respectivamente. Se cree que_ M. catarrhalis es responsable de aproximadamente -20% de las infeccion-es de otitis media (ref. 15) . Los reportes epidemiológicos indican que el número de casos de otitis media atribuibles a M. catarrhalis es cada vez mayor, junto con el número de aislados resistentes a .los antibióticos de M. catarrhalis . De este modo, antes de los años 1970, no habían sido reportados aislados de M. catarrhalís productores de ß-lacta asa, pero desde mediados de los añps setenta, ha sido detectado un número cada vez mayor de aislados que expresan ß-lactamasa. Los estudios recientes sugieren que el 75% de los aislados clínicos producen ß-lactamasa (ref. 16, 26) . El hierro es un nutriente esencial para el desarrollo de muchas bacterias. Muchas especies _ bacterianas, incluyendo M. catarrhalis, obtienen hierro del huésped mediante el uso de proteínas receptoras de transferrina, para capturar la transferrina.- Un número de bacterias incluyendo Neisseria meningitidis (ref. 17) , N. gonorrhoeae (ref. 18), Haemophilus influenzae (ref. 19), así como M. catarrhalis {reí. 20) , producen proteínas membranales externas las cuales se enlazan específicamente a la transferrina humana. La expresión de estas proteínas es regulada por la cantidad de hierro en el ambiente . Las dos proteínas receptoras de transferrina de M. catarrhalis, designadas proteína 1 de enlace a transferrina (Tbpl) y proteína 2 de enlace a transferrina (Tbp2) , tienen pesos moleculares de 115 kDa (Tbpl) y aproximadamente 80 a 90 kDa (Tbp2) . De manera contraria, las proteínas receptoras de transfer^ina de otras bacterias, las cuales tienen una afinidad para la apotransferrina, los receptores Tbp2 de 14. catarrhalis tienen una afinidad preferida para la transferrina saturada con hierro (por ejemplo, ferri-transferrina) , (ref. 21). La infección por M. catarrhalis puede conducir a enfermedad seria. Sería ventajoso proporcionar una fuente recombinante de proteínas de enlace a la transferrina como antigenos en preparaciones inmunogénicas incluyendo vacunas, portadores para otros antígenos e inmunógenos, y la generación de reactivos de diagnóstico. Los genes que codifican para las proteinas de enlace a la transferrina y los fragmentos de la misma son particularmente deseables y útiles en la identificación y diagnóstico específico de Moraxella y para _la inmunización contra la enfermedad provocada por M. catarrhalis y para la generación de reactivos de diagnóstico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida hacia la provisión de moléculas purificadas y aisladas de ácido nucleico que codifican para un receptor de la transferrina de una cepa de Moraxella, o un fragmento o- un análogo de la proteína receptora de la transferrina. _Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente son útiles para- la detección específica de cepas de Moraxella y para el diagnóstico de infección por Aforaxella. Las moléculas de ácido nucleico purificadas y aisladas, proporcionadas en la presente, tales co o ADN, son también útiles para la expresión de los genes Tbp por medios de ADN recombinante para ia provisión, de una manera económica, de proteínas receptoras de transferrina, purificadas y aisladas, así como subunidades, fragmentos o análogos de -las mismas . El receptor de transferrina, subunidades o fragmentos del mismo o análogos del mismo, así como las olécuias de ácido nucleico que codifican para los mismos y para los vectores que contienen tales moléculas de ácido nucleico, son útiles en composiciones inmunogénicas para vacunar contra enfermedades provocadas por Moraxella, para el diagnóstico de infección de Moraxella y como herramientas para la generación de reactivos inmunológicos. Los anticuerpos monoclonales o antisueros monoespecíficos (anticuerpos) producidos contra la proteina receptora de transferrina, producidos de acuerdo con aspectos de la presente invención, son útiles para el diagnóstico de la infección por Moraxella, la detección específica de Moraxella (por ejemplo en ensayos in vitro e in vivo) y para el tratamiento de enfermedades provocadas por Moraxella . De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula purificada y aislada de ácido nucleico que codifica para una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella, más particularmente una cepa de M. catarrhalis, específicamente^ M. catarrhalis cepa 4-223, Q8 o Rl, o un fragmento o un análogo de la proteína receptora de transferrina. En una modalidad preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico puede codificar- únicamente para la proteína Tbpl de la cepa de Moraxella, o únicamente para la proteína Tbp2 de la cepa de Moraxella. En otra modalidad preferida de la invención, el ácido nucleico puede codificar para un fragmento de la proteina receptora de transferrina de una cepa de Moraxella que tiene una secuencia de aminoácidos que está conservada. En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una molécula purificada y aislada de ácido nucleico que tiene una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de (a) „ una secuencia de ADN como se describe en las Eiguras 5, 6, 10, 11 ó 27 (Seq ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45 ó 46) o la secuencia de ADN complementario para las mismas; (b) una secuencia de .ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos como se describe en las Figuras 5, 6, 10, 11 ó 27 (Seq ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 47) o la secuencia de ADN complementaria a éstas; y (c) una secuencia de ADN que se hibrida bajo condiciones estrictas a cualquiera de las secuencias de ADN definidas en (a) o (b) . La secuencia de ADN definida en (c) tiene preferentemente al menos aproximadamente 90% de identidad secuencial con cualquiera otra de las secuencias de ADN definidas en (a) y (b) . La secuencia de ADN definida en (c) puede ser aquella que codifica para la proteína receptora de la transferrina, equivalente, proveniente de otra cepa de Moraxella. En un aspecto adicional, la presente invención incluye un vector adaptado para la transformación de un huésped, que comprende una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente, y puede tener las características de una- secuencia nucleotídica contenida dentro de los vectores LEM3-24, pLEM3. pLEM25, pLEM23, SLRD-A, DS-1698-1-1, DS-1754-1, pSLRD2, pSLRD3, pSLRD4 y pSLRDS.

El vector puede ser adaptado para la expresión del xeceptor de transferrina codificado, fragmentos o análogos del mismo, en un huésped heterólogo u homólogo, ya sea en una forma lipidada o no lipidada. En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un vector de expresión adaptado para la transformación de un huésped que comprende una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente, y los medios de expresión operativamente acoplados a la molécula de ácido nucleico, para la expresión por parte del huésped de la proteína receptora de transferrina o el fragmento análogo de la proteína receptora de transferrina. En las modalidades específicas de este aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico puede codificar -sustancialmente para toda la proteína receptora de la transferrina, únicamente para la proteína Tbpl, únicamente para la proteína Tbp2 de la cepa de Moraxella o para fragmentos de las proteínas Tbpl y Tbp2. Los medios de expresión pueden incluir un promotor y una porción de ácido nucleico que codifica para una secuencia guía para la secreción a partir del huésped de la proteína receptora de transferrina o el fragmento o el análogo de la proteína receptora de transferrina. Los medios de expresión pueden también incluir una porción de ácido nucleico que codifica para una señal de lipidación para la expresión a partir del huésped, de una forma lipidada de la proteína receptora de transferrina o el fragmento o el análogo de la proteína receptora de transferrina. El huésped puede ser seleccionado de, por ejemplo, Escherichia coli , Bordetella, Bacillusr Haemophil us, Moraxella, hongos, levaduras o baculovirus y pueden ser utilizados sistemas de expresión virales como el virus de Semliki Forest. En una modalidad particular, el plásmido adaptado para la expresión de Tbpl es el pLEM29 y aquel para la expresión de Tbp2 es pLEM33. Los vectores adicionales incluyen pLEM37, SLRD35-A y SLRD-35-B. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un huésped transformado que contiene un vector de expresión como se proporciona en la presente. La invención incluye además una proteína recombinante receptora de transferrina o un fragmento o un análogo de la misma, de una cepa de Moraxella producible por el huésped transformado . Tal proteína recombinante _ receptora de transferrina puede ser proporcionada sustancialmente en forma pura de acuerdo a un aspecto adicional de la invención, la cual proporciona un método para la formación de una proteína recombinante receptora "de transferrina, sustancialmente pura, la cual comprende el desarrollo del huésped transformado proporcionado en éste- para expresar una proteína receptora de transferrina como cuerpos de inclusión, purificando los cuerpos de inclusión libre de material celular y de las proteínas solubles, solubilizando la proteína receptora de transferrina a partir de los cuerpos de inclusión purificados, y purificando la proteína receptora de transferrina para liberarla de otros materiales solubilizados . La proteína recombinante receptora de transferrina, sustancialmente pura, puede comprender Tbpl solo, Tbp2 solo o una mezcla de los mismos. La proteína recombinante es en general al menos aproximadamente 70% pura, preferentemente al menos aproximadamente 90% pura. Los aspectos adicionales de la presente invención, por lo tanto, proporcionan proteiná Tbpl reco binantemente producida de una cepa de Moraxella desprovista de la proteína Tbp2 de la cepa "de Moraxella y cualquier otra proteína de la cepa de Moraxella y la proteína Tbp2 producida recombinantemente de una cepa de Moraxella desprovista de la proteína Tbpl de la cepa de Moraxella, y cualquier otra proteina de la cepa de Moraxella . La cepa de Moraxella puede ser M. catarrhalis cepa 4223, M. catarrhalis cepa Q8 o M. catarrhalis cepa Rl.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende al menos un componente activo seleccionado de al menos una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente, y al menos una proteína recombinante como se proporciona en la presente, y un portador farmacéuticamente aceptable para la misma o un vector para la misma. Al menos un componente activo produce una respuesta inmune cuando se administra a un huésped. Las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente pueden ser formuladas como vacunas para la administración in vivo a un huésped. Para tal propósito, las composiciones pueden ser formuladas como una micropartícula, cápsula, ISCOM o preparación de liposo a. La composición inmunogénica puede ser proporcionada en combinación con una molécula objetivo para la distribución a las células específicas del sistema inmune o a las superficies mucosales. Las composiciones inmunogénicas de la invención (incluyendo vacunas) pueden comprender además al menos otro material inmunogénico o i-nmunoestimulador y el material inmunoestimulador puede ser al menos un adyuvante o al menos una citosina. Los adyuvantes adecuados para el uso en la presente invención (pero no están limitados a) fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A, derivados y componentes de los mismos, matriz ISCOM, fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de zinc, un análogo de glucolípido, un éster de octadecilo de un aminoácido, un polifosfazeno dipéptido de muramilo, ISCOPREP, DC-chol, DDEA y una lipoproteína. Las combinaciones ventajosas de adyuvantes se describen en las Solicitudes de Patente Norteamericana copendientes Nos. 08/261,194 presentada el 16 de junio de 1994 y 08/483,856 presentada el 7 de junio de 1995, cedidas a la cesionaria de la presente, y las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente (WO95/34308) . De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para la generación de una respuesta inmune en un huésped, que comprende el paso de administrar a un huésped susceptible, tal como un humano, una cantidad efectiva de la composición inmunogénica proporcionada en la presente. La respuesta inmune puede ser una respuesta inmune humoral o mediada por células, y puede proporcionar protección contra enfermedad provocada por -Moraxella . Los huéspedes en los cuales puede ser conferida la protección la enfermedad, incluyen primates, incluyendo los humanos. En un aspecto adicional, se proporciona un vector vivo para la distribución del receptor de transferrina a un huésped, que comprende un vector que contiene la molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente. El vector puede ser seleccionado de Salmonella, BCG, adenovirus, poxvirus, vaccinia y poliovirus.

Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente son útiles en aplicaciones diagnósticas. En consecuencia, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la determinación de la presencia, en una muestra, del ácido nucleico que codifica para una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella, que comprende los pasos de: a) el poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico, como se proporciona en la presente, para producir dúplex o parejas que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquier molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella presente en la muestra, e~ hibridizable específicamente con ésta; y b) la determinación de la producción de las parejas o dúplex. Además, la presente invención proporciona un equipo de diagnóstico para la determinación de la presencia, en una muestra, del ácido nucleico que codifica para una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella, que comprende: a) una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente; b) los medios para poner en Contacto la molécula de ácido" nucleico con la muestra, para producir dúplex o parejas que comprenden la "molécula de ácido nucleico y cualquier ácido nucleico presente en la muestra, y que se puede hibridar con la molécula de ácido nucleico; Y c) los medios para la determinación de la producción de las parejas o dúplex. La invención incluye además el uso de las moléculas de ácido nucleico y las proteinas proporcionadas en la presente, como medicamentos. La invención incluye además el uso de las moléculas de ácido nucleico y las proteínas proporcionadas en la presente, en la fabricación de medicamentos para la protección contra infecciones por cepas de- Maraxella . Las ventajas de la presente invención, incluyen: - una molécula aislada y purificada de ácido nucleico que codifica para una proteína receptora de transferrina de una cepa de Moraxella o un fragmento o un análogo de la protelna receptora de transferrina; proteínas receptoras de transferrina recombinantemente producidas, incluyendo Tbpl y Tbp2, libre de cualesquiera otras proteínas y proteínas de Moraxella; y equipos de diagnóstico y reactivos inmunológicos para la identificación específica de Moraxella. 1 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención será además comprendida a partir de la siguiente descripción Con re'ferencia a los dibujos, en los cuales: la Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos (Seq ID NOs: 17 y 18) " de una porción conservada de las proteínas de Tbpl utilizadas para la síntesis de los cebadores degenerados utilizados para la amplificación por PCR de una porción del gen de tbpA de M. catarrhalis 4223; la Figura 2 muestra un mapa de restricción del clon LEM3-24 que contiene los genes tbpA y tbpB del aislado de M. catarrhalis 4223; la -Figura 3 muestra un mapa de restricción del gen tbpA para M. catarrhalís 4223; la Figura 4 muestra un mapa de restricción del gen tbpB para M. catarrhalis 4223; la Figura 5 muestra la secuencia nucleotídica del gen bpA (Seq ID NO. 1 - secuencia completa y Seq ID NO. 2 -secuencia de codificación) y la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína Tbpl de M. catarrhalis 4223 (Seq ID NO. 9 - longitud completa y Seq ID NO. 10 - proteina madura) . La secuencia guía (Seq ID NO. 19) se muestra por el subrayado; la Figura 6 muestra la secuencia nucleotídica del gen tbpB (Seq ID NO. 3 - secuencia completa y Seq ID NO. 4 - secuencia de codificación) y la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína Tbp2 de M. catarrhalis 4223 {Seq ID NO. 11 - longitud completa y Seq ID NO. 12 - proteina madura) . La secuencia guía (Seq ID NO. 20) es mostrada por el subrayado; la Figura 7 muestra un mapa de restricción del clon SLRD-A que contiene los genes tbpA y tbpB de M. catarrhalis Q8; la Figura 8 muestra un mapa de restricción del gen tbpA de M. catarrhalis Q8; la Figura 9 muestra un mapa de restricción del gen tbpB de M. catarrhalís Q8; la Figura 10 muestra la secuencia nucleotídica del gen tbpA (Seq ID NO. 5 - secuencia completa y Seq ID NO. 6 - secuencia de codificación) y la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína Tbpl de M. catarrhalis Q8 (Seq ID NO. 13 - longitud completa y Seq ID NO. 14 -proteína madura) ; la Figura 11 muestra la secuencia nucleotídica del gen tbpB (Seq ID NO. 7 - secuencia completa y Seq ID NO. 8 - secuencia de codificación) y la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína Tbp2 de M. catarxhalis Q8 (Seq XD NO. 15 - longitud completa y Seq ID NO. 16 -proteína madura) ; la Figura 12 muestra una comparacidn de las secuencias de aminoácidos de Tbpl de M. catarrhalis cepa 4223 (Seq ID NO. 9) y Q8 {Seq ID NO. 13), H. Tnfluenzae cepa Eagan (Seq ID NO. 21) , N. meníngi tidis cepa B16B6 (Seq ID NO. 22) y M982 (Seq ID NO. 23), y N. gonorrhoeae cepa FA19 (Seq ID NO. 24) . Las líneas discontinuas indican residuos idénticos y han sido insertados guiones para alineamiento máximo; la Figura 13 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Tbp2 del aislado 4223 de M. catarrhalis (Seq ID NO. 11) y Q8 (Seq ID NO. 15), H. influenzae cepa Eagan (Seq ID NO. 25) , N. meníngi tidis cepa B16B6 (Seq ID NO. 26) y M918 (Seq ID NO. 27), y N. gonorrhoeae cepa FA19 (Seq ID NO. 28) . Las líneas discontinuas indican residuos idénticos y han sido insertados guiones para alineamiento máximo; la Figura 14 muestra la construcción_del plásmido pLEM29 para la expresión de la proteína Tbpl recombinante de E. coli; la Figura 15 muestra un análisis de SDS-PAGE de la expresión de la proteína Tbpl por células de E. coli transformadas con el plásmido pLEM29; la Figura 16 muestra un diagrama de flujo para la purificación de la proteína Tbpl recombinante; la Figura 17 muestra un análisis de SDS-PAGE de la proteína Tbpl recombinante, purificada; la Figura 18 muestra la construcción del plásmido pLEM33 y pLEM37 para la expresión del gen TbpA de M. catarrhalis 4223 en E. coli, con y sin una secuencia guia, respectivamente. ; la Figura 19 muestra un análisis de SDS-PAGE de la expresión de la proteína rTbp2 por células de E. coli transformadas con el plásmido pLEM37; la Figura 20 muestra la construcción del plásmido SLRD35B para la expresión del gen tbpB de M. catarrhalis Q8 en E. coli, sin una secuencia guia, y la construcción del plásmido SLRD35A para la expresión del gen tbpB de M. catarrhalis Q8 en E. coli, con una secuencia guía. El sitio de restricción B = BamHl; Bg = Bgl II; H = Hind III; R = EcoRI; la Figura 21 muestra un análisis de SDS-PAGE de la expresión de la proteína rTbp2 en células de E. coli, transformadas con los plásmidos SLRD35A y SLRD35B; la Figura 22 muestra un diagrama de flujo para la_ purificación de la proteína Tbp2 recombinante a partir de E. coli} la Figura 23, la cual incluye Paneles A y B, muestra un análisis de SDS-PAGE de la purificación de la proteína Tbp2 recombinante de M. catarrhalis cepas 4223 (Panel A) y Q8 (Panel B) a partir de ia expresión en E. coli; la Figura 24 muestra el enlace de Tbp2 a la transferrina humana; la Figura 25, la cual incluye los Paneles A, B y C, muestra la conservación antigénica de la proteína Tbp2 contra las cepas de M. catarrhalis; la Figura 26 muestra un mapa de xestricción del gen tbpB para M. catarrhalis Rl; la Figura 27 muestra la secuencia nucleotídica del gen tbpB (Seq ID NO. 45 - secuencia -Completa y Seq ID NO. 46 - secuencia de codificación) y la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína Tbp2 de M. catarrhalis Rl (Seq ID NO. 47) ; y la Figura 28 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Tbp2 para M. catarrhalis 4223-(Seq ID NO. 21), Q8 (Seq ID NO. 15) y Rl (Seq ID NO. 47). Las líneas discontinuas indican residuos idénticos y han sido insertados guiones para el alineamiento máximo. Los asteriscos indican codones de detención.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN Cualquier cepa de Moraxella puede ser convenientemente utilizada para proporcionar el ácido nucleico purificado y aislado, el cual puede estar en la forma de moléculas de ADN, que comprende al menos una porción del ácido nucleico que codifica para un receptor de transferrina, como es tipificado por las modalidades de la presente invención. Tales cepas son en general disponibles de las fuentes clínicas y de las colecciones de cultivo bacterianos, tales como la Colección Norteamericana de Cultivos de Especies (American Type Culture Collection) . En esta solicitud, los términos "receptor de transferrina" (Tf-.) y "proteínas de enlace a la transferrina" (Tbp) son utilizadas para definir una familia de proteínas Tbpl y/o Tbp2 la cual incluye aquellas que tienen variaciones en sus secuencias de aminoácidos incluyendo aquellas de origen natural que se" encuentran en diversas cepas de, por ejemplo, Moraxella . Las moléculas de ADN purificadas y aisladas que comprenden al menos una porción que codifica para el receptor de la transferrina de la presente invención, también incluyen aquellas que codifican para los análogos funcionales de las proteínas Tbpl y Tbp2 del receptor de la transferrina de Moraxella . En esta solicitud, una primera proteína es un "análogo funcional" de una segunda proteína si la primera proteína está inmunológicamente relacionada a y/o tiene la misma función que la segunda proteína. El análogo funcional puede ser, por ejemplo, un fragmento de la proteína, o un mutante de sustitución, adición o supresión de la misma. El ADN cromosómico de M. catarrhalis 4223 fue digerido con Sau3A con el fin de generar fragmentos dentro de un intervalo de tamaño de 15 a 23 kb, y se clonó dentro del sitio BamHl del vector lambda EMBL3. La genoteca fue seleccionada con antisuero de cobayo anti-Tbpl, y un clon positivo LEM3-24, que contiene un inserto de aproximadamente 13.2 kb de tamaño, fue seleccionado para el análisis adicional. El lisado proveniente de E. coli LE392 infectado con LEM3-24, se encontrón que contiene una proteína de aproximadamente 115 kDa de tamaño, la cual reaccionó sobre los manchados de Western con antisueros anti-Tbpl. Una segunda proteína, de aproximadamente 80 kDa de tamaño, reaccionó con los antisueros de cobayo anti-Tbp2 sobre manchados de Western. Con el fin de localizar el gen tbpA sobre el inserto de 13.2 kb de LEM3-24, se utilizaron cebadores PCR degenerados para amplificar una región pequeña del gen tbpA putativo de M. catarrhalis 4223. Las secuencias de los cebadores oligonucleotídicos degenerados estuvieron basadas en las secuencia de aminoácidos conservados dentro de las proteínas Tbpl de varias especies de Neisseria y Baemopilus y se muestran en la Figura 1 (Seq ID NOs. 17 y 18) . Se generó un producto amplificado de 300 pares de bases y su sitio dentro del gen tbpA de 4223 es indicado por letras negritas en la Figura 5 (Seq ID NO. 29) . El producto amplificado fue subclonado dentro del vector pCRII, marcado, y utilizado para sondear un manchado de Southern que contiene el clon LEM3-24 de ADN digerido con endonucleasa de restricción. La sonda se híbrido a los fragmentos indlII-HindlII de 3.8 kb, un AvrlI-AvII de 2.0 kb, y Salí-Sphl de 4.2 kb (Figura 2). El fragmento J?indIII-HindIII de 3.8 kb fue subclonado dentro de pACYC177, y se secuenció. Se identificó una estructura de lectura abierta grande, y subsecuentemente se encontró que contenía aproximadamente 2 kb del gen tbpA putativo. El 1 kb restante del gen tpbA fue obtenido mediante subclonación de un fragmento HindlII-HindlII corriente abajo (en dirección 3') dentro del vector pACYC177. La secuencia nucleotídica del_~ gen tbpA de M. catarrhalis 4223 (Seq ID NOs: 1 y 2) , y la secuencia deducida de aminoácidos (Seq ID NO. 9 - longitud completa; Seq ID NO. 10 proteína madura) se muestran en la Figura 5. El ADN cromosómico de M. catarrhalis cepa Q8 fue-digerido con Sau3A I y los fragmentos de 15-23 kb fueron" ligados con los brazos BamHl de EMBL3. Se generó una" genoteca de alto título en células de E. coli LE392, y se seleccionó utilizando sondas oligonucleotídicas basadas en la secuencia tbpA de 4223. El ADN fago fue preparado y el análisis con enzima de restricción reveló que los insertos de aproximadamente 13-15 kb habían sido clonados. El clon fago SLRD-A fue utilizado para subclonar los fragmentos para el análisis secuencial. Se generó un vector de clonación (pSKMA) para facilitar la clonación de los fragmentos, y se generaron los plásmidos pSLRDl, pSLRD2, pSLRD3, pSLRD4 y pSLRD5 que contienen todo el tbpA y la mayor parte del tbpB. El nucleótido {Seq ID NOs. 5 y 6) y la secuencia deducida de aminoácidos (Seq ID NO. 13 -longitud completa, Seq ID NO. 14 - proteína madura) del gen tbpA de la cepa Q8 se muestran en la Figura 10. Las secuencias deducidas de aminoácidos para la proteína Tbpl codificada por los genes tbpA se encontró que comparten alguna homología con las secuencias de aminoácidos codificadas por los genes provenientes de un número de especies de Neisseria y Haemophilus (Figura 12; Seq ID NOs: 21, 22, 23 y 24) . Antes del presente descubrimiento, los genes tbpA identificados en las especies de Neisseria, Haemophil us, y Actinobacillus se ha encontrado que están precedidos por un gen tbpB con varias regiones conservadas. Los dos genes típicamente están separados por una secuencia intergénica corta. No obstante, no se encontró un gen tbpB en dirección 5' del gen tbpA en M. catarrhalis 4223. Con el fin de localizar el gen tbpB dentro del inserto de 13.2 kb del clon LEM3-24, se sintetizó una sonda oligonucleotídica degenerada basada en una secuencia de aminoácidos ÍGGFYGP (Seq ID NO. 30) , conservada entre las proteínas Tbp2 de varias especies. El oligonucleótido fue marcado y utilizado para sondear una mancha de Southern que contenía diferentes fragmentos de endonucleasa de restricción del clon LEM3-24. La sonda se hibridó al fragmento Nhel-Sall de 5.5 kb, el cual subsecuentemente fue clonado en pBR328, y secuenciado. El fragmento contenía la mayor parte del gen tbpB putativo, con la excepción de la región promotora. El clon LEM3-24 fue secuenciado para obtener la secuencia 5' remanente. El gen tbpB estuvo localizado aproximadamente a 3 kb con dirección 3' del extremo del gen tbpA, en contraste a la organización genética de los genes tjpA y tbpB en Haemophilus y Neisseria . La secuencia nucleotídica (Seq ID NOs: 3 y 4) del gen tbpB de M. catarrhalis 42 3 y la secuencia deducida de aminoácidos (Seq ID NOs: 11, 12) se muestran en la Figura 6. El gen tbpB de M. ca tarrhalis Q8 fue también clonado y secuenciado. La secuencia nucleotídica (Seq ID NOs: 7 y 8) y la secuencia deducida de aminoácidos (Seq ID NOs: 15 y 16) se muestran en la Figura 11. El gen tbpB de M. catarrhalis Rl fue también clonado y secuenciado. La secuencia nucleotídica (Seq ID NOs: 45 y 46) y la secuencia deducida de aminoácidos (Seq ID NO. 47) se muestran en la Figura 27. Las regiones de homología son evidentes entre la secuencia de aminoácidos de Tbp2 de M. catarrhalis como se muestra en la alineación comparativa de la Figura 28 (Seq ID NOs: 11, 15 y 47) y entre las secuencias de aminoácidos Tbp2 de M. catarrhalis y las secuencias Tbp2 de un número de especies de Neisseria y Haemophil us, como se muestran en la alineación comparativa en la Figura 13 {Seq ID NOs: 25, 26, 27, 28) . Los genes clonados tbpA y tbpB fueron expresados en E. coli para producir las proteínas Tbpl y Tbp2 recombinantes libres de otras proteínas de Moraxella . Estas proteínas recombinantes fueron purificadas y utilizadas para inmunización. La conservación antigénica de la proteína Tbp2 entre cepas de M. catarrhalis fue_ demostrada por la separación de las proteínas en lisados de células completas de M. catarrhalis o cepas de E. coli que expresan las proteínas Tbp2 recombinantes mediante SDS-PAGE e inmunomanchado de antisuero con el antisuero anti-4223 de rTbp2 o el antisuero anti-Q8 rTbp2 producido en cobayo. Fueron probadas M. catarrhalis cepas 3, 56, 135, 585, 4223, 5191, 8185 y ATCC 25240 de esta manera, y todas mostraron reactividad específica con el anticuerpo anti-4223 rTbp2 o anti-Q8 rTbp2 (Figura 25) . Además, en la Tabla 1 siguiente se muestra la habilidad de los anticuerpos anti-rTbp2 provenientes de una cepa, para reconocer la proteina nativa recombinante de la cepa homologa o heteróloga mediante ELISA. El secuenciamiento o secuenciación de aminoácidos de los. extremos N y los fragmentos de bromuro de cianógeno del receptor de la transferrina provenientes de M. catarrhalis A223 fue también llevado a cabo. Arabos extremos N de Tbpl y Tbp2 fueron bloqueados. Las secuencias de señal putativas de Tbpl y Tbp2 son indicadas por el subrayado en las Figuras 5 y 6 (Seq ID NOs: 19 y 20) respectivamente. Las secuencias deducidas de aminoácidos para la región N-terminal de Tbp2 sugiere una estructura de lipoproteína. Los resultados mostrados en las Tablas 1 y 2 siguiente ilustran la habilidad de los antisueros de cobayo anti-Tbpl y anti-Tbp2, para lisar M. catar halís. Los resultados muestran que los_ antisueros producidos mediante inmunización con las proteínas Tbpl o Tbp2 aisladas de M. catarrhalis 4223, fueron bactericidas contra una cepa RH408 de M. catarrhalis que no se aglomera, homologas (una cepa previamente depositada en relación con la Solicitud de Patente Norteamericana No. 08/328,589, cedida a la cesionaria de la presente, ( 096/12733) con la American Type Culture Collection, localizada en 1301 Paxklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA bajo los términos del Tratado de Budapest el 13 de diciembre de 1994 bajo el Depósito de la ATCC No. 55,637) derivada del aislado 4223. Además, los antisueros producidos por inmunización con la proteína Tbpl aislada de M. catarrhalis 4223, fueron bactericidas contra la cepa Q8 heteróloga que no se aglomera (una donación del Dr. M.G. Bergeron, Centre Hospitalier de l'Uniexsité Laval, St. Foy, Quebec). Además, el antisuero producido contra la proteina Tbp2 recombinante (rTbp2) fue bactericida contra la cepa homologa de M. catarrhalis. La habilidad de las proteínas de enlace a la transferrina, aisladas y purificadas, para generar anticuerpos bactericidas, es evidencia in vivo de la utilidad de estas proteínas como vacunas para proteger contra la enfermedad provocada por Moraxella . De este modo, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una vacuna contra la infección provocada por las cepas de Moraxella, que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de una proteína de enlace a la transferrina proveniente de una cepa de Moraxella, y un portador fisiológicamente aceptable para la misma. Las preparaciones de vacuna pueden comprender proteinas de enlace a la transferrina antigénica o sustancialmente divergentes. La proteína de enlace a la transferrina proporcionada en la presente es útil como un reactivo de diagnóstico, como un antígeno para la generación de anticuerpos de enlace anti-proteína transferrina, como un antígeno para la vacunación contra la enfermedad provocada por la especie de Moraxella y para detectar infección por Moraxella y otras bacterias de este tipo. La proteína de enlace a la transferrina proporcionada en la presente puede también ser utilizada como una proteina portadora para haptenos, polisacáridos o péptidos, para elaborar vacunas conjugadas contra los determinantes antigénicos no relacionados a las proteínas de enlace a la transferrina. En modalidades adicionales de la presente invención, por lo tanto, la proteína de enlace a la transferrina como se proporciona en la presente, puede ser utilizada como una molécula portadora para preparar moléculas quiméricas y vacunas conjugadas (incluyendo glucoconjugados) contra bacterias patógenas, incluyendo bacterias encapsuladas. De este modo, por ejemplo, los glucoconjugados de la presente invención pueden ser utilizados para conferir protección contra enfermedad e infección provocada por cualquier bacteria que tiene antígenos polisacáridos, incluyendo lipooligosacáridos (LOS) y PRP. Tales patógenos bacterianos pueden incluir, por ejemplo, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli , Neisseria meningitidis, Salmonella typhi , Streptococcus mutans, Criptococcus neoformans, Klebsiella, Staphul ococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa . Los antígenos particulares que pueden ser conjugados a la proteína de enlace a la transferrina y los métodos para lograr tales conjugaciones, se describen en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 08/433,522 presentada el 23 de noviembre de 1993 (W094/12641) , cedida a la cesionaria de la presente, y la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente. En otra modalidad más, la función portadora de la proteina de enlace a la transferrina puede ser utilizada, por ejemplo, para inducir una respuesta inmune contra polisacáridos anormales de células tumorales, o para producir anticuerpos antitumorales que pueden ser conjugados a agentes quimioterapéuticos o bioactivos. La invención se extiende a las proteínas de enlace a la transferrina provenientes de Moraxella catarrhalis, para el uso como un ingrediente activo en una vacuna contra la enfermedad provocada por infección con Moraxella . La invención también se extiende a una composición de vacuna farmacéutica que contiene las proteínas de enlace a la transferrina provenientes de Moraxella catarrhalis y opcionalmente, un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de las proteínas de enlace a la transferrina para la preparación de una composición de vacuna farmacéutica para la inmunización contra la enfermedad provocada por infección con Moraxella .

Es claramente aparente para - alguien de experiencia en la técnica, que las diversas modalidades de la presente invención tienen muchas aplicaciones en los campos de la vacunación, diagnóstico, tratamiento, por ejemplo, de infecciones por Moraxella y la generación de reactivos inmunológicos y otros reactivos de diagnóstico. Una discusión no limitante adicional de tales usos se presenta además en seguida. 1. Preparación y Uso de Vacuna Las composiciones inmunogénicas, adecuadas para ser utilizadas en vacunas, pueden ser preparadas a partir de proteínas inmunogénicas receptoras de la transferrina, análogos y fragmentos de la misma, codificados por las moléculas de ácido nucleico, así como las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente. La vacuna provoca una respuesta inmune que produce anticuerpos, incluyendo anticuerpos anti-receptor de transferrina y anticuerpos que son de opsonización o bactericidas. Si el sujeto vacunado es retado con Moraxella, los anticuerpos se enlazan al receptor de la transferrina y con esto previenen el acceso de la bacteria a una fuente de hierro -que es requerida para la viabilidad. Además, la opsonización o los anticuerpos bactericidas anti-receptor de transferrina, pueden también proporcionar protección mediante mecanismos alternativos.

Las composiciones inmunogénicas, incluyendo vacunas, pueden ser preparadas como inyectables, como soluciones líquidas o emulsiones. Las proteínas receptoras de transferrina, los análogos y fragmentos de las mismas y las moléculas de ácido nucleico que las codifican, pueden ser mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con las proteínas receptoras de transferrina, los fragmentos, análogos o moléculas de ácido nucleico. Tales excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden además contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores del pH, o adyuvantes, para mejorar la efectividad de las vacunas. Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden ser administradas parenteralmente, mediante inyección subcutánea, intradérmica o intramuscularmente. Alternativamente, las composiciones inmunogénícas proporcionadas de acuerdo a la presente -inyección, pueden ser formuladas y distribuidas de una manera para provocar una respuesta inmune en las superficies mucosales. De este modo, la composición inmunogénica puede ser administrada a las superficies mucosales mediante, por ejemplo, las rutas nasal u oral (intragástricas) . La composición inmunogénica puede ser proporcionada en combinación con una molécula objetivo para la distribución en las células específicas del sistema inmune, o a las superficies mucosas. Algunas de tales moléculas objetivo incluyen la vitamina B12 y fragmentos de toxinas bacterianas, como se describe en la Patente Internacional 092/17167 {Biotech Australia Pty. Ltd.), y anticuerpos monoclonales, como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,194,254 (Barber y colaboradores) . Alternativamente, pueden ser deseables otros modos de administración, incluyendo supositorios y formulaciones orales. Para supositorios, se pueden incluir aglutinantes y portadores, por ejemplo, polialquenglicoles o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones pueden tomar las formas de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contener aproximadamente 1 a 95% de las proteínas receptoras de transferrina, fragmentos, análogos y/o moléculas de ácido nucleico. Las vacunas son administradas de una manera compatible con la formulación de dosis, y en una cantidad tal que será terapéuticamente efectiva, protectora e inmunogénica. La cantidad que va a ser administrada depende del sujeto que va a ser tratado, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, y, si se necesita, para producir la respuesta inmune mediada por células. Las cantidades precisas del ingrediente activo requerido para ser administrado, dependen del juicio del practicante. No obstante, los intervalos de dosis adecuados son fácilmente determinados por alguien de experiencia en la técnica, y pueden ser del orden de microgramos de las proteínas receptoras de transferrina, análogos y fragmentos de las mismas, y/o moléculas de ácido nucleico. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo, son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por administraciones subsecuentes. La dosis de la vacuna puede también depender de la ruta de administración y variará de acuerdo al tamaño del huésped. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para el receptor de la transferrina de Moraxella, pueden ser utilizadas directamente para la inmunización mediante administración del ADN directamente, por ejemplo, mediante inyección para inmunización genética o mediante construcción de un vector vivo, tal como Salmonella, BCG, adensvirus, poxvírus, vaccinia o poliovirus que contienen las moléculas de ácido nucleico. Una descripción de algunos vectores vivos que han sido utilizados para llevar los antígenos heterólogos hacia el sistema inmune, está contenida por ejemplo en 0' Hagan (ref. 22) . Los procesos para la inyección directa del ADN dentro de los sujetos de prueba para la inmunización genética se describen por ejemplo en Ulmer y colaboradores (ref. 23). La inmunogenicidad puede ser significativamente mejorada si los antígenos son coadministrados con adyuvantes, comúnmente utilizados como una solución al 0.05-1.0 por ciento en solución salina amortiguada con fosfato. Los adyuvantes mejoran la inmunogenicidad de un antígeno, pero no son necesariamente inmunogénicos púr sí mismos. Los adyuvantes pueden actuar mediante la retención del antígeno localmente cerca del sitio de administración, para producir un efecto depósito facilitando una liberación sostenida y lenta del antígeno hacia las células del sistema inmune. Los adyuvantes pueden también atraer a las células del sistema hacia un depósito de antígeno y estimular tales células para provocar _las respuestas inmunes . Los agentes o adyuvantes inmunoestimuladores han sido utilizados por muchos años para mejorar las respuestas inmunes del huésped, por ejemplo, para las vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como lipopolisacáridos, normalmente son los componentes de bacterias muertas o atenuadas utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que están típicamente no covalentemente enlazados a los antígenos, y son formulados para mejorar las respuestas inmunes del huésped. De este modo, han sido identificados adyuvantes que mejoran la respuesta inmune a los antígenos distribuidos parenteralmente- Algunos de estos adyuvantes son tóxicos, no obstante, y pueden provocar efectos colaterales indeseables, haciéndolos inadecuados para el uso en humanos y en muchos animales. Por supuesto, únicamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (colectiva y comúnmente denominados como alumbre) "son rutinariamente utilizados como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia del alumbre en las respuestas de anticuerpo cada vez mayores para los toxoides de la difteria y del tétanos, está bien establecida y una vacuna de HBsAg ha sido -agregada con adyuvante de alumbre. Mientras que la utilidad del alumbre es bien establecida para algunas aplicaciones, ésta tiene limitaciones. Por ejemplo, el alumbre es inefectivo para la vacunación contra la influenza y provoca inconsistentemente, una respuesta inmune mediada por las células. Los anticuerpos producidos por los antígenos adyuvados por el alumbre, son principalmente del isotipo IgGl en el ratón, los cuales no pueden ser óptimos para la protección por algunos agentes de vacuna.

Una amplia gama de adyuvantes extrínsecos pueden provocar respuestas inmunes potentes a los antígenos . Éstos incluyen saponinas formadas en complejo a los antígenos de proteína membranal (complejos de estimulación inmune) , polímeros plurónicos con aceite mineral, micobacterias muertas y aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos, tales como dipéptido de muramilo (MDP) y lipopolisacá-rido (LPS) , asi como lipido A y liposomas. Para inducir eficientemente las respuestas inmunes humorales (HIR) y la inmunidad mediada por células (CMT) , los ínmunógenos son frecuentemente emulsificados en adyuvantes. Muchos adyuvantes son tóxicos, induciendo granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA) , citolisis (saponinas y polímeros plurónicos) y pirogenicidad, artritis y uveítis anterior (LPS y MDP) . Aunque el FCA es un excelente adyuvante y ampliamente utilizado en la investigación, éste no está probado para el uso en vacunas humanas y veterinarias, debido a su toxicidad. Las características deseables de los adyuvantes ideales incluyen: 1) falta de toxicidad; 2) habilidad para estimular una respuesta inmune de larga duración; 3) simplicidad de fabricación y estabilidad en el almacenamiento a largo plazo; 4) habilidad para provocar CMI y HIR a los antígenos administrados mediante diversas rutas, si se requiere; 5) sinergia con otros adyuvantes; 6) capacidad de interactuar selectivamente con poblaciones de células presentadoras de antígeno (APC) ; — 7) habilidad para provocar específicamente respuestas inmunes apropiadas específicas de células T l o Th2; y 8) habilidad para incrementar selectivamente los niveles apropiados de isotipo de anticuerpo (por ejemplo IgA) contra antígenos. La Patente Norteamericana No. 4,855,283 otorgada a Lockhoff y colaboradores del 8 de agosto de 1989, la cual es incorporada en la presente por referencia, enseña los análogos de glucolipido que incluyen N-glucosilamidas, N-glucosilureas y N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales está sustituido en el .residuo de azúcar por un aminoácido, como inmunomoduladores o adyuvantes. De este modo, Lockhoff y colaboradores 1991 (ref. 2~4) reportaron que los análogos de N-glucolípido que muestran similitudes estructurales a los glucolípidos de origen natural, tales como glucofosfolípidos y glucoglicerolípidos, son capaces de provocar respuestas inmunes fuertes en las vacunas del virus del herpes simple y vacuna del virus de la pseudorrabia. Algunos glucolípidos han sido sintetizados a partir de alquilaminas de cadena larga y ácidos grasos que son enlazados directamente con los azúcares a través del átomos de carbono anomérico, para imitar las funciones de los residuos lipidíeos de origen natural. La Patente Norteamericana No. 4,258,029 otorgada a Moloney, cedida a la cesionaria de la presente e incorporada por referencia a la misma, enseña que el clorhidrato de octadecil-tirosina (OTH) funciona como" un adyuvante cuando se forma en complejo con el toxoide tetánico y la vacuna del virus de la poliomielitis tipo I, II y III inactivada con formalina. También, Nixon-George y colaboradores 1990, (ref. 25) reportaron que los esteres de octadecilo de los aminoácidos aromáticos formados en complejo con un antígeno recombinante superficial de la hepatitis B, mejoraban las respuestas inmunes del huésped contra el virus de la hepatitis B. 2. Inmunoensayos Las proteínas receptoras de la transferrina, los análogos y/o fragmentos de las mismas de la presente invención, son útiles como inmunógenos, "como antígenos en inmunoensayos, incluyendo ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) , RIAs y otros ensayos" de enlace a anticuerpos, ligados no a enzimas, o procedimientos conocidos en la técnica para la detención de anticuerpos anti-proteínas receptoras de transferrina, de Moraxella. En las pruebas de ELISA, la proteína receptora de transferrina, los análogos y/o fragmentos correspondientes a las porciones de la proteina TfR, son inmovilizados sobre una superficie seleccionada, por ejemplo, una superficie capaz de enlazarse a las proteínas o a los péptidos, tales como los pozos de una placa de microtitulación de poliestireno. Después del lavado para eliminar el receptor de transferrina incompletamente adsorbido, análogos y/o fragmentos del mismo, puede ser enlazada a la superficie seleccionada una proteína no específica tal como una solución de albúmina sérica bovina (BSA) o caseina, que es conocida como antigénicamente neutra con respecto a la muestra de prueba. Esto permite el bloqueo de los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie de inmovilización, y de este modo reduce el ruido o antecedente provocado por los enlaces no específicos de los antisueros sobre la superficie. La superficie de inmovilización es luego puesta en contacto con una muestra, tal como materiales clínicos o biológicos, para ser probada de una manera que conduce a la formación del complejo inmune (antígeno/anticuerpo) . Este procedimiento puede incluir la dilución de la muestra con diluyentes, tales como BSA, gamma-globulina bovina (BGG) y/o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) /Tween. La muestra se deja luego incubar por aproximadamente 2 a 4 horas, a temperaturas tales como de aproximadamente 25° a 37°C. Después de la incubación, la superficie puesta en contacto con la muestra es lavada para eliminar el material no formado en inmunocomplejo . El procedimiento de lavado puede incluir el lavado con una solución tal como PBS/Tween o un amortiguador de borato. Después de la formación de los inmunocomplejos específicos entre la muestra de prueba y la proteína receptora de transferrina, enlazada, análogos y/o fragmentos de la misma, y el lavado subsecuente, la aparición e incluso la cantidad de la formación de inmunocomplejo, pueden ser determinados al sujetar el inmunocomplejo a un segundo anticuerpo que tiene especificidad para el primer anticuerpo. La muestra de prueba es de origen humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo que tiene especificidad para las inmunoglobulinas humanas y en general IgG. Para proporcionar los medios de detección, el segundo anticuerpo debe tener una actividad asociada tal como una actividad enzimática que generará, por ejemplo, un desarrollo de color después de la incubación con un substrato cromogéníco apropiado. La cuantificación puede ser luego lograda mediante la medición del grado de generación de color utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro. 3. Uso de secuencias como sondas de hibridación Las secuencias nucleotídicas de la presente invención, que comprenden la secuencia del gen del receptor de la transferrina, permiten ahora la identificación y la clonación de los genes receptores de la transferrina a partir de cualquier especie de Moraxella . Las secuencias nucleotídicas que comprenden la secuencia de los genes receptores de la transferrina de la presente invención, son útiles por su habilidad para formar selectivamente moléculas dúplex o parejas ' con tramos complementarios de otros genes Tfr. Dependiendo de la aplicación, puede ser empleada una variedad de condiciones de hibridación para lograr los diversos grados de selectividad de la sonda hacia los otros genes TfR. Para un alto grado de selectividad, se utilizan condiciones relativamente estrictas para formar los dúplex o parejas, tal como baja concentración de sal y/o alta temperatura, tal como es proporcionada por cloruro de sodio 0.02 M a 0.15 M a temperatura de entre aproximadamente 50°C a 70°C. Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones de hibridación menos estrictas tales como sal 0.15 M a 0.9 M, a temperaturas en el intervalo de entre aproximadamente °C a 55°C. Las condiciones de hibridación pueden también ser hechas más estrictas mediante la adición de cantidades cada vez mayores de formamida, para desestabilizar la pareja híbrida. De este modo, las condiciones de hibridación particulares pueden ser fácilmente manipuladas, y será en general un método de elección dependiendo de los resultados deseados. En general, las temperaturas de. hibridación convenientes en presencia de 50% de formamida son: 42°C para una sonda que es 95 a 100% homologa al fragmento objetivo, 37°C para 90 a 95% de homología y 32°C_ para 85 a 90% de homología. En una modalidad diagnóstica clínica, las secuencias de ácido nucleico de los genes TfR de la pres'ente invención pueden ser utilizados en combinación con un medio apropiado, tal como un marcador, para la determinación de la hibridación. Son conocidos una amplia variedad de indicadores apropiados en la técnica, incluyendo ligandos radioactivos, enzimáticos o de otro tipo, tales como avidina/biotina y marcación con digoxigenina, los cuales son capaces de proporcionar una señal detectable. En algunas modalidades de diagnóstico, puede ser utilizada una etiqueta enzimática tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en vez de un marcador radiactivo- En el caso "de .los marcadores enzimáticos, los subtratos indicadores colori étricos son conocidos, los cuales pueden ser empleados para proporcionar un medio visible al ojo humano o espectrofotométricamente, para identificar la hibridación específica con muestras que contienen las secuencias del gen TfR. Las secuencias de ácido nucleico- de los genes TfR_ de la presente invención son útiles como sondas de hibridación en hidridaciones en solución y en las modalidades que emplean los procedimientos en fase sólida. En las modalidades que involucran los procedimientos en fase sólida, el ADN de prueba (o ARN) proveniente de las muestras, tales como muestras clínicas, incluyendo exudados, fluidos corporales (por ejemplo, suero, fluido amniótico, efusión del oido medio, esputo, fluido de lavado broncoalveolar) o incluso tejidos, es adsorbido _o de otro modo fijado a una matriz o superficie seleccionada. El ácido nucleico de hebra simple, fijado, es luego sujeto a hibridación específica con sondas selectas que comprenden, las secuencias de ácido nucleico de los genes TfR o fragmentos de los mismos de la presente invención, bajo condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares con base en los criterios particulares requeridos, dependiendo de las circunstancias particulares con base en los criterios particulares requeridos dependiendo de, por ejemplo, los contenidos de G+C, el tipo de ácido nucleico objetivo, la fuente del ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc. Después del lavado de la superficie de hibridación para eliminar las moléculas de la sonda, no específicamente enlazadas, se detecta la hibridación específica, o incluso se cuantifica, por medio del marcador. Se prefieren seleccionar las porciones de la secuencia de ácido nucleico que están conservadas entre especies de Moraxella . La sonda seleccionada puede ser de al menos 18 pares de bases y puede estar en el intervalo de aproximadamente 30 a 90 bp. 4. Expresión de los genes receptores de Transferrina Los vectores plasmídicos que contienen el replicón y las secuencias control que son derivadas de especies compatibles con la célula huésped, pueden ser utilizados para la expresión de los genes "receptores de la transferrlna en los sistemas de expresión. El vector posee ordinariamente un sitio de replicación, así como las secuencias de marcación las cuales son capaces de proporcionar la selección fenotípica de las células transformadas. Por ejemplo, E. coli puede ser transformada utilizando pBR322 que contiene los genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y de este modo proporciona los medios fáciles para identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido o fago microbiano, debe también contener, o ser modificado para contener, los promotores que puedan ser utilizados por la célula huésped para la expresión de sus propias proteínas. Además, los vectores fago que contienen las secuencias replicón y control que son compatibles con el huésped, pueden ser utilizadas como el vector de transformación en conexión, con estos huéspedes. Por ejemplo, el fago en Lambda GEM™-11 puede ser utilizado en la elaboración de los vectores fágicos recombinantes, los cuales pueden ser utilizados para transformar las células huésped, tales como E. coli LE392. Los promotores comúnmente . utilizados en la construcción de ADN recombinante incluyen ß-lactamasa (penicilinasa) y sistemas promotores de lactosa, y otros promotores bacterianos, tales como el. sistema promotor T7 como" se describe en la Patente Norteamericana No. 4,952,496. Los detalles respecto a la secuencia nucleotídica de los promotores, son conocidos, haciendo posible que alguien de experiencia en la técnica los ligue funcionalmente con los genes. El promotor particular utilizado será en. general un asunto de elección dependiendo de los. resultados deseados. Los huéspedes que son apropiados para la extensión de los genes receptores de la transferrina, fragmentos, análogos o variantes de los mismos, pueden incluir especies de E. coli, Bacillus, Haemophilus, hongos, levaduras, Moraxella, Bordetella o pueden ser utilizados los sistemas de expresión de baculovirus. De acuerdo con la presente invención, se prefiere elaborar la proteína receptora de transferrina, el fragmento o el análogo de la misma, mediante métodos recombinantes, particularmente ya que la proteína TfR de origen natural como es codificada a partir de un cultivo de una especie de Moraxella, puede incluir cantidades en trazas de materiales tóxicos u otros contaminantes. Este problema puede ser evitado mediante el uso de la proteína TfR recombinantemente producida, en sistemas heterólogos que pueden ser aislados a partir del huésped, de una manera para minimizar contaminantes en el material purificado. Los huéspedes particularmente deseables para la expresión a este r-especto incluyen bacterias Gram positivas que no tienen LPS y son, por lo tanto, libres de endotoxina. Tales huéspedes incluyen especies de Bacillus y pueden ser particularmente útiles para la producción del receptor de transferrina no pirogénico, fragmentos o análogos del mismo. Además, los métodos recombinantes de producción permiten l _ fabricación de Tbpl o Tbp2 o los análogos o fragmentos respectivos de los mismos, separados uno del otro, lo cual es distinto de las proteínas combinadas normales, presentes en Moraxella .

Depósitos Biológicos Ciertos vectores que contienen al menos una porción que codifica para una proteina receptora de la transferrina a partir de cepas de Moraxella catarrhalís cepa 4223 y Q8 y una cepa de M Catarrhalis RH408, que se describen y se refieren a la presente, han sido depositadas con la American Type Culture Collection (ATCC) localizada en 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Estados Unidos de América, de conformidad al Tratado de Budapest, y antes de la presentación, de esta solicitud. Las muestras de los vectores depositados y la cepa bacteriana se volverán disponibles al público, y las restricciones impuestas al acceso de los depósitos serán retiradas después del otorgamiento de una patente basada en esta solicitud de Patente Norteamericana. Además, el depósito será reemplazado si no pueden ser surtidas muestras viables por la Depositaría. La invención descrita y reclamada en la presente no está limitada en alcance por los materiales biológicos depositados, ya que la modalidad depositada se pretende únicamente como una ilustración de la invención. Cualesquiera vectores equivalentes o similares, o cepas que codifiquen para antígenos similares y equivalentes, como se describe en esta solicitud, están dentro del alcance de la presente invención.

Resumen del Depósito EJEMPLOS La descripción anterior describe en general la presente invención. Puede ser obtenido un entendimiento más completo por referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen solamente para fines de ilustración, y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Los cambios en la forma y sustitución de equivalentes, son contemplados como circunstancias que pueden ser sugeridos o para hacerlos expeditos. Aunque han sido empleados términos específicos en la presente, se pretende que tales términos sean en un sentido descriptivo y no para fines de limitación. Los métodos de genética molecular, de bioquímica de proteínas y de inmunología utilizados pero no explícitamente descritos en esta descripción y en estos Ejemplos, son ampliamente reportados en la literatura científica y están muy por dentro de la habilidad de aquellos de experiencia en la técnica.

Ejemplo 1 Este Ejemplo ilustra la preparación y la inmunización de cobayos con las proteinas Tbpl y Tbp2 de M catarrhalis. Las proteínas Tbpl y Tbp2 fueron obtenidas como sigue: Preparaciones de membrana total cruda privadas de hierro fueron diluidas a 4 mg de proteína/ml en Tris.HCl 50 mM-cloruro de sodio 1M, pH 8, en un volumen total de 348 ml . Las membranas se solubilizaron mediante la adición de 8 ml de cada uno de EDTA 0.5 M y 30% de -sarcosil, y las muestras se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente, con agitación suave. Las membranas solubllizadas fueron centrifugadas a lOk rpm por 20 minutos. Se agregaron 15 ml de apo-hTf-Sefarosa 4B al sobrenadante, y se incubaron por 2 horas a temperatura" ambiente, con agitación suave. La mezcla se agregó a una columna. La columna" se lavó con 50 ml de Tris.HCl 50 mM -NaCl 1 M- clorhidrato de guanidina 250 mM, para eliminar las proteínas contaminantes. Tbp2 se eluyó a partir de la columna mediante la adición de 100 ml de clorhidrato de guanidina 1.5 M. Tbpl fue eluida mediante la adición de 100 ml de clorhidrato de guanidina 3M. Las primeras fracciones de 20 ml fueron dializadas contra 3 cambios de Tris. HCl 50 mM, pH 8.0. Las muestras se almacenaron a -20°C, o se dializaron contra bicarbonato de amonio y se liofilizaron. Se inmunizaron cobayos (Charles River) intramuscularmente en el dia +1 con una dosis de 10 µg de Tbpl o Tbp2 emulsificado en adyuvante completo de Freund. Los animales fueron reforzados en los días +14 y +29 con la misma dosis de proteína emulsificada en adyuvante completo de Freund. Se tomaron muestras sanguíneas en el día +42, y se utilizaron los sueros para el análisis de la actividad de anticuerpo bactericida. Además, todos los antisueros fueron evaluados mediante análisis de inmunomanchado para reactividad con las proteínas de M. catarrhalis 4223. La actividad anticuerpo bactericida de los anticuerpos de cobayo anti- Tbpl o Tbp2 de M. catarrhalis 4223, fue determinada como sigue. Una cepa RH408 de M. catarrhalis que no se aglomera, derivada del aislado 4223, fue inoculada en 20 ml de caldo BHI, y se desarrolló por 18 horas a 37°C, agitando a 170 rpm. Un ml de este cultivo fue utilizado para inocular 20 ml de BHI suplementado con ácido etilendiamino-hidroxifenilacético 25 mM (EDDA; Sigma) . El cultivo se desarrolló a una D057ß de 0.5. Las células se diluyeron 1:200,000 en cloruro de sodio 140 mM, carbonato ácido de potasio 93 mM, barbiturato de sodio 2n mM, ácido barbitúrico 4 mM, cloruro de magnesio hexahidratado 0.5 mM, cloruro de calcio bihidratado 0.4 M, pH 7.6 (amortiguador Veronal), que contiene albúmina sérica bovina 0.1% (VBS) y se colocó sobre hielo. El antisuero de cobayo anti-Tbpl o Tbp2 de M. catarrhalis 4223, junto con los antisueros control presangrados, fueron calentados a 56°C por 30 minutos, para inactivar el complemento endógeno. Diluciones en serie a la mitad de cada antisuero VBS fueron agregadas a los pozos de una placa de microtitulación en un clon de 96 pozos - (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Las diluciones empezaron a 1:8, y fueron preparadas a un volumen final de 25 µl en cada pozo. Se agregaron 25 µl de las células bacterianas diluidas a cada uno de los pozos. Un complemento de cobayo (BioWhittaker, Walkersville, MD) fue diluido 1:10 en BVS, y se agregaron porciones de 25 µl a cada pozo. Las placas se incubaron a 37 °C por ""SO minutos, agitando suavemente a 70 rpm sobre una plataforma rotatoria. Se colocaron en placas 50 µl de cada mezcla de reacción sobre placas de agar Mueller ?inton (Becton-Dickinson, Cockeysville, MD) . Las placas se incubaron a 37°C por 72 horas y se contó . el número de colonias por placa. Los títulos bactericidas fueron evaluados como el recíproco de la dilución más alta del antisuero, capaz de matar más de 50% de las bacterias en comparación con los controles que contienen sueros preinmunes. Los resultados mostrados en la tabla 1 siguiente ilustran la habilidad de los antisueros de cobayo anti-Tbpl y anti-Tbp2 para usar M. catarrhalis.

Ejemplo 2 Este ejemplo ilustra la preparación del ADN cromosómico de las cepas 4223 y Q8 de M. catarrhalis. El aislado de 4223 de M. catarrhalis fue inoculado en 100 ml de caldo BHI, y se incubó por 18 horas a 37°C con agitación. Las células se cosecharon mediante centrifugación a 10,000 x g por 20 minutos. El botón se utilizó para la extracción del ADN cromosómico de M. catarrhalis 4223. El botón celular fue resuspendido en 20 ml de Tris-HCl de 10 mM (pH 7.5)-EDTA 1.0 mM (TE). Se agregaron pronase y SDS a concentraciones finales de 500 µg/ml y 1% respectivamente, y la suspensión se incubó a 37°C por 2 horas. Después de varias extracciones secuenciales con fenol, fenol: cloroformo (1:1), y cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), el extracto acuoso se dializó, a 4°C, contra cloruro de sodio 1.0 M por 4 horas, y contra TE (pH 7.5) por 48 horas adicionales con tres cambios de amortiguador. Se agregaron dos volúmenes de etanol al dializado, y el ADN se enrolló sobre una varilla de vidrio. El ADN se dejó secar al aire, y se disolvió en 3.0 ml de agua. Se estimó que la concentración, mediante espectofotometría de UV, era de aproximadamente 290 µg/ml.

M. catarrhalis cepa Q8 fue desarrollada en caldo BHI como se describe en el ejemplo 1. Las células fueron centrifugadas a partir de 50 ml de cultivo, mediante centrifugación a 5000 rpm por 20 minutos, a" 4°C. El botón celular fue resuspendido en 10 ml de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5) y se agregaron proteinasa K y SDS a concentraciones finales de 500 µg/ml y 1%, respectivamente. La muestra se incubó a 37°C por 4 horas hasta que se obtuvo un lisado claro. El lisado fue extraído" dos veces con fenol/cloroformo (1:1), saturado con Tris, y dos veces con cloroformo. La fase acuosa final se dializó por 24 horas contra 2 x 1000 ml de cloruro de sodio I M a 4°C, cambiando el amortiguador una vez, y por 24 horas contra 2 x 1000 ml de TE a 4°C, cambiando el amortiguador una vez. El dializado final fue precipitado con dos volúmenes de 100% de etanol. El ADN fue enrollado, "secado y resuspendido en 5 a 10 ml de amortiguador TE.

Ejemplo 3 Este ejemplo ilustra la construcción de genotecas cromosómicas de M. catarrhalís en EMBL3. Se llevaron a cabo una serie de digestiones de restricción con Sau3A del ADN cromosómico, en volúmenes finales de 10 µl cada uno, con el fin de optimizar las condiciones necesarias para generar cantidades máximas de fragmentos de restricción dentro de un intervalo de 15 a 23 kb. Utilizando las condiciones de digestión optimizada, se estableció una digestión a gran escala en un volumen de 100 µl conteniendo lo siguiente: 50 µl de ADN cromosómico (290 µg/ml) , 33 µl de agua, 10 µl de amortiguador 10X Sau3A (New England Biolabs), 1.0 µl de BSA (10 mg/ml, New England Biolabs), y 6.3 µl de Sau3A (0.04 U/µl). Después de una incubación de 15 minutos a 37°C, la digestión se terminó mediante la adición de 10 µl de Tris-HCl 100 mM (pH 8.0) -EDTA 10 M-azul de bromofenol al 0.1%-glicerol al 50% (amortiguador de carga) . El ADN digerido fue sometido a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0.5% en acetato de Tris 40 mM-Na2EDTA.2H20 2 mM (pH 8.5) (amortiguador TAE) a 50 V por 6 horas. La región que contenia los fragmentos de restricción dentro de un intervalo de tamaño molecular de 15 a 23 kb, fue extirpada del gel y colocada en tubería de diálisis que contenía 3.0 ml de amortiguador TAE. El ADN fue electroeluido a partir del fragmento de gel mediante la aplicación de una fuerza de campo de 1.0 V/cm por 18 horas. El ADN electroeluido se extrajo una vez con cada uno de fenol y fenol: cloroformo (1:1), y se precipitó con etanol. El ADN seco se disolvió en 5.0 µl de agua. EL ADN cromosómico fraccionado por tamaño fue ligado con los brazos de EMBL3 digeridos con BamHl (Promega) , utilizando la ADN-ligasa T4 en un volumen final de 9 µl. La mezcla de ligadura completa fue empaquetada en el fago lamida utilizando un equipo de empaquetamiento comercial (Amersham) , siguiendo las instrucciones del fabricante. La genoteca de ADN empaquetada fue amplificada sobre medio sólido. Se incubaron alícuotas de 0.1 ml de Escherichia coli cepa NM539 en sulfato de magnesio 10 M (DO260 = 0.5) a 37°C por 15 minutos, con 15 a 25 µl de la genoteca de ADN empaquetada. Las muestras se mezclaron con 3 ml de agarosa al 0.6% que contenía 1.0% de peptona tripticasa BBL-0.5% de NaCl {agarosa BBL), y las mezclas se colocaron en placas, sobre placas de agar al 1.5% que contenían 1.0% de peptona tripticasa BBL-0.5% de cloruro de sodio, y se incubaron a 37°C por 18 horas. Cantidades de 3 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7.5) -sulfato de magnesio heptahidratado 8 mM-cloruro de sodio 100 mM- gelatina 0.01% (p/p) (amortiguador SM) se agregaron a cada placa, y las placas se dejaron a 4°C por 7 horas. El amortiguador SM que contenía el fago fue recolectado de las placas, y se combinaron, se almacenaron en un tubo con tapa roscada a 4°C, con cloroformo. El ADN cromosómico proveniente de la cepa Q8 de M. catarrhalis fue digerido con Sau3A I {0.1 unidad/30 µg de ADN) a 37°C por 30 minutos, y se fraccionó por tamaño sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión de 0.6%. Los fragmentos de ADN de 15-23 kb fueron extirpados y el ADN fue sometido a electroelución por 24 minutos en una tubería de diálisis que contenía TAE (acetato de Tris 40 mM, pH 8.5, EDTA 2 mM) a 150 V. El ADN se extrajo una vez con fenol/cloroformo (1:1), se precipitó, y se resuspendió en agua. El ADN se ligó toda la noche con los brazos BamHl de EMBL3 (Promega) y la mezcla de ligadura se empaquetó utilizando el equipo de empaquetamiento in vítro Lambda (Stratagene) y se colocó en placas sobre_células de E. coli LE392. La genoteca se tituló y se almacenó a 4°C en presencia de Q.3% de cloroformo.

Ejemplo 4 Este ejemplo ilustra la selección de las genotecas de M. catarrhalis. Se combinaron alícuotas de 10 µl de la reserva del fago a partir de la muestra de EMBL3/4223 preparada en el ejemplo 3, cada una con 100 µl de E. coli cepa LE392 en sulfato de magnesio 10 M (DO2-50 = 0.5) (células en placa), y se incubaron a 37°C por 15 minutos. Las muestras se mezclaron con 3 ml cada una de agarosa BBL, y las mezclas se vaciaron sobre placas de agarosa al 1.5% que contenía 1% de bactotriptona-0.5% de extracto de bactolevadura-0.05% de cloruro de sodio (LB agarose; Difco) y suplementado con EDDA 200 µm. Las placas se incubaron a 37°C por 18 horas. Las placas se levantaron sobre filtro de nltrocelulosa (Amersham Hybond-C Extra) utilizando un protocolo estándar, y los filtros se sumergieron en albúmina sérica bovina al 5% (BSA; Boehringer) en Tris-HCl 20 mM (7.5) -cloruro de sodio-150 mM {TBS) por 30 minutos a temperatura ambiente, o 4°C toda la noche. Los filtros se incubaron por al menos una hora a temperatura ambiente, o 18 horas a 4°C, en TBS que contenía una dilución 1/1000 de antisuero de cobayo anti-Tbpl de M. catarrhalis 4223. Después de cuatro lavados secuenciales de 10 minutos en TBS con 0.05% Tween 20 (TBS-Tween) , los filtros se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente en TBS-Tween que contenia una dilución 1/4000 de proteína G recombinante marcada con peroxidasa de rábano (rProtein G-HRP; Zymed) . Los filtros se lavaron como se describe anteriormente, y se sumergieron en solución substrato CN/DAB (Pierce) . El desarrollo del color se detuvo mediante la inmersión de los filtros en agua. Las placas positivas fueron retiradas de las placas, y cada una se colocó en 0.5 ml de amortiguador SM que contenía unas pocas gotas de cloroformo. El procedimiento de selección fue repetido dos veces más, hasta que 100% de las placas levantadas fueron positivas utilizando el antisuero de cobayo anti-Tbpl de M. catarrhalis 4223. La genoteca de EMBL3/Q8 fue colocada en placas sobre células LE392 sobre placas YT- utilizando agar superior 0.7% en YT como una sobre capa. Las placas se levantaron sobre filtros de nitrocelulosa y los filtros se sondearon con sondas oligonucleotídicas marcadas con 32P -dCTP (equipo de marcación de ADN cebado aleatoriamente, Boehringer Mannheim) . La prehibridación fue realizada en amortiguador de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) (ref. 27) a 37°C por 1 hora, y la hibridación se realizó a 42°C toda la noche. Las sondas estuvieron basadas en una secuencia interna de tbpA de 4223 : I R D L T R Y D P G (Seq ID NO. 31) 4236-RD 5' ATTCGAGACTTAACACGCTATGACCCTGGC 3' (Seq ID NO. 32) 4237-RD 5' ATTCGTGATTTAACTCGCTATGACCCTGGT 31 (Seq ID NO. 33) . Las placa putativas fueron nuevamente colocadas en placa y sometidas a segunda y tercera rondas de selección utilizando los mismos procedimientos. Se utilizó el clon fágico SLRD-A para subclonar los genes tfr para el análisis secuencial Ejemplo 5 Este ejemplo ilustra el análisis de inmunomanchado de los usados de fago utilizando antisueros anti-Tbpl y Tbp2 de M. catarrhalis 4223. Las proteínas expresadas por los eluyentes del fago seleccionados en el ejemplo 4 anterior, fueron precipitadas como sigue. 60 µl de cada fago eluyente fueron combinados con 200 µl de las células colocadas en placa de E. coli LE392, e incubadas a 37°C por 15 minutos. La mezcla se inoculó en 10 ml de NZamine-A al 1.0%-cloruro de sodio al 0.5%-casaaminoácidos al 0.5%-extracto de levadura al 0.5%-sulfato de magnesio heptahidratado al 0.2% (caldo NZCYM) , suplementado con EDDA 200 mM, y desarrollado a 37°C por 18 horas, con agitación. La A Nasa fue agregada a 1.0 ml del cultivo, a una concentración final de 50 µg/ml, y la muestra se incubó a 37°C por~30 minutos. Se agregó ácido tricloroacético a una concentración final de 12.5%, y la mezcla se dejó sobre hielo por 15 minutos. Las proteínas se convirtieron en pella o botón mediante centrifugación a 13,000 x g por 10 minutos, y la pella o botón fue lavada con 1.0 ml de acetona. El botón fue secado al aire y resuspendido en 50 µl de SDS al 4%-Tris 20 mM-HCl (pH 8.0)-EDTA 0.2 M (amortiguador de lisis). Después de la electroforesis en SDS-PAGE a través de un gel al 11.5%, las proteínas fueron transferidas a filtros Imobilon-p (Milipore) a un voltaje constante de 20 V por 18 horas en Tris-HCl 25 mM-glicina 220 mM-metanol al 20% (amortiguador de transferencia) . Las membranas se bloquearon en 5% de BSA en TBS por 30 minutos, a una temperatura ambiente. Las manchas se expusieron ya sea a antisuero de cobayo anti-Tbpl de M, catarrhalis 4223 o a antísuero de cobayo anti-Tbp2 de M. catarrhalis 4223, diluido 1/500 en TBS-Tween, por 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados secuenciales de 10 minutos en TBS-Tween, las membranas Se incubaron en TBS-Tween que contenía una dilución 1/4000 de rProtein G-HRP por 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron como se describe anteriormente, y se sumergieron en solución de substrato CN/DAB. El desarrollo del color se detuvo mediante la inmersión de las manchas en agua. Tres clones de fago EMBL3 expresaron una proteína de 115 kDa la cual reaccionó con el antisuero anti-Tbpl, y una proteína de 80 kDa, la cual reaccionó con el antisuero anti-Tbp2 sobre manchas de Western, y de este modo se concluyó que contenia los genes que codifican para las proteínas receptoras de la transferrina de Moraxella catarrhalis .

Ejemplo 6 Este ejemplo ilustra la subclonación del gen de la proteina Tbpl 4223 de M. catarrhalis, tbpA. Los cultivos de lisado de las placas del' fago recombinante descrito en el Ejemplo 5 se prepararon al combinar el eluyente del fago y las células colocadas en placa LE392 de E. coli, para producir la lisis confluente en las placas de agar LB. Se extrajo el ADN del fago de los lisados de la placa usando un Sistema de Purificación de Wizard Lambda Prepas (Promega) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El clon LM3-24 de EMBL3 se encontró que contiene un inserto de 13.2 kb, blanqueado por dos sitios Salí. Se preparó una sonda para un gen tbpA y consistió de un producto amplificado de 300 pares de bases generado por PCR usando dos cebadores de oligonucléotidos degenerados que corresponden a una secuencia de aminoácidos de la parte de la proteína de Tbpl (Figura 1) . Las secuencias de los cebadores se basaron en las secuencias de aminoácidos NEVTGLG (Seq ID NO: 17) y GAINEIE {Seq""ID NO: 18), que se encontró que se conserva entre las secuencias de aminoácidos reducidas a partir de diferentes genes tbpA de N, meningitidis y Haemophilus. El producto amplificado se clonó en pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) y se secuenció. La secuencia de aminoácidos deducida ..compartió homología con otras secuencias de aminoácidos putativas derivadas de _ los genes tbpA de N. menlngitidis y H. influenzae (Figura 12) . El subclón se linealizó con Notl ( (New England Biolabs) , y se marcó usando un equipo de marcado aleatorio de digoxigenina (Bdehringer Mannheim) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de las sondas se estimó que es de 2 ng/uL. El ADN del clon del fago se digirió con HindIII, avrll, S alI/Sphl, o Sall/avrll, y se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa a 0.8 %. Se transfirió el ADn a una membrana de nailon ÍGenescreen Plus, Dupont) usando un aparato de transparencia al vacío LKB VacuGene XL (Farmacia) . Después de la. transferencia, la transferencia se secó con aire, y se prehibridizó en SSC 5X- N-lauroilsarcosina al 0.1 %-dodecil sulfato de sodio al 0.02 %-reactivo de bloqueo al 1.0 % (Boheringer Mannheim) en ácido maleico 10 mM-NacL 15 mM (pH 7.5) (solución de prehibridación) . La sonda marcada se "adicionó a la. solución de pre-hibridación a una concentración final de 6 ng/ml, y la transferencia se incubó en 1.a solución de la sonda a 42°C durante 18 horas. La transferencia se lavó dos veces en SSC 2X-SDS al 0.1 %, durante 5 minutos, cada una a temperatura ambiente, luego dos veces en SSC 0.1 X- SDS al 0.1 % durante 15 minutos, cada una a 60°C. Después de los lavados, la membrana se puso en equilibrio en ácido maleico 100 M-NaCl 150 mM {pH 7.5) (amortiguador 1) durante 1 minuto, luego se dejó en el reactivo de bloqueo al 0.1 % (Boehringer Mannheim) en el amortiguador 1 (amortiguador 2) durante 60 minutos, a temperatura ambiente. La transferencia se expuso a anti-DIG-fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim) diluida a 1/500 en el amortiguador 2, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de dos lavados .de 15 minutos en el amortiguador 1, la transferencia llegó al equilibrio en Tr.is-Hcl 100 mM (pH 9.5), NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM (amortiguador 3J durante 2 minutos. La transferencia se humedeció con el substrato PPD Lu igen (Boehringer-Mannheim) , diluido 1/100 en el amortiguador 3, luego se envolvió en la mancha Sarán, y se expuso a una película de rayos X durante 30 minutos. La sonda se hibridizó a un fragmento HindIII-HindIII de 3.8 kb, un fragmento Avrll-Avrll de 2.0 kb, y un fragmento Sall-Sphl de 4.2 kb. A fin de subclonar el fragmento HindIII-HindIII de 3.8 kb en pACYC177, el ADN del fago a partir del clon EMBL3, y el ADN del plásmido del vector pACYC177 (New England Biolabs) , se digirieron con HindIII, y se fraccionaron por electroforesis en un gel de agarosa en un 0.8 %. El fragmento del ADN del fago HindIII-HindIII de 3.8 kg, cuyo fragmento de pACYC177 de HindIII-HindIII de 3.9 kb, se escindieron del gen y purificaron usando un equipo Geneclean (Bio 101 Inc., LaJolla, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El inserto y el vector purificado se ligaron conjuntamente usando la T4-ADN-ligasa {New England Biolabs) , y se transformaron en HB101 de E. coli (Gibco BRL) . Se usó un equipo Qiagen Plasmid Midi {Qiagen) para extraer y purificar el ADN de calidad de secuencia, a partir de uno de los transformantes _ resistentes a ampicilina/sensible a canamicina, se encontró que tiene un inserto HindIII-HindIII DE 3.8 B. El subclón se nombró pLEM3. Como se describe en el Ejemplo 7 posterior, la secuenciación subsecuente .reveló que pLEM3 contuvo los primeros 2.0 kb de la secuencia de tbpA (Figuras 2 y 5) . A fin de subclonar el 1 kb restante del gen de tbpA, se subclonó un fragmento HindIII-HindIII de 1.6 kb en pACYC177 como se describe anteriormente, y se transformó por electroporación en HB101 de E. coli (Gibco BRL) . Se usó un equipo de ADN de midi-plásmido (Qiagen) para extraer el ADN del plásmido a partir de un transformante sensible a canamicina, putativo, que tiene un plásmldo con un inserto de HindIII-HindIII de 1.6 kb. El subclón se nombró pLEM25. Como se describe en el Ejemplo 7 posterior, la secuenciación reveló que pLEM25 contuvo el 1 kb restante del gen tbpA (Figuras 2 y 5) .

Ejemplo 7 Este ejemplo ilustra la subclonación del gen de tbpB 4223 de M. catarrhalis. Como se describe anteriormente, en todas las especies Neisseriae y Haemophilus examinadas antes de la presente invención, se ha encontrado que los genes de tbpB en la dirección inmediatamente 5' de los genes de tbpA que comparten homología con el gen de tbpA de M. catarrhalis 4223. Sin embargo, la secuencia en la dirección 5' del M. catarrhalis 4223 no corresponde con otras secuencias que codifican para tbpB. A fin de localizar el gen de tbpB dentro del clon del fago EMBL3-, se llevó a cabo una transferencia Southern usando una sonda degenerada a partir de una región de aminoácidos altamente conservada dentro de la proteína de Tbp2. Una sonda de oligonucleótidos, degenerada, se diseñó correspondiendo a la secuencia que codifica para EGGFYGP {Seq ID NO: 30) , que está conservada dentro de la proteína Tbp2 en una variedad de especies Neisseriae y Haemophilus. La sonda se marcó con digoxigenina usando un equipo de coleo de oligonucleótidos (Boehringer Mannheim) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN del clon EMBL3 digerido con HmdlII se fraccionó a través de un gel de agarosa a 0.8 %, se transfirió a una membrana de nailon Geneclean Plus como se describe en el Ejemplo 6. Después de la hibridazión como se describe anteriormente, la membrana se lavó dos veces en SSC 2X-SDS al 0.1 %, durante 5 minutos, cada uno a temperatura ambiente, luego dos veces en SSC 0.1-SDS al 0.1 % durante 15 minutos cada uno a 50°C. La detección de la sonda marcada se llevó a cabo como se describe anteriormente. La sonda hibridizó a un fragmento Nhel-Sall de 5.5 kb. El fragmento de Nhel-Sall de 5.5 kb se subclonó en pBR328 como sigue. El ADN de LEM3-24, y el ADN de pBR328, se digirieron con Nhel-Sall, y se sometieron a electroforesis a través de agarosa al 0.8 %. El fragmento de Nhel-Sall de 5.5 kb, y los framgnetos de Nhel-Sall de pBR328 de 4.9 kb se escindieron del gel, y se purificaron usando un equipo Geneclean como se describe en el Ejemplo 6. Los fragmentos se ligaron conjuntamente usando la T4-ADN ligasa, se transformaron en DH5 de E. coli- Se usó un equipo de ADN Midi-Plásmido {Qiagen) para extraer el ADn de un clon resistente a ampicilina/sensible a tetraciclina que contiene un inserto de Nhel-Sall de 5.5 kb. Este subclón se nombró pLEM23. La secuenciación reveló que pLEM23 contuvo 2 kb del gen tbpB de M. catarrhalis 4223 (Figura 2) .

Ejemplo 8 Este ejemplo ilustra la subclonación de los genes tfR Q8 de M. catarrhalis. Los genes tfr Q8 de M. catarrhalis se subclonaron como sigue: el ADN del fago se preparó a partir de las placas. Brevemente, la capa superior d.e agarosa de las tres placas confluentes se rascó en 9. ml del amortiguador SM (NaCl 0.1 M, MgS0 al 0.2 %, Tris-HCl 50 M, pH 7.6, gelatina al 0.01 %) y se adicionaron 100 µl de cloroformo. La mezcla se sometió a un vórtice durante 10 segundos, luego se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Los desperdicios celulares se removieron por centrifugación a 8000 rpm durante 15 minutos a 4°C en un rotor SS34 (Sorvall modelo RC5C) . El fago se sedimentó por centrifugación a 35,000 rpm en un rotor Ti 70.1 a 10°C durante 2 horas (Beckman modelo L8-80) y se resuspendió en 500 µl de amortiguador SM. La muestra se incubó a 4°C durante la noche, luego la ARNsa y el ADNsa se adicionaron a concentraciones finales de 40 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente y la mezcla se incubó a 37°C durante 1 hora. A la mezcla se adicionaron 10 µl de EDTA 0.5 M y 5 µl de SDS al 10 % y la mezcla se incubó a 6°C durante 15 minutos. La mezcla se extrajo dos veces con fenol/ cloroformo {1:11 y dos veces con cloroformo y el ADN se precipitó por adición de 2.5 volúmenes dé etanol puro.

Se generó un mapa de restricción parcial y se subclonaron los fragmentos usando los sitios Sal I externos de EMBL3 y los sitios Avrll ó EcoR I internos como se indica en la Figura 4. A fin de facilitar la subclonación, el plásmido pSKMA se construyó, el cual introduce un nuevo sitio de clonación múltiple en el pBluescript .SK (Stratagene) . Se usaron oligonucleótidos para introducir sitios de restricción para Mst II, Sfi I, "y Avr II éntrelos sitios Sal I y HindIII de pBluescript .SK. Sfi I Sal I Cía I Mst II Avr II HindIII 4639-RD 5' TCGACGGTAT CGATGGCC TTAG GGGC CTAGGA 3' (Seq ID NO: 34) 4640-RD 3'GCCATA GCTACCGG AATC CCCG GATCCTTCGA (Seq ID NO: 35) El plásmido pSLRDl contiene un fragmento de Sal I-Avr de aproximadamente 1.5 kb clonado en pSKMA; los plásmídos pSLRD2 y pSLRD4 contienen fragmento Avrll-Avrll de aproximadamente 2 kb y 4 kb clonados en pSKMA, respectivamente, y contienen el gen tbpA completo. El plásmido pSLRD3 contiene un fragmento AvrlI-EcoR I de aproximadamente 2.3 kb clonado en pSKMA y el plásmido SLRD5 en un fragmento EcoRX-EcoRI de 22.7 kb clonado en pSKMA.

Estos dos clones contienen el gen tbpB completo (Figura 7) .

Ejemplo 9 Este ejemplo ilustra la secuenciación de los genes tbp de M. catarrhalis. Ambas hebras de los genes tbp subclonadas de acuerdo con los Ejemplos 6 a 8 se secuenciaron usando un secuenciador de ADN de Applied Biosystems. Las secuencias de los genes tbpA 4223 y Q3 de M. catarrhalis se muestran en las Figuras 5 y 10, respectivamente. Se comparó una secuencia de aminoácidos derivada con otras secuencias de aminoácidos de Tbpl, incluyendo aquellas de Neisseriae meningitidis, Neisseriae gonorrhoeae, y Haemophilus influenzae (Figura 12) . La secuencia de los genes de tbpB 4223 y Q8, de M. catarrhalis se muestra en las Figuras 6 y 11 respectivamente. A fin de obtener la secuencia desde el inicio putativo del gen tbpB de M. catarrhalis 4223, los datos de la secuencia se obtuvieron directamente desde el ADN del clon LEM3-24. Esta secuencia se erificó al seleccionar el clon DS-1754-1. La secuencia de los genes tbpB traducidos desde M. catarrhalis 4223 y Q8 compartieron la homología con las secuencias de aminoácidos de Tbp2 deducidas, de Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, y Haemophilus influenzae {Figura 13) .

Ejemplo 10 Este ejemplo ilustra la generación del vector de expresión para producir la proteína Tbpl recombinante . El esquema de construcción se muestra en la Figura 14. El ADN del plésmido desde el subclon pLEM3, preparado como se describe en el Ejemplo 6, se digirió con HindIII y Bgll para generar un fragmento de BglI-HindIII de 1.84 kb que contiene aproximadamente dos tercios del gen tbpA. Se adicionó BamHI a la digestión para eliminar un fragmento del vector BglI-HindIII de 1-89 kb, comigrante. Además, el ADN del plásmido del vector pT7-7 se digirió con Ndel y HindIII. Para crear el inicio del gen tbpA, se sintetizó un oligonucleótido en base _ a las primeras 61 bases del gen tbpA al sitio Bgll; se incorporó un sitio en el Ndel en el extremo 5' . El inserto purificado, el vector y el oligonucleótido se ligaron conjuntamente usando T4-ligasa (New England Biolabs) , y se transformaron en DH5 de E. coli. Se purificio el ADN a partir de uno de los transformantes de 4.4 kb resistente a ampicilina que contiene los sitios de restricción correctos (pLEM27) . El ADN de pLEM27 purificado se digirió con HindIII, se ligó al fragmento del inserto . HindIII-HindIII de 1.6 -kb de pLEM25 preparado como se describe en el Ejmplo 6, y se transformó en DH5a de E. coli. Se purificó el ADN a partir de un transformante resistente a ampicilina que contiene los sitios de restricción correctos (pLEM29) , y se transformó por electroporación en BL21 (DE3) (Novagen; Madison, Wl) para producir E. coli pLEM29B-l. Se usó una colonia transformada, aislada, individual, para inocular 100 ml del caldo YT uqe contiene 100 µg/ml de ampicilina, y el cultivo se mantuvo a 37°C durante la__noche, agitando a 200 rpm. Se inocularon 200 µl del cultivo durante la noche en 10 m del caldo YT que contiene 100 µg/ml de ampicilina, y el cultivo se mantuvo a 37°C a una OD6-8 de 0.35. El cultivo ae indujo por la adición de 30 µl de IPTG 100 mM, y el cultivo se mantuvo a 37°C durante 3 horas adicionales. Se removió un ml del cultivo al tiempo de la inducción (t = 0) a t=l hora y a t=3 horas. Se sedimentaron muestras de 1 ml por centrifugación, y se redispersaron en SDS al 4 %-Tris.Cl 20 mM, pH 8-EDTA 200 µm (amortiguador de lisis) . Las muestras se fraccionaron en un gel de SDS-PAGE al 11.5 %, y se transfirieron en filtros Immobilon (Amersham) . Se revelaron las transferencias usando el antisuero de asnti-Tbpl (M. catarrhalis 4223), diluido a 1:100, como el anticuerpo primario, y la r-proteína-G conjugada con peroxidasa de rábano {Zymed) como el anticuerpo secundario. Un substrato quimioluminescente (Lumiglo; Kirkegaard and Pery Laboratories, Gaithersburg, MD) se usó para la detección. Las proteínas recombinantes inducidas fueron visibles a los geles teñidos con Coomassie (Figura 15) . El antisuero anti-Tbpl (4223) reconoció a las proteínas recombinantes en las transferencias Western.

Ejemplo 11 Este ejemplo ilustra la extracción y purificación de Tbpl reco binante de M. catarrhalis 4223. La proteína de Tbpl recombinantes, que está contenida en los cuerpos de inclusión, se purificó a partir de células de E. coli que expresan los genes tbpA (Ejemplo 10) , por un proceso como se muestra en la Figura 16. Las células de E. coli a partir de un cultivo de 500 ml, preparados como se describe en el Ejemplo 10, se redispersaron en 50 ml de Tris-HCl 50 ipM, pH 8.0 que contiene NaCl 0-1 M y AEBSF 5 mM (inhibidor de proteasa), y se rompieron por tratamiento con sonido (3 x 10 mi., ciclo de trabajo al 70 %) . El extracto se centrifugó a 20,000 x g durante 30 minutos, y se descartó el sobrenadante resultante que contuvo > 85 % de las proteínas solubles de E. coli. El sedimento restante (Figura 16, PPTi) se extrajo adicionalmente en 50 ml de Tr8is 50 mM, pH 8.0 que contiene Tritón X-100 al 0.5 % y EDTA 10 mM. Después de la centrifugación a 20,000 x g durante 30 minutos, el sobrenadante contiene las proteínas solubles residuales y la mayoría de las proteínas de membrana se decantó. El sedimento restante (Figura 16) ; PPT2, se extrajo adiconalmente en 50 ml de Tris 50 mM, pH 8.0 que contiene urea 2 M y ditriotroitol 5 mM (DTT) . Después de la centrifugación a 20,000 x g durante _ 30 minutos, el sedimento resultante (Figura 16, PPT3) obtenido después de la extracción anterior contuvo los cuerpos de inclusión purificados. La proteína de Tbpl se solubilizó a partir de PPT3 en Tris 50 M, pH 8.0, que contiene clorhidrato de guanidina 6 M y DTT 5 mM. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante se purificó adic onalmente en una columna .de filtración en gel Superdex 200 puesto en equilibrio en Tris 50 mM, pH 8.0, que contiene clorhidrato de guanidina 2 M y DTT 5 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y aquellas que contienen Tbpl purificado se mezclaron. Se adicionó Tritón -X-100 a la fracción de Tbpl mezclada a una concentración final de 0.1 % . La fracción luego se dializó durante la noche a 4°C contra Tris 50 M, pH 8.0, y luego se centrifugó a 20,000 c g durante 30 minutos. La proteína permaneció soluble bajo estas condiciones y el Tbpl purificado se almacenó a -20°C. _ El procedimiento de purificación mostrado en la Figura 16 produce la proteína de Tbpl que fue al menos 70 % pura como se determina por el análisis SDS-PAGE (Figura 17) .

Ejemplo 12 Este ejemplo ilustra la construcción de un plásmido de expresión para rTbp2 de M. catarrhalis 4223 sin una secuencia guia. El esquema de construcción para el plásmido que expresa rTbp2 se muestra en la Figura 18. Se usaron oligonucleótidos para construir los primeros aproximadamente 58 pb del gen tbpB de M. catarrhalis 4223 que codifican para la proteína madura. Se incorporó un sitio Ndel en el extremo 5' de los oligonucleótidos: 'TATGTGTGGTGGCAGTGGTGGTTCAAATCCACCTGCTCCTACGCCCA TTCCAAATG {Seq ID NO: 35) 3' 3' ACACACCACCGTCACCACCAAGTTTAGGTGGACGAGGATGCGGGTAA GGTTTACGATC (Seq ID NO: 37) 5' Un fragmento Nhel-Clal, que contiene aproximadamente 1 kb del gen tbpB a partir de pLEM23, preparado como se describe en el Ejemplo 7, se ligó a los oligonucleótidos nateriores y se insertó en pT7-7 cortado con Ndel-Clal, generando pLEM31, que de esta manera contiene la. mitad 5' de tbpb. También, se usaron oligonucleótidos para construir los últimos aproximadamente 104 pb del gen tbpB, a partir del sitio Avall al final del gen. Se incorporó un sitio BamHl en el extremo 3' de los oligonucleótidos: ' GTCCAAATGCAAACGAGATGGGCGGGTCATTTACACACAACGCCGAT GACAGCAAAGCCTCTGTGGTCTTTGGCACAAAAAGACAACAAGAAGTTAAGTAGTAG (Seq ID NO: 38) 3' 3'GTTTACGTTTGCTCTACCCGCCCAGTAAATGTGTFTTGCGGCTACTG TCGTTTCGGAGACACCAGAAACCGTGTTTTTCTGTTGTTCTTCAATTCATCATCCTAG (Seq ID NO: 39) 5' Un fragmento de Clal-Avall a partir de pLEM23, que contiene aproximadamente 0.9 kb del extremo 3' del gen tbpB, se ligó a los oligonucledtidos de AvalI-BamHI, y se insertó en pT7-7 cortado con Clal-BamHI, generando pLEM32. El inserto de Ndel-Clal de 1.0 kb a partir de Plem31 y el inserto de Clal-BamHI de 1.0 kb a partir de pLEM32 luego se insertó en pT7-7 cortado con Ndel-BamHI, generando pLEM33 que tiene un gen tbpB de longitud completa ba o la dirección del promotor T7. Se purificó el ADN a partir de pLEM33 y se transformó por electroporación en las células electrocompetentes B121{DE3) (Novagen; Madison, Wl) , para generar la cepa pLEM33B-l. La cepa pLEM33B-l se cultivó, y se indujo usando IPTG, como se describe anteriormente en el Ejemplo 10. Se disolvieron las proteínas expresadas por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas adecuadas por inmunotransferencia. Se revelaron las transferencias usando el antisuero de Tbp2 anti-4223, diluido a 1:400, como el anticuerpo primario, y la r-proteína y G conjugada con peroxidasa de rábano (Zymed) como el anticuerpo secundario. Se usó un substrato quimioluminescente (Lumiglo; Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersbug, MD) para la detección. Fueron visibles las proteínas recombinantes inducidas, en los geles teñidos con azul de Comassie {Figura 19) . El antisuero d.e Tbp2 anti-4223 reconoció las proteínas recombinantes en las transferencias Western.

Ejemplo 13 Este ejemplo ilustra la generación de un plásmido de expresión de rTbp2 de M. catarrhalis 4223 con una secuencia guía. El esquema de construcción se muestra en la Figura 18. Los oligonucleótidos que contienen la secuencia guía natural del gen rTbp2 de M. catarrhalis 4223 se usaron para construir los primeros aproximadamente 115 pb del gen tbpB al sitio Nhel. Se incorporó un sitio Ndel en el extremo 5' de los oligonucleótidos: ' TATGAAACACATTCCTTTAACCACACTGTGTGTGGCAATCTCTGCCG TCTTATTAACCGCTTGTGGTGGCAGTGGTGGTTCAAATCCACCTGCTCCTACGCCCATT CCAAATG (Seq ID NO: 40) 3' 3'ACTTTGTGTAAGGAAATTGGTGTGACACACACCGTTAGAGACGGCAG AATAATTGGCGAACACCACCGTCACCACCAAGTTTAGGTGGACGAGGATGCGGGTAAGG TTTACGATC (Seq ID NO: 41) 5' Los oligonucleótidos Ndel-Nhel se ligaron a pLEM33 cortado con Ndel-Nhel, generando pLEM37, que de esta manera contiene un gen de tbpB de 4223, de longitud completa, que codifica para la proteína de Tbp2 con su secuencia guía, impulsada por el promotor T7. Se.purificó el ADN de pLEM37 y se transformó por electroporación en las células electrocompetentes de BL21 (DE3) (Novagen; Madison, Wl) , para generar la cepa pLEM37B-2. pLEM37B-2 se cultivó, y se indujo usando IPTG, como se describe anteriormente en el Ejemplo 10. Se disolvieron las proteínas expresadas por SDS-PAGE y se transfirieron las membranas adecuadas para la inmunotransferencia. Se revelaron las transferencias usando el antisuero de Tbp2 anti-4223, diluido 1:4000, como el anticuerpo primario, y la r-proteína-G conjugada con peroxidasa de rábano (Zymed) como el anticuerpo secundario. Un substrato quimiluminiscente (Lumiglo; Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) se usó para la detección. Las proteínas recombinantes inducidas fueron, visibles en geles teñidos con azul de Coomassie (Figura 21) . El antisuero de Tbp2 ant?-4223 reconoció las proteínas recombmantes en las trans erencias Western.

Ejemplo 14 Este ejemplo ilustra la construcción de un plásmido de expresión para rTbp2 de M. catarrhalis Q8 sin una secuencia guía. El esquema de construcción para rtbp2 se muestra en la Figura 20. El extremo 5' del gen tbpB de M. catarrhalis Q8 se amplificó por PCR a partir del codon Cys1 de la proteína madura a través del sitio de restricción Bsm I. Se introdujo un sitio de restricción Nde I en el extremo 5', para la clonación posterior en pT7-7, y el fragmento final de PCR fue de 238 pb de longitud. Los cebadores de PCR se indican a continuación: Ndel C G G S S G G F N 5'GAATTCCATATG TGT GGT GGG AGC TCT GGT GGT TTC AAT C 3' 5247.RD (Seq ID NO: 42) ' CCCATGGCAGGTTCTTGAATGCCTGAAACT 3' 523.6-RD. (Seq ID NO: 43) .

El gen tbpB de Q8 se subclonó en dos fragmentos contenidos en los plásmidos SLRD3 y SLRD5, preparado como se describe en el Ejemplo 8. El plásmido S1RD3-5 se construyó para obtener el gen tbpB de longitud completa al digerir SLRD5 con EcoR I y Dra I, que libera el extremo 3' de tbpB, e insertando este fragmento de aproximadamente 619 pb en SLRD3 que se ha digerido con EcoR I y Dra I. El fragmento Bsm I-BamH I de 1.85 kb a partir de SLRD 3-5 se ligó con el fragmento de PCR de 238 pb y se insertó en pT7-7 que se ha digerido con Nde I y BamH I, generando el plásmido SLRD35B. Este plásmido contiene de esta manera un gen tbpB de longitud completa sin su secuencia guía, bajo la dirección del promotor T7. Se purificó el ADN de SLRD35B y se transformó por electroporación en las células electrocompetentes B121(DE3) para generar la cepaSLRD35BD que se cultivó y se indujo usando IPTG, como se describen anteriormente en el Ejemplo 10. Las proteínas expresadas se disolvieron por SDS-PAGE y la proteína Tbp2 fue claramente visible por teñido de azul de Coomassie (Figura 19) .

Ejemplo 15 Este ejemplo ilustra la generación del plásmido de expresión para rTbp2 de M. catarrhalis Q8 con una secuencia guia. El esquema de construcción para el rTbp2 se muestra en la Figura 20. El extremo 5' del gen tbpB de Q8 fue amplificado por PCR a partir del codon de inicio ATG al sitio de restricción Bsm I. Se manejó por ingeniería el sitio Nde I en el extremo 5' para facilitar la clonación en el vector de expresión PT7-7, y el fragmento final de PCR fue de 295 pb. Los cebadores de PCR se indican a continuació : Nde I K H I P T 5' GAATTCCATATG AAA CAC ATT CCT TTA ACC 3' 5235.RD (Seq ID NO: 44) ' CCCATGGCAGGTTCTTGAATGCCTGAAACT 3' 5236.RD (Seq ID NO: 43) Se digirió SLRD3-5 (Ejemplo 14) con Bsm I y BamH I, generando un fragmento de 1.85 kb, que se ligó con el fragmento de PCR de 295 pb y se ligó en pT7-7 que se ha digerido con Nde I y BamH I. El plásmido resultante SLRD35A, contiene de esta manera el gen tbpB de Q8, de longitud completa, con su secuencia guía endógena bajo el control del promotor T7. Se purificó el ADN de SLRD35A y se transformó por electroporación en las células electrocompetente BL21(DE3)) para generar la cepa SLRD35AD que se cultivó e indujo usando IPTG, como se indica anteriormente en el Ejemplo 10. Las proteínas expresadas se disolvieron por SDS-PAGE y la proteína de Tbp2 inducida fue claramente visible, por teñido con azul de Coomassie (Figura 19) .

Ejemplo 16 Este ejemplo ilustra la extracción y purificación de rTbp2 de M. catarrhalis 4223 y Q8 de E. coli. Se cultivaron los transformantes pLEM37B (4223) y SLRD35AD (Q8) para producir Tbp2 en cuerpos de inclusión y luego el Tbp2 se purificó de acuerdo con el esquema en la Figura 22. Las células de E. coli a partir de un cultivo de 500 L, se redispersaron en 50 L de Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 que contiene AEBSF a 5 mM (inhibidor de proteasa), y se rompieron por tratamiento consumido (3 x 10 minutos, ciclo de trabajo al 70 %) . El extracto se centrifugó a 20,000 x g durante 30 minutos y el sobrenadante resultante que contuvo > 95 % de las proteínas solubles de E. coli se descartó. El sedimento restante (PPTi) se extrajo adicionalmente en 50_mL de Tris 50 M, pH 8.0 que contiene Tritón X-100 al 0.5 % y EDTA 10 mM. La mezcla se agitó a. 4°C durante al menos 2 horas y luego se centrifugó a 20,000 x g durante 30 minutos y el sobrenadante ue contiene proteínas solubles residuales y la mayoría de las proteínas de membrana se descartó . El sedimento resultante {PPT2J obtenido después de la extracción anterior contuvo los cuerpos de inclusión. La proteína de Tbp2 se solubilizó en Tris 50 mM, pH 8.0, que contiene guanidina 6 M y DTT 5 mM. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante se purificó adicionalmente en una columna de filtración en gel Superdex 00 puesto en equilibrio en Tris 50 mM, pH 8.0, que contiene guanidina 2 M y DTT 5 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y aquellos que contienen Tbp2 purificada se mezclaron. Se adicionó Tritón X-100 a lá fracción de Tbp2 mezclada a una concentración final de 0.1 %. La fracción luego se dializó durante la noche a 4°C contra PBS, y luego se centrifugó a 20,000 x g durante 30 minutos. La proteina permaneció soluble bajo estas condiciones y el Tbp2 purificado se almacenó a -20°C. La Figura 22 muestra el análisis por SDS-PAGE de las fracciones del proceso de purificación para rTbp2 de la cepa 4223 (Panel A) y la cepa Q8 {Panel B) . El rTbp2 fue al menos 70 % puro. Se inyectaron grupos de cinco ratones BALB/c tres veces subcutáneamente (s.c.) en los días 1, 29 y 43 con rTbp2 purificado (0.3 mg a 10 mg) de las cepas 4223 y Q8 de M. catarrhalis en la presencia o ausencia de A1P04 (1.5 mg por dosis) . Se tomaron muestras sanguíneas en los días 14, 28, 42 y 56 para el análisis de los títulos de anticuerpos anti-rTbp2 por EIA. Se inmunizaron grupos de dos conejos y dos caballos (.Charles River, quebec) , de manera intramuscular (i.m.) en el día 1 con una dosis de 5 mg de la proteína de rTbp2 purificada, emulsionada en el adyuvante completo de Freund (CFA) . Los animales se reforzaron en los días 14 y 29 con la misma dosis de la proteína emulsionada en el adyuvante incompleto de Freund (IFA) . Se tomaron muestras sanguíneas en el día 42 para analizar los títulos de los anticuerpos anti-rTbp2 y la actividad bactericida. La Tabla 2 posterior muestra la actividad bactericida de los anticuerpos formulados a las proteínas de unión de transferrina, recombinantes rTbpl (4223), rTbp2 (4223) y rTbp2 (Q8) , preparadas como se describen en estos ejemplos,, contra las cepas 4223 y Q8 de M. catarrhalis.

Ejemplo 17 Este ejemplo ilustra la unidad de Tbp2 a la transferencia humana in vitro. Se valoró la actividad de unión a la transferrina de Tbp2 de acuerdo con los procedimientos de Schryvere y Lee (ref. 28) con modificaciones. Brevemente, se sometió el rTbp2 purificado a electroforesis discontinua a través de los geles de SDS-PAGE al 12.5 %. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a la membrana PVDF y se incubaron con transferrina humana conjugada con peroxidasa de rábano (transferrina humana HRP, dilución 1:50) (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., Mississauga, Ontario) a 4°C durante la noche. El substrato LumiGLO (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) se usó para la detección por quimioluminiscencia de la actividad de HRP de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tanto rTbp2 de 4223 y rTbp2 de Q8 se unieron a la transferrina humana bajo estas condiciones, como se muestra en la Figura 24.

Ejemplo 18 Este ejemplo ilustra la conservación antigénica de Tbp2 contra las cepas de M. catarrhalis. Los Usados de células completas de las cepas de M. catarrhalis y las cepas de E. coli expresan las proteínas de Tbp2 recombinante se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron electroforéticamente a la membrana PVDF. Se usaron los antisueros anti-rTbp2 de 4223 y anti-rTbp de Q8, de cobayo, como el primer anticuerpo y el anticuerpo anti-cobayo de cabra, conjugado con fosfatasa alcalina, se usó como, el segundo anticuerpo para detectar Tbp2. Las cepas 3, 56, 135, 585, 4223, 5191, 8185 y ATCC 25240 de M. catarrhalis se probaron y todos mostraron reactividad específica con el anticuerpo anti-rTbp2 de 4223 ó anti-rTbp2 de Q8 (Figura 25) . La Tabla 3 ilustra la capacidad de los anticuerpos anti-rTbp2 de una cepa de M. catarrhalis para reconocer la proteína nativa o recombinante de una cepa homologa o heteróloga de M. catarrhalis.

Ejemplo 19 Este ejemplo ilustra la amplificación por PCR del gen tbpB de la cepa Rl de M. catarrhalis y la caracterización de tbpB de Rl, amplificado. El ADN cromosómico de la cepa Rl de M. catarrhalis se preparó técnicas normales. El diseño del cebador homosentido del oligonucleótido se basó en una región aproximadamente 274 bases corriente en la dirección 5' del gen tbpB de M. catarrhalis 4223, y el cebador antisentido se basó en una región aproximadamente 11 bases en la dirección 3' del extremo de tbpB de 4223. Se usaron los siguientes cebadores.

Cebador homosentido (4940) : 5' GATATAAGCACGCCCTACTT 3' (Seq ID NO: 48) Cebador antisentido (4967) : 5' CCCATCAGCCAAACAAACATTGTGT 3' (Seq ID NO: 49) .

Cada tubo de reacción contuvo Tris-HCl 10 mM (pH 8.85), KCl 25 mM, (NH4)2S04, 2 mM, MgS04, dNTPs 800 mM, 1.0 mg de cada uno de los cebadores 49.40 y 4967. 10 ng de ADN Rl, y Pwo-ADN-polimerasa 2.5 U (Boehringer Mannheim) en un volumen total de 100 µl . el aparato termociclador se programó durante 5 minutos a 95°C, seguido por 25 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, y 72°C durante 2 minutos, y un alargamiento final, de 10 minutos a 72°C. El producto amplificado se purificó usando un Geneclean (Bio 101J .de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenció. Se muestra en la Figura 26 un mapa de restricción parcial de tbpB de la cepa Rl de M. catarrhalis, preparado como se describe anteriormente. . Las ..secuencias de aminoácidos deducidas y de nucleótidos del sen tbpB de Rl, amplificado por PCR se muestran en la Figura 27. El gen tbpB de Rl codifica para una proteina de 714 aminoácidos de peso molecular 76.8 kDa. La secuencia guía de la proteina de Tbp2 de Rl es idéntica a aquella de las proteínas de de Tbp2 de 4223 y Q8. Cuando la secuencia de Tbp2 de Rl, deducida, se alineó con la secuencia de Tbp2 de 4223, se encontró que es 83 % idéntica y 88 % homologa (Figura 28) . El epítope de LEGGFYG conservado (Seq ID NO: 50) estaba presente, como se encuentra en Tbp2 de otras cepas de M. catarrhalis asi .co o las proteínas de Tbp2 de H. influenzae y N. meningitidis .

SOMRRIO DE LA DESCRIPCIÓN En el sumario de esta descripción, la presente invención proporciona moléculas de ADN purificadas y aisladas . que contienen los genes _jdel receptor de transferrina de Moraxella catarrhalis, las secuencias de estos genes del receptor de transferrina, y las secuencias de aminoácidos derivadas de los mismos.. Los genes y las secuencias de ADN. son útiles para la diagnosis, inmunización, y la generación de reactivos de diagnóstico e inmunológicos. Las composiciones inmunogénicas incluyen vacunas, en base a Tbpl y/o Tbp2 recombinantes, expresados, porciones de los mismos, o análogos de los mismos, se pueden preparar para la prevención de enfermedades provocadas por Moraxella. Son posibles modificaciones dentro del alcance de esta invención.

TABLA 1 TÍTULOS DE ANTICUERPOS BACTERICIDAS PARA DE ANTÍGENOS M. CATARRHALIS antígenos aislados de M. Catarrhalis 4223 GP=cobayo títulos bactericidas : expresado en log2 como la dilución de un antisuero capaz de aniquilar al 50% de células. M. Catarrhalís RH408 es un derivado no agregado de M. Catarrhalis 4223 M. Catarrhalis Q8 es un aislado clínico que exhibe un fenotipo no agregado TABLA 2 Los títulos de anticuerpos estén expresados en log2 como, la dilución de un antisuero capaz de aniquilar al 50% de las células NT=no probado TABLA 3 Títulos ELISA para anticuerpos anti-rTbp2 que reconocen nativo o rTbp2 de la cepa 4223 o rTbp2 de la cepa Q8 Antígeno Títulos de anticuerpo Títulos de anticuerpo revestido Anti-rTbp2(4223) Anti-rTbp2(Q8) Antisuero Antisuero Antisuero Antisuero de conejo de cobayo de conejo de cobayo Tbp2(4223) 409, 600 1,638,400 25, 600 51,200 nativo 204, 800 1, 638,400 25, 600 102,400 rTbp2(4223) 409,600 1, 638,400 102,400 204,800 409, 600 1, 638,400 102,400 204,800 rTbp2 (q8) 409, 600 1, 638,400 1,638,400 1, 638,400 102,400 1, 638,400 409, 600 1, 638,400 REFERENCIAS 1. Brorson, J-E., A. Axelsson, and S. E. Holm. Í976. Studies on Branhamella catarrhalis (Neisseria catarrhalis) with special reference to maxillary sinusitis. Sean. J. Infect. Dis. 8: 151-155. 2. Catlin, B. W., 1990. Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 3: 293-320. 3. Hager, H., A. Verghese, S. Al arez, and S. L. Berk. 1987. Branhamella catarrhalis respiratory infections. Rev. Infect. Dis. 9: 1140-1199. 4. McLeod, D. T., F. Ahmad, M. J. Croughan, and M. A. Calder. 1986. Bronchopulmonary infection due to M. catarrhalis. Clinicai features and therapeutic response. Drugs 31(Suppl. 3): 109-112.

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Claims (22)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico, purificada y aislada, que codifica para una proteína del receptor de transferrina de una cepa de Moraxella o un fragmento inmunogénico o un análogo de la proteína del receptor de transferrina.
2. 2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada en que la proteína del receptor de transferrina es la proteína 1 de unión del receptor de transferrina (Tbpl) de la cepa Moraxella.
3. 3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada en que la proteína del receptor de transferrina es la proteína 2 de unión del receptor de transferrina (Tbp2) de la cepa de Moraxella.
4. 4. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada enq que la cepa de Moraxella es una cepa de Moraxella catarrhalis .
5. 5. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, caracterizada en gue la cepa de Moraxella catarrhalis .es Moraxella catarrhalis 4223, Q8" ó Rl .
6. 6. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que tiene una secuencia de ADN seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ADN como se expone en las Figuras 5, 6, 10, 11 ó 27 (Seq ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45, ó 46) ó la secuencia complementaria de ADN a la misma; (b) una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos como se expone en la Figura 5, 6, 10, 11 ó 27 {Seq ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 47) ó la secuencia.de ADN complementaria a la misma; y (c) una secuencia de ADN que codifica para una proteína del receptor de transferrina de una cepa de Moraxella que hibridiza bajo condiciones severas a cualquiera de las secuencias de ADN definidas en (a) ó (b) .
7. 7. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, caracterizada en que la secuencia de ADN definida en (c) tiene al menos 90 % de identidad de., secuencia con cualquiera de las secuencias de ADN definidas en (a) o (b) .
8. 8. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6 6 7, caracterizada en que la secuencia de ADN definida en (c) es aquella que codifica para la proteína del receptor de transferrina, equivalente, de otra cepa de Moraxella.
9. 9. Un vector adaptado para la transformación de un hospedero que contiene la molécula de ácido nucleico reivindicada según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8.
10. 10. El vector según la reivindicación 9, caracterizado en que la molécula de ácido nucleico codifica para un fragmento de una proteína del receptor de transferrina y que tiene las características de un plásmido seleccionado a partir del grupo que consiste de pLEM3, pLEM25, pLEM23, DS-1698-1-1, DS-1754-1, pSLRD2, pSLRD3, pSLRD4 y pSLRD5.
11. 11. El vector según la reivindicación 9, caracterizado además por el medio de expresión acoplado operativamente a la molécula de ácido nucleico para la expresión por el hospedero de la proteína del receptor de transferrina y una cepa de Moraxella o el fragmento o el análogo de la proteína del receptor de transferrina.
12. 12. El vector según la reivindicación 11, que tiene las características de un plásmido seleccionado a partir del grupo que consiste de Plem-20, pLEM33, pLEM37, SLRD35-A y SLRD35-B.
13. 13. Un hospedero transformado que contiene un vector de expresión según la reivindicación 11 ó 12.
14. 14. Un método para formar una proteína del receptor de transferrina, recombinante, substancialmente pura, de una cepa de Moraxella o un fragmento inmunogénico o un análogo del mismo, caracterizado por: cultivar el hospedero transformado de la reivindicación 13 para expresar una proteína del receptor de transferrina o un fragmento inmunogénico o un análogo del mismo como cuerpos de inclusión, purificar los cuerpos de inclusión libres de material celular y proteínas solubles, solubilizar .la proteína del receptor de transferrina o un fragmento inmunogénico o un análogo de la misma de los cuerpos de inclusión purificados, y purificar la proteína del receptor de transferrina a un fragmento inmunogénico o un análogo del mismo libre de otros materiales solubilizados .
15. 15. El método según la reivindicación 14, caracterizado en que la proteína del receptor de transferrina es Tbpl sola, Tbp2 sola, o una mezcla de Tbpl y Tbp2.
16. 16. El método según la reivindicación 14 ó 15, caracterizado en que_ la proteína' d-el receptor de transferrina es al menos 70 % pura.
17. 17. El método según la reivindicación 16, caracterizado en que la proteína del receptor de transferrina es al menos..90 % pura.
18. 18. Una proteína recombinante del receptor de transferrina, o un fragmento inmunogénico o un análogo de la misma, que se puede producir por el hospededor transformado reivindicado en la reivindicación 13. l
19. 19. La proteína según la reivindicación 18, que es (a) la pp 1 de unión del receptor de transferrina (Tbpl) de la cepa de Moraxella libre de otras proteínas de la cepa de Moraxella; o (b) la proteína 2 de unión del receptor de transferrina (Tnp2) de la cepa de Moraxella libre de otras proteínas de la cepa de Moraxella.
20. 20. Una composición inmunogénica, caracterizada por al menos un componente activo seleccionado a partir del grupo que consiste de: (A) una molécula de ácido nucleico, purificada y aislada, que codifica para una proteína del receptor de transferrina de una cepa de Moraxella o un fragmento de un análogo de la proteína del receptor de transferrina; (B) una molécula de ácido nucleico, purificada y aislada, que codifica para una proteína del receptor de transferrina de una cepa de Moraxella y que tiene una secuencia de ADN seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ADN como se expone en las Figuras 5, 6, 10, 11 ó 27 {Seq ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45, ó 46) ó la secuencia de ADN complementaria a la misma; (b) una secuencia de ADN que codifica a una secuencia de aminoácidos como se expone en las Figuras 5, 6, 10, 11 ó 27 (Seq ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 47) o la secuencia de ADN complementaria a la misma;, y (c) una secuencia de ADN que codifica para una proteína del receptor de transferrina de una. cepa de Moraxella que hibridiza bajo condiciones severas a cualquiera de las secuencias de ADN definidas en (a) ó (b) ; y (C) una proteína recombinante del receptor de transferrina o fragmento análogo de la misma que se puede producir por un hospedero transformado que contiene un vector de expresión y comprende una molécula de ácido nucleico como ee define en (A) o (B) .y un medio de expresión acoplado operativamente a la molécula de ácido nucleico para la expresión por el hospedero de la proteína del receptor de transferrina recombinante o fragmento análogo del mismo; y un portador farmacéuticamente aceptable para la misma, al menos un componente activo .que produce una inmunorrespuesta cuando se administra a un hospedero.
21. 21. Un método para determinar la presencia, en una muestra, del ácido nucleico que codifica para una proteína" del receptor de transferrina y una compuesto deseado, caracterizado por los pasos de: (a) poner en contacto la muestra con la molécula de ácido nucleico reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, para producir duplicados que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquier" molécula de ácido nucleico que codifica para la proteina del receptor de transferrina, y una cepa de Moraxella presente en la muestra e hibridizable específicamente con ésta; y (b) determinar la producción de los duplicados.
22. 22. Un equipo de diagnóstico para determinar la presencia, en una muestra, de ácido nucleico que codifica para una muestra del receptor de transferrina y una cepa de Moraxella, caracterizado por: (a) la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8; (b) un medio para poner en contacto la molécula de ácido nucleico con la muestra para producir duplicados que comprenden la molécula de cualquier ácido nucleico presente en la muestra e hibridizable con la molécula de ácido nucleico; y (c) un medio para determinar la producción de los duplicados .