MXPA98005648A - Analogos sinteticos de interleucina 10 - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de una sustancia o polipéptído de acuerdo con la fórmula X1-X2-X3-Thr-X4-5 Lys-X5-Arg-X;(SEQ ID NO:22), en donde X, es Ala o Gly, X2 es Tyr o Phe, X3, X4 y X5 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met,Il-2, Leu y Val;y X6 se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, opcionalmente al menos uno de X1, X2, X3, X4, X5 y X6 esta independiente sustituido son un aminoácido no natural o inusual y/o el péptido esta ciclizado y/o el péptído esta estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-terminal esta acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal esta amidado y los pectidomiméticos modelados en base a la fórmula anterior para la preparación de una composición farmacéutica para la reducción de la producción de TNF-alfa y/o para la profilaxis o tratamiento de la pancreatitis y/o para la profilaxis o tratamiento de infecciones virales tal como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o infección cutánea por HPV. En particular, la invención se refiere análogos de péptidos de la fórmula anterior, en donde al menos uno de XI, X2, X3, X4, X5 y X6 esta independientemente sustituido con un aminoácido no natural 0 inusual y/o el péptido esta ciclizado y/o el péptido esta estabilizado y/o un residuo de aminoácido amino terminal esta acilado y/o el, residuo de aminoácido carboxi terminal esta amídado, y los peptidomiméticos modelados en base a la fórmula anterior.

Description

ANÁLOGOS SINTÉTICOS DE INTERLEUCINA 10 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso farmacéutico de substancias que son agonistas de interieucina 10 (IL-10). En particular, la invención se refiere al uso de una substancia de la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para la reducción de la producción de TNF-a y/o la profilaxis o tratamiento de la pancreatitis, artritis urática (gota), alergia de la piel, reacciones alérgicas en la piel, daño al tejido como resultado de la hipoxia/isquemia, (infarto, reperfusión), reacciones inflamatorias debidas a infecciones de virus, y/o para la fabricación de un agente conceptivo .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han descrito por ejemplo en WO 93/02693 y WO 94/04180, composiciones farmacéuticas que comprenden IL-10 ó vIL-10 y el uso de hIL-10 ó vIL-10 para la fabricación de una composición farmacéutica REF. 27816 para el tratamiento de varias condiciones, y se han descrito en WO 96/01318 ciertos agonistas de IL-10.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de una substancia o polipéptido de acuerdo con la fórmula Xi-Xz-Xs-Thr-Xí-Lys-Xs-Arg-Xg (SEQ ID NO: 22), en donde X2 es Tyr o Phe, X3, X4 y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu, y Val; y X6 se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, opcionalmente al menos uno de Xi, X2, X3, X4, X5 y Xe está independientemente sustituido con aminoácidos no naturales o inusuales y/o el péptido está ciclizado y/o el péptido está estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-terminal está acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal está amidado, y los peptidomiméticos moderados en base a la fórmula anterior para la preparación de una composición farmacéutica para la reducción de la producción de TNF-a y/o para la profilaxis o tratamiento de la pancreatitis. Adicionalmente, la invención se refiere a una substancia o polipéptido que tiene la fórmula: X1-X2-X3-Thr-X4-Lys-Xs-Arg-X6 (SEQ ID NO: 22) en donde : X2 es Tyr o Phe, X3, X4 y X5 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu, y Val; y Xs se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, en donde al menos y uno de Xi, X2, X3, XA , XS y Xs está independientemente sustituido con aminoácidos no naturales o inusuales y/o el péptido está ciclizado y/o el péptido está estabilizado y/o el residuo de aminoácido a ino-terminal está acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal está amidado, y los peptidomiméticos moderados en base a la fórmula anterior, la substancia o polipéptido que tiene al menos una de las siguientes propiedades: a) induce la inhibición de la producción espontánea de IL-8 por monocitos humanos, b) induce la inhibición de la producción de IL-8 inducida IL-lß por células mononucleares de sangre periférica, humanas (PBMC), c) induce la producción de la proteina antagonista del receptor de interleucina-l (IRAP) por monocitos humanos, d) induce la migración quimiotáctica de los linfocitos T, CD8+, in vitro, e) desensibiliza las células T CD8+, humanas dando por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, f) suprime la respuesta quimiotáctica de los linfocitos T, humanos, CD4+ hacia IL-8, g) suprime la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/MCP-1 h) inhibe la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados con IFN-?, i) induce la producción de IL-4 por células T CD4+, humanas, normales, cultivadas, j ) reduce la producción de TNF-a en la reacción de los leucocitos mezclados, humanos, k) regula descendentemente la producción de TNF-a e IL-8 en un modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y reduce la infiltración de neutrófilos en los pulmones de los conejos tratados. Se contempla (como se describe en detalle en la siguiente descripción de los mecanismos inmunológicos ) que el mecanismo de acción es via la interferencia con la acción de los mediadores del sistema inmunitario, en particular las citocinas tal como onocinas, linfocinas quimiocinas y antagonistas del receptor de monocinas, es decir, que la substancia del ingrediente activo interfiere con/suprime la producción de y/o la acción de ciertas citocinas e inhibe de esta manera los procesos patológicos que conducen al daño del tejido, y que la substancia de la invención induce una producción de antagonistas de los receptores naturales de monocinas, interfiriendo/suprimiendo de este modo con la acción de ciertas citocinas tal como TNF-a o IL-1 e inhibiendo de este modo los procesos patológicos que conducen al daño del tejido. Una modalidad importante de la presente invención se relaciona de esta manera a una composición farmacéutica que comprende, como el ingrediente activo, una substancia de la invención. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una substancia de la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para inhibir substancialmente un efecto biológico relacionado a una citocina, es decir, el uso de una substancia de la invención como una proteina/péptido antagonista del receptor IL-1, linfocina, monocina, interieucina, interferón, quimiocina o factor de estimulación de la colonia. Otro aspecto se relaciona al uso de una substancia de la invención para la fabricación o elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis o el tratamiento de una condición relacionada con al disturbio de un sistema de citocina, es decir, la proteina/péptido antagonista del receptor de IL; linfocina, monocina, interieucina, interferon, quimiocina o sistema del factor de estimulación de la colonia. En otro aspecto, la invención también se refiere a un método para tratar una condición en un humano relacionada a un disturbio en un sistema de citocina, método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una substancia de la invención. El sistema inmunitario, celular toma parte en el desarrollo de estos desórdenes tal como enfermedades infecciosas, inflamatorias y neoplásticas. Las células inmunocompetentes y sus productos pueden jugar papeles importantes en la iniciación, progreso y posible naturaleza crónica del desarrollo de las condiciones inflamatorias. Estos desórdenes frecuentemente son sin etiología conocida e incluyen enfermedades comunes tal como la diabetes mellitus, artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal y de la piel. A parte de estos ejemplos, la inmunidad mediada por células, o los mediadores pro-inflamatorias, sin embargo, contribuyen a muchas otras enfermedades inflamatorias y proliferativas (ver Tabla 1) .

TABLA I Algunas enfermedades donde las reacciones inmunitarias mediadas por macrófagos/linfocitos T son considerados patogénicamente importantes Enfermedades de la piel: Psoriasis "Dermatitis atópica Dermatitis por Contacto Linfoma cutáneo de células T (CTCL) Síndromes de Sezari Pénfigo vulgar Penfigordeo buloso Eritema nodoso Esclerodermia Enfermedades autoinmunitarias (incluyendo reumáticas): Uveitis Enfermedad de Bechet Sarcoidosis Boeck Síndrome de Sjdgren Artritis reumatoide Artritis juvenil Síndrome de Reiter Gota Osteoartrosis Lupus eritematoso sistémico Polimiositis Miocarditis Cirrosis biliar primaria Enfermedad de Crohn Colitis ulcerativa Esclerosis múltiple y otra enfermedades de desmielinación Anemia aplástica Púrpura Trombocitopénica idiopática Mieloma múltiple y linfoma de células B Panhipopituitarismo de Simmons Enfermedades Graves y oftalmopatia de Graves Tireoditis subaguda y enfermedad de Hashimoto Enfermedad de Addison Diabetes mellitus dependiente de insulina (tipo 1) Otras enfermedades Varios síndromes clínicos con vasculitis (por ejemplo, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, Fiebre de arteritis de células gigantes, malestar, Anorexia (por ejemplo, en enfermedades inflamatorias e infecciosas agudas y crónicas) Coagulación intravascular diseminada (DIC) Arteriesclerosis (aterosclerosis ) Choque (por ejemplo, en sepsis gram-negativa) Caquexia (por ejemplo, en cáncer, enfermedades inflamatorias crónicas e infecciosas crónicas) Rechazo al trasplante y enfermedad del huésped contra el injerto Prevención de la absorción espontánea.

Actividad, de IL-10 en la producción de citocinas : La hIL-10 inhibe la producción de un número de citocinas incluyendo el interferon-? (IFN-?), en factor-a Necrosis de Tumor (TNF-a), factor de estimulación de la colonia de Macrófagos de Granulocitos (GM-CSF), Granulocito-CSF (G-CSF), IL-la, IL-lß, IL-2, IL-6, IL-8 y polipéptido-1 quimiotáctico de monocitos (MCP-1/MCAF) por monocitos/macrófagos y/o linfocitos T (4, 5) . Las IL-10 también inhiben la capacidad de monocitos para migrar como una respuesta a la quimiocina MCP-1/MCAF (75 ) . Además, hIL-10 induce la producción antagonista (IRAP) del receptor endógeno, interleucina-l natural (6), que inhibe a IL-la e IL-lß al competir con la unión al receptor. Puesto que IL-8 es fuertemente inducible pro IL-la y por IL-lß, IL-10 ejerce parte de su efecto inhibidor en la producción de IL-8 al estimular la producción del antagonista IRAP del receptor de IL-1. Este último mecanismo es de importancia considerable para la presente invención como se describe y ejemplifica en lo siguiente. El IRAP tiene actividades antiinflamatorias (9), y su efecto terapéutico en artritis reumatoide se ha sugerido (10) . También, el IRAP probó ser efectivo en el tratamiento del síndrome de sepsis y se asoció a un beneficio de supervivencia de 28 dias dependiente de la dosis con el tratamiento de IRAP (p = 0.015) en el estudio por Fisher y colaboradores (11). El IRAP ejerce parte de sus efectos anti-inflamatorios al inhibir la producción de quimiocinas tal como la producción de IL-8.

La expresión IL-10 y el antíge?o : La IL-10 inhibe la expresión de MHC clase II en monocitos humanos (8). La expresión constitutiva IL-4 ó inducida por IFN-? de HLA-DR/DP y DQ se inhibió por hIL-10 (12). Además, los monocitos pre-incubados con IL-10 son intratables a la inducción subsecuente de la expresión de MHC clase II por IL-4 ó IFN-?. La IL-10 inhibe la expresión clase II por monocitos humanos después de la activación por LPS (12, 76) . Ratones BALB/c que se les dio de 1 a 10 mg de IL-10 concomitante con una dosis letal de LPS se protegieron de la muerte ( 6) . La IL-10 inhibe los compuestos intermedios de nitrógeno y los aniones de superóxidos. La IL-10 también inhibe el compuesto intermedio de nitrógeno reactivo (NO) asi como los compuestos intermedios de oxigeno reactivo (H202) por macrófagos después de la activación por INF-? (13).

Actividad, de IL-10 y células T: La IL-10 también tiene efectos moduladores en las funciones/actividad de las células T. De esta manera, la hIL-10 es un factor quimiotáctico potente para los linfocitos T CD8+, mientras que la hIL-10 no Muestra quimiotaxis hacia las células T CD4+ (14). Adicionalmente, El IL-10 suprime la capacidad de las células T CD4+ para responder a las señales quimiotácticas de la ß-quimiocina RANTES asi como la a-quimiocina e IL-8. La hIL-10 también inhibe directamente la proliferación de células T de la sangre de periférica, humana, y los clones de células T CD4+ (14) .

Consideraciones terapéuticas : Estos resultados/datos in vivo y otros datos resumidos por ejemplo en WO 96/01318 sugieren fuertemente un papel homeostático de el IL-10 en el control de la inflamación inmunitaria amplificada por monocinas y mediadas por células e indican las aplicaciones terapéuticas de intervalo amplio de el IL-10 ó un fármaco con la actividad similar a el IL-10 en el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por una producción disminuida/insuficiente y/o actividad de el IL-10. Las Tablas 1 y 2 listan algunas enfermedades donde se considera que tienen importancia terapéutica un inmunomodular similar a IL-10 ó un inmunomodulador con actividad similar a IL-10.

TABLA 2 Algunas enfermedades donde un inmunomodulador con actividad similar a IL-10, debido a su inducción de producción de IRAP y/o inhibición de la producción de citocinas y/o actividad de citocinas puede tener importancia terapéutica (Ref. 20-74 + 109) Labor pre-término provocada por infección u otras condiciones Artritis reumatoide Artritis de Lyme Gota Síndrome de Sepsis Hipertermia Colitis o enterocolitis ulcerativa Osteoporosis Citomegalovirus Enfermedad periodontal Glomerulonefritis Inflamación crónica, no infecciosa del pulmón (por ejemplo, sarcoidosis y enfermedad del fumador) Formación de granuloma Fibrosis del higado Fibrosis del pulmón Rechazo al transplante Enfermedad del huésped contra el injerto Leucemia mieloide crónica Leucemia mieloide aguda Otras enfermedades neoplásticas Asma bronquial Diabetes mellitus, tipo I (dependiente de insulina) Arteriosclerosis/aterosclerosis Psoriasis Leucemia crónica de linfocitos B Inmunodeficiencia variable común Efectos laterales usando otros modificadores de respuesta biológica Coagulación intravascular diseminada Esclerosis sistémica Encefalomielitis Inflamación del pulmón Síndrome de Hiper IgE Enterocolitis Metástasis y crecimiento de cáncer Terapia inmunitaria adoptiva Síndrome de esfuerzo respiratorio adquirido Sepsis Síndrome de reperfusión Inflamación postquirúrgica Trasplante de órganos Alopecia SIDA Infección cutánea por HPV DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Desarrollo de un nonapéptido homólogo a IL-10 con actividad similar a IL-10 Se eligieron secuencias parciales de hIL-10 que tiene una longitud de 9 aminoácidos de acuerdo con los principios que la secuencia debe proceder alta homologia ente vIL-10 y hIL-10, pero tan baja homologia a mIL-10 como sea posible. Se encontró que un nonapéptido, IT9302, poseyó algunas actividades inmunosupresoras que imitan aquellas de hIL-10 como se describe en detalle adicional en los siguientes ejemplos. El IT9302 corresponde a una secuencia de nonapéptido a partir del extremo C-terminal de hIL-10 con la siguiente secuencia de aminoácido: NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn-C00H (SEQ ID NO : 1 ) El nonapéptido IT9302 es muy potente para inducir diferentes funciones y es muy estable, y se presume que no se puede acoplar incorrectamente a receptores. Se ha elegido un nonapéptido debido en general a la secuencia de polipéptidos de 9 aminoácidos es única para una proteina. Sin embargo, se debe señalar que los 6 aminoácidos en el muy extremo de hIL-10 parecen ser los más importantes. Dentro del alcance de la presente invención, es de esta manera una substancia el polipéptido que comprende una secuencia de la secuencia de aminoácidos Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID NO : ' 1 ) . Probablemente, se considera que algunas sustituciones de aminoácidos no tendrán efectos adversos en la actividad agonistas de hIL-10 como se define en la presente mientras que estén presentes la treonina, la lisina y la arginina y con un aminoácido colocado entre éstos.

La presente invención se refiere en particular al uso de una substancia o polipéptido de acuerdo con la fórmula: X?-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID NO: 22) en donde : Xi es Ala o Gly, X2 es Tyr o Phe, X3, X4 y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu, y Val; y X6 se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, opcionalmente al menos uno de Xi, X2, X3, X4, X5 y Xs está independientemente " sustituido con aminoácidos no naturales o inusuales y/o el péptido está ciclizado y/o el péptido está estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-terminal está acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-ter inal está amidado, y los peptidomiméticos moderados en base a la fórmula anterior para la preparación de una composición farmacéutica para la reducción de la producción de TNF-a inducida por IL-1 presumiblemente por el bloqueo del receptor de IL-1 con IRAP y/o para la profilaxis o tratamiento de la pancreatitis .

Los ej emplos de polipéptidos específicos que se presume son útiles para la reducción de la producción de TNF-a y/o la profilaxis o tratamiento de la pancreatitis son como sigue : 1. m^-Ala-Tyt-lfet-T r-Ilt-Lsrs-l i-Arg-?cn'COOH (SEQ ID NO: 2) 2. M2- a-^-^t-Thr-Lea»Lys-Leu-Arg-Asn-COOH (SEQ ID H0:3) 3. W^-Ala- r-Met-Thr-Met- yB-Val-Arg-^ii'COOH {SEQ ID N0:4) 4. KH^-Gly' yr-Met-t r-Met-Lye- lle-Arg-Asp-COOH {SEQ ID H0:5) . K^-Ala-Phß-Mßt-O?r-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID R0: 6) 6. HHj-Ala-Tyr-Ile-T r-Mat-Lys-Ile-Arg^Asp'OOOH (SEQ ID NO: 7) 7. l^-JÜ.a-Tyr- eu- hr-Mat- ys-Ile-Arg-Asp-CODH {SEQ ID NO: 8) a . N%-Ala-tyr -Val -Thr-Mat- Lys- lié -Arg-Asp- COOH {SEQ ID N0:9) 9. HHj-Ala-Tyr-K t-Oir-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NQ: 10) . í3H2-Ala-Tyr-Mst-T r' eu-l.ya*lle-Arg-Aßp-COCa {SEQ ID m-.11} 11. NH2-Ala-Tyr*Met-T r-Val-Lys-Ile?rg*ABp-C00H (SEQ ID NO: 12) 12. NH2*Ala- yr-Met-T r-Met-í,yB.Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 13) 13. NH2-Ala-Tyr-3Sfet- hr-Met-Lye-lfót-A3rg-ABp-CX30H {SEQ ID HO?l4) 14. NH2-Ala-Tyr-Ifet-Thr-tfet-LyB-Val-Arg-A8p*C00H (SEQ ID NÜ.15J . NH2-Ala-Tyr«lfet-Thr-Ifet-tys- Ild-Arg-Gln-COOB (SEQ ID ND:1S) 16. W^.-Ala-Tyr-Met-T r-Met-Lys-Ilß-Arg-Glu-COOH (SEQ ID NÜ:17) La presente invención se refiere en particular a un polipéptido que tiene la fórmula: Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID NO: 19) , un polipéptido que tiene la fórmula: Xs-Thr-Xí-Lys-Xs-Arg-Xs (SEQ ID NO: 20) un polipéptido que tiene la fórmula: X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-Xs (SEQ ID NO: 21) y un polipéptido que tiene la fórmula Xi-Xz-Xs-Thr-Xí-Lys-Xs-Arg-Xg (SEQ ID NO: 22; en donde : X2 es Tyr o Phe, X3/ X4 y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu, y Val; y X6 se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, en donde al menos y uno de Xx, X2, X3, X4, X5 y Xs está independientemente sustituido con aminoácidos no naturales o inusuales y/o el péptido está ciclizado y/o el péptido está estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-terminal está acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal está a idado, y los peptidomiméticos moderados en base a la fórmula anterior, los análogos que tienen al menos una de las siguientes propiedades: a) induce la inhibición de la producción espontánea de IL-8 por monocitos humanos, b) induce la inhibición de la producción de IL-8 inducida IL-lß por células mononucleares de sangre periférica, humanas (PBMC), c) induce la producción de la proteina antagonista del receptor de interleucina-l (IRAP) por monocitos humanos, d) induce la migración quimiotáctica de los linfocitos T, CD8+, in vitro, e) desensibiliza las células T CD8+, humanas dando por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, f) suprime la respuesta quimiotáctica de los linfocitos T, humanos, CD4+ hacia IL-8, g) suprime la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/MCP-1 h) inhibe la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados con IFN-?, i) induce la producción de IL-4 por células T CD4 +, humanas, normales, cultivadas, j ) reduce la producción de TNF-a en la reacción de los leucocitos mezclados, humanos, k) regula descendentemente la producción de TNF-a e IL-8 en un modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y reduce la infiltración de peutrófilos en los pulmones de los conejos tratados.

Por el uso el término "al menos una actividad biológica de 19302" en la presente especificación y las reivindicaciones, la referencia es para querer decir que es al menos una de las propiedades mencionadas anteriormente. Cualquiera de los péptidos contemplados de la invención puede tener un residuo de aminoácido amino-terminal que está acilado tal como acetilado o benzoilado . También, cualquiera de los péptidos contemplados puede tener un residuo de aminoácido carboxi-terminal que esté amidado . La presente invención contempla además análogos de los péptidos formados por otras sustituciones conservadoras de aminoácidos que aquellas sustituciones especificas propuestas anteriormente, sustituciones de aminoácidos inusuales o no naturales, estabilización de péptidos, ciclización de péptidos, y peptidomimétidos modelados en los péptidos agonistas de IL-10 identificados. El principio detrás de la sustitución conservadora de aminoácidos es que ciertos pares de aminoácidos tienen cadenas laterales compatibles tal que, cuando uno está sustituido por otro, habrá solo cambios mínimos en la estructura terciaria y la afinidad de unión del péptido. Se explican en (78) las reglas para sustitución conservadora. "Conservadora" como se usa en la presente significa (i) que las alteraciones son tan neutrales de manera estructural como sean posibles, es decir, se diseñan para producir cambios mínimos en la estructura terciaria de los polipéptidos mutantes en comparación a la proteina nativa, y (ii) que las alteraciones tan antigénicamente neutrales como sea posible, que se diseñan para producir cambios mínimos en los determinantes antigénicos de los polipéptidos mutantes en comparación a la proteina nativa. Es deseable la neutralidad estructural para conservar la actividad biológica y es deseable la neutralidad antigénica para evitar la activación de respuestas inmunogénicas en pacientes o en animales tratados con la substancia de la invención. Aunque es difícil seleccionar con certeza absoluta qué alternativas serán estructuralmente y antigénicamente neutrales, existen reglas que pueden guiar a aquellas personas expertas en la técnica para hacer alteraciones que tengan altas probabilidades de ser estructuralmente y antigénicamente neutrales, por ejemplo (77) y (78) . Algunas de las reglas más importantes incluyen (1) reemplazo de los residuos hidrofóbicos es menos probable que produzca cambios en la antigenicidad debido a que probablemente se van a localizar en el interior de la proteina, por ejemplo, Berzofsky (citado anteriormente) y Bowie y colaboradores (citado anteriormente); (2) reemplazo de residuos fisicoquimicamente similares, es decir, sinónimos, es menos probable que produzcan cambios estructurales debido a que el aminoácido de replicación puede jugar el mismo papel estructural como el aminoácido de reemplazo; y (3) la alteración de las secuencias evolucionariamente conservadas probablemente va a conducir efectos estructurales perjudiciales debido a que la conservación evolutiva sugiere que pueden ser funcionalmente importantes las secuencias. Además, estas reglas básicas para seleccionar secuencias de muteina, los ensayos están disponibles para confirmar la actividad biológica y la estructura de las moléculas manejadas por ingeniería genética. Los cambios en la estructura se pueden probar por al menos dos ensayos bien conocidos: el método de fijación de microcomplemento, por ejemplo (79) y (80) usado ampliamente en los estudios evolutivos de las estructuras terciarias de las proteínas; y afinidades a los conjuntos de anticuerpos monoclonales específicos de la estructura, por ejemplo (81). Los ensayos biológicos para las substancias de la invención se describen no completamente en los ejemplos: Se prueba la inhibición de la producción espontánea de IL-8 por monocitos humanos, como se resume en el Ejemplo 1, usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si se suprime la producción de IL-8 para ser no más de 50 % cuando se usa 1 ng/ml en la substancia o péptido, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. Se prueba la inhibición de la producción de IL-8 inducida por IL-lß por las células mononucleares, humanas de la sangre periférica (PBMC) como se resume en el Ejemplo 2, usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si el por ciento de inhibición de la producción de IL-8 es al menos 50 % cuando se usa 1 ng/ml de la substancia o péptido, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. Se prueba la producción de la proteina antagonistica del receptor de interleucina-l (IRAP) por monocitos humanos, como se resume en el Ejemplo 3 usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si la inducción de IRAP es al menos 30 ng/ml cuando se usan 10 ng/ml de la substancia o péptido, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. Se prueba la inducción de la migración quimiotáctica de los linfocitos T, humanos, CD8+, in vitro, como se resume en el Ejemplo 4, usando la substancia o péptido en lugar de IT932. Si la potencia de la substancia o péptido cuando se usa una concentración de 10 ng/ml, está presente, es decir, 2 ó más, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. Se prueba la desensibilización de las células T CD8+, humanas que dan por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, como se resume en el Ejemplo 5, usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si la preincubación de las células con la substancia o péptido da por resultado una sensibilidad totalmente suprimida de manera substancial de las células CD8+ hacia hrIL-10, es decir, que da un valor de aproximadamente 1, tal como de 0.8 a 1.2, a una concentración de la substancia o péptido de 10 ng/ml, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. La supresión de la respuesta quimiotáctica de los linfocitos T, humanos, CD4+ hacia IL-8 se prueba como se resume en el Ejemplo 6, usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si la adición de la substancia o péptido a una suspensión de linfocitos T CD4+, humanos da por resultado una inhibición substancialmente total de la respuesta de la célula CD4+ hacia IL-8, es decir, que da un valor de aproximadamente 1, tal como 0.8 a 1.2, una concentración de la substancia o péptido de 10 ng/ml, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. Se prueba la supresión de la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAP/MCP-1 como se resume en el Ejemplo 7 usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si la adición de la substancia o péptido a una suspensión de monocitos humanos da por resultado una inhibición substancialmente total de la respuesta quimiotáctica de los monocitos hacia MCAF/MCP-1, es decir, que da un valor de aproximadamente 1, tal como de 0.8 a 1.2, a una concentración de la substancia o péptido de 10 ng/ml, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. La inhibición de la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados con IFN-? se prueba como se resume en el Ejemplo 8 usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. El INF-? regula ascendentemente la expresión del antigeno MHC II en la población celular desde 36.8 % hasta 58.4 %, y esta estimulación se bloqueó o reguló descendentemente a 25.2 % por 10 ng/ml de rhIL-10 y a 31.2 % por 1 ng/ml de IT9302 (Figura 12) . Si una substancia o péptido bloquea o regula descendentemente la expresión de MHC clase II y los monocitos al nivel no estimulado, cuando se adicionan en una cantidad de 1-10 ng/ml, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. .Si la adición de la substancia o péptido es capaz de bloquear el efecto de la estimulación de IFN-? a una concentración de la substancia o péptido de 10 ng/ml, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención.

Se prueba la inducción de la producción de IL-4 por células T CD4+, humanas, normales, cultivadas como se resume en el Ejemplo 9, usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si la adición de substancia o péptido induce la producción de IL-4 en los linfocitos T CD4+ a una concentración de la substancia o péptido de 10 ng/ml, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. La reducción de la producción de TNF-a en la reacción de los leucocitos, mezclados, humanos, se prueba como se resume en el Ejemplo 10 usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT93-02. Si la adición de la substancia o péptido reduce significantemente la producción de TNF-a en la reacción de leucocitos mezclados, humanos, en el espacio de 24 horas a una concentración de la substancia o péptido 10 ng/ml, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. La regulación descendente de TNF-a y la producción de IL-8 en un modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y la reducción de la infiltración de neutrófilos en los pulmones de los conejos tratados se prueba como se resume en el Ejemplo 14 usando la substancia o péptido sintetizado en lugar de IT9302. Si la adición de la substancia o péptido reduce significantemente la mortalidad de los animales de prueba, cuando se adiciona la substancia o péptido a una concentración de 100 µg/kg, entonces la substancia o péptido está dentro del alcance de la presente invención. Una modalidad importante de la presente invención se relaciona de esta manera a un polipéptido en la cual al menos un residuo de aminoácido se ha sustituido con un residuo de aminoácido diferente y/o en el cual al menos un residuo de aminoácido se ha suprimido o adicionado para dar por resultado un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es diferente de la secuencia de aminoácidos o una secuencia de la secuencia de aminoácidos como se define en lo siguiente, pero que tiene esencialmente actividad agonista de hIL-10 como se define anteriormente . También se pueden elaborar análogos de péptidos sintéticos al sustituir residuos individuales con aminoácidos no naturales o inusuales. Las secuencias de los péptidos bioactivos se derivan originalmente a partir de proteínas que están constituidas de los residuos de los veinte L-aminoácidos que se presentan de manera natural. Sin embargo, un proceso de síntesis química usado para construir los péptidos sintéticos permiten la sustitución de residuos alternativos incluyendo los D-aminoácidos, ß-aminoácidos , aminoácidos N-sustituidos, aminoácidos que se presentan de manera natural de manera infrecuente, o análogos de aminoácidos sintéticos, no naturales (93). Los ejemplos no limitantes de los aminoácidos útiles en la presente invención son: Aad Ácido 2-aminoadipático bAad Ácido 3-aminoadipático bAla Beta-alanina, ácido beta- aminopropiónico Abu Ácido 2-aminobutírico 4Abu Ácido 4-aminobutírico, ácido piperidínico Acp Ácido 6-aminocaproico Ahe Ácido 2-aminoheptanoico Aib Ácido 2-aminoisobutírico bAib Ácido 3-aminoisobutirico Ap Ácido 2-aminopimélico Dbu Ácido 2, 4-diaminobutírico Des Desmosina Dp Ácido 2, 2 ' -diaminopimélico Dpr Ácido 2, 3-diaminopropiónico EtGly N-etilglicina EtAsn N-etilaspagina Hyl Hidroxilisina aHyl Alo-hidroxilisina 3Hyp 3-hidroxiprolina 4Hyp 4-hidroxiprolina Ide Isodesmosina alie Alo-isoleucina MeGly N-metilglicina, sarcosina Melle N-metilisoleucina MeLys 6-N-metillisina MeVal N-metillisina N a Norvalina Nle Norleucina Orn Ornitina Los ejemplos adicionales no limitantes de los aminoácidos no naturales que se presentan de manera infrecuente o bloques de construcción, se listan como sigue: Novabiochera 1994/95 Catalog (Calbiochem-Novabiochem AG, Weidenmattweg 4, CH-4448 Laufelfingen/S itzerland) , pp . 65-125; Bachem Feinkemikalien AG 1995 Catalog (Bachem Feinkemikalien AG, Hauptstrasse 144, CH-4416 Bubendoft/S itzerland) , pp . 753-831; Neosystem Laboratoire Catalogue 1997/98 (Neosystem Laboratoire, 7 rué de Boulogne, 67100 Strasbourg, France), pp . 131-176. Los residuos alternativos, descritos anteriormente se pueden usar (a) para reemplazar residuos químicamente reactivos y mejorar la estabilidad del péptido sintético hacia, por ejemplo, la degradación enzimática y proteolítica, (b) para proporcionar marcas analíticas útiles en la detección del péptido sintético, y (c) para modular la bioactividad de péptido sintético al incrementar o disminuir la afinidad de unión del péptido para el receptor IL-10, por ejemplo por la introducción de restricciones estructurales que reducen la libertad rotacional para uniones químicas específicas. Dentro del alcance de la presente invención están substancias adicionales en donde uno o más residuos Thr, Lys o Arg en la fórmula anterior están sustituidas con aminoácidos no naturales o inusuales como se propone anteriormente. Todas las secuencias de polipéptido en la siguiente especificación y reivindicaciones están descritas, también cuando no se señala de manera explícita, desde el extremo N-ter inal al extremo C-terminal en el formato convencional.

El método de elección para la síntesis de los péptidos y sus análogos es la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Este método se introdujo por Marrifield (100) en 1963, y se han sintetizado numerosos péptidos desde entonces con esta técnica. Una excelente revisión de la síntesis química corriente de péptidós y proteínas se da por S.B.H. Kent (101) . En la práctica, se montan péptidos por SPPS gradual, el aminoácido C-terminal en la forma de un derivado reactivo N-alfa-protegido, si es necesario, protegido en la cadena lateral, se acopla covalentemente ya sea directamente o por medio de un enlazador adecuado a un soporte sólido, por ejemplo, una resina polimérica, que se hincha en un solvente orgánico. El grupo N-alfa-protector luego se remueve y los aminoácidos protegidos subsecuentes de acuerdo con la secuencia deseada se unen de una manera gradual . Después del montaje de la cadena completa de péptidos, los grupos protectores de la cadena lateral se remueven, y el péptido se escinde de la resina, que se puede hacer de manera simultánea o en pasos separados .

Entre las varias estrategias diferentes de acoplamiento que han emergido durante los años, dos están en general en uso corrientemente, en base a los diferentes grupos N-alfa-protectores y la igualación de los grupos protectores de cadena lateral. Merrifield usó ter-butiloxi-carbonilo (Boc) como el grupo N-alfa-protector, mientras que se introdujo 9-fluór-menilmetoxicarbonilo (Fmoc) por Carpino y Han (102) . La aplicación práctica de estas dos estrategias incluyendo la reacción de los soportes sólidos, los grupos protectores de cadena lateral, los procedimientos de activación, los procedimientos de escisión, instrumentación, y técnicas analíticas y de monitoreo se han dado en varios artículos entre los cuales se deben mencionar los siguientes: Stewart y Young (103), Atherton y Sheppard (104), y Pennington y Dunn (105) . Los péptidos y sus análogos con aminoácidos inusuales o no naturales en la presente invención se sintetizan convenientemente de acuerdo con estos protocolos. Los análogos de los péptidos lineales, sintéticos se pueden hacer al convertir químicamente las estructuras a formas cíclicas . La ciclización de los péptidos lineales pueden modular la bioactividad al incrementar o disminuir la afinidad de unión del péptido por la proteina objetiva (94). Los péptidos lineales son muy flexibles y tienden a adoptar muchas estructuras diferentes en solución. La ciclización actual para restringir el número de estructuras disponibles y de esta manera favorecer las estructuras más activas o inactivas del péptido. La inmunogenicidad de los péptidos se ha correlacionado con las preferencias estructurales, observadas de manera experimental en solución (95) . Las diferencias en la inmunogenicidad pueden ser indicativas de las diferencias en la afinidad de unión de los anticuerpos específicos para péptidos cíclicos. Se logra la ciclización de péptidos lineales ya sea al formar un péptido unido entre los extremos N-terminal y C-terminal ( ciclopéptidos homodéticos) o al formar un nuevo enlace covalente entre la estructura de aminoácidos y/o los grupos de cadena lateral (ciclopéptidos heterodéticos ) (93). Estas últimas ciclizaciones usan estrategias químicas alternativas para formar enlaces covalentes, - por ejemplo, disulfuros, lactonas (ambos también presentes en los péptidos naturales), éteres, o tioéteres. Los péptidos lineales de más de cinco residuos se pueden ciclizar de una manera relativamente fácil. La predisposición del péptido para formar una estructura de beta-vuelta en los cuatros residuos centrales facilita la formación tanto de ciclopéptidos homo- y heterodéticos. La presencia de residuos de prolina o glicina en los extremos N- o C-terminales también facilitan la formación de ciclopéptidos, especialmente de péptidos lineales más cortos que seis residuos de longitud. Los ejemplos de protocolos para la formación de enlaces de disulfuro y para otras reacciones de ciclización de péptidos se dan en Pennington y Dunn (105), capítulo 7 y 11. La tecnología de los peptidomiméticos es el diseño de los miméticos moleculares de los péptidos. La capacidad para diseñar exitosamente estas moléculas depende del entendimiento de las propiedades de la secuencia de lineal de péptidos y la estructura en la cual se presente al receptor de IL-10. La síntesis de los miméticos puede proporcionar compuestos que exhiban mayor actividad biológica, solubilidad mejorada, y estabilidad (96) . Como un ejemplo, el siguiente peptidomimético se ha derivado en base a las plantillas a-helicoidales en los miméticos de péptido C-terminales de citocinas descritas en la US 5,446,128 (97) en combinación con el conocimiento que el extremo C-terminal de IL-10 existe como una a-hélice (98) .

Por esta unión de una pequeña molécula al extremo N-terminal del péptido, se estabiliza una estructura a-helicoidal del péptido sintético, y el péptido se hace más resistente a la degradación proteolítica. Se puede derivar otros peptidomiméticos en base a la descripción en US 5,446,128. Estas substancias en donde la sustitución ha tomado lugar en otros residuos diferentes de Xi y/o en donde la sustitución ha tomado lugar con otras moléculas diferentes de la molécula N-terminal mostrado en la fórmula anterior están dentro del alcance de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, el término "un análogo del péptido" comprende cualquier compuesto farmacéuticamente activo y aceptable derivado en base a las fórmulas anteriores que exhiba al menos una actividad biológica similar a IT9302, incluyendo derivados de estos análogos, especialmente sales farmacéuticamente aceptables, esteres y solvatos de los mismos. Los siguientes términos: "citocina", "linfocina", "interieucina", "monocina", "quimiocina", "interferon", "factor de estimulación de la colonia", y "polipéptidos" se usan como se definen en WO 96/01318. Una modalidad de interés de la invención se relaciona a un polipéptido de la invención donde los aminoácidos dan cuenta de un total de 6, 7, 8, 9 ó 10 hasta aproximadamente 100 aminoácidos, por ejemplo, 11, 12, 13, 14, ó 15 aminoácidos, o aún más grande tal como 20 aminoácidos ó 30 aminoácidos. En una modalidad preferida de la invención, la substancia o polipéptido se usa en la forma substancialmente pura. Para obtener esto, se puede requerir la purificación del polipéptido. Los ejemplos de los procedimientos empleados para la purificación de los polipéptidos son: (i) inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad con anticuerpos, (ii) cromatografía de afinidad con un ligando adecuado, (iii) otros procedimientos de cromatografía tal como filtración en gel, intercambio iónico o cromatografía líquida de alto desempeño o derivados de cualquiera de los anteriores, (iv) procedimientos electroforéticos similares a electrofóresis en gel de poliacrilamida, electrofóresis en gel de poliacrilamida de desnaturalización, electrofóresis en gel de agarosa y enfoque isoeléctrico, (v) cualquier otra técnica de solubilización y/o purificación específica. Dentro del alcance de la presente invención también está una composición farmacéutica que comprende una substancias polipéptica de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender, por ejemplo, proteina sintetizada, purificada, o un polipéptido recombinante, purificado. El agonista de IL-10 usado en esta invención se puede preparar como formulaciones en un medio farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato (PBS), solución de Ringer, dextrosa/solución salina, solución de Hank, y glucosa. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, tal como agentes de amortiguamiento, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Los aditivos también pueden incluir ingredientes activos adicionales, por ejemplo, agentes bactericidas, o estabilizadores. La cantidad administrada al paciente variará dependiendo de lo que se esté tratando, el propósito de la administración, tal como profilaxis o terapia, el estado del huésped, la manera de administración, y similares . Las composiciones farmacéuticas se proponen típicamente para la administración transcutánea o parenteral, por ejemplo, de manera intravenosa, subcutánea, o de manera intramuscular. Las formas administrables de manera oral también se desean y se pueden proporcionar al modificar la composición al derivar el ambiente del estómago. La composición se puede usar para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Las composiciones farmacéuticas de la invención adecuadas para la administración tópica pueden ser, por ejemplo, cremas, ungüentos, lociones, unturas, geles, soluciones, suspensiones, pastas, barras, pulverizaciones o polvos. La composición se puede impregnar o distribuir sobre por ejemplo, almohadillas, yesos o tiras y se aplica convenientemente de 1-10 veces en un día. Las composiciones tópicas comprenderán en general de 1-80 % del compuesto activo en peso, en base al peso total de las preparaciones, tal como de 0.001-25 % p/p del compuesto activo, por-ejemplo, 0.1-10 %, 0.5-5 %, ó 2-5 %. La composición se puede formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional con excipientes farmacéuticos convencionalmente usados para aplicaciones tópicas. Los vehículos diferentes del agua que se pueden usar de las composiciones pueden incluir sólidos o líquidos tal como emolientes, solventes, humectantes, espesantes y polvos. El pH de la composición puede estar en principio dentro de un intervalo muy amplio tal como 3-9, aunque se prefiere un pH de aproximadamente 4 a 8. Los agentes amortiguadores convencionales se pueden usar para obtener el pH deseado. Como un ejemplo, una composición para la administración transcutánea puede contener 1 mg de substancia (IT9302) disuelta en 1 g de una base de crema tal como crema neutral de Moistion con ácido s_alicilico al 0.05 % (la farmacia de Árhus Kommunehospital) y se aplica en una cantidad de 0.4-0.5 mg bajo plástico en la piel. La composición se usa en los Ejemplos 16 y 17. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar alternativamente de manera intravenosa.

Esta manera, la invención proporciona composiciones que comprenden una substancia agonista de IL-10 disuelta o dispersada en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso. Estas composiciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales, o se pueden filtrar de manera estéril. Las soluciones acuosas resultantes se puede empacar para el uso como está, o se liofilizan, la preparación liofilizada que se combina con un portador acuoso estéril antes de la administración. El agonista de IL-10 también se puede administrar con un segundo agente biológicamente activo, tal como un agente quimioterapéutico, normal. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a, vincristina, daunorubicina, L-asparaginasa, mitoxantrona y a sacrina . En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un paciente en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, definida como una "dosis terapéuticamente efectiva". La dosis terapéuticamente efectiva de un agonista de IL-10 variará de acuerdo a, por ejemplo, el uso particular para el cual se hace el tratamiento, la manera de administración, la salud y condición del paciente, y el juicio del facultativo.

Por ejemplo, la dosis para la infección continua estará típicamente entre 500 ng/kg/día y 50 µg/kg/día. Esta dosis se calcula en base a un ensayo controlado, aleatorizado de IL-10 humanos (90) . La concentración del agonista de IL-10 en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, desde aproximadamente 10 µg hasta aproximadamente 5 mg/ml, en forma preferente entre aproximadamente 100 µg y aproximadamente 2 mg/ml. La concentración se seleccionará usualmente de manera principal por los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de la administración seleccionada. De esta manera, una composición farmacéutica típica para la infección intravenosa podría elaborarse para contener 250 ml de solución de dextrosa/solución salina y 2.5 µg del agonista IL-10. Para composiciones sólidas, se pueden usar portadores sólidos no tóxicos, convencionales, que incluyen, por - ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sólida, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio, y similares. Para la administración oral, se forma una composición no tóxica, farmacéuticamente aceptable al incorporar excipientes normalmente empleados, tal como aquello portadores listados previamente y en general de 10-95 % de ingrediente activo, esto es, una substancia agonista de IL-10, preferentemente de 25-75 %. Para la administración en aerosol, el agonista de IL-10 se suministra preferentemente en forma finamente dividida junto con un agente tensioactivo y un propulsor. Los porcentajes típicos del agonista de IL-10 son de 0.01-20 % en peso, preferentemente 1-10 %. El agente tensioactivo debe ser por supuesto no tóxico, y preferentemente soluble en el propulsor. Los representativos de estos agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tal como ácido caproico, octanoico, laurático, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico tal como por ejemplo, etilenglicol, glicerol, eritritol, arbitol, manitol, sorbitol, los anhídridos de hexitol derivados de sorbitol, y los derivados de polioxietileno y polioxipropileno de estos esteres. Los esteres mezclados, tal como los glicéridos mezclados o naturales también se pueden emplear. El agente tensioactivo puede constituir de 0.1-20 % en peso de la composición, preferentemente de 0.25-5 %. El resto de la composición es ordinariamente el propulsor. Los propulsores licuados son típicamente gases a condiciones ambientes, y se condensan bajo presión. Entre los propulsores licuados adecuados están los alcanos inferiores que contienen hasta 5 átomos de carbono, tal como butano y propano; y preferentemente alcanos fluorados y fluoroclorados . También se pueden emplear las mezclas de los anteriores. En la producción del aerosol, un recipiente equipado con una válvula adecuada se rellena con el propulsor adecuado, que contiene el (los) polipéptido ( s ) finamente dividido (s) y el agente tensioactivo. De esta manera, los ingredientes se mantienen a una temperatura elevada hasta que se libera por la acción de la válvula. Para mejorar la vida media en suero, el agonista de IL-10 se puede encapsular, introducir en el lumen de liposomas, preparar como un coloide, u otras técnicas convencionales se pueden emplear que proporcionen un tiempo de vida prolongado de los polipéptidos. De esta manera, en ciertas modalidades, el agonista de IL-10 se puede encapsular en un liposoma. Están disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en (83), (84), (85) y (86).

Como se describe anteriormente, se ha encontrado que el IT9302 y los análogos o variantes de los mismos son útiles para prevenir los efectos de las citocinas conocidas que están comprendidas patogénicamente en las condiciones patológicas descritas previamente. Por lo tanto, los potenciales de terapia al usar el polipéptido de la invención o análogos y derivados del mismo se contempla y se debe investigar en todas las enfermedades donde se sospecha del efecto terapéutico de hIL-10 y/o IRAP (ver antes, Tablas 1 y 2) .

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama que muestra que el IT9302 inhibe la producción espontánea de IL-8 por los monocitos humanos, cultivados, purificados.

La Figura 2 es un diagrama que muestra que el IT9302 inhibe la producción de IL-8 inducido por IL-1 (1 ng/ml) por células mononucleares humanas de la sangre periférica.

La Figura 3 ilustra la producción de IRAP por monocitos humanos estimulados por IT9302.

La Figura 4 ilustra la producción de IRAP por monocitos humanos estimulados con IL-10.

La Figura 5 ilustra la actividad quimiotáctica de IT9302 en las células T CD8+.

La Figura 6 ilustra la desensibilización de células T CD8+ por IT9302, que da por resultado una insensibilidad de las células T CD8+ hacia la quimiotaxis inducida por IL-10 (10 ng/ml) .

- La Figura 7 ilustra la supresión de la actividad de IL-8 en células T CD4+ por IT9302.

La Figura 8 es un diagrama que muestra que el IT9302 inhibe la quimíotaxis de monocitos inducida por MCAF/MCP-1.

La Figura 9 muestra la producción de IL-4 en células y fracciones citosólicas de células T CD4+ por la transferencia Western ECL .

La Figura 10 muestra la producción de TNF-a que las fracciones citosólicas de cultivos de linfocitos mezclados, humanos por la transferencia Western ECL. Se llevó a cabo la transferencia Western de TNF-a como e IL-4 descrito en materiales y métodos, pero usando un anticuerpo anti-TNF-a humano de conejo (Pepro Tech. Inc., Londres, Inglaterra) y el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano (No. de Catálogo P 217, Dako, Dinamarca) .

La Figura 11 muestra la regulación de la proliferación de células T por IL-10 e IT9302.

La Figura 12 muestra la expresión de HLA-DR en monocitos humanos (citometría de flujo) .

La Figura 13 muestra que el choque inducido por LPS y la leucopenia se modulan por IT9302, mostrado por el conteo total de leucocitos.

La Figura 14 muestra que la inyección de IT9302 murino en conejos antes que la pancreatitis producida previene la leucopenia.

EJEMPLOS Materiales y Métodos atocinas y qu mioa trayentes Se obtuvo la hIL-10 recombinante de Pepro Tech Inc., NJ. (No. de Catálogo 200 10). La hIL-lß recombinante y la hIL-8 recombinante fueron una clase obsequiada de Dainippon Pharmaceutical Company, Osaka, Japón. El medio de cultivo fue RPMI 1640 GIBCO, libre de LPS de acuerdo con el ensayo de Lisado de Limulos Amoebocito (Sigma E-TOXATE Kit No. de Catálogo 210-Al ) . rhMCAF/MCP-1 fue una clase obsequiada del profesor Kouj i Matsushima, Kanazawa, Japón.

Ensayo de quimotaxis de leucocitos Quimiotaxis de células T Subconjuntos de linfocitos T CD4+ y CD8+ caracterizados por expresar antígenos ya sea de CD4 ó CD8 se purificaron a partir de la sangre heparinizada de donadores normales. De esta manera, se purificaron las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) a partir de la sangre heparinizada al diluir 100 ml de la sangre con la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 1:1 y luego separando por estrateficación de las células en Linfopac^ (Nycomed Phar a, Oslo, Noruega) seguido por centrifugación en gradiente a 2000 rpm durante 20 minutos. Las células mononucleares se lavaron 3 veces en HBSS y el sedimento celular se diluyó en 4 ml de HBSS que contiene suero de becerro fetal al 1 % y se separaron a 4°C al usar Dynabeads revestidas con anticuerpo monoclonar hacia el antígeno CD4 ó CD8 (Dynabeads M-450 CD4 No. Catálogo 111.16, Dynabeads M-450 CD8 No. de Catálogo 111.08, DETACHaBEAD No. de Catálogo 125.904) . La relación cuenta : célula fue de 10:1 y el tiempo de incubación de 1 hora. Las cuentas se desecharon al adicionar el anticuerpo anti-ratón policlonal de acuerdo con las instrucciones del fabricante . El ensayo de quimiotaxis fue una técnica de microcámara de 48 pozos (Neuroprobe, Rockville, MD) como se describe previamente (74; ver referencia 3 y referencia 14). Se diluyeron los quimioatrayentes en RPMI 1640 (GIBCO No. de Catálogo 61870-010) con suero de becerro fetal, filtrado, estéril al 1 % y se colocaron en una cámara inferior de 25 µl . En el caso de terminar quimiotaxis de células T, se dispersaron células T (5 x 10s ml) en el medio y se colocaron 50 µl en la cámara superior separada de la cámara inferior por un filtro libre de polivinilpirrolidona, de policarbonato con un tamaño de poro de 5 µm (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) revestido con colágeno tipo IV (Sigma No. de Catalogo C 0543) . Se dejaron que las células migrarán durante 2 horas a 37°C en C02 al 5 % . Los filtros luego se removieron cuidadosamente, se fijaron en metanol al 70 %, y se tiñeron durante 5 minutos en azul brillante de Coomassie. Las células unidas a la superficie inferior del filtro se contaron al medir su área usando una cámara de video en el microscopio conectado a un sistema de computadora para el análisis digital y soportado por programas para la determinación objetiva de la migración quimiotáctica. Aproximadamente 5 % de las células T migrarán espontáneamente que corresponden entre 12,000 y 13,000 células; esto puede variar día con día, pero muy poco en los experimentos del mismo día. Como se ha descrito anteriormente (ref. 13 y ref. 14), se eligió por lo tanto reportar los resultados como una relación entre el número y células que migran en la muestra y en el control negativo, que refleja la migración espontánea. Esta relación se refiere como el índice quimiotáctico (Cl) . Todas las muestras se analizaron en triplicado y la migración celular en cada pozo se midió en tres campos antes de que se estimara el valor medio del área. En algunos experimentos, no se revistió la membrana de quimiotaxis con colágeno, y en el presente sistema de ensayo las células igradoras caerán por lo tanto en el fondo del pozo inferior de la cámara de quimiotaxis . En un experimento, la actividad quimiotáctica de IT9302 en células T CD8+ se realizó al probar diluciones seriales de IT9302 adicionado a la cámara inferior y evaluar la quimiotaxis como se describe anteriormente . En un segundo experimento, se estudió la capacidad del IT93Q2 para desensibilizar la migración de células T CD8+ como una respuesta a rHIL-10 (10 ng/ml) al adicionar IT9302 a las células objetivo 30 minutos antes de la quimiotaxis. Se adicionó IT9302 en concentraciones en serie y se evaluó como se describe anteriormente la respuesta quimiotáctica de rhJL-10. En un tercer experimento, se estudió la capacidad del IT9302 para suprimir la respuestas quimiotáctica de células T CD4+ hacia rhIL-8 (10 ng/ml) al adicionar IT9302 a las células objetivo minutos antes de realizar la quimiotaxis. Se adicionó IT9302 en concentraciones en serie y la respuesta quimiotáctica de rhIL-8 se evaluó como se describe anteriormente .

Quimiotaxis de Monocitos Se midió la quimotaxis de monocitos usando el mismo equipo de cámara Boyden como se describe para las células T anteriores. El quimoatrayente MCAF/MCAF-1 se diluyó en el medio RPMI 1640 con BSA al 0.5 % y se adicionó a la cámara inferior una concentración de 10 ng/ml. Los monocitos, purificados por la técnica de adherencia de plástico, normal, a partir de PBMC humanas, normales, obtenidas como se describe anteriormente se dispersaron en el medio RPMI 1640 con BSA al 0.5 % y luego se incubaron durante 30 minutos en la presencia de IT9302 a concentraciones diferentes; las células se adicionaron a las cámaras superiores de quimotaxis a una concentración de 10s células/ml. Las cámaras superior e inferior se separaron por un filtro de policarbonato libre de polivinilpirrolidona con un tamaño de poro de 8 µm o (Nucleopore, Pleasanton, CA) . La cámara se incubó a 37 °C durante 90 minutos. Las membranas que contienen las células migradoras se probaron como se describe anteriormente y un índice quimiotáctico se calculó de acuerdo con la técnica descrita anteriormente.

Producción de IL-8 por células mononucleares, periféricas , humanas , normales (PBMC) Se purificaron PBMC a partir de la sangre heparinizada de donadores humanos normales. Después de la centrifugación con gradiente con Lymphoprep1^ (Nycomed Phar a, Oslo, Noruega) , las células mononucleares se diluyeron a 2 x 106 células/ml en el medio RPMI 1640 libre de LPS (Gibco No. de Catálogo 6187-010) que contiene suero de becerro fetal inactivado con calor, filtrado, estéril al 1 % y penicilina (10,000 IE/ml), estreptomicina (10 mg/ml) y gentamicina (2.5 mg/ml) . Las células se cultivaron en placas micro de 24 pozos Nunc Micro Plates (Nunc, Dinamarca) y en la presencia de diferentes concentraciones de IT9302 (0,1 µg, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, 0.01 ng/ml) durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se adicionó otra dosis de IT9302 una vez más, y 1 hora más tarde se adicionó r-hlL-lß (1 ng/nml) a los cultivos celulares. Se colectaron los sobrenadantes después de un total de 48 horas de incubación, y se midió la concentración de la IL-8 segregada por ELISA de IL-8 al usar un equipo ELISA de IL-8 (Dainippon Pharmaceutical, Co . Ltd, Osaka, Japón) . Brevemente, los sobrenadantes normales y celulares se incubaron durante una hora y en duplicado a 20°C en un agitador de microplacas. Después del lavado, se adicionó un segundo anticuerpo durante una hora, seguido por una hora de incubación con IgG anti-conejo de cabra marcada con peroxidasa. Después del lavado, la reacción se desarrolló con 0-fenilendiamina . Treinta minutos más tarde la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 1.6 N. Se midió la densidad óptica (OD) en un vector de ELISA a 490 nm. Se calculó la concentración de IL-8 por una curva de calibración de absorbancia de concentración conocida contra concentraciones de normas de IL-8.

Determinación de la concentración de IRAP Se purificaron PBMC como se describe anteriormente. Las PBMC se cultivaron en RPMI y 1640, suero de becerro fetal inactivado con calor, estéril al 10 % (que incluye penicilina 100,00 IE/ml, estreptomicina 10 mg/ml, gentamicina 2.5 mg/ml) y la concentración celular fue de 5 x 10s células/ml. Los monocitos se purificaron luego por la técnica de adherencia de plástico, normal. Luego, los monocitos se cultivaron en RPMI 1640 con FCS al 2 % (2.5 x 10s células/ml) con diferentes diluciones de rhIL-10 ó IT9302. Las células se estimularon durante 24 horas y se colectaron los sobrenadantes para la determinación de IRAP. Se llevó a cabo la ELISA de IRAP al usar el Equipo de Inmunoensayo Quantikin de IL-lra humana de R&D Systems Europe Ltd. (No. de Catalogo DRA 00, Abingdon, Oxon, UK) .

Determinación de la proliferación de células T Ensayo de proliferación. Se cultivaron PBMC (2 x 10 ) en 200 µl del RPMI con FCS al 10 % durante 72 horas con PHA 0.5 µl/ml y rhIL-10 (1, 10, 100 ng/ml) ó IT9302 (0.1, 1, 10 ng/ml) en triplicado. Las últimas 48 horas, se adicionó 3H-timidina con 0.5 µCi/pozo (Amersham, Dinamarca) . Las células se recolectaron en un filtro (Glass Microfibre Filters, Whatman, No. de Catálogo 1822 849) y se adicionó fluido de escintilación (Ultima, Gold MV, Packard) . El conteo de escintilación se hizo en un Tri-Carb modelo 1600 TR, Packard.

Determinación de 2a expresión del antigeno MHC clase II en monocitos La expresión de HLA-DR en monocitos humanos. Los monocitos se aislaron de sangre heparinizada, fresca por adherencia a plástico a 37°C en RPMI 1640 que contiene FCS al 10 %. Después de la incubación, se removió el sobrenadante, se adicionó solución de Hank (4°C con FCS al 1 %) y las células se desecharon al enfriar a -20°C durante 15 minutos y sacudiendo suavemente en la mesa. Se estimularon los monocitos (2 x 106 células/ml) en RPMI 1640 adicionado con FCS al 2 %, con IFN-? (10 ng/ml), ó rhIL-10 (100, 10, 1 ng/ml) adicionado antes de IFN-? ó IT9302 (10, 1, 0.1 ng/ml) adicionado antes de IFN-? durante 40 horas. Las células se desecharon de los pozos al enfriar como antes. Se usaron células no fijas, frescas para la tipificación superficial por el anticuerpo anti-humano para HLA-DR. Las se resuspendieron en solución de Hank con FACS al 1 %, 1 x 10s células/ml y anticuerpos anti-HLA DR, DP, DK de ratón, conjugados con FITC se adicionaron (F 0817, DAKI Dinamarca) durante 45 minutos. Las células se lavaron tres veces en solución Hank y se realizó un análisis FACS en un cítómetro de flujo coulter-Epics XL-MCL a un longitud de onda de 488 nm. Se determinaron las uniones no específicas con una anticuerpo conjugado de Fitch no pertinente (DAKO F 479 anti-cabra de ratón) . De manera alternativa, se fijaron células en DMSO al 10 %, RPMI 1640 al 40 % y FCS estéril al 50 %, y se almacenaron a -80°C y se usaron para la tipificación de ADN.

De erminación de la apóptosis en monocitos Tipificación de ADN de los monocitos estimulados. Las células fijas se incubaron en etanol al 70 % durante 60 minutos y se lavaron dos veces en solución de Hank. Se resuspendieron 1 x 106 células en 250 µl de RNasa 1 µg/ml en citrato de sodio al 1.12 %, pH 8.4 (ribonucleasa A, Farmacia No. 17-0442-01) y se incubaron a 37°C durante 3 minutos. Posteriormente, se adicionaron 250 µl de propiodiumiodida (50 µg/ml) en solución de Hank) , y las células se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos. Después de esto, las células se lavaron dos veces en solución de Hank (Jensen y colaboradores, (110)). Se midió el contenido de ADN por citometría de flujo en un coulter-Epics XL-MCL a un longitud de onda de 550 nm.

Resuitados Regulación de 2a proiiferacciióón de células T por IL-10 e IT9302 Se estimularon PBMC por PHA como se describe anteriormente y se adicionaron rhIL-10 e IT9302 durante 72 horas, y se midió la incorporación de 3H-timidina durante las últimas 18 horas . Tanto rhIL-10 como IT9302 regularon descendentemente la purificación celular en una concentración óptima de 100 ng/ml de rhIL-10 y 10 ng/ml de IT9302, como se ve en la Figura 11.

Expresión de HLA-DR en monocitos humanos Los monocitos se purificaron como se describe anteriormente y se estimularon durante 40 horas por IFN-? (10 ng/ml) y/o rhIL-10 y/o IT9302 adicionados 30 minutos antes de IFN-?. Se estudió la expresión del antígeno MHC II por incubación con. el anticuerpo anti-HLA DR, DP, DK humano de ratón, conjugado con FITC. La expresión del antígeno MHC II se reguló ascendentemente por IFN-? como se ve en la Figura 12, y 10 ng/ml de rhIL-10 y 1 ng/ml de IT9302 regularon descendentemente la expresión del antígeno MHC II de una manera similar.

Tipificación de ADN de los monocitos estimulados Los monocitos estimulados con IFN-? a partir de lo anterior se incubaron con yoduro de propidio y se midió el contenido de ADN por citometría de flujo. Se midió la fracción de células que expresan el ADN en la fase Gi ó G2 de la proliferación celular y también la fracción que expresa apóptosis. Como se ve en la Figura 12, los monocitos no estimulados que expresan 6.6 % de apóptosis, la estimulación de IFN-? reguló descendentemente la apóptosis a 4.1 %, mientras que la estimulación tanto de IL-10, IFN-? e IT9302 + IFN-? de las células indujo la fracción apoptósica a 10.3 % y 9.3 %, respectivamente.

Determinación de la producción de IL-4 por linfocitos T CD4+ Cultivos de células Se purificaron linfocitos T CD4+ a partir de la sangre humana normal, heparinizada. Después de la centrifugación en gradiente con LymphoprepMR (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) , las células mononucleares se separaron adicionalmente 4°C usando Dynabeads (Dynal AS, Noruega) revestidas con anticuerpos anti-CD4 monoclonales . Las cuentas se desecharon al adicionar anticuerpo-antiratón policlonal (Dinal, AS, Noruega) . La pureza de las células seleccionadas positivamente fue más alta de 99 % como se juzga por el análisis FACS. Cuando se examina que la producción de nuevo de IL-4 por células T estimuladas con IL-8 las células T fueron cultivos, 5 x 106 células/ml de un RPMI 1640 libre de LPS (Gibco No. de Catálogo 61870-010) que contiene suero de becerro fetal inactivado con calor, filtrado, estéril al 1 % (FCS) penicilina (10,000 IU/ l), estreptomicina (10 mg/ml) y gentamicina (2.5 mg/ml) . Se estimularon células T durante 3 días usando rIL-8 (100 ng/ml), rIL-10 (100 ng/ml), IT9302 (10 ng/ml) e IFN-? (10 ng/ml) . La IL-8 humana, recombinante (rh IL-8) fue una clase otorgada de Dainippon Pharmaceuticals, Co . Ltd., Osaka Japón), y la IFN-? se compró se Boehringer Ingelheim Am Rhein, Alemania. Para obtener la inhibición específica de la estimulación de IL-8, se usó un anticuerpo anti-IL-8 monoclonal de neutralización (WS.4) una clase otorgada del Dr . K. Matsushima, Japón) . El IL-10 recombinante se compró de Pepro Tech, ?nc. (Londres, Inglaterra).

Preparación dei material celular y el sobrenadante del cultivo para la electrof óresis en gel .

Se separaron las células T cultivadas y el medio e cultivo por centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos . Los sobrenadantes se secaron por congelación y se disolvieron en 100 µl del amortiguador de lisis. Las células se redispersaron directamente en 100 µl del amortiguador de lisis en gel (9) . El material se mantuvo a -80°c hasta el examen adicional.

Transferencia ECL-Western de las proteínas derivadas de las células T CD4+ .

Se usaron células o sobrenadantes de los cultivos celulares secados por congelación para la determinación del contenido de proteína de IL-4. Las proteínas de los geles SDS-PAGE al 15 %, unidimensionales se transfirieron por transferencia en membranas de nitrocelulosa Hybond-ECL (Amersham RPN 2020D, UK) y se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5 % (Sigma) en solución salina pH 7.8 de amortiguador Tris que contiene T een-20 al 0.1 %. Las transferencias luego se incubaron con un anticuerpo anti-IL-4 humano, de cabra policlonal (R&D Systems, UK) seguido por un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano (No. de Catálogo RPN 2106 ECL, Amersham, UK) , y se detectó el inmunomanchado al disponer una película (Kodak X-OMAT-S, USA) durante 90 segundos .

EJEMPLO 1 Inhibición de la producción espontánea de IL-8 por monocitos humanos La prueba se realizó como se describe en "Producción de IL-8 por células mononucleares periféricas, humanas, normales (PBMC)". Los monocitos se purificaron por la técnica de adherencia al plástico y se estimularon 3.0 x 10s células/ml durante 40 horas. Como se conoce en la Figura 1, el IT9302 inhibió la producción de IL-8 por monocitos, y a 0.1 ng/ml de IT9302, la producción de IL-8 se suprimió a 35 % de la producción espontánea in vitro. La viabilidad de las células siempre excedió el 80 % después de 1 día en cultivo y la adición de IT9302 no afectó, en este o en otros ejemplos, la viabilidad a ninguna concentración de IT9302 entre 0.1 y 1000 ng/ml (IT9302 PM: 1,127 dalton, rhIL-10 pronosticado PM: 18, 400 dalton) .

EJEMPLO 2 Inhibición de la producción de IL-8 inducida por IL-lß por células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC) La prueba se realizó como se describe en "Producción de IL-8 por células mononucleares humanas, normales de sangre periférica (PBMC)". Como se muestra en la Figura 2, el IT9302, en una manera dependiente de la dosis, inhibió la producción de IL-8 inducida por IL-lß por células mononucleares humanas de sangre periférica in vitro. La supresión de la producción de IL-8 estabilizada a concentraciones de IT9302 entre 0.01 y 100 ng/ml.

EJEMPLO 3 Producción de la proteína antagonista del receptor de interleucina-l (IRAP) por monocitos humanos La prueba se realizó como se describe en "Determinación de la concentración de IRAP". Como se muestra en la Figura 3, el IT9302 indujo dependientemente de la dosis la producción de IRAP por monocitos humanos . La producción se incrementó básicamente cuando se usaron concentraciones de IT9302 por arriba de 10 ng/ml. La Figura 4 muestra la inducción de IRAP por rhIL-10 y puesto que hIL-10 es aproximadamente 20 veces más grande que IT9302, 5 ng/ml de IT9302 igual a 100 ng/ml de IL-10 en molaridad. Por lo tanto, en las potencias de IT9302 y rhIL-10 son comparables y aproximadamente iguales con respecto a la inducción de IRAP a concentraciones inferiores. A concentraciones de IT9302 que exceden 10 ng/ml, la inducción de IRAP se incrementó y alcanzó un nivel máximo de 60 ng/ml. Además, se probó la especificidad de esta inducción por el anticuerpo que se dirige específicamente contra IT9302. En un experimento separado, donde los monocitos produjeron espontáneamente 3.5 ng/ml de IRAP y se indujeron por 1-10 ng/ml de IT9302 a una producción máxima de IRAP de 10.6 + 0.6 ng/ml, esta producción se podría bloquear por un anticuerpo policlonal para IT9302, 2 µg/ml adicionados 30 minutos antes de 10 ng/mg de IT9302, de modo que el nivel de IRAP se reguló descendentemente a 2.9 + 0.3 ng/ml. Estos resultados en contraste al resultado contenido con el anticuerpo y elegido contra IL-10, 19F1, que se adicionó de la misma manera (2 µg/ml 30 minutos antes de 10 ng/ml de IT9302) no bloquearon la producción de IRAP pero al contrario regularon ascendentemente esto a 22 ng/ml. Este resultado se puede explicar ya que este anticuerpo es capaz de neutralizar El IL-10 endógena pero no el IT9302. El IL-10 producida espontáneamente en el cultivo celular tiene un efecto autorregulador negativo en la producción de IRAP por IT9302.

EJEMPLO 4 El efecto quimiotáctico en los linfocitos T CD8+, humanos El experimento se llevó a cabo como se describe en "Ensayo de quimiotaxis de leucocitos". Como se muestra en la Figura 5, el IT9302 indujo la migración quimiotáctica de los linfocitos T humanos, CD8+ in vitro, mientras que no afectó en las células T CD4+ (datos no mostrados) . Nuevamente, la potencia en IT9302 mostrado en este experimento es comparable con aquella de rhIL-10 mostrada previamente (14).

EJEMPLO 5 Desensibílización de las células T CD8+ humanas que dan por resultado una insensibilidad hacia el rhIL-10 El experimento se llevó a cabo como se describe en "ensayo de quimiotaxis de leucocitos". Se adicionó el IT9302 a una suspensión de células T CD8+ 30 minutos antes de que estas células se probaran hacia su respuesta quimiotáctica a rhIL-10. Como se muestra en la Figura 6, la pre-incubación de las células con IT9302 da por resultado una sensibilidad suspendida de las células T CD8+ hacia hrIL-10. Esto indica que el IT9302 puede afectar la unión de rhIL-10 al receptor de IL-10.

EJEMPLO 6 Supresión de la respuesta quimiotáctica de los linfocitos T CD4+ hacia IL-8 El experimento se llevó a cabo como se describe en "ensayo de quimiotaxis de leucocitos". Como se muestra en la Figura 7, el IT9302, de una manera dependiente de la dosis y adicionado a una suspensión de linfocitos T CD4+, humanos, inhibió la respuesta de las células T CD4+ hacia IL-8.

EJEMPLO 7 Supresión de la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/CP1 El experimento se llevó a cabo como se describe en "quimiotaxis de monocitos". Como se muestra en la Figura 8, el IT9302, de una manera dependiente de la dosis de adicionar una suspensión de monocitos humanos, "inhibición la respuesta quimiotáctica de los monocitos hacia MCAF/MCPl .

EJEMPLO 8 Inhibición de la expresión de las moléculas MHC clase II de los monocitos humanos cuando se estimulan con IFN-? En un nuevo modelo experimental (citrometria de flujo), se ha mostrado que los monocitos estimulados con IFN-? regulan ascendentemente su expresión del antígeno MHC II, y esta inducción se puede bloquear por IL-10 e IT9302 de una manera similar. Al mismo tiempo, ambos péptidos regulan ascendentemente el número de células que muestran apóptosis en los monocitos (ver Figura 12). Estos experimentos indican que IL-10 e IT9302 pueden inhibir la proliferación de células T dependiente de los monocitos/macrófagos al disminuir el antígeno que presenta la capacidad de los monocitos vía la regulación descendente con la expresión de MHC clase II (ver 12) . Las PMBC estimuladas por PHA empezaron a proliferarse como se muestra por la incorporación de 3H-timidina, que también se puede regular descendentemente por IL-10 e IT9302. PHA estimula la proliferación de células T a través de la activación de los canales dependientes de Ca2+ . Se disminuyeron los flujos de Ca2+ en los clones de células T humanas cuando se preincubaron células con IL-10 (Taga, K. y colaboradores., 1992). El presente experimento muestra que la proliferación de células T se regula descendentemente por IT9302 también por el control de los canales dependientes de Ca2+.

Discusión relacionada a los experimentos .

Los presentes datos muestran un efecto inhibidor dependiente de la dosis del nonapéptido sintético, IT9302, en los procesos que reflejan la actividad pro-inflamatoria, incluyendo la producción de IL-8 y la migración de monocitos y/o células T. De esta manera, el IT9302 fue capaz de suprimir la producción espontánea de IL-8 por los monocitos humanos cultivados durante la noche. Esto se podría explicar por un efecto inhibidor directo en la producción de ARNm de IL-8 y/o la subsecuente producción proteica y/o la liberación. Otro mecanismo se podría explicar por el hecho que los monocitos cultivados in vitro expresarán y producirán IL-1, que luego a su vez induce la producción de IL-8. Esto se soporta por el hecho que se ha demostrado que el IT9302 induce potentemente la producción de IRAP de los monocitos. Por lo tanto, el IT9302 también inhibe la producción espontánea de IL-8 al interferir con la actividad de IL-1. La inducción de IRAP observada, por IT9302 parece inducir un IRAP biológicamente activo, puesto que el IT9302 adicionado a los cultivos contrarresta la producción de IL-8 inducida por IL-1, pero solo cuando se adiciona al menos 16 horas antes de adicionar IL-1 a los cultivos. Esto podría significar que el IT9302 inhibe la producción de IL-8 inducida por IL-1 al inducir la producción de IRAP, que luego a su vez bloquea la actividad de IL-1 a través de su receptor. Si el IT9302 inhibió directamente la producción de IL-8, se habría esperado que la adición de IT9302 a los cultivos 1 hora antes de adicionar IL-1 deba inhibir la producción de IL-8, que no fue el caso (datos no mostrados) . Por lo tanto, la inhibición observada de la producción de IL-8 de IT9302 va ser probablemente debida a una inducción de la producción de IRAP en lugar de una inhibición directa de la producción de IL-8. El IT9302 bloquea específicamente el receptor IL-1 por la inducción de IRAP, y de este modo la inducción de otras citocinas que se inducen por IL-1, similares a TNF-a, IL-8 y probablemente muchas otra citocinas y factores. La especificidad de la inducción se confirmó porque el anticuerpo para IT9302 podría bloquear la inducción de IRAP. Otro anticuerpo 19F1 de IL-10 no bloque la producción de IRAP inducida por IT9302. El IT9302 también imita la actividad de IL-10 al suprimir la capacidad de las células T CD4+ para migrar como una respuesta a IL-8. Puesto que el IL-8 se relaciona a muchos estados diferentes de inflamación y puesto que las células CD4+ parecen tempranamente en el infiltrado de la inflamación inmunitaria mediada por células T tal como alergia de la piel, esta característica puede probar tener un valor terapéutico significante para el control de la inflamación inmunitaria mediada por células T. La actividad quimiotáctica de células T CD8+, demostrada de IT9302 también es paralela a aquella de IL-10, e IT9302 puede activar de esta manera poblaciones de células T con actividad supresora que contribuye a la finalización de la inflamación inmunitaria mediada por células T. Por lo tanto, el IT9302 de acuerdo con los ejemplo que se demuestran anteriormente, posee valor terapéutico en enfermedades donde la IL-10 y/o IRAP también pueden tener valor terapéutico. Adicionalmente, el IT9302 puede tener valor terapéutico en enfermedades donde IL-8 y/o MCAF y/o IL-1 se cree que tienen papales patogenéticos . La presente invención describe análogos de IT9302, es decir, sustancias o péptidos que tienen al menos algunas de las propiedades descritas anteriormente.

EJEMPLO 9 Jnducsión de 2a producción de IL-4 en linfocitos T CD4+ A teceden tes Similar a IL-10, la IL-4 es un producto de células T CD4+ del tipo TH2. Se observo que la IL-10 humana, recombinante induce la producción de IL-10 por células T CD4+, humanas , cultivadas. Esto significa que la IL-10, además de sus propias funciones inmunosupresoras, también induce la producción de otra citocina inmunosupresora, IL-4. Por lo tanto, se probó si IT9302 también induce la producción de IL-4 por células T CD4+. De esta manera, las células T CD4+, purificadas como se describe en "Métodos para quimiotáxis de células T", y cultivadas como se describe en la sección "Determinación de la producción IL-4 por linfocitos T CD4+", se estimularon durante 3 días con IT9302 (10 ng/ml) o IL-10 (100 ng/ml) . Se colectaron las fracciones citosólicas y se analizaron para su contenido de IL-4 usando la transferencia Western (Figura 9) y un anticuerpo policlonal anti-IL-4 humana, de cabra. Como se demuestra en la Figura 9, se observó que 11-10 asi como IT9302 inducen la producción de IL-4 por las células T CD4+, humanas, normales, cultivadas .

EJEMPLO 10 Inhibición de la producción de TNF-a durante una reacción de leucocitos mezclados (MLR) .

Se ha demostrado que la reacción de leucocitos mezclados es parcialmente dependiente de la producción de TNF-a durante la reacción. Se ha mostrado que el IT9302 no reduce significantemente la MLR, pero se encontró que hay una reducción significante en la producción de TNF-a durante la MLR. De esta manera, se realizó la MLR al purificar los leucocitos humanos y luego cultivar un millón de células/ml de donadores alogenéicos durante 4 días. Antes de establecer los cultivos, se irradió un grupo de células durante 2 minutos usando irradiación beta. Se purificaron las fracciones proteicas citosólicas como se describe en la sección "Determinación de la producción de IL-4 por linfocitos T CD4+", y se realizo la transferencia Western usando anticuerpo anti-TNF-a humano de conejo. Como se demuestra en la Figura 10, se observó una reducción significante en la producción de TNF-a durante una reacción de leucocitos mezclados, humanos.

EJEMPLO 11 La modulación del choque inducido por LPS y leucopenia en cerdos .

Puesto que se encontró que el IT9302 modula la producción de citocinas, incluyendo TNF-a e IL_8, y se soportó por la secuencia publicada de la IL-10 porcina (88), se probó si el IT9302 era capaz de modular el curso de la leucopenia inducida por LPS en cerdos (Figura 13) . En un experimento preliminar, se probó como la inyección intravenosa de 0.1 mg/kg de IT9302 moduló el efecto de la inyección intravenosa de 2 µg/kg de LPS en cerdos (N= 3) . El IT9302 se inyectó 30 minutos antes de la inyección de LPS, y se extrajeron muestras sanguíneas como se describe en la Figura 13. La cuenta total de leucocitos así como la cuneta diferencial de células se determinaron, y se calculó el número total de leucocitos neutrofílicos en base a estos resultados. Como se demuestra, se observo que la inyección de LPS provocó leucopenia momentánea. Sin embargo la inyección de IT9302, previno la leucopenia como se demuestra en la Figura.

EJEMPLO 12 El efecto del IT9302 murino homólogo al 119302 humano en la liberación de TNF-a en plasma después de 2a administración de LPS en ratones .

Se ha demostrado en animales que la IL-10 murina, recombinante puede proteger a los ratones de la endotoxemia letal (89) y además, se ha demostrado que la IL-10 administrada en humanos tiene efectos inhibidores en las células T y suprime reproducción de citocinas proinflamatorias (90). La finalidad del estudio fue probar si el IT9302 puede suprimir la producción de TNF-a en ratones expuesto al choque inducido por endotoxina después de la administración de LPS (Figura 14 ) . Se usaron ratones BALB/C de ocho semanas de edad (obtenidos del centro para animales de investigación, Bomholtgaard, Bomholtvej 10, DK-8680 Ry, Dinamarca) . LPS de E. Coli fue de sigma (lote 3444114) y el IT9302 murino fue de Schafer-N, Lers0n Parkallé 42, DK-2100 Copenhagen 0, Dinamarca. Se inyectaron los ratones de manera intraperitoneal con 100 µg de LPS en 1 ml de NACÍ 0.9 M. 60 minutos antes de la inyección de LPS, a los ratones se les dio IT9302 murino equivalente a 0.1 µg, 1 µg y 10 µg de IL-10 humana. Se anestesiaron grupos de 5 animales (Imobilon, Pherovet, Malmo, Suecia) después de 1, 2, 3 horas, respectivamente, después de lo cual se retiro máximo sangre entera a través de una perforación cardiaca. La sangre se centrifugó en frío y los sueros se colectaron y almacenaron a -70° C para el análisis subsecuente del contenido de TNF_a por ELISA (TNF-a Mouse Immuno Assay Diagnostic kits, Genzyme, Cambrige, MA, USA) . Como se demuestra, se observó que 10 µg de IT9302 murino suprimió claramente el TNF-a en los sueros de ratón en comparación al grupo total no tratado con mIT9302 (ver Tabla 3) .

TABLA 3 m-TNF-a ng/ml + SEM en suero de ratones IT9302 murino equivalente a hIL-10 adicionado 60 minuto antes de LPS 0 0.1 µg 1 µg 10 µg 1 h 2.48±0.16 1.92±0.48 2. .64+0.38 1.84+0.16 2 hs 1.43+0.17 1.68+0.27 1. , 16±0.21 0.62±0.14 3 hs 0.48+0.04 0.05+0.02 0. ,18±0.05 0.0 4 hs 0.09+0.06 0.06±0.02 0. .20+0.04 0.05±0.01 EJEMPLO 13 La modulación de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar usando IT9302 murino Frecuentemente se usan roedores, ratones y conejos en los modelos d animales, y recientemente la Genzyme Diagnostics ha anunciado equipos de reactividad cruzada para productos de búsqueda de citocinas. Especialmente, fue posible medir el TNF-a e IFN-? de conejo por los equipos de inmunoensayo de ratón. Como se estuvo trabajando en un modelo de conejo, el estudio del papel patofisiológico de la IL-8 en la pancreatitis aguda experimental, se investigó el efecto del IT9302 murino en la leucopenia inducida (Figura 14) . La hipótesis fue que aún IL-10 podría ser idéntico en los ratones y conejos y podría tener efectos en la invasión de leucocitos inducida por IL-8 en el páncreas durante la pancreatitis aguda.

Modelo experimental Se pusieron en ayudo conejos blancos de la raza Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) que pesan 1.7.4.0 kg durante 18-24 horas. Los procesos operativo de acuerdo con Benerjee et al., 1994 (91) se siguieron, y se indujo la pancreatitis aguda en los conejos por ácido biliar al 5 % dado en el conducto pancreático. El IT9302 murino (100 µg/kg) se dio a través de una vena central 30 minutos antes del ácido biliar y subsecuentemente en una dosis de 100 µg/kg en conejos inmediatamente después. Se colectaron muestras de plasma de acuerdo con la Figura 14. Como se demuestra, se observó que la inyección de IT9302 murino en conejos antes de la pancreatitis inducida previno la leucopenia como se demuestra en la Figura.

EJEMPLO 14 La modulación de 2a pancreatitis aguda en conejos inducida por ácido biliar usando IT9302 Se usó el mismo modelo experimental como en el Ejemplo 13 con la excepción que el IT9302 murino se cambio por IT9302 humano. Se indujo la pancreatitis aguda por la inyección intraductal de 2.0 ml de ácido biliar de quimiodesoxicolina al 5 % (10 animales) . Se trató otro grupo de animales con IT9302 humano (8 animales), la primera dosis (100 µg/kg) que se inyectó subcutáneamente y la segunda dosis (100 µg/ml) de manera intravenosa, media hora antes de la inducción de la pancreatitis aguda. Se colectaron muestras de suero para las mediciones de citocina con intervalos de tiempo de 0, 1, 3, 6, y 12 horas después de la inducción de la pancreatitis aguda.

Métodos para la medición de TNF-a e IL-8 en el suero de conejo .

EL equipo de ELISA de TNF-a de ratón Genzyme número de código 80-3807-00 se uso en una versión modificada de las mediciones de TNF-a en el suero de conejos. Este equipo está constituido por el anticuerpo anti-TNF-a, de gamster monoclonal, de fase sólida que captura el TNF-a presente en el suero, y un anticuerpo anti-TNF-a de ratón, de cabra policlonal, conjugado con peroxidasa, substrato y TMB cromagen. El tiempo de incubación para el suero y el TNF-a normal se extendió durante 4 horas y el tiempo de desarrollo para la incubación de substrato fue de 30 minutos . Las mediciones de IL-8 de conejo en el suero de conejo se llevaron "a cabo por un equipo ELISA de IL-8 especial, una concesión del profesor Kouj i Matsushima, Tokio, Japón. De manera breve, la IL-8 anti-conejo de cobayo, anti-IL-8, monoclonal, y los anticuerpos de inmunoglubulina G anti-cobayo de conejo conjugados con fosfatasa alcalina se emplearon como captura, los anticuerpos segundos y detección, respectivamente. Para métodos, ver Ikeda y colaboradores. (106).

Resultado TABLA 4 Pancreatitis aguda en conejo, por ácido biliar al 5 %, contenido de TNF-a en suero (pg/ml ± SEM) 0 1 3 6 9 12 1210±396 1206+239 1918+374 1662+357 1884±698 915±431 Pancreatitis aguda, tratada con IT9302 humano, 30 minut antes del ácido biliar al 5 %, contenido de TNF-a suero (pg/ml ± SEM) 0 1 3 6 9 12 347±77 739±339 697+146 658±156 872±594 493±203 TABLA 5 Pancreatitis aguda, por ácido biliar al 5 %, contenido de IL-8 en suero (pg/ml ± SEM) 0 1 3 6 9 12 1154±351 780±153 2210±459 2690±468 2196+1058 1833±11 Pancreatitis aguda, tratada con IT9302 humano, 30 minut antes del ácido biliar al 5 %, contenido de IL-8 en sue (pg/ml + SEM) 0 1 3 6 9 12 875±181 695±205 900±178 1037±244 1207±210 1087±21 COMPENDIO SE logró la inducción máxima de TNF-a a las 3 horas, y la IL-8 máxima a 6 horas. Los niveles tanto de TNF-a como de IL-8 en la circulación sanguínea e regularon descendentemente de manera marcada de 4 a 12 horas. Los niveles de las enzimas pancreáticas en la sangre también se midieron (amilasa, lipasa y triptasa) y mostraron todos picos después de 3-6 horas después de la inducción de la pancreatitis aguda, pero ninguna de estas enzimas pareció ser afectada por el tratamiento con IT9302. Los cambios pancreáticos histológicamente similares se observaron en los dos grupos mientras que hubo una reducción significante en la infiltración de neutrófilos intertisciales en los pulmones .

Conclusión El regula descendentemente la producción de TNF-a e IL-8 en un modelo de pancreatitis aguda inducida por ácido biliar, y bloquea la infiltración de neutrófilos en pulmones de estos conejos tratados, previniendo de este modo el desarrollo del síndrome similar a ARDS en estos animales, dando por resultado una reducción de la mortalidad de 60 % a 0 % después de 6 horas . La interieucina 1 s5J3 consideró como un inductor importante de la pancreatitis aguda (ver referencia 107) y soportando de este modo la hipótesis que el IT9302 puede bloquear todos los efectos inducibles por IL-1. La razón por la cual el IT9302 humano se puede usar en un modelo de conejo se podría explicar por la observación hecha por Dan Gaur y colaboradores y publicada este año en Nature (108) donde mostró que las proteínas de conejo (Lagomorfa) están filogenéticamente más cercanas a las proteínas de primates (humano) que a otra proteínas de roedores ( ratón, rata, ... ) .

EJEMPLO 15 IT9302 como un tratamiento de cáncer y en la prevención de la metástasis .

Se demostró recientemente (111) que la administración sistémica de IL-10 celular induce una inmunorrespuesta efectiva, específica y de larga vida contra tumores establecidos en ratones in vivo. Se sugirió que este efecto se explique parcialmente por los efectos renovados de IL-10 en diversos tipos de células, incluyendo la co-estimulación de la proliferación de células T, la quimioatracción de células T CD8+, y la estimulación de la actividad de células asesinas activadas con linfocina. También se observó que la IL-10 humana puede invertir el efecto inmunosupresor local de la IL-10 viral. Otro grupo de investigación confirmó el papel terapéutico potencial de la administración de IL-10 en el cáncer (112) debido a que observaron que la IL-10 inhibe la metástasis a través de un mecanismo dependiente de las células asesinas naturales en un experimento in vivo con ratones que tienen diferentes tumores, incluyendo melanoma maligno de metástasis. Kundu y colaboradores (1996) (113) reportaron que la IL-10 ejerce efectos anti-metastáticos y antitumor en un modelo murino de cáncer de pecho humano. Estas observaciones indicaron un papel potencial para IL-10 y para la administración de IT9302 en la terapia biológica del cáncer.

EJEMPLO 16 IT9302 como un adyuvante inmunitario en el tratamiento de infecciones vírales .

Se conoce que la IL-10 posee ciertas capacidades antivirales. De esta manera, Kollmann y colaboradores (1996) (114) encontró que -la IL-10 inhibe la infección aguda del VIH in vivo de ratones SCID con timus fetal humano e hígado. Se observó que dos de los solicitantes/investigadores, cuando aplicaron IT9302 en una formulación en crema (dosis total de 400 a 500 µg) bajo la oclusión de envoltura de plástico en la piel de la espalda durante 24 horas, desarrollo un incremento en su número total de células T CD8+ (60 % y 90 %, respectivamente) y un incremento en la concentración de IRAP en suero de 1 ng/ml a ng/mml. En siete voluntarios no tratados, la concentración de IRAP nunca excedió 1.1 ng/ml. Como una observación accidental e inesperada, ambos investigadores observaron que las verrugas comunes (debidas a la infección cutánea de HPV) mostraron claros signos de inflamación con rojez y comezón alrededor de las verrugas 3 a 4 días después de la aplicación y una crema que contiene IT9302. La reacción inflamatoria ocurrió de manera sincronizada en varios dedos para una de las personas de prueba, mientras que la otra persona solo tuvo una verruga en un dedo. En ambos casos, las verrugas disminuyeron rápidamente de manera gradual en su tamaño durante los siguientes 4 a 7 días de modo que no hubo signos clínicos de infección restante de las verrugas después de 10 a 11 días. En un control siguiente 2 meses más tarde, no hubo signos de recurrencia de la infección. Por lo tanto, se encontró que el IT9302, posiblemente a través de una activación sistémica de las células NK y/o la actividad de las células T CD8+ citotóxicas, es capaz de provocar una inmunorrespuesta latente contra la infección cutánea de HPV, dando por resultado eventualmente la remisión clínica de la infección del virus. De esta manera, el IT9302 es una alternativa terapéutica posible para el tratamiento de las infecciones por virus tal como infecciones por HIV y HPV.

EJEMPLO 17 I 9302 como un adyuvante ínmunitario en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias de las articulaciones (artritis) .

La terapia anti-IL-1 así como la terapia TNF-a parecen tener potencial clínico significante en el tratamiento de la artritis (Maini, 1996) (115) . Como se describe en otras partes de este documento, se encontró que el IT9302 es un inhibidor de la producción de TNF-a así como un estimulador de IRAP (proteína antagonista del receptor de IL-1) de las células mononucleares humanas. De esta manera, el IT9302 es una modalidad de tratamiento potencial de artritis. Esto se soportó por una observación de unos de los solicitantes de esta invención quien, después de aplicar IT9302 (aproximadamente 500 µg) en una base de crema en la piel durante 24 horas, observó una fuerte reducción en los dolores crónicos de las articulaciones debido a al artritis. Esta observación se hizo tres veces y en cada caso los síntomas se redujeron gradualmente durante la siguiente semana después de la remoción de la aplicación de IT9302. De esta manera, se encontró soporte in vivo de los argumentos para usar IT9302 en el tratamiento de las reacciones inflamatorias agudas o crónicas tal como artritis u otra enfermedades autoinmunitarias .

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LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) DESTINATARIO: Steeno Research Group A/S (B) CALLE: Dunbirkevej 6 (C) CIUDAD: Odense SV (E) PAÍS: Dinamarca (F) CÓDIGO POSTAL: 5250 ;ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Inmunomoduladores ¡iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 23 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 1: Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Asn 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 2 Ala Tyr Met Thr lie Lys Met Arg Asn 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 3; Ala Phe Met Thr Leu Lys Leu Arg Asn 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 4 Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Glu 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 5 Gly Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 'iii) HIPOTÉTICO: NO [xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 6: Ala Phe Met Tyr Met Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 7 Ala Tyr lie Thr Met Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 8: Ala Tyr Leu Thr Met Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido ;iii) HIPOTÉTICO: NO [xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 9: Ala Tyr Val Thr Met Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 10 Ala Tyr Met Thr lie Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 11: Ala Tyr Met Thr Leu Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: ;i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO ;xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 12 Ala Tyr Met Thr Val Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 13 Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: ;í) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 14 Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 15 Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp 1 5 ;2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal iii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO [xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No : 16: Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Gln 1 5 ;2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal ;ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 17 Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Glu 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal ;ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido ;iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: lí Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 19: Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 20: Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal ;ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 21: Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 22 Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN PARA LA SEQ. ID No: 23: GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. El uso de una sustancia o polipéptido de acuerdo con la fórmula: Xi-Xs-Xs-Thr-Xí-Lys-Xs-Arg-Xs (SEQ ID NO: 22), en donde X2 es Tyr o Phe, X3, X4 y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y Xs se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, opcionalmente al menos uno de Xi, X2, X3, X4, X5 y Xs esta independientemente sustituido con un amino ácido no natural o inusual y/o el péptido esta ciclizado y/o el péptido esta estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-terminal esta acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal esta amidado, y los peptidomiméticos se modelan en base a la fórmula anterior para la preparación de una composición farmacéutica para la reducción de la producción de TNFa.

2. El uso de una sustancia o polipéptido según la fórmula Xi-Xa-Xs-Thr-Xí-Lys-Xs-Arg-Xs (SEQ ID NO: 22), en donde Xi es Ala o Gly, X2 es Tyr o Phe, X3, X4 y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y X6 se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu opcionalmente al menos uno de Xi, X2, X3, X4, X5 y X6 esta independientemente sustituido con un amino ácido no natural o inusual y/o el péptido esta ciclizado y/o el péptido esta estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-ter inal esta acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal esta amidado, y los peptidomiméticos están modelados en base a la fórmula anterior para la preparación de una composición farmacéutica para profilaxis o tratamiento de la pancreatitis.

3. El uso de una sustancia o polipéptido según la fórmula X?-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID NO: 22), en donde X2 es Tyr o Phe, X3, X y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y Xs se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, opcionalmente al menos uno de Xi, X2, X3, X, Xs y Xß esta independientemente sustituido con un amino ácido no natural o inusual y/o el péptido esta ciclizado y/o el péptido esta estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-terminal esta acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal esta amidado, y los peptidomiméticos modelados en base a la fórmula anterior para la preparación de una composición farmacéutica para profilaxis del tratamiento de infecciones vírales tal como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o infección por HPV cutánea.

4. Una sustancia o polipéptido que tiene la fórmula X?-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID NO: 22), caracterizada porque Xi es Ala o Gly, X2 es Tyr o Phe, X3 X4 y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y Xs se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu en donde al menos uno de Xi, X2, X3, X , X5 y X6 esta independientemente sustituido con un aminoácido no natural o inusual, esta sustancia o polipéptido que tiene al menos una de las siguientes propiedades. a) induce la inhibición de la producción espontanea de IL-8 por monocitos humanos, b) induce la inhibición de la producción de IL-8 inducida por IL-lß por las células mononucleares, de sangre periférica, humanas (PBMC) , c) induce la producción de la proteína antagonística del receptor de interleucina-l (IRAP) por los monocitos humanos, d) induce la migración quimiotáctica de los linfocitos T humanos CD-8+ in vitro, e) desensibiliza las células T CD8+ humanas dando por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, f) suprime la respuesta quimiotáctica de los linfocitos humanos T CD4+ hacia IL-8, g) suprime la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/MCP-1, h) inhibe la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados por IFN-?, i) induce la producción IL-4 por células T CD4+ humanas, normales, cultivadas, j ) reduce la producción de TNFa en la reacción de los leucocitos mezclados, humanos, k) regula descendentemente la producción de TNFa e IL-8 en el modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y reduce la infiltración de neutrófilos en los pulmones de los conejos tratados,

5. Una sustancia o polipéptido que tiene la fórmula X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID NO: 21), caracterizada porque X2 es Tyr o Phe, X3, X y = se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y Xs se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu en donde al menos uno de Xi, X2, X3, X4, X5 y X6 esta independientemente sustituido con un aminoácido no natural o inusual, la sustancia o polipéptido que tiene al menos una de las siguientes propiedades a) induce la inhibición de la producción espontanea de IL-8 por monocitos humanos, b) induce la inhibición de la producción de IL-8 inducida por IL-lß por las células mononucleares, de sangre periférica, humanas (PMBC) , p 3 c) induce la pr antagonistica del receptor de interleucina-l (IRAP) por los monocitos humanos, d) induce la migración quimiotáctica de los linfocitos T humanos CD-8+ in vitro, e) desensibiliza las células T CD8+ humanas dando por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, f) suprime la respuesta quimiotáctica de los linfocitos humanos T CD4+ hacia IL-8, g) suprime la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/MCP-1, h) inhibe la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados por IFN-?, i) induce la producción IL-4 por células T CD4+ humanas, normales, cultivadas, j ) reduce la producción de TNFa en la reacción de los leucocitos mezclados, humanos, k) regula descendentemente la producción de TNFa e IL-8 en el modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y reduce la infiltración de neutrófilos en los pulmones de los conejos tratados.

6. Una sustancia o polipéptido que tiene la fórmula X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID NO: 20), caracterizada porque X3, X4 y X5 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y X6 se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, en donde al menos uno de X3, X4, X5 y Xe esta independientemente sustituido con un aminoácido no natural o inusual, esta sustancia o polipéptido que tiene al menos una de las siguientes propiedades a) induce la inhibición de la producción espontanea de IL-8 por monocitos humanos, b) induce la inhibición de la producción de IL-8 inducida por IL-lß por las células mononucleares, de sangre periférica, humanas (PMBC), c) induce la producción de la proteúna antagonilstica del receptor de interleucina-l (IRAP) por los monocitos humanos, d) induce la migración quimiotáctica de los linfocitos T humanos CD-8+ in vitro, e) desensibiliza las células T CD8+ humanas dando por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, f) suprime la respuesta quimiotáctica de los linfocitos humanos T CD4+ hacia IL-8, g) suprime la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/MCP-1, h) inhibe la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados por IFN-?, i) induce la producción IL-4 por células T CD4+ humanas, normales, cultivadas, j ) reduce la producción de TNFa en la reacción de los leucocitos mezclados, humanos, k) regula descendentemente la producción de TNFa e IL-8 en el modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y reduce la infiltración de neutrófilos en los pulmones de los conejos tratados.

7. Una sustancia o polipéptido que tiene la fórmula Thr-X4-Lys-X5-Arg-Xs (SEQ ID NO: 19), caracterizada porque X4 y Xs se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y Xs se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, en donde al menos uno de X3, X4/ Xs y Xe esta independientemente sustituido con un aminoácido no natural o inusual, esta sustancia o polipéptido que tiene al menos una de las siguientes propiedades a) induce la inhibición de la producción espontanea de IL-8 por monocitos humanos, b) induce la inhibición de la producción de IL-8 inducida por IL-lß por las células mononucleares, de sangre periférica, humanas (PMBC), c) induce la producción de la proteúna antagonústica del receptor de interleucina-l (IRAP) por los monocitos humanos, d) induce la migración quimiotáctica de los linfocitos T humanos CD-8+ in vitro, e) desensibiliza las células T CD8+ humanas dando por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, f) suprime la respuesta quimiotáctica de los linfocitos humanos T CD4+ hacia IL-8, g) suprime la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/MCP-1, h) inhibe la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados por IFN-?, i) induce la producción IL-4 por células T CD4+ humanas, normales, cultivadas, j ) reduce la producción de TNFa en la reacción de los leucocitos mezclados, humanos, k) regula descendentemente la producción de TNFa e IL-8 en el modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y reduce la infiltración de neutrófilos en los pulmones de los conejos tratados.

8. Una sustancia o péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, caracterizada porque esta ciclizada.

9. Una sustancia o péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, caracterizada porque esta estabilizada.

10. Una sustancia o péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, caracterizada porque el residuo de aminoácido amino-terminal esta acilado .

11. Una sustancia o péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, caracterizada porque el residuo de aminoácido carboxi-terminal esta amidado .

12. Un polipéptido modelado en base a la fórmula X?-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-Xs (SEQ ID NO: 22), caracerizado porque: Xi es Ala o Gly, X2 es Tyr o Phe, X3, X y X5 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y Xs se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu los peptidomiméticos que tienen al menos una de las siguientes propiedades a) induce la inhibición de la producción espontanea de IL-8 por monocitos humanos, b) induce la inhibición de la producción de IL-8 inducida por IL-lß por las células mononucleares, de sangre periférica, humanas (PMBC), c) induce la producción de la proteúna antagonústica del receptor de interleucina-l (IRAP) por los monocitos humanos, d) induce la migración quimiotáctica de los linfocitos T humanos CD-8+ in vitro, e) desensibiliza las células T CD8+ humanas dando por resultado una insensibilidad hacia rhIL-10, f) suprime la respuesta quimiotáctica de los linfocitos humanos T CD4+ hacia IL-8, g) suprime la respuesta quimiotáctica de los monocitos humanos hacia MCAF/MCP-1, h) inhibe la expresión de las moléculas MHC clase II en los monocitos humanos estimulados por IFN-?, i) induce la producción IL-4 por células T CD4+ humanas, normales, cultivadas, j ) reduce la producción de TNFa en la reacción de los leucocitos mezclados, humanos, k) regula descendentemente la producción de TNFa e IL-8 en el modelo de conejo de la pancreatitis aguda inducida por ácido biliar y reduce la infiltración de neutrófilos en los pulmones de los conejos tratados.

13. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una sustancia o polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-12.

14. El uso de una sustancia o polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-12 para el tratamiento o profilaxis de una o más de las enfermedades mencionadas en las Tablas 1 y 2.

15. El uso de una sustancia o polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4-12 para la fabricación de una composición farmacéutica con el tratamiento o profilaxis de una o más de las enfermedades mencionadas en las Tablas 1 y 2.

16. Un método para tratar y/o prevenir una o más de las enfermedades mencionadas en las Tablas 1 y 2, el método esta caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva en una sustancia o polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-12.

17. La súntesis de una sustancia o péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-12, caracterizada porque es por el uso de la súntesis de péptidos de fase sólida (SPPS), el proceso que comprende los siguientes pasos: a) acoplar covalentemente el aminoácido C- terminal en la forma de un derivado reactivo, opcionalmente protegido en la cadena lateral, N-alfa- protegido, ya sea directamente o por medio de un enlazador ^adecuado a un soporte sólido, b) remover el grupo N-alfa-protector, c) adicionar los aminoácidos protegidos, subsiguientes de acuerdo con la secuencia deseada de una manera gradual, d) remover los grupos protectores de la cadena lateral, si los hay, e) en el montaje de la cadena completa de péptidos, escindir el péptido de la resina, y opcionalmente f) ciclizar y/o estabilizar el péptido y/o acilar el residuo de aminoácido amino-terminal y/o amidar el residuo de aminoácido carboxi-terminal . RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al uso de una sustancia o polipéptido de acuerdo con la fórmula X?-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID NO: 22), en donde Xi es Ala o Gly, X2 es Tyr o Phe, X3/ X4 y X5 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de Met, lie, Leu y Val; y X6 se selecciona a partir del grupo que consiste de Asn, Asp, Gln y Glu, opcionalmente al menos uno de Xi, X2, X3, X4^ Xs y ß esta independiente sustituido con un aminoácido no natural o inusual y/o el péptido esta ciclizado y/o el péptido esta estabilizado y/o el residuo de aminoácido amino-terminal esta acilado y/o el residuo de aminoácido carboxi-terminal esta amidado y los peptidomiméticos modelados en base a la fórmula anterior para la preparación de una composición farmacéutica para la reducción de la producción de TNF-a y/o para la profilaxis o tratamiento de la pancreatitis y/o para la profilaxis o tratamiento de infecciones virales tal como el súndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o infección cutánea por HPV. En particular, la invención se refiere análogos de péptidos de la fórmula anterior, en donde al menos uno de Xi, X2, X3, X4, X5 y Xs esta independientemente sustituido con un aminoácido no natural o inusual y/o el péptido esta ciclizado y/o el péptido esta es;ttabilizado y/o un residuo de aminoácido amino- iiduo de aminoácido terminal esta acilado y/o el res: .,, „„ v los peptidomiméticos carboxi-terminal esta amxdado, y modelados en base a la fórmula anterior.