MXPA98004040A - Una particula resistente al almacenamiento, en particular un portador para reacciones unidas a portador y los procesos para la produccion del mismo - Google Patents

Abstract

Se describe una partícula resistente al almacenamiento de al menos un primero y al menos un segundo componente, en donde - el segundo componente de al menos un polímero reticulable como una cubierta o capa protectora, envuelve y/o encierra al menos parcialmente al primer componente como un núcleo y - el primer componente tiene al menos una propiedad valorable, obtenible - mediante reacción del primer componente con el polímero reticulable, y subsecuentemente la reacción del producto formado con un agente de reticulación, tal que el primer componente con resistencia al almacenamiento permanece dentro del segundo componente.

Description

UNA PARTÍCULA RESISTENTE AL ALMACENAMIENTO, EN PARTICULAR UN PORTADOR PARA REACCIONES UNIDAS A PORTADOR Y LOS PROCESOS PARA LA PRODUCCIÓN DEL MISMO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de. la presente invención es una partícula resistente al almacenamiento, especialmente un portador jparticulado para reacciones unidas a portadores, a los procesos de detección y/o de aislamiento, un proceso para la producción de esta partícula resistente al almacenamiento, y los usos de ía partícula de acuerdo a la invención.

Los portadores particulados que consistan de un núcleo sólido y un polímero son conocidos - como tales, han sido ya utilizados para muchos propósitos. En particular, tales partículas han sido utilizadas para marcadores de inmunoensayo, para enlazarse a un núcleo sólido por medio de polímeros, • por ejemplo, biopolimeros , a un componente de afinidad.' Como material particulado, especialmente han sido utilizados los soles de partículas metálicas, por ejemplo, partículas de REF: 27550 hierro magnéticas o partículas de oro coloridas, partículas no metálicas, por ejemplo, selenio, polvo de carbón mineral, Si02 o partículas de cerámica, corpúsculos o incluso partículas de látex de otro polímero con diferentes propiedades (enla?e ) .

De este modo, la Patente Norteamericana US 4,230,685 describe un mejoramiento del enlace de los aglutinantes específicos a las partículas magnésicas, con lo cual una partícula es recubierta con un polímero de acrilato o un polisacárido, con lo cual la proteina A es unida a este recubrimiento mediante glutaraldehído .

La Patente Norteamericana US 4,452,773 describe la producción de micropartículas de hierro magnético-dextrano. Estas partículas tienen un tamaño de 100 a 700 Á, en particular de 300 a 400 Á. Un número mayor de las partículas son coloidales y ferromagnéticas , con una cubierta o capa protectora de dextrano. Las partículas obtenidas son funcionalizadas mediante oxidación con peryodato.

La Patente Europea EP-B-452,342 se refiere a las partículas super-magnéticas recubiertas con polisacáridos que tienen tamaño coloidal. Las partículas pueden ser unidas a los grupos adicionales. Mediante la selección de la mezcla de partículas en suJ fracciones de tamaño que tienen magnetizaciones uniformes, se han obtenido composiciones que tienen propiedades homogéneas con respecto al retardo de las mismas dentro de un campo magnético. Es también mencionada la posibilidad para separarse con respecto al tamaño . Son preferidos los recubrimientos provenientes de polisacáridos o proteínas. Los polisacárídos son fLimcionalizados por oxidación con peryodato. Además, la funcionalización con bromocianógeno es posible. El enlace de la cubierta o capa protectora de proteína a moléculas particulares puede ser efectuada mediante grupos amino de cadena lateral o grupos sulfhidrilo.

La Patente Alemana DE-A-40 37 724 se refiere a los dispositivos para inmunoensayos en los cuales se utilizan marcadores directos o indirectos. Los marcadores directos son preferidos, ya que éstos no requieren pasos adicionales para visualizar los resultados de prueba. Los ejemplos para marcadores directos son soles metálicos, soles colorantes, partículas de látex, indicadores de color, colorantes localizados en liposomas, y soles no metálicos tales como un sol de carbono. Otro aspecto más de la Patente Alemana DE-A-40 37 724 se refiere a un marcador inmunoquímicamente activo. Posteriormente, una partícula de polvo de carbón mineral es unida adsort ivamente a un ligando o a un conjugado de ligando. La sensibilidad de la prueba, por ejemplo, la gonadotropina coriónica humana hCG es denotada como 25 mUI/ml (Ul = unidad internacional) .

La Patente Europea EP-A-0, 410, 893 describe un proceso para la determinación y el reconocimiento de un anticuerpo dentro de los fluidos biológicos, dirigido contra un antígeno específico. Las partículas portadoras insolubles listadas comprenden células, partículas de gelatina, microcápsulas, polímeros orgánicos, partículas finas inorgánicas, o partículas coloidales de metal o compuestos metálicos que están finamente dispersos con albúmina sérica bovina o colesterol.

También la Patente Europea EP-A-0, 032 , 270 describe una determinación cuantitativa y/o cualitativa de un componente inmunológico utilizando uno o varios compuestos marcados que son obtenidos mediante un acoplamiento directo o indirecto de tal componente o componentes a partículas provenientes de una dispersión acuosa de un colorante hidrofóbico o pigmento o núcleos poliméricos que son recubiertos con tales colorantes o pigmentos.

La Patente Europea EP-0,321,008 se refiere a un proceso para la determinación de uno o varios componentes de una reacción entre una proteína de enlace específico y la correspondiente sustancia enlazable, dentro de una muestra, la actividad mutua de tales componentes y de al menos un componente marcado que es obtenido, mediante acoplamiento o adsorción de las partículas de sol de la marcación directa o indirectamente al componente. Las partículas de sol preferidas son fósforo, carbono y/o silicio. La aglutinación y la agregación pueden ser prevenidas mediante la cobertura de las partículas con macromoléculas que contienen grupos polares tales como proteínas, poli (etilenglicol ) , carbohidratos poliméricos, poli ( alcoholes vinílicos), y similares. Las proteínas protectoras adecuadas son antígenos, anticuerpos, y anti-anticuerpos . Los materiales inmunoqui ícamente inertes tales como por ejemplo albúmina, poli ( etilenglicol ) , u otras macromoléculas polares pueden ser utilizadas también. La sensibilidad de la prueba, por ejemplo, con respecto a la inmunoglobulina G de conejo, es especificada como 1.5 ng absoluto.

La Patente Europea EP-0,298,368 se refiere a un proceso para llevar a cabo un inmunoensayo diagnóstico mediante el uso de partículas que contienen hierro metálico coloidal, que tienen un conjugado acoplado a éstas, que es capaz de reconocer específicamente el analito que se va a determinar. La sensibilidad de la prueba para hCG está en el intervalo de mUI/ml.

La Patente Europea EP-A-0 , 280 , 560 describe los anticuerpos contra el antígeno A de Streptococcus que están unidos covalentemente a las partículas poliméricas del núcleo/cobertura, siendo formada la cobertura a partir de poli (mp-clorometilest ireno ) y el núcleo a partir de poli (metacrilato de estiren-co-2-acetoacetoxidetilo) que contienen Oil Red EGN dentro del núcleo, para obtener un reactivo de aglutinació .

La Patente Norteamericana US 4,452,886 describe la polimerización de la lisina con glutaraldehído y rojo Congo a partículas coloridas. La sensibilidad de la prueba para hCG está en el intervalo de 1000 Ul/ l .

.P. Collins describe en su libro "Alternative Inmunoassays", John Wiley & Sons, Chichester, New York, etc., en el capítulo "Disperse Dye Immunoassay (DÍA)" en la página 48 - 49 las ventajas de los marcadores particulados y señala la significancia de los parámetros esenciales tales como el tamaño de partícula, la distribución de la forma,, las solubilidad en solventes orgánicos, la estabilidad del coloide, y la capacidad de enlace, ppr ejemplo, para anticuerpos. Las sensibilidades de las pruebas mencionadas por él están en el intervalo de mUI/ml. Los conjugados son estables por al menos 15 meses si éstos son almacenados en el estado liofilizado a -20°C o 4°C; los conjugados acuosos deben de ser consumidos dentro de 6 días después de la preparación.

La Patente Japonesa Jp-A-0686771 se refiere a los pigmentos orgánicos encapsulados y a la producción de los mismos .

Los núcleos inertes descritos en la técnica han sufrido de inconvenientes obvios. • En el caso en que los núcleos son polimerizados en éstos, la propiedad deseada del núcleo es deteriorada demasiado. En el caso de que el polímero es absorbido sobre el núcleo con un enlace covalente subsecuente u otro tipo de enlace del componente de afinidad, el 'enlace del núcleo en la 'mayoría de los casos es demasiado débil, de modo que la estabilidad no es asegurada a un plazo mayor. Además, mediante el empleo de los métodos de acuerdo a la técnica únicamente es logrado el enlace de uno o una pequeña cantidad de reactivo y los componentes de afinidad.

El objetivo de la invención consiste en proporcionar partículas estables con propiedades utilizables características, especialmente propiedades de marcación, que permiten, si es necesario, que numerosos componentes reactivos al mismo tiempo sean también establemente unidos sobre éstos. La estabilidad debe comprender también en particular un almacenamiento a términos más prolongados .

La presente invención proporciona una partícula resistente al almacenamiento, especialmente un portador particulado de acuerdo a las características de la reivindicación 1. Las reivindicaciones dependientes 2 - 18 se refieren a las modalidades preferidas de acuerdo a la partícula de la invención. La reivindicación 19 junto con las reivindicaciones 20 - 22 dependientes, apropiadas, se refieren a un proceso para la producción de la partícula de acuerdo a la invención, resistente al almacenamiento. Las reivindicaciones 23 - 31 se refieren a los usos de la partícula de acuerdo a la invención.

La partícula de acuerdo a la invención, resistente al almacenamiento está especialmente destinada a reacciones unidas a un portador, para procesos de detección y/o de aislamiento. Esta consiste de al menos un primero y segundo componentes, siendo adecuada la partícula para ser proporcionada con un componente reactivo, especialmente, un componente reactivo específico. El segundo componente consiste de un polímero reticulable y forma más o menos una envoltura o capa de protección y/o encierra el primer componente como el núcleo, al menos parcialmente.

El primer componente tiene al menos una propiedad evaluable. Sobre el segundo componente se pueden acomodar componentes reactivos adicionales. La partícula resistente al almacenamiento está caracterizada por su proceso de fabricación y es disponible mediante la reacción del primer componente con el polímero reticulable, después de lo cual se tiace reaccionar el producto formado con un agente de reticulación tal que el primer componente es acumulado dentro del segundo componente resistente al almacenamiento.

Preferentemente, las condiciones de reacción son ajustadas tal que el primer componente es envuelto y/o encerrado por el segundo componente de una manera reticular.

El segundo componente se forma el portador de acuerdo a la invención es preferentemente un polímero que tiene grupos funcionales activos o activables, que son capaces de reaccionar en un aspecto con el agente de reticulación o incluso con los componentes reactivos o con ambos. El polímero que forma el segundo componente del portador de acuerdo a la invención, puede también ser producido a partir de diversos polímeros reticulables y/o monómeros reticulables. Posteriormente, el polímero puede ser producido a partir de proteínas y/o poliamidas con grupos funcionales. En principio, también son posibles otros polímeros tales como biopolímeros o más bien monómeros, siempre y cuando pueda ser lograble la reticulación. Preferentemente, el segundo componente es reticulable con al menos compuestos bifuncionales .

Preferentemente, son utilizados polímeros que estabilizan la suspensión acuosa del componente 1 adsortivamente, es decir, especialmente polímeros polares .

Los componentes reactivos acomodados en el -segundo componente de la partícula de acuerdo a la invención, son especialmente moléculas o grupos moleculares que poseen propiedades de afinidad hacia .otras sustancias» Estos incluyen especialmente enzimas y sustancias que interactúan con las enzimas. Posteriormente, por un. lado el sustrato o por otro lado, la enzima, pueden ser acomodados en o sobre el segundo componente, como eí componente reactivo. El anticuerpo/antígeno, biotina/estreptavidina se comportan de igual modo, La estreptavidina o la biotina en la forma de un componente de reacción específico, enlazable establemente al colorante, posee la ventaja de que el colorante es universalmente utilizable como un co-reactivo para componentes biotinilados, o aquellos acoplados con la estreptavidina. Estos pueden, por su parte poseer funciones completamente diferentes, por ejemplo, actúan nuevamente específicamente contra otro componente o como un catalizador. Además, los ácidos nucleicos de los tipos ARN o ADN, son utilizables dentro del significado del portador de acuerdo a la invención. Los ácidos nucleicos son capaces de hibridarse con las hebras complementarias o parcialmente complementarias correspondientes, dependiendo de la exigencia de las condiciones de reacción y para formar complejos estables. En consecuencia, es posible identificar las hebras específicas de ácidos nucleicos dentro de una muestra que va a ser investigada y el proceso adicional con base en lo mismo. Además, las combinaciones de . los componentes reactivos pueden ser acomodadas en o sobre el segundo componente. Posteriormente, de acuerdo con las investigaciones se obtienen portadores que son aplicables para diferentes problemas .

Mediante la .selección del agente de reticulación y la concentración del mismo y el ajuste de las condiciones de procesamiento específicas, la reacción de reticulación puede ser controlada tal que el segundo componente envuelve al primer componente más o menos en una red molecular, las mallas del mismo poseen una distribución angosta del tamaño de malla.

Al mismo tiempo, por medio de las condiciones de procesamiento de la reticulación se puede ajustar el número de sitios de enlace libres en la superficie de la partícula, que permanecen libres debido al enlace de al menos el agente de reticulación bifuncional únicamente con un grupo funcional a la superficie por un enlace adicional, especialmente de componentes reactivos. El número creado de sitios de enlace puede ser utilizado completa o parcialmente con una porción definida después de una saturación parcial.

En particular, por medio de las condiciones de procesamiento puede ser ajustado el espesor de la capa de recubrimiento, con lo cual se ve incrementada todavía subsecuentemente la homogeneidad de la misma, mediante un fraccionamiento. Un proceso de cobertura de pasos múltiples puede también mejorar la inclusión del primer componente.

El primer componente de la partícula de acuerdo con la invención sí posee al menos un componente 2 de propiedad evaluable y/o los componentes reactivos unidos sobre éste no poseen, con respecto a la calidad de los mismos, tal absortividad o emisividad de las ondas electromagnéticas, masa, magnetismo, dielectricidad, radioactividad, tamaño y/o densidad.

El núcleo como el primer componente del portador de acuerdo a la invención puede poseer propiedades evaluables, existiendo también un efecto farmacológico-biológico así como un efecto catalítico o combinaciones de éstos. Así pues, por ejemplo la absortividad o la emisividad de las ondas electromagnéticas pueden ser producidas por cromóforos o fluoróforos respectivos. Las propiedades de masa, tamaño y densidad están interconectadas físicamente, y pueden ser ajustadas en consecuencia mediante, por ejemplo, partículas con una densidad específica más alta. La propiedad de tamaño puede ser utilizada ventajosamente para 1.a aglomeración y la propiedad de masa para la gravimetría. La aglomeración es ventajosa para la precipitación específica de los componentes en soluciones o microemulsiones. El primer componente puede ser proporcionado con la propiedad de radioactividad por estructuras marcadas radioactivamente. De manera similar, las otras propiedades especificadas pueden estar relacionadas con el primer componente. El primer componente puede también ser una cápsula que contiene líquidos o partículas que no pueden ser encerradas suficientemente (por ejemplo partículas que son extremadamente pequeñas o inestables en solución) .

En un diseño ventajoso del portador de acuerdo a la invención, el portador es tal que el primero y segundo componentes están conectados separadamente uno con el otro. La conexión entre el primero y segundo componentes es efectuada mediante el encerramiento del primer componente dentro del segundo. Básicamente, es posible exponer el primer componente mediante eliminación, si es necesario, del segundo componente para facilitar una detección de las propiedades relacionadas con el núcleo, mediante técnicas de medición. La remoción del segundo componente puede ser realizada, por ejemplo en el caso de proteínas, mediante enzimas proteolíticas apropiadas. Estas degradan la cubierta o capa protectora tal que el núcleo permanece. Este último puede además ser tratado de acuerdo con su propiedad que va a ser medida. Además., es posible resolver el núcleo de la conexión del primer/segundo componente mediante el tratamiento de éste con un medio en donde el núcleo se disuelve preferentemente, de modo que al final permanece una cubierta o capa protectora "vacía", o disolver la partícula completa por medio de un solvente total. De este modo, por ejemplo, si un colorante soluble en etanol es encerrado por el segundo componente, es posible tratar con el solvente y medir la solución etanólica obtenida espectroscópica ente . Si las condiciones son estandarizadas y, si es necesario calibradas, puede ser utilizada una decoloración correspondiente como una cantidad para determinaciones cuantitativas.

Además de los portadores particulados individuales resistentes al almacenamiento, las modalidades de la presente también poseen una gran significancia en la realización de métodos de aplicación. Entonces, los portadores particulados resistentes al almacenamiento, se presentan en su mayoría en la forma de poblaciones. Para la aplicación de las partículas de acuerdo a la invención, se prefiere que los portadores estén presentes en poblaciones que son distinguidas por una distribución de tamaño estrecha de las partículas portadoras individuales de acuerdo a la invención.

Se prefiere especialmente que la población posea partículas portadoras que tengan también un intervalo estrecho de distribución de tamaño de capa protectora, así como un intervalo estrecho de distribución del tamaño del núcleo y en consecuencia un intervalo estrecho de la distribución del tamaño de la capa protectora/núcleo. También para otras propiedades se desea una distribución homogénea, por ejemplo, de la intensidad de color o de la capacidad de magnetización, para el núcleo, especialmente para la partícula completa. En el uso práctico de la partícula de acuerdo a la invención como un portador, es ventajoso acomodar una alta concentración de componentes reactivos en o sobre el segundo componente. Debido a esto pueden ser logradas constantes de enlace relativamente altas para las estructuras complementarias correspondientes en los inmunoensayos , aunque el componente reactivo individual y su estructura complementaria correspondiente posiblemente posea únicamente una constante de enlace promedio. No obstante, debido a la multiplicidad de sitios de enlace la efectividad del enlace (avidez) es incrementada. t Un proceso para la producción del portador de acuerdo a la invención comprende los pasos de hacer reaccionar el primer componente con un polímero reticulable al menos una vez. Posteriormente, el polímero puede ser adsorbido físicamente en la superficie del primer componente. El polímero reticulable entonces, subsecuente a los pasos de procesamiento adicionales, formará el segundo componente. Esto es efectuado mediante un tratamiento con el agente de reticulación. Como agentes de reticulación existen posibles moléculas especialmente bi funcionales tales como glutardialdehído, ácidos dicarboxílicos, acrilatos, metacrilatos . Posteriormente, los agentes de reticulación que tienen grupos olefínicos son activables mediante, por ejemplo, fotorreacciones u otras reacciones en cadena por radicales libres. Las moléculas funcionales pueden reticular los polímeros en particular vía la condensación o las reacciones de adición.

Opcionalmente, el primer componente antes del tratamiento y/o el producto intermediario junto con el segundo componente y/o la partícula, pueden ser sujetos a una separación por tamaño y/o por otra propiedad, para lograr una distribución de tamaño y/o de otra propiedad tan homogénea como sea posible. Se prefiere realizar el tratamiento del primer componente con los polímeros dos a tres veces, y se prefiere especialmente realizar una separación por tamaños.

El proceso es particularmente ventajoso ya que es posible homogeneizar el primer componente y ajustar la concentración del mismo dentro de la suspensión inicialmente, independientemente de una reacción. Dependiendo del primer componente utilizado pueden ser empleados procesos estándares para la homogeneización y la estabilización de la suspensión. Preferentemente, el segundo componente es utilizado para estabilizar la suspensión si éste es un componente polar con adsorción suficientemente buena en el primer componente. La proporción de las concentraciones del primero y el segundo se selecciona tal que es logrado mediante adsorción un espesor adecuado de la capa protectora. En el proceso de pasos múltiples el espesor de la cubierta o capa protectora se selecciona preferentemente delgado. Otros parámetros tales como el tiempo y la temperatura pueden ser utilizados también para influir sobre la adsorción. Después de esto, el producto intermediario puede ser re-homogeneizado . Para legrar una buena reticulación de la cubierta o capa protectora, es especialmente dentro del área interna cercana al primer componente, el componente de reticulación es agregado en un exceso de varios órdenes de magnitud. Además, el efecto del componente de reticulación puede ser influenciado por otros parámetros, en particular el tiempo de contacto así como por el número de grupos reactivos formados sobre la superficie, debido a * las moléculas de reticulación unidas por un solo lado, cuyo número puede ser reducido mediante bloqueo parcial subsecuente.

Los portadores de acuerdo a la invención son preferentemente utilizados en técnicas de ensayo tales como inmunoensayo, ensayos en fase sólida y/o ensayos cromatográficos. Además, éstos pueden ser utilizados como el vehículo para el transporte por afinidad de sustancias efectivas, si por ejemplo sustancias farmacológicamente activas como el primer componente son encerradas por el segundo componente. Por transporte de afinidad se debe de entender, por ejemplo, los transportes de sustancias farmacológicamente activas por medio de anticuerpos que están localizados en el segundo componente y que se unen específicamente a una estructura objetivo particular.

Pueden también ser utilizadas ventajosamente partículas con un núcleo radioactivo, ya que éstas actúan o se concentran debido al transporte de afinidad, por encima de todo, en el sitio de aplicación, y por lo tanto pueden ser utilizadas dosis de radioactividad totales menores, con lo cual una tensión sistémica puede ser mantenida dentro de límites estrechos.

El uso de los portadores particulados resistentes al almacenamiento, de acuerdo a la invención, como un catalizador para las reacciones químicas es también ventajoso. En consecuencia, para un entremezclado rápido del catalizador unido al portador (biocatalizador ) con la mezcla de reacción, puede ser utilizado un núcleo magnético, el peso del cual proporciona subsecuentemente una separación rápida.

La invención será ilustrada además por los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Preparación de una partícula de colorante de Sudan IV que tiene una alta carga de estreptavidina como el componente reactivo específico para los componentes biotinilados Peptización Se agregaron 10.0 g de Sudan IV a 100 mi de amortiguador de PBS (Solución Amortiguadora de Fosfato) con 2% de BSA (Albúmina Sérica Bovina) esterilizada mediante filtración por arriba de 2 µm y agitada a una alta velocidad de agitación para producir una suspensión homogénea. Después de eso, la suspensión fue filtrada en papel de poro ancho (papel filtro Biorad, modelo 543) .

La suspensión fue distribuida sobre dos tubos para centrífuga y centrifugada en una centrífuga previamente enfriada a 4°C a 1000 rpm, a 2000 rpm, y a 3000 rpm por 5 minutos, respectivamente. Subsecuentemente se realizó una segunda filtración. 2. Reticulación y activación 50 mi de una solución acuosa al 50% de glutaraldehído fueron llevados a temperatura ambiente (campana) y ajustados a pH 7.3 con aproximadamente 11 mi de amortiguador de Na2HP0 0.3 M (verificación con potenciómetro) . Subsecuentemente se agregaron 25 mi de amortiguador de PBS y 5 mi de una mezcla 1:1 de amortiguador PBS y agua bidestilada (en la solución de reacción aproximadamente 1.5 M de glutaraldehído o 2.8 M de grupos aldehido, aproximadamente 1.5 x 10"4 M de BSA o con 300 aminoácidos por BSA, aproximadamente 4.5 x. 10~2 M de aminoácido reactivo, es decir, aproximadamente 60 grupos aldehido por grupo amino) . La solución completa (pH 7.3) fue esterilizada mediante filtración (0.2 µm) .

A 20 mi de esta solución amortiguadora de glutaraldehído, respectivamente, se agregaron con mezclado turbulento (Vortex) 20 mi de la suspensión peptizada de Sudan IV (4 preparaciones en paralelo), respectivamente, y se agitaron por 4 horas a temperatura ambiente. 40 mi de la suspensión activada, respectivamente, fueron estabilizados en el tubo para centrífuga con 2.2 mi de una solución al 25 de BSA (filtración de 0.2 µm) . Subsecuentemente las preparaciones se centrifugaron a 2500 rpm por 5 minutos y después de esto se filtraron en papel de poro ancho. 3. Purificación en columna (filtración en gel) Una columna con CL 4B Sepharose (Pharmacia) fue bien regenerada y equilibrada por al menos una hora con amortiguador PBS a temperatura ambiente, luego el filtro redondo fue alimentado y el volumen del amortiguador sobrenadante fue succionado o drenado. Los 160 mi de la suspensión estabilizada fueron alimentados a la columna y la columna fue cubierta. Después de la infiltración (aproximadamente 25 minutos) el extremo de la columna fue enjuagado con amortiguador PBS y se encendió una bomba.

Para e l 'fraccionamiento se prepararon tubos cónicos de 12 mi con graduaciones para los volúmenes de recepción : Tubo No. 1 al 10 y 23 al.3-0 cada uno 4 mi; No. 11 y 22 4.5 mi; No. 12 y 21 5 mi; No. 13 y 20 5.5 mi; No. 14-19 6 mi .

Tan pronto como apareció el frente del solvente rojo en la salida, las fracciones fueron recolectadas. La filtración en gel tomó aproximadamente 30 minutos.

Cada 5 µl de cada fracción fueron diluidos con cada 5 mi de amortiguador PBS (1:1000) y se mezclaron turbulentamente ¡Vortex) para la evaluación óptica-visual de la intensidad de color. La evaluación de las fracciones con respecto a la intensidad de color de las mismas dio como resultado un área pico central ancha con alta intensidad de color y disminuyendo claramente la coloración en las fracciones antes y después de ésta. El área pico ancha de aproximadamente 140 mi fue utilizada. Las fracciones de las mismas fueron combinadas, distribuidas en 3 tubos de 50 mi, centrifugadas a 2500 rpm por 5 minutos, y subsecuentemente filtradas con papel de poro ancho.

(Si era necesario, se repitieron los pasos 2 y 3 una ez o varias veces para una cubierta o capa protectora más gruesa y/o más segura) . 4. Conjugación con estreptavidina como el componente reactivo, específico 100 mg de estreptavidina fueron disueltos en 6 mi de PBS, para probar la calidad la concentración de la proteína fue determinada por medie de la densidad óptica a 280 nm y comparada con la especificación del fabricante. La solución de estreptavidina fue dada en una tubería para diálisis de 6 mm y dializada contra 1 litro de amortiguador de PBS a 4°C toda la noche. La solución se colocó en .tubos, el conjunto de tubos fue reenjuagado con 4 mi de amortiguador de PBS, y la concentración de proteína fue nuevamente determinada con la D028o para verificar la concentración. Las soluciones de. estreptavidina fueron centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante, después de otra determinación de D028o, fue utilizado para la conjugación.

La suspensión filtrada en poro ancho del colorante Sudan IV recubierto con BSA reticulado, con grupos aldehido residuales activos, fue acoplado en 4 preparaciones con el sobrenadante de estreptavidina como sigue: Aproximadamente 3 mi de solución de estreptavidina (con aproximadamente 11 mg/ml de proteína) se colocaron en tubos de 50 mi. A estas se agregaron aproximadamente 30 mi de la suspensión con mezclado turbulento (es decir, aproximadamente 33 mg de estreptavidina por 33 mi de suspensión) . Las soluciones fueron mantenidas en el agitador aéreo a temperatura ambiente toda la noche, y se centrifugaron a 2500 rpm a la mañana siguiente por 5 minutos, y subsecuentemente se filtraron en filtro de poro ancho. El volumen total de la suspensión fue de aproximadamente 130 mi después de esto .

. Purificación en columna con prueba de color en CL-6B Sepharose La columna fue preparada y equilibrada como se describe bajo el inciso 3. La infiltración de 130 mi de suspensión tomó aproximadamente 25 minutos, y la filtración en gel aproximadamente 30 minutos. Los tubos para el fraccionamiento fueron preparados como se describe bajo el inciso 3. Las fracciones fueron ya sea diluidas como se describe para el inciso 3 o evaluadas únicamente de manera óptica y visual. En el caso de que se requiriera una más alta calidad de color, las fracciones fueron probadas por una dilución 1:50 en una prueba de acuerdo a la Patente Alemana DE-A1-195 00 862, Ejemplo 1, con respecto a la adecuación de la misma. A una columna con un lecho de gel con anticuerpo monoclonal IgG murino anti-humano se agregaron 250 µl de un suero combinado diluido a 1:5000, que contenía inicialmente 84 Ul/ml de IgG humana anti-tetanos (sensibilidad 1.7 mUI/ml, absolutamente de aproximadamente 0.4 mUI, Unidades Internacionales), seguido por 250 µl de una solución de 5 µg/ml de toxoide tetánico biotinilado. Después de agregar 250 µl de la suspensión diluida a 1:50 del colorante acoplado a la estreptavidina, fue visible una coloración distinta. El intervalo combinado central que tenía una alta absorción comprendía un- área pico amplia de aproximadamente 10-0 mi, para requerimientos menores las dos áreas de hombro, a mano izquierda y a mano derecha, de 30 mi, respectivamente, fueron combinadas separadamente también. Después del mezclado turbulento (Vortex) y filtración en gel ambos combinados se almacenaron a 4°C (si era necesario, toda la noche) hasta que se logró la estabilización. 6. , Estabil' iza •ción Una solución al 20% de BSA en amortiguador de PBS fue esterilizada mediante filtración con 0.2 µm .

Dentro de los tubos de 50 mi enjuagados con solución de BSA se colocaron con 22 mi de solución de BSA al 20% con mezclado turbulento (Vortex) 18 mi de la suspensión filtrada gruesa.

Subsecuentemente, las suspensiones fueron refiltradas en poro grueso. 7. Almacenamiento En tubos de 50 mi bien sellados la suspensión estabilizada con 0.09% de azida de sodio es estable a 4°C por al menos 12 meses con valor de absorción estable. 8. Propiedades En comparación con un tamaño promedio de aproximadamente 50 nanómetros de las partículas de Sudan IV el tamaño es de aproximadamente 51 a 200 nm después de un recubrimiento simple y de 300 a 400 nm después de un recubrimiento doble.

EJEMPLO 2 Inmunaensayo utilizando los materiales portadores particulados de la invención, resistentes al almacenamiento de acuerdo al Ejemplo 1. pedición semi-cuantitativa y cuantitativa de la condición de vacunación contra el tétanos, es decir, de la concentración de IgG anti-tetanos en la sangre. a) Prueba semi-cuantitativa Para la prueba semi-cuantitativa indicada hacia el efecto visual, se utilizó una columna de reacción para la multi-medición simultánea de acuerdo a la Patente Alemana DE-A1-195 00 862 con 3 áreas.

El área de reacción del fondo (área comparativa) de la columna de reacción se cargó con proteína G y se enlazó sobre ésta con una cantidad definida de IgG humana anti-tetanos correspondiente a una inoculación suficiente en Ul (Unidades Internacionales) del volumen sanguíneo dentro del capilar para la aplicación de sangre. Este suero combinado se diluyó en consecuencia, y la IgG humana total incluyendo la específica del tétanos, fue unida a la proteína G de esta área de reacción en el flujo (proteína G acoplada con agarosa activada con CNBr, ver Patente Alemana DE-A-195 00 862, Ejemplo 2 dado en la misma) .

El área del control negativo intermedia contiene Sepharose 4B activada con CNBr, con BSA acoplada covalentemente .

El área de reacción superior (área de prueba) de la unidad de reacción contiene exclusivamente proteína G acoplada con agarosa activada con CNBr.

Una cantidad definida de sangre es aplicada a la columna por medio de un ,capilar. - Después del lavado con un amortiguador de lavado, se aplican 250 µl de una solución de .5 µg/ml de toxoide tetánico biotinilado (nivel de biotinilación 50) en el amortiguador de lavado. Después de un lavado adicional se aplica y se lava nuevamente una dilución de amortiguador de lavado 1:20 de la emulsión de colorante de estreptavidina.

La IgG humana total de la muestra es enlazada dentro del lecho portador de prueba durante su flujo. En ambas áreas, el área de prueba y el área comparativa durante el flujo, se llega a unir una cantidad de la IgG humana anti-tetanos de antemano, respectivamente, correspondiente con el toxoide tetánico biotinilado. Las proteínas no específicamente enlazadas son lavadas con amortiguador subsecuente. Después de esto, durante el flujo de la emulsión colorante en el área de prueba y el área comparativa existe una cantidad unida de colorante acoplado con estreptavidina, correspondiente con la cantidad de toxoide tetánico. También es este caso la proteína no especificamente enlazada es lavada con amortiguador de lavado. No se une nada dentro del área control negativa .

La evaluación semi-cuantitativa ' tiene lugar mediante comparación visual de los colores. En el caso en que la coloración del área de prueba iguala o excede a aquella del área comparativa, el estado de vacunación es suficiente, en el caso en que sea más débii, se debe de inocular, es decir, entre más urgentemente, más importante es la diferencia de color (graduaciones más finas de las áreas comparativas pueden ser producidas de acuerdo a la información médica o de WHO, por ejemplo, dos años de protección remanente, cinco años de protección remanente,- inoculación recomendada, inoculación fuertemente recomendada. Una alternativa consiste en evaluar la profundidad de penetración de los colores dentro del área de prueba con la marcación correspondiente. Posteriormente, puede ser omitida o utilizada como protección un área comparativa) . b) Prueba cuantitativa Para esto únicamente es requerida un área de prueba, no obstante, para certidumbre las áreas control positiva y negativa pueden ser incorporadas .

El área es cargada con IgG murina anti-hµmana de acuerdo a la Patente Alemana DE-A-195 00 862, Ejemplo 2. .La secuencia de aplicación y las reacciones son tales como se describen bajo el inciso (a)_ La evaluación es .realizada mediante medición de absorción fotométrica a 520 nm Q 492 nm después de la elución con una solución alcohólica.

La elución con alcohol es necesaria ya que el marcador colorante, debido al gran número d sitios de enlace, se adhiere tan establemente al lecho de gel que no puede ser separado del lecho de gel como otros marcadores, por medio de variaciones de pH o por su tratamiento con una molécula de concurrencia, incluso no parcialmente, sino en este caso exclusivamente mediante disolución.

La sensibilidad de la prueba está en el intervalo de mUI/ml para ambas evaluaciones o la IgG humana anti-tetánica . Absolutamente,, sin optimijzación adicional de la prueba, las cantidades de menos 10 pg de IgG pueden ser determinadas cualitativamente ( visualmente) y cuantitativamente, con enriquecimiento . dentro de la. columna incluso menor (intervalo de pg/ml) .

El control de calidad actual produjo una estabilidad de emulsión de al menos 12 meses.

EJEMPLO 3 Síntesis de una partícula de colorante activada A 20 mi de solución BSA dentro de un intervalo de concentración de 1 a 50 mg/ml en solución amortiguadora de fosfato 0.01-0 2 M, pH 6-8.5-, se agregaron de 0.1 a 2 g de carbón. La mezcla es mezclada mediante un agitador magnético o un mezclador tipo Vortex hasta que ha ocurrido adsorción suficiente de la proteína (pepti zación) . La suspensión obtenida es centrifugada a 6000 x g por 5 a 10 minutos.

Las partículas de carbón de 50 a 350 nm, sobre las cuales se adsorbe el BSA, son activadas con glutardialdehído durante el siguiente paso. La concentración de glutardialdehído para esto está en el intervalo de 1 a 25%, el tiempo de activación es de 20 a 120 minutos.

La suspensión activada es purificada mediante centrifugación 3 a 4 veces y mediante filtración en gel con Sepharose 6B, 4B, 2B, CL-6B. CL4B, CL-2B, Sephacryl S300, o con otros geles (Toyoperl, Ultragel, etc.), con lo cual el límite de exclusión no es permitido que caiga por debajo de 1 x 106 Dalton para proteínas globulares. Empleando este método se obtienen partículas colorantes negras. La preparación de otras partículas colorantes es realizada de una manera análoga utilizando en vez del carbón, por ejemplo, Sudan II para el rojo, Sudan II para el rojo oscuro, negro Sudan para el gris, violeta de tetrazolformazan para el violeta, neotetrazoldiformazan para el violeta oscuro, y azul de tetrazoldiformazan para el azul. El intervalo de trabajo para estos conjugados en suspensión es de aproximadamente 0.08%, con base en el peso seco. Los marcadores de colorante son producidos mediante la conjugación con antianalitos tales como proteína A, estreptavidina o anticuerpos .

EJEMPLO 4 Determinación serológica de anticuerpos de anti-HIV sobre una fase sólida no porosa, por medio de un conjugado de proteína A-carbón Como fase sólida se emplearon placas para ELISA de poliestireno con péptidos sintéticos adsorbidos de HIV-1 y HIV-2. Subsecuentemente, en una dilución en serie se agregó suero de conejo anti-HIV. Después de una incubación de 15 minutos y de un paso de purificación se agregó el conjugado de proteína A-carbón y el punto o mancha resultante fue leído después de 15 minutos siguiendo un paso de purificación.

En paralelo, se condujeron experimentos análogos con el coloide proteína A-oro, adquirido comercialmente (tamaño de partícula 40 nm) y la proteína A-POD. La comparación de la evaluación visual produjo una sensibilidad de ambos de los otros marcadores para una dilución de 1/12-80, para el conjugado con carbón de 1/20480.

EJEMPLO 5 Determinación de HCG con conjugado de carbón mediante cromatografía en capa delgada Una tira de nitrocelulosa de 2 x 16 mm se une a PVC transparente de 0.5 mm. Un extremo de la tira fue unido a una pieza de 1 x 1 cm de papel para cromatografía como el elemento de succión. En la parte intermedia de la tira de nitrocelulosa se aplicó una solución de anticuerpo anti-HCG (1 mg/ml en amortiguador de fosfato) con una jeringa de Hamilton. Después de 30 minutos éste se bloqueó con una solución de caseína al 1% (amortiguador de fosfato con Tween) (una hora), después de lo cual se purificó y se secó.

El estándar de HCG se diluye una vez con amortiguador de fosfato/Tween, después de lo cual una vez más con orina de un individuo saludable agregando hasta 0.1 de Tween 20. Se agregan 50 µl de conjugado de carbón con anti-HCG a 50 µl de esta solución estándar. El extremo libre de la tira es sumergido en esta solución, el resultado es leído visualmente como una línea negra después de 2 a 3 minutos. La sensibilidad de 50 mUI/ml es suficiente para una prueba de embarazo después de una semana.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims (31)

RE IVINDICACIONES

1. Una partícula resistente al almacenamiento, de al menos un primero y al menos un segundo componente, caracterizada porque: el segundo componente de al menos un polímero reticulable, como una cubierta o capa protectora, envuelve y/o encierra al primer componente como un núc1eo y - el primer componente tiene al menos una propiedad valorable, obtenible mediante la reacción del primer componente con un polímero reticulable y después de esto la reacción del producto formado con al menos un exceso de diez veces de agente de reticulación, tal que el primer componente es mantenido con resistencia al almacenamiento dentro del segundo componente .

2. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula es una partícula resistente al almacenamiento para reacciones unidas a portadores, para métodos de detección y/o aislamiento, con lo cual el portador es adecuado para ser proporcionado con al menos un componente reactivo, en particular un componente de reacción específico.

3. La partícula de conformidad con la reivindicación 1 y/o 2, caracterizada porque el primer componente es envuelto o encerrado reticularmente por el segundo componente.

4. La partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizada porque el segundo componente es al menos un polímero que comprende grupos funcionales activos o activables.

5. La partícula de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos un polímero es producido a partir de uno o varios polímeros reticulables y/o monómeros reticulables.

6. La partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 1 a la 5, caracterizada porque el polímero es producido a partir de al menos una poliamida, preferentemente una proteína, o al menos otro biopolímero que tiene grupos funcionales.

7. La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6, caracterizada porque el segundo componente es reticulable con al menos compuestos bifuncionales .

8. La partícula de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque al menos los compuestos bi funcionales unidos a la superficie tienen además al menos un grupo reactivo, y porque estos grupos reactivos pueden ser saturados conjunta o parcialmente y/o pueden ser utilizados conjunta o parcialmente, preferentemente a una porción específica, para el enlace covalente de los componentes reactivos o una capa adicional del segundo componente.

9. El portador de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 2 a la 8, caracterizado porque el componente reactivo es una molécula o un grupo molecular que tiene propiedades afines a otras sustancias.

10. El portador de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque al menos un componente reactivo es una enzima, un sustrato que interactúa con las enzimas, un anticuerpo, antígenos, biotina o estreptavidina, un ácido nucleico de los tipos ARN o ADN que son hidro.lizables con otro ácido nucleico.

11, La partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 1 a la 10, caracterizada porque el segundo componente envuelve al primer componente en una red molecular.

12. La partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 1 a la 11, caracterizado porque la propiedad valorable del primer componente es al menos una seleccionada del grupo que consiste de absortividad o emisividad de ondas electromagnéticas, masa, magnetismo, dielectricidad, radioactividad, tamaño, densidad así como el efecto farmacológico, biológico y/o catalítico .

13. La partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 1 a la 12, caracterizada porque el primero y segundo componentes están conectados uno con el otro separablemente.

14. La partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 1 a la 13, caracterizada porque el portador está presente en poblaciones, y las poblaciones son fraccionadas al menos una vez por el tamaño de la partícula después del encerramiento y/o por una de las propiedades valorables de dicho primer componente antes, durante y/o después del encerramiento.

15. La partícula de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la partícula está presente en una población con una distribución estrecha de tamaño y/o la propiedad valorable, en particular el tamaño y/o el color.

16. La partícula de conformidad con la reivindicación 14 y/o 15, caracterizada porque dicha partícula está presente dentro de un intervalo estrecho de la distribución de una propiedad valorable del primer componente, en particular el tamaño y/o el color.

17. La partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 2 a la 16, caracterizada porque el portador tiene una alta cobertµra del segundo componente, con al menos un componente reactivo, en particular componentes reactivos específicos.

18. La partícula de ^ conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 17, caracterizada porque el o los componentes reactivos está (están) unidos conjuntamente vía. el espaciador con la cubierta o capa protectora y el núcleo.

19. Un proceso para la producción de una partícula de al menos un primero y al menos un segundo componente, 'caracterizado porque el jprimer componente es tratado al menos una vez con al menos un polímero reticulable como el segundo componente, y el producto respectivo y/o el producto final es reticulado con al menos un compuesto bifuncional que está presente en al menos un exceso de diez veces .

20. El proceso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque durante dicho proceso al menos una vez es conducido un fraccionamiento del primer componente no tratado, un producto intermediario y/p la partícula, por tamaño y/o alguna otra propiedad valorable.

21. El proceso de conformidad con la reivindicación 19 y/o 20, caracterizado porque al menos el compuesto bifuncional es un .compuesto seleccionado del grupo que. consiste de, por e emplo, un dialdehído, un glutardialdehído particular, un ácido dicarboxílico, un acrilato, o un compuesto _divinílico y el polímero reticulable es reticulado mediante reacciones de condensación, de adición o de sustitución.

22. El proceso de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 19 a la 21, caracterizado porque el tratamiento con los polímerps y/o el agente de reticulación y/o un fraccionamiento son realizados dos veces o varias veces .

23. El uso de la partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 2 a la 18 en técnicas de ' ensayo, -en particular inmunoensayos en fase sólida en columna, cualitativos, semi-cuantitativos y cuantitativos.

24. El uso de la partícula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la propiedad valorable es evaluada manualmente y/o visualmente de manera cualitativa o semi-cuantitativa, vía las áreas comparativas y/o las zonas de concentración.

25. El uso de la partícula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la propiedad valorable es evaluada por medición técnica y cuantitativa, si es necesario después de haber disuelto el segundo componente y/o la partícula completa en otro solvente o con diferentes condiciones, tales como un pH diferente y/o diferente concentración salina.

26. El uso de la partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 23 a la 25, caracterizado porque se utilizan al menos dos propiedades evaluables, por ejemplo, el magnetismo para mejorar el entremezclado y/o la separación subsecuente de la fase sólida de la fase fluida, y/o absorción para cuantificar.

27. El uso de una partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 1 a la 15, para el empleo de sustancias farmacológicas y/o biológicas activas, caracterizado por la disolución de al menos el segundo componente, separado.

28. El uso de la partícula de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque una distribución estrecha de tamaño del segundo componente determina el tiempo hasta la disolución, y/o una distribución estrecha de al menos una propiedad valorable del primer componente determina el efecto en un intervalo angosto.

29. El uso de una partícula de conformidad con la reivindicación 17 y/o 28 como un vehículo para el transporte por afinidad de sustancias activas .

30. El uso de una partícula de conformidad con al menos alguna de las reivindicaciones 2 a la 15, como un catalizador para las reacciones químicas y/o bioquímicas.

31. El uso de la partícula de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque son utilizadas al menos dos propiedades valorables, por ejemplo, el magnetismo para el entremezclado rápido y el peso para la separación rápida. R?jSUMEU DE LA IJÜVEUCION e describe una partícula resistente- ai almacenamiento -de -a -átenos un p im ro y -ai -menos un segundo componente^ en donde el segundo, componente de al menos un polímero reticulabie como una cubierta p capa - pro ector s < e ueis^e yVo encierra al menos parcialítente , al primer componente como un núcleo y - el primer componente tiene al menos una propiedad valorable, obtenible mediante reacción del primer componente con el polímero reticulable, y subsecuentemente la reacción del producto formado con un agente de reticulación, tal que el primer componente con resistencia al almacenamiento permanece dentro del segundo componente.