MXPA98002464A

MXPA98002464A - Factor estimulante de celula dendritica

Info

Publication number: MXPA98002464A
Application number: MXPA/A/1998/002464A
Authority: MX
Inventors: D Lyman Stewart; Brasel Kenneth; Maraskovsky Eugene; R Mckenna Hilary; H Lynch David
Original assignee: Immunex Corporation
Priority date: 1995-10-04
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 1998-11-12

Abstract

El ligando fit3 puede ser usado para generar grandes números de células dendriticas a partir de células progenitoras y del tallo hematopoyéticas. El ligando fit3 puede ser usado para aumentar la respuesta inmune in vivo, y expandir las células dendríticas ex vivo. Dicha células dendriticas entonces pueden ser usadas para presentar antígenos de tumor, virales u otros antígenos a células T naturales, pueden serútiles como auxiliares de vacuna.

Description

FACTOR ESTI MULANTE DE CÉLULA DENPRITICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un factor estimulante de célula dendrítica , a métodos para mejorar la respuesta inmune in vivo, a métodos para expandir células dendríticas ex vivo, y a preparaciones de células dendríticas purificadas, y a poblaciones de célula dendrítica útiles en la manipu lación de respuestas inm unes mediadas por célula T y mediadas por célula B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El objetivo de la vacunación es proveer u na inmunidad efectiva estableciendo niveles adecuados de anticuerpo y u na población in iciada de células que pueden expandirse rápidamente bajo el contacto renovado con el antígeno . El primer contacto con el antígeno durante la vacunación no debe ser dañ ino al receptor y as í usualmente consiste de un antígeno patogénicamente deficiente . U na frecuente dificultad con los protocolos de inmunización activa es que el antígeno de vacuna no posee una inmunogeneicidad suficiente para promover una fuerte respuesta inmu ne , y, por lo tanto , un nivel suficiente de protección contra un ataque su bsecuente por el m ismo antígeno . Además , ciertos antígenos pueden producir solamente una respuesta débi l mediad a por célu la o anticuerpo. Para muchos antígenos, es deseable tanto una respuesta humoral fuerte como una respuesta mediada por célula fuerte. Durante décadas, los investigadores han experi mentado con diversos compuestos para incrementar la inmunogeneicidad de las vacunas. Los inmunopotenciadores, también conocidos como auxiliares, de vacunas son composiciones de materia que facilitan una respuesta inmune fuerte a una vacuna. Además , la inmunogeneicidad relativamente débil de ciertos antígenos recombinantes ha requerido que los auxiliares sean más potentes . Los auxiliares de vacunas tienen diferentes modos de acción , afectando la respuesta inmune tanto cuantitativa como cualitativamente . Dichos modos de acción pueden ser movilizando las cél ulas T, actuando como almacenes y alterando la circulación de linfocitos, de manera que estas células permanecen u bicadas en nodos de linfa de drenaje . Tam bién sirven para enfoca r el antígeno en el sitio de inmu nización , permitiendo as í que las célu las T y las células B específicas en el antígeno interactúen más eficientemente con las células de presentación de antígeno . Tam bién pueden estim ular la proliferación y la diferenciación de células T y tienen efectos sobre las células B , tales como mejorar la producción de diferentes isoti pos Ig. Además, los auxi liares pueden estimular y afectar el comportamiento de células de presentación de antígeno , particularmente macrófagos, haciéndolos más efectivos para presentar el antígeno a las células T y a las células B . Las células dendríticas son u na población de células raras y heterogéneas con morfología distintiva y una amplia distribución de tejido. Una discusión del sistema de célula dendrítica y su papel en la inmunogeneicidad se provee por Steinman, R. M. Annu. Rev. Immunol. , 9_:271 -296 (1991 ), incorporada aquí por referencia. Las células dendríticas exhiben una superficie de célula no usual y pueden ser caracterizadas por la presencia de los marcadores de superficie de célula CD1 a+, CD4+, CD14", CD86+, CD 1 1 c+ , DEC-205+, CD14+ o HLA-DR + . Las células dendríticas tienen una alta capacidad para sensibilizar células T restringidas por M HC y proveen una trayectoria efectiva para presentar antígenos a células T in situ, tanto antígenos propios durante el desarrollo de la célula T como antígenos extraños durante la inmunidad . De esta manera , existe un gran interés en usar células dendríticas ex vivo como auxiliares de vacuna de enfermedad tumoral o infecciosa. Ver, por ejemplo, Romani et al . , J. Exp. Med. , 180:83 (1994). El uso de células dendríticas como agentes inmunoestimulantes ha sido limitado debido a la baja frecuencia de células dendríticas en la sangre periférica, la capacidad de acceso limitada a órganos linfoides y el estado terminal de diferenciación de las células dendríticas . Las células dendríticas se originan de progenitores de médula ósea CD34+ , y la proliferación y maduración de las células dendrítícas pueden ser mejoradas a través délas citoquinas GM-CSF (sargramostim, Leukine®, I mmunex Corporation , Seattle, Washington) , TNF-a, un ligando de equipo c (también conocido como factor de célula del tallo (SCF) , o factor de crecimiento de célula cebada (MGF)) e interleucina-4. Por lo tanto, un agente que estimula la generación de grandes números de células dendríticas funcionalmente maduras, in vivo o in vitro, podría ser de gran importancia.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN El ligando flt3 ("ligando" flt3 o "flt3-L") es conocido porque afecta células del tallo hematopoiéticas y progenitoras. Sorprendentemente se encontró que el ligando flt3 también puede estimular potencialmente la generación de células corriente abajo o intermedias, tales como células precursoras mieloides, células monocíticas, macrófagos, células B, y células dendríticas de células progenitoras y del tallo de médula ósea CD34 + . La presente invención se refiere a un método para movilizar células dendríticas in vivo, expandir células dendríticas ex vivo y a preparaciones purificadas de células dendríticas. La preparación de células dendríticas de acuerdo con la invención potencialmente podría encontrar uso como auxiliares de vacuna. También incluido dentro de las modalidades de la invención está un método para preparar células T específicas en el antígeno usando células dendríticas movilizadas con el ligando flt3. La invención provee el uso de una cantidad efectiva del ligando flt3 para incrementar o movilizar los números de células intermedias in vivo, por ejemplo, en la sangre periférica, tejidos u órganos del paciente. Ya que la invención se refiere a la generación de grandes números de dichas células corriente abajo e intermedias (por ejemplo, células mieloides, células monocíticas y macrófagos) de células CD34+ usando el ligando flt3, el foco es particularmente en las células dendríticas. Incrementando la cantidad de células dendríticas en un paciente, dichas células por sí mismas pueden ser utilizadas para presentar el antígeno a las células T. Por ejemplo, el antígeno puede ser uno que ya exista en el paciente, tal como un antígeno de tumor, o un antígeno bacteriano o viral. Por lo tanto, el ligando f 113 puede ser usado para incrementar los números de células dendríticas in vivo para reforzar la respuesta inmune de un paciente contra antígenos existentes. Alternativamente, el ligando flt3 puede ser administrado antes de , concurrentemente con o subsecuente a la administración de un antígeno a un paciente para propósitos de inmunización . Así, como un auxiliar de vacuna, el ligando flt3 puede generar grandes cantidades de células dendríticas y otras células intermedias, in vivo, para presentar más efectivamente el antígeno. La respuesta total es una respuesta inmune más fuerte y mejorada y una inmunización más efectiva para el antígeno. La invención también provee un método para generar grandes cantidades de células dendríticas ex vivo. Después de la recolección de células progenitoras y del tallo hematopoiéticas CD34+ del paciente, el ligando flt3 puede ser usado para expandir dichas células in vitro (también conocida como expansión ex vivo) y para activar dichas células CD34+ para diferenciar a células dendríticas de la línea linfoide o mieloide. La recolección resultante de células dendríticas puede ser administrada a un paciente para proveer una respuesta inmune más fuerte y mejorada a un antígeno. Alternativamente, las células dendríticas resultantes encuentran uso como un auxiliar de vacuna y pueden ser administradas antes de , concurrentemente con o subsecuente a la administración del antígeno. La invención también provee un método para generar grandes cantidades de células dendríticas que presentan el antígeno, ex vivo. Después de la colección de las células progenitoras y del tallo hematopoiéticas CD34+ del paciente, el ligando flt3 puede ser usado para expandir dichas células in vitro y para activar dichas células CD34+ para diferenciar a células dendríticas. La colección resultante de células dendríticas después es expuesta a un antígeno y se deja procesar y presentar el antígeno in vitro (este procedimiento algunas veces es denominado en la técnica como "pulsación de antígeno") . Un método alternativo para preparar células dendríticas que presenten antígeno es transfectar las células dendríticas con un gen que codifica un polipéptido específico en el antígeno. Una vez que las células dendríticas expresan el antígeno, las células dendríticas que presentan el antígeno pueden ser administradas a un paciente. La invención también provee la preparación ex vivo de células T específicas en el antígeno. Siguiendo los procedimientos descritos anteriormente para preparar grandes números de células dendríticas que presentan antígeno , ex vivo , las células dendríticas que presentan el antígeno pueden ser utilizadas para generar células T específicas en el antígeno a partir de células T naturales que han sido recogidas de un paciente. Después de que el antígeno ha sido adecuadamente presentado a las células T generadas, las células T específicas en el antígeno pueden ser administradas al paciente . La invención también provee un método para aumentar una respuesta inmu ne en un paciente que tiene una enfermedad infecciosa, en donde el método comprende el paso de administrar una cantidad de ligando flt3 suficiente para incrementar el número de células dendríticas en el paciente. La invención también provee un método para aumentar una respuesta inmune en u n paciente que tiene una enferm edad cancerosa o neoplástica, en donde el método com prende el paso de administrar una cantidad del ligando flt3 suficiente para incrementar el número de células dendríticas en el paciente . Dicho método provee medios para mejora r la respuesta inmune específica en el tumor del paciente . U n método para mejorar una tolerancia autoi n mu ne del paciente, en donde el método comprende el paso de ad mi nistrar una cantidad del ligando flt3 suficiente para i ncrementar el n úmero de células dend ríticas del paciente . Además se incl uyen métodos para promover la sobrevivencia de injertos y tej idos y órganos transplantados. Los métodos de la i nvención además com prenden el uso de u na cantidad efectiva de una citoquina en combinación secuencial o concurrente con el ligando flt3. Dichas citoquinas incluyen, pero no se limitan a, interleucina ("lis") I L-3 y 11-4, un factor de estimulación de colonia ("CSF") seleccionado del grupo que consiste del factor estimulante de colonia del macrófago de granulocito ("GM-CSF") o fusiones de GM-CSF/I L3, u otras citoquinas tales como TN F-a o un ligando de equipo c. La invención además incluye un medio de expansión de célula dendrítica que comprende medios de crecimiento de célula, suero autólogo, y ligando flt3 sólo o en combinación con una citoquina del grupo listado anteriormente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención está dirigida al uso del ligando flt3 para generar grandes números de tipos de célula intermedia de células progenitoras y células del tallo hematopoiéticas CD34 + . Dichos tipos de célula intermedia incluyen células mieloides, células monocíticas, macrófagos, células B y células dendríticas. Los grandes números de estos tipos de célula intermedia no se encuentran naturalmente in vivo y pueden ser generadas administrando el ligando flt3. Dicho mejoramiento en el número total de célula puede aumentar la respuesta inmune a un antígeno en el huésped. Otra modalidad de la invención es el aislamiento y el uso de dichos tipos de célula intermedia como células que presentan antígeno o su uso como auxiliares de vacuna. La invención, ya que particularmente enfocada a la modalidad con respecto a las células dendríticas, también es aplicable a tipos de célula mieloide, monocítica y macrófago. Como se utiliza en la presente, el término "ligando flt3" se refiere a un género de polipéptidos que se describen en la patente de E. U.A. No. 5, 554,512, EP 0627487 A2 y en WO 94/28391 , todas incorporadas aquí por referencia. Un ADNc de ligando flt3 humano fue depositado en American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC) en 6 de Agosto de 1993, y se le asignó el número de acceso ATCC 69382. El depósito se hizo bajo los términos del Tratado de Budapest. El ligando flt3 puede hacerse de acuerdo con los métodos descritos en los documentos citados anteriormente.

El término "I L-3" se refiere a un género de polipéptido de interleucina-3, como se describe en la patente de E. U .A. No. 5, 108, 910, incorporada aquí por referencia. Dichos polipéptidos incluyen análogos que tienen secuencias de aminoácido que son substancialmente similares a las secuencias de aminoácido de interleucina-3 humana natural descritas, por ejemplo, en la publicación EP Nos. 275,598 y 282, 185, cada una se incorpora aqu í por referencia . El término "I L-3" también incluye análogos y alelos de moléculas de I L-3 que exhiben por lo menos algo de actividad biológica en común con I L-3 humana natural . Los análogos ilustrativos de I L-3 se describen en la publicación EP No. 282, 185. Otras formas de I L-3 incluyen I L-3[Pro8Asp1 sAsp70] humana, I L-3[Ser8 Asp15Asp70] humana e I L-3[Ser8] humana. Una secuencia de ADN que codifica la proteína IL-3 humana adecuada para usarse en la invención está públicamente disponible de American Type Culture Collection (ATCC) bajo el número de acceso ATCC 67747. La nomenclatura usada aquí con respecto a secuencias de aminoácido entre corchetes designa qué aminoácidos difieren de la forma humana natural. Por ejemplo, IL-3[Ser8Asp15Asp70] humana se refiere a una proteína de I L-3 humana en la cual el aminoácido 8 ha sido cambiado a un residuo de serina. El aminoácido 15 ha sido cambiado a un residuo de ácido aspártico y el aminoácido 70 ha sido cambiado a un residuo de ácido aspártico. El término "I L-4" se refiere a un polipéptido como se describe por Mosley et al. , Cell 59:335 (1989) , Idzerda et al . , J. Exp. Med. 171 :861 (1990) y Galizzi et al. , Intl. Immunol. 2 :669 (1990, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. Dicho polipéptido I L-4 incluye análogos que tienen una secuencia de aminoácido que es substancialmente similar a las secuencias de aminoácido de IL-4 humana natural descritas por Mosley et al. , Idzerda et al . , y Galizzi et al. , y las cuales son biológicamente activas ya que son capaces de unirse a un receptor I L-4, transduciendo una señal biológica iniciada uniendo el receptor I L-4, o haciendo reaccionar en forma cruzada con anticuerpos anti-I L-4. El término "I L-4" también incluye análogos de moléculas de I L-4 humana natural suficiente para retener la actividad biológica de la I L-4 humana natural. Como se utiliza en la presente, "GM-CSF" se refiere a un género de proteínas como se describe en las patentes de E. U .A .

Nos. 5,108,910 y 5,229,496, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. Dichas proteínas incluyen análogos que tienen una secuencia de aminoácido que es substancialmente similar a las secuencias de aminoácido GM-CSF humana natural (por ejemplo, como es públicamente disponible ATCC 53157 o ATCC 39900), y las cuales son biológicamente activas ya que son capaces de unirse a un receptor de GM-CSF, transduciendo una señal biológica iniciada uniendo el receptor GM-CSF, o haciendo reaccionar en forma cruzada con anticuerpos anti-GM-CSF. Las secuencias de aminoácido se describen, por ejemplo, por Anderson et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA 82_:6250 (1985). El GM-CSF comercialmente disponible (sargramostim, Leukine®) se obtiene de Immunex, Corp., Seattle, WA). El término "GM-CSF" también incluye análogos de las moléculas de GM-CSF humano natural descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,108,910 y 5,229,496 suficientes para retener la actividad biológica del GM-CSF humano natural. Los análogos ilustrativos de GM-CSF incluyen, por ejemplo, aquellos descritos es la publicación EP No. 212914 y WO 89/3881, cada una de los cuales se incorpora aquí por referencia. Otros análogos de GM-CSF también pueden ser usados para construir proteínas de fusión con IL-3. Una secuencia de ADN que codifica una proteína de GM-CSF particularmente preferida que tiene sitios de glicosilación potenciales removidos, está públicamente disponible de ATCC bajo los números de designación ATCC 67231. El término "proteína de fusión de GM-CSF/IL-3" significa una fusión de C-terminal a N-terminal de GM-CSF e IL-3. Las proteínas de fusión son conocidas y se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,199,942, 5,108,910 y 5,073,627, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. Una proteína de fusión preferida es PIXY321, como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,199,942. El término "ligando de equipo c" también conocido como Factor de Crecimiento de Célula Cebada (MGF), o Factor de Célula del Tallo (SCF), se refiere a un polipéptido descrito en EP 423,980, la cual se incorpora aquí por referencia, y que reclama prioridad de la solicitud de patente de E.U.A. Serie No. 589,701, presentada el 1° de Octubre de 1990. Dicho polipéptido de ligando de equipo c incluye análogos que tienen una secuencia de aminoácido que es substancialmente similar a las secuencias de aminoácido de ligando de equipo c humano natural, descritas en EP 423,980, y los cuales son biológicamente activos ya que son capaces de unirse a un receptor de equipo c, transduciendo una señal biológica iniciada uniendo el receptor de equipo c, o haciendo reaccionar en forma cruzada con anticuerpos de ligando de anti-equipo-c. El término "ligando de equipo c" también incluye análogos de moléculas de ligando de equipo c humano natural suficientes para retener la actividad biológica del ligando de equipo c humano natural. El término "auxiliar" se refiere a una substancia que mejora, aumenta o potencia la respuesta inmune del huésped a un antígeno de vacuna. El procedimiento para la "expansión ex vivo" de células del tallo y progenitoras hematopoíéticas se describe en la patente de E. U.A. No. 5, 199,942 , incorporada aquí por referencia. En resumen, el término significa un método que comprende: (1 ) recoger células del tallo y progenitoras hematopoiéticas CD34+ de un paciente a partir de la cosecha de sangre periférica o de explantes de médula ósea; y (2) expandir dichas células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente 5, 199,942, se pueden utilizar otros factores tales como el ligando flt3, I L- 1 , I L-3, ligando de equipo c . El término "inmunogeneicidad" significa la efectividad relativa de un inmunogen o antígeno para inducir una respuesta inmune. El término "substancialmente similar" significa una secuencia de aminoácido de variante preferiblemente que es por lo menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácido natural , muy preferiblemente por lo menos 90% idéntica. El porcentaje de aspecto idéntico puede ser determinado, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando el programa de computadora GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucí. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970) , según revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2 :482 , 1981 ). Los parámetros por omisión preferidos para el programa GAP incluyen : (1 ) una matriz de comparación unaria (conteniendo un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación pesada de Gribskov y Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds. , Atlas of protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358, 1979; (2) una penalidad de 3.0 para cada hueco y una penalidad adicional de 0.10 para símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalidad para huecos de fin. Las variantes pueden comprender secuencias conservativamente substituidas, significando que un residuo de aminoácido dado es reemplazado por un residuo que tiene características fisioquímicas similares. Ejemplos de substituciones conservadoras incluyen la substitución de un residuo alifático por otro, tal como Me, Val, Leu, o Ala por otro, o substituciones de un residuo polar por otro, tales como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras substituciones conservadoras , por ejemplo, substituciones de regiones completas que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas. Las variantes de existencia natural también son abarcadas por la invención. Ejemplos de dichas variantes son proteínas que resultan de casos de unión de ARNm alternante o de la escisión proteólitica de la proteína natural, en donde la propiedad biológica natural es retenida. Como se utiliza en la presente, "vacuna" significa un organismo o material que contiene un antígeno en forma inocua. La vacuna está diseñada para disparar una respuesta inmunoprotectora. La vacuna puede ser recombinante o no recombinante. Cuando se inocula a un huésped no inmune, la vacuna provocará inmunidad activa al organismo o material, pero no causará enfermedad. Las vacunas pueden tomar la forma de, por ejemplo, un toxoide, el cual se define como una toxina que ha sido destoxificada, pero que sigue reteniendo sus determinantes principales; o un organismo aniquilado, tal como un tifoide, cólera o poliomielitis; u organismo atenuados, que son formas de patógenos vivos, pero no virulentos, o puede ser un antígeno codificado por dicho organismo, o puede ser una célula de tumor viva o un antígeno presente en una célula de tumor. Una variedad de técnicas de selección de célula son conocidas por identificar y separar células del tallo o progenitoras hematopoyéticas CD34+ de una población de células. Los métodos y los materiales para identificar y seleccionar dichos tipos de célula son conocidos. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales para unirse a una proteína marcadora o proteína de antígeno de superficie encontrada en células del tallo o progenitoras. Dichos marcadores o antígenos de superficie de célula para cél ulas del tallo hematopoyéticas incluyen CD34 y Thy-1 . En un método, los anticuerpos se fijan a una superficie, por ejemplo, perlas de vidrio, y se ponen en contacto con una mezcla de células que se sospecha que contienen células del tallo. Esto permite que los anticuerpos unan y aseguren las células del tallo alas perlas de vidrio. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser incubados con la mezcla de célula y la combinación resultante se pone en contacto con una superficie que tiene una afinidad para el complejo de anticuerpo-célula. Las células no deseadas y la materia celular son removidas proveyendo una población relativamente pura de células del tallo. Las células del tallo o progenitoras que tienen el marcador CD34, constituyen sólo de aproximadamente 1 % a 3% las células mononucleares en la médula ósea. La cantidad de células del tallo o progenitoras CD34+ en la sangre periférica es de aproximadamente 10- a 100 veces menos que en la médula ósea. Con respecto a los aspectos particulares de la invención, la elección de medios de selección de célula del tallo o progenitura dependerá del fenotipo deseado de la célula que será aislada. Las células del tallo hematopoyéticas son seleccionables en virtud de sus características físicas, tales como expresar el receptor flt3 unido a la membrana, o tener los siguientes marcadores celulares: CD34 o Thy-1 . Los anticuerpos monoclonales que reconocen cualquiera de estos antígenos han sido descritos en la patente de E. U.A. No. 4,714,680 (anti-My- 10), incorporada aquí por referencia, anti-CD34 está comercialmente disponible de Becton Dickinson, Franklin Lakes, BJ) , y los anticuerpos monoclonales anti-Thy-1 pueden ser fácilmente generados usando los métodos descritos por Dalchau et al. , J. Exp. Med. 149:576 (1979) , incorporada aquí por referencia. También se puede utilizar una proteína de unión del receptor flt3. Tal como anticuerpos monoclonales anti-flt3 o el ligando flt3. La proteína de unión de célula se pone en contacto con la mezcla de célula recogida y la combinación se deja incubar durante un período suficiente para permitir la unión de la célula deseada a la proteína de unión de célula.

Un medio alternativo para seleccionar las células del tallo estables es inducir la muerte de la célula en los tipos de célula de división , de linaje más comprometido, usando antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo (5-FU) o un agente de alquilación tal como 4-hidroxiciclofosfamida (4-HC) . Las células no estables son estimuladas para proliferar y diferenciar a través de la adición de factores de crecimiento que tienen poco o nada de efecto en las células del tallo, haciendo que las células del tallo se proliferen y se diferencien, y haciéndolas más vulnerables a los efectos citotóxicos de 5-FU o 4-HC. Ver Berardi et al . , Science, 26_: 104 (1995) , la cual se incorpora aquí por referencia. El aislamiento de las células del tallo o progenitoras hematopoyéticas puede ser realizado usando, por ejemplo, cromatografía de afinidad , perlas magnéticas revestidas con anticuerpo, o anticuerpos fijos a una matriz sólida, tal como perlas de vidrio, matraces , etc. Los anticuerpos que reconocen un marcador de célula del tallo o progenitora pueden ser fusionados o conjugados a otras porciones químicas, tales como biotina, la cual puede ser removida con una porción de avidina o estreptavidina asegurada a un soporte sólido; fluorocromos útiles en la clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS) , o similares. Preferiblemente, el aislamiento se logra a través de una columna de afinidad. Las columnas de inmunoafinidad pueden tener cualquier forma, pero usualmente comprenden un reactor de lecho empacado. El lecho empacado en estos bio-reactores preferiblemente se hace de un material poroso que tiene un revestimiento substancialmente uniforme de un substrato. El material poroso, el cual provee una alta relación de área de superficie a volumen, permite que la mezcla de célula fluya sobre un gran área de contacto, mientras no impide el flujo de células fuera del lecho. Los substratos típicos incluyen avidina y estreptavidina, mientras que otros substratos convencionales pueden ser usados. El substrato debe, ya sea por sus propias propiedades, o por la adición de una porción química, exhibir alta afinidad para una porción encontrada en la proteína de unión a la célula, tal como un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales reconocen un antígeno de superficie de célula sobre las células que serán separadas, y además típicamente son modificados para presentar una porción de biotina. Es bien sabido que la biotina tiene una alta afinidad para la avidina, y la afinidad de estas substancias de esta manera removiblemente asegura el anticuerpo monoclonal a la superficie del lecho empacado. Dichas columnas son bien conocidas en la técnica, ver Berenson, et al . , J. Cell Biochem. , 10D:239 (1986) . La columna se lavó con una solución de PBS para remover el material no unido. Las células objetivo pueden ser liberadas de las perlas usando métodos convencionales. Las columnas de inmunoafinidad del tipo descrito anteriormente que utilizan anticuerpos monoclonales anti-CD34 biotinilados asegurados a un lecho empacado, revestido con avidina se describen en , por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 93/08268. U na variación de este método utiliza proteínas de unión de célula, tales como los anticuerpos monoclonales o el ligando flt3 como se describió anteriormente, removiblemente asegurados a una superficie fija en los medios de aislamiento. La proteína de unión de célula, unida, después se pone en contacto con la mezcla de célula recogida y se incuba durante un período suficiente para permitir el aislamiento de las células deseadas. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales que reconocen los antígenos de superficie de célula pueden ser marcados con una etiqueta fluorescente, por ejemplo, cromóforo o fluoróforo, y separado a través de clasificación de célula de acuerdo con la presencia o ausencia de la cantidad de producto marcado. Las células CD34+ recogidas después son expuestas a su ligando flt3 sólo o el ligando flt3 en combinación concurrente o secuencial con una o más de las siguientes citoquinas: GM-CSF, TNF-a, I L-3, IL-4, ligando de equipo c o proteínas de fusión GM-CSF/I L-3. Las células CD34+ después se dejan diferenciar y comprometerse a células de linaje dendrítico. Las células dendríticas son recogidas y pueden ser ya sea (a) administradas a un paciente con el fin de aumentar el sistema inmune y las respuestas inmunes mediadas por célula T o mediadas por célula B al antígeno, (b) expuestas a un antígeno antes de la administración de las células dendríticas a un paciente, (c) transfectadas con un gen que codifica un polipéptido específico en el antígeno, o (d) expuestas a un antígeno y después se dejan procesar y presentar al antígeno, ex vivo, a células T recogidas del paciente después de la administración de las células T específicas en el antígeno al paciente. Más específicamente, la invención provee I uso de una cantidad efectiva de un ligando flt3 para incrementar o movilizar células dendríticas in vivo, por ejemplo, en la sangre periférica del paciente u otros tejidos y órganos, tales como el bazo. Incrementando la cantidad de las células dendríticas del paciente, dichas células por sí mimas pueden ser utilizadas para presentar el antígeno a las células T. Por ejemplo, el antígeno puede ser uno que ya exista dentro del paciente, tal como un antígeno de tumor, o un antígeno bacteriano o viral. Por lo tanto, el ligando flt3 puede ser usado para fomentar la respuesta inmune del paciente mediada por linfocitos (por ejemplo, mediada por célula T o célula B) o mediada por mieloide, a los antígenos ya presentes presentando así potencialmente una presentación de antígeno más efectiva a las células T del paciente. Alternativamente, el ligando flt3 puede ser administrado antes de, concurrentemente con o subsecuente a la administración de un antígeno a un paciente para propósitos de inmunización. De esta manera, como un auxiliar de vacuna, el ligando flt3 puede generar grandes cantidades de células dendríticas in vivo para presentar más efectivamente el antígeno. La respuesta total es una respuesta inmunes más fuerte y mejorada y una inmunización más efectiva al antígeno. La administración sistémica del ligando flt3 no solamente es efectiva como un auxiliar de vacuna, sino que también, como ya se discutió, es efectiva para aumentar una respuesta inmune contra antígenos previamente existentes . Por ejemplo, los inventores han mostrado que la administración del ligando flt3 a ratones con tumor, da como resultado por lo menos una reducción significativa en la velocidad de crecimiento del tumor, y puede dar como resultado el rechazo del tumor en una gran proporción de los ratones. Los datos son presentados con más detalle en el Ejemplo 3. Por lo tanto, el ligando flt3 es una importante citoquina en la generación de una respuesta inmune, in vivo, contra el antígeno . Debido a su habilidad para generar células dendríticas, el ligando flt3 también encuentra uso para promover la sobrevivencia de tejidos y órganos transplantados. Cuando órganos alogenéicos u otro tejido son transplantados a un huésped, estos pueden transferir células del tallo, células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras a partir del donador. Estas células son denominadas células pasajeras, y dichas células pueden injertarse en el sistema hematopoyético del huésped . Además, las células del tallo, las células dendríticas inmaduras, y las células dendríticas maduras del huésped pueden injertarse al órgano o tejido donador. Es posible entonces establecer una tolerancia entre el injerto y el huésped , ya que las células dendríticas inmaduras del huésped y del tejido donador interactúan con células T del "otro lado". Dicha interacción puede incluir la eliminación de células T que reconocen el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) que las células dendríticas expresan. De esta manera, las células del donador son "clasificadas", de manera que fallan para reconocer y reaccionar contra el huésped (es decir, ningún injerto contra enfermedad huésped) y las células T son clasificadas, de manera que fallan para reconocer y reaccionar contra el injerto (es decir, ningún rechazo de injerto). Así, se puede lograr una tolerancia mutua, y la aceptación del injerto es mejorada. La administración del ligando flt3 al huésped o donador antes del transplante podría generar números incrementados de células dendríticas en dicho huésped p donador, y permitir la tolerancia incrementada y sobrevivencia del injerto. Para el crecimiento y cultivo de células dendríticas, se puede utilizar una variedad de medios de crecimiento y de cultivo, y la composición de dichos medios puede ser fácilmente determinada por algún experto en la técnica. Los medios de crecimiento adecuados con soluciones que contienen nutrientes o aditivos metabólicos , e incluyen aquellos que reducidos en el suero o a base de suero . Los ejemplos representativos de medios de crecimiento son RPMI , TC 199, medio de Dulbecco modificado con Iscoves (Iscove et al . , F. J. Exp. Med. , 147:923 (1978)), DMEM, de Fisher, medio alfa , NCTC, F-10, L- 15 de Leibovitz, MEM y McCoy. Ejemplos particulares de nutrientes que serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica incluyen , albúmina de suero, transferina , l ípidos, colesterol, un agente de reducción tal como 2-mercaptoetanol o monotioglicerol , piruvato, butirato y un glucocorticoide, tal como 2-hemisuccinato de hidrocortisona. Más particularmente, los medios estándares incluyen una fuente de energía, vitaminas y otros compuestos orgánicos de soporte de células, un regulador de pH tal como HEPES, Tris, que actúan para estabilizar el pH de los medios, varias sales inorgánicas. Se hace particular referencia a la publicación del PCT No. WO 95/00632, en donde una variedad de medios de crecimiento celular libres de suero se describen, dicha descripción se incorpora aquí por referencia. Para cualquiera de los métodos ex vivo de la invención , las células progenitoras de sangre periférica (PBPC) y las células del tallo de sangre periférica (PBSC) son recogidas usando procedimiento de aféresis conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Bishop et al. , Blood, vol . 83, No. 2, pág . 610-616 (1994). Brevemente, las PBPC y PBSC son recogidas usando dispositivos convencionales, por ejemplo, un dispositivo de aféresis Haemonetics Modelo V50 (Haemonetics, Braintree, MA). Se realizaron recolecciones de 4 horas, típicamente no más de cinco veces a la semana hasta que, por ejemplo, se recogieron aproximadamente 6.5 x 108 células mononucleares (M NC)/kg del paciente . Las células se suspendieron en medios estándares y después se centrifugaron para remover los glóbulos rojos y los neutrófilos . Las células ubicadas en la superficie colindante entre las dos fases (también conocido en la técnica como cubierta amarilla) son retiradas y resuspendidas en H BSS. Las células suspendidas son predominantemente mononucleares y una porción substancial de la mezcla de célula son células del tallo primeras. La suspensión de célula del tallo resultante después se pone en contacto con anticuerpos monoclonales anti-CD34 biotinilados u otros medios de unión de célula. El período de contacto es mantenido durante un tiempo suficiente para permitir la interacción substancial entre los anticuerpos monoclonales anti-CD34 y los antígenos CD34 sobre la superficie de la célula del tallo. Típicamente, son suficientes tiempos de por lo menos una hora. La suspensión de célula después se pone en contacto con los medios de aislamiento provistos en el equipo. Los medios de aislamiento pueden comprender una columna empacada con perlas revestidas con avidina. Dichas columnas son bien conocidas en el técnica, ver Berenson et al . , J. Cell Biochem. , 10D:239 (1986). La columna es lavada en una solución de PBS para remover el material no unido. Las células del tallo objetivo pueden ser liberadas de las perlas y del anticuerpo monoclonal anti-CD34 usando métodos convencionales. Las células del tallo obtenidas de esta manera pueden ser congeladas en un congelador de régimen controlado (por ejemplo, Cryo-Med, Mt. Clemens, MI) , después pueden ser almacenadas en la fase de vapor de nitrógeno líquido. Se puede utilizar 10% de sulfóxido de dimetilo como un crioprotector. Después de que se han hecho todas las recolecciones del donador, las células del tallo descongeladas y vaciadas. Las alícuotas conteniendo las células del tallo, el medio de cultivo, tal como el medio 5A de McCoy, 0.3% de agar, y por lo menos uno de los factores de expansión: GM-CSF humano recombinante, ligando flt3 humano recombinante, y moléculas de fusión de GM-CSF/IL-3 humano recombinante (PIXY321 ) a concentraciones de aproximadamente 200 U/ml , fueron cultivadas y expandidas a 37°C en 5% de CO2 en aire completamente humedecido durante 14 días. Opcionalmente, se puede añadir IL-1 a o IL-4 humana. La combinación más preferida de factores de expansión comprende el ligando flt3 más ya sea IL-3 o una proteína de fusión GM-CSF/IL-3. Para administración in vivo en seres humanos, el ligando flt3 puede ser formulado de acuerdo con métodos conocidos que se usan para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. El ligando flt3 puede ser combinado en mezcla, ya sea como un sólo material activo o con otros materiales conocidos, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, Tris-HCl , acetato, fosfato), conservadores (por ejemplo, Thimerosal, alcohol bencílico, parabenes) , emulsificantes, solubilizantes , auxiliares y/o veh ículos. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16° edición , 1980, Mack Publishing Co. Además , dichas composiciones pueden contener el ligando flt3 en complejo con glicol polietilénico (PEG) , iones metálicos, o incorporarse a compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poiiglicólico, hidrogeles , etc. , o incorporarse a liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, eritrocitos fantasmas o esferoblastos. Dichas composiciones influenciarán el estado físico , la solubilidad , la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de claro in vivo del ligando flt3. El ligando flt3 puede ser administrado tópica, parenteralmente o mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal. O técnicas de infusión. Estas composiciones típicamente contendrán una cantidad efectiva del ligando flt3, sólo o en combinación con una cantidad efectiva de cualquier otro material activo. Dichas dosis y concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones pueden variar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso pretendido, el cuerpo y la edad del paciente, y la ruta de administración. Las dosis preliminares pueden ser determinadas de acuerdo con animales de prueba, y la clasificación de dosis para administración a seres humanos puede realizarse de acuerdo con prácticas aceptadas por la técnica. Manteniendo en mente esta descripción , las dosis típicas del ligando flt3 pueden variar de aproximadamente 10 µg por metro cuadrado a aproximadamente 1000 µg por metro cuadrado. Una escala de dosis preferida es del orden de aproximadamente 100 µg por metro cuadrado a aproximadamente 300 µg por metro cuadrado. Además de lo anterior, se proveen los siguientes ejemplos para ilustrar las modalidades particulares y no para limitar el alcance de la invención .

EJEMPLO 1 Generación de Células Dendríticas Este Ejemplo describe un método para usar un ligando flt3 para generar grandes números de células dendríticas ex vivo . Las células que tienen el fenotipo CD34+ son aisladas como se describió anteriormente, por ejemplo, generando primero una cubierta amarilla de células usando un procedimiento descrito supra. Las células de la cubierta amarilla después se incuban con un anticuerpo monoclonal específico CD34. Las células CD34+, las cuales son seleccionadas, después se cultivan en un medio mejorado de McCoy con 20 ng/ml de cada uno de GM-CSF, IL-4, TNF-a o 100 ng/ml del ligando flt3 p el ligando de equipo c. El cultivo se continuó durante aproximadamente dos semanas a 37°C en 10% de CO2 en aire húmedo. Las células después se clasificaron a través de citometría para la expresión de CD1 a+ y H LA-DR + . La combinación de GM-CSF, I L-4 y TN F-a, dio como resultado un incremento de seis a siete veces el número de células obtenidas después de dos semanas de cultivo. La combinación del ligando flt3 y el ligando de equipo c dio como resultado un incremento aditivo de 12-13 veces en números absolutos de células. Esto se correlacionó con una expansión de 18 veces ya sea con el ligando flt3 o con el ligando de equipo c, o una expansión de 34 veces con la combinación del ligando flt3 y el ligando de equipo c. El análisis fenotípico de las células mostró que de entre 60-70% de las células fueron H LA-DR+, CD86 + , con un 40-50% de las células expresando CD1 a en todas las combinaciones de factor examinadas. La adición del ligando flt3 incrementó el número absoluto de células CD1 a+ por 5 veces. El ligando de equipo c incrementó aquellas células por 6.7 veces, y la combinación del ligando flt3 y el ligando de equipo c por 1 1 veces. El análisis funcional de las células resultantes en MLR reveló que la presencia del ligando flt3 o del ligando de equipo c no afectó la capacidad estimulante de las células dendríticas resultantes, mientras se incrementaban los números obtenidos.

EJEMPLO 2 Uso de Flt3-L en la Expansión de Células Dendríticas Este Ejemplo describe un método para usar el ligando flt3 para la expansión de células dendríticas. Antes de la recolección de células, puede ser deseable movilizar o incrementar los números de PBPC y PBSC en circulación. La movilización puede mejorar la recolección de PBPC y PBSC, y se puede lograr a través de la administración intravenosa del ligando flt3 o sargramostim (Leukine®, Immunex Corporation, Seattle, Washington) a pacientes antes de la recolección de dichas células. Otros factores tales como CSF-1, GM-CSF, ligando de equipo c, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, proteínas de fusión GM-CSF/IL-3, LIF, FGF y combinaciones de los mismos, pueden ser asimismo administrados en secuencia, o en combinación concurrente con el ligando flt3. Se recolectaron PBPC y PBSC movilizados y no movilizados usando procedimientos de aféresis conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Bishop et al., Blood, vol. 83, No. 2, pág. 610-616 (1994). Brevemente, se recogieron PBPC y PBSC usando dispositivos convencionales, por ejemplo, un dispositivo de aféresis Haemonetics Modelo V50 (Haemonetics, Braintree, MA) . Se realizaron recolecciones de 4 horas típicamente no más de cinco veces a la semana hasta que se recogieron aproximadamente 6.5 x 108 células mononucleares (MNC)/kg del paciente. Las alícuotas de PBPC y PBSC recogidas se analizaron para el contenido de la unidad de formación de colonia de granulocito-macrófago (CFU-GM) diluyendo aproximadamente 1 :6 con una solución de sal balanceada de Hank sin calcio o magnesio (H BSS) y colocando como capa sobre el medio de separación de linfocito (Organon Teknika, Durham , North Carolina). Después de la centrifugación , se recogieron M NC en la superficie colindante, se lavaron y resuspendieron en H BSS. Alícuotas de un mililitro conteniendo aproximadamente 300, 000 de MNC, medio de 5A de McCoy modificado, 0.3% de agar, 200 U/ml de GM-CSF humano recombinante, 200 µ/ml de I L-3 humana recombinante, y 200 µ/ml de G-CSF humano recombinante , se cultivaron a 37°C en 5% de CO2 en aire completamente humedecido durante 14 días. Opcionalmente, el ligando flt3 o las moléculas de fusión GM-CSF/I L-3 (PIXY 321 ) pueden ser añadidos a los cultivos. Estos cultivos son teñidos con tinción de Wright, y las colonias de CFU-GM se clasificaron usando un microscopio de disección (Ward et al . , Exp. Hematol. , 16: 358 ( 1988) . Alternativamente , las colonias de CFU-GM pueden ser analizadas usando el método de citometría de flujo CD34/CD33 de Siena et al. , Blood, Vol . 77, No. 2 , pág. 400-409 (1991 ) , o cualquier otro método conocido en la técnica.

Los cultivos que contienen CFU-GM se congelaron en un congelador de régimen controlado (por ejemplo, CryoMed , Mt. Clemens, MI), después se almacenaron en la fase de vapor de nitrógeno líquido. Como crioprotector se puede usar 10% de sulfóxido de dimetílo. Después de haberse hecho todas las recolecciones del paciente, los cultivos que contienen CFU-GM se descongelaron y se vaciaron . La recolección de células descongeladas se puso en contacto con el ligando flt3 ya sea sólo, secuencialmente o en combinación concurrentes con oras citoq uinas listadas anteriormente. Dicha exposición al ligando flt3 activará la CFU-GM al linaje de célula dendrítica. Las células dendríticas se reinfundieron intravenosamente al paciente.

EJEMPLO 3 Uso de Flt3-L para Aumentar Respuestas Inmunes Anti-tumor Este Ejemplo describe un método para usar flt3-L para aumentar las respuestas inmunes anti-tumor in vivo. Se inyectaron ratones C57BL/10J (B10) hembras (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) con 5 x 105 de células de tumor de fibrosarcoma B 10. O B 10.5 viables a través de inyección intradérmica en una posición ventral en un volumen total de 50 µl . Las líneas B 10.2 y B 10.5 de fibrosarcoma son de origen B 10 y han sido descritas previamente, ver Lynch et al. , Euro. J. Immunol., 21 : 1403 (1991 ) incorporada aquí por referencia. La linea B 10.2 de fibrosarcoma fue inducida a través de implantación subcutánea de una pella de parafina conteniendo 5 mg de metilcolantreno, y la línea B10.5 fue inducida mediante exposición crónica a radiación ultravioleta. Las líneas de célula de tumor fueron mantenidas in vitro en MEM modificado con a conteniendo 5% de FBS, 2nM de L-glutamina, 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Se administró flt3-L humano recombinante (10 µg/inyección) en una base diaria durante un período de 19 días (a menos que se observe otra cosa) a través de inyección subcutánea en un volumen total de 100 µl . Similarmente se inyectaron ratones de control con un volumen similar de regulador de pH conteniendo 100 ng de MSA. Se determinaron las velocidades de crecimiento graficando el tamaño del tumor contra el tiempo después del ataque del tumor. El tamaño del tumor se calculó como el producto de dos diámetros perpendiculares, medidos a través de calibres, y se expresa como el tamaño de tumor medio solamente de aquellos ratones que llevan un tumor dentro de un grupo de tratamiento particular. El número de ratones que llevan tumores comparado con el número de atacados para cada grupo de tratamiento al término de un experimento se muestran en los datos más adelante. A partir del Cuadro I, los datos son una compilación de seis diferentes experimentos, en donde los ratones que llevan tumores fueron tratados ya sea con ligando flt3 o con MSA. Se observó una completa regresión del tumor en 19 de 50 ratones tratados con el ligando flt3, comparado con 1 a 30 ratones tratados con MSA (p<0.0001 usando la Prueba Exacta de Fishers). La observación de que la velocidad de crecimiento de tumor en ratones tratados con el ligando flt3 (tamaño de tumor medio en ratones que llevan tumores a un ataque post-tumor de 5 semanas fue de 60+/-8 mm2) se redujo significativamente, comparado con los ratones tratados con MSA (tamaño de tumor medio a un ataque post-tumor de 5 semanas fue de 185 +/- 17 mm2) también se confirmó (p.0001 mediante el Análisis de Variación).

CUADRO I Material Compuesto de Fibrosarcoma +/- Flt3-L de Seis Experimentos de Tamaño de Tumor (mm2) El tamaño del tumor fue agudamente retrasado con el ligando flt3 comparado con el control. Por lo tanto, los datos muestran que el ligando flt3 es una citoquina importante en el aumento de la respuesta inmune contra antígenos extraños, y en particular contra cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método para aumentar una respuesta inmune en un paciente, que comprende el paso de administrar una cantidad de ligando flt3 al paciente, suficiente para generar un incremento en el número de células dendríticas del paciente.

2.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además el paso de administrar una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste de GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-3, ligando de equipo c, y fusiones de GM-CSF e IL-

3. 3.- Un método para aumentar una respuesta inmune en un paciente que tiene una enfermedad infecciosa, que comprende el paso administrar el ligando flt3 en una cantidad suficiente para generar un incremento en el número de células dendríticas del paciente.

4.- Un método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además el paso de administrar una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste de GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-3, ligando de equipo c, y fusiones de GM-CSF e IL-3.

5.- Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la enfermedad infecciosa es VIH (virus de inmunodeficiencia adquirida).

6.- Un método para aumentar una respuesta inmune en un paciente que tiene una enfermedad cancerosa o neoplástica, que comprende el paso de administrar el ligando flt3 en una cantidad suficiente para generar un incremento en el número de células dendríticas del paciente.

7.- Un método de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además el paso de administrar una o más de las moléculas seleccionadas del grupo que consiste de GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-3, ligando de equipo c, y fusiones de GM-CSF e IL-3.

8.- Una preparación de células dendríticas que tiene por lo menos dos marcadores de superficie de célula, seleccionados del grupo que consiste de CD1a, HLA-DR y CD86, producidos poniendo en contacto células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con el ligando flt3. 9 - Una preparación de célula dendrítica de acuerdo con la reivindicación 8, producida además poniendo en contacto las células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con una molécula seleccionada del grupo que consiste de GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-3, ligando de equipo c, y fusiones de GM-CSF e IL-3. 10 - Una población de célula dendrítica que expresa el antígeno producida mediante el procedimiento de: (a) poner en contacto células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con el ligando flt3 en una cantidad suficiente para generar una población de célula dendrítica; (b) ya sea (i) exponer las células dendríticas a un péptido específico en el antígeno, o (ii) transfectar las células dendríticas con un gen que codifica un péptido específico al antígeno; (c) permitir que las células dendríticas procesen y expresen el antígeno; y (d) purificar las células dendríticas que expresan el antígeno. 1 1.- Una población de célula dendrítica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el paso (a) del procedimiento comprende además, poner en contacto las células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con una molécula seleccionada del grupo que consiste de GM-CSF, I L-4, TN F-a, IL-3, ligando de equipo c, y fusiones de GM-CSF e I L-3. 12.- Un método para activar células del tallo o progenitoras hematopoyéticas a un linaje de célula dendrítica, que comprende poner en contacto dichas células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con el ligando flt3. 13.- U n método para preparar una población de célula dendrítica que se presenta al antígeno, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con el ligando flt3 en una cantidad suficiente para generar una población de célula dendrítica; (b) ya sea (i) exponer las células dendríticas a un péptido específico al antígeno, o (ii) transfectar las células dendríticas con un gen que codifica un péptido específico al antígeno; (c) permitir que las células dendríticas procesen y expresen el antígeno ; y (d) purificar las células dendríticas que expresan al antígeno. 14 - Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el paso (a) además comprende poner en contacto las células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con una molécula seleccionada del grupo que consiste de GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-3, ligando de equipo c, y fusiones de GM-CSF e IL-3. 15.- Un método para preparar células T específicas al antígeno que comprende los pasos de: (a) poner en contacto las células del tallo o progenitoras hematopoyéticas con el ligando flt3 en una cantidad suficiente para generar una población de célula dendrítica; (b) ya sea (i) exponer las células dendríticas a un péptido específico al antígeno, o (ii) transfectar las células dendríticas con un gen que codifica un péptido específico al antígeno; (c) permitir que las células dendríticas procesen y expresen el antígeno; y (d) permitir que las células dendríticas presenten el antígeno a las células T. 16.- Un método para mejorar una respuesta inmune en un mamífero a un antígeno de vacuna, que comprende los pasos de, administrar a dicho mamífero una cantidad inmunogénica del antígeno de vacuna y una cantidad para incrementar la inmunogeneicidad del ligando flt3 en combinación concurrente o secuencial con dicho antígeno de vacuna. 17 - Un auxiliar de vacuna que comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste del ligando de equipo c y el ligando flt3. 18.- Un método para inducir tolerancia de tejido de injerto en un huésped, que comprende administrar el ligando flt3 al huésped en una cantidad suficiente para incrementar el número de células dendríticas. 1

9.- Un medio de expansión de célula dendrítica que comprende una cantidad efectiva del ligando flt3 y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de I L-3, I L-4, GM-CSF, TN F, ligando de equipo C y proteínas de fusión GM-CSF/I L-3.